JPH0667B2 - 核酸単離用水性組成物 - Google Patents
核酸単離用水性組成物Info
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- JPH0667B2 JPH0667B2 JP14776589A JP14776589A JPH0667B2 JP H0667 B2 JPH0667 B2 JP H0667B2 JP 14776589 A JP14776589 A JP 14776589A JP 14776589 A JP14776589 A JP 14776589A JP H0667 B2 JPH0667 B2 JP H0667B2
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- Japan
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- weight
- composition
- nucleic acid
- composition according
- chloroform
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、真核細胞、原核細胞およびウイルスの培養
物から核酸を単離精製するのに有用な試薬組成物に関す
る。
物から核酸を単離精製するのに有用な試薬組成物に関す
る。
従来の技術 バイオテクノロジーの分野においては、核酸フラグメン
トは一般に原核細胞、真核細胞およびウイルスの培養物
から単離される。これらのフラグメントの単離によって
それらの塩基配列分析が可能となり、また、該フラグメ
ントは診断もしくは他の研究用のプローブおよび全タン
パク質もしくはポリペプチドをコード化する遺伝子との
組換え等に利用できる。従来から、核酸は界面活性剤
（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）および塩
溶液（例えば、酢酸カリウム）の存在下で溶菌させ、次
いでフェノールもしくはクロロホルムまたはこれらの混
合物を用いて抽出（除タンパク質処理）することによっ
てタンパク質夾雑物（例えば、細菌やウイルスの培養
物）から単離されている。これらの方法においては、核
酸は細胞もしくはウイルス培養物の脂質およびタンパク
質夾雑物から一般に沈澱処理によって分離される。
トは一般に原核細胞、真核細胞およびウイルスの培養物
から単離される。これらのフラグメントの単離によって
それらの塩基配列分析が可能となり、また、該フラグメ
ントは診断もしくは他の研究用のプローブおよび全タン
パク質もしくはポリペプチドをコード化する遺伝子との
組換え等に利用できる。従来から、核酸は界面活性剤
（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）および塩
溶液（例えば、酢酸カリウム）の存在下で溶菌させ、次
いでフェノールもしくはクロロホルムまたはこれらの混
合物を用いて抽出（除タンパク質処理）することによっ
てタンパク質夾雑物（例えば、細菌やウイルスの培養
物）から単離されている。これらの方法においては、核
酸は細胞もしくはウイルス培養物の脂質およびタンパク
質夾雑物から一般に沈澱処理によって分離される。
細菌培養物からプラスミドＤＮＡを単離するこの種の常
用法はビルンボイム（Ｈ．Ｃ．Ｂirnboim）とドリー
（Ｊ．Ｄoly）の報文に記載されている［「ア・ラピッ
ド・アルカライン・エクストラクション・プロセジュア
・フォー・スクリーニング・レコンビナント・プラスミ
ド・ディー・エヌ・エイ（ＡＲapid Ａlkaline Ｅxtr
action Ｐrocedure for Ｓcreening Ｒecombinant
Ｐlasmid ＤＮＡ）」、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、
第７巻、第１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年）参
照］。通常の方法では２つの工程、即ち溶菌工程と除タ
ンパク質工程は、前者で用いる試薬と後者で用いる試薬
が混和しないので別々におこなわれる。従って、溶菌と
夾雑物からの核酸の除タンパク質には２工程の操作が必
要である。
用法はビルンボイム（Ｈ．Ｃ．Ｂirnboim）とドリー
（Ｊ．Ｄoly）の報文に記載されている［「ア・ラピッ
ド・アルカライン・エクストラクション・プロセジュア
・フォー・スクリーニング・レコンビナント・プラスミ
ド・ディー・エヌ・エイ（ＡＲapid Ａlkaline Ｅxtr
action Ｐrocedure for Ｓcreening Ｒecombinant
