JPH11192090A - ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出及びクローニング法 - Google Patents
ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出及びクローニング法Info
- Publication number
- JPH11192090A JPH11192090A JP10000857A JP85798A JPH11192090A JP H11192090 A JPH11192090 A JP H11192090A JP 10000857 A JP10000857 A JP 10000857A JP 85798 A JP85798 A JP 85798A JP H11192090 A JPH11192090 A JP H11192090A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- site
- linker
- restriction enzyme
- cdna
- dna fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 （１）被検ｃＤＮＡを、任意の４塩基認
識制限酵素Ｘ処理、リンカー連結、該Ｘとは異なる任意
の４塩基認識制限酵素Ｙ処理、次いでリンカー連結を行
い、リンカー−Ｘ部位−Ｙ部位−リンカーのＤＮＡ断片
を得、（２）被検ｃＤＮＡを、前記Ｙ処理、リンカー連
結、前記Ｘ処理、次いでリンカー連結を行い、リンカー
−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカーのＤＮＡ断片を得、（３）
必要により、同様の操作によりさらにリンカー連結ＤＮ
Ａ断片を得、（４）得られた２種以上のＤＮＡ断片の各
クロマトグラフパターンと、他のｃＤＮＡから同様にし
て得られた２種以上のＤＮＡ断片のそれとを対比する被
検ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出及びクローニング方
法。 【効果】 被検細胞に特異的に発現している遺伝子を簡
便な操作で、再現性よく検出し、クローニングできる。
識制限酵素Ｘ処理、リンカー連結、該Ｘとは異なる任意
の４塩基認識制限酵素Ｙ処理、次いでリンカー連結を行
い、リンカー−Ｘ部位−Ｙ部位−リンカーのＤＮＡ断片
を得、（２）被検ｃＤＮＡを、前記Ｙ処理、リンカー連
結、前記Ｘ処理、次いでリンカー連結を行い、リンカー
−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカーのＤＮＡ断片を得、（３）
必要により、同様の操作によりさらにリンカー連結ＤＮ
Ａ断片を得、（４）得られた２種以上のＤＮＡ断片の各
クロマトグラフパターンと、他のｃＤＮＡから同様にし
て得られた２種以上のＤＮＡ断片のそれとを対比する被
検ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出及びクローニング方
法。 【効果】 被検細胞に特異的に発現している遺伝子を簡
便な操作で、再現性よく検出し、クローニングできる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は細胞又はｃＤＮＡに
特異的に発現又は発現量が増減している遺伝子の検出及
びクローニング法に関する。
特異的に発現又は発現量が増減している遺伝子の検出及
びクローニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ひとつの生物種はある特定の遺伝子を持
ち、免疫細胞など一部の例外を除き、いかに分化しよう
と、この遺伝子配列は共通であるとされている。ヒトの
場合、全遺伝子数は高々十万個程度と見積もられてい
る。細胞の分化、増殖を始め、癌や老化、感染症、免疫
病など各種病的状態、あるいは正常な生理現象など、あ
らゆる生物現象はほとんどの場合、発現される遺伝子の
種類と量の多寡によって規定される、ということが今日
明らかになってきている。
ち、免疫細胞など一部の例外を除き、いかに分化しよう
と、この遺伝子配列は共通であるとされている。ヒトの
場合、全遺伝子数は高々十万個程度と見積もられてい
る。細胞の分化、増殖を始め、癌や老化、感染症、免疫
病など各種病的状態、あるいは正常な生理現象など、あ
らゆる生物現象はほとんどの場合、発現される遺伝子の
種類と量の多寡によって規定される、ということが今日
明らかになってきている。
【０００３】つまり、細胞のある状況において特異的に
発現が高まる、又は逆に低下する遺伝子を明らかにでき
れば、それら遺伝子の消長を測定するだけで、その細胞
の状況についてのおおよその推定が可能になる。そのよ
うなわけで、現在細胞の状況特異的遺伝子を明らかにす
るための努力が世界各地でなされているが、遺伝子の総
数は上述のごとくヒトで十万種といわれるぐらいに多
い。細胞のあらゆる状況下における全遺伝子の発現状態
を把握するのは事実上不可能に近いし、あらゆる細胞に
共通して発現される遺伝子の種類も多いので、このやり
かたでは無駄も大きい。そこで状況に特異的な遺伝子の
みを選択的に抽出し、調べることができれば、時間的、
経済的、人的資源の費用対効果面から考えて、大いに資
することになる。
発現が高まる、又は逆に低下する遺伝子を明らかにでき
れば、それら遺伝子の消長を測定するだけで、その細胞
の状況についてのおおよその推定が可能になる。そのよ
うなわけで、現在細胞の状況特異的遺伝子を明らかにす
るための努力が世界各地でなされているが、遺伝子の総
数は上述のごとくヒトで十万種といわれるぐらいに多
い。細胞のあらゆる状況下における全遺伝子の発現状態
を把握するのは事実上不可能に近いし、あらゆる細胞に
共通して発現される遺伝子の種類も多いので、このやり
かたでは無駄も大きい。そこで状況に特異的な遺伝子の
みを選択的に抽出し、調べることができれば、時間的、
経済的、人的資源の費用対効果面から考えて、大いに資
することになる。
【０００４】この目的のために、今まで多くのいわゆる
“差スクリーニング”と呼ばれる方法が考案され、試さ
れてきた。これらは古典的な分別的コロニー（プラー
ク）ハイブリダイゼーションであり、また最近のポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたり、ＤＮＡ結合試薬
を用いたいくつかの方法である。これらは互いに相手の
ｃＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズさせることにより共
通部分を除いたり、ＤＮＡにクロスリンクする特殊な試
薬を用いたり、またアイソトープラベルした微量のサン
プルをシークエンスゲルで展開した後、直接比較する方
法などと組み合わせて特異的な遺伝子を見いだそうとす
る工夫がなされている。
“差スクリーニング”と呼ばれる方法が考案され、試さ
れてきた。これらは古典的な分別的コロニー（プラー
ク）ハイブリダイゼーションであり、また最近のポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたり、ＤＮＡ結合試薬
を用いたいくつかの方法である。これらは互いに相手の
ｃＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズさせることにより共
通部分を除いたり、ＤＮＡにクロスリンクする特殊な試
