JPH0654688A - Dnaの単離方法 - Google Patents
Dnaの単離方法Info
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- JPH0654688A JPH0654688A JP3342874A JP34287491A JPH0654688A JP H0654688 A JPH0654688 A JP H0654688A JP 3342874 A JP3342874 A JP 3342874A JP 34287491 A JP34287491 A JP 34287491A JP H0654688 A JPH0654688 A JP H0654688A
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- xanthate
- isolation
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- forming compound
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/82—Subcellular parts of microorganisms
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 キサントゲン酸エステル形成化合物の水溶液
に、植物、酵母および細菌の細胞を接触させて、該溶液
から細胞破片を濾過し、この濾液にエタノールを加え
て、DNAを沈澱させる。 【効果】 組織をホモゲナイズしたり、タンパク質を除
去することなしに、分子生物学用に適したDNAが得ら
れる。
に、植物、酵母および細菌の細胞を接触させて、該溶液
から細胞破片を濾過し、この濾液にエタノールを加え
て、DNAを沈澱させる。 【効果】 組織をホモゲナイズしたり、タンパク質を除
去することなしに、分子生物学用に適したDNAが得ら
れる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、植物全体および植物細
胞、組織および器官、並びに酵母および細菌からのDN
Aの単離に関するものである。
胞、組織および器官、並びに酵母および細菌からのDN
Aの単離に関するものである。
【0002】
【従来の技術】バイオテクノロジーにおける、DNAフ
ィンガープリント法、制限断片長多型(RFLP)分
析、サザンブロット法、ゲノムライブラリーの構築およ
び形質転換実験の必要性の増加にともなって、高分子量
(HMW)DNAの単離は主要な問題となっている。H
MW DNAの単離のいくつかの方法が報告されてきた
が、それらの全ては、様々な理由で欠点を有する。方法
には一般に細胞の物理的粉砕が含まれ、続いてEDT
A、界面活性剤、トリスおよび他の試薬を含む緩衝液で
の抽出が行われる。使用される試薬のいくつかは、様々
な細胞小器官と反応するが、他の試薬の機能は未知であ
る。従来の技術の方法は、科学というよりもむしろ技術
を必要として、しばしば時間がかかり、再現性がなく、
DNAの収量が変化する。得られるDNAは純度に関し
てもさまざまであり、全ての方法には、ユーザーには危
険になり得る、フェノールすなわち、タンパク質変性剤
によるDNAの精製が含まれる。結局は、ひとつの植物
群で有効なDNAの抽出方法は、他の植物に用いられる
時にはたびたび失敗する。
ィンガープリント法、制限断片長多型(RFLP)分
析、サザンブロット法、ゲノムライブラリーの構築およ
び形質転換実験の必要性の増加にともなって、高分子量
(HMW)DNAの単離は主要な問題となっている。H
MW DNAの単離のいくつかの方法が報告されてきた
が、それらの全ては、様々な理由で欠点を有する。方法
には一般に細胞の物理的粉砕が含まれ、続いてEDT
A、界面活性剤、トリスおよび他の試薬を含む緩衝液で
の抽出が行われる。使用される試薬のいくつかは、様々
な細胞小器官と反応するが、他の試薬の機能は未知であ
る。従来の技術の方法は、科学というよりもむしろ技術
を必要として、しばしば時間がかかり、再現性がなく、
DNAの収量が変化する。得られるDNAは純度に関し
てもさまざまであり、全ての方法には、ユーザーには危
険になり得る、フェノールすなわち、タンパク質変性剤
によるDNAの精製が含まれる。結局は、ひとつの植物
群で有効なDNAの抽出方法は、他の植物に用いられる
時にはたびたび失敗する。
【0003】ごく最近まで、シリカを含有しその表面に
ヒドロキシル基を有する固相抽出材料が、フェノールの
代用としてタンパク質の除去用に報告されてきた。しか
しながら、この材料の調製は面倒であり、組織の粉砕