Ｐlasmid ＤＮＡ）」、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、
第７巻、第１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年）参
照］。通常の方法では２つの工程、即ち溶菌工程と除タ
ンパク質工程は、前者で用いる試薬と後者で用いる試薬
が混和しないので別々におこなわれる。従って、溶菌と
夾雑物からの核酸の除タンパク質には２工程の操作が必
要である。
発明が解決しようとする課題 この発明はこれらの工程を１工程でおこなうことができ
るようにする新規な試薬組成物を提供するためになされ
たものである。
るようにする新規な試薬組成物を提供するためになされ
たものである。
課題を解決するための手段 即ち本発明は、細胞もしくはウイルスの培養物から核酸
を単離するのに有用な単一相で安定な水性組成物であっ
て、酢酸カリウム約１．６〜２．４Ｍ、フェノール約５
〜１５重量％、クロロホルム約５〜１５重量％、および
核組成物のpHを３．５〜５．５にするのに充分な量の酢
酸を含有し、酢酸カリウム４容量部に対して、フェノー
ルとクロロホルムの合計量が１〜３重量部である核産単
離用水性組成物に関する。
を単離するのに有用な単一相で安定な水性組成物であっ
て、酢酸カリウム約１．６〜２．４Ｍ、フェノール約５
〜１５重量％、クロロホルム約５〜１５重量％、および
核組成物のpHを３．５〜５．５にするのに充分な量の酢
酸を含有し、酢酸カリウム４容量部に対して、フェノー
ルとクロロホルムの合計量が１〜３重量部である核産単
離用水性組成物に関する。
本発明によれば、種々の核酸単離法において利用される
安定で単一相の水性組成物が提供される。該組成におい
ては、通常は水と混和しない抽出試薬が、水性の溶菌試
薬中に完全に溶解し、安定な試薬組成となる。
安定で単一相の水性組成物が提供される。該組成におい
ては、通常は水と混和しない抽出試薬が、水性の溶菌試
薬中に完全に溶解し、安定な試薬組成となる。
即ち本発明によれば、酢酸カリウム約１．６〜３．２
Ｍ、フェノール約５〜１５重量％、クロロホルム約５〜
１５重量％および系のpHを３．５〜５．５にするのに充
分な量の酢酸を含有する安定な単一相水性組成物が提供
される。本発明による組成物は所望により、イソアミル
アルコール０〜約１．２重量％および／または８−ヒド
ロキシキノリン０〜約０．１２重量％含有していてもよ
い。
Ｍ、フェノール約５〜１５重量％、クロロホルム約５〜
１５重量％および系のpHを３．５〜５．５にするのに充
分な量の酢酸を含有する安定な単一相水性組成物が提供
される。本発明による組成物は所望により、イソアミル
アルコール０〜約１．２重量％および／または８−ヒド
ロキシキノリン０〜約０．１２重量％含有していてもよ
い。
該組成物の必須成分である酢酸カリウムおよびフェノー
ル／クロロホルムの望ましい配合比は、酢酸カリウム４
容量部に対してフェノールとクロロホルムの全量約１〜
３容量部である。該配合比の好ましい値は４：１であ
る。一つの望ましい組成物は、酢酸カリウム２．４Ｍ、
酢酸１０Ｍ、フェノール１０％、クロロホルム１０％、
イソアミルアルコール０．２％およびヒドロキシキノリ
ン０．０２％含有するpH５の組成物である。より好まし
い組成物は、５Ｍ酢酸カリウム６０ml、クロロホルム１
２ml、酢酸４０mlフェノール１２ml、イソアミルアルコ
ール１mlおよび８−ヒドロキシキノリン０．０１２ｇ含
有するpH５の溶液である。
ル／クロロホルムの望ましい配合比は、酢酸カリウム４
容量部に対してフェノールとクロロホルムの全量約１〜
３容量部である。該配合比の好ましい値は４：１であ
る。一つの望ましい組成物は、酢酸カリウム２．４Ｍ、
酢酸１０Ｍ、フェノール１０％、クロロホルム１０％、
イソアミルアルコール０．２％およびヒドロキシキノリ
ン０．０２％含有するpH５の組成物である。より好まし
い組成物は、５Ｍ酢酸カリウム６０ml、クロロホルム１
２ml、酢酸４０mlフェノール１２ml、イソアミルアルコ
ール１mlおよび８−ヒドロキシキノリン０．０１２ｇ含
有するpH５の溶液である。
上記の試薬組成物の驚くべき点は、フェノールの溶解度
を変化させることである。この理由は、上記成分の組合
せによつて酢酸カリウム溶液のイオン強度が変化して該
溶液とフェノールとが混和して長時間にわたつて安定な
状態になると考えられている。該試薬組成物は室温（２
５℃）で少なくとも３０日間は安定であり、少なくとも
６０日間にわたって安定に保存できる。
を変化させることである。この理由は、上記成分の組合
せによつて酢酸カリウム溶液のイオン強度が変化して該
溶液とフェノールとが混和して長時間にわたつて安定な
状態になると考えられている。該試薬組成物は室温（２
５℃）で少なくとも３０日間は安定であり、少なくとも
