BR112019022665A2 - métodos de tratamento usando um composto inibidor de jak - Google Patents

Abstract

a invenção relaciona os métodos de tratamento de doenças oculares e algumas doenças respiratórias usando o composto 5 etil-2-fluoro-4-(3-(5-(1-metilpiperidin-4-il)-4,5,6,7-tetraidro-1h-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1h-indazol-6-il)fenol ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Description

MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO UM COMPOSTO INIBIDOR DE JAK HISTÓRICO DA INVENÇÃO Campo da invenção [0011 A presente invenção destina-se a métodos para tratar doenças oculares e algumas doenças respiratórias ao usar um composto inibidor de JAK particular ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico. Estado da arte [002] As citocinas são moléculas de sinalização intracelular que incluem quimiocinas, interferonas, interleucinas, linfocinas e fator de necrose tumoral. As citocinas são críticas para o crescimento celular normal e a imunorregulação, mas também disparam doenças mediadas pelo sistema imune e contribuem para o crescimento de células malignas. Níveis elevados de várias citocinas estão envolvidos na patologia de um grande número de doenças ou condições, em particular, aquelas doenças caracterizadas por inflamação. Muitas das citocinas envolvidas na doença agem por meio de vias de sinalização dependentes da família Janus de tirosina-quinases (JAKs), que sinalizam via a família de Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição (STAT) de fatores de transcrição.

[003] A família JAK é composta por quatro membros, JAK1, JAK2, JAK3 e tirosina quinase 2 (TYK2) . A ligação da citocina a um receptor de citocina dependente de JAK induz a dimerização do receptor que resulta na fosforilação de resíduos de tirosina na JAK quinase, ativando a JAK. As JAKs fosforiladas, por sua vez, se ligam e fosforilam várias proteínas STAT que dimerizam, internalizam no núcleo da célula e modulam diretamente a transcrição do gene, levando

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 20/107 entre outros efeitos, a efeitos downstream associados com a doença inflamatória. As JAKs em geral se associam com receptores de citocina em pares como homodímeros e heterodimeros. As citocinas específicas estão associadas com pareamentos específicos de JAK. Cada um dos quatro membros da família JAK está envolvido na sinalização de pelo menos uma das citocinas associadas com a inflamação.

[004] A inflamação desempenha um papel proeminente em muitas doenças oculares, incluindo uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade e ceratoconjuntivite atópica. A uveíte engloba múltiplas condições inflamatórias e é muitas vezes autoimune, surgindo sem. um gatilho infeccioso conhecido. Estima-se que a condição afete cerca de 2 milhões de pacientes nos EUA. Em alguns pacientes, a inflamação crônica associada à uveíte leva à destruição de tecido e é a quinta principal causa de cegueira nos EUA. As citocinas elevadas nos olhos de pacientes com uveíte que sinalizam através da via JAK-STAT incluem IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-

10, IL-23	e IFN-γ.	(Horai	e Caspi, J I	'nterferon	Cytokine Res
2011, 31,	733-744;	Ooi et	al, Clinicai	Medicine	and Research
2006, 4,	294-309) .	As ter	apias existe'	Ωι L Θ S p <3 I? cL	a uveíte sã*

frequentemente subótimas muitos pacientes sao mal controlados. Os esteroides, embora muitas vezes eficazes.

estão associados a cataratas e ao aumento da pressão i n t r a o cu1ar/g1aucoma.

[005] A retinopatia diabética (RD) é causada por danos nos vasos sanguíneos da retina. Ê a causa mais comum de perda de visão entre as pessoas com diabetes. A angiogênese, assim como as vias inflamatórias, desempenha um

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 21/107 papel Importante na doença. Multas vezes, a RD progride para edema macular diabético (EMD), a causa mais frequente de perda de visão em pacientes com diabetes. Estima-se que a condição afete cerca de 1,5 milhões de pacientes apenas nos EUA, dos quais cerca de 20% têm doenças que afetam, ambos os olhos. Acredita-se que as citocinas que sinalizam através da via JAK-STAT, como a IL-6, assim como outras citocinas, como a IP-10 e a MCP-1 (alternativamente conhecida como CCL2), cuja produção é impulsionada em parte pela via de sinalização JAK-STAT desempenham um. papel na inflamação associada com DR/EMD (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 1-12; Sohn et al., American Journal of Optnalmology, 2011, 152, 686-694; Owen e Hartnett, Curr Diab

Rep, 2013, 13, 47	6-480;	Cheung et al,	Mol ec	’ular Vision,
2012, 18, 830-837;	Dong e	t al, Moleculai	Visic	)n, 2013, 19,
1734-1746; Funatsu	e t a 1,	Ophthalmology,	2009,	116, 73-7 9) .

As terapias existentes para o EMD são subótimas: os tratamentos anti-VEGF intravítreos só são eficazes em. uma fração dos pacientes e os esteroides estão associados às cataratas e ao aumento da pressão intraocular.

[006] A doença do olho seco (DED) é uma doença multifatorial que afeta aproximadamente 5 milhõesde pacientes nos EUA. Acredita-se que a inflamaçãoda superfície ocular desempenha um papel importanteno desenvolvimento e propagação desta doença. Foram observados níveis elevados de citocinas como IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 e IFN-γ nos fluidos oculares de pacientes com DED. (Stevenson et. al. Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), e frequentemente, os níveis correlacionam-se com a gravidade da doença. A degeneração macular relacionada à idade e a

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 22/107 //9 ceratoconjuntivite atópica também estão associadas a citocinas dependentes de JAK.

[007] Considerando o número de citocinas elevadas nas doenças inflamatórias e que cada citocina está associada a um pareamento de JAK particular, seria desejável fornecer um inibidor químico com atividade abrangente contra todos os membros da família JAK para o tratamento de doença ocular. Entretanto, o amplo efeito anti-inflamatório de tais inibidores pode suprimir a função das células imunológicas normais, levando pot.encialm.ente ao aumento do risco de infecção. Seria desejável, portanto, fornecer um inibidor que possa ser administrado no local de ação no olho, assim limitando a potencial imunossupressão sistêmica adversa.

[008] Comumente designado Pedido EUA No. de Série

15/341.226, depositado em 2 de novembro de 2016 divulga compostos de diamino úteis como inibidores de JAK. Em particular, o composto 5-etil-2-fluoro-4-(3-(5-(1metilpiperidin-4-il)-4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5c]piridin-2-il)-lH-indazol-6-il)fenol (composto 1).

É espec

camente divulgado no pedido como um potente inibidor de JAK de ampla ação.

Este pedido divulga vários usos do composto 1, em particular, o tratamento e doenças respiratórias incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 23/107 crônica (DPOC), fibrose cistica (FC), pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome de angústia respiratória aguda, bronquite, enfisema e bronquiolite obliterante. Entretanto, este pedido não divulga o uso do composto 1 para o tratamento de doença ocular.

RESUMO DA INVENÇÃO

[009] Ά presente invenção diz respeito a. métodos de tratamento de doenças oculares ou seus sintomas usando o inibidor de JAK, 5-etil~2-fluoro-4-(3-(5-(l-metilpiperidin-4il)-4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1Hindazol-6-il)fenol ou um sal aceitável do ponto de vista f a rm a c ê u t i c o .

[0010] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença ocular em um paciente humano, o método compreendendo administrar ao olho do paciente, composto 5-etil-2-fluoro-4-(3-(5-(l-metilpiperidin-4-il)4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-IH-indazol-

doravante composto 1, ou um. sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

[0011] Em um aspecto, a doença ocular é uveite, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença, do

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6/7 9 olho seco, degeneração macular relacionada à idade ou ceratoconjuntivite atópica. Em particular, a doença ocular é uveite ou edema macular diabético.

[0012] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica de 5-etil~2~fluoro-4-(3-(5-(1~ metilpiperidin-4-il)-4,5,6,7-tetraidro-lü-imidazo[4,5c]piridin~2~il)-IH-indazol-6-il)fenol (composto 1) ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, onde a composição farmacêutica é adequada para administração direta no olho de um paciente.

[0013] Ά presente invenção diz ainda respeito aos métodos de uso do composto 1 para tratar determinadas Q Ο Θ Pi Ç 3. S T Θ S p -1.1? Η u 01? .1 â S .

[0014] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença respiratória em um mamífero, o método compreendendo administrar ao mamífero uma composição farmacêutica compreendendo o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico, onde a doença respiratória é uma ir ção pulmonar helmint hiperte bronquiec uma.

[0015]

Ainda em out asoecto mvenç fornece um de uma do em admini um.í aceitável de jmposto 1 farmacêutico ou monite f árma

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 25/107 pneumonite induzida por fungos, aspergilose bronc.opulm.onar alérgica, pneumonite por hipersensibilidade, granulomatose eosinofílica com poliangeíte, pneumonia eosinofílica idiopática aguda, síndrome hipereosinofílica, sindrome de Lõffler, bronquiolite obliterante com pneumonia em organização ou pneumonite induzida por inibidor do ponto de verificação imunológico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0016] As estruturas químicas são nomeadas nesse relatório de acordo com. as convenções da IUPAC como implementado no programa ChemDraw (PerkinElmer, Inc.,

Cambridge, MA). [0017] Além disso, a porção imidazo da porção tetraidroimidazopiridina na estrutura do presente composto existe nas formas tautoméricas. 0 composto podería ser representado de forma equivalente como

IUPAC, cl S representações dão origens

Tumerações dos átomos da porção imidazopiridina. Portanto, esta estrutura é designada 5~etil~2-fluoro-4-(3-(5-(l-metilpiperidin~4~il) 4,5,6,7-tetraidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-IH-indazol6-il)fenol. Deve-se compreender que, embora as estruturas sejam apresentadas ou nomeadas, em. uma forma particular, a invenção também inclui seu tautômero.

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Definições

[0019] Quando descritos na presente invenção, os seguintes termos têm os significados abaixo, a menos que seja indicado de outra forma.

[0020] O singular um e o/a inclui os correspondentes termos no plural, a menos que o contexto de uso define claramente o contrário.

[0021] 0 termo cerca de significa ± 5 % do valor e s p e c i r r c a cl o .

[0022] O termo quantidade terapeuticamente efetiva significa uma quantidade suficiente para fazer o tratamento quando administrado a um doente que precisa, por exemplo, a quantidade necessária para obter o efeito terapêutico desej ado.

[0023] O termo para tratar ou tratamento significa atenuar ou suprimir a doença ou distúrbio médico a ser tratado (p. ex., uma doença respiratória) um paciente (em particular, um humano); ou aliviar os sintomas da doença ou distúrbio médico.

[0024] O termo forma farmacêutica unitária refere-se a uma unidade separada fisicamente adequada para administrar a um paciente, ou seja, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de um agente terapêutico calculado para produzir o efeito terapêutico desejado, isolado ou combinado com uma ou mais unidades adicionais. Os exemplos incluem cápsulas, comprimidos e similares.

[0025] Todos os termos usados neste documento são destinados a ter o seu sentido comum, como entendido por aqueles que são versados na técnica.

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[0026] O termo aceitável do ponto de vista farmacêutico significa aceitável para administração ao paciente (por exemplo, segurança aceitável para o uso especiiicado).

[0027] 0 termo sal aceitável do ponto

de vista

farmacêutico significa um sal preparado a partir de um ácido ou base (incluindo zwitterions (sal interno)) que é aceitável para a administração a um paciente (por exemplo,

sal com segurança aceitável para um determinado

regime de

posologia).

[0028] Os sais aceitáveis do ponto	de vista
farmacêutico incluem sais de ácido acético,	ascórbico,
b e n z e η o s s u1fôn i co, benzoico, cantorsu1fônico,	cítrico,
etanossulfônico, edisílico, fumárico, gentísico,	glicônico,
glicurônico, glutâmico, hipúrico, bromídrico, (	clorídrico,
isetionônico, lático, lactobiônico, maleico,	málico,
mandélico, metanossulfônico, múcico, naftalenoí	5sulfônico,
naftaleno-1,5-dissulfônico, naftaleno-2,6-dif	ssulfônico,
nicotinico, nitrico, orótico, pamoico, pe	3 n t. o t ê n 2. c o,

fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, toluenossulfônico e xinafoico e similares.

[0029] O termo seu sal significa um composto formado quando o hidrogênio de um ácido é substituído por um cátion, como um cátion de metal ou um cátion orgânico e similares.

Composto· 1

[0030] O presente método da invenção usa 5-etil-2fluoro~4“ (3~ (5~ (l~m.etilpiperidin-4-il) ~4,5, 6, 7-tetraidro-l.Him.ida.zo [4,5-c] piridin~2~il) -l.H-indazol~6~il) fenol (composto 1).

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 28/107 um s a 1

Η aceitável do ponto de farmacêutico.

no Pedido EUA No de /341.226 ou exemplos um t( omposi empreq na de lino de base por raç de raio (PXRD) com picos dii ão signi outros

2Θ

19,2810,20 e

6,2010,20

21,5110,20. A preparação do hidrato cristalino também está descrita no EUA No. de série 15/341.22 6 e nos exemplos a seguir.

