JPS63152999A - 非放射性核酸ハイブリッド形成プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は非放射性核酸ハイブリッド形成プローブに関す
る。

植物ウィルス類のおおかたのルーチン的診断法は、血清
学的方法による。しかしながら、これらには限界がある
ため、核酸ハイブリッド形成法の利用可能性が最近現実
化してきた。この研究において、サンプル中の核酸（標
的核酸）は固体マトリックスに固定され、相補的配列を
もつ核酸で探査されることから、プローブは標的とハイ
ブリッド形成するようになる。

形成されたハイブリッドの検出のためには、プローブは
レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）基を有していなければ
ならない。初期の技術開発段階では、放射性標識３２Ｐ
がレポーター基として使用された。しかしながら、ルー
チン的使用の場合には放射性標識は著しい欠陥を６°す
ることが広く認識されている。その結果、いくつかの非
放射性レポーター基が開発されるに至った。レンズ（Ｒ
ｅｎｚ）及びクルツ（Ｋｕｒｚ）　　（１９８４年）は
、ポリエチレンイミン、ｐ−ベンゾキノン及びグルタル
アルデヒドから製造されたリンカ−鎖（ｌｉｎｋｅｒ　
ａｒｍ）を用いて、ペルオキシダーゼ及びアルカリホス
ファターゼをＤＮＡに直接結合・させた。しかしながら
、これらのプローブは、ハイブリッド形成が４５℃以上
の温度で生じる場合には不安定であって、しかもプロー
ブの酵素による直接のこのような長い標詭化はハイブリ
ッド形成、ひいては最終的視覚化を妨げることになる。

他の非放射性プローブの大多数は、アビジン又はストレ
プトアビジンに対するその強い親和性によって検出され
るビオチンを基体にしている。酵素がアビジンに結合し
ている場合には、レポーター基は比色分析によって検出
することができる。ビオチンはビオチニル化デオキシリ
ボヌクレオチドとして直接プローブに組込まれるか〔ラ
ンガー（Ｌａｎｇｃｒ）ら、１９８１年参照〕、又は化
学的手段によってプローブに結合せしめられる。ケンブ
（にｃｔａｐａ　）ら（１９８５年）並びにチョレット
（ＣｂｏｌｌｅＬ　）及びカワシ？　（Ｋａｖａｓｈｉ
−ｍａ）　　（１９８５年）は、ビオチンがＤＮＡ分子
の５′末端に結合せしめられる方法について報告した。

この方法は、ビオチン１分子のみしかＤＮＡ１分子に組
込まれないという欠点を有している。

フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）ら（１９８５年）はビオチ
ン誘導体（フォトビオチンと呼ばれる）を開発し　　、
ており、この誘導体は、光照射時に非常に反応性の高い
ニトレン類を生じるその光活性アジド基によって、核酸
へテロ環塩基に直接結合することができる。

別の研究では、ビオチン誘導体は塩基性タンパク質（チ
トクロームＣ及びヒストン類）のアミド基に結合せしめ
られ、次いでこれはホルムアルデヒド又はグルタルアル
デヒドによってＤＮＡ又はＲＮＡプローブに結合せしめ
られる〔ソジャ（Ｓｏｄｊａ　）及びデビッドソン（Ｄ
ａｖｌｄｓｏｎ）　＋１９７８年；マニング（Ｍａｎｎ
ｌｎｇ　）ら、１９７５年；レンズ（Ｒｅｎｚ）　、　
　１９８３年〕。

我々は、様々な長さの側鎖及び側鎖当たり多数のビオチ
ン分子を付与する、核酸へのビオチンの新規な結合方法
を開発した。この方法では非常に感受性の高いプローブ
を提供し、それによって１０〜５０ｆｇはどの微量の標
的ＤＮＡであっても、アビジン又はストレプトアビジン
酵素複合体とともにドツト−プロット（ｄｏｇ−ｂｌｏ
ｔ）ハイブリッド形成操作法を適用して視見化させるこ
とができる。

本発明は下記一般式を有する塩基性高分子及びビオチン
の付加物を提供する： 〔上記式中、 ＭＭは、１以上の一級アミノ基の水素原子を置換するこ
とにより形成された塩基性高分子の残基である： ａｌｋは、１〜１０の炭素原子を有し任意に置換された
アルキレン基を表わす； ｍは０又は１である；及び ｎは正の整数である； 但し、ＭＭがチトクロームＣ又はヒストンを表わす場合
には、ｍは０でない〕。

高分子ＭＭは、チトクロームＣ，ヒストンＨ１又はポリ
エチレンイミン（ＰＥＩ）であることが好ましい。特に
好ましくは、例えば１０００〜２０００の比較的低分子
量のＰＥＩである。

基ａｌｋは、好ましくは２〜８の炭素原子を有する直鎖
アルキレン基、特に（ＣＨ２−）５である。整数ｎは通
常１〜３０、好ましくは１〜２０である。

本発明の付加物は、塩基性高分子ＭＭを下記一般式のビ
オチン誘導体と反応させることによって製造することが
できる： 上記式中、ａｌｋ及びｍは前記と同義であり、Ｌは脱離
（ｌｅａｖｉｎｇ）基である。