薬を用いたり、またアイソトープラベルした微量のサン
プルをシークエンスゲルで展開した後、直接比較する方
法などと組み合わせて特異的な遺伝子を見いだそうとす
る工夫がなされている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
は実際のところ、大量の原材料（例えば、ヒトの組織）
が必要である、ＰＣＲを繰り返すためバイアスがかか
る、結果に再現性がない等の理由によりごく限られた研
究室でのみかろうじて成功裏に動いている、というのが
現状である。従って現在、これらの施行困難な諸点がク
リアされた簡潔な方法の開発が、各方面の医学生物学研
究者の間で切に要望されている。
は実際のところ、大量の原材料（例えば、ヒトの組織）
が必要である、ＰＣＲを繰り返すためバイアスがかか
る、結果に再現性がない等の理由によりごく限られた研
究室でのみかろうじて成功裏に動いている、というのが
現状である。従って現在、これらの施行困難な諸点がク
リアされた簡潔な方法の開発が、各方面の医学生物学研
究者の間で切に要望されている。
【０００６】従って、本発明の目的はより簡便な操作
で、再現性よく、細胞又はｃＤＮＡに特異的に発現して
いる遺伝子を選択的に検出し、クローニングする方法を
提供することにある。
で、再現性よく、細胞又はｃＤＮＡに特異的に発現して
いる遺伝子を選択的に検出し、クローニングする方法を
提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、上記
課題を解決すべく種々検討した。そして、ＤＮＡ上には
４塩基認識制限酵素部位が平均２５６ｂｐ毎に一個存在
するという理論的事実と、ｍＲＮＡの平均長は約２ｋｂ
であるという事実に着目し、ｃＤＮＡ中のある特定部位
の相互に異なる４塩基認識制限酵素部位間の断片のライ
ブラリーを調製して、２種以上のｃＤＮＡ間で対比すれ
ば被検ｃＤＮＡにおいて特異的に発現している遺伝子が
検出、クローニングできることを見出し、本発明を完成
するに至った。
課題を解決すべく種々検討した。そして、ＤＮＡ上には
４塩基認識制限酵素部位が平均２５６ｂｐ毎に一個存在
するという理論的事実と、ｍＲＮＡの平均長は約２ｋｂ
であるという事実に着目し、ｃＤＮＡ中のある特定部位
の相互に異なる４塩基認識制限酵素部位間の断片のライ
ブラリーを調製して、２種以上のｃＤＮＡ間で対比すれ
ば被検ｃＤＮＡにおいて特異的に発現している遺伝子が
検出、クローニングできることを見出し、本発明を完成
するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、（１）被検ｃＤＮＡ
を、任意の４塩基認識制限酵素Ｘ処理、該制限酵素Ｘ部
位に連結するリンカーの連結、該制限酵素Ｘとは異なる
任意の４塩基認識制限酵素Ｙ処理、次いで該制限酵素Ｙ
部位に連結するリンカーの連結を行い、リンカー−Ｘ部
位−Ｙ部位−リンカーからなるＤＮＡ断片を得、（２）
被検ｃＤＮＡを、前記制限酵素Ｙ処理、該制限酵素Ｙ部
位に連結するリンカーの連結、前記制限酵素Ｘ処理、次
いで該制限酵素Ｘ部位に連結するリンカーの連結を行
い、リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカーからなるＤＮ
Ａ断片を得、（３）必要により、さらに前記Ｘ及びＹと
異なる任意の４塩基認識制限酵素を１種以上用いて同様
の操作により相互に異なる４塩基認識制限酵素部位間の
断片の両端にリンカーが連結したＤＮＡ断片を得、
（４）得られた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラ
フパターンと、被検ｃＤＮＡと異なる他の少なくとも１
種のｃＤＮＡから前記（１）〜（３）と同様にして得ら
れた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラフパターン
とをそれぞれ対比することを特徴とする、被検ｃＤＮＡ
中の特異的遺伝子の検出方法を提供するものである。
を、任意の４塩基認識制限酵素Ｘ処理、該制限酵素Ｘ部
位に連結するリンカーの連結、該制限酵素Ｘとは異なる
任意の４塩基認識制限酵素Ｙ処理、次いで該制限酵素Ｙ
部位に連結するリンカーの連結を行い、リンカー−Ｘ部
位−Ｙ部位−リンカーからなるＤＮＡ断片を得、（２）
被検ｃＤＮＡを、前記制限酵素Ｙ処理、該制限酵素Ｙ部
位に連結するリンカーの連結、前記制限酵素Ｘ処理、次
いで該制限酵素Ｘ部位に連結するリンカーの連結を行
い、リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカーからなるＤＮ
Ａ断片を得、（３）必要により、さらに前記Ｘ及びＹと
異なる任意の４塩基認識制限酵素を１種以上用いて同様
の操作により相互に異なる４塩基認識制限酵素部位間の
断片の両端にリンカーが連結したＤＮＡ断片を得、
（４）得られた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラ
フパターンと、被検ｃＤＮＡと異なる他の少なくとも１
種のｃＤＮＡから前記（１）〜（３）と同様にして得ら
れた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラフパターン
とをそれぞれ対比することを特徴とする、被検ｃＤＮＡ
中の特異的遺伝子の検出方法を提供するものである。
【０００９】また、本発明は、上記被検ｃＤＮＡとし
て、被検細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡを用いて上記の操作を
行うことを特徴とする被検細胞特異的遺伝子の検出方法
を提供するものである。さらに本発明は、上記操作のス
テップ（４）で得られたクロマトグラフパターンを対比
し、被検ｃＤＮＡに特異的な遺伝子を分離することを特
徴とする被検ｃＤＮＡ特異的遺伝子のクローニング法を
提供するものである。さらにまた本発明は、上記クロー
ニング法の被検ｃＤＮＡとして、被検細胞ｍＲＮＡのｃ
ＤＮＡを用いて上記の操作を行うことを特徴とする被検
細胞特異的遺伝子のクローニング法を提供するものであ
る。
て、被検細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡを用いて上記の操作を
行うことを特徴とする被検細胞特異的遺伝子の検出方法
を提供するものである。さらに本発明は、上記操作のス
テップ（４）で得られたクロマトグラフパターンを対比
し、被検ｃＤＮＡに特異的な遺伝子を分離することを特
徴とする被検ｃＤＮＡ特異的遺伝子のクローニング法を
提供するものである。さらにまた本発明は、上記クロー
ニング法の被検ｃＤＮＡとして、被検細胞ｍＲＮＡのｃ
ＤＮＡを用いて上記の操作を行うことを特徴とする被検
細胞特異的遺伝子のクローニング法を提供するものであ
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、前記の如く、４塩基認
識制限酵素（以下、「４ｂ酵素」という）部位が、ＤＮ
Ａ上に平均２５６ｂｐ毎に一個存在するという理論的事
実と、ｍＲＮＡの平均長は約２ｋｂであるというふたつ
の事実を根拠としている。従って、大部分のｍＲＮＡは
４ｂ酵素の認識部位を有していることになる。本発明に
おいて、任意の２種類の４ｂ酵素ＸとＹを用いる場合を
考えると、ｍＲＮＡの３′末端に近い部分の構造はＸ部
位−（Ｙ部位）n−ポリＡ、又はＹ部位−（Ｘ部位）n−
