JPS60501141A - 細胞におけるヌクレオチド配列の測定方法および細胞からの核酸の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞におけるヌクレオチド配列の測定方法および細胞からの核酸の単離方法 本発明は、主として、細胞中に存在するＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含むヌクレオ チド配列の測定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）または検定（ａｓｓａＶ）に関 するものである。本明細書中において、「測定」および「検定」という用語はヌ クレオチド配列の有無の定性的検出並びにその量の定量的もしくは半定量的測定 を包含するよう使用する。本発明の第２の面は、細胞からのポリヌクレオチド、 実際には核酸の単離に関するものである。

従来、たとえばウィルスまたは細菌を同定するための細胞におけるヌクレオチド 配列の測定には細胞からの核酸の単離を必要とする。次いで、適当な相補的配列 を有するポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより単離された核酸を 測定することができる。一般にＲＮＡは主として一本鎖型で細胞中に存在する。

一般にＤＮＡはパイヘリカル（二本鎖型）で存在するが、加熱またはアルカリの 作用により容易に一本鎖にすることができる。ハイブリダイゼーション検定にお いて、たとえば支持体への結合によりポリヌクレオチドは容易に不溶化され、固 相中の核酸量は免疫検定法と同様な方法で標識することにより測定される。

主として細胞中にヌクレアーゼ、すなわちＲＮＡもしくはＤＮＡを分解する酵素 が存在するという理由で、細胞からの核酸の単離が必要となる。これらのヌクレ アーゼは失活させるか或いは除去しなければならない。何故なら、そうしないと 核酸が急速に分解して、ハイブリダイゼーション検定において間違った結果を与 えるからである。

細胞溶解物中のヌクレアーゼの不活化は可能である。たとえば、界面活性剤は成 る種のヌクレアーゼに対し阻害効果を有している。より良好な種類の不活剤はい わゆるカオトロープ剤である。これらの試薬は、核酸がリポソーム蛋白質と複合 体を形成している細胞の核蛋白質を破壊する。これらは核蛋白質の近傍における 水の規則正しい水素結合構造に混乱を生ぜしめて、蛋白質に対する立体構造変化 をもたらし、その結果天然の型よりも加水分解に対し熱安定性の低い立体構造を 取らせるよう作用すると思われる。さらに、これらのカオトロープ剤はヌクレア ーゼをも阻害する。これらは、組繊細胞からＲＮＡを抽出する際に使用すること が記載されている［たとえば、アール・ニー・コックス、［メソッズ・イン・エ ンザイモロジー」、第１２Ｂ巻、第１２０ｉ２９頁（１９６８）；ジエー・ディ ー・バーディングおよびダブリュー・ジェー・ルッター、ジャーナル・バイオロ ジカル・ケミストリー、第２５３巻、第８７．３６−８７４０頁（１９７８）お よびティー・マニアチス等、「モレキュラー・クローニング：ラボラトリ−・マ ニュアル」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、 （１９８２）第１８９−１９０頁］。この種の典型的なカオトロープ剤は塩化グ アニジニウムおよびイソチオシアン酸グアニジニウムである。これらは高モル濃 度で使用すると効果的である。長い間、ハイブリダイゼーションを促進する溶剤 の選択において高モル濃度の塩を避けてきたく恐らく、これらがハイブリダイゼ ーションが起こる温度を上昇させる結果、反応体の熱不安定性という問題を引き 起すからである）。ハイブリダイゼーションに使用される典型的な塩濃度は０． ３〜０．９Ｍである。細胞溶解物中のヌクレアーゼを高塩ｍ度溶解緩衝液の中で 失活させ、粗製溶解物を相補的ポリヌクレオチドで直接処理するというアイデア は魅力的ではなかった。

細胞溶解物からのヌクレアーゼの除去は各種の抽出法により行なわれている。１ つの普及した方法においては、抽出剤としてフェノールを使用する。フェノール 抽出では、成る程度のヌクレアーゼはフェノール相中に除去され、成る程度のヌ クレアーゼは変性する。他の蛋白質は変性されて、フェノール／水の界面に沈澱 として現われる。フェノールの代りに、クロロホルム、或いはこれと他の有機液 との混合物も使用することができる。

他の抽出法ではプロテアーゼ、たとえばプロティナーゼＫを使用する。これらの 酵素は、ヌクレアーゼを含めて蛋白質を分解するが、これは極めてゆっくり進行 する。ヌクレアーゼが分解される間にこのヌクレアーゼを阻害するには、たとえ ばＳＤＳのような界面活性剤を使用する。

これら抽出法は全て、満足しうるハイブリダイゼーション検定を妨害するような ヌクレアーゼおよび核蛋白質を含む細胞成分を含まないように核酸を精製するた めに従来使用されている。

しかしながら、これらは時間がかかるものである。

今回、驚くことに高モル濃度塩溶液中でハイブリダイゼーションを実施する際の 当業界における予測にもかかわらず、上記したようにカオトロープ剤を含有する 細胞溶解物のハイブリダイゼーション検定を実際に上手く行ない得ることが見い 出された。この驚くべき知見は、ハイブリダイゼーションを用いて枯菌からＤＮ Ａを含まないＲＮＡを単離する研究からもたらされた。本発明者等は時間が重要 であるため、この方法を試みた。

偶然に、枯菌類が使用するのに特に適する生物であることを見い出した。何故な ら、その高いヌクレアーゼ含有量により従来の抽出法の使用は特に困難とされる からである。

本発明は溶剤抽出またはプロテアーゼ分解を行なう必要なしに粗製細胞溶解物を 直接ハイブリダイゼーション検定することを可能にすることにより、これまで厄 介であると信じられていた問題を解決した。

これまで知られている最も近縁な従来技術は、常法からなる方法を記載した２つ の文献からなっている。１つはニー・リントバークおよびビー・サンドキスト、 ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第８６＠、第４５１−４６９頁（１ ９７４）の方法であって、これはポリソームからのｍＲＮＡの単離を記載してい る。ポリソーム（ポリリポソーム）は同じｍＲＮＡに結合した数個のリポソーム よりなる分子量の大きい粒子であり、細胞内でＲＮＡからの蛋白質の合成に関与 している。これらの著者は、ポリソームを分解しリポソーム粒子にして複合体か らｍＲＮＡ番遊離させ、リポソームＲＮＡと蛋白質とを含有する核蛋白質を放出 させるためにＥＤＴＡを使用した。この方法は、ｍＲＮＡを望む場合にのみ興味 がある。次いでこれら著者は、オリゴ−ｄＴセルロースを使用してポリーＡ末端 を有するｍＲＮＡと反応させるアフィニティーク日マドグラフィーを行ないうろ ことを見い出した。これら著者は細胞全体ではなくポリソームから出発し、かつ 最初にＥＤＴＡ抽出を使用しているので、本発明はこの報告とは明らかに異なっ ている。

第２の文献はピー・エル・コリンズ、エル・イー・ハイタワーおよびエル・ニー ・ボールによるジャーナル・オブ・パイロジー、第３２４−３３６頁（１９７８ ）であって、雛鳥の細胞からのニューキャッスル病ウィルスＲＮＡの調整に関す るものである。１つの方法においては、溶解物をプロティナーゼにと共にインキ ュベートし、フェノールとクロロホルムとアミルアルコールとの混合物でＲＮＡ を抽出した。他の方法においては、２種の界面活性剤を含有する冷緩衝液中で細 胞をプレート上で溶解させた。この溶解物をプレートに付着した核から分離した 。

