JPH07508422A - Ｄｎａの単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡの単離方法 技術分野 本発明は、植物全体および植物細胞、組織および器官、ならびに酵母および細菌 、ならびに動物細胞または組織がらのＤＮＡの単離に関する。

ル胛立互遣 バイオテクノロジーにおける、ＤＮＡフィンガープリント法、制限断片長条型（ ＲＦＬＰ）分析、サザンブロツティング、ゲノムライブラリーの構築および形質 転換実験の必要性の増加にともなって、高分子量（Ｈ！１ｌＷ）　ＤＮＡの単離 は主要な問題となっている。ＨＭＷ　ＤＮＡの単離のいくつかの方法が報告され てきたが、それらの全ては、様々な理由で欠点を有する。方法には一般に細胞の 物理的粉砕が含まれ、続いてＥＤＴＡ、界面活性剤、トリスおよび他の試薬を含 む緩衝液での抽出が行われる。使用される試薬のいくつかは、様々な細胞小器官 と反応するが、他の試薬の機能は未知である。

従来の技術の方法は、科学というよりもむしろ技術を必要として、しばしば時間 がかかり、再現性がなく、ＤＮＡの収量が変化する。得られるＤＮＡは純度に関 してもさまざまであり、全ての方法には、ユーザーには危険１こなり得る、フェ ノールすなわち、タンパク質変性剤によるＤＮＡの精製が含まれる。結局は、１ つの植物または動物群で有効なりＮへの抽出方法は、他の植物または動物に用い られる時にはたびたび失敗する。

ごく最近まで、シリカを含有しその表面にヒドロキシル基を有する固相抽出材料 が、フェノールの代用としてタンパク質の除去用に報告されてきた。しかしなが ら、この材料の調製は面倒であり、組織の粉砕は、依然として必要である。

これらの難点に関して、これらの問題を解決し得る有用な方法が、引き続き必要 となっている。

本発明の目的はこのような方法を提供することである。

λ尻座■ｊ 理論により制限されることを意図していないが、植物、酵母および細菌からのＤ ＮＡの単離は、多糖類に富んだ硬い細胞壁の存在により部分的に難しく、そのた め通常に使用される緩衝液で完全に破壊するのは難しい。酵素による細胞壁の除 去は面倒であり、いつも可能であるとは限らない。現在の方法を用いた抽出の繰 り返しでのＤＮＡの収量および質の変化は、おそらく、細胞壁の破壊のいろいろ な程度から生ずる。従って、細胞または組織をホモゲナイズすることなく、再現 性を有するようにＤＮＡの単離をし得る、徹底的であるが限界が定められた方法 によって細胞壁を破壊する、新しい方法が必要とされている。

多価アルコール（セルロースを含む）は、キサントゲン酸金属塩への転換により 従来は溶解されてきた。この方法（オ、１８１５年にＺｅｉｓｅにより発見され 、繊維産業では広く用いられてきた。キサントゲン酸金属塩は、ｐ）Ｉ条件を調 整して、低溶解性および種々の溶解性を利用して、多くの金属イオンを分離およ び定置するのに広く適用されることが見いだされている。

キサントゲン酸塩形成化合物によるＤＮＡ抽出用試薬への、現在ある試薬の代用 は、可能であり、非常に優れていると、現在では確信されている。これらの化合 物が、植物細胞壁の実質的な部分を構成する多糖類のヒドロキシル基と水溶性の 多糖キサントゲン酸塩を形成することにより植物の細胞壁を溶かすと考えられて きた。キサントゲン酸塩形成化合物とアミンとの反応もまた報告されている。さ らに、キサントゲン酸塩形成化合物はまた、金属イオンに結合してＤＮ＾アーゼ 活性を阻害し得る。結果として、これらの化合物は、混入しているタンパク質、 金属イオンおよび他の化合物を不溶性の残留物として残し、細胞小器官からＤＮ Ａを選択的に溶解し得る。次に、ＤＮＡは上清から沈澱され得る。