は、依然として必要である。
ヒドロキシル基を有する固相抽出材料が、フェノールの
代用としてタンパク質の除去用に報告されてきた。しか
しながら、この材料の調製は面倒であり、組織の粉砕
は、依然として必要である。
【0004】これらの難点に関して、これらの問題を解
決し得る有用な方法が、引き続き必要となっている。本
発明の目的はこのような方法を提供することである。
決し得る有用な方法が、引き続き必要となっている。本
発明の目的はこのような方法を提供することである。
【0005】
【発明の構成】理論により制限されることを意図してい
ないが、植物、酵母および細菌からのDNAの単離は、
多糖類に富んだ硬い細胞壁の存在により部分的に難し
く、そのため通常に使用される緩衝液で完全に破壊する
のは難しい。酵素による細胞壁の除去は面倒であり、い
つも可能であるとは限らない。現在の方法を用いた抽出
の繰り返しでのDNAの収量および質の変化は、おそら
く、細胞壁の破壊のいろいろな程度から生ずる。従っ
て、細胞や組織をホモゲナイズすることなしに再現性の
あるDNAの単離をし得る、徹底的であるが限界が定め
られた方法によって細胞壁を破壊する、新しい方法が必
要とされている。
ないが、植物、酵母および細菌からのDNAの単離は、
多糖類に富んだ硬い細胞壁の存在により部分的に難し
く、そのため通常に使用される緩衝液で完全に破壊する
のは難しい。酵素による細胞壁の除去は面倒であり、い
つも可能であるとは限らない。現在の方法を用いた抽出
の繰り返しでのDNAの収量および質の変化は、おそら
く、細胞壁の破壊のいろいろな程度から生ずる。従っ
て、細胞や組織をホモゲナイズすることなしに再現性の
あるDNAの単離をし得る、徹底的であるが限界が定め
られた方法によって細胞壁を破壊する、新しい方法が必
要とされている。
【0006】セルロースを含む多価アルコールは、キサ
ントゲン酸エステルの金属塩への転換により従来は溶解
されてきた。この方法は、1815年にZeiseによ
り発見され、繊維産業では広く用いられてきた。キサン
トゲン酸エステルは、pH条件を調整して、低溶解性お
よび種々の溶解性を利用して、多くの金属イオンを分離
および定量するのに広く適用されることが見いだされて
いる。
ントゲン酸エステルの金属塩への転換により従来は溶解
されてきた。この方法は、1815年にZeiseによ
り発見され、繊維産業では広く用いられてきた。キサン
トゲン酸エステルは、pH条件を調整して、低溶解性お
よび種々の溶解性を利用して、多くの金属イオンを分離
および定量するのに広く適用されることが見いだされて
いる。
【0007】キサントゲン酸エステル形成化合物による
DNA抽出用試薬への、現在ある試薬の代用は、可能で
あり、非常に優れていると、現在では確信されている。
これらの化合物が、植物細胞壁の実質的な部分を構成す
る多糖類のヒドロキシル基と水溶性の多糖キサントゲン
酸エステルを形成することにより植物の細胞壁を溶かす
と考えられてきた。キサントゲン酸エステル形成化合物
とアミンとの反応もまた報告されている。さらに、キサ
ントゲン酸エステル形成化合物はまた、金属イオンに結
合してDNAナーゼ活性を阻害し得る。結果として、こ
れらの化合物は、混入しているタンパク質、金属イオン
および他の化合物を不溶性の残留物として残し、細胞小
器官からDNAを選択的に溶解し得る。次に、DNAは
上清から沈澱され得る。
DNA抽出用試薬への、現在ある試薬の代用は、可能で
あり、非常に優れていると、現在では確信されている。
これらの化合物が、植物細胞壁の実質的な部分を構成す
る多糖類のヒドロキシル基と水溶性の多糖キサントゲン
酸エステルを形成することにより植物の細胞壁を溶かす
と考えられてきた。キサントゲン酸エステル形成化合物
とアミンとの反応もまた報告されている。さらに、キサ
ントゲン酸エステル形成化合物はまた、金属イオンに結
合してDNAナーゼ活性を阻害し得る。結果として、こ
れらの化合物は、混入しているタンパク質、金属イオン
および他の化合物を不溶性の残留物として残し、細胞小
器官からDNAを選択的に溶解し得る。次に、DNAは
上清から沈澱され得る。
【0008】(キサントゲン酸エステル形成化合物)本
発明の”キサントゲン酸エステル形成化合物”には、植
物細胞の細胞壁の多糖類とキサントゲン酸エステル反応
生成物を形成し得るあらゆる化合物が含まれる。これら
には明らかに、二硫化炭素とその有機アルカリ誘導体が
含まれる。この反応(ビスコースレーヨンの方法)の工
業的使用において使用される一般的な試薬は二硫化炭素
であるが、本発明に従うDNAの分析用の単離には、二
硫化炭素の有機アルカリ誘導体がより好ましい。”二硫
化炭素の有機アルカリ誘導体”とは下記の一般式の化合