Composições farmacêuticas

0033] O presente compost

5-eti1-2-f1uoro-4-(3-(5- (1metilpiperidin-4-il) -4,5, 6, V-tetraidro-lJT-imidazo [4,5c]piridin

1)-IH-indazol

1)fenol (1) aceitáveis do ponto de vista farmacêutico são geralmente usados na forma de uma composição ou formulação farmacêutica. Tais composições farmacêuticas podem, ser administradas, de forma. vantajosa, a um. paciente por qualquer via. de administração aceitável, incluindo, mas não limitada às, formas de administração oral, por inalação, por injeção

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 29/107 / 7 9 tópica, tópica (incluindo a transdérmica), retal, nasal e parenteral.

[0034] As composições farmacêuticas usadas na invenção contêm em. geral uma. quantidade terapeuticamente eficaz do composto 1. Aqueles que são versados na técnica vão reconhecer, porém, que uma composição farmacêutica pode ter mais de uma quantidade terapêutica eficaz, ou seja, composições a granel ou menos de uma quantidade terapêutica eficaz, ou seja, doses unitárias individuais projetadas para a administração de doses múltiplas para atingir uma quantidade terapêutica eficaz. Quando falamos de composições e seus usos, o composto 1 também pode ser aqui referido como o agente ativo.

[0035] Norm.alment.e, as composições farmacêuticas vão conter cerca de 0,01 a 95%, em peso do agente ativo, incluindo, por exemplo, a partir de cerca de 0,05 a cerca de 30%, em peso e a partir de 0,1% a cerca de 10% em peso do a g e n t. e a t. i v o .

[0036] Quaisquer carreador ou excipiente convencionais podem ser usados nas composições farmacêuticas usadas na invenção. A. escolha de um determinado carreador ou excipiente, ou combinações de carreadores ou excipientes, dependerá do modo de administração a ser usado para tratar um paciente em particular ou tipo do estado de doença ou condição médica. Neste contexto, a preparação de uma composição farmacêutica adequada para um determinado modo de administração está bem. dentro do escopo daqueles que são versados na. técnica farmacêutica. Além, disso, os carreadores ou excipientes usados nas composições farmacêuticas desta invenção estão comercialmente disponíveis. Por meio de outra

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 30/107 ilustração, as técnicas de formulação convencionais estão descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^a edição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Mariland (2000) ; e H.C. Ansel et al.,

Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, edição, Lippincott Williams

White, Baltimore, Maryland '1999)

[0037] Exemplos representativos de materiais que podem servir como carreadores aceitáveis do ponto e vista farmacêutico incluem, mas não estão limitados aos seguintes: açúcares, como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como o amido de milho e fécula; celulose, como celulose microcristalina, e seus derivados, como a carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó'.; malte; gelatina; talco; excipientes, como a manteiga de cacau e ceras de supositórios; óleos, como óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, como propilenoglicol; polióis, tais como a glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol;

ésteres,	como	oleato	de	e t i 1 a	e laurato	de etila; ágar;
agentes	tampoi	aanres,	cc	mo o	hidróxido	de magnésio e
hidróxido	de	alumín	io;	ci C i Cl O	a 1 g 1 n 1 c o;	á gu a ap i r ó g e n a;

solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções tampão de fosfato e outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas em composições farmacêuticas.

[0038] As composições farmacêuticas são geralmente preparadas ao agitar ou misturar completamente e de forma eficiente o agente ativo com um carreador e um ou mais ingredientes opcionais aceitos do ponto de vista

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 31/107 farmacêutico. A mistura agitada uniformemente resultante pode então ser moldada ou carregada em comprimidos, cápsulas, pílulas e similares usando procedimentos e equipamentos convencionais.

[0039] Em. um. aspecto, a composição farmacêutica é adequada para injeção ocular. Neste aspecto, o composto pode ser formulado como uma suspensão ou solução aquosa estéril. Excipientes úteis que podem ser incluídos em tal formulação aquosa incluem polissorbato 80, carboximetilcelulose, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, acetato de sódio, citrato de sódio, histidina, di-idrato de α-α-trealose, sacarose, polissorbato 20, hidroxipropil-βciclodextrina e fosfato de sódio. O álcool benzilico pode servir como conservante e o cloreto de sódio pode ser incluído para ajustar a tonicidade. Além disso, o ácido clorídrico e/ou hidróxido de sódio podem ser adicionados à solução para ajustar o pH. As formulações aquosas para injeção ocular podem, ser preparadas sem conservantes.

[0040] Em um aspecto, a composição farmacêutica é adequada para administração por inalação. As composições farmacêuticas adequadas para administração por inalação estão tipicamente na forma de aerossol ou pó. Tais composições são geralmente administradas usando dispositivos de liberação inaladores, como um inalador dosimetrado (IDM), dispositivo de liberação sim.il um inalador de pó seco (DPI), um inalador nebulizador ou um

[0041] Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica é administrada por inalação através de um inalador de pó seco. Tais inaladores de pó seco normalmente administram a composição farmacêutica como um pó de fluxo

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 32/107 '1 4 / 7 9 livre que é dispersado no fluxo de ar do paciente durante a inspiração. Para obter uma composição em pó de fluxo livre, o agente terapêutico geralmente é formulado com um excipiente adequado como lactose, amido, manitol, dextrose, ácido polilático (PLA), poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) ou suas combinações. Tipicamente, o agente terapêutico é micronizado e combinado com um carreador adequado para formar uma composição adequada para inalação.

[0042] Uma composição farmacêutica representativa para uso em um. inalador de pó seco compreende lactose e o composto da invenção na forma micronizada. Tal composição de pó seco pode ser preparada, por exemplo, ao combinar lactose seca e triturada com o agente terapêutico e então misturar os componentes a seco. A composição é norm.alm.ente carregada em um dispensador de pó seco, em cartuchos ou cápsulas de inalação para uso em um dispositivo de liberação de pó seco.

[0043] Os dispositivos inaladores de pó seco adequados para administrar os agentes terapêuticos são descritos na técnica e exemplos de tais dispositivos estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, os dispositivos ou produtos de liberação inalador de pó seco incluem Aeolizer (Novartis); Airmax (IVAX); ClickHaler (Innovata Biomed); Diskhaler (GlaxoSmithKline); Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline); Ellipta (GlaxoSmithKline); Easynaler (Orion Pharma); Eclipse (Aventis); FlowCaps (Hovione); Handihaler (Boehringer Ingelheim.) ; Pulvinal (Chiesi) ; Rotahaler (GlaxoSmithKline) ; SkyeHaler/Certihaler (SkyePharma); Twisthaler (ScheringPlough) ; Turbuhaler (AstraZeneca); Ultrahaler (Aventis) e similares.

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[0044] Em outra modalidade particular, composição farmacêutica é administrada por inalação através de um inalador dosimetrado.

i η a 1 a cio r e s do s ime t r ados descarregam uma quantidade medida de um agente terapêutico usando um gás propulsor com.prim.ido. Assim, as composições farmacêuticas administradas usando um inalador dosimetradc tipicamente compreendem uma solução ou suspensão do agente terapêutico em um propelente liquefeito. Qualquer propelente liquefeito adequado pode ser empregado inclusive hidrofluoroalcanos (HFAs), como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) e 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano, (HFA 227); e clorofluorocarbonos, como CCI3F. Em uma modalidade particular, o propelente são hidrofluoroalcanos. Em. algumas modalidades, a formulação de hidrofluoroalcano contém um. cossolvente, como etanol ou pentano e/ou um surfactante, como trioleato de sorbinato, ácido oleico, lecitina e glicerina.

[0045] Uma composição farmacêutica representativa para uso em um inalador dosimetrado compreende de cerca, de 0,01% a cerca de 5% em peso do composto da invenção; de cerca de

0% a cerca de 20% em peso do composto da invenção e de cerca de em.

de riactante im pi lente HFA.

Tais compo são normalmente pela adição de hidrof luoroalcan· ref rigerade a um cL P r O p r _L (se

Pai preparar agente é micron comb in ade arregada em um cipiente

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 34/107 aerossol, que normalmente faz parte de um dispositivo inalador dosimetrado.

[0046] Os dispositivos inaladores dosimetrados adequados para administrar os agentes terapêuticos são descritos na técnica e exemplos de tais dispositivos estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, os dispositivos inaladores dosimetrados ou produtos representantes incluem AeroBid Inhaler System (Forest Pharmaceuticals); Atrovent Inhalation Aerosol (Boehringer Ingelheim); Flovent (GlaxoSmithKline); Maxair Inhaler (3M); Proventil Inhaler (Schering); Serevent Inhalation Aerosol (GlaxoSmithKline) e similares

[0047] Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica é administrada por inalação através de um inalador nebulizador. Tais dispositivos nebulizadores geralmente produzem um vapor de ar de alta velocidade que faz com que a composição farmacêutica pulverize como uma névoa que é carreada para o trato respiratório do paciente. Assim, quando formulado para uso em um nebulizador inalador, o agente terapêutico pode ser dissolvido em um carreador adequado para formar uma solução. Por outro lado, o agente terapêutico pode ser micronizado ou nanotriturado e combinado com um. carreador adequado para formar uma suspensão.

[0048] Uma composição farmacêutica representativa para uso em um inalador nebulizador compreende uma solução ou suspensão compreendendo cerca de 0,05 ug/ml a cerca de 20 mg/ml do composto da invenção e excipientes compatíveis com as formulações nebulizadas. Em uma modalidade, a solução tem um oH de cerca de 3 a cerca de 8.

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[0049] Os dispositivos inaladores nebulizadores adequados para administrar os agentes terapêuticos são descritos na técnica e exemplos de tais dispositivos estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, dispositivos nebulizadores ou produtos representantes incluem, o Respimat Softmist Inhaler (Boehringer Ingelheim) ; AERx Pulmonary Delivery System (Aradigm Corp.); PARI LC Plus Reusable Nebulizer (Pari GmbH) e similares.

[0050] Em ainda outro aspecto, as composições f armacêuticas da invenção podem., alternativamente, ser preparadas em uma forma farmacêutica destinada para a administração por via oral. As composições farmacêuticas adequadas para administração por via oral podem estar na forma de cápsulas, comprimidos, pastilhas, pílulas, drágeas, pós, grânulos, ou como uma solução ou suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo em água, ou água em óleo; ou como um elixir ou xarope e similares; cada uma contendo uma quantidade predeterminada de um composto da. presente invenção como um ingrediente cL u ΐ V O o

[0051] Quando destinadas à administração por via oral em uma forma farmacêutica sólida, as composições farmacêuticas da invenção geralmente incluirão o agente ativo e um ou mais carreadores aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, como citrato de sódio ou fosfato bicálcico. Opcional ou alternativamente, tais formas farmacêuticas sólidas também podem compreender: preenchedores ou extensores, ligantes, umectantes, agentes retardadores de solução, aceleradores de absorção, agentes umectantes, absorventes, lubrificantes, agentes colorantes e agentes

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 36/107 tamponantes. Os agentes de liberação, uinectantes, de revestimento, adoçantes, edulcorantes e aromatizantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição de composições farmacêuticas da invenção.

[0052] As formulações alternativas podem também incluir formulações de liberação controlada, formas farmacêuticas liquidas para administração por via oral, adesivos transdérmicos e formulações parenterais. Os excipientes convencionais e os métodos de preparação de tais formulações alternativas são descritos, por exemplo, na referência por Remington, citado acima.

[0053] Os seguintes exemplos não limitantes ilustram composições farmacêuticas representantes da presente invenção.

Formulação aquosa para Injeção ocular

[0054] Cada ml de uma suspensão aquosa estéril inclui de 5 mg a 50 mg do composto 1, cloreto de sódio para tonicidade, 0,99% (p/v) álcool benzilico como conservante, 0,75% carboximetilcelulose de sódio e 0,04% polissorbato. Hidróxido de sódio ou ácido clorídrico podem ser incluídos para ajustar o pH para 5 a 7,5.

Formulação aquosa para injeção ocular

[0055] Uma suspensão aquosa estéril sem. conservantes inclui 5 mg/ml a 50 mg/ml do composto 1 em. fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 40 mM, polissorbato 20 0, 03% e s a c a r o s e 5 % .

Composição do pó seco

[0056] O composto 1 micronizado (1 g) é misturado com lactose triturada (25 g) . Esta mistura combinada é então carregada em blisters individuais de um pacote de blister de

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 37/107 fácil abertura em uma quantidade suficiente para fornecer entre cerca de 0,1 mg a 4 mg do composto de fórmula I por dose. O conteúdo dos blisters são administrados usando um inalador de pó seco.

Composição do pó seco

[0057] O composto micronizado 1 (1 g) é misturado com lactose triturada (20 g) para formar uma composição em granel tendo uma relação de peso do composto para a lactose triturada de 1:20. A composição combinada é acondicionada em um dispositivo de inalação de pó seco capaz de liberar entre cerca de 0,1 mg a cerca de 4 mg do composto de fórmula I por dose.