同じキサントゲン酸塩形成化合物が、動物細胞および組織からのＤ　Ｎ　Ａの効 率的な抽出のために用いられ得る。単離したＤＮ、Ａには、制限酵素消化を妨害 する不純物が含まれない。

キサントゲン酸塩〉　化ム 本発明の「キサントゲン酸塩形成化合物」には、植物細胞の細胞壁の多糖類を用 いてキサントゲン酸塩反応生成物を形成し得るあらゆる化合物が含まれる。これ らには明らかに、二硫化炭素およびその有機アルカリ誘導体が含まれる。この反 応（ビスコースレーヨンの製造方法）の工業的使用において使用される一般的な 試薬は二硫化炭素であるが、本発明に従うＤＮＡの分析用の単離には、二硫化炭 素の有機アルカリ誘導体がより好ましい。「二硫化炭素の有機アルカリ誘導体」 とは下記の一般式の化合物を意味する。

Ｏ−Ｃ ５Ｍ ここでＲは、置換されないが、またはアルキル基、アルケニル基またはアラルキ ル基、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、イソアミル 、ビニル、アリル、２−３−ジヒドロキシプロピル、フェネチル、４−モルホリ ニルメチル、およびヒドロキシフェネチルがら選択される基で置換され、ここで Ｍは、アルカリ金属またはＮＨ，、好ましくはＮａまたはＫである。これらの化 合物は、二硫化炭素と対応するアルコール性アルカリとを反応させて形成される ：これらの化合物で最も好ましいのは、カルボッジチオイン酸〇−エチルエステ ルであり、そのナトリウム塩（Ｒ＝　ＣｚＨａ。

＞ｉ　＝　Ｎａ　；ナトリウム　キサントゲン酸エチルエステル）は標準法で調 製し得、そのカリウムアナロクは、Ｆｉｕｋａから商業的に入手可能である。本 発明における有用な化合物の全クラス（二硫化炭素を含めて）は、下記の式によ り表し得る：ここでｎは、０または１であり、Ｒは置換されないか、またはアル キル基、アルケニル基またはアラルキル基、好ましくは、メチル、エチル、プロ ピル、ブチル、ヘキシル、イソアミル、ヒニル、アリル、２−３−ジヒドロキシ プロピル、フェネチル、４−モルホリニルメチル、およびヒドロキシフェネチル から構成される装置換され、そしてここでｎが１のときはＭはアルカリ金属また はアンモニウム、好ましくはＮａまたはＫであり、モしてｎが０のときは、炭素 への他の結合である。

これらの化合物を用いる本明細書に記載の方法は、組織をホモゲナイズしたり、 タンパク質を除去することなく、有効なり！の星離を可能にする。

（以下余白） 太ｍ± 組織を粉砕するプロトコール １３日齢のトウモロコシ幼苗の新鮮な葉（０，６−０，６３ｇ）を、非常にこわ れやす（なるまで液体窒素浴で凍らせ、ガラス製のホモゲナイザーを用いて細か い粉末に粉砕した。その粉末を、１５ｆｆｌｌのプロピレン管中の４Ｉｌ＋１の 緩衝化抽出試薬（６９４ｆｆ１Ｍカルボッジチオイン酸〇−エチルエステルのナ トリウム塩、１００ｍＭ　）リス、ｐＨ７，５，７００ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１，１Ｏ ＩＩ′１Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８、またはＣ２５ノＭカルボッジチオイン酸０− エチルエステルのカリウム塩、１００１ｎｙトリス、ｐＨ７，５，７００ａ＋Ｍ 　ＮａＣ１，１０ｃ＋Ｍ　ＥＤＴＡ）に懸濁した。

６５℃で５分間インキュベートした後、葉の破片を、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈｌ：通 してホモゲネートを濾過することにより除去した。ＤＮＡは、濾液に２倍容量の エタノールを加えて沈澱させ、４℃、３にで１０分間遠心分離した。

沈澱したタンパク質およびキサントゲン酸金属塩を除去する前に、ペレットを１ ００μｍのＴＥ中に懸濁させ、３分間遠心分離した。上清を１．５ａ＋１のエッ ペンドルフチューブに移して５分間遠心分離した。ＤＮＡを、２ＭのＮＨ４Ｏ＾ Ｃで調整し、エタノールを２倍容量加えることにより再び上清から沈澱させた。