ポリＡのいずれかのタイプに分類できるはずである（こ
こで、ｎは１以上の任意の整数である）。このＸＹ断片
及びＹＸ断片は、ｍＲＮＡ毎に決まった長さのものが１
種類だけ存在する。すなわち、ｍＲＮＡとこれらの断片
とは１対１の対応をしている。つまり、これらＸＹ断片
及びＹＸ断片の集合はｃＤＮＡライブラリーということ
になる。これらの断片のＸ及びＹ部位のそれぞれに適当
なオリゴヌクレオチドリンカーを連結すれば、そのリン
カーをプライマーとするＰＣＲにより増幅も可能とな
る。従って、被検ｃＤＮＡと対比すべきｃＤＮＡについ
て、それぞれリンカーのついたＸＹｃＤＮＡライブラリ
ー及びＹＸｃＤＮＡライブラリーを作製し、これらのク
ロマトグラフパターンを対比し、被検ｃＤＮＡにおいて
特異的に発現量が増加している部分を検出及び分離すれ
ば、被検ｃＤＮＡに特異的な遺伝子を検出し、クローニ
ングすることができる。
識制限酵素（以下、「４ｂ酵素」という）部位が、ＤＮ
Ａ上に平均２５６ｂｐ毎に一個存在するという理論的事
実と、ｍＲＮＡの平均長は約２ｋｂであるというふたつ
の事実を根拠としている。従って、大部分のｍＲＮＡは
４ｂ酵素の認識部位を有していることになる。本発明に
おいて、任意の２種類の４ｂ酵素ＸとＹを用いる場合を
考えると、ｍＲＮＡの３′末端に近い部分の構造はＸ部
位−（Ｙ部位）n−ポリＡ、又はＹ部位−（Ｘ部位）n−
ポリＡのいずれかのタイプに分類できるはずである（こ
こで、ｎは１以上の任意の整数である）。このＸＹ断片
及びＹＸ断片は、ｍＲＮＡ毎に決まった長さのものが１
種類だけ存在する。すなわち、ｍＲＮＡとこれらの断片
とは１対１の対応をしている。つまり、これらＸＹ断片
及びＹＸ断片の集合はｃＤＮＡライブラリーということ
になる。これらの断片のＸ及びＹ部位のそれぞれに適当
なオリゴヌクレオチドリンカーを連結すれば、そのリン
カーをプライマーとするＰＣＲにより増幅も可能とな
る。従って、被検ｃＤＮＡと対比すべきｃＤＮＡについ
て、それぞれリンカーのついたＸＹｃＤＮＡライブラリ
ー及びＹＸｃＤＮＡライブラリーを作製し、これらのク
ロマトグラフパターンを対比し、被検ｃＤＮＡにおいて
特異的に発現量が増加している部分を検出及び分離すれ
ば、被検ｃＤＮＡに特異的な遺伝子を検出し、クローニ
ングすることができる。
【００１１】本発明に用いられる被検ｃＤＮＡは、ｍＲ
ＮＡに対するｃＤＮＡであれば特に制限されず、ｍＲＮ
Ａに逆転写酵素を作用させて得られるｃＤＮＡである。
被検細胞の全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮ
Ａを被検体として用いて本発明方法を行えば、その被検
細胞の特異的遺伝子の検出及びクローニングが可能とな
る。本発明で用いる全ＲＮＡは１μｇでも十分である。
１μｇの全ＲＮＡは細胞１mgに相当する。従って、本発
明は、ニードルバイオプシーなどでしか得ることのでき
ない貴重な人体組織サンプルなどを取り扱う際には特に
有効である。また、被検細胞としては、ｍＲＮＡとして
ポリＡ尾を有する細胞ならいずれでもよく、真核細胞の
場合、原生動物、真菌類、植物細胞あるいは動物細胞で
あるかを問わない。
ＮＡに対するｃＤＮＡであれば特に制限されず、ｍＲＮ
Ａに逆転写酵素を作用させて得られるｃＤＮＡである。
被検細胞の全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮ
Ａを被検体として用いて本発明方法を行えば、その被検
細胞の特異的遺伝子の検出及びクローニングが可能とな
る。本発明で用いる全ＲＮＡは１μｇでも十分である。
１μｇの全ＲＮＡは細胞１mgに相当する。従って、本発
明は、ニードルバイオプシーなどでしか得ることのでき
ない貴重な人体組織サンプルなどを取り扱う際には特に
有効である。また、被検細胞としては、ｍＲＮＡとして
ポリＡ尾を有する細胞ならいずれでもよく、真核細胞の
場合、原生動物、真菌類、植物細胞あるいは動物細胞で
あるかを問わない。
【００１２】本発明に用いられる４ｂ酵素としては、公
知の４ｂ酵素の２種以上の組み合わせであれば特に制限
されず、例えばＴｓｐ５０９Ｉ、ＭａｅII、ＡｌｕＩ、
ＮｌａIII、ＨｐａII、ＭｓｐII、ＡｃｃII、ＢｓｔＵ
Ｉ、ＭｖｎＩ、ＭａｅＩ、ＲｍａＩ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ
３ＡＩ、ＤｐｎＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨｈａＩ、ＣｆｏＩ、
ＨａｅIII、ＣｖｉＱＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＡｆａＩ、Ｒｓ
ａＩ、ＴａｑＩ、ＭｓｅＩ等から任意に２種以上、好ま
しくは２〜４種を組み合わせて用いることができる。こ
のうち、切断後接着末端を生ずる４ｂ酵素、例えばＮｌ
ａIII及びＳａｕ３ＡＩの組み合わせが、リンカーライ
ゲーションの効率が良好であり、目的のＤＮＡ断片のＰ
ＣＲ後のオートラジオグラムを行った際の再現性も良好
である。
知の４ｂ酵素の２種以上の組み合わせであれば特に制限
されず、例えばＴｓｐ５０９Ｉ、ＭａｅII、ＡｌｕＩ、
ＮｌａIII、ＨｐａII、ＭｓｐII、ＡｃｃII、ＢｓｔＵ
Ｉ、ＭｖｎＩ、ＭａｅＩ、ＲｍａＩ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ
３ＡＩ、ＤｐｎＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨｈａＩ、ＣｆｏＩ、
ＨａｅIII、ＣｖｉＱＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＡｆａＩ、Ｒｓ
ａＩ、ＴａｑＩ、ＭｓｅＩ等から任意に２種以上、好ま
しくは２〜４種を組み合わせて用いることができる。こ
のうち、切断後接着末端を生ずる４ｂ酵素、例えばＮｌ
ａIII及びＳａｕ３ＡＩの組み合わせが、リンカーライ
ゲーションの効率が良好であり、目的のＤＮＡ断片のＰ
ＣＲ後のオートラジオグラムを行った際の再現性も良好
である。
【００１３】本発明に用いられるリンカーは、連結すべ
き４ｂ酵素との接着末端を有する限り、特に制限されな
いが、当然、自分自身あるいはもう一方のリンカーと相
補的であってはならない。また、目的とするＤＮＡ断片
を得た後、ＰＣＲにより該断片を増幅させる際のプライ
マー設計の観点から、リンカーは既知の塩基配列になる
べく一致しないものを選ぶのが好ましい。
き４ｂ酵素との接着末端を有する限り、特に制限されな
いが、当然、自分自身あるいはもう一方のリンカーと相
補的であってはならない。また、目的とするＤＮＡ断片
を得た後、ＰＣＲにより該断片を増幅させる際のプライ
マー設計の観点から、リンカーは既知の塩基配列になる
べく一致しないものを選ぶのが好ましい。
【００１４】次に本発明を前記ステップ毎に説明する。
【００１５】まず、ステップ（１）は、被検ｃＤＮＡを
任意の４ｂ酵素Ｘで処理し、得られた断片のＸ部位に適
当なリンカーを連結し、さらに前記Ｘとは異なる任意の
４ｂ酵素Ｙで処理し、次に得られた断片のＹ部位に適当
なリンカーを連結することにより、「リンカー−Ｘ部位
−Ｙ部位リンカー」からなるハーフｃＤＮＡライブラリ
ーを得るステップである。
任意の４ｂ酵素Ｘで処理し、得られた断片のＸ部位に適
当なリンカーを連結し、さらに前記Ｘとは異なる任意の
４ｂ酵素Ｙで処理し、次に得られた断片のＹ部位に適当