ビオチン誘導体は、高分子上の−ＮＨ２基で求核性置換
をうける。好ましい脱離基りはスクシンイミド誘導体、
例えば下記式を有するスクシンイミジル及びスルホノス
クシンイミジル：であり、これらはＮ−ヒドロキシスク
シンイミド又はそのスルホ誘導体と適切なビオチン誘導
体との反応によって製造される。他の好ましい脱離基は
ハロゲン基、例えば塩素及びヨウ素、並びにハロゲン化
ベンゼン銹導体、例えば２．４−ジクロロベンゼンであ
る。

上記付加物は、非放射性核酸ハイブリッド形成プローブ
を製造するために、架橋剤によって核酸に結合させるこ
とができる。いかなる同種二官能性架橋剤も適切であっ
て、その例としてはホルムアルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、１，２，７゜８−ジェポキシオクタン、ビス（ス
クシンイミジル）スベレート及びビス（スルホスクシン
イミジル）スベレートがある。

本発明は核酸サンプル中において特定の配列を有する標
的核酸の存在を検知する方法をも提供するが、この方法
はサンプルを前記ビオチン標識核酸プローブ（該プロー
ブは所望の配列とハイブリッド形成しうる）と接触せし
め、得られる標的核酸及びプローブのハイブリッド生成
物を検出することからなる。

ハイブリッド生成物は、それを酵素と結合させ、結合し
た酵素の適切な基質に対する作用を検知することによっ
て検出される。

酵素は、酵素とアビジン又はストレプトアビジンとの複
合体を用いることにより、ハイブリッド生成物に結合さ
せることができる。酵素はペル芽キシダーゼ又はアルカ
リホスファターゼであることが好ましい。

本発明は更に、前記ビオチン標識核酸プローブ、並びに
標的核酸とプローブとのハイブリッド生成物検出用物質
を含む、前記方法を実施するためのキットを提供する。

上記物質は、ハイブリッド生成物に結合しうる酵素複合
体及び酵素用基質からなることが好ましい。

本発明は下記例によって更に説明される。

好ましい態様の説明 例 イルチェク（ｖｉｌｃｈｅｋ　）　　（１９８０年）に
記載された方法の修正法により合成した。Ｎ、Ｎ’　　
−ジシクロへキシルカルボジイミド（０，４ｇ）、Ｃア
ルドリッチ（Ａｌｄｒｌｃｈ　）をビオチン（０，５ｇ
）〔シグマ（Ｓｌｇｍａ　）　）及びＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（０，３ｇ）（シグマ）含有のジメチルホ
ルムアミド溶液（６ｍｌ　）に溶解した。反応混合物を
室温で一夜攪拌した。生成物をン濾過し、ろ液を減圧下
で蒸発させ（酢酸エチルとの共沸蒸発が勧められる）、
粗結晶生成物を得た。生成物をジエチルエーテルで洗浄
し、イソプロパツール／水から再結晶し、白色結晶生成
物ｍ、ｐ、１９６−１９８℃（収率７５％）を得た。

ヒストンＨ１及びチトクロームＣのビオチニル化を、ヒ
ストンのビオチニル化のためのレンズ（Ｒｅｎｚ）　　
（１９８３年）の操作法に類似した方法で行なった。ヒ
ストンＨ１（シグマ）及びチトクロームＣ（シグマ）を
別々に異なる比でＢＨＳＥ（短鎖）及び６−　（ビオチ
ンアミド）ヘキサン酸スルホノスクシンイミジル（ＳＢ
ＡＨ）［ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）　）　　（長鎖）によ
りそれぞれビオチニル化した。短鎖ビオチニル化ヒスト
ンＨ１及びチトクロームＣを次のように製造した。ＢＨ
３Ｅ５μｇ１５０μｇｓ　２５０μｇ、５００μｇ及び
ＩＩｇをそれぞれジメチルホルムアミドｌＯμｇに溶解
し、（５０ｍＭ　　ＮａＨＣＯ３２５０１１１１中）ヒ
ストンＨ１１ｍｇ含有溶液にそれぞれ加えた。

同様の実験を、ヒストンＨ１の代わりにチトクロームＣ
を用いて行なった。溶液を頻繁に混合攪拌しながら室温
で１時間イン舟ユベートシ、次いで５ｍＭリン酸ナトリ
ウム（ｐ　Ｈ６，８）に対して一夜透析し、サンナルを
一２０℃で貯蔵した。

長鎖ビオチニル化ヒストンＨ１及びチトクロームＣを同
様に製造したが、但し長鎖６−　（ビオチンアミド）へ
キサン酸スルホノスクシンイミジルを用いた。この化合
物は水溶性であるため、ジメチルホルムアミドに溶解さ
せる代わりに、これを直接カーボネート溶液に加えた。

