JPH0310686A - 核酸単離用水性組成物 - Google Patents
核酸単離用水性組成物Info
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- JPH0310686A JPH0310686A JP14776589A JP14776589A JPH0310686A JP H0310686 A JPH0310686 A JP H0310686A JP 14776589 A JP14776589 A JP 14776589A JP 14776589 A JP14776589 A JP 14776589A JP H0310686 A JPH0310686 A JP H0310686A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、真核細胞、原核細胞およびウィルスの培養
物から核酸を単離精製するのに有用な試薬組成物に関す
る。
物から核酸を単離精製するのに有用な試薬組成物に関す
る。
従来の技術
バイオテクノロジーの分野においては、核酸フラグメン
トは一般に原核細胞、真核細胞およびウィルスの培養物
から単離される。これらのフラグメントの単離によって
それらの塩基配列分析が可能となり、また、該フラグメ
ントは診断もしくは他の研究用のプローブおよび全タン
パク質らしくはポリペプチドをコード化する遺伝子との
組換え等に利用できる。従来から、核酸は界面活性剤(
例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、5DS)および塩溶
液(例えば、酢酸カリウム)の存在下で溶菌させ、次い
でフェノールらしくはクロロホルムまたはこれらの混合
物を用いて抽出(除タンパク質処I’Iりすることによ
ってタンパク質夾雑物(例えば、細菌やウィルスの培養
物)から単離されている。
トは一般に原核細胞、真核細胞およびウィルスの培養物
から単離される。これらのフラグメントの単離によって
それらの塩基配列分析が可能となり、また、該フラグメ
ントは診断もしくは他の研究用のプローブおよび全タン
パク質らしくはポリペプチドをコード化する遺伝子との
組換え等に利用できる。従来から、核酸は界面活性剤(
例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、5DS)および塩溶
液(例えば、酢酸カリウム)の存在下で溶菌させ、次い
でフェノールらしくはクロロホルムまたはこれらの混合
物を用いて抽出(除タンパク質処I’Iりすることによ
ってタンパク質夾雑物(例えば、細菌やウィルスの培養
物)から単離されている。
これらの方法においては、核酸は、細胞らしくはウィル
ス培養物の脂質およびタンパク質夾雑物から一般に沈澱
処理によって分離される。
ス培養物の脂質およびタンパク質夾雑物から一般に沈澱
処理によって分離される。
細菌培養物からプラスミドDNAを単離するこの種の常
用法はビルンボイム(H,C,B irnboim)と
ドリー(J、Doly)の報文に記載されている[[ア
・ラビッド・アルカライン・エクストラクンヨン・プロ
セノユア・フォー・スクリーニング・レコンピナント・
プラスミド・デイ−・エヌ・エイ(ARapid Al
kaline Extraction Procedu
re forScreening Recombina
nt Plasmid DNA)J、Nucleic
Ac1ds Res、 、第7巻、第1513頁〜第1
523頁(1979年)参照]。通常の方法では2つの
工程、即ち溶菌工程と除タンパク質工程は、前者で用い
る試薬と後者で用いる試薬が混和しないので別々におこ
なわれる。従って、溶菌と夾雑物からの核酸の除タンパ
ク質には2工程の操作が必要である。
用法はビルンボイム(H,C,B irnboim)と
ドリー(J、Doly)の報文に記載されている[[ア
・ラビッド・アルカライン・エクストラクンヨン・プロ
セノユア・フォー・スクリーニング・レコンピナント・
プラスミド・デイ−・エヌ・エイ(ARapid Al
kaline Extraction Procedu
re forScreening Recombina
nt Plasmid DNA)J、Nucleic
Ac1ds Res、 、第7巻、第1513頁〜第1
523頁(1979年)参照]。通常の方法では2つの
工程、即ち溶菌工程と除タンパク質工程は、前者で用い
る試薬と後者で用いる試薬が混和しないので別々におこ
なわれる。従って、溶菌と夾雑物からの核酸の除タンパ
ク質には2工程の操作が必要である。
発明が解決しようとする課題
この発明はこれらの工程を1工程でおこなうことができ
るようにする新規な試薬組成物を提供するためになされ
たものである。
るようにする新規な試薬組成物を提供するためになされ
