JPH0310686A

JPH0310686A - 核酸単離用水性組成物

Info

Publication number: JPH0310686A
Application number: JP14776589A
Authority: JP
Inventors: Ee Debonbiiiru Deibitsuto; デイビット・エー・デボンビィール; Ii Raideru Gerarudo; ゲラルド・イー・ライデル
Original assignee: Kurabo Industries Ltd; Kurashiki Spinning Co Ltd
Current assignee: Kurabo Industries Ltd; Kurashiki Spinning Co Ltd
Priority date: 1989-06-08
Filing date: 1989-06-08
Publication date: 1991-01-18
Anticipated expiration: 2009-01-05
Also published as: JPH0667B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野この発明は、真核細胞、原核細胞およびウィルスの培養
物から核酸を単離精製するのに有用な試薬組成物に関す
る。

従来の技術バイオテクノロジーの分野においては、核酸フラグメン
トは一般に原核細胞、真核細胞およびウィルスの培養物
から単離される。これらのフラグメントの単離によって
それらの塩基配列分析が可能となり、また、該フラグメ
ントは診断もしくは他の研究用のプローブおよび全タン
パク質らしくはポリペプチドをコード化する遺伝子との
組換え等に利用できる。従来から、核酸は界面活性剤（
例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、５ＤＳ）および塩溶
液（例えば、酢酸カリウム）の存在下で溶菌させ、次い
でフェノールらしくはクロロホルムまたはこれらの混合
物を用いて抽出（除タンパク質処Ｉ’Ｉりすることによ
ってタンパク質夾雑物（例えば、細菌やウィルスの培養
物）から単離されている。

これらの方法においては、核酸は、細胞らしくはウィル
ス培養物の脂質およびタンパク質夾雑物から一般に沈澱
処理によって分離される。

細菌培養物からプラスミドＤＮＡを単離するこの種の常
用法はビルンボイム（Ｈ，Ｃ，Ｂ　ｉｒｎｂｏｉｍ）と
ドリー（Ｊ、Ｄｏｌｙ）の報文に記載されている［［ア
・ラビッド・アルカライン・エクストラクンヨン・プロ
セノユア・フォー・スクリーニング・レコンピナント・
プラスミド・デイ−・エヌ・エイ（ＡＲａｐｉｄ　Ａｌ
ｋａｌｉｎｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｄｕ
ｒｅ　ｆｏｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ）Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、第７巻、第１５１３頁〜第１
５２３頁（１９７９年）参照］。通常の方法では２つの
工程、即ち溶菌工程と除タンパク質工程は、前者で用い
る試薬と後者で用いる試薬が混和しないので別々におこ
なわれる。従って、溶菌と夾雑物からの核酸の除タンパ
ク質には２工程の操作が必要である。

発明が解決しようとする課題この発明はこれらの工程を１工程でおこなうことができ
るようにする新規な試薬組成物を提供するためになされ
たものである。

課題を解決するための手段即ち本発明は、細胞もしくはウィルスの培養物から核酸
を単離するのに有用な単一相で安定な水性組成物であっ
て、酢酸カリウム約１．６〜２．４Ｍ１フ工ノール約５
〜１５重量％、クロロホルム約５〜１５重量％、および
該組成物のｐＨを３．５〜５５にするのに充分な量の酢
酸を含有し、酢酸カリウム４容量部に対して、フェノー
ルとクロロホルムの合計量が１〜３容量部である核酸単
離用水性組成物に関する。

本発明によれば、種々の核酸単離法において利用される
安定で単一相の水性組成物が提供される。

該組成においては、通常は水と混和しない抽出試薬が、
水性の溶菌試薬中に完全に溶解し、安定な試薬組成とな
る。

即ち本発明によれば、酢酸カリウム約１．６〜３．２Ｍ
、フェノール約５〜１５重量％、クロロホルム約５〜１
５重量％および系のｐ■１を３．５〜５５にするのに充
分な量の酢酸を含有する安定な単一川水性組成物か提供
される。本発明による組成物は所望により、イソアミル
アルコール０〜約１．２重量％および／または８−ヒド
ロキノキノリン０〜約０．１２重量％含有していてもよ
い。