６０日間にわたって安定に保存できる。
本発明による上記の安定な組成物は、細菌培養物からの
プラスミドＤＮＡの精製およびバクテリオファージＭ１
３からの一本鎖鋳型ＤＮＡの単離を含む種々の標準的な
ＤＮＡの単離操作において有用である。この場合、数種
類の溶菌試剤と抽出試剤が該組成物によって置き換えら
れる。本発明による組成物はまた、原核細胞以外の他の
組織源、例えば真核細胞からのＤＮＡやＲＮＡの単離に
関して当該分野において既知の標準的な溶菌と抽出技術
の代わりにも利用できる。
プラスミドＤＮＡの精製およびバクテリオファージＭ１
３からの一本鎖鋳型ＤＮＡの単離を含む種々の標準的な
ＤＮＡの単離操作において有用である。この場合、数種
類の溶菌試剤と抽出試剤が該組成物によって置き換えら
れる。本発明による組成物はまた、原核細胞以外の他の
組織源、例えば真核細胞からのＤＮＡやＲＮＡの単離に
関して当該分野において既知の標準的な溶菌と抽出技術
の代わりにも利用できる。
本発明による試剤組成物は手動によるＤＮＡの単離操
作、例えばマニアチス（Ｍaniatis）らの文献、即ち
「モレキュラー・クローニング−ア・ラボラトリー・マ
ニュアル（Ｍolecular Ｃloning−Ａ Ｌaboratory
Ｍanual）」、ＣoldＳpring Ｈarber Ｌaboratory
（１９８２年）に記載されている単離操作等、または自
動単離操作、例えば以下の実施例２に記載された単離操
作等に利用してもよい。いずれのタイプの単離操作にお
いても、本発明による組成物を使用することによつて、
単離される核酸の収量が有効に増加するだけでなく、該
組成物が溶菌作用と除タンパク質作用を併せ持つために
操作効率が改良される。
作、例えばマニアチス（Ｍaniatis）らの文献、即ち
「モレキュラー・クローニング−ア・ラボラトリー・マ
ニュアル（Ｍolecular Ｃloning−Ａ Ｌaboratory
Ｍanual）」、ＣoldＳpring Ｈarber Ｌaboratory
（１９８２年）に記載されている単離操作等、または自
動単離操作、例えば以下の実施例２に記載された単離操
作等に利用してもよい。いずれのタイプの単離操作にお
いても、本発明による組成物を使用することによつて、
単離される核酸の収量が有効に増加するだけでなく、該
組成物が溶菌作用と除タンパク質作用を併せ持つために
操作効率が改良される。
本発明による試剤組成物は安定であるので、核酸の単離
操作において有用な試剤キツトの一部として利用しても
よい。あるいは、該組成物は自動単離装置に使用可能な
容器、例えば自動単離装置に着脱可能な容器内で利用し
てもよい。
操作において有用な試剤キツトの一部として利用しても
よい。あるいは、該組成物は自動単離装置に使用可能な
容器、例えば自動単離装置に着脱可能な容器内で利用し
てもよい。
以下の実施例においては、本発明による組成物の好まし
い態様および核酸の自動単離法におけるその使用につい
て説明する。
い態様および核酸の自動単離法におけるその使用につい
て説明する。
実施例１ 試薬組成物の調製 ５Ｍ酢酸カリウム４８mlを氷酢酸３２mlと混合すること
によつて第１溶液を調製する（酢酸カリウムと酢酸との
容量比は３：２にするのが好ましい）。フェノール９．
９mlに８−ヒドロキシキノリン０．１重量％、クロロホ
ルム９．９mlおよびイソシアミルアルコール０．２mlを
この順序で添加して第２溶液を調製する。上記２種の溶
液を混合することによつて、安定な単一相組成物（pH
５）を得る。
によつて第１溶液を調製する（酢酸カリウムと酢酸との
容量比は３：２にするのが好ましい）。フェノール９．
９mlに８−ヒドロキシキノリン０．１重量％、クロロホ
ルム９．９mlおよびイソシアミルアルコール０．２mlを
この順序で添加して第２溶液を調製する。上記２種の溶
液を混合することによつて、安定な単一相組成物（pH
５）を得る。
実施例２ 細菌菌体からのプラスミドＤＮＡの単離 ＳＯＢＭ培地（マニアチスらの前記文献、第６９頁参
照）５mlに大腸菌ＪＭ１０１株およびＭ１３mp１９バク
テリオファージを接種し、３７℃で一夜培養する。菌体
を３０００rpmで１０分間の遠心分離処理に付すことに
よつて沈澱させる。培地を流し去つた後、残存するペレ
ツトを５０mＭグルコース、１０mＭＥＤＴＡおよび１０
mＭトリス塩酸を含有する溶液（pH７．５）０．３ml中
に再懸濁させ、室温で過巻状の撹拌を２分間おこなう。
次いで、１％ＳＤＳを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ０．６ml
を添加し、該溶液を室温で１５秒間穏やかに過巻状の撹
拌をおこなつた後、３０秒間放置し、さらに穏やかに過
巻状の撹拌を１５秒間おこなう。
照）５mlに大腸菌ＪＭ１０１株およびＭ１３mp１９バク