次イテ、溶解物を０．４Ｍ−ＮａＣ＋！および０．５％ＳＤＳで処理し、オリゴ ｄｌ’−セルロースアフィニティークロマトグラフィーによりＲＮＡを単離し、 ここでもＲＮＡにおけるポリへ−末端を利用した。この方法がどの位成功したか は論文から明確でない。何故なら、単離されたＲＮＡからの翻訳の結果は、単離 におけるこれら２種の方法の間で区別されていないからである。

いずれにせよ、この方法は核を分解しないし、またカオトロープ剤も使用してお らず、したがって本発明はこれとは明らかに相違する。

本発明は、核蛋白質とヌクレアーゼとを含有すると思われる細胞に存在する核酸 の測定方法を提供し、この方法は核蛋白質を破壊するためのカオトロープ剤を含 みヌクレアーゼを阻害する溶解緩衝液中で細胞を溶解させ、ＤＮＡを測定する際 には溶解物を処理してこれを一本鎖とし、ハイブリダイゼーション条件下で溶解 物を測定すべき核酸中に存在する配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有する ポリヌクレオチドと接触させ、ハイブリダイゼーションの程度を測定することか らなる。

同様に本発明は核蛋白質とヌクレアーゼとを含有する細胞に存在する核酸の単離 方法をも提供し、この方法は核蛋白質を破壊するためのカオトロープ剤を含みヌ クレアーゼを阻害する溶解緩衝液中で細胞を溶解させ、ＤＮＡを単離する際には この溶解物を処理して一本鎖とし、ハイブリダイゼーション条件士で溶解物を単 離すべき核酸中に存在する配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌ クレオチドと接触させ、得られたハイブリッドから所望の核酸を単離することか らなる。

本発明はプロトプラストを包含する広範囲の真核細胞および原核細胞に適用する ことができる。一般に本発明は、浸透圧ショック、酵素処理またはたとえば羽根 付きブレンダーでのホモジエナイズもしくは崩壊のような機械的作用により溶解 させうる任意の細胞に適用することができる。したがって、組織培養動物細胞、 動物組織（たとえば溶解緩衝液中でホモジエナイズされた心臓、肝臓もしくは脳 ）、血球、網状赤血球、リンパ球、浸透圧ショックにより溶解しうる植物細胞、 並びに細菌、酵母およびその他の小微生物細胞に適用することができる。細胞が 浸透圧ショックにより溶解しうる場合、カオトロープ剤中の高モル濃度の塩は、 一般に溶解をもたらすのに充分細胞中へ塩を移動させる。他の手段で溶解を行な う場合は、緩衝液が必要とされ、カオトロープ剤を緩衝液中に混入する。

カオトロープ剤は核蛋白質から核酸を解離させ、かつヌクレアーゼを阻害せねば ならない。好適なカオトロープ剤はグアニジニウム塩であって、ハイブリダイゼ ーションの時点において緩衝液中で少なくとも３Ｍ、好ましくは約４Ｍの濃度で ある。

例としては塩化グアニジニウムおよびイソチオシアン酸グアニジニウムが挙げら れる。他のカオトロープ剤は尿素、塩化リチウムおよび他のイソチオシアン酸塩 であって、高モルＩＩ痕とする。グアニジニウム塩に対する好適な代替物は４Ｍ 塩化リチウムと８Ｍ尿素との混合物である。これらカオトロープ剤はいずれもＳ ＤＳを含んで、ヌクレアーゼの阻害を改善することができる。

カオトロープ剤の濃度に関する上限は、各種の因子により支配される。実施する ハイブリダイゼーションがそれぞれ同じヌクレオチドとその塩基対パートナ−で ある２つの配列、たとえばポリ（Ｔ）もしくはポリ（Ｕ）配列にハイブリダイズ されたポリ（Ａ）末端に関与する場合、ハイブリダイゼーションは６Ｍもしくは それより若干高い濃度のグアニジニウム塩中で行なうことができるが、塩の溶解 度によりそれよりずっと高い濃度は許容されない。ハイブリダイゼーションが異 なるヌクレオチドの組み合せを含む配列に関する場合は、後記に説明するように 好適温度で実施するのがより困難となり、一般にグアニジニウム塩は約４．５Ｍ を越えないことが好ましい。他のカオトロープ剤の濃度は、グアニジニウム塩に 関するこれらの指針にしたがって適切に調整することができる。

本発明における予想外のことはその塩濃度が高いにもかかわらず、カオトロープ 剤がハイブリダイゼーションを比較的低湿度で生ぜしめうるという知見から一部 生ずる。換言すれば、ＲＮＡの近傍における水素結合構造の不規則性が増大する ため、ハイブリダイゼーションを容易化させる際の塩の作用がより重要になると 思われる。

本発明は全ての種類のＲＮＡおよびＤＮＡの検定および単離に適用される。ＲＮ Ａは一部一本鎖型として細胞中に存在するので、特殊な処理なしにカオトロープ 剤を含有する溶解物から直接にハイブリダイズさせることができる。ＤＮＡを含 有しないＲＮＡのみを検定し或いは単離しようとする場合には、溶解物を存在す る全てのＤＮＡを一本鎖にするような処理にかけてはならない。ＲＮＡとＤＮＡ との全体を問題とする場合には、溶解物を典型的には９５℃まで２分間加熱して ＤＮＡを一本鎖にすることにより常法にしたがって熱処理することができる。

ＤＮＡのみを検定し或いは単離することを望む場合には、ＲＮＡをアルカリでの 処理により除去することができる。これは一般に、１段階でＲＮＡをその成分ヌ クレオチドまで変性させると共に、ＤＮＡを一本鎖にする。勿論、このような処 理は周知されている。

さらに、ＤＮＡの分子サイズをたとえば０．１〜５メガダルトンのフラグメント にまで小さくして、ハイブリダイゼーションを容易化させるのが望ましい。ＤＮ Ａフラクションの大きさは、たとえば溶解物を超音波で処理して或いは機械的剪 断、たとえば溶解物を微細な寸法の皮下注射針に通すことにより減することがで きる。

多くのＲＮＡ分子は、その３′末端に連続アデニン残基の長い［末端（ｔａｉｌ ）Ｊを有する。これらは、たとえば口蹄疫ウィルスにおけるようなポリアデニル 化ウィルスのＲＮＡ、および枯菌類に存在するＲＮＡを包含する。このいわゆる ポリ（Ａ）＋−１＋１ＲＮＡは約４℃より高い温度にて相補的ポリ（Ｕ）もしく はポリ（Ｔ＞配列に容易にハイブリダイズさせることができる。

これに対し、通常（非末端化（ｕｎｔａｉｌｅｄ））のＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤ ＮＡ、ＤＮＡハイブリッド形成に対する最適温度は−般に、パイヘリカル（二本 鎖）生成物の溶融温度（Ｔｍ）より２５℃低いとみられ６つＴｍ−２５℃におい て、ハイブリダイゼーションは許容しうる速度で進行し、ＲＮＡおよび変性ＤＮ Ａの部分的パイヘリカル構造が減少し、かくしてもはやハイブリッド形成に対す る主たる障害がなくなる。したがって、ヌクレオチド間の結合の熱加水分解を最 少化するためにハイブリダイゼーション反応の温度は低く保つべきである。所要 温度を低く保ちなからカオトロープ剤の作用を増大させるには、この温度を低下 させる薬剤を添加することが好ましい。この種の好適な薬剤はホルムアミドであ る。かくして３５〜４２℃の範囲の温度における溶解／ホルムアミド緩衝液（た とえば４Ｍ−塩化グアニジニウムなど／　３３　ｖ／ｖ％ホルムアミド）が、Ｒ ＮＡ。