物を意味する。
発明の”キサントゲン酸エステル形成化合物”には、植
物細胞の細胞壁の多糖類とキサントゲン酸エステル反応
生成物を形成し得るあらゆる化合物が含まれる。これら
には明らかに、二硫化炭素とその有機アルカリ誘導体が
含まれる。この反応(ビスコースレーヨンの方法)の工
業的使用において使用される一般的な試薬は二硫化炭素
であるが、本発明に従うDNAの分析用の単離には、二
硫化炭素の有機アルカリ誘導体がより好ましい。”二硫
化炭素の有機アルカリ誘導体”とは下記の一般式の化合
物を意味する。
【0009】
【化2】
【0010】ここでRは、置換されないか、またはアル
キル基、アルケニル基またはアラルキル基、好ましく
は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、イ
ソアミル、ビニル、アリル、2−3−ジヒドロキシプロ
ピル、フェネチル、4−モルホリニルメチル、およびヒ
ドロキシフェネチルから選択される基で置換され、ここ
でMは、アルカリ金属またはNH4、好ましくはNaま
たはKである。これらの化合物は、対応する水酸化アル
カリとアルコールと反応して形成される。
キル基、アルケニル基またはアラルキル基、好ましく
は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、イ
ソアミル、ビニル、アリル、2−3−ジヒドロキシプロ
ピル、フェネチル、4−モルホリニルメチル、およびヒ
ドロキシフェネチルから選択される基で置換され、ここ
でMは、アルカリ金属またはNH4、好ましくはNaま
たはKである。これらの化合物は、対応する水酸化アル
カリとアルコールと反応して形成される。
【0011】
【化3】
【0012】これらの化合物で最も好ましいのは、カル
ボノジチオイン酸O−エチルエステルであり、そのナト
リウム塩(R=C2H5,M=Na;ナトリウム キサン
トゲン酸エチルエステル)は標準法で調製し得、そのカ
リウムアナログは、Flukaから商業的に入手可能で
ある。本発明における有用な化合物の全クラス(二硫化
炭素を含めて)は、下記の式により表し得る。
ボノジチオイン酸O−エチルエステルであり、そのナト
リウム塩(R=C2H5,M=Na;ナトリウム キサン
トゲン酸エチルエステル)は標準法で調製し得、そのカ
リウムアナログは、Flukaから商業的に入手可能で
ある。本発明における有用な化合物の全クラス(二硫化
炭素を含めて)は、下記の式により表し得る。
【0013】
【化4】
【0014】ここでnは、0または1であり、Rは置換
されないか、またはアルキル基、アルケニル基またはア
ラルキル基、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、
ブチル、ヘキシル、イソアミル、ビニル、アリル、2−
3−ジヒドロキシプロピル、フェネチル、4−モルホリ
ニルメチル、およびヒドロキシフェネチルから選択され
る基で置換され、そしてここでnが1のときはMはアル
カリ金属またはアンモニウム、好ましくはNaまたはK
であり、そしてnが0のときは、炭素への他の結合であ
る。
されないか、またはアルキル基、アルケニル基またはア
ラルキル基、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、
ブチル、ヘキシル、イソアミル、ビニル、アリル、2−
3−ジヒドロキシプロピル、フェネチル、4−モルホリ
ニルメチル、およびヒドロキシフェネチルから選択され
る基で置換され、そしてここでnが1のときはMはアル
カリ金属またはアンモニウム、好ましくはNaまたはK
であり、そしてnが0のときは、炭素への他の結合であ
る。
【0015】本発明は、キサントゲン酸エステル形成化
合物の水溶液に、細胞を接触させる工程を包含する、植
物、酵母および細菌の細胞から、DNAを単離する方法
である。
合物の水溶液に、細胞を接触させる工程を包含する、植
物、酵母および細菌の細胞から、DNAを単離する方法
である。
【0016】本発明の方法は、さらに溶液から細胞破片
を濾過する工程を包含する。
を濾過する工程を包含する。
【0017】本発明の方法は、さらに濾過した溶液から
DNAを沈澱させる工程を包含する。
DNAを沈澱させる工程を包含する。
【0018】これらの化合物を用いる本明細書に記載の
方法は、組織をホモゲナイズしたり、タンパク質を除去
することなく、有効なDNAの単離を可能にする。
方法は、組織をホモゲナイズしたり、タンパク質を除去
することなく、有効なDNAの単離を可能にする。
【0019】
(実施例I)組織を粉砕するプロトコール 13日齢のトウモロコシ若木の新鮮な葉(0.6−0.