テリオファージを接種し、３７℃で一夜培養する。菌体
を３０００rpmで１０分間の遠心分離処理に付すことに
よつて沈澱させる。培地を流し去つた後、残存するペレ
ツトを５０mＭグルコース、１０mＭＥＤＴＡおよび１０
mＭトリス塩酸を含有する溶液（pH７．５）０．３ml中
に再懸濁させ、室温で過巻状の撹拌を２分間おこなう。
次いで、１％ＳＤＳを含む０．２Ｎ ＮａＯＨ０．６ml
を添加し、該溶液を室温で１５秒間穏やかに過巻状の撹
拌をおこなつた後、３０秒間放置し、さらに穏やかに過
巻状の撹拌を１５秒間おこなう。
この溶液に実施例１で調製した組成物０．５４mlを添加
する。この混合物を穏やかに過巻状の撹拌処理に１５秒
間付し、３０秒間放置した後、１５秒間の過巻状の撹拌
処理に付し、次いで３０００rpmで１５分間の遠心分離
処理に付す。
する。この混合物を穏やかに過巻状の撹拌処理に１５秒
間付し、３０秒間放置した後、１５秒間の過巻状の撹拌
処理に付し、次いで３０００rpmで１５分間の遠心分離
処理に付す。
得られた上澄みを、孔径０．８ミクロンの酢酸セルロー
ス製フイルターおよび５mlのレシーバー管を備えた試験
管（シュリーヒャー・アンド・シュエル社製）に移す。
該試験管内ヘイソプロパノール１．３mlを添加し、穏や
かな過巻状の撹拌処理をおこなつた後、室温で２分間放
置する。試験管内の内容物を室温下、３０００rpmで４
分間の遠心分離処理に付すことによつてＤＮＡをフィル
ターに付着させる。ＤＮＡをフィルター上に付着させた
状態で、７０％エタノール０．５mlを試験管内へ入れ、
遠心分離処理をさらに２分間おこなう。この処理操作を
３回以上繰り返すことによつて夾雑物を完全に除去す
る。
ス製フイルターおよび５mlのレシーバー管を備えた試験
管（シュリーヒャー・アンド・シュエル社製）に移す。
該試験管内ヘイソプロパノール１．３mlを添加し、穏や
かな過巻状の撹拌処理をおこなつた後、室温で２分間放
置する。試験管内の内容物を室温下、３０００rpmで４
分間の遠心分離処理に付すことによつてＤＮＡをフィル
ターに付着させる。ＤＮＡをフィルター上に付着させた
状態で、７０％エタノール０．５mlを試験管内へ入れ、
遠心分離処理をさらに２分間おこなう。この処理操作を
３回以上繰り返すことによつて夾雑物を完全に除去す
る。
レシーバー管を除去し、ふたのないエッペンドルフ管
（１．５ml）を取り付ける。１０mＭトリス塩酸（pH
８．０）１mＭＥＤＴＡおよび２０μｇ／mlＲＮアーゼ
Ａを含有する試薬溶液を０．１mlを該管内へ入れ、室温
で３０分間反応することによってＤＮＡをフィルターか
ら溶出させる。該管とその内容物を室温下、３０００rp
mで４分間の遠心分離処理に付す。
（１．５ml）を取り付ける。１０mＭトリス塩酸（pH
８．０）１mＭＥＤＴＡおよび２０μｇ／mlＲＮアーゼ
Ａを含有する試薬溶液を０．１mlを該管内へ入れ、室温
で３０分間反応することによってＤＮＡをフィルターか
ら溶出させる。該管とその内容物を室温下、３０００rp
mで４分間の遠心分離処理に付す。
得られた溶出液１０μｌを別のエッペンドルフ管内に入
れる。１０Ｘ ＥcoＲＩ緩衝液［ニュー・イングランド
・バイオラブズ社（Ｎew Ｅngland Ｂiolabs）製］
１．２μｌをＥcoＲＩ制限酵素１ユニツトと共に添加
し、得られた溶液を３７℃で２時間反応する。ＤＮＡフ
ラグメント含有溶液をゲル電気泳動法によって分析し、
７．２ｋbの線状Ｍ１３mp０９ベクターＤＮＡを確認す
る。
れる。１０Ｘ ＥcoＲＩ緩衝液［ニュー・イングランド
・バイオラブズ社（Ｎew Ｅngland Ｂiolabs）製］
１．２μｌをＥcoＲＩ制限酵素１ユニツトと共に添加
し、得られた溶液を３７℃で２時間反応する。ＤＮＡフ
ラグメント含有溶液をゲル電気泳動法によって分析し、
７．２ｋbの線状Ｍ１３mp０９ベクターＤＮＡを確認す
る。
マニアチスらの前記文献に記載された方法によつて同
じ培養物を精製したところ、本発明による組成物を用い
る上記方法の場合と同じ結果が得られることがゲル電気
泳動法による分析データによつて確認されたが、自動化
された操作に本発明による組成物を使用することによつ
て節約される時間は約１０〜１５％であつた。さらに、
手動および自動ＤＮＡプラスミド単離法に本発明による
組成物を使用することによつて、単離されるＤＮＡフラ
グメントの収量は著しく高くなる。
じ培養物を精製したところ、本発明による組成物を用い
る上記方法の場合と同じ結果が得られることがゲル電気
泳動法による分析データによつて確認されたが、自動化
された操作に本発明による組成物を使用することによつ
て節約される時間は約１０〜１５％であつた。さらに、
手動および自動ＤＮＡプラスミド単離法に本発明による
組成物を使用することによつて、単離されるＤＮＡフラ