ＤＮＡハイブリッド形成に対し特に適していることが判明した。

実際の実験において、１容量のホルムアミドをグアニジニウム塩中の４．５〜６ Ｍの溶解物２容量に加えた。

本発明は粗製溶解物について行なうことを目的とするが、その僅かな機械的処理 を除外すると考えてはならない。たとえば、特に測定すべき核酸に対し相補的な 配列を有するポリヌクレオチドを不溶化させる場合には、ハイブリダイゼーショ ン前に溶解物を清澄させるのが望ましい。溶解物は低速遠心分離により清澄させ ることができる。

ハイブリダイゼーション検定は、それ自体公知の或いは免疫検定法に類似した任 意の方法で行なうことができる。これは測定すべき核酸に存在する配列に対し相 補的なヌクレオチド配列を有する不溶化ポリヌクレオチドを用いるが、ボモジニ アスであっても或いはへテロジニアスであってもよく、便利にはへテロジニアス である。好適検定方法は、エム・ピルタネン等、ザ・ランセット、１９８３年２ 月１９日、第３８１−３８３頁およびエム・ランキー等、ジーン、第２１巻、第 ７７−８５頁（１９８３）に記載されたようなサンドインチ型および拮抗もしく は置換検定である（置換検定は準拮抗検定であって、未標識パートナ−を先ず反 応させ、次いで標識されたパートナ−を反応させるが、未標識パートナ−は標識 パートナ−の全部は結合されないように使用結合部位に対し過剰とする）。

たとえば、本発明の１つの好適具体例において、ハイブリダイゼーションの程度 はサンドインチ検定により測定され、このし互いに相いれない第１および第２ヌ クレオヂド配列を有し、溶解物をハイブリダイゼーション条件下で（１）測定す べき核酸の第１ヌクレオチド配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有し、かつ 不溶化された第１ポリヌクレオチドおよび（２）液相であり、標識されかつ測定 すべき核酸の第２ヌクレオチド配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有する第 ２ポリヌクレオチドと接触させ、不溶性物質を分離し、これに結合した標識の量 を測定する。

本発明の他の好適具体例においては、ハイブリダイゼーションの程度を拮抗検定 （ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）により測定し、この場合ハイブリダイ ゼーション条件下で溶解物を、測定すべき核酸中に存在する配列に対し相補的な ヌクレオチド配列を有しかつ不溶化されている第１ポリヌクレオチドと接触させ 、この第１ポリヌクレオチドを同時にまたはその後にハイブリダイゼーション条 件下で、液相であり、標識されかつ第１ポリヌクレオチドの前記ヌクレオチド配 列に対し相補的なヌクレオチド配列からなる第２ポリヌクレオチドと接触させ、 その場合これら条件は測定すべき核酸および第２標識ポリヌクレオチドの各々に 関し不溶化第１ポリヌクレオチドをモル過剰で存在させるが、測定すべき核酸と 第２標識ポリヌクレオチドとの合計に対し第１ポリヌクレオチドをモル不足の状 態とし、不溶性物質を分離し、これに結合したまたは液相中に残留する標識の量 を測定する。

この検定を単にＲＮＡまたはＤＮＡの検出に使用し得ることが了解され、ＲＮＡ またはＤＮＡのいずれも細胞中に存在しない場合にはハイブリダイゼーションの 程度はＯとなる。

標識は便利には放射線標識であるが、他の任意の標識、たとえばビオチン／アビ ジン型の標識［たとえば、ヨーロッパ特許出願第６３８７９号（エール大学）明 細書に記載されている］、化学発光性触媒標識［たとえば、ヨーロッパ特許出願 第７０６８７号（スタンダード・オイル・カンパニー）明細書に記載されている ］、酵素標識［たとえば、ニー・ディー・ビー・マルコルム等、１９８３年７月 １日に英国ケンブリッジにて、バイオケミカル・ソサエティーの第６０４回会議 で発表］および蛍光標識［たとえば、エム・ニス・シルバーおよびニー・アール ・フェルシト、バイオケミストリー、第２１巻、第６０６６−６０７２頁（１９ ８２）に記載されている］を使用することができる。

核酸を単離するには、単に１回のハイブリダイゼーションスナツプのみが必要と される。相補的配列を有するポリヌクレオチドを不溶化させ（固相中もしくは固 相上に固定もしくは支持し、或いは固相にする）結合した核酸をそのカラムから 或いは支持体からポリヌクレオチドのアフィニティークロマトグラフィーにおい て周知の適当な手段により遊離させると便利である。

測定もしくは単離すべき核酸に対し相補的配列を有するポリヌクレオチドの種類 は、核酸がポリ（Ａ）末端を有するか或いは同じヌクレオチド（Ｎ）の長い連続 配列が存在する他の領域を有するかどうかに依存する。ポリ（Ａ）配列に対する ハイブリダイゼーションに使用しろるアフィニティーマトリックスの他の形態は オリゴ（ｄＴ）−セルロース、セルロースもしくはガラスファイバーディスクに 結合したポリ（Ｕ）、またはポリ（Ｕ）−ジアゾベンジルオキシメチル紙および ポリ（Ｕ）−Ａ女３＋雲母を包含する。

核酸がこの種のポリ＜Ｎ）配列を持たない場合には、ポリヌクレオチドを予め単 離し、たとえばプラスミドもしくはファージのようなベクター中に組み込みクロ ーン化したものとすることもできる。或いは、好ましくは少なくとも約１８個も しくは−とすることもできる。ポリヌクレオチドという用語は核酸、ヌクレオチ ド塩基のポリマー、オリゴマーなど必要に応じてＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブ リダイズするものを包含する。

好ましくは、ポリヌクレオチドを共有結合により支持体に結合させ、この支持体 はたとえばジアゾ化したアミノチオフェノール紙とすることができる。ニトロセ ルロース支持体は余り好適ではない。

以下、実施例により本発明を説明する。

一般的説明 ガラス器具は全てジメチルジクロルシラン溶液でシリコン処理し、そして１気圧 １２０’Ｃにて１５分間オートクレーブ処理した。緩衝液およびプラスチック器 具も、全て上記と同様にオートクレーブ処理した。

特記しない限り「溶解緩衝液」という用語は、実施例全体を通じて、６Ｍ−塩化 グアニジニウム／１ｍＭ−β−メルカプトエタノール／１５ｍＭ−トリス−ＨＣ １’（ＤＨ７，５）を意味する。「溶解ホルムアミド緩衝液」という用語は３３ ｖ／ｖ％のボルムアミドを含有する溶解緩衝液を意味する。

実施例１ フィサルム・ポリセファルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ） （枯菌類）の粗製溶解物からポリ（Ａ）”　−ｍＲＮＡフラクションを単離す溶 解緩衝液は６Ｍ−塩化グアニジニウム／１ｍＭ−β−メルカプトエタール／１５ ｍＭ−トリス−Ｈｃｐ　（ｐＨ７，５）または６Ｍ−イソチオシアン酸グアニジ ニウム／１ｍＭ−β−メルカプトエタノール／１０ｍＭ−トリス−ＨＣＪ！　（ ｐＨ７，５）のいずれかとした。

ポリ（Ａ＞”−ｍＲＮＡ、ポリ（Ｌｌ）−セファロース４Ｂを回収するための溶 出用緩衝液は９０ｖ／シＸホルムアミド／１ｍＭ−ＥＤＴＡ／１５ｍＭ−トリス ｆＨ（Ｊ！　（ｐｌ−１７，５）とした。