該組成物の必須成分である酢酸カリウムおよびフェノー
ル／クロロホルムの望ましい配合比は、酢酸カリウム４
容量部に対してフェノールとクロロホルムの全全約１〜
３容へ１部である。該配合比の好ましい値は４．１であ
る。一つの望ましい組成物は、酢酸カリウム２．４Ｍ、
酢酸１０Ｍ、、フェノールｌＯ％、クロロホルム１０％
、イソアミルアルコール０．２％およびヒドロキシキノ
リン００２％含有するｐＨ５の組成物である。より好ま
しい組成物は、５Ｍ酢酸カリウム６「１１クロロホルム
１２１１２、酢酸４０ｘ（１，フェノール１２村、イソ
アミルアルコール１ｘＣおよび８−ヒドロキシキノリン
０．０１２９含有するｐＨ５の溶液である。

上記の試剤組成物の驚くべき点は、フェノールの溶解度
を変化させることである。この理由は、上記成分の組合
せによって酢酸カリウム溶液のイオン強度が変化して該
溶液とフェノールとが混和して長期間にわたって安定な
状態になると考えられている。該試剤組成物は室温（２
５°Ｃ）で少なくとも３０日間は安定であり、少なくと
も６０日間にわたって安定に保存できる。

本発明による上記の安定な組成物は、細菌培養物からの
プラスミドＤＮＡの精製およびバクテリオファージＭ＋
３からの一本鎖鋳型ＤＮＡの単離を含む種々の標準的な
りＮＡの単離操作において有用である。この場合、数種
類の溶菌試剤と抽出試剤か該組成物によって置き換えら
れる。本発明による組成物はまた、原核細胞以外の他の
組織源、例えば真核細胞からのＤＮＡやＲＮＡの単離に
関して当該分野において既知の標準的な溶菌と抽出技術
の代わりにも利用できる。

本発明による試剤組成物は手動によるＤＮＡの単離操作
、例えばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの文献、即
ち［−モレキュラー・クローニングーア・ラボラトリ−
’？二５アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣｔｏｎｉｎｇＡ
、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ、Ｃｏ１
ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（１９８２年）にａａ載されている単離操作等、または
自動単離操作、例えば以下の実施例２に記載された単離
操作等に利用してらよい。いずれのタイプの単離操作に
おいても、本発明による組成物を使用することによって
、単離される核酸の収量が有効に増加するだけでなく、
該組成物が溶菌作用と除タンパク質作用を併せ持−〕た
めに操操作率が改良される。

本発明にｊ〜る試剤組成物は安定であるので、核酸の単
離操作において有用な試剤キットの一部として利用して
もよい。あるいは、該組成物は自動単離装置に使用可能
な容器、例えば自動単離装置に着脱可能な容器内で利用
してもよい。

以下の実施例においては、本発明による組成物の好まし
い態様および核酸の自動単離法におけるその使用につい
て説明する。

夫皺眸Ｖ試薬組成物の調製５Ｍ酢酸カリウム４８Ｒ１２を氷酢酸３２肩Ｑと混合す
ることによって第１溶液を調製する（酢酸カリウムと酢
酸との容量比は３：２にするのが好ましい）。フェノー
ル９　、９　ｘＱに８−ヒドロキシキノリン０．１重量
％、クロロホルム９．９１およびイソアミルアルコール
０　、２　ｘＱをこの順序で添加して第２溶液を調製す
る。上記２種の溶液を混合することによって、安定な単
一相組成物（ｐＨ５）を得る。

実施例２細菌菌体からのプラスミドＤＮＡの単離５０８Ｍ培地（
マニアチスらの前記文献、第６９頁参照）　５　肩Ｑに
大腸菌、１Ｍ１０１株およびＭ１３＋ｏｐＩ９バクテリ
オファージを接種し、３７°Ｃで一夜培養する。菌体を
３００　Ｏｒｐｍで１０分間の遠心分離処理に付ｔこと
によって沈澱させる。培地を流し去った後、残存するベ
レットを５０１１ＩＭグルコース、Ｉ　ＯｍＭ　ＥＤ’
ｒＡおよびｌｏｍＭ　　トＪス塩酸を含有する溶液（ｐ
！（７，５）０．３ｚＱ中にｉＩＳ懸蜀させ、室温で渦
巻状の撹拌を２分間おこなう。次いで、１％ＳＤＳを含
む０　、２　Ｎ　　Ｎ　ａ　ＯＨＯ，６ｒｐＱを添加し
、該溶液を室温で１５秒間穏やかに渦巻状の撹拌をおこ
なった後、３０秒間放置し、さらに穏やかに渦巻状の撹
拌を１５秒問おこなう。

この溶液に実施例１で調製１．た組成物０．５４ｗＱを
添加する。この混合物を穏やかに渦巻状の撹拌処理に１
５秒間付し、３０秒間放置した後、１５秒間の渦巻状の
撹拌処理に付し、次いで３０００ｒｐｌＴ＋で１５分間
の遠心分離処理に付す。