グメントの収量は著しく高くなる。
本発明による組成物は当業者であれば適宜修正変更する
ことができ、このような態様も本発明に包含されるもの
である。
ことができ、このような態様も本発明に包含されるもの
である。
発明の効果 本発明によれば、従来２工程でおこなわれていた溶菌と
除タンパク質処理を１工程でおこなうことができるの
て、核酸の分子およびフラグメントの単離操作が簡単化
されるだけでなく、核酸の単離収量が従来法に比べて著
しく増加する。
除タンパク質処理を１工程でおこなうことができるの
て、核酸の分子およびフラグメントの単離操作が簡単化
されるだけでなく、核酸の単離収量が従来法に比べて著
しく増加する。
Claims (6)
- 【請求項１】細胞もしくはウイルスの培養物から核酸を
単離するのに有用な単一相で安定な水性組成物であっ
て、酢酸カリウム約１．６〜２．４Ｍ、フェノール約５
〜１５重量％、クロロホルム約５〜１５重量％、および
該組成物のpHを３．５〜５．５にするのに充分な量の酢
酸を含有し、上記酢酸カリウム溶液４容量部に対して、
フェノールとクロロホルムの合計量が１〜３容量部であ
る核酸単離用水性組成物。 - 【請求項２】イソアミルアルコール０〜約１．２重量％
およびヒドロキシキノリン０〜約０．１２重量％をさら
に含有する請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】酢酸カリウム２．４Ｍ、酢酸１０Ｍ、フェ
ノール１０重量％、クロロホルム１０重量％、イソアミ
ルアルコール０．２重量％およびヒドロキシキノリン
０．０２重量％含有する請求項１記載の組成物。 - 【請求項４】請求項１記載の組成物を含有する、細胞も
しくはウイルスの培養物からＤＮＡを単離する方法にお
いて有用な試薬キット。 - 【請求項５】請求項１記載の組成物を含有する、細胞の
培養物からＤＮＡを自動的に単離する装置に使用可能な
容器。 - 【請求項６】細胞を溶解させ、タンパク質夾雑物から核
酸を抽出することによって核酸を単離する方法におい
て、請求項１記載の組成物を使用することを特徴とする
核酸の単離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14776589A JPH0667B2 (ja) | 1989-06-08 | 1989-06-08 | 核酸単離用水性組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14776589A JPH0667B2 (ja) | 1989-06-08 | 1989-06-08 | 核酸単離用水性組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0310686A JPH0310686A (ja) | 1991-01-18 |
| JPH0667B2 true JPH0667B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=15437669
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14776589A Expired - Lifetime JPH0667B2 (ja) | 1989-06-08 | 1989-06-08 | 核酸単離用水性組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0667B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2771000A1 (en) * | 1998-10-23 | 2000-05-04 | Qiagen Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Processes and means for the isolation and purification of nucleic acids at surfaces |
| DE19900638C2 (de) * | 1999-01-11 | 2002-12-19 | Max Planck Gesellschaft | Methode zur Isolierung von DNA aus biologischen Materialien |
-
1989
- 1989-06-08 JP JP14776589A patent/JPH0667B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0310686A (ja) | 1991-01-18 |
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