ポリエチレンイミンのビオチニル化：ポリエチレンイミ
ン（！１色均分子１ｉ１６０，０００の高分子の５０％
溶液、Ｐ２Ｏと呼ばれる）をアルドリッチ（Ａｌｄｒｌ
ｃｈ　）から入手し、ポリミン（Ｐｏｌｙｍｉｎ　）Ｇ
３５（分子ｍ　１４００のポリエチレンイミン）（ＰＧ
３５と呼ばれる）をＢＡＳＦから入手した。

Ｐ２Ｏ及びボリミンＧ３５を様々なモル比のビオチンに
よりビオチニル化した。長鎖ビオチン誘導体６−　（ビ
オチンアミド）ヘキサン酸スルホノスクシンイミジル５
μｇ１５０μｇ、２５０μｇ１５００ｕｇ、１．４＠Ｈ
，２，８ｍｇ、５．６ｍｇ及び１１．２ｍｇを５０　ｍ
　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３０、５ｍｌ中ボリミン１ｍｇ
含有溶液に加えた。反応混合物を頻繁に振盪しながら室
温で２時間インキュベートした。次いで溶液を５ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）に対して透析して未反応
ビオチン誘導体を除去し、サンプルを一２０℃で貯蔵し
た。

標的核酸及びＤＮＡプローブ：これら方法の開発のため
に、Ｍ１３にクローン化されたササゲ（ｃｏｖｐｃａ）
モザイクウィルス（ＣＰＭＶ）に対する４〜１０ｋｂ　
　ｃＤＮＡを用いた。一本杭複製ＪＪ：１ＤＮＡを常法
〔メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　。

１９８３年〕に従い製造した。陰性コントロールとして
、牛胸腺、サケ精子ＤＮＡ　（シグマ）及びアルファル
ファ（ａｌｌ’ａＨａ　）モザイクウィルスＲＮＡを用
いた。

ビオチニル化タンパク質のＤＮＡへの架橋結合二Ｍ１３
ファージ５ｓＤＮＡを５ａｕ３Ａで切断して３〜４ｋｂ
の分子を得、これをリン酸ナトリウム溶液で希釈しくＤ
ＮＡ　　１μｇ＋５ｍＭリン酸塩１００μｌ、ｐＨ６，
８）　、加熱（１００℃で５分間）により変性させ、水
冷した。ビオチニル化ヒストンＨ１又はチトクロームＣ
溶液（４〜５μｇ）を変性ＤＮＡ溶液に加え、次いで２
．５％架橋剤（結果参照）２０℃ｇを加えた。次いでサ
ンプルを頻繁に攪拌しながら３７℃で２０分間インキュ
ベートした。オレンジ（Ｏｒａｎｇｅ）　Ｇ　５μｇ（
０，０２５量ｇ／ｍｌ）の添加後、１ｍｌ使い捨て用ピ
ペット中で形成されたセファデックス０７５カラムに通
過させて、未導入物質から生成物を分離した。必要な生
成物をオレンジＧマーカーより先に溶出した排出容量分
（約１５０〜２００μｇ）中に回収し、ハイブリッド形
成溶液に直接加えた。

ルロースフィルター（シュライヒャー＆ジュール（Ｓｃ
ｈｌｅｌｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｉｉｌｌ　）製ＢＡ
８５）をｌｃｄ角で区切り、所望の大きさに裁断し、水
に１５分間及び２０％ＳＳＣに１０分間浸漬し、ワット
マン（ｗｈａｔｓａｎ　）　３ＭＭ紙の上に置き、様々
な量の変性二本鎖標的ＤＮＡ　（５μｇ）でスポットし
た。

標的ＤＮＡは共有結合で閉環した環状型として存在して
いるため、これを脱プリン及びアルカリ処理によって切
断にツク）した。脱プリンは０．２５Ｎ　　ＨＣＩＣ室
中で１５分間行ない、アルカリ処理は０．７５Ｎ　　Ｎ
ａＯＨ中で同様に１５分間行なった。ｐＨ６の０．６Ｍ
酢酸ナトリウムで中和後、ＤＮＡを２分間１００℃に加
熱することにより変性させた。フィルターを室温で１５
〜２０分間風乾し、減圧オーブン中８０℃で２時間ベー
キングした。前ノ１イブリッド形成及びハイブリッド形
成においては、モーム（Ｍｏｕｌｃ　）ら（１９８３年
）の条件を採択した。２．５％ドライスキムミルク溶液
（センスベリー社（Ｓａｌｎｓ−ｂｕｒｙ　ｐｌｃ）　
）　　（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ　）ら。

１９８４年〕をデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）液の代
わりに時々用いたが、この場合でも同様の結果を与えた
。ハイブリッド形成溶液（２０Ｃ−ニトロセルロース紙
用に２．５ｍ１）はプローブ５０〜２５０ｎｇ／ｍｌを
含有していた。