たものである。
課題を解決するための手段
即ち本発明は、細胞もしくはウィルスの培養物から核酸
を単離するのに有用な単一相で安定な水性組成物であっ
て、酢酸カリウム約1.6〜2.4M1フ工ノール約5
〜15重量%、クロロホルム約5〜15重量%、および
該組成物のpHを3.5〜55にするのに充分な量の酢
酸を含有し、酢酸カリウム4容量部に対して、フェノー
ルとクロロホルムの合計量が1〜3容量部である核酸単
離用水性組成物に関する。
を単離するのに有用な単一相で安定な水性組成物であっ
て、酢酸カリウム約1.6〜2.4M1フ工ノール約5
〜15重量%、クロロホルム約5〜15重量%、および
該組成物のpHを3.5〜55にするのに充分な量の酢
酸を含有し、酢酸カリウム4容量部に対して、フェノー
ルとクロロホルムの合計量が1〜3容量部である核酸単
離用水性組成物に関する。
本発明によれば、種々の核酸単離法において利用される
安定で単一相の水性組成物が提供される。
安定で単一相の水性組成物が提供される。
該組成においては、通常は水と混和しない抽出試薬が、
水性の溶菌試薬中に完全に溶解し、安定な試薬組成とな
る。
水性の溶菌試薬中に完全に溶解し、安定な試薬組成とな
る。
即ち本発明によれば、酢酸カリウム約1.6〜3.2M
、フェノール約5〜15重量%、クロロホルム約5〜1
5重量%および系のp■1を3.5〜55にするのに充
分な量の酢酸を含有する安定な単一川水性組成物か提供
される。本発明による組成物は所望により、イソアミル
アルコール0〜約1.2重量%および/または8−ヒド
ロキノキノリン0〜約0.12重量%含有していてもよ
い。
、フェノール約5〜15重量%、クロロホルム約5〜1
5重量%および系のp■1を3.5〜55にするのに充
分な量の酢酸を含有する安定な単一川水性組成物か提供
される。本発明による組成物は所望により、イソアミル
アルコール0〜約1.2重量%および/または8−ヒド
ロキノキノリン0〜約0.12重量%含有していてもよ
い。
該組成物の必須成分である酢酸カリウムおよびフェノー
ル/クロロホルムの望ましい配合比は、酢酸カリウム4
容量部に対してフェノールとクロロホルムの全全約1〜
3容へ1部である。該配合比の好ましい値は4.1であ
る。一つの望ましい組成物は、酢酸カリウム2.4M、
酢酸10M、、フェノールlO%、クロロホルム10%
、イソアミルアルコール0.2%およびヒドロキシキノ
リン002%含有するpH5の組成物である。より好ま
しい組成物は、5M酢酸カリウム6「11クロロホルム
12112、酢酸40x(1,フェノール12村、イソ
アミルアルコール1xCおよび8−ヒドロキシキノリン
0.0129含有するpH5の溶液である。
ル/クロロホルムの望ましい配合比は、酢酸カリウム4
容量部に対してフェノールとクロロホルムの全全約1〜
3容へ1部である。該配合比の好ましい値は4.1であ
る。一つの望ましい組成物は、酢酸カリウム2.4M、
酢酸10M、、フェノールlO%、クロロホルム10%
、イソアミルアルコール0.2%およびヒドロキシキノ
リン002%含有するpH5の組成物である。より好ま
しい組成物は、5M酢酸カリウム6「11クロロホルム
12112、酢酸40x(1,フェノール12村、イソ
アミルアルコール1xCおよび8−ヒドロキシキノリン
0.0129含有するpH5の溶液である。
上記の試剤組成物の驚くべき点は、フェノールの溶解度
を変化させることである。この理由は、上記成分の組合
せによって酢酸カリウム溶液のイオン強度が変化して該
溶液とフェノールとが混和して長期間にわたって安定な
状態になると考えられている。該試剤組成物は室温(2
5°C)で少なくとも30日間は安定であり、少なくと
も60日間にわたって安定に保存できる。
を変化させることである。この理由は、上記成分の組合
せによって酢酸カリウム溶液のイオン強度が変化して該
溶液とフェノールとが混和して長期間にわたって安定な
状態になると考えられている。該試剤組成物は室温(2
5°C)で少なくとも30日間は安定であり、少なくと
も60日間にわたって安定に保存できる。
本発明による上記の安定な組成物は、細菌培養物からの
プラスミドDNAの精製およびバクテリオファージM+
3からの一本鎖鋳型DNAの単離を含む種々の標準的な
りNAの単離操作において有用である。この場合、数種
類の溶菌試剤と抽出試剤か該組成物によって置き換えら
れる。本発明による組成物はまた、原核細胞以外の他の
組織源、例えば真核細胞からのDNAやRNAの単離に
関して当該分野において既知の標準的な溶菌と抽出技術
の代わりにも利用できる。
プラスミドDNAの精製およびバクテリオファージM+
3からの一本鎖鋳型DNAの単離を含む種々の標準的な
りNAの単離操作において有用である。この場合、数種
類の溶菌試剤と抽出試剤か該組成物によって置き換えら