C o mp o s i ç ã o d o i n a 1 a d o r d o s i m e t r a d o

[0058] O composto micronizado 1 (10 g) é disperso em uma solução preparada dissolvendo lecitina (0,2 g) em água desmineralizada (200 ml). A suspensão resultante é secada com spray e micronizada para formar uma composição micronizada compreendendo partículas com um diâmetro médio de menos de 1,5 um. A composição micronizada é então carregada em cartuchos de inalador dosimetrado contendo 1,1,1,2tetrafluoroetano pressurizado em uma quantidade suficiente para fornecer cerca de 0, 1 mg a cerca de 4 mg do composto de fórmula I por dose quando administrado por inalador dosimetrado.

Composição do nebuiizador

[0059] 0 composto 1 (25 mg) é dissolvido em uma solução contendo 1,5-2,5 equivalentes de ácido clorídrico, seguida pela adição de hidróxido de sódio para ajustar o pH para 3,5 a 5,5 e 3% em peso de glicerol. A solução é agitada bem até que todos os componentes estejam dissolvidos. A

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 38/107 solução é administrada com um dispositivo nebulizador que fornece cerca de 0,1 mg a cerca de 4 mg do composto de fórmula I por dose. Ut11idade [0060] Foi demonstrado que o presente composto, 5-etil-2-fluoro-4-(3-(5-(l-metilpiperidin-4-il)-4,5,6, 7tetraidro-l-H-imidazo [4,5-c] piridin-2-il) -1 H-indazol-6ilifenol (composto 1) é um potente inibidor da família de enzimas JAK: JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2. Doenças oculares [0061] Foi demonstrado que muitas doenças oculares estão associadas com a elevação de citocinas próinflamatórias que dependem da. via JAK-STAT. Como o composto da invenção exibe potente inibição em. todas as quatro enzimas JAK, é esperada a potencial inibição da sinalização dos efeitos patogênicos de numerosas citocinas (como IL-6, IL-2 e IFN-γ) , que sinalizam através de JAK, assim como evitam o aumento de outras citocinas (como MCP-1 e IP-10), cuja produção é impulsionada pela via de sinalização JAKSTAT .

[0062] Em particular, o presente composto exibiu valores de pIC.50 de 6, 7 ou superiores (valores de IC.50 de

00 nM ou. menos) para inibição da sinalização de IL -2, IL4, IL-6 e ΙΕΝγ em ensaios com células descritos nos Ensaios a 7, incluindo ensaios que registram a inibição dos efertos downstream da eievaçao de ciLocmes.

[0063] O estudo farmacocinético do Ensaio 8 demonstrou exposição sustentada nos olhos de coelhos após uma única injeção intravítrea e uma concentração' no plasma de pelo

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 39/107 menos três ordens de magnitude menores do que a concentração observada no tecido vítreo.

[0064] Além disso, a administração intravítrea do composto da invenção demonstrou significativa inibição de pSTAT3 induzida por IL-6 na retina/tecido coroide de rato assim como inibição significativa de TP-10 induzida por IFNY no vítreo de coelho assim como na retina/tecido coroide.

[0065] Espera-se que a inibição ocular de JAK sustentada na ausência de níveis sistêmicos significativos resultará em. potente atividade anti-inflamatória local no olho sem os efeitos adversos sistêmicos direcionados. Espera-se que o composto da invenção seja benéfico em várias doenças oculares que incluem., mas não estão limitadas a, uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia da retina e ceratoconjuntivite atópica.

[0066] Em particular, uveíte (Horai and Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744), retinopatia diabética (.Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 112), edema macular diabético (Sohn et al., American Journal of Opthamology, 2011, 152, 686-694), doença do olho seco (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100) e degeneração macular relacionada à idade (Knickelbein et al, Int Ophthalmol Clin, 2015, 55(3), 63-78) são caracterizadas por elevação de algumas citocinas pró-inflamatórias que sinalizam através da via JAK-STAT. Desta forma, os compostos da divulgação podem ser capazes de aliviar a inflamação ocular associada e reverter a progressão da doença ou melhorar os sintomas.

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[00 67] A oclusão da vela da retina (OVR) é uma doença que compromete a visão e tem alta prevalência. A obstrução do fluxo sanguíneo da retina pode danificar a vasculatura da retina, causar hemorragia e isquemia tecidual. Embora os casos de OVR sejam multifatoriais, foi demonstrado que os mediadores vasculares e inflamatórios são importantes (Deobhakta et al, International Journal of Inflammation, 2013, artigo ID 438412). As citocinas que sinalizam através da via JAK-STAT, como a IL-6 e a IL-13, assim, como outras citocinas, como a MCP-1, cuja produção é impulsionada em parte pela via de sinalização JAK-STAT, foram detectadas em níveis elevados nos tecidos oculares de pacientes com OVR (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911) . Desta forma, o composto 1 pode ser capaz de aliviar a inflamação ocular associada e reverter a progressão da doença ou proporcionar aiívio dos sintomas nesta doença. Muitos pacientes com OVR são tratados com fotocoagulação, uma terapia inerentemente destrutiva. Os agentes anti-VEGF também são usados, mas são eficazes apenas em uma fração dos pacientes. Foi demonstrado que os medicamentos esteroides que reduzem o nível de inflamação no olho (implantes de acetonida triancinolona e dexametasona) fornecem, resultados benéficos para pacientes com. certas formas de OVR, mas também foi demonstrado que eles provocam cataratas e aumento da pressão intraocular/glaucoma.

[0068] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença ocular em um mamífero, o método compreendendo administrar 5-etil-2-fluoro-4- (3-(5- (1metilpiperidin-4-il)-4,5,6,7-tetraidro-lV-imidazo[4,5c]piridin-2-il)-lfí-indazol-6-il)fenol ou um sal aceitável do

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 41/107 ponto de vista farmacêutico no olho do mamífero. Em. um aspecto, a doença ocular é uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia da retina ou ceratoconjuntivite atópica. Em. um. aspecto, o método compreende administrar o presente composto por injeção intravítrea.

Doenças respiratórias

[0069] O presente composto, 5-etil-2-fluoro-4-(3-(5(l-metilpiperidin-4-il)-4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5c]piridin-2-il)-lH-indazol-6-il)fenol (1) demonstrou inibição da ativação das células T, inibição das citocinas associadas com inflamação e a atividade nos ensaios de eosinofilia e neutrofilia em pulmões de roedores. Portanto, acredita-se que o composto seja útil para o tratamento de determinadas doenças respiratórias específicas.

[0070] A inflamação eosinofílica das vias aéreas é uma característica de doenças colet.ivam.ente denominadas doenças pulmonares (Cottin et. ai., Clin. Chest. Med., 2016, 3 / (3) , 535-56). As doenças eosinofílicas estão associadas com sinalização de IL-4, IL-13 e IL-5. As doenças pulmonares eosinofílicas incluem infecções (especialmente infecções helminticas), pneumonite induzida por fármacos (induzidas por

exemplo, por	fármacos como antibiotic^	os, fenitoína	ou
1-triptofano),	pneumonite induzida por	fungos (p. e	· r
aspergilose	broncopulmonar alérgica),	pneumonite	por
h ipersensibili'	dade e granulomatose	eosinofílica	com
poliangeíte (a	.nteriormente conhecida como	síndrome de Chu	.rg-

Strauss). As doenças pulmonares eosinofílicas de etiologia desconhecida incluem pneumonia eosinofílica idiopática aguda,

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 42/107 pneumonia eosinofílica idiopática crônica, síndrome hipereosinofílica e síndrome de Lôffler. Foi demonstrado que o composto 1 reduz de forma significativa a eosinofilia pulmonar em modelo de vias aéreas de roedores do Ensaio 13 e inibe potencialmente a sinalização de IL-13, IL-4 e IL-2 em ensaios celulares.

[0071] Um polimorfismo no gene da IL-6 tem sido associado com elevados níveis de IL-6 e um risco aumentado de desenvolvimento de hipertensão arterial pulmonar (HAP) (Fang et al., J Am Soc Hypertens., o polimorfismo da interleucina-6, 572C/G está associado com elevados níveis de

IL-6	e riscc	) de hipertensão	arterial pulmonar,	2017,	, ahead
of p	>rint} .	C o r r o b o r a n d o c o m	o papel da IL-6	Ilâ	HAP, a
inibi	.ção da	cadeia, do recep	tor de IL-6 gp!30	melt	torou a
doenç	:a em ui	it modelo de rato	de HAP (Huang et	< Λ	Can u

Cardiol., 2016, 32(11), 1356.el-1356.elO). Foi demonstrado que o composto da invenção inibe a sinalização de IL-6.

i U072 ] As citocinas como ΙΕΝγ, IL—12 e IL—6 estão envolvidas em. uma variedade de doenças pulmonares não alérgicas como sarcoidose e linfangioleiomiomatose (ElHashemite et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2005, 33, 227-230, e El-Hashemite et al., Cancer Res., 2004, 64, 34363443) . Também foi demonstrado que o composto da invenção inibe a sinalização de IL-6 e IFNv.

[0073] Bronquiectasia e doenças pulmonares infiltrativas são doenças crônicas associadas com inflamação neutrofílica crônica. Foi demonstrado que o composto da invenção inibe a neutrofilia das vias aéreas em um. modelo de roedor.

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[0074] A ativação patológica das células T é fundamental na etiologia de várias doenças respiratórias. As células T autorreativas desempenham um papel na bronquiolite obliterante com pneumonia em organização (também chamada BOOP [pneumonia criptogênica em. organização] ) . Mais recentemente, pneumonite induzida por inibidor do ponto· de verificação imunológico, outra doença pulmonar mediada por célula T surgiu com o uso crescente de inibidores de ponto de verificação imunológico. Os pacientes com. câncer tratados com esses agentes estimulantes de células T podem desenvolver pneumonite fatal. Foi demonstrado que o composto da invenção inibe a ativação em isolados de células T de células mononucleares do sangue periférico humano.

[0075] Em um. aspecto, portanto, a. invenção fornece um. método de tratamento· de uma doença respiratória em um mamífero (p. ex., humano), o método compreendendo administrar ao mamífero 5-etil-2-fluoro-4-(3-(5-(1metilpiperid.in-4-i.l) -4,5, 6, 7-tetraid.rO-l.H-imida.zo [4, 5c]piridin-2-il)-ln-indazol-6-il)fenol ou um. sal aceitável do ponto· de vista farmacêutico, ou uma composição farmacêutica compreendendo um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico ou um sal aceitável. do ponto de vista farmacêutico, onde a doença pulmonar é uma infecção pulmonar, uma infecção· helmíntica, hipertensão arterial pulmonar, sarcoidose, linfangioleiomiomatose, bronquiectasia ou uma doença pulmonar infiltrativa.

[0076] Em outro aspecto, a invenção fornece um. método de tratamento de uma doença, respiratória em. um. mamífero (p. ex., humano), o método compreendendo administrar ao mamífero o composto da invenção ou um sal aceitável do ponto de vista

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 44/107 farmacêutico ou um composição farmacêutica compreendendo um. carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico e o composto da invenção ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, onde a doença respiratória é uma pneumonite induzida por fármaco, pneumonite induzida por fungos, aspergilose broncopulmonar cL _L ΘI? C[ Σ C 3. e hipersensibilidade.

g r anu1oma t o s e poliangeíte, pneumonia eosinofílica pneumonite por eosinofílica com idiopática aguda, sindrome hipereosinofílica, síndrome de Lõffler, bronquiolite obliterante com pneumonia em organização ou pneumonite induzida por inibidor do ponto de verificação imunológico.