63g)を、非常にこわれやすくなるまで液体窒素浴で
凍らせ、ガラス製のホモゲナイザーを用いて細かい粉末
に粉砕した。その粉末を、15mlのプロピレン管中の
4mlの緩衝化抽出試薬(0.0694mM カルボノ
ジチオイン酸O−エチルエステルのナトリウム塩、10
0mM トリス、pH7.5、700mM NaCl、
10mMEDTA)に懸濁した。65℃で5分間インキ
ュベート後、葉の破片を、Miraclothに通して
ホモゲネートを濾過することにより除去した。DNA
は、濾液に2倍容量のエタノールを加えて沈澱させ、4
℃、3000rpmで10分間遠心分離した。沈澱した
タンパク質とキサントゲン酸エステルの金属塩を除去す
る前に、ペレットを100μlのTE中に懸濁させ、3
分間遠心分離した。上清を1.5mlのエッペンドルフ
チューブに移して5分間遠心分離した。DNAを、2M
のNH4OAcで調整し、エタノールを2倍容量加える
ことにより再び上清から沈澱させた。DNAを、735
gで5分間遠心分離してペレットにした。上清をデカン
テーションして除いた後、ペレットをスピード真空機
(speed vac)で乾燥し、100μlのTE緩
衝液に再溶解した。DNAの収量は20−40μgであ
った。
63g)を、非常にこわれやすくなるまで液体窒素浴で
凍らせ、ガラス製のホモゲナイザーを用いて細かい粉末
に粉砕した。その粉末を、15mlのプロピレン管中の
4mlの緩衝化抽出試薬(0.0694mM カルボノ
ジチオイン酸O−エチルエステルのナトリウム塩、10
0mM トリス、pH7.5、700mM NaCl、
10mMEDTA)に懸濁した。65℃で5分間インキ
ュベート後、葉の破片を、Miraclothに通して
ホモゲネートを濾過することにより除去した。DNA
は、濾液に2倍容量のエタノールを加えて沈澱させ、4
℃、3000rpmで10分間遠心分離した。沈澱した
タンパク質とキサントゲン酸エステルの金属塩を除去す
る前に、ペレットを100μlのTE中に懸濁させ、3
分間遠心分離した。上清を1.5mlのエッペンドルフ
チューブに移して5分間遠心分離した。DNAを、2M
のNH4OAcで調整し、エタノールを2倍容量加える
ことにより再び上清から沈澱させた。DNAを、735
gで5分間遠心分離してペレットにした。上清をデカン
テーションして除いた後、ペレットをスピード真空機
(speed vac)で乾燥し、100μlのTE緩
衝液に再溶解した。DNAの収量は20−40μgであ
った。
【0020】(実施例II)粉砕しないプロトコール カルボノジチオイン酸O−エチルエステルのナトリウム
塩を含む抽出緩衝液4ml中で、1gの新鮮な葉を20
分間、65℃でインキュベートし、そして濾過する。D
NAを濾液から沈澱させ、上記のように再沈澱させる。
トウモロコシに適用したこの粉砕しない方法では、葉の
組織1g当り2.56から6.68μgのDNAの収量
であった。
塩を含む抽出緩衝液4ml中で、1gの新鮮な葉を20
分間、65℃でインキュベートし、そして濾過する。D
NAを濾液から沈澱させ、上記のように再沈澱させる。
トウモロコシに適用したこの粉砕しない方法では、葉の
組織1g当り2.56から6.68μgのDNAの収量
であった。
【0021】(実施例III)実施例IおよびIIのプ
ロトコールを評価するために、単離されたDNAを、B
amHIとHindIIIとで、およびEcoRIとS
stIとで6時間消化し、アガロースゲル電気泳動によ
り分析した。消化されなかったDNAは、23kbであ
るλマーカーよりも明らかに大きい分子量を示した。消
化されたサンプルにおいて高分子量DNAが存在しない
ことおよびスミアの存在は、DNAが完全に消化され、
制限酵素の消化を妨害する不純物のないことを示唆して
いる。
ロトコールを評価するために、単離されたDNAを、B
amHIとHindIIIとで、およびEcoRIとS
stIとで6時間消化し、アガロースゲル電気泳動によ
り分析した。消化されなかったDNAは、23kbであ
るλマーカーよりも明らかに大きい分子量を示した。消
化されたサンプルにおいて高分子量DNAが存在しない
ことおよびスミアの存在は、DNAが完全に消化され、
制限酵素の消化を妨害する不純物のないことを示唆して
いる。
【0022】(実施例IV)DNA調製物の質は、サザ
ンブロット法によりさらに評価される。単離されたDN
AをBamHIで消化し、電気泳動にかけてMSI膜に
移動し、32pシングルコピープローブにハイブリダイ
ズさせた。
ンブロット法によりさらに評価される。単離されたDN