２％５ｓｃａ＊溶液（各洗浄液２５０ｍ１．１０分間で
４回）で洗浄した。フィルターを３％牛血清アルプリン
含有のｐＨ７，５の０、ＩＭトリスＨＣ１，０，ＩＭ　
　ＮａＣ１，２ｍＭＭｇＣ１つ、０．０５％トリトンＸ
−Ｘ−１Ｏ０２０中室温で１時間インキュベートした。

次いでそれらをアビジン−ペルオキシダーゼ又はアビジ
ン−アルカリホスファターゼ複合体（シグマ）１μｇ／
ｍｌ含有の上記緩衝液中で静かに振盪しながら室温で更
に１時間インキュベートした。フィルターをＬＭ　　Ｎ
ａＣ１，ｐＨ７，５の０．１ＭトリスＨＣｌ　１２−　
５ｍＭ　　ＭｇＣ１２，０，０５％トリトン及び１９６
　Ｂ　Ｓ　Ａからなる緩衝液で振盪しながら洸浄しく５
分間×５回）、次いでＩＭ　　ＮａＣ１、ｐＨ９，５の
Ｏ，ＩＭ）リスＨＣｌ　−１０ｍＭ　　Ｍｇ　Ｃ１２の
溶液で再度洗浄した（１０分間×２回）。

発色させるために、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体
と一緒にインキュベートされたフィルターを、ｐＨ７，
４の０．１ＭトリスＨＣＩ　　１０ｍ！、エタノール２
ｍｌ、　３．　３’　　−ジアンシジン６ｍｇ及び３０
９６ＨっＯっ　６μｇと一緒に又はメタノール２ｍｌ＋
３０％Ｈ２０２６ｕ　ｆｌ中の４−クロロ−１−ナフト
ールと一緒にインキュベートした。アルカリホスファタ
ーゼ検出のために、フィルターを、７０％ジメチルホル
ムアミド中のニトロブルーテトラゾラム０．３３ｍｇ／
ｍｌ及びジメチルホルムアミド中の５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドイルホスファターゼ０．　１７　ｎ　
ｇ／ｍｌ〔リーリイ（Ｌｃａｒｙ　）ら、１９８３年〕
又はリン酸ナフトールＡｓ−Ｍｘと混合された５−クロ
ロ−２−トルイジンジアゾニウムクロリド６ａｇ（バン
タリ（ＢａｎＬａｒｒｌ）及びグツドウィン（Ｇｏｏｄ
ｖｉｎ）。

１９８５年〕のいずれかを含有したｐＨ９，５の０、Ｉ
ＭトリスＨＣ１，１０ｍＭ　　ＭｇＣ１２の溶液中に入
れた。すべての発色操作は暗所中室温で行なった。発色
反応を水でのフィルター洗浄によって終結させた。フィ
ルターはワットマン３ＭＭ紙の包装中に貯蔵することが
できる。

ＰＧ３５に結合したビオチン量の測定：様々な量（結果
参照）の３Ｈ標識Ｎ−ヒドロスクシンイミドビオチン〔
アマ−ジャム（Ａ■ｅｒｓｈａｍ）　）をＢＨＳＦによ
りＰＧ３５に結合させた（前記参照）。未導入ビオチン
をセファデックス０２５カラム中でボリミンに組込まれ
たビオチンから分離したが、関連分画はシンチレーショ
ンカウンターで計測した。試験スペルトルは、ポリミン
及びビオチンがそれぞれ２５０ｎｍにおいて０．１８４
／■／ｍｌ及び０．１１１／■／　ｍｌの吸光度を有す
ることを示した。ビオチニル化ＰＧ３５分画中のビオチ
ン量はシンチレーションカウンターでの計測により評価
し、ＰＧ３５の量はビオチンによる吸光度を斜酌後Ａ　
　　の読みから評価した。

２５０ｎｇ＋ ３Ｈ標識ビオチニル化ＰＧ３５を前記のようにＤＮＡに
結合させた。シンチレーションカウンターでの計測及び
生成物のスペクトルから、ＤＮＡ単位重量当たりのビオ
チニル化ＰＧ３５の量を評価した。

方法の感度及び特定成分の有用性の２四節１図に示され
たレポーター基の各種特徴を、はとんどの可能な組合せ
について試験した（第１表）。

クロスリンカー：５８ｉの二官能性架橋剤、即ちホルム
アルデヒド（ＢＤＨケミカルズ（ＢＤＨｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ））　、グルタルアルデヒド〔アガー（Ａｇｃｒ）
　、　　エイズ（ａｌｄｓ　）　）　、１．　２．　７
．　８−ジェポキシオクタン（アルドリッチ）、ビス（
スクシンイミジル）スベレート（ピアス）及びビス（ス
ルホノスクシンイミジル）スベレート（ピアス）を比較
した。これらは、ホルムアルデヒド（１つの炭素原子）
乃至グルタルアルデヒド（５つの炭素原子）から他の３
種の８つの炭素原子をもつ化合物までにおいて、鎖長が
異なる。試験感度は架橋剤の鎖長に応じて増加し、炭素
原子８つの３種の化合物間では著しい差のないことが、
第１表から判明する。しかしながら、ビス（スクシンイ
ミジル）スベレートは水溶性ではないため、使用前にジ
メチルホルムアミドに溶解されねばならなかった。