[0077] As citocinas de sinalizações JAK desempenham também, um. papel importante na ativação das células T, um. subtipo de células imunes que é central para muitos processos imunológicos. A ativação patológica das células T é fundamental na etiologia de várias doenças respiratórias. As células T autorreat ivas desempenham um. papel na bronquiolite obliterante com pneumonia em organização (também chamada BOOP). Similar à BOOP, a etiologia das rejeições de transplante pulmonar está associada a uma ativação aberrante da ativação das células T dos receptores pelo pulmão transplantado do doador. As rejeições de transplante pulmonar podem ocorrer cedo como disfunção primária do enxerto (PGD), pneumonia em organização (PO) , rejeição aguda (RA) ou bronquiolite linfocítica (BL) ou podem ocorrer anos após o transplante pulmonar como disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD). A CLAD era anteriormente conhecida como bronquiolite obliterante (BO) , mas agora é considerado uma síndrome que pode ter diferentes

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7/79 manifestações patológicas incluindo BO, CLAD restritiva (rCLAD ou RAS) e disfunção neutrofilica do· enxerto. A disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD) é um grande desafio para o manejo em longo prazo dos receptores de transplante pulmonar, pois ela faz com. que o pulmão transplantado perda sua funcionalidade de forma progressiva (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185191) . A CLAD é pouco sensível ao tratamento e, portanto, permanece a necessidade de compostos eficazes capazes de prevenir ou tratar esta. condição. Várias citocinas dependentes de JAK, como IFNy e IL-5 são superreguladas na CLAD e na rejeição do transplante de pulmão (Berastegui et al, Clin Transplant. 2017, 31, el2898) . Além disso, altos níveis de quimiocinas CXCR3 pulmonares como CXCL9 e CXCL10 que estão downstream (a jusante) à sinalização de IFN dependente de JAK estão relacionados a piores desfechos nos pacientes submetidos a transplante de pulmão (Shino et al,

transplante renal (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). Portanto, os inibidores de JAK têm. o potencial para serem eficazes no tratamento ou prevenção do transplante pulmonar e CLAD. Eventos sim.ila.res à ativação de células T como descrito· como a base para a rejeição do transplante pulmonar também são considerados o principal fator da doença do enxerto contra o hospedeiro pulmonar (DECH) que pode ocorrer após transplante de células-tronco hematopoéticas. Similar à CLAD, a. DECH pulmonar é uma condição· progressiva com desfechos extremamente fracos e não existe tratamento atualmente

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 46/107 aprovado. Um estudo de pesquisa multicêntrico, retrospectivo de 95 pacientes com DECH aguda ou crônica refratária s esteroide que receberam o inibidor sistêmico de JAK ruxolitinibe como terapia de resgate demonstrou resposta completa ou parcial para ruxolitinibe na maioria dos pacientes, incluindo aqueles com DECH pulmonar (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2 0 652 — 68) . Como a inibição sistêmica do JAK está associada a eventos adversos graves e um pequeno índice terapêutico, permanece a necessidade de um inibidor não sistêmico de JAK, direcionado para o pulmão para evitar e/ou tratar a rejeição do transplante pulmonar ou DECH pulmonar.

[0078] Portanto, a divulgação fornece ainda um método de tratamento de condições respiratórias adicionais acima descritas em um mamífero, o método compreendendo a administração do composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico a um mamífero.

Doença, inflamatória gastrointestinal

[0079] Como um inibidor de JAK, o composto 1 ou um. sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis para tratar doenças inflamatórias gastrointestinais que incluem, mas não estão limitados a, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa (proctosigmoidite, pancolite, proctite ulcerativa e colite do lado esquerdo), Doença de Cronn, colite colagenosa, colite linfocítica, Doença de Behcet, doença celíaca, colite induzida por inibidor do ponto de verificação imunológico, ileíte, esofagite eosinofílica, colite relacionada à doença enxerto versus hospedeiro e colite infecciosa. Colite ulcerativa (Reimund et al. , J Clin Immunology, 1996, 16', 144-150), doença de

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Crohn (Woywodt et al., Eur J Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), oolite colagenosa (Kumawat et al.. Mol Immunology, 2013, 55, 355-364), oolite linfocitica (Kumawat et al., 2013), esofagite eosinofilica (Weinbrand-Goichberg et al., Imnrunol Res, 2013, 56, 249-260), oolite relacionada à doença enxerto versus hospedeiro (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 3268-3276), colite infecciosa (Stallmach et al. , Int J Colorectal Dis, 2004, 19, 308-315), doença de Behcet (Zhou et al. , Autoimmun Rev, 2012, 11, 699-704), doença celíaca (de Nitto et al., World J Gastroenterol, 2009, 15, 4609-4614), colite induzida por inibidor (ponto de verificação) checkpoint imunológico (p. ex., colite induzida por inibidor de CTLA-4; (Yano et al., J Translation Med, 2014, 12, 191), ou colite induzida por inibidor de PD-1- ou PD-L1) e ileite (Yamamoto et al., Dig Liver Dis, 2008, 40, 253-259) são caracterizadas pela elevação dos niveis de algumas citocinas pró-inflamatórias. Como muitas citocinas pró-inf lamatórias sinalizam. via ativação de JAK, os compostos descritos nessa aplicação podem, ser capazes de aliviar a inflamação e fornecer alivio para seus sintomas.

Doença inflamatória da pele

[0080] A dermatite atópica e outras doenças inflamatórias da pele estão associadas com a elevação de citocinas pró-inflamatórias que dependem da via JAK-STAT. Portanto, o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser benéficos em várias condições inflamatórias ou pruriginosas dérmicas, que incluem, mas não estão limitados a dermatite atópica, alopecia areata, vitiligo, psoriase, dermatomiosite, linfoma cutâneo de células T (Netchiporouk et al., Cell Cycle. 2014; 13, 3331

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3335) e subtipos (sindrome de Sezary, micose fungoide, reticulose pagetoide, pele frouxa granulomatosa, papulose linfomatosa, pitiríase liquenoide crônica, pitiriase liquenoide e varioliforme aguda, linfoma cutâneo de células T CD30+, linfoma cutâneo secundário de células grandes CD30+, fungoides não micóticos, linfoma cutâneo de células T grandes CD30-, linfoma pleomórfico de células T, linfoma de Lennert, linfoma de células T subcutâneo, linfoma angiocócito, linfoma blástico de células NK), prurigo nodular, líquen plano, amiloidose cutânea localizada primária, pênfigo bolhoso, manifestações cutâneas de doença do enxerto versus hospedeiro, penfigoide, lúpus discoide, granuloma anular, líquen simples crônico, prurido vulvar/escrotal/perianal, líquen escleroso, coceira pós-nevralgia herpética, líquen plano pilar e foliculite decalvante. Em especial, dermatite atópica (Bao et al., Jak-STAT, 2013, 2, N24137), alopecia areada (Xing et al. , Nat Med. 2014, 20, 1043-1049), vitiligo (Craiglow et al, JAMA Dermatol. 2015, 151, 1110-1112),

prurigo nodular (Sonkc	rly et	al., J All·	ergy Clin	Immunol.
2006, 7..Z7, 411-417),	líquen	piano (Welz	-Kubiak, et	cl 1 * f ü
Immunol Res. 2015, ID	: 854747)	i , amiloidos	Θ Cu.uâRG3.	primária

localizada (Tanaka et al., Br J Dermatol. 2009, 161, 12171224), penfigoide bolhoso (Feliciand et al., Int J Immunopathol Pharmacol. 1999, 12, 55-61), e manifestações cutâneas da doença enxerto versus hospedeiro (Okiyama et al., J Invest Dermatol. 2014, 134, 992-1000) são caracterizadas pela elevação de algumas citocinas que sinalizam, via ativação JAK. Desta forma, o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, podem ser capazes de aliviar o prurido

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 49/107 / 7 9 associado à inflamação cutânea ou disparado por essas citocinas.

U LI cl S Ο. Ο Θ Π Ç cl S

[0 081] O composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também, podem, ser úteis para o tratamento de outras doenças como doenças inflamatórias, doenças autoimunes ou cânceres. O composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser úteis para o tratamento de um ou mais de artrite, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, rejeição de transplante, xeroftalmia, artrite psoriática, diabetes, diabetes insulina dependente, doença do neurônio motor, síndrome mielodisplásica, dor, sarcopenia, caquexia, choque séptico, lúpus eritematoso sistêmico, leucemia, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogênica aguda, espondilite anquilosante, mielofibrose, linfoma de células B, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer de mama, mieloma múltiplo, melanoma, linfoma não Hodgkin, câncer de célula não pequena do pulmão, câncer de células claras do ovário, tumor ovariano, tumor de pâncreas, policitemia vera, síndrome de Sjoegrens, sarcoma de partes moles, sarcoma, esplenom.egal.ia, linfoma de células T e t a1a s s emia mai o r.

Terapia combinada

[0082] 0 composto 1 da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser usados combinados com um ou mais agentes que agem, pelo mesmo mecanismo ou por mecanismos diferentes para tratar uma doença. Os diferentes agentes podem ser administrados em sequência ou simultaneamente, em composições separadas ou na

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 50/107 mesma composição. As classes úteis de agentes para terapia combinada incluem, mas não estão limitados a, um agonista adrenoceptor beta 2, um antagonista do receptor muscarlnico, um. agonista de glicocorticoide, um antagonista do receptor 44 da proteína G acoplada, um. antagonista de leucotrieno D4, um antagonista do receptor muscarínico M3, um antagonista do receptor H1 da histamina, um antagonista da imunoglobulina E, um inibidor de PDE 4, um antagonista de IL-4, um antagonista do receptor muscarínico Ml, um antagonista do receptor de histamina, um antagonista de IL-13, um antagonista de IL-5, um inibidor da 5-lipoxigenase, um agonista beta-adrenoceptor, um antagonista da quimiocina CCR3, um estimulador de CFTR, um modulador de imunoglobulina, um inibidor de ligante de interleucina 33, um. inibidor de PDE 3, um inibidor de fosfoinositideo-3 quinase delta, um antagonista de tromboxano A2, um inibidor da elastase, um inibidor Kit da tirosina quinase, um antagonista de leucotrieno E4, um antagonista do leucotrieno, um antagonista PGD2, um inibidor do ligante TNFalfa, um agente de ligação de TNF, um inibidor do complemento da cascata, um inibidor do ligante eotaxina, um inibidor de glutationa redutase, um antagonista do receptor H4 da histamina, um antagonista de IL-6, um estimulador do gene IL2, um modulador do receptor de imunoglobulina gama Fc IIB, um ligante da gamainterferona, um inibidor do ligante da interleucina 13, um inibidor do ligante da interleucina 17 inibidor, um antagonista da L-selectina, um inibidor da elastase leucocitária, um antagonista de leucotrieno C4, um inibidor de leucotrienos C4 sintase, um inibidor a base de cobre da amino oxidase de membrana, um inibidor de metaloprotease-12, inibidor de metaloprotease-9, um modulador

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3 / 7 9 de alérgenos de ácaros, um modulador de receptor muscarínico, um agonista do receptor nicotínico da acetilcolina, um inibidor do fator nuclear kappa B, um antagonista da P~ selectina, um inibidor de PDE 5, um antagonista do receptor PDGF, um Inibidor fosfoinositideo-3 quinase gama, um agonista de TLR-7, antagonista de TNF, um inibidor de tirosina quinase Aol, um antagonista de receptor de acetilcolina, um inibidor de quitinase ácida de mamífero, um agonista do receptor de ACTH, um modulador de polimerização de actina, um antagonista de receptor de adenosina Al, um estimulador de adenilato ciclase, um antagonista adrenoceptor, um ligante do hormônio

adrenocorticotrófico, um inibidor da	álcool	de s i dr o geria s e	O ;
um estimulador de antitripsina al	.fa 1,	um inibidor	de
proteinase alfa 1, um modulador do r	eceptor	de andrógeno,	um
estimulador da enzima conversora	da angí	.01 ensina 2,	um

agonista de ANP, um inibidor da proteína Bcr, um antagonista adrenoceptor beta 1, antagonista adrenoceptor beta 2, um modulador adrenoceptor beta 2, um modulador de beta-amiloide, um. inibidor do gene BMP10, um. inibidor do gene BMP15, um inibidor do canal de cálcio, um inibidor da catepsina G, um inibidor do gene CCL26, um modulador da quimiocina CCR3, um antagonista da quimiocina CCR4, um inibidor da molécula de adesão celular, de um estimulador chaperonina, um inibidor de quitinase, um antagonista de colágeno I, um inibidor de complemento C3, um antagonista CSF-1, um antagonista da quimiocina CXCR2, um modulador de cadeia beta comum do receptor de citocina, um estimulador da proteina-4 do linfócito T citotóxico, um estimulador de desoxirribonuclease I, um estimulador de desoxirribonuclease, um inibidor da dipeptidil peptidase I, um inibidor de DNA girase, um

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4 / 7 9

modulador c	lo r	'eceptor	de prostanoide DP, um	antagonista da E-
Selectina,	um	inibidc	ir do receptor da tii	:osina quinase da
família EG	FR,	um mod	ulador de elastina, l	im antagonista da
e n do t e 1 i n a	ET	~Αλ ΌΚι	antagonista da endc	>tel ma ET—B, um

inibidor de epóxido hidrolase, um antagonista do receptor FGF.3, um inibidor de tirosina quinase Fyn, um inibidor do fator de transcrição· GATA 3, um modulador de Glucosilceramidase, um modulador do receptor de glutamato, um inibidor do ligante de GM-CS, um inibidor da. gua.nl. lato cicla.se, um estimulador de H+ K+ ATPase inibidor, um modulador de hemoglobina, um agonista de heparina, um inibidor de historia desacetilase, um estimulador da histona deacetilase-2, um inibidor da HMG CoA reduta.se, um inibidor de I-kappa B beta quinase, um inibidor do gene ICAM1,um antagonista de IL-17, um modulador do receptor de IL-17,um antagonists! de IL-23, um modulador do receptor de IL-4,um modulador da imunoglobulina G, um agonista deda imunoglobulina Gl, um. modulador da imunoglobulina Gl, um antagonista do receptor IA da imunoglobulina epsilon Fc, um antagonista IIB do receptor Fc gama imunoglobulina antagonista, um modulador da imunoglobulina kappa, um sensibilizador de insulina, um ligante betainterferona, um antagonista similar do receptor da interleucina 1, inibidor do ligante da Interleucina 18, um inibidor do receptor da interleucina 17A, um inibidor de ligante da interleucina-1 beta, um inibidor de ligante interleucina-5, um inibidor de ligante da interleucina-6, inibidor do canal 3 KCNA dependente de voltagem, um inibidor de ligante kit, um agonista da laminina-5, um antagonista de receptor de leucotrieno CysLTl, um antagonista de receptor de leucotrieno