ＤＮｌへを、７３５ｇで５分間遠心分離してペレットにした。上溝をデカンテー ションして除いた後、ペレットを高速真空器（ｓｐｅｅｄｖａｃ）で乾燥し、１ ００μＩのＴＥ緩衝液に再溶解した。ＤＮＡの収量は２０〜４０μｇであった。

夾ｉｆ■ 粉砕しないプロトコール カルボッジチオイン酸〇−エチルエステルのナトリウム塩を含む抽出緩衝液４Ｉ ＩＩｌ中で、１ｇの新鮮な葉を２０分間、６５°Ｃでインキュベートし、そして 濾過する。ＤＮＡを濾液から沈澱させ、上記のように再沈澱させる。トウモロコ シに適用したこの粉砕しない方法では、葉の組織１ｇ当り２．５６〜６．６８μ ｇのＤＮＡの収量であった。

夾蔦上」旦 実施例Ｉおよび１１のプロトコールを評価するために、単離されたＤＮＡを、Ｂ ａｍ１ｌｌと１ｌｉｎｄｌｌｌとで、およびＥｃｏＲＩと５ｓｔｌとで６時間消 化し、アガロースゲル電気泳動により分析した。消化されなかったＤＮＡは、２ ３ｋｂであるλマーカーよりも明らかに大きい分子量を示した。消化されたサン プルにおいて高分子量ＤＮＡが存在しないことおよびスミア（ｓｍｅａｒ）の存 在は、ＤＮＡが完全に消化され、制限酵素の消化を妨害する不純物のないことを 示唆した。

Ｋ１拠■ ＤＮＡ調製物の質を、サザンブロツテイングによりさらに評価した。単離された ＤＮＡをＢａａ＋旧で消化し、電気泳動にかけてＭＳＩ膜に移動させ、３２ｐシ ングルコピープローブとノーイブリダイズさせた。

宙施例Ｖｌｌ−Ｘｌ＋ 未消化および消化ＤＮＡは、予想されたハイブリダイゼーションパターンを与え た。消化サンプルの分離したバンドの外観は、ＤＮＡが酵素により完全に消化さ れ、プローブとのハイブリダイゼーションが成功したことを確証した。これは、 ＤＮＡの質には重要な基準である。

Ｋ五何Ｖ′ 分子生物学適用のために単離したＤＮＡの質をさらに確実にするために、抽出し たＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により分析した。単離の後、ＤＮ Ａを増幅し、産物をアガロースゲル上に流した。コントロールの実験はまた、鋳 型ＤＮＡをＰＣＲ反応に含めないで行った。コントロールでは、予測される目的 のバンドがないこと、および前述のプロトコールにより得たＤＮＡサンプルでは そのバンドが存在することによって、さらにＤＮＡの質を確実にした。

夫五五里 これらの抽出手順での収量および効率を、粉砕するプロトコールでテストした。

ホモゲナイズするのに先だって葉のサンプルにＤＮＡの既知の量（２０μｇ）を 加え、その後同様の工程を行って、最終工程で少なくとも８１％のＤＮＡの収量 があった。このことは、酵素分解または機械的分解によるＤＮＡの損失が最小で あることを示唆した。

宙ｔＴ＋　ＭＩ　Ｘ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　−Ｘ　Ｘ　Ｉ　Ｖ−ノｌ’ｌ１１１１１ この粉砕する方法はまた、アガロースゲル電気泳動およびサザンブロッティング により測定されたように、ダイズ、モロコシ類、ヒマワリ、ムラサキウマゴヤシ 、およびタノくコの１３日齢幼苗からのＤＮＡの単離にうまく用（１られｔこ。