ビスチン対ヒストン及びチトクロームＣの割合：レンズ
（Ｒｃｎｚ）　　（１９８３年）は、ヒストン１１ｇを
短鎖ビオチン（ＢＨＳＦ）５μｇ、２５μｇ及び２５０
μｇと反応させた場合には、２．７及び２０のビオチン
残基がそれぞれ各ヒストン分子に結合していたことを示
した。短鎖ビオチンとヒストン又はチトクロームＣとが
異なる割合からなるプローブの分析（第２表）では、短
鎖ビオチン５００μｇ　／　ｍｇタンパク質の場合に著
しい非特異的反応を生じることなく最大の感度を発揮す
ることを示している。この割合を次の実験で利用した。

ＰＧ３５を用いて組込まれたビオチン分子の数：異なる
ビオチン対ボリミン比を用いた場合において各ＰＣ３５
分子に結合したビオチン分子の数は、マテリアルズ・ア
ンドーメソッズ（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄＭｅｔｈ
ｏｄｓ　）に記載されているように、３Ｈビオチンを用
いて評価した。第３表は、ビオチン比の増加がＰＧ３５
に結合するビオチン分子の数を高めることを示している
。

ビオチニル化ＰＧ３５が結合したＤＮＡの分析では、Ｄ
ＮＡの５０ヌクレオチド当たりで１分子のビオチニル化
ＰＧ３５が存在することを示した。

この結果は、ＤＮＡに対するビオチニル化ヒストンの結
合性に関し、レンズ（Ｒｃｎｚ）　　（１９８３年）の
場合（７０ヌクレオチド当たりで１つのとオチン）より
も若干多い。

ＰＧ３５に結合した様々な量のビオチンを含有するプロ
ーブを用いた場合の検出感度評価（第３表）では、１分
子のＰＧ３５につき１５〜２０のビオチン分子が最良の
結果を発揮したことを示す。

これよりも裔い比率の場合には非特異的結合を生じた。

塩基性高分子：試験感度に関し２種の塩基性タンパク質
問では大きな差がなかった（第１表）。

アミンポリマーとしてＰ２Ｏを使用した場合は、タンパ
ク質のときよりも感度が低かった。しかしながら、レポ
ーター基にＰＧ３５を組込んだ場合には、より高い感度
を与えた（第１表）。

ビオチン側鎖：ビオチンに結合した２つの側鎖を比較し
た。ＢＨＳＥは５つの炭素原子を有し、５ＢＡＨは１１
の炭素原子を有する。第１表は、側鎖の長さが検出レベ
ルに関して著しい効果を発揮することを示している。

酵素：アビジンで復合化されたアルカリホスファターゼ
の使用は、検出感度の面でペルオキシダーゼ復合体より
も優れていることが証明された（第１表）。ペルオキシ
ダーゼに関して試験された２種の基質、即ち褐色生成物
を与える３、３′−ジアニシジン及び青色生成物を与え
る４−クロロ−１−ナフトールは、それらの感度の而で
差異がなく、ホスファターゼに関して使用された２′！
ｇｉの基質、即ち紫色を呈するニトロブルーテトラゾリ
ウム及び赤色を呈するファースト・レッドＴＲ塩は、そ
れらの感度の面で同じく差異がなかった・（結果未掲示
）。

非特異的反応＝２種の型の非特異的反応がみられた。一
方においては、ニトロセルロースフィルターの全体が希
色した。この反応はプローブＦ又はＧを用いた場合にみ
られた（第３表）。予備実験において１．この非特異的
反応は、ニトロセルロースの場合にはバックグラウンド
反応を生じないプローブであってさえも、ナイロン膜〔
ボール（Ｐａｉｌ）製のバイオダイン・トランスファー
・メンプラン（Ｂｉｏｄｙｎｃ’Ｔｒａｎｓｌ’ｃｒ　
Ｍｅｍｂｒａｎｅ　）　）の場合では顕著な問題を生じ
ることも判明した。第二のタイプの非特異的反応は、コ
ントロールの非相同性ＤＮＡ又はＲＮＡスポットによっ
て示された。

２５０ｎｇ／ｍ１以上のボリミン、ヒストン又はチトク
ロームＣプローブを用いた場合は、コントロールスポッ
トにおいて着色反応を生じたが、相同性核酸スポットは
ど薄くはない。