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CysLT2, um inibidor do gene LOXL2, um inibidor de Lyn tirosina quinase, um inibidor da proteina MARCKS, um inibidor da proteína associada 4 MDR, um modulador da metaloprotease2, um modulador da metaloprotease-9, um antagonista do receptor de mineralocorticoide, um antagonista do receptor muscarinico M2, um antagonista do receptor muscarinico M4, uni antagonista do receptor muscarinico M5, um agonista do receptor do peptídeo natriurético, um modulador do receptor de células natural killer, um estimulador da alfa subunidade

ACh do receptor nicotinico, um modulador do receptor das células NK, um modulador do fator nuclear kappa B, uni agonista opioide do receptor de fator de crescimento, um inibidor da glicoproteína-P, um antagonista de P2X3 purinoceptor, um inibidor da p38 MAP quinase, um modulador da Peptidase 1, um inibidor da fosfolipase A2, um inibidor da enzima fosfolipase C, um inibidor do ativador de

ρ 1 asminogênio t	ΐ	urn antagoni	.sta do receptor do	fator ati	.vador
d e p 1 a. qu e t a s,	L	im agonista	de PPAR gama, ui	m agonist	ia de
p r o s t a c i c 1 i n a,		m inibidor	da proteina tirosi:	ria quinas	e, um
estimulador de		domínio SR	2 1 fosfatase de	inositoJ	., um

inibidor de transdução de sinal, um inibidor do canal de sódio, um modulador de STA.T-3, um inibidor do antígeno de células-tronco-Ι, um modulador de superóxido dismutase, um inibidor da glicoproteína de superfície de célula T CD28, um inibidor de CD8 glicoproteína de superfície de células T, um inibidor de TGF beta-agonista, antagonista de TGF beta, urn inibidor de tromboxana sintetase, um inibidor de linfoproteina do estroma timico, um inibidor do ligante timosina, um agonista beta 4 timosina, um agonista de TLR-8, um agonista de TLR-9, um estimulador de gene TLR9, um

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6 / 7 9 inibidor da topoisomerase IV, um estimulador da troponins I fast do músculo esquelético, um estimulador da troponina T fast estimulador muscular esquelética, um antagonists do receptor I IL-1, um modulador do receptor tipo II de TNF, um modulador de canal iônico, um estimulador de uteroglobina e um agonista de VIP.

[0083] Agentes específicos que podem ser usados combinados com o composto 1 inibidor de JAK presentes incluem, mas não estão limitados a, acetato de rosiptor, brometo de umeclidinio, secukinumabe, acetato de metencefalina, acetato de tridecactídeo, propionato de fluticasona, sulforafana slfs-ciclodextrina-estabilizads, tezepelumsbe, furoato de mometssons, BI-1467335, dupilumsbe, aclidínio, formoterol, AZD-1419, HI-1640V, rivipansel, CMP001, manitol, ANB-020, omalizumabe, tregalizumabe, Mitizax, benralizumabe, golimumabe, roflumilaste, imatinibe, REGN3500, masitinibe, apremilaste, RPL-554, Actimmune, a d a. 1 i mumab e, r up a t a. d i n e, p a. r o g r e 1 i 1, MK -102 9, d i p r o p i o n a t o de beclometasona, fumarato de formoterol, mogamulizumabe, seratrodaste, UCB-4144, nemiralisibe, CK-2127107, fevipiprante, danirixina, bosentana, abatacepte, EC-18, duvelisi.be, dociparstato, ciprof loxacino, salbutamol HFA, erdosteina, PrEP-001, nedocrom.il, CDX-0158, salbutamol, enobosarma, R-TPR-022, lenzilumabe, furoato de fluticasona, trifenatato de vilanterol, propionato de fluticasona, salmeterol, PT-007, PRS-060, remestemcel-L, citrulina, RPC4046, óxido nitrico, DS-102, gerilimzumabe, Actair, furoato de fluticasona, umeclidinio, vilanterol, AG-NPP709, Gamunex, infliximabe, Ampion, acumapimode, canakinumabe, INS-1007, CYP-001, sirukumabe, propionato de fluticasona,

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37/79 mepolizumabe, pitavastatina, solitromicina, etanercepte, ivacaftor, anakinra, MPC-300-IV, brometo de glicopirrônio, brometo de aclidinio, FP-025, risankizumabe, glicopirrônio, fumarato de formoterol, Adipocell, YPL-001, brometo de tiotrópio, brometo de glicopirrônio, maleato de indacaterol, andecaliximabe, olodaterol, esomeprazol, vacina anti-poeira de ácaro, vacina do alérgeno do pólen da artemisia, vamorolona, gefapixanto, revefenacina, gefitinibe, ReJoin, tipelucaste, bedoradrina, SCM-CGH, SHP-652, RNS-60, brodalumabe, BIO-11006, brometo de umeclidinio, trifenatato de vilanterol, brometo de ipratrópio, tralokinumabe, PUR1800, VX-561, VX-371, olopatadina, tulobuterol, fumarato de formoterol, triancinolona acetonida, reslizumabe, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, dipropionato de beclometasona, fumarato de formoterol, brometo de tiotrópio, ligelizumabe, RUTI, bertilimumabe, omalizumabe, brometo de glicopirrônio, SENS-111, dipropionato de beclometasona, CHF5992, LT-4001, indacaterol, brometo de glicopirrônio, furoato de mometasona, fexofenadina, brometo de glicopirrônio, azitromicina, AZD-7594, formoterol, CHF-6001, batefenterol, OATD-Ol, olodaterol, CJM-112, rosiglitazona, salmeterol, setipiprante, betainterferona inalada, AZD-8871,

piecanatida,	fluticasona,	s a ime t e ro1, mono g	licérides d<
ácido eicof	sapentaenoico,	lebrikizumabe, RG-	6149, QBKPN
Mometasona,	indacaterol,	AZD-9898, piruvatc	) de sódio
zileutona,	CG-201, imic	[af enacina, CNTO-67E	15, CLBS-03
mometasona,	RGN-137, proca	terol, formoterol, CC	:1-1510 6, POL

6014, indacaterol, beclometasona, MV-130, GC-1112,

Allergovac depot, MEDI-3506, QBW-251, ZPL-389, udenafila,

GSK-3772847, levocetirizina, AXP-1275, ADC-3680,

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8 / 79 timapiprante, abediterol, AZD-7594, brometo de ipratrópio, sulfato de salbutamol, tadekinig alfa, ACT-774312, dornase alfa, iloprosta, batefenterol, furoato de fluticasona, alicaforseno, ciclesonida, emeramida, arformoterol, SB-010, Ozagrel, BTT-1023, Dectrekumab, levalbuterol, pranlucaste, ácido hialurônico, GSK-2292767, Formoterol, NOV-14, Lucinactante, salbutamol, prednisolona, ebastina, cipecilato de dexametasona, GSK-2586881, BI-443651, GSK-2256294, VR179, VR-096, hdm-ASIT+, budesonida, GSK-2245035, VTX-1463, Emedastina, dezpramipexol, levalbuterol, N-6022, fosfato sódico de dexametasona, PIN-201104, OPK-0018, TEV-48107, suplataste, BI-1060469, Gemilucaste, gamainterferona, dalazatida, bilastina, propionato de fluticasona, xinafoato de salmeterol, RP-3128, brometo de bencicloquidio, reslizumabe, PBF-680, antagonista de CRTH2, Pranlucaste, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, brometo monoidrato de tiotrópio, masilucaste, RG-7990, Doxofilina, abediterol, brometo de glicopirrônio, TEV-46017, ASM-024, propionato de fluticasona, brometo de glicopirrônio, xinafoato de salmeterol, salbutamol, TA-270, Flunisolida, cromoglicato de sódio, Epsi-gam, ZPL-521, salbutamol, a. v i p t a d i 1 a, T RN -15 7, Z a f i r 1 u c a s t e, S t e mp e u c e 1, p e m i r o 1 a s t o sódico, nadolol, propionato de fluticasona + xinafoato de salmeterol, RV-1729, sulfato de salbutamol, dióxido de carbono + brometo de perfluorooctila, APL-1, dectrekumabe + VAK-694, acetilsalicilato de lisina, zileuton, TR-4, terapia de células progenitoras mesenquimais derivadas de tecido adiposo alogênico humano, MEDI-9314, PL-3994, HMP-301, TD5471, NKTT-120, pemirolaste, dipropionato de beclometasona, trantinterol, alfaluminol monossódico, IMD-1041, AM-211,

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Q/79

TBS-5, ARRY-502, seratrodaste, midismase recombinante, ASM8, deflazacorte, bambuterol, RBx-10017609, ipratrópio + fenoterol, fluticasona + formoterol, epinastina, WIN-901X, VALERGEN-DS, OligoG-COPD-5/20, tulobuterol, oxis Turbuhaler, DSP-3025, ASM-024, mizolastina, budesonida + salmeterol, LH011, AXP-E, imunoglobulina humana histamina, YHD-001, teofilina, ambroxol + erdosteina, ramatrobana, montelucaste, pranlucaste, AG-1321001, tulobuterol, ipratrópio + salbutamol, tranilaste, suleptanato de metilprednisolona, daropato de colforsina, repirinaste e doxofilina.

[0084] Também é fornecida aqui uma composição farmacêutica compreendendo 1 ou um sal aceitável do· ponto de vista farmacêutico e um ou mais agentes terapêuticos. O agente terapêutico pode ser selecionado da classe de agentes especificados acima e da lista de agente específico descrita acima. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para liberação para os pulmões. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da invenção é adequada para administração inalatória ou por nebulização. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um pó seco ou uma composição liquida.

[0085] Além disso, em um. aspecto do método, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença ou desordem em um. mamífero compreendendo a administração do composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um ou mais agentes terapêuticos a um mamífero.

[0086] Quando usado em. combinação terapêutica, os agentes poderão ser formulados em. uma única composição farmacêutica, como divulgado· anteriormente ou os agentes podem ser fornecidos em diferentes composições que são

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 58/107 zj q / 7 9 administradas simultaneamente ou em. tempos distintos, pela mesma via ou por diferentes vias de administração. Tais composições podem ser acondicionadas separadamente ou podem ser acondicionadas como um kit. Os dois ou mais agentes terapêuticos no kit podem ser administrados pela mesma via de administração ou por diferentes vias de administração.

[0087] Foi demonstrado que o composto da invenção é potente inibidor das enzimas JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2 em ensaios de ligação enziraática e têm potente atividade funcional, sem. citotoxicidade em ensaios celulares, e exercem os efeitos farmacodinâmicos da inibição da JAK nos modelos pré-clinicos, como descrito nos exemplos a seguir. EXEMPLOS

[0088] Os exemplos sintéticos e biológicos a seguir são fornecidos para ilustrar a invenção, e não são para ser interpretados de qualquer forma como uma limitação do escopo da invenção. Nos exemplos abaixo, as abreviaturas têm. os seguintes significados, a menos que seja indicado de outra forma. As abreviaturas não definidas abaixo têm seus significados aceitos.

ACN = ac e t on i t r i1a

DCC = dicicloexilcarbodi-imida

DIPEA == A,lV-di-isopropietilamina

DMF ^::: N, A-dimetilformamida

EtOAc = acetato de etila

HATU = hexaf luorofosf ato de Ν,Ν,Ν ’,N '-tetrametil-O~ (7~azabenzotriazol~l~il)urônio

LDA = di-isopropilamida de litio min. minuto (s)

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MTBE

NBS éter metil terc-butílico

N - b r o mo s s u c c i n i m i d a temperatura ambiente

THE tetraidrofurano bis(pinacolato)diboron = 4, 4,5, 5,4’,4’, 5^!, 5^!-octametil[2,2’]bi[[1,3,2]dioxaborolanil]

Pd (dppf) CI2-CH2CI2 = complexo de dicloro (1,1'bis(difenilofosfino)ferrocene)-dipaládio(II) com diclorometano

[0089] Os reagentes e solventes foram comprados de fornecedores comerciais (Aldrich, Fluka, Sigma etc.), e usados sem purificação. O progresso da mistura da reação foi monitorado por cromatografia em. camada fina (TLC) , cromatografia líquida de alta eficiência analítica (CLAE/HPLC analítica) e espectrometria de massa. As misturas da reação foram, trabalhadas como descrito especificamente em cada reação; foram purificadas por métodos de extração e outros de purificação, como cristalização e precipitação dependentes de temperatura e solvente. Além disso, as misturas da reação foram purificadas por cromatografia em coluna ou HPLC preparativa, geralmente usando empacotamento C18 ou BDS de coluna e eluentes convencionais. As condições típicas de HPLC preparativa estão descritas abaixo.