結果を表１に示す。

表１ Ｖｌ　ムラ号キウマコ゛￥ン　ｌ５−４２　良　検出Ｖｌｌｌ　カッ：１　ｇ− １４良 Ｉ　ｘ　ｔａ：＋ゾｔｌ！　１２−ｚ８　良　検出（以下余白） これらの２つの方法（粉砕するおよび粉砕しない）の融通性を、さらに、ムラサ キウマゴヤシ、オオムギ、カノラ、モロコシ類、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コ ムギ、ペチュニア、ホウレンソウ、酵母、およびＥ、ｃｏｌｉで比較した。酵母 およびＥ、ｃｏｌｉについては、粉砕するプロトコールでのホモゲナイゼーショ ンは省略した。表２はＤＮへの収量を示す。

（以下余白） 表２ 収！ｔ　収量２ と　鼠宣　庇ｕ」Ｊユ　別色じ込堕ユ Ｘ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ａう’ｔ４？ｖｌｉシ　１５−４２　１．５０−２．８０ＸＩ Ｖ　＊／ラ　３−１４　２．７０−４．［１０Ｘ　Ｖ　＋ａゴンＱ　１２−２８ 　１．７０−２．６６ＸＶＩ　タ゛イｘ’　２６−３７　０．４５−１．１４Ｘ ＶＩＩ　Ｌマ’７１１　７−３０　０．１３−１．３４ＸＶＩＩＩ　タハ′コ　 ７−３０　１．００−３．７４ＸＩＸ　へ’チ、：Ｔ　１１−１９　２．０７− ２．２７Ｘ　Ｘ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　本ルンｉ’ｔ　２０．６４　１．４３４５ＸＸＩ Ｖ　！！ｌ　１．２３９　２．３６９’　μｇ／６００−６３０　Ｂ　新鮮な組 −織２μｇ　ＤＮＡ／１　ｇ　新鮮な組織 ３μｇ　ＤＮＡ／２　ｇ　（市場で購入した）レタス寒１ｊハＮ［づＸＶｌ 本発明の方法はまた、以下の植物からのＤＮＡの単離でもうまく適用された： 寒施五　植玄 ＸＸｖ　ノゲイトウ ｘｘｖ　ｔ　ニワナズナ 粉砕しない方法の容易さは、ＤＮＡ単離の自動化および専門家以外によるＤＮＡ 単離が要求される分析および診断法の分野での使用を容易にし得る。本発明の粉 砕する方法の広い適用性は、植物細胞からのＤＮＡ単離の一般方法としての可能 性がある。抽出は、種々の濃度および址の緩衝液を用いた、さまざまなｐＨ下で 、異なる濃度の基質を用いて、様々な温度で試みられてきた。

粉砕しない方法による、２ｎ＋１の緩衝液／試薬を用いてのムラサキウマゴヤシ 、トウモロコシ、モロコシ類およびレタスは、ＤＮへの高い収量と質を与えた。

一方では、エチルキサントゲン酸ナトリウムを用いたダイズ、ヒマワリおよびコ ムギからのＤＮＡの単離は、清浄なりＮＡを得るのに２倍の量を必要とした。カ ノラ、タバコおよびペチュニアでは、インキュベーションの前にやや穏やかにホ モゲナイズすることが、よりよいＤＮＡの質および収量を得るのに役だった。従 って、本発明の方法の多くの特定の実施例は、配漕の下に、特定のインビボまた はインヒドロ系に適用するように効果的に利用し得る。

−ＸＸＶＩＩ−ＸＸＶＩ＋１ 本発明の方法はまた、動物組織からのＤＮＡの単離にもうまく適用された。乾燥 させた（ｄｒａｉｎｅｄ）ニワトリの肝臓的１．０　ｇのサンプルを乳鉢および 乳棒を用いて凍結させずにすりつぶした。約５＋ｎｌの新鮮な緩衝化抽出試薬（ ６２４ｆｆ１Ｍエチルキサントゲン酸カリウム；　１００ｍＭ　トリス、ｐｏ７ ．ｓ、７００ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１；　ｌＯＩｎＭＥｌｏＩｎを乳鉢に加えた。混合 物を適当にスムースなスラリーが得られるまですりつぶした。このスラリーを滅 菌した１５＋ｎｌのポリプロピレン管中に注ぎ込み、そして６５℃で１５分間イ ンキュベートした。この管を室温まで冷却し、次いで１４．４６０ｇで１５分間 遠心した。