AをBamHIで消化し、電気泳動にかけてMSI膜に
移動し、32pシングルコピープローブにハイブリダイ
ズさせた。
【0023】未消化および消化されたDNAは、予想さ
れたハイブリダイゼーションパターンを与えた。消化さ
れたサンプルの展開したバンドの外観は、DNAが完全
に酵素により消化され、プローブのハイブリダイゼーシ
ョンが成功したことを確証した。これは、DNAの質に
は重要な基準である。
れたハイブリダイゼーションパターンを与えた。消化さ
れたサンプルの展開したバンドの外観は、DNAが完全
に酵素により消化され、プローブのハイブリダイゼーシ
ョンが成功したことを確証した。これは、DNAの質に
は重要な基準である。
【0024】(実施例V)分子生物学に適用するために
単離したDNAの質をさらに確実にするために、抽出し
たDNAを、複製連鎖反応(PCR)により分析した。
単離の後、DNAを増幅し、生成物をアガロースゲル上
にかけた。コントロールの実験はまた、鋳型DNAをP
CR反応に含めないで行った。コントロールでは、予測
される目的のバンドがないこと、および前述のプロトコ
ールにより得たDNAサンプルではそのバンドが存在す
ることによって、さらにDNAの質を確実にした。
単離したDNAの質をさらに確実にするために、抽出し
たDNAを、複製連鎖反応(PCR)により分析した。
単離の後、DNAを増幅し、生成物をアガロースゲル上
にかけた。コントロールの実験はまた、鋳型DNAをP
CR反応に含めないで行った。コントロールでは、予測
される目的のバンドがないこと、および前述のプロトコ
ールにより得たDNAサンプルではそのバンドが存在す
ることによって、さらにDNAの質を確実にした。
【0025】(実施例VI)これらの抽出操作での収量
および効率は、粉砕するプロトコールでテストした。ホ
モゲナイズするのに先だって葉のサンプルにDNAの既
知の量(20μg)を加え、その後同様の工程を行っ
て、最終工程で少なくとも81%のDNAの収量があっ
た。このことは、酵素または機械的分解によるDNAの
損失が最小であることを示唆した。
および効率は、粉砕するプロトコールでテストした。ホ
モゲナイズするのに先だって葉のサンプルにDNAの既
知の量(20μg)を加え、その後同様の工程を行っ
て、最終工程で少なくとも81%のDNAの収量があっ
た。このことは、酵素または機械的分解によるDNAの
損失が最小であることを示唆した。
【0026】(実施例VII−XII)この粉砕する方
法はさらに、アガロースゲル電気泳動およびサザンブロ
ット法により測定されたようにダイズ、モロコシ類、ヒ
マワリ、ムラサキウマゴヤシおよびタバコの13日齢の
若木からのDNAの単離にうまく用いられた。結果を表
1に示す。
法はさらに、アガロースゲル電気泳動およびサザンブロ
ット法により測定されたようにダイズ、モロコシ類、ヒ
マワリ、ムラサキウマゴヤシおよびタバコの13日齢の
若木からのDNAの単離にうまく用いられた。結果を表
1に示す。
【0027】
【表1】
【0028】(実施例XIII−XXIV)これらの2
つの方法(粉砕するおよび粉砕しない)の融通性を、さ
らに、ムラサキウマゴヤシ、オオムギ、カノラ、モロコ
シ類、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コムギ、ペチュニ
ア、ホウレンソウ、酵母およびE.coliで比較し
た。酵母およびE.coliについては、粉砕するプロ
トコールでのホモゲナイゼーションは省略した。表2は
DNAの収量を示す。
つの方法(粉砕するおよび粉砕しない)の融通性を、さ
らに、ムラサキウマゴヤシ、オオムギ、カノラ、モロコ
シ類、ダイズ、ヒマワリ、タバコ、コムギ、ペチュニ
ア、ホウレンソウ、酵母およびE.coliで比較し
た。酵母およびE.coliについては、粉砕するプロ
トコールでのホモゲナイゼーションは省略した。表2は
DNAの収量を示す。
【0029】
【表2】
【0030】(実施例XXV−XIX)本発明の方法
は、さらに以下の植物からのDNAの単離でもうまく適
用された。
は、さらに以下の植物からのDNAの単離でもうまく適
用された。
【0031】
【表3】
【0032】粉砕しない方法の容易さは、DNA単離の
自動化および専門家以外によるDNA単離が要求される
分析および診断法の分野での使用を容易にし得る。本発
明の粉砕する方法の広い適用性は、植物細胞からのDN
A単離の一般方法としての可能性がある。抽出は、種々
の濃度および量の緩衝液を用いた、さまざまなpH下