[0090] A caracterização dos produtos da reação foi feita usando espectrometria de massa e ¹H-RMN. Para análise por RMN, as amostras foram dissolvidas em solventes deuterados (como CD3OD, CDCI3, ou d₆-DMSO) e foram adquiridos os espectros de iH-RMN com o instrumento Varian Gemini 2 00 0 (4 00 MHz) sob condições de observação padrão. A identificação por

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2 / 7 9 espectrometria de massa dos compostos foi feita por um método de ionização por electrospray (ESMS) com um instrumento da

Applied Biosystems, (Foster City CA) modelo API 150 EX ou um in s t rumen t da Waters (Milford, MA)

3100, acoplados a.

sistemas de autopurificação.

Condições da HPLC preparativa

Coluna:

Temperatura coluna:

Va z ã o do fluxo:

Fases móveis:

Volume de injeção:

Cl8, 5 pm. 21,2 x 150 mM ou Cl8, pm 21 x 2 50 ou Cl4, 5 pm 21 x

0 mM da Temperatura ambiente

0,0 ml/min.

A = Agua + 0,05% TEA B = ACN + 0,05%; TEA, (100-1500 pl)

Comprimento de onda 214 nm do detect

[0091] Os compostos brutos foram dissolvidos em 1:1 de água:ácido acético em cerca de 50 mg/ml. Uma corrida de 4 minuto de escala analítica de teste foi realizada usando uma coluna C18 2,1 x 50 mM, seguida de uma corrida de escala preparativa de 15 ou 20 minutos usando injeção de 100 pl com o gradiente baseado na retenção de % B da corrida da escala analítica de teste. Os gradientes precisos dependiam da amostra. As amostras com impurezas com tempos de retenção próximos foram verificadas com uma coluna C18 21 x 250 mm e/ou coluna Cl4 21 x 150 mm para melhor separação. As frações com. o produto desejado foram, identificadas por análise de espectrometria de massa.

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Condições de análise po	r HPLC (CLAE)

Método

Coluna:	Agilent Zorbax Bonus-RP C18, 150 x 4,60 nm, 3,5 micron
T emp e r a t u r a d a c o1una:	4 0 °C
Va z ã o do fluxo:	1,5 ml/min.
Volume de injeção:	5 μΐ
Preparo da amostra:	Dissolver em 1:1 de ACN: 1 M HC1
Fases móveis:	A = Água: TEA (99,95:0,05) B = ACN:TFA (99,95:0,05)
Comprimento de onda do	2 5 4 nm e 214 nm

ietector

Gradiente:

26 min. total (tempo (m,in.)/%B) : 05, 18 / 9 0, 2 2 / 90, 22,5 / 9 0, 2 6 / 5

Método B

Coluna:	Agilent Poroshell 120 Bonus-RP, 4,6 x 150 mm, 2,7 um
Temperatura da co1una:	30 °C
Vazão do fluxo:	1,5 ml/min.
Volume de injeção:	10 μΐ
Fases móveis:	A = ACN:Água:TFA (2:98:0,1) B = ACN:Água:TFA (90:10:0,1)
Preparo da amostra:	Dissolver em fase móvel B
Comprimento de onda do	254 nm e 214 nm

ietector

Gradiente:

60 min. total (tempo (m,in.)/%B) : 0/0, 5 0/10 0, 5 5/100, 5 5, 1/0, 6 0/0

Preparação 1: l-benzil-4-imino-l, 4~di~idropiridin--3“ amina

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[0092] Uma mistura de piridina-3,4-diamina (445 g, 4,07 8 mol) e ACN (11,0 1) foi agitada durante 80 min, de 25 °C a 15 °C. Foi adicionado brometo de benzila (485 ml, 4,078 mol) durante 20 min, e a mistura reacional foi agitada a 20 °C durante a noite. A mistura reacional foi resfriada a 10 °C e filtrada. Foi adicionada ACN (3 1) ao reator, que foi resfriado a 10 °C. O sedimento foi lavado com o enxágue do reator e lavado novamente com. ACN (3 1) e aquecido a 25 °C. O sólido foi seco no filtro durante 24 h sob nitrogênio, a 55 °C sob vácuo durante 2 h e depois à TA durante a noite e durante 4 d para fornecer o sal HBr do título composto (1102,2 g, 3,934 mol, 96% de rendimento). Tempo de retenção do método A HPLC 4,12 min.

Preparação 2: 5~Benzil~2~ (6~bromo~lJf~indazol~3--il) ~5Jí” imidazo[4,5~c]piridina

(a)

5~Benzil-2~ ( 6”bromo--17Aindazol~3--il) -5H imidazo[4,5-c]piridina

[0093] Uma solução de 6~bromo~lH-indazol-3~carbaldeido (550 g, 2,444 mol), l-benzil-4-imino-l,4-di-idropiridin-3~ amina HBr (721 g, 2,333 mol) e DMAc (2,65 1) foi agitada durante 60 min. e foi adicionado bissulfito de sódio (257 g, 2,468 mol) . A mistura reacional foi aquecida a 135 °C e mantida durante 3 h e resfriada a 2 0 °C e mantida a 2 0 °C

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 63/107 durante a noite. Foi adicionada acetonitrila (81) e a mistura reacional foi agitada durante 4 h a 15 °C. A pasta fluida foi filtrada em um filtro de pressão com taxa de filtração média. Foi adicionada ACN (1 1) ao reator. 0 sedimento foi lavado com. ACN do enxágue do reator e seco sob nitrogênio durante a noite e depois sob vácuo a 50 °C durante 2 4 h para fornecer o sal HBr do título composto (1264 g, 2,444 mol, 100% de rendimento, 94% de pureza) como um sólido úmido denso bege/castanho. Tempo de retenção do método A. HPLC 8,77 min.

[0094] Uma mistura do produto da etapa anterior (1264 g, 2,444 mol), MeTHF (61) e água (2,75 1) foi aquecida a 65 °C e hidróxido de sódio 50% em peso (254 g, 3,177 mol) foi adicionado durante 5 min. e a mistura reacional foi agitada a 65 °C durante lhe resfriada à TA, então a 5 °C e mantida durante 2 h. A. pasta fluida foi filtrada e o reator e o sedimento foram lavados com MeTHF (1 1) . O sólido bege a. amarelo resultante foi seco no filtro sob nitrogênio durante 3 d para fornecer o título composto (475 g, 1,175 mmol, 48% de rendimento) como um sólido bege/amarelo. O licor principal (cerca de 81) foi concentrado a cerca de 21, onde os sólidos começaram a quebrar. A pasta fluida foi aquecida a 50 °C, mantida durante 2 h, resfriada a 5 °C durante 2 h, agitada durante a noite e filtrada. O sedimento foi lavado com MeTHF (100 ml) e seco durante a noite sob vácuo a 40 °C para fornecer um título composto adicional (140 g, 0,346 mol, 14% de rendimento).

[0095] Uma mistura do produto total da etapa anterior, combinada com o produto de um segundo lote na mesma escala (1500 g, 3,710 mol) e MeTHF (4 1) foi agitada a 20 °C

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 64/107 durante 2 h e filtrada. 0 reator e o sedimento foram, lavados com MeTHF (1,5 1) . 0 sólido bege a amarelo resultante foi seco no filtro sob nitrogênio durante 3 d para fornecer o titulo composto como um sólido bege/amarelo (1325 g, 3,184 mol, 86% de rendimento (geral 68% de rendimento,), 97% de pureza). Tempo de retenção do método A HPLC 8,77 min.

Preparação 3: 5~benzil”2^-(6~bromO”lHindazol3~il)~ 4,5,6,7“tetraidrO“lH“imidazo[4,5~c]piridina

H

[0096] 74 um balão de 15 1 foi adicionado 5~benzil~2~ ( 6-bromo ^-1H— indazo 1^— 3 — i 1) — 5H~unidazo [ 4, 5~c ] ρίridina (, 4 4 u g, 1, 088 mol) seguido por MeTHF (4,5 1), metanol (2,25 1) e água (1,125 1). A pasta fluida foi resfriada a 20 °C, agitada durante In e foi adicionado NaBFp (247 g, 6, 530 mol) . A mistura foi agitada a 25 °C durante 18 h. Foi adicionada água. (1,125 1), seguida por solução de cloreto de sódio a 20% em. peso (1,125 1) e a mistura foi agitada durante 30 min. e as camadas se separaram. A camada aquosa foi drenada. Uma solução pré-misturada de NaOH (522 g) e água (5 1) foi adicionada e a mistura reacional foi agitada durante 60 min.; as camadas foram separadas e a camada aquosa foi drenada. Foram preparados dois lotes adicionais na mesma escala.

[0097] A camada orgânica de um lote foi concentrada sob pressão reduzida em um reator revestido de 15 1 com o conjunto de revestimento a 50 °C e temperatura interna de 20 °C. Foram adicionados lotes adicionais ao reator e

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7/79 concentrados nm de cada vez resultando em. uma pasta fluida de cerca de 6 1 em volume. A pasta fluida foi aquecida a 50 °C,

ιοί acticionacio 2.	PAc	(61) e a mi í	stura foi mant	ida	a 60 ° C
durante 1,5 h, r	esfr	•iada a 2 0 °C	durante 10 h,	aq-	uecida a.
60 °C durante 5Í	) h,	resfriada a	20 °C durante	5 ]	a, então
resfriada a 5 0	C e	mantida dur;	ante 3 h. A	mist	:ura foi
filtrada e 0 res	itor	e 0 sedimente	3 lavados com	uma	solução
pré-misturada de	IPA	,c (11) e MeT	HF (11), pré-	-res	friada a

°C. Os sólidos foram, secos sob nitrogênio no filtro a 40 °C durante 3 d para fornecer o titulo composto (1059 g, 2,589 mol, 79% de rendimento) como um sólido esbranquiçado. O material foi posteriormente seco numa estufa a vácuo a. 50-60 °C durante 8 h e a 27 °C durante 2 d para fornecer o titulo composto (1043 g, 2,526 mol, 77% de rendimento, 99% de pureza). Tempo de retenção do método A HPLC 6,73 min.

Preparação 4: (4-(Benziloxi)~2~etil-5~ fluorofenil)trifluoroborato, potássio bf₃k (a) 2-(4-(Benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5tetrametil-1,3,2-dioxaborolano

[0098] Uma mistura de 1-(benziloxi)-4-brom.o-5-et.il-2fluorobenzeno (520 g, 1682 mmol) e dioxano (5193 ml) foi purgada com nitrogênio e então foi adicionado bis (pinacolato)diboron (641 g, 2523 mmol), seguido por acetato de potássio (495 g, 5046 mmol). A mistura reacional foi purgada com. nitrogênio; foi adicionado Pd(dppf)C1.2 (41,2 g, 50,5 mmol); a mistura reacional foi purgada, com

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 66/107 nitrogênio; aquecida a 103 °C sob nitrogênio durante 5 h e resfriada à TA. A mistura reacional foi concentrada por destilação a vácuo e dividida entre acetato de etila (5204 ml) e água (5212 ml). A mistura reacional foi filtrada através de Celite; a camada orgânica foi lavada com salmoura (2606 ml), seguida de remoção do solvente por destilação a vácuo para fornecer o produto bruto como um óleo preto espesso (aprox. 800 g).

[0099] O produto bruto foi dissolvido em. DCM (1289 ml) e purificado por cromatografia em silica gel (2627 g de silica pré-empacotada em hexano, eluida com 20% de acetato de etila em hexanos (10,35 1)). O solvente foi removido por destilação a vácuo para produzir um óleo amarelo claro (600 g) . Tempo de retenção do método B HPÃC .33,74 min.

(b) (4-(Benziloxi)-2-etil~5fluorofenil)trifluoroborato, potássio

[00100] O produto da etapa anterior (200 g, 561 mmol) foi misturado com acetona (1011 ml) até a dissolução completa e metanol (999 ml) foi adicionado seguido por difluoreto de hidrogênio de potássio 3 M (307 g, 3930 mmol) dissolvido em água (1310 ml). A mistura reacional foi agitada durante 3,5 h. A maior parte do solvente orgânico foi removida por destilação a vácuo. Foi adicionada água (759 ml) e a pasta espessa resultante foi agitada durante 30 min. e filtrada. O sedimento foi lavado com água (506 ml) e os sólidos foram secos no filtro durante 30 min. Os sólidos foram dissolvidos em acetona (1237 ml) e agitados durante 1 h. A. pasta fluida resultante foi filtrada, e os sólidos lavados com acetona (247 ml) . A solução de acetona foi concentrada por destilação a vácuo e um volume constante

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9 / 7 9 (2 1) foi mantido pela lenta adição de tolueno (2983 ml) até que toda a acetona e água fosse destilada. A solução de tolueno foi destilada para uma pasta amarela espessa por evaporação rotativa, durante a qual os produtos precipitavam como sólidos brancos. Foi adicionada uma porção adicional de tolueno (477 ml) à mistura e agitada durante 1 h. A mistura foi então filtrada e enxaguada com tolueno (179 ml) e seca sob vácuo a 50 °C durante 24 h para fornecer o título composto (104 g, 310 mmol, 55% de rendimento) como um sólido macio, fluido, ligeiramente esbranquiçado. Tempo de retenção do método B HPLC 27,71 min.