ポリ（Ａ）　−１＋１ＲＮＡ、ポリ（Ｕ）−セファロース４Ｂ複合体を精製する ための洗浄用緩衝液は、４Ｍ塩化グアニジニウム／１ｍＭ−メルカプト■タノー ル／１５ｍＭ−トリス−ＨＣｆ（ｐＨ７，５＞とした。

ポリ（Ａ＞＋−ｍＲＮＡの貯蔵用緩衝液は、１０ｍＭ−トリス−Ｈｃｐ（ｐ）− １７，０＞とした。さらに、このＭ′ｆＩ液を使用して、溶出用緩衝液で処理す る直前にポリ（Ａ）　＋−ｍＲＮＡ・ポリ（Ｕ）−セファロース４Ｂ複合体を洗 浄した。

ポリ（ｔＪ）−セファ０−ス４Ｂの作成ファルマシアＡＢ社により供給される乾 燥ゲルを１ｍＭのＮａＣＪ！で５分間処理し、０．１Ｍ−Ｎａ　ｃ！　（１００ ｔｔｔｌｌ／Ｈ乾燥粉末）で洗浄し、次いで溶出用緩衝液（２５威／ｇ乾燥粉末 ）で洗浄し、最後に溶解緩衝液で平衡化した。

フィサルム・ポリセフ７’ルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ ）のミクロプラス干シア（ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｏｄｉａ）の増殖ミクロプラス 干シア（菌株Ｍ３Ｃ■）を、ジエー・ダブリュー・ダニエルおよびエッチ・ピー ・ラッシュによりジャーナル・ジェネラル・マイクロバイオロジー、第２５巻、 第４７−５９頁（１９６１）に記載された所定培地（ただし雛鳥の胚抽出物を培 地１００ｄにつき１１ｄ、のヘメヂン（ｈａｅｍｅｔｉｎ）溶液（０，０５ｗ／ ｖ％ヘミンの１　ｗ／ｖ％Ｎａ　ＯＨにおける溶液）で置き換えた）において２ ６℃で増殖させた。ミクロプラス干シアを、５００ｍのフラスコに入れた１２５ −の培地中で増殖させ、フラスコを毎分８０回の振動速度で運動する振幅’ｌ０ ｃｍの往復型振どう器に載せ、２〜３日毎に植継ぎして対数増殖を維持した。

このミクロプラスモジアを接種してから約２日後の対数期に収穫した。

フィサルム・ポリセファルムのミクロプラスモジアの粗製溶解物からのポリ（Ａ ）”−ｍＲＮＡフラクションの単離培養物をＭＳＥ　ミストラル　４Ｌ型遠心分 離器にて４℃で２分間遠心分離することにより、ミクロプラスモジアを回収した 。ベレット化したフイサルムを秤量し、水浴中で冷却し、−１５℃まで予備冷却 した溶解緩衝液（１０Ｉｄ／ｇ湿潤重量）を加え、その間溶液をガラス棒で撹拌 した。混合物を一１５℃に約２０分間保ち、そして溶解物を低速遠心分離（ＭＳ Ｅ　ミストプル４Ｌ型遠心分離器にして４℃で３０００回転／分にて１０分間） または高速度（ベックマンＪ２−２１型遠心分離器にて１４，０００回転／分で ４℃にて１０分間）のいずれかにより清澄させた。この段階で不動化ポリ（Ｕ） を汚染する粒状物質を全て除去することが重要である。

次いで、溶解緩衝液で平衡化したポリ（ＬＪ）−セファロース４Ｂ（少な（とも ５０Ｉｔｇ乾燥重！／ｇ湿潤重量のフイサルム）を溶解物に加えた。処理すべき フイサルムの量に応じて２００■、５００ＩＩｇまたは１ｇのゲルを使用した。

ゲルが沈降するのを防ぐため４℃にて２〜３時間静かに懸濁液を撹拌した。ポリ （Ｕ）−セファロース４Ｂを遠心分離（３０００回転／分にて１０分間）により 回収した。ベレットを溶解緩衝液（１０Ｉｌｌｉり中に再懸濁し遠心分離した。

上澄液が殆んどＵ、Ｖ、吸収性物質を含有しなくなるまで（Ａ２６ｏ０．０１〜 ０．１）この手順を反復した。次いで、ポリ（Ｕ）−セファロース４Ｂをカラム 中に充填し、そして溶出物がＵ、Ｖ、吸収性物質を含有しなくなるまで（Ａ２６ ｏ＜０１ＯＯ３）溶解用緩衝液または洗浄用緩衝液で洗浄した。次いで、カラム を貯蔵用緩衝液（１５ｄ）で処理した。結合したポリ（Ａ＞＋−＋１１ＲＮＡフ ラクシヨンは溶出用緩衝液での洗浄によりカラムから回収した。ポリ（Ａ）”− １１１ＲＮＡフラクシヨンを、溶液を酢酸カリウム中で１％とし、エタノールを ２．５容量／溶液１容量の割合で加えた後に、−２０℃で沈澱させて溶出液から 回収した。ＲＮＡをミクロ遠心分離器（Ｈｉｃｒｏｆｕｇｅ）での遠心分離によ り回収し、貯蔵用緩衝液に溶解させた。沈澱および溶解の手順をさらに２回反復 し、次いでＲＮＡを貯蔵用緩衝液中で一２０℃に保った。

最適条件を得るための全てのパラメータは検討しなかったが、上記手順は信頼性 があることが判った。

精製ポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡの収率は、１ｇ湿潤重量のミクロプラスモジア当り 、約２５μ９のポリ（Ａ）”−ｎ＋ＲＮＡフラクションであることが判った。１ ｇ湿潤重量のミクロブラスモジアは４０μ９のポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡを含有す ると推定され、この基準に基づき６０％以上の収量は極めて合理的であると思わ れる。

（以下余白） ウサギ網状赤血球溶解物におけるポリ（Ａ）”　−ｍＲＮＡの翻訳エッチ・アー ル・ビー・ペルハムおよびアール・ジエー・ジャクソンによりヨーロピアン・ジ ャーナル・オブ・バイオケミストリー、第６７巻、第２４７−２５６頁（１９５ ６）に記載されたように検定を行なった。５μＣ１の３５８−メチオニンと１９ 種の放射性ではないアミノ酸とを含有するヌクレアーゼ処理したウサギ網状赤血 球溶解物（２５μρ）をポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡ（貯蔵用緩衝液中のｍＲＮＡの ５μρまで）と混合し、水を加えて容量を３０μρにした。ポリ（Ａ＞”　−ｎ ＋ＲＮＡを３つの異なる濃度で試験した。反応混合物を３４℃で９０分間インキ ュベートし、次いで氷上で冷却した。試料（２μρ）を各検定物から抜き取り、 ０．１ｌｖｌ−ＫＯＨ（１５０μρ）と混合し、Ｈ２０２を１滴加え、そして試 料を３４℃にて１０分間インキュベートした。氷冷した１０ｖ／ｖ％ＴＣＡを過 剰に加え、試料を０℃で１５分間保って蛋白質を沈澱させた。この沈澱した蛋白 質をオキソイド酢酸セルロースフィルタ（等級０．４５μｍ）を用いる濾過によ り回収した。検定チューブおよびフィルターは５　ｖ／ｖ％ＴＣＡで洗浄した。

各フィルターは蒸留水で１回次いでエターノール、次いでエタノール／ジエチル エーテル（１：１３ｖ／ｖ）、最後にジエチルエーテルで洗浄した。これらのフ ィルタの放射活性はシンチレーションカウンターで測定した。下記第１表に示す 結果は、フェノール抽出剤を用いる常法により単離されたマウスポリ（Ａ）　＋ −ｍＲＮＡと同様な効率で枯菌類ポリ（Ａ）”−ｍＲＮＡが翻訳されたことを示 している。