異なるプローブ構造体における非特異的反応の評価は、
第１表に示されている。

検討 モデル系を用いて、我々はレポーター基を構成する様々
な特徴を変更させた場合の効果について試験した。各々
の基本的特徴が重要であることは明らかである。

２つの特徴、即ちクロスリンカ−及びビオチン側鎖はレ
ポーター基の長さに影響を与え、第１表に示されたデー
タからは、レポーター基が長くなるにつれて検出感度が
高まることがわかる。ブリガンティ（ＢｒｉｇａｎＬｉ
）ら（１９８３年）は、プローブに直接組込まれたデオ
キシリボヌクレオチドのビオチン誘導体を用いた場合に
、ビオチン側鎖の長さはニトロセルロース上においてハ
イブリッド形成感度にさほど影響を与えないが、しかし
組織サンプルの現場でのハイブリッド形成には影響を与
えることを発見した。

塩基性高分子の大きさも検出感度に影響を与えた。分子
量の多いポリエチレンイミン（分子量６００００）を用
いた場合の感度は、ポリメンＧ３５（分子量１４００）
、チトクロームＣ（分子量１２３２７）又はヒストン（
分子量２３０００）を用いた場合よりも著しく低かった
。

感度は立体障害によっておそらく制限されるようである
。クロスリンカ−分子が大きくなるほど、より多くの塩
基性高分子がＤＮＡの単位長さ当たりに対して結合しう
るようになる。塩基性高分子間の立体障害は、高分子の
分子量が大きくなるにつれて感度を低下させる。それに
次ぐレベルでの立体障害、即ち塩基性高分子に結合した
ビオチン分子間の立体障害も存在しうる。

試験された酵素の中では、ホスファターゼが良好な検出
レベルを与えた。各酵素において、−基質間に差異はな
かった。

本発明で達成された感度は、他の系に関して報告された
感度よりも有意に優れている。ビオチニル化プローブの
中では、塩基性タンパク質を基礎にしたプローブ類は５
ｐｇの核酸を検出することができ〔レンズ（１２ｅｎｚ
）　、　　１９８３年〕、プローブ中にニックトランス
レーションにより組込゛まれたビオチニル化デオキシリ
ボヌクレオチド〔ランガー（Ｌａｎｇｃｒ）ら、１９８
１年〕及びプローブ上に光結合せしめられたフォトビオ
チン〔フォスター　（Ｆｏｓｔｅｒ）ら、１９８５年〕
は５００ｆｇの核酸を検出することができた。このフォ
トビオチンプローブは感度が高くかつ信頼度も高いと報
告されているが、出発物質は、多量に使用された場合に
は爆発性を帯び、しかも（核酸に結合する荊の）最終生
成物は光に対し極度に感受性が窩い。酵素を直接ＤＮＡ
に結合させるか〔レンズ（Ｒｅｎｚ）及びクルツ（Ｋｕ
ｒｚ）　、　　１９８４４年〕はＤＮＡに結合せしめら
れたＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレ
ン検出用の抗体を用いた〔チェノ（Ｔｃｈｅｎ　）ら、
１９８３年〕ような非ビオチニル化プローブは、１〜５
ｐｇオーダーの核酸を検出することができた。第１表は
、本発明者らのプローブ構造体のいくつかがより高い感
度を有していたことを示している。これらの構造体は他
のプローブ系におけるいくつかの欠点を有していなかっ
た。ビオチニル化デオキシリボヌクレオチドを使用する
場合は、比較的高価となり、しかもニックトランスレー
ションプロセスを要する。フォトビオチンは光照射によ
り分解してしまうため、暗所保存されねばならない。Ｎ
−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレンは発
癌性物質である。

酵素発色試験においては、非特異的反応を最小に抑制す
るよう注意が払われねばならない。様々なファクターの
中で、例中に記載されたブロッキング緩衝液の使用、ア
ビジン−酵素複合体とのインキュベート後における大量
洗浄及び前ハイブリッド形成溶液中における純粋な一本
鎖ＤＮＡの使用が重要であることが判明した。我々は牛
胸腺又はサケ精子ＤＮＡをルーチン的にフェノール抽出
している。第１表は、長鎖ビオチンの方が短鎖ビオチン
よりも非特異的反応を生じにくいことを示している。