Preparação 5: 5-Benzil“2-(6-(4~(benziloxi)-2-etil-5fluorofenil) -lJf-indazol-3-il) -4,5,6,7-tetraidro-lHimidazo[4,5-c]piridina

(a) 5-Benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5-c]piridina

[00101] Uma mistura de bis(pinacolato)diboron (250 g, 984 mmol) e IPA (1,88 1) foi agitada para dissolver e então foi adicionada uma solução de difluoreto de hidrogênio de potássio (538 g, 6,891 mol) em água (2,31 1) aos poucos durante 10 min. A mistura reacional foi agitada durante 1 h e filtrada. O sólido semelhante a gel foi dissolvido com água (1,33 1) até a misturar formar um hidrogel claro e então por mais 45 min. Os sólidos/gel resultantes foram filtrados e então redissolvidos em acetona (1,08 1),

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 68/107 filtrados, secos ao ar durante 30 mi e secos durante a noite para fornecer um sólido branco macio {19 6, 7 g) .

[00102] A um balão de 5 1 foi adicionado 5-benzil-2-(6bromo-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5c]piridina (135 g, 331 mmol), (4-(benziloxi)-2-etil-5fluorofenil)-trifluoroborato de potássio (133 g, 397 mmol) e o sólido branco da etapa anterior (40,5 g) seguido de MeTHF (1,23 1) e MeOH (1,75 1) . A pasta fluida resultante foi desgaseificada três vezes com nitrogênio. Foi adicionada à pasta fluida uma solução desgaseificada de carbonato de césio (431 g, 1,323 mol) em água (1,35 1) . A pasta fluida foi desgaseificada duas vezes, foi adicionado Pd(anfos)2CI2 (11,71 g, 16,53 nimol), a pasta fluida foi novamente desgaseificada duas vezes e a mistura reacional foi agitada a 67 °C durante a noite e resfriada a 20 °C. As camadas foram separadas e novamente extraídas com MeTHF (550 ml). As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas por destilação rotativa até que os sólidos fossem, precipitados. MeTHF (7 00 ml) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada a 6 5 0. As camadas foram separacias e a rase aquosa foi extraída novamente com MeTHF (135 ml) . As fases orgânicas foram combinadas e concentradas a cerca de 300 ml, resultando em uma densa pasta fluida cor laranja. À pasta fluida foi adicionado MeOH (270 ml) seguido de IM HC1 com.

pida agitação. A mistu reacional foi agitada durante adicionaaa água (1 1) pasta fluida resultante foi agitada, durante 1 h. Os sólidos foram filtrados, lavados com água (150 ml), secos no filtro iurante 10 min. e a sob nitrogênio durante 16 h para

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51/79 fornecer o sal 2 HC1 do título composto (221,1 g, 351 mmol, 92,2% de pureza) como um sólido amarelo claro. Tempo de retenção do método B HPLC 23,41 min.

Preparação 6: 5~etil“2~fluoro“4“(3-(4,5,6,7-tetraidroIH-imidazo [4,5~c]piridin“2~il) -lJí-indazol-6-il) fenol

[00103] A um balão de 1 1 foi adicionado 5-benzil-2-(6(4- (benziloxi) -2~etil~'5-fluorofenil) -líf-indazol-3-il) 4,5, 6, 7-tetraidro-lH-imidazo [4,5-c] piridina, 2 HC1 (40 g, 63,4 mmol) como uma pasta fluida em. etanol (348 ml) e HC1 1,25 M em MeOH (101 ml) e água. (17,14 ml) . A mistura reacional foi desgaseifiçada com nitrogênio durante minutos e então foi adicionado Pd/C 10% em peso, H₂O 50% em. peso (4,05 g, 1,903 mmol) . O reator foi vedado, purgado com H2, pressurizado a 1-2 psi, aquecido a 50 °C e a mistura reacional foi agitada durante a noite e filtrada através de Celite. O reator e o sedimento foram lavados com metanol (100 ml).

[00104] A solução filtrada foi combinada com o produto de um segundo lote na escala de 9 8 mmol e concentrada a 390 g. Foi adicionado EtOAc (2,04 1) lentamente com agitação e então a solução foi resfriada a 5 °C com agitação. Os sólidos foram filtrados, lavados com EtOAc (510 ml) e secos durante a. noite a. 4 5 °C sob nitrogênio para fornecer o sal 2 HC1 do titulo composto (58 g, 8 0% de rendimento) como um

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 70/107 sólido quase branco. Tempo de retenção do método B HPLC 12,83 min.

Exemplo 1: Hidrato cristalino de 5~etil~2~fluoro~4~(3(5- (l-metilpiperidin-4-il) -4,5,6,7-~tetraidro-lJí“imidazo [4,5c]piridin-2-il)-IH-indazol-e-il)fenol

NMP (239 ml)

4,5,6,7-tetraidro-l.H-

imidazo[4,	5 - c ] p i r	•idin-2-il) -IH-i	. n d a. z o 1 - 6 - i 1) f e η o 1,		HC1
(74,5 g, 1	6 5 mmo1	.) , com agitaçãc	:> seguida de NMP (74	ml) .	Foi
adicionado	ácido	acético (31,3 n	cl) e a mistura read	.01131	r o i
cl C[ LI Θ C 1. CÍ 3 3	5 5 ° C	durante 10 min	. e então resfriada	ci Δ O	O
Foi adicio	nada 1-	•met i 1 p i p e r i d i n -	-4-ona. (61,0 ml, 496	mmo 1)	em
uma única	porção	e a mistura rt	sacional foi agitada	a 21	5 °C

durante 30 minutos e resfriada a 15 °C. Foi adicionado triacetoxiboroidreto de sódio (98 g, 463 mmol) e o revestimento externo foi ajustada para 20 °C após 5 min. Após 3 h, foi adicionado hidróxido de amônio (365 ml, 57 90 mmol) gota a gota durante 4 5 min. mantendo a

temper	atura abaixo	de 2 5 ° C.	A mistura	i θ a c i ο π a 1 t o i	agitada
durant	e 1,5 h a	20 °C,	formando	uma pasta	fluida
esbran	quiçáda. Foi	adieionac	Io metanol	(7 0 9 m l) e a.	mistura

reacional foi agitada lentamente durante a noite a 55 °C. Foi adicionada água (1,19 1) durante 30 minutos a 55 °C e a mistura foi resfriada a 10 °C, agitada durante 2 h e

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 71/107 filtrada. 0 sedimento foi lavado com. 1:1 MeOH:água (334 ml), seco no filtro durante 20 min e a 45 °C sob vácuo com sangria de nitrogênio para fornecer sólidos amarelos (87 g).

[OOlOfej Foi adicionado 5% de agua/acetona (1,5 1) aos sólidos a 55 °C, com. lenta agitação e a mistura reacional foi aquecida a 55 °C durante 6 h, resfriada a 10 °C, filtrada e lavada com 5% de água/acetona (450 ml). Os sólidos foram secos durante a noite a 50 °C sob vácuo com sangria de nitrogênio, equilibrados no ar durante 20 h, secos no forno a vácuo durante 4 8 h e equilibrados com. ar para fornecer o título composto (71,3 g, 91% de rendimento) como um sólido amarelo pálido, fluido. Tempo de retenção do método B HPLC 12,29 min.

Exemplo 2: Difração por raios X do pó

[ 00107 ] O padrão de difração de raios X do pó (PXRD) do produto do Exemplo 1 foi obtido com um difratômetro de raiox, Bruker D8-Advance, usando radiação Cu-Kcx (À = 1,54051 A) com tensão de saída de 45 kV e corrente de 40 mA. O instrumento foi operado na geometria. Bragg~B.renta.no com. fendas incidentes, de divergência e de espalhamento ajustadas para maximizar a intensidade na amostra. Para medição, uma pequena quantidade de pó (5-25 mg) foi gentilmente pressionada em um. suporte de amostra para formar uma superfície lisa e submetida à exposição aos raios X. As amostras foram examinadas no modo 2Θ-2Θ de 2° a 40° em 2Θ com um tamanho de etapa de 0,02° e uma velocidade de leitura de 0,30°segundo por etapa. A. aquisição de dados foi controlada pelo programa de medida. DiffracSuite Bruker e analisados pelo programa Jade (versão 7.5.1). O instrumento foi calibrado com um padrão de corindo, dentro do ângulo de

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 72/107 dois tetas ±0,02°. A tabela 1 mostra as posições de duas teta PXRD e espaçamentos em d observados

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 73/107

Tabela 1: Dados de PXRD para o hidrato cristalino

2-Teta	d (Â)	Área	A%
6,20	14,24	81639	45, 7 0
9, 58	CM CM	178629	10 0,00
0,3 4	J, 55	30022	.1. b f 8 0
0,65	5, 3 0	12801	7,20
1,54	1, 6 6	2 722 0	15,20
2,77	: qq	27705	15,50
3,01	5,80	4 8 7 8 5	2 7,30
3,39	f Ό1	92 61	5,2 0
6, 94	: i [ο I Cl!	40031	22,4 0
7,53	) f U O	8 3718	46, 90
CO I bl	5,7 5	9542	5,30
9,2 8	5,60	152922	85, 60
L L·-.______	cl CO ί	22 3 91	12,50
0, 61	5,31	30308	]. 7 , 0 0
1,51	5,13	92 875	52,0 0
o i n	í 9,9	0 1 4 o, 5	9 1 0 0
	t f υ Z
22,79	o CO	13802	/ Λ / u
23,22	Q % - !	12117	6,80
2 5, 16	3,54	137 92	7,70
2 8,80	3,10	14 4 8 7	8, ?i. 0
29, 62	3, 01	14 810	CO CO o
3 0,20	2 ; 9 Ό	9 7 0 9	5,40

[00108] 0 presente composto,

5-etil~2-fluoro-4-(3(l-metilpiperidin-4-il) -4, b, 6_f 7-tetraidro--l.fi--imidazo [4,5

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c] piridin-2-il)-lJf-indazol-6-il) fenol (composto 1) foi caracterizado nos seguintes ensaios biológicos.

Ensaio 1: Ensaios bioquímicos da quinas© JAK

[00109] Um painel de quatro ensaios bioquímicos LanthaScreen JAK (JAK1, 2, 3 e Tyk2) foi realizado em um tampão de reação comum para quinase (50 mM de HEPES, pH 7,5, 0,01% Brij-35, 10 mM de MgCl?, e 1 mM de EGTA) . As enzimas JAK marcadas com GST recombinante e o substrato de peptídio STAT1 marcado com GFP foram adquiridos da Life Technologies.

[00110] O composto diluído em. série foi pré-incubado com cada uma das quatro enzimas JAK e o substrato em microplacas brancas de 384 poços (Corning) à temperatura ambiente durante 1 h. ATP foi adicionado posteriormente para iniciar as reações de quinase em 10 ul de volume total, com 1% de DMSO. As concentrações enzimáticas finais para JAK1, 2, 3 e Tyk2 são 4,2 nM, 0,1 nM, 1 nM, e 0,25 nM, respectivamente; as concentrações correspondentes de Km. ATP usadas são 25 uM, 3 μΜ, 1,6 pM e 10 μΜ; enquanto a concentração de substrato é de 200 nM para todos os quatro ensaios. As reações da quinase continuaram por 1 hora à temperatura ambiente antes de serem adicionados uma preparação de 10 pl de EDTA (10 mM de concentração final) e anticorpo Tb-anti-pSTATl (pTyr701) (Life Technologies, 2 nM concentração final) em tampão de diluição TR-FRET (Life Technologies). As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 1 hora antes de serem lidas no leitor Envision (Perkin Elmer). Os sinais de taxa de emissão (52 0 nm/495 nm.) foram registrados e usados para calcular a percentagem de valores de inibição com base no DMSO e nos controles de fundo.

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7/79

[00111] Para a análise de dose-resposta, dados de inibição percentual foram aplicados em um gráfico versus as

concentrações dos	compostos,	e os valores	de IC50 foram
determinados a. pai	?tir de um	modelo de ajust	e robusto de 4
parâmetros com o	software i	Prism (GraphPad	S o11ware). 0 s

resultados foram expressos como pICso (logaritmo negativo de IC_5Q) e, posteriormente, convertidos para pI-G (logaritmo negativo da constante de dissociação, Ki) usando a equação de Cheng-Prusoff.

[001121 O composto da invenção exibiu a potência enzimática a seguir.