溶解物に添加した　酸不溶性蛋白質 ｍＲＮＡの種類　の放射活性（ｃｐｍ）なし　１，７００ 常法により単離された３Ｔ６　１３．４００マウスｍＲＮＡ’（１μｇ） Ｐ、ポリセファルムボリ（Ａ）”−ｍＲＮＡ（０，５μｇ＞　９，０６０ （１μｇ）　１２．６００ （２μｇ）　９．１３０ レムリによりネイチャー、第２２７巻、第６８０−６８５頁（１９７０）に記載 されたように１　ｖ／ｖ％ＳＤＳ−１５ｖ／ｖ％ポリアクリルアミドゲルを用い た電気泳動により分離した。このゲルを乾燥し、放射性蛋白質を蛍光写真法によ り検出した。使用した分子量マーカーはりゾチーム（１，４００）、トリプシン 阻害剤（１９，，０００）　、タレアチンキナーゼ（４０，０００）グルタミン 酸デヒドロゲナーゼ（５３，０００）　、カタラーゼ（６０，０００）、フルク トース−６−燐酸キナーゼ（８１，０００）およびホスホリラーゼａ　（９４， ０００）とした。Ｐ・ポリセファルムポリ（Ａ）＋−＋１１ＲＮＡから翻訳され た放射線標識蛋白質は、１５，０００〜９５，０００ダルトンの範囲の大きさで あった。

Ｔ４　ＲＮＡリガーゼを用いてポリ（Ａ＞＋−ｍＲＮＡフラクションをその３′ 末端において［５−３２Ｐ］　Ｃで標識した。

ｐ 放射能標識したｍＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。大きさの範 囲が５００〜１．８００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡの６個の異なるバンドをゲ ルから取り出し、ＲＮＡを溶出させ、ＲＮＡアーゼＴ１で処理してポリ（△）末 端を放出させた。これら生成物を８％ポリアクリルアミド配列決定用ゲルで分離 した。それぞれの場合、放射能は約１５個ヌクレオヂドから１５０〜２００個ヌ クレオチドまでの範囲のポリ（Ａ）末端を示した。検査したＰ・ポリセファルム ｍＲＮＡ種類のポリ（Ａ）末端の大きさは、グロビンｍＲＮＡのポリ（Ａ）末端 の大きさに匹敵する。

実施例２ 実施例１に使用したとほぼ同じ方法をラットの肝臓組織に適用した。

ラットの肝臓を取り出し、一部（３，５ｇ）を小片に切断し、液体窒素中で凍結 させ、かつウルトラチュラツクス（ｕｌｔｒａｔｕｒｒａＸ）ホモジエナイザを 用いて溶解緩衝液（３０μρ）中でホモジエナイズした。このホモジエネートを ベックマンＪ２’−２１型遠心分離器にて１４，０００回転／分で２０分間清澄 させた。

上澄液をプラスチック遠心分離管に移し、実施例１と同様に作成したポリ（Ｕ） −セファロース４Ｂ（約２００１１！ｇ乾燥重量）を加えた。このチューブを４ ℃にて２時間静かに撹拌した。ポリ（Ｕ）−セファ０−ス４Ｂを遠心分離により 回収し、溶解緩衝液で４℃にて数回洗浄し、使い捨てプラスチックカラム中へ充 填し、再び溶解緩衝液で洗浄した。次いでポリ（Ｕ）−セファロース４Ｂのカラ ムを約２０℃にて、貯蔵用緩衝液の代りに５ｍの高塩濃度緩衝液（０，５Ｍ−Ｎ ａ　Ｃ１！／１０ｍＭ−ＥＤＴＡ１５０ｖ／ｖ％ホルムアミド／トリス−ＨＣＬ 　ｐＨ７，５＞で洗浄した。次いで約２０℃にてこのポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡを 実施例１の溶出用緩衝液で溶出させた。３Ｍ−酢酸カリウム（ｐＨ７，０）０． ０１容量とエタノール２．５容量とを添加し、溶液を一１２℃で２時間保った後 にポリ（Ａ＞”−ｍＲＮＡフラクションを沈澱させた。収量はポリ（Ａ）”−ｍ ＲＮＡ１５０μグであった。ヌクレアーゼ処理したウサギ網状赤血球溶解物にお いて蛋白質合成を指示する能力を下記第２表に示す。

５ ヌクレアーゼ処理したウサギ網状　Ｓ標識した酸不溶性赤血球溶解物に対する添 加物　蛋白質の放射活性（ｃｐｍ）な　し　６５０ ラツト肝臓ポリ（Ａ）”、−ｍＲＮＡ　２１．０５０（２μｇ） ラット肝臓ポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡ　１０，６２２（４μｇ） 実施例３ 実施例１に使用したとほぼ同じ方法を蛙ゼノプス・レビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ ｅａｖｉｓ）の組織に適用し、ポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡを回収した。別々の実験 において使用した組織は（ａ）卵母細胞および（ｂ）肝臓とした。

卵母細胞（３，７ｇ）を、−１２℃まで冷却した溶解用緩衝液（２０ｄ）中でＰ ＴＦＥプランジャを備えたガラスホモジエナイザを用いてホモジエナイズした（ 全容量２４ｄ）。ベックマンＪ２−２１型遠心分離器で１４．０００回転回転転 て２０分間遠心分離して細胞の残骸を除去した。次いで実施例１におけると同様 に作成したポリ（Ｕ）−セファロース４Ｂを実施例２に記載したと同様に上澄液 に加え、次いでポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡフラクションを実施例１に実質的に記載 したと同様に単離した。

肝臓を蛙から取り出し、洗浄して血液を除去し、一部（１ｇ）を−１２℃まで冷 却した溶解用緩衝液（１０ｄ）に加え、切断し、次いでガラスホモジエナイザお よび機械駆動式ＰＴＦＥプランジャを用いてホモジエナイズした。ホモジエネー トをパタームスリン（ｂｕｔｔｅｒ　ｍｕｓｌｉｎ）を通して濾過し、４℃にて 遠心分離により清澄させた。次いで、ポリ（Ｕ）−セファロース４Ｂを加え、ポ リ（Ａ）＋−ｍＲＮＡフラクションを実施例１に実質的に記載したように単離し た。収量はポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡ約５０μ９であった。

無細胞蛋白質合成におけるポリ（Ａ）”　−ｍＲＮＡフラクションの活性を下記 第３表に示す。

５ ヌクレアーゼ処理したウサギ網状　Ｓ標識した酸不溶性赤血球溶解物に対する添 加物　蛋白質の放射活性卵母細胞からのボＩＪ　（Ａ）＋−ｍＲＮＡ　８．８０ ０（１，３μｇ） 肝臓からのポリ（Ａ＞”−ｍＲＮＡ　１６．８１０実施例１に使用したとほぼ同 じ方法をウサギの組織に適用しポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡを回収した。この実験に おいては組織は未熟な赤血球（網状赤血球）とした。血液は貧血症のウサギから 得た。洗浄し、充填した細胞（１０ｄ）を０℃にてクエン酸塩／食塩水緩衝液（ ２ｄ）に再懸濁し、撹拌しながら冷却した（−１２℃）溶解用緩衝液（６ｄ）に 加えた。ＭＳＥ　ミストラル遠心分離器にて６０００回転／分で２０分間遠心分 離することにより溶解物を清澄させた。次いで実施例１と同様に作成したポリ（ Ｌｌ）−セファロース４Ｂを実施例２に記載したように上澄液に加え、そしてポ リ（Ａ）＋−ｍＲＮＡフラクション（１６０μｇ）を実施例１と同様に単離し、 これはｍＲＮＡに指示された蛋白質生合成において活性であることが示された（ 第４表参照）。