なリンカーを連結することにより、「リンカー−Ｘ部位
−Ｙ部位リンカー」からなるハーフｃＤＮＡライブラリ
ーを得るステップである。
【００１６】ここで、被検ｃＤＮＡとしては、４ｂ酵素
Ｘ処理後の断片を３′側又は５′側のいずれか一方を回
収するために、その片末端に標識オリゴヌクレオチドを
結合させたものを用いるのが好ましい。ここで、標識オ
リゴヌクレオチドとしては、固相固定化オリゴヌクレオ
チド、補酵素標識オリゴヌクレオチド等が挙げられる
が、再現性や目的断片の回収性の点から固相固定化オリ
ゴヌクレオチドが好ましく、ラテックスビーズ固定化オ
リゴヌクレオチド、マグネットビーズ固定化オリゴヌク
レオチド等がより好ましく、さらにラテックスビーズ固
定化オリゴヌクレオチドが特に好ましい。さらにまた、
標識オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分とし
ては、オリゴｄＴが特に好ましい。標識オリゴヌクレオ
チドとして、固相固定化オリゴｄＴを用いた場合の本発
明各ステップの概略図を、図１に示す。
Ｘ処理後の断片を３′側又は５′側のいずれか一方を回
収するために、その片末端に標識オリゴヌクレオチドを
結合させたものを用いるのが好ましい。ここで、標識オ
リゴヌクレオチドとしては、固相固定化オリゴヌクレオ
チド、補酵素標識オリゴヌクレオチド等が挙げられる
が、再現性や目的断片の回収性の点から固相固定化オリ
ゴヌクレオチドが好ましく、ラテックスビーズ固定化オ
リゴヌクレオチド、マグネットビーズ固定化オリゴヌク
レオチド等がより好ましく、さらにラテックスビーズ固
定化オリゴヌクレオチドが特に好ましい。さらにまた、
標識オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分とし
ては、オリゴｄＴが特に好ましい。標識オリゴヌクレオ
チドとして、固相固定化オリゴｄＴを用いた場合の本発
明各ステップの概略図を、図１に示す。
【００１７】被検ｃＤＮＡとして片末端標識オリゴヌク
レオチド結合ｃＤＮＡを用いた場合には、これを４ｂ酵
素Ｘで処理し、該標識に基づいて回収すればＸ部位−標
識オリゴヌクレオチドＤＮＡ断片のみが得られる（図１
中、ステップ（１−ａ）参照）。ここで、標識体として
固相固定化体を用いた場合には、単に固相のみを回収す
れば目的とする断片が容易に得られる。
レオチド結合ｃＤＮＡを用いた場合には、これを４ｂ酵
素Ｘで処理し、該標識に基づいて回収すればＸ部位−標
識オリゴヌクレオチドＤＮＡ断片のみが得られる（図１
中、ステップ（１−ａ）参照）。ここで、標識体として
固相固定化体を用いた場合には、単に固相のみを回収す
れば目的とする断片が容易に得られる。
【００１８】次に得られた断片に、Ｘ部位に連結するリ
ンカーを連結させれば、リンカー−Ｘ断片結合物が得ら
れる（図１中、ステップ（１−ｂ）参照）。
ンカーを連結させれば、リンカー−Ｘ断片結合物が得ら
れる（図１中、ステップ（１−ｂ）参照）。
【００１９】さらに、リンカー−Ｘ断片結合物を４ｂ酵
素Ｙで処理すればリンカー−Ｘ部位−Ｙ部位からなる断
片が得られる（図１中、ステップ（１−ｃ）参照）。こ
こで、目的とする断片の回収は、標識体として固相固定
化体を用いた場合には、固相を除去し、液相を回収する
だけでよい。
素Ｙで処理すればリンカー−Ｘ部位−Ｙ部位からなる断
片が得られる（図１中、ステップ（１−ｃ）参照）。こ
こで、目的とする断片の回収は、標識体として固相固定
化体を用いた場合には、固相を除去し、液相を回収する
だけでよい。
【００２０】次に得られた断片に、Ｙ部位に連結するリ
ンカーを連結させれば、「リンカー−Ｘ部位−Ｙ部位−
リンカー」からなる断片のｃＤＮＡライブラリーが得ら
れる（図１中、ステップ（１−ｄ）参照）。
ンカーを連結させれば、「リンカー−Ｘ部位−Ｙ部位−
リンカー」からなる断片のｃＤＮＡライブラリーが得ら
れる（図１中、ステップ（１−ｄ）参照）。
【００２１】次にステップ（２）は、被検ｃＤＮＡを、
前記の４ｂ酵素Ｙで処理し、得られた断片のＹ部位に適
当なリンカーを連結し、さらに前記４ｂ酵素Ｘで処理
し、次に得られた断片のＸ部位に適当なリンカーを連結
することにより「リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカ
ー」からなるハーフｃＤＮＡライブラリーを得るステッ
プである。
前記の４ｂ酵素Ｙで処理し、得られた断片のＹ部位に適
当なリンカーを連結し、さらに前記４ｂ酵素Ｘで処理
し、次に得られた断片のＸ部位に適当なリンカーを連結
することにより「リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカ
ー」からなるハーフｃＤＮＡライブラリーを得るステッ
プである。
【００２２】このステップ（２）とステップ（１）と
は、４ｂ酵素ＸとＹの反応順序が異なり、それに伴ない
用いるリンカーも反応順序が異なるのみで、各反応操作
は同様である（図１、ステップ（２−ａ）−（２−ｄ）
参照）。従って、このステップ（２）も、前記のステッ
プ（１）同様に、（２−ａ）標識オリゴヌクレオチド結
合被検ｃＤＮＡを４ｂ酵素Ｙ処理してＹ部位−標識オリ
ゴヌクレオチドＤＮＡ断片を得、（２−ｂ）得られたＤ
ＮＡ断片にリンカーを連結させ、（２−ｃ）さらに４ｂ
酵素Ｘで処理し、（２−ｄ）次いでこれにリンカーを連
結させて、「リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカー」か
らなるＤＮＡ断片を得るのが好ましい。
は、４ｂ酵素ＸとＹの反応順序が異なり、それに伴ない
用いるリンカーも反応順序が異なるのみで、各反応操作
は同様である（図１、ステップ（２−ａ）−（２−ｄ）
参照）。従って、このステップ（２）も、前記のステッ
プ（１）同様に、（２−ａ）標識オリゴヌクレオチド結
合被検ｃＤＮＡを４ｂ酵素Ｙ処理してＹ部位−標識オリ
ゴヌクレオチドＤＮＡ断片を得、（２−ｂ）得られたＤ
ＮＡ断片にリンカーを連結させ、（２−ｃ）さらに４ｂ
酵素Ｘで処理し、（２−ｄ）次いでこれにリンカーを連
結させて、「リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカー」か
らなるＤＮＡ断片を得るのが好ましい。
【００２３】上記の如く、４ｂ酵素を２種用いれば、ハ
ーフライブラリーが２種作製される。必要に応じて４ｂ
酵素を３種以上用いることもできる。例えば４ｂ酵素を
３種（例えばＸ、Ｙ、Ｚ）用いた場合には、（１）リン
カー−Ｘ部位−Ｙ部位−リンカーからなる断片、（２）
リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカーからなる断片、
（３）リンカー−Ｘ部位−Ｚ部位−リンカーからなる断
片、（４）リンカー−Ｚ部位−Ｘ部位−リンカーからな
る断片、（５）リンカー−Ｙ部位−Ｚ部位−リンカーか
らなる断片、及び（６）リンカー−Ｚ部位−Ｙ部位−リ
ンカーからなる断片の６種のライブラリーが作製される
ことになる。２種の４ｂ酵素を用いて被検ｃＤＮＡに特
異的遺伝子の分別が困難な場合には、用いる４ｂ酵素の
数を３種又は４種と増加させれば、分別が可能となる。
このように、ステップ（３）は、任意のステップであ
る。
ーフライブラリーが２種作製される。必要に応じて４ｂ
酵素を３種以上用いることもできる。例えば４ｂ酵素を
３種（例えばＸ、Ｙ、Ｚ）用いた場合には、（１）リン
カー−Ｘ部位−Ｙ部位−リンカーからなる断片、（２）
リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカーからなる断片、
（３）リンカー−Ｘ部位−Ｚ部位−リンカーからなる断
片、（４）リンカー−Ｚ部位−Ｘ部位−リンカーからな
る断片、（５）リンカー−Ｙ部位−Ｚ部位−リンカーか
らなる断片、及び（６）リンカー−Ｚ部位−Ｙ部位−リ
ンカーからなる断片の６種のライブラリーが作製される
ことになる。２種の４ｂ酵素を用いて被検ｃＤＮＡに特
異的遺伝子の分別が困難な場合には、用いる４ｂ酵素の
数を３種又は４種と増加させれば、分別が可能となる。
このように、ステップ（３）は、任意のステップであ
る。
【００２４】ステップ（４）は、被検ｃＤＮＡから得ら
れた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラフパターン
と、他のｃＤＮＡから上記同様にして得られた２種以上
のＤＮＡ断片の各クロマトグラフパターンとをそれぞれ
対比して、被検ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子を検出又はク
ローニングする工程である。
れた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラフパターン
と、他のｃＤＮＡから上記同様にして得られた２種以上
のＤＮＡ断片の各クロマトグラフパターンとをそれぞれ
対比して、被検ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子を検出又はク
ローニングする工程である。
【００２５】前記ステップ（１）〜（３）で得られたＤ
ＮＡ断片は、前記の如くハーフライブラリーであるので
直接、例えばシークエンスゲルにて展開した後、泳動パ
ターンを対比することもできるが、標識オリゴヌクレオ
チドの存在下にＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片の増幅を行っ
てからシークエンスゲルに展開するのが好ましい。ここ
で、ＰＣＲは、前記のリンカー部分から設計されたプラ
イマーを用いればよい。また、クロマトグラフパターン
としては、各種シークエンスゲル電気泳動パターンが挙
げられる。
ＮＡ断片は、前記の如くハーフライブラリーであるので
直接、例えばシークエンスゲルにて展開した後、泳動パ
ターンを対比することもできるが、標識オリゴヌクレオ
チドの存在下にＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片の増幅を行っ
てからシークエンスゲルに展開するのが好ましい。ここ
で、ＰＣＲは、前記のリンカー部分から設計されたプラ
イマーを用いればよい。また、クロマトグラフパターン
としては、各種シークエンスゲル電気泳動パターンが挙
げられる。
【００２６】一方、対比すべき他のｃＤＮＡ由来のＤＮ
Ａ断片は、前記ステップ（１）〜（３）と同様にして得
る。この他のｃＤＮＡは、被検ｃＤＮＡの種類により選
択されるのが好ましく、例えば被検ｃＤＮＡが肝癌細胞
と思われる細胞由来のｃＤＮＡである場合には、正常肝
細胞由来のｃＤＮＡを用いるのが好ましい。また、当該
他のｃＤＮＡは１種である必要はなく、２種以上であっ
てもよい。
Ａ断片は、前記ステップ（１）〜（３）と同様にして得
る。この他のｃＤＮＡは、被検ｃＤＮＡの種類により選
択されるのが好ましく、例えば被検ｃＤＮＡが肝癌細胞
と思われる細胞由来のｃＤＮＡである場合には、正常肝
細胞由来のｃＤＮＡを用いるのが好ましい。また、当該
他のｃＤＮＡは１種である必要はなく、２種以上であっ
てもよい。
【００２７】なお、クロマトグラフパターンの対比は、
Ｘ−Ｙ断片同士、Ｙ−Ｘ断片同士を行う。かかる対比に
おいて、バンドの濃さに差がある部分が、被検ｃＤＮＡ
に特異的な遺伝子の断片である。従って、被検ｃＤＮＡ
に特異的に発現している遺伝子断片の分離が可能とな
る。なお、被検ｃＤＮＡ特異的遺伝子のクローニング
は、常法、例えばシークエンスゲル上のバンドの分取、
ＰＣＲ、既知のクローニング手段等を組み合わせること
により行われる。
Ｘ−Ｙ断片同士、Ｙ−Ｘ断片同士を行う。かかる対比に
おいて、バンドの濃さに差がある部分が、被検ｃＤＮＡ
に特異的な遺伝子の断片である。従って、被検ｃＤＮＡ
に特異的に発現している遺伝子断片の分離が可能とな
る。なお、被検ｃＤＮＡ特異的遺伝子のクローニング
は、常法、例えばシークエンスゲル上のバンドの分取、
ＰＣＲ、既知のクローニング手段等を組み合わせること
により行われる。
【００２８】好ましいクローニング手段としては、分取
したバンドをアイソトープを含まない条件下でＰＣＲを
行い、次いで既知のプラスミドへ組み込んでシークエン
スする方法が挙げられる。また、ＴＡクローニングキッ
トを用いることもできる。
したバンドをアイソトープを含まない条件下でＰＣＲを
行い、次いで既知のプラスミドへ組み込んでシークエン
スする方法が挙げられる。また、ＴＡクローニングキッ
トを用いることもできる。
【００２９】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。
【００３０】実施例１ 正常ヒト腎臓、正常ヒト肝臓及びヒト肝癌細胞からｍＲ
ＮＡを分離し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得た。そ
れぞれのｃＤＮＡについて以下の如くして特異的遺伝子
の検出及びクローニングを行った。
ＮＡを分離し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得た。そ
れぞれのｃＤＮＡについて以下の如くして特異的遺伝子
の検出及びクローニングを行った。
【００３１】まず、二本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄＴラテッ
クスビーズをプライマーとして合成し、産物を二分した
（以下、図２参照）。それぞれを４ｂ酵素ＮｌａIII及
びＳａｕ３ＡＩで切断した。反応液を遠心分離して沈澱
したラテックスビーズ部分を回収し、ｍＲＮＡの最も
３′末端に近いＮｌａIII又はＳａｕ３ＡＩ部位をもつ
ｃＤＮＡ断片を得た。これに下記の塩基配列を有するリ
ンカーＸ又はリンカーＹを図２の如く、Ｔ４ＤＮＡライ
ゲースを用いて連結した。
クスビーズをプライマーとして合成し、産物を二分した
（以下、図２参照）。それぞれを４ｂ酵素ＮｌａIII及
びＳａｕ３ＡＩで切断した。反応液を遠心分離して沈澱
したラテックスビーズ部分を回収し、ｍＲＮＡの最も
３′末端に近いＮｌａIII又はＳａｕ３ＡＩ部位をもつ
ｃＤＮＡ断片を得た。これに下記の塩基配列を有するリ
ンカーＸ又はリンカーＹを図２の如く、Ｔ４ＤＮＡライ
ゲースを用いて連結した。
【００３２】
【００３３】次に、図２の如く、前回とは逆にそれぞれ
をＳａｕ３ＡＩ又はＮｌａIIIで切断し、これらの断片
中で最も５′末端に近いリンカーＸ−ＮｌａIII−Ｓａ
ｕ３ＡＩ断片、又はリンカーＹ−Ｓａｕ３ＡＩ−Ｎｌａ
III断片をラテックスビーズから遊離させた。この部分
を遠心によりラテックスビーズから分離し、今度はそれ
ぞれの接着末端をもつ上記のリンカーを前回と逆の組み
合わせで連結した。このようにして両端に既知のリンカ
ーを接続したｃＤＮＡ断片のハーフライブラリーを２個
完成させた。
をＳａｕ３ＡＩ又はＮｌａIIIで切断し、これらの断片
中で最も５′末端に近いリンカーＸ−ＮｌａIII−Ｓａ
ｕ３ＡＩ断片、又はリンカーＹ−Ｓａｕ３ＡＩ−Ｎｌａ