で、異なる濃度の基質を用いて、様々な温度で試みられ
てきた。粉砕しない方法による、2mlの緩衝液/試薬
を用いてのムラサキウマゴヤシ、トウモロコシ、モロコ
シ類およびレタスは、DNAの高い収量と質を与えた。
一方では、キサントゲン酸エチルエステルナトリウムを
用いたダイズ、ヒマワリおよびコムギからのDNAの単
離は、清浄なDNAを得るのに2倍の量を必要とした。
カノラ、タバコおよびペチュニアでは、インキュベーシ
ョンの前にやや穏やかにホモゲナイズすることが、より
よいDNAの質および収量を得るのに役だった。従っ
て、本発明の方法の多くの特定の実施例は、配慮の下
に、特定のインビボまたはインビトロ系に適用するよう
に効果的に利用し得る。
自動化および専門家以外によるDNA単離が要求される
分析および診断法の分野での使用を容易にし得る。本発
明の粉砕する方法の広い適用性は、植物細胞からのDN
A単離の一般方法としての可能性がある。抽出は、種々
の濃度および量の緩衝液を用いた、さまざまなpH下
で、異なる濃度の基質を用いて、様々な温度で試みられ
てきた。粉砕しない方法による、2mlの緩衝液/試薬
を用いてのムラサキウマゴヤシ、トウモロコシ、モロコ
シ類およびレタスは、DNAの高い収量と質を与えた。
一方では、キサントゲン酸エチルエステルナトリウムを
用いたダイズ、ヒマワリおよびコムギからのDNAの単
離は、清浄なDNAを得るのに2倍の量を必要とした。
カノラ、タバコおよびペチュニアでは、インキュベーシ
ョンの前にやや穏やかにホモゲナイズすることが、より
よいDNAの質および収量を得るのに役だった。従っ
て、本発明の方法の多くの特定の実施例は、配慮の下
に、特定のインビボまたはインビトロ系に適用するよう
に効果的に利用し得る。
【0033】キサントゲン酸エチルエステルナトリウム
/カリウムのようなキサントゲン酸エステル形成化合物
を用いる、植物、酵母および細菌からの高分子量DNA
の単離方法が開示されている。この方法ではタンパク質
を除去することなく、PCRおよびサザンブロット法の
両方に適した清浄なDNAが得られる。この方法は、組
織をホモゲナイズすることなく、小規模での使用が可能
である。これらの特徴はまた、分子生物学の労働集約型
技術の一つである、植物組織サンプルの自動化されたス
クリーニングを容易にする。さらに、この方法は、当分
野の使用に適用され得る。
/カリウムのようなキサントゲン酸エステル形成化合物
を用いる、植物、酵母および細菌からの高分子量DNA
の単離方法が開示されている。この方法ではタンパク質
を除去することなく、PCRおよびサザンブロット法の
両方に適した清浄なDNAが得られる。この方法は、組
織をホモゲナイズすることなく、小規模での使用が可能
である。これらの特徴はまた、分子生物学の労働集約型
技術の一つである、植物組織サンプルの自動化されたス
クリーニングを容易にする。さらに、この方法は、当分
野の使用に適用され得る。
Claims (7)
- 【請求項1】キサントゲン酸エステル形成化合物の水溶
液に細胞を接触させる工程を包含する、植物、酵母およ
び細菌の細胞からDNAを単離する方法。 - 【請求項2】前記キサントゲン酸エステル形成化合物が
式 【化1】 を有し、ここで、nが0または1のとき、Rは置換され
ないか、または低級アルキル、低級アルケニルまたはア
ラルキルで置換され、そしてnが1のとき、Mはアルカ
リ金属またはアンモニウムであり、そしてnが0のと
き、イオウ−炭素結合である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】nが1であって、Rが置換されないか、ま
たは低級アルキルで置換され、そしてMがNaまたはK
である、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】Rが、メチル、エチル、プロピル、ブチ
ル、ヘキシル、イソアミルおよび2−3−ジヒドロキシ
プロピルからなる群から選択される、請求項3に記載の
方法。 - 【請求項5】キサントゲン酸エステル形成化合物がカル
ボノジチオイン酸O−エチルエステルのナトリウム塩ま
たはカリウム塩である、請求項4に記載の方法。 - 【請求項6】さらに、溶液から細胞破片を濾過する工程
を包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】さらに、濾過した溶液からエタノールでD
NAを沈澱させる工程を包含する、請求項2に記載の方
法。