得られた上澄みを、孔径０，８ミクロンの酢酸セルロー
ス製フィルターおよび５ｊＩＲのレシーバ−管を備えた
試験管（シュリーヒャー・アンド・シュエル社製）に移
す。該試験管内へイソプロパツールＬ、３ｍ（ｌを添加
し、穏やかな渦巻状の撹拌処理をおこなった後、室温で
２分間放置する。試験管内の内容物を室温下、３０００
　ｒｐｍで４分間の遠心分離処理に付すことによってＤ
ＮＡをフィルターに付着させる。ＤＮＡをフィルターと
に付着させた状態で、７０％エタノール０　、５　ｘ（
ｌを試験管内へ入れ、遠心分離処理をさらに２分間おこ
なう。

この処理操作を３回以上繰り返ケことによって夾雑物を
完全に除去する。

レンーバー管を除去し、ふたのないエッペンドルフ管（
１，５＋（りを取り付ける。ｌｏｌＩＭ）リス塩酸（ｐ
＋−［８，０）ＩｍＭ　ＥＤＴＡおよび２０ｕ９／Ｒ（
ＩＲＮアーゼＡを含有する試薬溶液０　、　ｌ　ｙＱを
該管内へ入れ、室温で３０分間反応することによってＤ
　Ｎ　Ａをフィルターから溶出させる。該管とその内容
物を室温下、３０００　ｒｐｍで４分間の遠心分熱処理
に付す。

得られた溶出液ＩＯμｇを別のエッペンドルフ管内に入
れる。ＩＯＸ　　ＥｃｏＲ［ｌ衝液［ニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ　１
ｏｌａｂｓ）調相、２ｕＱをＥｃｏＲ１制限酵素ｌユニ
ットと共に添加し、得られた溶液を３７℃で２時間反応
する。ＤＮＡフラグメント含有溶液をゲル電気泳動法に
よって分析し、７　、２　Ｋｂの線状Ｍ１３ｍｐ１９ベ
クターＤＮＡを確認する。

マニアチスらの前記文献に記載された方法によって同じ
培養物を精製したところ、本発明による組成物を用いる
上記方法の場合と同じ結果が得られることがゲル電気泳
動法による分析データにより確認されたが、自動化され
た操作に本発明による組成物を使用することによって節
約される時間は約１０〜１５％であった。さらに、手動
および自動ＤＮＡプラスミド単離法に本発明による組成
物を使用することによって、単離されるＤＮＡフラグメ
ントの収量は著しく高くなる。

本発明による組成物は当業者であれば適宜修正変更する
ことができ、このような態様も本発明に包含されるもの
である。

発明の効果本発明によれば、従来２工程でおこなわれていた溶菌と
除タンパク質処理を１工程でおこなうことかできるので
、核酸の分子およびフラグメントの単離操作が簡単化さ
れるだけでなく、核酸の単離収量か従来法に比べて著し
く増加する。

Claims

【特許請求の範囲】１、細胞もしくはウィルスの培養物から核酸を単離する
のに有用な単一相で安定な水性組成物であって、酢酸カ
リウム約１．６〜２．４Ｍ、フェノール約５〜１５重量
％、クロロホルム約５〜１５重量％、および該組成物の
ｐＨを３．５〜５．５にするのに充分な量の酢酸を含有
し、上記酢酸カリウム溶液４容量部に対して、フェノー
ルとクロロホルムの合計量が１〜３容量部である核酸単
離用水性組成物。２、イソアミルアルコール０〜約１．２重量％およびヒ
ドロキシキノリン０〜約０．１２重量％をさらに含有す
る請求項１記載の組成物。３、酢酸カリウム２．４Ｍ、酢酸１０Ｍ、フェノール１
０重量％、クロロホルム１０重量％、イソアミルアルコ
ール０．２重量％およびヒドロキシキノリン０．０２重
量％含有する請求項１記載の組成物。４、請求項１記載の組成物を含有する、細胞もしくはウ
ィルスの培養物からＤＮＡを単離する方法において有用
な試薬キット。５、請求項１記載の組成物を含有する、細胞の培養物か
らＤＮＡを自動的に単離する装置に使用可能な容器。６、細胞を溶解させ、タンパク質夾雑物から核酸を抽出
することによって核酸を単離する方法において、請求項
１記載の組成物を使用することを特徴とする核酸の単離
方法。