III断片をラテックスビーズから遊離させた。この部分
を遠心によりラテックスビーズから分離し、今度はそれ
ぞれの接着末端をもつ上記のリンカーを前回と逆の組み
合わせで連結した。このようにして両端に既知のリンカ
ーを接続したｃＤＮＡ断片のハーフライブラリーを２個
完成させた。
【００３４】得られたそれぞれのハーフライブラリーに
ついてＰＣＲを行い、それらのサンプルをウレアを含ま
ない６％ポリアクリルアミドゲルにて展開した。ここで
ＰＣＲのプライマーとしては、リンカー部分の配列から
設計した下記のプライマーを用いた。
ついてＰＣＲを行い、それらのサンプルをウレアを含ま
ない６％ポリアクリルアミドゲルにて展開した。ここで
ＰＣＲのプライマーとしては、リンカー部分の配列から
設計した下記のプライマーを用いた。
【００３５】 ５′−CGAATGTACAGGATACGCCATG ５′−CATAGTCAGTTGCGACACGATC
【００３６】得られた結果を図３に示す。ここでＮＳ及
びＳＮはそれぞれ、４ｂ酵素、ＮｌａIIIとＳａｕ３Ａ
Ｉを用いた順序を示す。すなわち図２における左半分の
方法によって得られたサンプルがＮＳに相当し、右半分
がＳＮに相当する。数字１、２及び３はそれぞれ正常腎
細胞、正常肝細胞及び肝癌細胞に由来するサンプルであ
ることを示す。中央のレーンＭは分子量サイズマーカー
であり、ここでは市販の１００bpラダーを用いた。
びＳＮはそれぞれ、４ｂ酵素、ＮｌａIIIとＳａｕ３Ａ
Ｉを用いた順序を示す。すなわち図２における左半分の
方法によって得られたサンプルがＮＳに相当し、右半分
がＳＮに相当する。数字１、２及び３はそれぞれ正常腎
細胞、正常肝細胞及び肝癌細胞に由来するサンプルであ
ることを示す。中央のレーンＭは分子量サイズマーカー
であり、ここでは市販の１００bpラダーを用いた。
【００３７】上記と同様にして得られたそれぞれのハー
フライブラリーを32Ｐ−ｄＣＴＰの存在下にＰＣＲを行
い、６％のシークエンスゲルにて展開した後、オートラ
ジオグラムをとり、比較した。ここでＰＣＲのプライマ
ーは、前記と同じ。
フライブラリーを32Ｐ−ｄＣＴＰの存在下にＰＣＲを行
い、６％のシークエンスゲルにて展開した後、オートラ
ジオグラムをとり、比較した。ここでＰＣＲのプライマ
ーは、前記と同じ。
【００３８】図４に、結果を示す。ここでＮＳ及びＳ
Ｎ、さらに数字１、２及び３は図３に用いたのと同様の
内容を表す。
Ｎ、さらに数字１、２及び３は図３に用いたのと同様の
内容を表す。
【００３９】図３及び図４それぞれの泳動パターンは極
めて再現性がよく、また図からも明らかなように、肝と
肝癌のパターンはお互い似通っているが、腎のそれとは
一見して異なっていることが分かる。これらの事実もパ
ターン再現性の良好さを示す証拠のひとつである。
めて再現性がよく、また図からも明らかなように、肝と
肝癌のパターンはお互い似通っているが、腎のそれとは
一見して異なっていることが分かる。これらの事実もパ
ターン再現性の良好さを示す証拠のひとつである。
【００４０】これら多数のバンドの内、それぞれの組織
に特異的に見える部分を切り出し、水に浸した後、１０
０℃に５分間加温し、水層の一部を上記と同一のプライ
マーペアを用いてアイソトープを含まない条件下でのＰ
ＣＲを行い、増幅されたＤＮＡバンドを回収した後、プ
ラスミドに組み込みシークエンスを決定した。組み込み
ベクタープラスミドとして、制限酵素ＳｍａＩで切断
後、アルカリフォスファターゼ処理したｐＵＣ１１９を
用いた。
に特異的に見える部分を切り出し、水に浸した後、１０
０℃に５分間加温し、水層の一部を上記と同一のプライ
マーペアを用いてアイソトープを含まない条件下でのＰ
ＣＲを行い、増幅されたＤＮＡバンドを回収した後、プ
ラスミドに組み込みシークエンスを決定した。組み込み
ベクタープラスミドとして、制限酵素ＳｍａＩで切断
後、アルカリフォスファターゼ処理したｐＵＣ１１９を
用いた。
【００４１】既存のデータベースとのホモロジー検索を
行った結果の一部を表１に示す。それぞれの組織での発
現が高い遺伝子が選択的に分離されていることが分か
る。またこれらのうちのいくつかは過去報告のない遺伝
子であった。
行った結果の一部を表１に示す。それぞれの組織での発
現が高い遺伝子が選択的に分離されていることが分か
る。またこれらのうちのいくつかは過去報告のない遺伝
子であった。
【００４２】
【表１】
【００４３】これら単離されたクローンが実際その組織
に特異的に発現されているかどうかを確かめるために、
公知の標準的なノーザンブロットハイブリダイゼーショ
ン法を用いていくつかのクローンについて調べた。
に特異的に発現されているかどうかを確かめるために、
公知の標準的なノーザンブロットハイブリダイゼーショ
ン法を用いていくつかのクローンについて調べた。
【００４４】すなわち、正常腎細胞（１）、腎癌細胞
（２）、正常肝細胞（３）及び肝癌細胞（４）よりそれ
ぞれ全ＲＮＡを公知のグアニジンチオシアネート法によ
り抽出し、１０μｇずつを１．２％アガロース電気泳動
にて展開、ニトロセルロース紙に移し取り、アイソトー
プラベルした遺伝子小断片を用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行った。遺伝子は表１で明らかになったもののう
ち、ＨＦＲＥＰ−１、チトクロームｐ−４５０ｊ、グリ
セロアルデヒド３ｐデヒドロゲナーゼ及びチトクローム
ｃオキシダーゼｓｕｂ．IIの４者を用いた。遺伝子のア
イソトープラベルは市販のランダムプライムラベリング
キットを用いた。
（２）、正常肝細胞（３）及び肝癌細胞（４）よりそれ
ぞれ全ＲＮＡを公知のグアニジンチオシアネート法によ
り抽出し、１０μｇずつを１．２％アガロース電気泳動
にて展開、ニトロセルロース紙に移し取り、アイソトー
プラベルした遺伝子小断片を用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行った。遺伝子は表１で明らかになったもののう
ち、ＨＦＲＥＰ−１、チトクロームｐ−４５０ｊ、グリ
セロアルデヒド３ｐデヒドロゲナーゼ及びチトクローム
ｃオキシダーゼｓｕｂ．IIの４者を用いた。遺伝子のア
イソトープラベルは市販のランダムプライムラベリング
キットを用いた。
【００４５】図５に結果の一部を示すが、組織特異的発
現は歴然としており、本発明による泳動パターンに見ら
れた差異が、実際のｍＲＮＡ発現頻度の差異を正確に反
映していることが確認された。
現は歴然としており、本発明による泳動パターンに見ら
れた差異が、実際のｍＲＮＡ発現頻度の差異を正確に反
映していることが確認された。
【００４６】
【発明の効果】本発明によれば被検ｃＤＮＡ又は被検細
胞に特異的に発現している遺伝子を簡便な操作で、再現
性よく検出し、クローニングすることができる。本発明
によれば、任意のふたつの細胞における機能、形態上の
違いを遺伝子発現状態の差として明らかにできるので、
生理的条件下、あるいは病的状態におけるあらゆる生物
現象の解析に広く応用できる。
胞に特異的に発現している遺伝子を簡便な操作で、再現
性よく検出し、クローニングすることができる。本発明
によれば、任意のふたつの細胞における機能、形態上の
違いを遺伝子発現状態の差として明らかにできるので、
生理的条件下、あるいは病的状態におけるあらゆる生物
現象の解析に広く応用できる。
【図１】本発明方法の一実施態様を示す概略図である。
【図２】４ｂ酵素としてＮｌａIII及びＳａｕ３ＡＩを