５ ヌクレアーゼ処理したウサギ網状　Ｓ標識した酸不溶性赤血球溶解物への添加物 　蛋白質の放射活性（ｃｐｎ。

ポリ（Ａ）＋−ｍＲＮＡ　１１．２００フイサルム・ポリセファルムの粗製溶解 物から個々のｍＲＮＡ種類を単離するための単一ステップ法。

ｐ５−１３プラスミドＤＮＡの単離 プラスミドｐ５−１３を有し、プラスミドｐＡＣ１８４中に挿入されたフィサル ムＤＮＡの５ｋｂｐＨｉ　ｎｄｌ［［一旦旦ｍＨＩフラグメントを有する大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）菌株ＦＭＡＩＯをクロラムフェニコール の存在下で増殖させ、エッチ・シー・ビルンボイムおよびジエー・ドリーによる ヌクレイツク　アシド　リサーチ、第７巻、第１５１３−１５２３頁（１９７９ ）の方法でｐ５−１３プラスミドＤＮＡを単離した。　。

アミノチオフェノール（ＡＴＰ）−紙に対するＤＮＡの結合シードにより開発さ れかつピー・エフ・サージおよびジエー・アール・タタによりセル、第２３巻、 第７４１−７４６頁（１９８１）に引用された方法にしたがってＤＮＡを共有結 合するＡＴＰ紙を作成した。ワットマンＮｏ、５４０の紙シートを密封袋におい て３５０ｍＭ−Ｎａ　ＯＨ／３０ｖ／ｖ％１，４−ブタンジオールジグリセリル エーテルおよび２ｍｙ／ｌｄの硼水素化ナトリウムと共に１６時間振とうした。

次いで、この紙を０．２５Ｍ−Ｎａ　０Ｈ１５０ｖ／ｖ％エタノールで１時間洗 浄し、次いで振とうしながらエタノール中５ｗ／ｖ％の２−アミノチオフェノー ル１容量と０．５Ｍ−Ｎａ　ＯＨの１容量中でインキュベートした。この紙を無 水エタノール中で２回洗浄し、次いで０．１Ｍ−Ｈ−（Ｊで洗浄した。洗浄過程 をさらに２回反復し、次いでこの紙を蒸留水中で洗浄しかつ風乾し、暗所にて２ ０℃で貯蔵した。

使用直前にＡＴＰ紙を１．２Ｍ−ＨＣＪ！１０．０３ｗ／ｖ％−ＮａＮＯ２によ り４℃で３０分間処理しジアゾ化した。この紙を氷冷した蒸留水で２回、氷冷し た５０ｍＭ−燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）でそれぞれ２回洗浄し、次い で吸い取り乾燥させた。

制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉ　ｎｄｌ［［で処理して線状化さ せたプラスミドＤＮＡを、８０ｖ／ｖ％ジメチルスルホキシド１５０ｍＭ−燐酸 ナトリウム（ｐＨ６，５）により８０℃にて１０分間処理して変性させ、次いで 氷上で迅速に冷却した。変性した（一本鎖）ＤＮＡ（１０〜１５μρ）を新たに ジアゾ化したＡＴＰ紙のディスク（直径７　Ｍ　）に０℃で加え、次いで４℃に て少なくとも４時間放置することによりＤＮＡを結合させた。使用前にＤＮＡ／ ＡＴＰ紙ディスクを８０ｖ／ｖ％ＤＭＳＯ１５０ｍＭ−燐酸ナトリウム（ｐＨ６ ，５）中にて４℃で３０分間洗浄し、ｏ、１ｘｓｓｃにて９５℃で１５分間洗浄 することにより、非共有結合ＤＮＡを除去した。

粗製細胞溶解物からのｐ５−１３ＤＮＡ選択ｍＲＮＡの直接的実施例１における と同様に増殖したフィサルム・ポリセファルムのミクロブラスモジア（１０ｑ、 １０ｄ）を、６Ｍ−塩化グアニジニウム溶解緩衝液（３０−）中で一２０℃にて 溶解させた。溶解物（全容喰４０−１塩化グアニジニウム中４．５Ｍ）を低速遠 心分離により清澄させ、次いでホルムアミド（２０ｄ）を加えた。得られた溶解 ／ホルムアミド緩衝液を次いで塩化グアニジニウム中で３Ｍとした。それぞれ１ ０μびの不動化ｐ５−１３ＤＮＡを有する上記のように作成した直径１ｃ＃Ｉの Ａ７ｒＰ紙６枚を溶解／ホルムアミド緩衝溶液に加え、次いでこれを４２℃にて 静かに４０時間振とうした。これら紙ディスクを取り出し、溶解／ホルムアミド 緩衝液（２００ｄ）で４２℃にて洗浄し、次いで溶出用緩衝液（２ｄ）で２０℃ にて洗浄した。

溶出用緩衝液で４２℃にて洗浄することにより結合したｍＲＮＡを回収した。酵 母ｔＲＮＡ（２５μ９）をキャリヤとして加え、−２０℃にて酢酸カリウム緩衝 液（最終濃度１％）および２．５容量のエタノールの添加によりＲＮＡを沈澱さ せた。このＲＮＡを貯蔵用緩衝液に再溶解させ、さらに２回沈澱させ、次いで無 菌蒸留水（１０μρ）に再溶解させた。

別の試験を行ない、この場合１２５■で標識したＰ・ポリセファルムからのポリ （Ａ）＋−ｍＲＮＡを３７℃および４２℃でインキュベートし、溶解／ホルムア ミド緩衝液（４Ｍ−塩化グアニジニウム／　３３　ｖ／ｖ％ホルムアミド）中で ｐ５−１３プラスミドＤＮＡにハイブリダイズさせた。ＳＳＣの希釈を増大して 測定した場合の生成物の溶解温度における低下およびそのＲＮＡアーゼに対する 耐性の強さを観察することにより、疑いもなくハイブリダイゼーションが生じた ことが確認された。これらの試験は、上記細胞溶解の同じ条件下ではハイブリダ イゼーションも生じたはずであることを示している。

ウサギ網状赤血球溶解物におけるｍＲＮＡの翻訳実施例１でポリ（Ａ）＋−ｍＲ ＮＡにつき記載したと同様に検定を行なった。マウス３Ｔ６細胞から単離したポ リ（Ａ）＋−ｍＲＮＡについても比較のために検定した。これらの結果を下記第 ５表に示す。

第５表 ５ ヌクレアーゼ処理したウサギ網状　Ｓ標識した酸不溶性赤血球溶解物に対する添 加物　蛋白質の放射活性（ｃｐｍ）なし　９９０ マウス３Ｔ６細胞から単離した　９．０３５ポリ（Ａ）　＋−ｍＲＮＡ　（１ｕ ｇ）、比較用 ｐ５−１３ＤＮＡ選択ｍＲＮＡ　２，０６０（１μρ） ｐ５−１３ＤＮＡ選択ｍＲＮＡ　１．６９０（３μρ） ｐ５−１３ＤＮＡ選択ｍＲＮＡ　１．１５０無細胞系でこのように合成された放 射性蛋白質を、ニー・ケー・レムリ、ネイチャー、第２２７巻、第６８０−６８ ５頁（１９７０）に記載されたように１　ｗ／ｖ％ＳＤＳ−１５ｗ／ｖ％ポリア クリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離した。ゲルを乾燥させ、そして放 射性蛋白質を蛍光写真法により検出した。