各管中の上清を、新しいポリプロピレン管中で等量の冷イソプロパツールで沈殿 させた。管を一２０°Ｃで１５分間インキュベートした。ピンク色のペレットを エタノールでリンスし、室温で乾燥し、そして３００μｍの滅菌蒸留水中に再懸 濁した。

本発明の方法を用いる１、０ｇの肝組織サンプルからのＤＮＡの収量は、１５０ 〜１５９ηｇであった。これに対して、周知のＣＴＡＢ法（Ｓａｇｈａｉ−Ｍａ ｒｏｏｆら、ＰＮＡＳ　８１：８０１４−８０１８　（１９８４）により教示さ れている、これは本明細書中に参考として援用されている）を用いて抽出した１ 、ｏｇの同じ肝組織サンプルからのＤＮＡの収量は、７４〜８８ηｇであった。

本発明の方法はまた、Ｂｅｔｈｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したＥ ＤＴＡ処理ウサギ血液にも適用された。約１０の１の血液サンプルをそれぞれ１ ５ａ＋１のポリプロピレン管中に入れ、１４．４６０　ｇで２０分間遠心分離に かけた。細胞ペレットはすりつぶさず、ポルテックスにもかけなかった。ペレッ トを乾燥し、３ａ＋１の緩衝化抽出試薬（６２４ｄエチルキサントゲン酸カリウ ム＋　１００ａ＋Ｍ　トリス、ｐＨ７，５，７００ｍ＋Ｉ　ＮａＣ１；　１０ａ ＩＭ　ＥＤＴ＾）中に再懸濁した。この管を６５°Ｃで１５分間インキュベート し、次いで室温まで冷却した。ＤＮＡ単離方法の残りの工程は、最終的なりＮＡ ペレットを１００μｍの滅菌蒸留水に再懸濁したことを除いて、肝組織に関する 上記方法と同様に行った。

本発明の方法を用いる１０ｍ１の血液サンプルからのＤＮＡの収Ｉは、２８〜３ ０ηｇであった。これに対して、ＣＴＡＢ法を用いて抽出した同じ血液サンプル ｌＯｎ＋１からのＤＮＡの収量は、２４〜２７ηｇであった。

本発明の方法およびＣＴＡＢ法を用いて肝組織およびウサギ血液から単離したＤ ＮＡを評価し比較するために、ＤＮＡサンプルをＥｃｏＲｌで一晩消化し、そし てアガロースゲル電気泳動により分析した。未消化のコントロールＤＮＡサンプ ルおよび消化したＤＮＡサンプル（ＣＴＡＢ法または本発明の方法のいずれかに より生成された）の両方とも同じであるようであった。両方ともスメアを生成し ており、ＤＮＡは完全に消化され、そして制限酵素消化を妨害する不純物を含ま ないことが示唆された。

手続補正書 平成７年５月２日 平成６年特許願第５２１２８７号 ２、発明の名称 ＤＮＡの単離方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国　アイオワ　５０３０９．デモイン、　四カストストリー ト　４００．キャビクル　スクエア　７００名称　パイオニア　ハイ−ブレノド 　インターナシラナル。

インコーポレイテッド ４、代理人 住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見−Ｔ目２番２７号またはアルキル基、 アルケニル基またはアラルキル基、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブ チル、ヘキシル、イソアミル、ビニル、アリル、２−３−ジヒドロキ／プロピル 、フェネチル、４−モルホリニルメチル、およびヒドロキシフェネチルから構成 される装置換され、」を、「ここでＲは、置換されない旦た装置Ｂアルキル基、 アルケニル基またはアラルキル基て、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、 ブチル、ヘキシル、イソアミル、ビニル、アリル、２−３−ジヒドロキンプロピ ル、フェネチル、４−モルホリニルメチル、およびヒドロキシフェネチルから選 択さｇと補正します。