用いた場合の本発明方法を示す概略図である。
用いた場合の本発明方法を示す概略図である。
【図３】正常腎細胞、正常肝細胞及び肝癌細胞間のｃＤ
ＮＡ小断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン
を示す図である。
ＮＡ小断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン
を示す図である。
【図４】正常腎細胞、正常肝細胞及び肝癌細胞間のシー
クエンスゲル電気泳動像を示す図である。
クエンスゲル電気泳動像を示す図である。
【図５】各種細胞由来の遺伝子のノーザンブロットによ
る電気泳動像を示す図である。
る電気泳動像を示す図である。
Claims (8)
- 【請求項１】 （１）被検ｃＤＮＡを、任意の４塩基認
識制限酵素Ｘ処理、該制限酵素Ｘ部位に連結するリンカ
ーの連結、該制限酵素Ｘとは異なる任意の４塩基認識制
限酵素Ｙ処理、次いで該制限酵素Ｙ部位に連結するリン
カーの連結を行い、リンカー−Ｘ部位−Ｙ部位−リンカ
ーからなるＤＮＡ断片を得、 （２）被検ｃＤＮＡを、前記制限酵素Ｙ処理、該制限酵
素Ｙ部位に連結するリンカーの連結、前記制限酵素Ｘ処
理、次いで該制限酵素Ｘ部位に連結するリンカーの連結
を行い、リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカーからなる
ＤＮＡ断片を得、 （３）必要により、さらに前記Ｘ及びＹと異なる任意の
４塩基認識制限酵素を１種以上用いて同様の操作により
相互に異なる４塩基認識制限酵素部位間の断片の両端に
リンカーが連結したＤＮＡ断片を得、 （４）得られた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラ
フパターンと、被検ｃＤＮＡと異なる他の少なくとも１
種のｃＤＮＡから前記（１）〜（３）と同様にして得ら
れた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラフパターン
とをそれぞれ対比することを特徴とする、被検ｃＤＮＡ
中の特異的遺伝子の検出方法。 - 【請求項２】 ステップ（１）が、（１−ａ）片末端に
標識オリゴヌクレオチドが結合した被検ｃＤＮＡを任意
の４塩基認識制限酵素Ｘ処理して、該制限酵素Ｘ部位−
標識オリゴヌクレオチドＤＮＡ断片を得、 （１−ｂ）（１−ａ）で得たＤＮＡ断片の該制限酵素Ｘ
部位に連結するリンカーを連結させ、 （１−ｃ）（１−ｂ）で得たＤＮＡ断片を該制限酵素Ｘ
とは異なる任意の４塩基認識制限酵素Ｙ処理し、 （１−ｄ）次いでこれに該制限酵素Ｙ部位に連結するリ
ンカーを連結させて、リンカー−Ｘ部位−Ｙ部位−リン
カーからなるＤＮＡ断片を得るものであり；ステップ
（２）が、（２−ａ）片末端に標識オリゴヌクレオチド
が結合した被検ｃＤＮＡを前記制限酵素Ｙ処理して、該
制限酵素Ｙ部位−標識オリゴヌクレオチドＤＮＡ断片を
得、 （２−ｂ）（２−ａ）で得たＤＮＡ断片の該制限酵素Ｙ
部位に連結するリンカーを連結させ、 （２−ｃ）（２−ｂ）で得たＤＮＡ断片を該制限酵素Ｘ
処理し、 （２−ｄ）次いでこれに該制限酵素Ｘ部位に連結するリ
ンカーを連結させて、リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リン
カーからなるＤＮＡ断片を得るものである請求項１記載
の被検ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出方法。 - 【請求項３】 ステップ（４）のクロマトグラフパター
ンが、得られた２種以上のＤＮＡ断片のＰＣＲ産物のク
ロマトグラフパターンである請求項１又は２記載の被検
ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出方法。 - 【請求項４】 請求項１〜３における被検ｃＤＮＡとし
て被検細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡを用いることを特徴とす
る被検細胞の特異的遺伝子の検出方法。 - 【請求項５】 （１）被検ｃＤＮＡを、任意の４塩基認
識制限酵素Ｘ処理、該制限酵素Ｘ部位に連結するリンカ
ーの連結、該制限酵素Ｘとは異なる任意の４塩基認識制
限酵素Ｙ処理、次いで該制限酵素Ｙ部位に連結するリン
カーの連結を行い、リンカー−Ｘ部位−Ｙ部位−リンカ
ーからなるＤＮＡ断片を得、 （２）被検ｃＤＮＡを、前記制限酵素Ｙ処理、該制限酵
素Ｙ部位に連結するリンカーの連結、前記制限酵素Ｘ処
理、次いで該制限酵素Ｘ部位に連結するリンカーの連結
を行い、リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リンカーからなる
ＤＮＡ断片を得、 （３）必要により、さらに前記Ｘ及びＹと異なる任意の
４塩基認識制限酵素を１種以上用いて同様の操作により
相互に異なる４塩基認識制限酵素部位間の断片の両端に
リンカーが連結したＤＮＡ断片を得、 （４）得られた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラ
フパターンと、被検ｃＤＮＡと異なる他の少なくとも１
種のｃＤＮＡから前記（１）〜（３）と同様にして得ら
れた２種以上のＤＮＡ断片の各クロマトグラフパターン
とをそれぞれ対比し、被検ｃＤＮＡに特異的な遺伝子を
分離することを特徴とする、被検ｃＤＮＡ特異的遺伝子
のクローニング法。 - 【請求項６】 ステップ（１）が、（１−ａ）片末端に
標識オリゴヌクレオチドが結合した被検ｃＤＮＡを任意
の４塩基認識制限酵素Ｘ処理して、該制限酵素Ｘ部位−
標識オリゴヌクレオチドＤＮＡ断片を得、 （１−ｂ）（１−ａ）で得たＤＮＡ断片の該制限酵素Ｘ
部位に連結するリンカーを連結させ、 （１−ｃ）（１−ｂ）で得たＤＮＡ断片を該制限酵素Ｘ
とは異なる任意の４塩基認識制限酵素Ｙ処理し、 （１−ｄ）次いでこれに該制限酵素Ｙ部位に連結するリ
ンカーを連結させて、リンカー−Ｘ部位−Ｙ部位−リン
カーからなるＤＮＡ断片を得るものであり；ステップ
（２）が、（２−ａ）片末端に標識オリゴヌクレオチド
が結合した被検ｃＤＮＡを前記制限酵素Ｙ処理して、該
制限酵素Ｙ部位−標識オリゴヌクレオチドＤＮＡ断片を
得、 （２−ｂ）（１−ｄ）で得たＤＮＡ断片の該制限酵素Ｙ
部位に連結するリンカーを連結させ、 （２−ｃ）（２−ｂ）で得たＤＮＡ断片を該制限酵素Ｘ
処理し、 （２−ｄ）次いでこれに該制限酵素Ｘ部位に連結するリ
ンカーを連結させて、リンカー−Ｙ部位−Ｘ部位−リン
カーからなるＤＮＡ断片を得るものである請求項４記載
の被検ｃＤＮＡ特異的遺伝子のクローニング法。 - 【請求項７】 ステップ（４）のクロマトグラフパター
ンが、得られた２種以上のＤＮＡ断片のＰＣＲ産物のク
ロマトグラフパターンである請求項４又は５記載の被検
ｃＤＮＡ特異的遺伝子のクローニング法。 - 【請求項８】 請求項５〜７における被検ｃＤＮＡとし
て被検細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡを用いることを特徴とす