第１表 塩基性　　　　　　　　　検出限界点　非特異的架橋剤
　ポリマー　側　鎖　酵　素　　（ｐｇ）　　　反　　
応Ｆ　チトＣ短　ペル　５００　　　　＋＋Ｆ　　チト
Ｃ長　　ホ　ス　　１００　　　　　＋十Ｆ　　ヒスト
　　　短　　ペ　ル　　５００　　　　　＋　＋Ｆ　　
ヒスト　　　長　　ベ　ル　　１００　　　　　＋＋Ｇ
　チトＣ短　ペル　１００＋ Ｇ　チトＣ短　ホ　ス　　５０＋ Ｇ　チトＣ長　ペル　１００− Ｇ　チトＣ長　ホス　　５〇− Ｇ　　ヒスト　　　短　　ペ　ル　　１０−５０　　　
　＋Ｇ　　ヒスト　　　短　　ホ　ス　　１０＋Ｇ　　
ヒスト　　　長　　ベ　ル　　！０−５０　　　−Ｇ　
　ヒスト　　　長　　ホ　ス　　　１　　　　−Ｄ　チ
トＣ短　ペル　　１０− Ｄ　チトＣ短　ホス　　２　　− Ｄ　チトＣ長　ペル　　１０　　　− Ｄ　チトＣ長　ホス　　０．２５　　−８　　ヒスト　
　　短　　ベ　ル　　１０　　　　−８　　ヒスト　　
　短　　ホ　ス　　　２　　　−８　　ヒスト　　　長
　　ベ　ル　　１０　　　　　−８　　ヒスト　　　長
　　ホ　ス　　　０．２５　　　−Ｇ　　ＰＥＩ　　短
　ホス　０．２５　−Ｇ　　ＰＥＩ　　長　ホス　１０
　　−Ｇ　　ＰＧ３５　　短　ホス　１　− Ｇ　　ＰＧ３５　　長　ホス　０．（１１−０，（１５
−Ｄ　　ＰＥＩ　　短　ホス　１０　　−Ｄ　　ＰＥＩ
　　長　ホス　２　− Ｄ　　ＰＧ３５　　短　ホス　０．２５　−Ｄ　　ＰＧ
３５　　長　ホス　０．０１−０．０５−Ｓ　　ＰＥＩ
　　短　ホス　１０− Ｓ　　ＰＥＩ　　長　ホス　２　− Ｓ　　ＰＧ３５　　短　ホス　０．０５−０．２５−Ｓ
　　ＰＧ３５　　長　ホス　０．０！−０，０５−Ｆ　
　■ホルムアルデヒド Ｇ　　−グルタルアルデヒド Ｄ　　　−１，２，７，８−ジェポキシオクタンＳ　　
−ビス（スルホノスクシンイミジル）スベレート、 ナトＣ−チトクロームＣ ヒスト糟ヒストンＨ１ ペル　−アビジンベルオキシダーゼ ホス　■アビジンアルカリホスファターゼ−−非特異的
部位との反応なし 十　　−非特異的部位との反応あり 第２表 ビオチニル化ブローブ二を増加させていった場合におけ
るヒストン／チトクロームＣプローブの感度 ５　　　　　　　　１　　　　　　　５００９ｇ０１）
　　　　　　　　　１　　　　　　　　１−５ｐ１−５
ｐ　　　　　　　　　１　　　　　　０．２５０−０．
５００ｐｇ１０００　　　　　　１　　　　　非特異的
結合箱゛　３　表 ビオチニル化ポリミンブローブ及びそれらに対応する感
度 Ａｏ、００５　　　１　　　　　３　　　　５−１０Ｂ
０．０５　　　　１　　　　　７　　　　１−５Ｃ０，
２５０１１２０，０５−０，５ Ｄ　　１．４　　　　１ Ｅ２．８　　　　１　　　　１７　　　０．０１−０．
０５Ｐ　　５．［ｌ　　　　　ｌ 応 サウザーンプロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒ口ｂｌｏｔｓ）
におけるポリミン、ポリビオチンプロセスの利用物質及
びｈ″法 プラスミドｐＣＤ４及びこのクローンからのｃＤＮＡ挿
入物をドマニー（ＤｏＩＩｌｏｎｅｙ　）及びケージ−
（Ｃａｓｅｙ　）　、　　１９８５年に記載されている
ように製造した。ｐＣＤ４内部においてコード化された
遺伝子はエントウ〔ビスム・サチブム（ＰｉｓｕＩｌｓ
ａＬｉｖｕｍ　）　）貯蔵タンパク質ピシリンに対応す
る。プラスミド及び挿入物双方の調製物はシー・ドマニ
ー博士（叶、　Ｃ，ＤｏＩＩｌｏｎｅｙ　）からの進呈
品であった。挿入物を前記のようにボリミン及びポリビ
オチンで標識した。

ｐＣＤ４クローンの消化は、製造者が勧めるように、Ｅ
ｃｏＲＩ　　（ベーリンガー社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｃｏｒｐ、　）　）で行なった。消化されたサンプルを
エタノール沈降させ、１０ｍＭ）リス／１ｍＭＥＤＴＡ
に再懸濁し、ニトロセルロースフィルターに移す前に３
〜４時間１？６アガロースゲルで電気泳動に付した〔サ
ウザーン（Ｓｏｕｔｈｃｒｎ）　。

１９７５年〕。

しかる後のフィルター処理は、ドツト−プロット法につ
いて前記したとおりであった。簡１１１に述べると、ニ
トロセルロースフィルターを８０℃で２時間ベーキング
し、前ハイブリッド形成させ、ビオチニル化プローブと
ハイブリッド形成させた。

ハイブリッド形成は６５℃で１８〜２０時間行なった。

フィルターを２％５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ溶液２．５０
　ｍｌで４回（各々１５分間）６５℃で洗浄し、次いで
ブロッキング溶液中で１時間インキュベートした。しか
る後、アビジンアルカリホスファターゼ（１μｇ　／　
ｍｌ　）と１〜２時間インキュベートした。次いでフィ
ルターを発色試薬にトロブルーテトラゾリウム及びリン
酸インドリル）とのインキュベート前に上記ブロッキン
グ緩衝液で洗浄した（１０分間×４）。