２５．０００±７５０ダルトンの蛋白質が検出されたが、これはｐ５−１３ＤＮ Ａ選択ｍＲＮＡが添加された試料においてのみであった。この大きさの蛋白質を コードするｍＲＮＡ種類の最小大きさは、非コード配列を除いて約７５０個のヌ クレオチフィサルム・ポリセファルムの溶解物におけるｒＲＮＡおよび実施例１ におけると同様に増殖させたフィサルム・ポリセファルムのミクロプラスモジア を回収し、液体窒素中で凍結させ、次いで凍結乾燥した。この粉末を一１２℃で 貯蔵した。−１２℃に保たれた溶解緩衝液１０ｄへ１０Ｒｇの前記粉末を加える ことにより、正常な溶解物を作成した。さらに、この溶解物を必要に応じて溶解 緩衝液で希釈して、−１２℃で貯蔵した。

アルカリ処理した溶解物の作成 凍結乾燥したＰ・ポリセファルムの粉末（５３ｗｊ）を−１２℃の溶解緩衝液（ ４００μρ）に再懸濁させた。この溶液を４×１４秒の超音波により０℃で音波 処理した。溶液を約５Ｍ−Ｎａ　ＯＨ（７５μｕ）の添加により約ｐＨ１２とな し、４２℃で２．５時間保ち、０℃まで冷却し、約５　Ｍ　−ＨＣ１’（５０μ ！２）の添加により中和し、次いで一１２℃で貯蔵した。

不動化Ｐ、ポリセファルムＤＮＡのＡＴＰ紙ディスク上での調整 Ｐ、ポリセファルムの１８Ｓおよび２５Ｓ　ｒＲＮＡ配列の全体に対するゲノム ＤＮＡからなる１４ｋｂｐ挿入物を含有するファージラムダ２０５　ＤＮＡを標 準法により調整した。このＤＮＡを先ず８０ｖ／ｖ％ジメチルスルホキシド／２ ０Ｍ−ＥＤＴＡ　（ｐＨ６，５）の添加により典型的には２０倍希釈し、９０℃ まで５分間加熱し、次いで氷冷した。これら試料を、実施例５におけると同様に ジアゾ化したジアゾ化したばかりのＡＴＰ紙に加え、４℃にて１晩放置した。約 ２０％のＤＮＡがこの紙に共有結合された。ディスクを０．０１Ｍ−燐酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ６，５）中で洗浄し、乾燥させ、次いでトランスファＲＮＡ　 （溶解／ホルムアミド緩衝液中１０１！ｉりにより４２℃で３時間処理した。

フィサルム・ポリセファルムから得られた精製ｒＲＮＡを用いて次のようにカリ ブレーションを行なった。直径６ｓＸ長さ２３ｍの小さい円筒状プラスナック容 器を使用した。各容器は、上記のように作成した直径５＃ＩＩＩのＡＴＰ紙ディ スク５枚を含有し、そのうち２枚は比較とした。各容器に、２．１４Ｘ１０４２ ５ ｃｐｓの　Ｉ　ｒＲＮＡ試料（約１　ｘ　１０’　ｃｐｍ　／ｎｏ）とトランス ファＲＮＡ（１０ａｙ）とｒＲＮＡ標準溶液とを含有する溶解／ホルムアミド緩 衝液（５０μＡ）を加えた。この標準ｒＲＮＡ溶液は１μｐ当りそれぞれ１８８ 　ｒＲＮＡおよび２５ＳｒＲＮＡを１．１×１０−１６モル含有した。コノ溶液 を４２℃にて（加熱しながら）４２時間保った。

ＡＴＰ紙ディスクを溶解／ホルムアミド緩衝液（２０６ａｉりにて３７℃で３０ 分間洗浄し、次いで０．１ＸＳＳＣ（０，０１５Ｍ−Ｎａ　ｃＲｌｏ、００１５ Ｍ−クエン酸ナトリウムｐＨ７，０）で少なくとも２時間洗浄した。

これは拮抗検定であるため、検出された放射線標識の量とｒＲＮＡの量との間の 関係は反比例である。１／Ｒ（ここでＲは１分間当りの放射線カウントである） をｒＲＮＡ溶液の容積■に対しプロットした場合、 式１／Ｒ＝８．４Ｘ１０　Ｖ十（ＩＸＩＯ−３）に一致する直線５ が得られた。平均した結果は下記第６表に示す通りであった。

第６表 ０　１０２２　０．９８ １　８９０　１．１２ ２　８３５　１．２０ ４　７４２　１．３５ ８　６０３　１．６６ 上記検定を反復し、その際標準ｒＲＮＡ溶液の代りに（１）Ｐ、ポリセファルム の粗製溶解物を使用してｒＲＮＡを検定し、（２）アルカリで処理したＰ、ポリ セファルムの粗製溶解物を使用してそのＤＮＡを一本鎖にすると共にそのＲＮＡ を変性させ、それによりｒＤＮＡを検定した。

ｒＲＮＡの検定の結果は式 １／Ｒ＝２．０３ｘ１０−４＋　（１ｘｌＯ−３）に一致する直線プロットを与 え、この結果を下記第７表に示す。

第７表 ０　１０１０　０．９９ ８　４０３、２．４８ 化学分析により、凍結乾燥したＰ、ポリセファルムの１μ９がＲＮＡ全体を３Ｏ ｒ＋ｇ含有し、そのうち８５％がｒＲＮＡであること、すなわち２５ｐｇｒＲＮ Ａ　（１，１ｘｌＯ−１７モル）／ｎｇＰ、ポリセファルムであることを示した 。

たとえば、２００ｎｏのＰ、ポリセファルム粉末は２５Ｘ２０．０＝５０００Ｈ のｒＲＮＡを含有することが知られている。この検定は、２０ＯｎｌｌｌのＰ、 ポリセファルム粉末の当量を含有する溶解物４μｐが約 を含有することを示し、これは適正な程度であって、使用したフェムトモル（１ ０”’モル）１１度を考慮し、かつ検定がまだ恐らく最適化されていないことを 考慮すれば高い精度を示す。

ｒＤＮＡ検定の結果は式 ％式％ 直線プロットを示し、これを下記第８表に示す。

０　１０１０　０．９９ ２　（１７９μｙ＞　１０１０　０．９９４　（３５０μ９）　８７７　１．１ ４８　（６８４μシ）６７５１．４８ アルカリ処理された溶解物の容積を秤量によって検査し、これら重量を括弧内に 示す。

ＲＮＡ対ＤＮＡの既知の比（１７：１）およびｒＲＮＡをコードするＤＮＡの割 合（ＤＮＡの０．１５％）から、２．６ｐｇ（１，２ｘｌＯ”モル）のｒ’　Ｒ Ｎ　Ａ／μ！ＶのＰ、ポリセフフルム粉末が存在したと推定された。この検定か ら２１１（Ｊｒ［）ＮＡ／μ９Ｐ、ポリセファルム粉末が存在すると推定される 。