れる。本発明による組成物はまた、原核細胞以外の他の
組織源、例えば真核細胞からのDNAやRNAの単離に
関して当該分野において既知の標準的な溶菌と抽出技術
の代わりにも利用できる。
本発明による試剤組成物は手動によるDNAの単離操作
、例えばマニアチス(Maniatis)らの文献、即
ち[−モレキュラー・クローニングーア・ラボラトリ−
’?二5アル(Molecular CtoningA
、 Laboratory Manual)J、Co1
d SpringHarber Laboratory
(1982年)にaa載されている単離操作等、または
自動単離操作、例えば以下の実施例2に記載された単離
操作等に利用してらよい。いずれのタイプの単離操作に
おいても、本発明による組成物を使用することによって
、単離される核酸の収量が有効に増加するだけでなく、
該組成物が溶菌作用と除タンパク質作用を併せ持−〕た
めに操操作率が改良される。
、例えばマニアチス(Maniatis)らの文献、即
ち[−モレキュラー・クローニングーア・ラボラトリ−
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、 Laboratory Manual)J、Co1
d SpringHarber Laboratory
(1982年)にaa載されている単離操作等、または
自動単離操作、例えば以下の実施例2に記載された単離
操作等に利用してらよい。いずれのタイプの単離操作に
おいても、本発明による組成物を使用することによって
、単離される核酸の収量が有効に増加するだけでなく、
該組成物が溶菌作用と除タンパク質作用を併せ持−〕た
めに操操作率が改良される。
本発明にj〜る試剤組成物は安定であるので、核酸の単
離操作において有用な試剤キットの一部として利用して
もよい。あるいは、該組成物は自動単離装置に使用可能
な容器、例えば自動単離装置に着脱可能な容器内で利用
してもよい。
離操作において有用な試剤キットの一部として利用して
もよい。あるいは、該組成物は自動単離装置に使用可能
な容器、例えば自動単離装置に着脱可能な容器内で利用
してもよい。
以下の実施例においては、本発明による組成物の好まし
い態様および核酸の自動単離法におけるその使用につい
て説明する。
い態様および核酸の自動単離法におけるその使用につい
て説明する。
夫皺眸V
試薬組成物の調製
5M酢酸カリウム48R12を氷酢酸32肩Qと混合す
ることによって第1溶液を調製する(酢酸カリウムと酢
酸との容量比は3:2にするのが好ましい)。フェノー
ル9 、9 xQに8−ヒドロキシキノリン0.1重量
%、クロロホルム9.91およびイソアミルアルコール
0 、2 xQをこの順序で添加して第2溶液を調製す
る。上記2種の溶液を混合することによって、安定な単
一相組成物(pH5)を得る。
ることによって第1溶液を調製する(酢酸カリウムと酢
酸との容量比は3:2にするのが好ましい)。フェノー
ル9 、9 xQに8−ヒドロキシキノリン0.1重量
%、クロロホルム9.91およびイソアミルアルコール
0 、2 xQをこの順序で添加して第2溶液を調製す
る。上記2種の溶液を混合することによって、安定な単
一相組成物(pH5)を得る。
実施例2
細菌菌体からのプラスミドDNAの単離508M培地(
マニアチスらの前記文献、第69頁参照) 5 肩Qに
大腸菌、1M101株およびM13+opI9バクテリ
オファージを接種し、37°Cで一夜培養する。菌体を
300 Orpmで10分間の遠心分離処理に付tこと
によって沈澱させる。培地を流し去った後、残存するベ
レットを5011IMグルコース、I OmM ED’
rAおよびlomM トJス塩酸を含有する溶液(p
!(7,5)0.3zQ中にiIS懸蜀させ、室温で渦
巻状の撹拌を2分間おこなう。次いで、1%SDSを含
む0 、2 N N a OHO,6rpQを添加し
、該溶液を室温で15秒間穏やかに渦巻状の撹拌をおこ
なった後、30秒間放置し、さらに穏やかに渦巻状の撹
拌を15秒問おこなう。
マニアチスらの前記文献、第69頁参照) 5 肩Qに
大腸菌、1M101株およびM13+opI9バクテリ
オファージを接種し、37°Cで一夜培養する。菌体を
300 Orpmで10分間の遠心分離処理に付tこと
によって沈澱させる。培地を流し去った後、残存するベ
レットを5011IMグルコース、I OmM ED’
rAおよびlomM トJス塩酸を含有する溶液(p
!(7,5)0.3zQ中にiIS懸蜀させ、室温で渦
巻状の撹拌を2分間おこなう。次いで、1%SDSを含
む0 、2 N N a OHO,6rpQを添加し
、該溶液を室温で15秒間穏やかに渦巻状の撹拌をおこ
なった後、30秒間放置し、さらに穏やかに渦巻状の撹
拌を15秒問おこなう。
この溶液に実施例1で調製1.た組成物0.54wQを