ＬＬＬ　明細書第５頁第１行目の「ナトリウム　キサントゲン酸エチルエステル 」を、「ｘ　ｆ　ｔｖキサントゲン酸ナトリウム」と補正します。

ＬＬし　明細書第５頁第６〜１１行目の「Ｒは置換されないか、またはアルキル 基、アルケニル基またはアラルキル基、好ましくは、メチル、エチル、プロピル 、ブチル、ヘキシル、イソアミル、ビニル、アリル、２−３−ジヒドロキンプロ ピル、フェネチル、４−モルホリニルメチル、およびヒドロキシフェネチルから 構成される装置換され、」を、「Ｒは、置換されない友または置逸り扛なアルキ ル基、アルケニル基またはアラルキル基又、好ましくは、メチル、エチル、プロ ピル、ブチル、ヘキシル、イソアミル、ビニル、アリル、２−３−ジヒドロキ／ プロピル、フェネチル、４−モルホリニルメチル、およびヒドロキシフェネチル から選択されよ」と補正します。

鼠求ｄ刊 １、動物細胞または動物組織からＤＮＡを単離する方法であって、キサントゲン 酸塩形成化合物である１つまたは複数の化合物を含有する水溶液に該細胞または 組織を接触させる工程、および該細胞からＤＮＡを単離する工程を包含する、方 法。

２　前記１つまたは複数の化合物が式 を有し、ここで、ｎが０または１であり、Ｒは置換されないＵたは１良立れＬ低 級アルキル、低級アルケニルまたはアラルキル基工そしてｎが１のとき、Ｍはア ルカリ金属またはアンモニウムであり、そしてｎが０のとき、イオウ−炭素結合 である、請求項１に記載の方法。

３、ｎが１であって、Ｒが置換されないカ遣、たはｌ逃襄扛左低級アルキルＬそ してＭがＮａまたはＫである、請求項２に記載の方法。

４　Ｒが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、イソアミル、および ２−３−ジヒドロキ／プロピルからなる群から選択される、請求項３に記載の方 法。

５　前記１つまたは複数の化合物がエチルキサントゲン酸のナトリウム塩または カリウム塩である、請求項４に記載の方法。

６　前記溶液から細胞破片を遠心分離によって除去する工程をさらに包含する、 請求項１に記載の方法。

７　遠心分離した前記溶液からエタノールでＤＮＡを沈澱させる工程をさらに包 含する、請求項６に記載の方法。

フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、　ＬＵ、　ＮｉＣ，ＮＬ、Ｐ Ｔ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ 、　ＭＬ、　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ、　ＣＨ。

ＣＮ、　ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ 、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＬＶ、ＭＧ、ＭＮ、　ＮｉＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　 ＮＺ、　Ｐ　Ｌ、　Ｐ　Ｔ、　ＲＯ，ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＺ、ＶＮ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．動物細胞または動物組織からＤＮＡを単離する方法であって、キサントゲン 酸塩形成化合物である１つまたは複数の化合物を含有する水溶液に該細胞または 組織を接触させる工程、および該細胞からＤＮＡを単離する工程を包含する、方 法。
2. ２．前記１つまたは複数の化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、ここで、ｎが０または１であり；Ｒは置換されないか、または低級アル キル、低級アルケニルまたはアラルキルで置換され；そしてｎが１のとき、Ｍは アルカリ金属またはアンモニウムであり、そしてｎが０のとき、イオウー炭素結 合である、請求項１に記載の方法。
3. ３．ｎが１であって、Ｒが置換されないか、または低級アルキルで置換され、そ してＭがＮａまたはＫである、請求項２に記載の方法。
4. ４．Ｒが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、イソアミル、および ２−３−ジヒドロキシプロピルからなる群がら選択される、請求項３に記載の方 法。
5. ５．前記１つまたは複数の化合物がエチルキサントゲン酸のナトリウム塩または カリウム塩である、請求項４に記載の方法。
6. ６．前記溶液から細胞破片を遠心分離によって除去する工程をさらに包含する、 請求項１に記載の方法。
7. ７．遠心分離した前記溶液からエタノールでＤＮＡを沈澱させる工程をさらに包 含する、請求項６に記載の方法。