実施例７ ポリオーマウィルスのサンドインチ検定ポリオーマウィルスＤＮＡの中間−Ｔ　 （ｍｉｄｄｌｅ−Ｔ）抗原遺伝子配列の検定を説明する。細胞を形質転換させ、 ラットに腫瘍を誘発するポリオーマウィルスの能力は主として中間−１■抗原の 作用から生ずる。新たなプラスミドｐＡｓ１０１を作成した［ビー・ニー・オー ストラ、アール・ハーベー、ビー・ケー・工り−、ニー・エフ・マークハンおよ びニー・イー・スミス、ネイチャー、第３０４巻、第４５６−４５９頁（１９８ ３）参照］。これらの著者は複製のオリジンと中間−丁抗原に対する遺伝子とを 含有するポリオーマウィルスの２２２０塩基対フラグメントをプラスミドｐＡＴ １５３のＤＮＡ中に挿入した。次いでこれらの著者は、この新規なプラスミドｐ Ａｓ１０１が細胞を形質転換させ、宿主ゲノム中へのプラスミドｐＡｓ１０１Ｄ ＮＡの挿入の結果として腫瘍を誘発したことを示した。

ｐＡｓ１０１配列の検定は次のように確立された。この検定は３つの成分に基づ く：第１は、たとえばＡＴＰ紙上に不動化された一本鎖のＭＴ１５３　ＤＮＡで あり、第２は一本鎖にした３２ｐ４！ｌ識された２２２０塩基対のポリオーマウ ィルスＤＮＡフラグメントであり、第３は一本鎖にしたｐＡＴ１５３　ＤＮＡと ポリオーマウィルスＤＮＡとからなる試験配列である。

ハイブリダイゼーションに際し、放射線標識を不動化ＤＮＡ配列と会合（ａｓｓ ｏｃｉａｔｅ）させた。何故なら、検出すべき核酸種類はｐＡＴ１５３配列とポ リオーマウィルスＤＮＡ配列との両者を含むからである。正常なラット−１の細 胞と形質転換されたラット−１の細胞および１）ＡＳＩＯＩ誘発された腫瘍とは 全て溶解緩衝液中で容易に溶解された。

線状化した一本鎖のｐＡＴｌ　５３　ＤＮＡ　（２００１１（＋＞をＡＴＰ紙デ ィスク（直径７　ａｍ　）上に不動化させ、実施例５に記載したと同様にトラン スファＲＮＡと共に加熱した。

制限エンドヌクレアーゼＥ（：ＯＲ１およびＢａ１ｔｉｃ−ＩＩでの処理により ポリオーマウィルスＤＮＡフラグメントをｐＡＳｌｏｌから切り取って、放射性 プローブを作成し、これをアガロースゲル電気泳動により精製した。分離した２ ２２０塩基対のフラグラットをニックトランスレーションにより３２Ｐ標識した 。このプローブを使用前に９０℃まで５分間加熱することにより一本鎖にした。

各検定には約２Ｘ　１０”　ｃｐｍを使用した。

溶解緩衝液中２５１）（ＩＩ／μρのｐＡｓｌｏｌの標準溶液（４ｒｌまで）を 、使用前に９０℃にて５分間熱処理することにより一本鎖にした。最終容量は２ ００μΩの溶解／ホルムアミド緩衝液であった。ハイブリダイゼーションは４２ ℃で１８時間行なった。各反応混合物は５枚のＡＴＰ紙ディスクとし、そのうち ３枚にはＩ）ＡＴ１５３　ＤＮＡを付着させ、２枚は比較とした。

一本鎖ｐＡｓ１０１　ＤＮＡ　放射活性（２５ｐｇ／ｄ）の容積（、ＣＩ）　ｃ ｐｍ２１、−４９０ 上記のように行なったカリブレーションを行なった後、形質転換されたラット細 胞中のポリオーマＤＮＡウィルスを検出するための検定を行なった。正常なラッ ト−１の細胞とｐＡｓｌｏｌで形質転換されたラット−１の細胞（ラット−１− １０１細胞）とを組織培養で増殖させた。１つの組織培養プレートの細胞を洗浄 し、凍結乾燥させ、次いで一１２℃の溶解緩衝液２００μ女に溶解させ、実施例 ６に実質的に記載したように音波処理しアルカリ処理した。次いで、溶解物２容 量当り１容量のホルムアミドを加え′、そして溶液をマイクロ遠心分離器で清澄 させた。上澄液の試料（２００μ！２）、放射性プローブ（２Ｘ　１０５ｃｐｍ 　）および不動化されたｐＡＴ１５３　ＤＮＡ（添加２００　ｎＭディスク）を 上記の検定に使用した。形質転換された細胞からの溶解物を使用した場合、組み 込まれた放射活性は７２０ｃｐｍであったのに対し、形質転換されてないラット −１の細胞からの溶解物を検定した場合には１５０ｃｐｍであった。

図面の簡単な説明 国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　核蛋白質およびヌクレアーゼを含有する細胞に存在すると思われる核酸を 測定するに際し、核蛋白質を破壊するためのカオトロープ剤を含みヌクレアーゼ を阻害する溶解緩衝液中で細胞を溶解させ、ＤＮＡを測定する際には溶解物を処 理してこれを一本鎖とし、ハイブリダイゼーション条件下でこの溶解物を測定す べき核酸中に存在する配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレ オチドと接触させ、ハイブリダイゼーションの程度を測定することを特徴とする 核酸の測定方法。 ２、　カオトロープ剤がグアニジニウム塩であり、ハイブリダイゼーションの時 点では少なくとも３Ｍの濃度で溶解物中に存在させることを特徴とする請求の範 囲第１項に記載の方法。 ３、　ハイブリダイゼーションの前にハイブリダイゼーションに必要とされる温 度を低下させる薬剤を溶解物へ加えることを特徴とする請求の範囲第１項に記載 の方法。 ４、　ハイブリダイゼーション湿度の低下剤がホルムアミドであることを特徴と する請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、　ハイブリダイゼーションの程度をサンドインチ検定により測定し、このサ ンドインチ検定において、測定すべき核酸は別々のかつハイブリダイゼーション に関し互いに相いれない第１および第２ヌクレオチド配列を有し、溶解物をハイ ブリダイゼーション条件下で（１）測定すべき核酸の第１ヌクレオチド配列に対 し相補的なヌクレオチド配列を有しかつ不溶化されている第１ポリヌクレオチド 、および（２）液相であり、標識されかつ測定すべぎ核酸の第２ヌクレオチド配 列に対し相補的なヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドと接触させ、 不溶性物質を分離し、これに結合された標識の量を測定することを特徴とする請 求の範囲第１項に記載の方法。 ６、　ハイブリダイゼーションの程度を拮抗検定により測定し、この拮抗検定に おいては、溶解物をハイブリダイゼーション条件下で測定すべき核酸中に存在す る配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有しかつ不溶化されている第１ポリヌ クレオチドと接触させ、この第１ポリヌクレオブトを同時にまたはその後にハイ ブリダイゼーシ」ン条件下で、液相であり標識されかつ第１ポリヌクレオチドの 前記ヌクレオチド配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレ オチドと接触させ、その際の条件は測定すべき核酸及び標識された第２ポリヌク レオチドの各々に対し不溶化されている第１ポリヌクレオヂドをモル過剰で存在 させるが、測定すべき核酸と標識された第２ポリヌクレオチドとの合計に対し第 １ポリヌクレオヂドをモル不足の状態とし、不溶性物質を分離し、これに結合さ れたまたは液相中に残存する標識の量を測定することを特徴とする請求の範囲第 １項に記載の方法。 ７、　核蛋白質およびヌクレアーゼを含有する細胞中に存在する核酸を単離する に際し、核蛋白質を破壊するためのカオトロープ剤を含みヌクレアーゼを阻害す る溶解緩衝液中で細胞を溶解させ、ＤＮＡを単離する際には溶解物を処理してこ れを一本鎖とし、ハイブリダイゼーション条件下でこの溶解物を単離すべき核酸 中に存在する配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと 接触させ、得られたハイブリッドから所望の核酸を単離することを特