結果 ｐＣＤ４からＥｃｏＲＩ切断プラスミドまでのビオチニ
ル化挿入物のハイブリッド形成は第２図に示されている
。（ａ）〜（ｅ）の列はそれぞれ５ｎｇ、ｌｎｇ、２５
０ｐｇ、５０ｐｇ、１０ｐｇのプラスミド瓜を含Ｈして
いる。ポリミン、ポリビオチニル化プローブは、標的配
タリ約２ｐｇを意味するプラスミド１０ｐｇを容易に検
出することができた。

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第５巻、第３８５−４０１頁（Ｓｏｄ　ｊ　ａ、＾、　
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−４０１１ チェンφビー、フックス・アル・ビー・ビー。

セージ・イー及びレンゲ・エム、１９８４年、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
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ｎ、Ｐ、、　Ｐｕｃｈｓ、Ｒ，Ｐ、Ｐ、、　Ｓａｇｃ、
Ｅ。

ａｎｄ　Ｌｃｎｇ、Ｍ、　（１９８４）、　Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇ　ｏｒ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　
　ｏｆ’　　５ｃｉｅｎｃｅ　　ＵＳＡ　　８１．　３
４６Ｂ　　）ドマニー・シー及びケージ−・アール。

１９８５年、ヌクレイツク・アシッズ中リサーチ。

第１３巻、第６８７−６９９頁（Ｄｏｍｏｎｅｙ、Ｃ，
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（１９７５）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｂｌｏｌｏｇｙ　９８．５０３−５１７〕

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のハイブリッド形成プローブの好まし
い態様の構造を示す。 第２図は、サウザーンプロット法におけるかかるプロー
ブの使用について示す。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 ｅｃｂａ ＦＩＧ、２゜ 手続補正書坊均 昭和６２年１り月／ｆ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記一般式を有する塩基性高分子及びビオチンの付
   加物： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上記式中、 ＭＭは、１以上の一級アミノ基の水素原子を置換するこ
   とにより形成された塩基性高分子の残基である； ａｌｋは、１〜１０の炭素原子を有し任意に置換された
   アルキレン基を表わす； ｍは０又は１である；及び ｎは正の整数である； 但し、ＭＭがチトクロームＣ又はヒストンを表わす場合
   には、ｍは０でない〕。 ２、ＭＭがチトクロームＣ又はヒストンを表わし、かつ
   ｍ＝１である、特許請求の範囲第１項記載の付加物。 ３、ＭＭがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を表わす、特
   許請求の範囲第１項記載の付加物。 ４、ＰＥＩが１０００〜２０００の分子量を有する、特
   許請求の範囲第３項記載の付加物。 ５、ａｌｋが（−ＣＨ＿２−）＿５である、特許請求の
   範囲第１項〜第４項のいずれか一項に記載の付加物。 ６、ｎが１〜３０である、特許請求の範囲第１項〜第５
   項のいずれか一項に記載の付加物。 ７、特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載さ
   れた付加物が架橋剤により核酸と結合せしめられている
   、ビオチン標識核酸。 ８、架橋剤がホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、
   １，２，７，８−ジエポキシオクタン、ビス（スクシン
   イミジル）スベレート又はビス（スルホスクシンイミジ
   ル）スベレートである、特許請求の範囲第７項記載のビ
   オチン標識核酸。 ９、非放射性核酸ハイブリッド形成プローブ用の特許請
   求の範囲第７項又は第８項記載のビオチン標識核酸。 １０、核酸サンプル中において特定の配列を有する標的
   核酸の存在の検知方法であって、サンプルを特許請求の
   範囲第９項記載のビオチン標識核酸プローブ（該プロー
   ブは所望の配列とハイブリッド形成しうる）と接触せし
   め、得られる標的核酸及びプローブのハイブリッド生成
   物を検出することからなる方法。 １１、ハイブリッド生成物が、それを酵素と結合させ、
   結合した酵素の適切な基質に対する作用を検知すること
   によって検出される、特許請求の範囲第１０項記載の方
   法。 １２、酵素が、酵素とアビジン又はストレプトアビジン
   との複合体を用いることによってハイブリッド生成物に
   結合せしめられる、特許請求の範囲第１１項記載の方法
   。 １３、酵素がペルオキシダーゼ又はアルカリホスファタ
   ーゼである、特許請求の範囲第１１項又は第１２項記載
   の方法。 １４、特許請求の範囲第９項記載のビオチン標識核酸プ
   ローブ、並びに標的核酸及びプローブのハイブリッド生
   成物の検出用物質を含む、特許請求の範囲第１０項〜第
   １３項のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキ
   ット。 １５、物質が、ハイブリッド生成物と結合せしめられう
   る酵素複合体及び酵素用基質からなる、特許請求の範囲
   第１４項記載のキット。