添加する。この混合物を穏やかに渦巻状の撹拌処理に1
5秒間付し、30秒間放置した後、15秒間の渦巻状の
撹拌処理に付し、次いで3000rplT+で15分間
の遠心分離処理に付す。
添加する。この混合物を穏やかに渦巻状の撹拌処理に1
5秒間付し、30秒間放置した後、15秒間の渦巻状の
撹拌処理に付し、次いで3000rplT+で15分間
の遠心分離処理に付す。
得られた上澄みを、孔径0,8ミクロンの酢酸セルロー
ス製フィルターおよび5jIRのレシーバ−管を備えた
試験管(シュリーヒャー・アンド・シュエル社製)に移
す。該試験管内へイソプロパツールL、3m(lを添加
し、穏やかな渦巻状の撹拌処理をおこなった後、室温で
2分間放置する。試験管内の内容物を室温下、3000
rpmで4分間の遠心分離処理に付すことによってD
NAをフィルターに付着させる。DNAをフィルターと
に付着させた状態で、70%エタノール0 、5 x(
lを試験管内へ入れ、遠心分離処理をさらに2分間おこ
なう。
ス製フィルターおよび5jIRのレシーバ−管を備えた
試験管(シュリーヒャー・アンド・シュエル社製)に移
す。該試験管内へイソプロパツールL、3m(lを添加
し、穏やかな渦巻状の撹拌処理をおこなった後、室温で
2分間放置する。試験管内の内容物を室温下、3000
rpmで4分間の遠心分離処理に付すことによってD
NAをフィルターに付着させる。DNAをフィルターと
に付着させた状態で、70%エタノール0 、5 x(
lを試験管内へ入れ、遠心分離処理をさらに2分間おこ
なう。
この処理操作を3回以上繰り返ケことによって夾雑物を
完全に除去する。
完全に除去する。
レンーバー管を除去し、ふたのないエッペンドルフ管(
1,5+(りを取り付ける。lolIM)リス塩酸(p
+−[8,0)ImM EDTAおよび20u9/R(
IRNアーゼAを含有する試薬溶液0 、 l yQを
該管内へ入れ、室温で30分間反応することによってD
N Aをフィルターから溶出させる。該管とその内容
物を室温下、3000 rpmで4分間の遠心分熱処理
に付す。
1,5+(りを取り付ける。lolIM)リス塩酸(p
+−[8,0)ImM EDTAおよび20u9/R(
IRNアーゼAを含有する試薬溶液0 、 l yQを
該管内へ入れ、室温で30分間反応することによってD
N Aをフィルターから溶出させる。該管とその内容
物を室温下、3000 rpmで4分間の遠心分熱処理
に付す。
得られた溶出液IOμgを別のエッペンドルフ管内に入
れる。IOX EcoR[l衝液[ニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ社(New EnglandB 1
olabs)調相、2uQをEcoR1制限酵素lユニ
ットと共に添加し、得られた溶液を37℃で2時間反応
する。DNAフラグメント含有溶液をゲル電気泳動法に
よって分析し、7 、2 Kbの線状M13mp19ベ
クターDNAを確認する。
れる。IOX EcoR[l衝液[ニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ社(New EnglandB 1
olabs)調相、2uQをEcoR1制限酵素lユニ
ットと共に添加し、得られた溶液を37℃で2時間反応
する。DNAフラグメント含有溶液をゲル電気泳動法に
よって分析し、7 、2 Kbの線状M13mp19ベ
クターDNAを確認する。
マニアチスらの前記文献に記載された方法によって同じ
培養物を精製したところ、本発明による組成物を用いる
上記方法の場合と同じ結果が得られることがゲル電気泳
動法による分析データにより確認されたが、自動化され
た操作に本発明による組成物を使用することによって節
約される時間は約10〜15%であった。さらに、手動
および自動DNAプラスミド単離法に本発明による組成
物を使用することによって、単離されるDNAフラグメ
ントの収量は著しく高くなる。
培養物を精製したところ、本発明による組成物を用いる
上記方法の場合と同じ結果が得られることがゲル電気泳
動法による分析データにより確認されたが、自動化され
た操作に本発明による組成物を使用することによって節
約される時間は約10〜15%であった。さらに、手動
および自動DNAプラスミド単離法に本発明による組成
物を使用することによって、単離されるDNAフラグメ
ントの収量は著しく高くなる。
本発明による組成物は当業者であれば適宜修正変更する
ことができ、このような態様も本発明に包含されるもの
である。
ことができ、このような態様も本発明に包含されるもの
である。
発明の効果
本発明によれば、従来2工程でおこなわれていた溶菌と
除タンパク質処理を1工程でおこなうことかできるので
、核酸の分子およびフラグメントの単離操作が簡単化さ