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US634,256 | 1990-12-26 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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---|---|---|---|
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AU635207B2 (en) * | 1989-05-22 | 1993-03-18 | Genetics Institute Inc. | Improved composition for isolating and purifying nucleic acid and improved method using same |
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- 1991-11-07 NZ NZ240503A patent/NZ240503A/en unknown
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- 1991-12-24 EP EP91312018A patent/EP0493115B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-24 DK DK91312018.4T patent/DK0493115T3/da active
- 1991-12-24 AT AT91312018T patent/ATE125296T1/de active
- 1991-12-24 DE DE69111406T patent/DE69111406T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-24 ES ES91312018T patent/ES2077187T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-25 JP JP3342874A patent/JP2527510B2/ja not_active Expired - Lifetime
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPH07508422A (ja) * | 1993-03-23 | 1995-09-21 | パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル,インコーポレイテッド | Dnaの単離方法 |
JP2619228B2 (ja) * | 1993-03-23 | 1997-06-11 | パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル,インコーポレイテッド | Dnaの単離方法 |
JP2010075152A (ja) * | 2008-09-29 | 2010-04-08 | Forestry & Forest Products Research Institute | 木材のdnaを分析するための前処理方法 |
JP2013545964A (ja) * | 2010-09-15 | 2013-12-26 | ビーエーエスエフ プラント サイエンス カンパニー ゲーエムベーハー | 生物学的サンプルから成分を抽出するための抽出デバイス及び方法 |
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---|---|
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US5204246A (en) | 1993-04-20 |
HU209858B (en) | 1994-11-28 |
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EP0493115A3 (en) | 1993-02-24 |
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Legal Events
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A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19960422 |