る被検細胞特異的遺伝子のクローニング法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10000857A JPH11192090A (ja) | 1998-01-06 | 1998-01-06 | ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出及びクローニング法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10000857A JPH11192090A (ja) | 1998-01-06 | 1998-01-06 | ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出及びクローニング法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11192090A true JPH11192090A (ja) | 1999-07-21 |
Family
ID=11485337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10000857A Pending JPH11192090A (ja) | 1998-01-06 | 1998-01-06 | ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出及びクローニング法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11192090A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001076917A1 (fr) * | 2000-04-11 | 2001-10-18 | Nihon Plast Co.,Ltd. | Procede et dispositif de pliage d'un coussin gonflable de securite et coussin gonflable de securite |
| JP2007129934A (ja) * | 2005-11-09 | 2007-05-31 | Tokyo Metropolitan Univ | 遺伝子探索ベクター隣接ゲノム配列の同定方法、及び酸化ストレス感受性変異体 |
-
1998
- 1998-01-06 JP JP10000857A patent/JPH11192090A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001076917A1 (fr) * | 2000-04-11 | 2001-10-18 | Nihon Plast Co.,Ltd. | Procede et dispositif de pliage d'un coussin gonflable de securite et coussin gonflable de securite |
| JP2007129934A (ja) * | 2005-11-09 | 2007-05-31 | Tokyo Metropolitan Univ | 遺伝子探索ベクター隣接ゲノム配列の同定方法、及び酸化ストレス感受性変異体 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5935825A (en) | Process and reagent for amplifying nucleic acid sequences | |
| US5262311A (en) | Methods to clone polyA mRNA | |
| JP3535159B2 (ja) | Ｄｎａ分析への選択的アプローチ | |
| US5599672A (en) | Method of differential display of exposed mRNA by RT/PCR | |
| EP0456304B1 (en) | Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by avidin-biotin cleavage | |
| EP0668867B1 (en) | Multidomain nucleic acid ligands for affinity chromatography and use of dna bound to solid-phase | |
| US5827658A (en) | Isolation of amplified genes via cDNA subtractive hybridization | |
| Gromova et al. | Identification of true differentially expressed mRNAs in a pair of human bladder transitional cell carcinomas using an improved differential display procedure | |
| WO1991011533A1 (en) | Method for isolating primer extension products from template-directed dna polymerase reactions | |
| JPH02503515A (ja) | 標識された相補的核酸プローブを開裂する触媒反応の補因子としての活性に基づく核酸配列検出のための触媒ハイブリッド形成系 | |
| JPH07184698A (ja) | 標識用組成物 | |
| JPH07509371A (ja) | 核酸配列の検出及び増幅のための方法，試薬及びキット | |
| JPS60501141A (ja) | 細胞におけるヌクレオチド配列の測定方法および細胞からの核酸の単離方法 | |
| JPH0398586A (ja) | プライマー３′末端におけるプライマーと標的のミスマッチを克服する診断および増幅方法 | |
| US6528256B1 (en) | Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cDNA and genomic DNA | |
| EP1105527A1 (en) | Method of identifying gene transcription patterns | |
| JP3452717B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| US20090053698A1 (en) | Method for obtaining subtraction polynucleotide | |
| JPH05508305A (ja) | 非特異的ｄｎａ増幅 | |
| JP3853161B2 (ja) | 微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法 | |
| JPH025863A (ja) | 相補的鎖からなる関連する対象および参照高分子の処理方法 | |
| JPH11192090A (ja) | ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の検出及びクローニング法 | |
| EP0458909A1 (en) | Oligonucleotide primer pairs for sequence independent gene amplification and methods which employ them | |
| JP3416981B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| JP3494509B2 (ja) | 核酸合成法 |