れるだけでなく、核酸の単離収量か従来法に比べて著し
く増加する。
除タンパク質処理を1工程でおこなうことかできるので
、核酸の分子およびフラグメントの単離操作が簡単化さ
れるだけでなく、核酸の単離収量か従来法に比べて著し
く増加する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、細胞もしくはウィルスの培養物から核酸を単離する
のに有用な単一相で安定な水性組成物であって、酢酸カ
リウム約1.6〜2.4M、フェノール約5〜15重量
%、クロロホルム約5〜15重量%、および該組成物の
pHを3.5〜5.5にするのに充分な量の酢酸を含有
し、上記酢酸カリウム溶液4容量部に対して、フェノー
ルとクロロホルムの合計量が1〜3容量部である核酸単
離用水性組成物。 2、イソアミルアルコール0〜約1.2重量%およびヒ
ドロキシキノリン0〜約0.12重量%をさらに含有す
る請求項1記載の組成物。 3、酢酸カリウム2.4M、酢酸10M、フェノール1
0重量%、クロロホルム10重量%、イソアミルアルコ
ール0.2重量%およびヒドロキシキノリン0.02重
量%含有する請求項1記載の組成物。 4、請求項1記載の組成物を含有する、細胞もしくはウ
ィルスの培養物からDNAを単離する方法において有用
な試薬キット。 5、請求項1記載の組成物を含有する、細胞の培養物か
らDNAを自動的に単離する装置に使用可能な容器。 6、細胞を溶解させ、タンパク質夾雑物から核酸を抽出
することによって核酸を単離する方法において、請求項
1記載の組成物を使用することを特徴とする核酸の単離
方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14776589A JPH0667B2 (ja) | 1989-06-08 | 1989-06-08 | 核酸単離用水性組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14776589A JPH0667B2 (ja) | 1989-06-08 | 1989-06-08 | 核酸単離用水性組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0310686A true JPH0310686A (ja) | 1991-01-18 |
JPH0667B2 JPH0667B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=15437669
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14776589A Expired - Lifetime JPH0667B2 (ja) | 1989-06-08 | 1989-06-08 | 核酸単離用水性組成物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0667B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002534120A (ja) * | 1999-01-11 | 2002-10-15 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルンク デル ヴィッセンシャフテン エー.ファウ. | 生体材料からのdnaの単離方法 |
JP2008220377A (ja) * | 1998-10-23 | 2008-09-25 | Qiagen Gmbh | 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段 |
-
1989
- 1989-06-08 JP JP14776589A patent/JPH0667B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008220377A (ja) * | 1998-10-23 | 2008-09-25 | Qiagen Gmbh | 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段 |
JP2002534120A (ja) * | 1999-01-11 | 2002-10-15 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルンク デル ヴィッセンシャフテン エー.ファウ. | 生体材料からのdnaの単離方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0667B2 (ja) | 1994-01-05 |
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