Tabela 2

JAK 1 pKi	pKi	ϋΆΚ 3 pKi	Tyk2 pKi
10,2	10,8	9, 7	9,8

Ensaio 2: Ensaio da potência celular da JAK: inibição da IL-13

[00113] O ensaio da potência celular AlphaScreen JAKI foi feito ao medir a fosforilação de STA.T6 induzida por interleucina-13 (IL-13, R&D Systems) em células epiteliais do pulmão humano BEAS-2B (ATCC). O anticorpo anti-STAT6 (Cell Signaling Technologies) foi conjugado a pérolas aceptoras AlphaScreen (Perkin Elmer), enquanto o anticorpo anti-pSTA.T6 (pTyr641) (Cell Signaling Technologies) foi biotinilado usando a sulfo-NHS-biotina EZ-Link (Thermo Scientific).

[00114] As células BEAS-2B foram cultivadas a 37 °C em uma incubadora umidificada a 5% de CO2 no meio de 50%

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DMEM/50% F-12 (Life Technologies), suplementado com 10% de

FBS (Hyclone) , 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies) e 2 mM de GlutaMAX (Life Technologies). No dia 1 do ensaio, as células foram semeadas a uma densidade de 7.500 células/poço em placas brancas com 384 poços revestidos com poli-D-lisina (Corning) com 25 μΐ de meio, e ficaram durante a noite na incubadora para aderência. No dia 2 do ensaio, o meio foi removido e substituído com 12 μΐ de tampão de ensaio (Hank's Balanced Salt Solution, 25 mM HEPES e 1 mg/ml de albumina sérica bovina/BSA) contendo respostas-dose dos compostos de teste. O composto foi diluído em série em DMSO e, então, diluído 1000 vezes nos meios para chegar à concentração final de 0,1%; em. DMSO. As células foram incubadas com. os compostos de teste a 37 °C durante 1 h, seguida pela adição de 12 μΐ de IL-13 pré-aquecido (80 ng/ml em tampão de ensaio) para estimulação. Após incubação a 37 °C durante 30 min., o tampão do ensaio (contendo composto e IL-13) foi removido, e 10 μΐ de tampão de lise celular (25 mM HEPES, 0,1%: SDS, 1% NP-40, 5 mM de MgCÍ2, 1,3 mM, 1 mM de EDTA, EGTA e suplementado com os inibidores de protease Ultra mini e PhosSTOP da Roche Diagnostics). As placas foram, agitadas a temperatura ambiente por 30 min. antes da adição dos reagentes de detecção. Uma mistura de pérolas aceptoras conjugadas anti-biotina-pSTAT6 e anti-STAT6 foi adicionada pr.im.ei.ro e incubada à temperatura ambiente durante 2 h, seguida pela adição de pérolas doadoras conjugadas a estreptavidina (Perkin Elmer) . Após um mínimo de 2 h de incubação, as placas de ensaio foram lidas no leitor de placa EnVision. Os sinais de luminescência AlphaScreen foram

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 77/107 gravados e usados para calcular os valores percentuais de inibição com base em DMSO e controles de fundo.

[00115] Para análise de resposta-dose, os dados percentuais de inibição foram inseridos em um gráfico versus as concentrações de compostos, e os valores de IC50 foram determinados a partir de um modelo de ajuste robusto de 4 parâmetros com o programa Prism. Os resultados também podem ser expressos como o logaritmo negativo do valor de IC50, pICso. O composto da invenção exibiu um valor de pIC.50 de cerca de 8,2 neste ensaio.

Ensaio 3: Ensaio da potência celular da JAK: inibição de IL“2/anti“CD3 estimulada por IFNy em PBMCs humanos

[00116] A potência do composto de teste para inibição da interleucina-2 (IL-2)/anti-CD3 estimulada pela gama interferona (IFNy) foi medida em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas do sangue humano total (Stanford Blood Center) . Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK.

[00117] (1) As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis usando um gradiente Ficoll. As células foram cultivadas a 37 °C, em. incubadora umidificada a 5% de CO2 em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 10% de Soro Fetal Bovino Inativado pelo Calor (SFB, Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e IX Pen/Strep (Life Technologies) . As células foram semeadas em. 2 00.000 células/poço nos meios (50 μΐ) e cultivadas durante 1 h. Os compostos foram diluídos em série em DMSO e, então, diluídos

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500 vezes (para unia concentração final de ensaio de 2x) nos meios. Os compostos do teste (100 μΐ/poço) foram adicionados às células e incubados; a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 hora, seguida pela adição de IL-2 (R&D Systems; concentração final de 100 ng/ml) e anti-CD3 (BD Biosciences; concentração final de 1 pg/ml) em meios de ensaio pré-aquecido (50 μΐ) durante 24 horas.

[00118] (2) Após	a estimulação com citocina,	as células
foram, centrifugadas a	500 g durante 5 min. e o s	o b r e n a d a. n t e
removido e congelado	a -80 °C. Para determinar	a potência

inibitória do composto de teste em resposta à IL-2/anti-Cd3, foram medidas as concentrações de IFNy sobrenadante via ELISA (R&D Systems) . Os valores de IC.50 foram determinados a partir da análise das curvas de concentração de IFNy versus a concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pIC.50 (IC50 logaritmo decádico negativo). O composto da invenção exibiu um valor de pIC.50 de cerca de 7,3 neste ensaio.

Ensaio 4: Ensaio da potência celular da JAK: inibição de pSTAT5 estimulada por IL-2 em células T CD4+

[00119] A potência do composto de teste para inibição da fosforilação de STAT5 estimulada pela interleucina-2 (IL2)/anti-CD3 foi medida em. células T CD4-positivos (CD4 + ) , células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas do sangue humano total (Stanford Blood Center) usando a citometria de fluxo. Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK.

[00120] Células T CD4+ foram identificadas usando um anticorpo anti~CD4 conjugado com ficoeritrobilina (PE) (Clone RPA-T4, BD Biosciences), enquanto foi usado um

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 79/107 anticorpo anti-pSTAT5 conjugado Alexa Fluor 647 (pY694,

Clone 47, BD Biosciences) para detectar a fosforilação de

[00121] (1) O protocolo do parágrafo 3 do ensaio (1) foi seguido com exceção que a estimulação de citocinas com anti-CD3 foi realizada durante 30 minutos em vez de em 24 h.

[00122] (2) Após a estimulação com citocinas, as células foram fixadas com solução de fixação pré aquecida (200 ul; BD Biosciences) durante 10 min. a 37 °C, 5% de CO2, lavadas duas vezes com tampão DPBS (1 ml, Life Technologies), e ressuspendidas em tampão ITT Perm resfriado (1000 μΐ, BD Biosciences) durante 30 min. a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com 2% de SFB DPBS (tampão FACS) e então ressuspendidas em. tampão FACS (100 μΐ) contendo antiCD4 PE (diluição 1:50) e anti-CD.3 anti-CD3Alexa Fluor 647 (diluição

1:5) durante 60 min.

à temperatura ambiente escuro. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS antes de serem analisadas usando o citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences). Para determinar a potência inibitória dos compostos de teste em resposta a IL-2/anti-CD3, foi medida a intensidade fluorescente mediana (IEM) de pSTAT5 em. células T CD4+. Os valores de IC50 foram determinados a. partir da análise das curvas de inibição da IMF versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pICso (IC50 logaritmo decádico negativo). O composto da invenção exibiu um valor de pICso de cerca de 7,7 neste ensaio.

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Ensaio 5: Ensaio da potência celular da JAK: inibição de pSTAT6 estimulada por IL-4 em células T CD3+

[00123] A potência do composto de teste para inibição da fosforilação de STAT6 estimulada pela interleucina-4 (IL4) foi medida em. células T CD3-positivos (CD3+), células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas do sangue humano total (Stanford Blood Center) utilizando a citometria de fluxo. Como a IL-4 sinaliza por meio da JAK, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK.

[00124] Células T CD3+ foram identificadas utilizando um anticorpo anti-CD.3 conjugado com f icoeritrobilina (PE) (Clone UCHT1, BD Biosciences), enquanto foi usado um anticorpo anti-pSTAT6 conjugado Alexa Fluor 647 (pY641, Clone 18/P, BD Biosciences) para detectar a fosforilação de STAT6.

[00125] As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis como nos Ensaios 3 e 4. As células foram semeadas na taxa de 250.000 células/poço em meios (200 ul) , cultivadas por 1 h e, em seguida, ressuspendidas em meios de ensaio (50 μΐ) (RPMI suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino (Sigma) , 2 mM Glutamax, 25 mM HEPES e IX Penstrep) contendo diferentes concentrações de compostos de teste. Os compostos foram diluídos em série em DMSO e, então, diluídos 500 vezes (para uma concentração final de ensaio de 2x) nos meios de ensaio. Os compostos de teste (50 μ!) foram incubados com as células a 37 °C, 5% de CO? por 1 h, seguido pela adição de 50 μΐ de IL~4 (R&D Systems; concentração final 20 ng/ml) em meio para ensaio pré-aquecido durante 30 min. Após estimulação das citocinas, as células foram fixadas com

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 81/107 solução de fixação pré-aquecida (100 μΐ) (BD Biosciences) por 10 min. a 37 °C, 5% de CO2, lavadas duas vezes com tampão FACS (1 ml) (2% FBS de DPBS) e ressuspendidas em 1000 μΐ de tampão Perm III gelado (BD Biosciences) durante 30 min. a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e, em seguida, colocadas em suspensão de tampão FACS (100 ul) contendo anti-CD3 PE (diluição 1:50) e anti-pSTAT6 Alexa Fluor 647 (diluição 1:5) durante 60 min. à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS antes de serem, analisadas usando o citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences).

[00126] Para determinar a potência inibitória do composto de teste em resposta a IL-4, foi medida a intensidade fluorescente mediana (IFM) de pSTATo em células T CD.3+. Os valores de IC50 foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da IMF versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos como pICso (IC50 logaritmo decádico negativo). O composto da invenção exibiu um valor de pIC.50 de cerca de 8,1 neste ensaio.

Ensaio 6: Ensaio da potência celular da JAK: inibição de pSTAT3 estimulada por IL~6 em células T CD3+

[00127] Um protocolo análogo ao Ensaio 5 foi usado para determinar a potência do composto de teste para inibição de fosforilação de STAT3 estimulada por interleucina 6 (IL-6). Foi usada um anticorpo anti-STAT3 Alexa Fluor 647 conjugado (pY705, Clone 4/P, BD Biosciences) para detectar a fosforilação de STAT3.

[00128] O composto da invenção exibiu um. valor de pICso de cerca de 7,4 neste ensaio.

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Ensaio 7: Ensaio da potência celular da JAK: inibição de IFN-γ induzida por pSTATl

[00129] A potência do composto do teste para inibição da fosforilação de STAT1 estimulada pela gamainterferona (IFNy) foi medida em monócitos CD14-positivos (CD14+) derivados do sangue total (Stanford Blood Center) usando citometria de fluxo. Como IFNy sinaliza por meio da JAK, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK.

[00130] Os monócitos foram. identificados usando anticorpo anti-CD14 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Clone RM052, Beckman Coulter) e um anticorpo anti-pSTATl conjugado Alexa Fluor 647 (pY701, Clone 4a, BD Biosciences) foi usado para detectar a fosforilação de STAT1.

[00131] As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis usando um gradiente Ficoll. As células foram cultivadas a 37 °C, incubadora umidificada a 5% de CO? em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS, Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e IX Pen/Strep (Life Technologies). As células foram semeadas numa taxa de 250.000 células/poço em. meios (200 μΐ), cultivadas por 2 h e ressuspendidas em meios de ensaio (50 μΐ) (RPMI suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino (Sigma), 2 mM Glutamax, 25 mM HEPES e IX Penstrep) contendo diferentes concentrações dos compostos de teste. O composto foi diluído em série em DMSO e, então, diluído 1000 vezes nos meios para chegar à concentração final de 0,1% em DMSO. As diluições dos compostos de teste foram incubadas

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 83/107 com as células a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 h, seguido pela adição de IFNy pré-aquecido (R&D Systems) nos meios (50 μΐ) a uma concentração final de 0,6 ng/ml durante 30 minutos. Após a estimulação de citocinas, as células foram fixadas com solução de fixação pré-aquecida (100 μΐ) (BD Biosciences) durante 10 min. a 37 °C, 5% de CO₂, lavadas duas vezes com tampão de FACS (1 ml) (1% de BSA em PBS), ressuspendidas em 1:10 de anti-CD14FITC: tampão FACS (100 μΐ) , e incubadas a 4 °C durante 15 min. As células foram lavadas uma vez e, em seguida, ressuspendidas em tampão Perm III gelado (BD Biosciences) (100 μΐ) durante 30 min. a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspendidas em. 1:10 de Alexa Fluor 647 anti-pSTATl: tampão FACS (100 μΐ) durante 30 min. à TA no escuro, lavadas duas vezes com tampão FACS, e analisadas através de um citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences).

[00132] Para determinar a potência inibitória do composto do teste, a intensidade fluorescente mediana (IFM) de pSTATl foi medida em monócitos CD14+. Os valores de IC50 foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da IMF versus concentração dos compostos. Os dados são expressos como valores de pICso (IC50 logaritmo decádico negativo). O composto da invenção exibiu um valor de pIC₂o de cerca de 7,5 neste ensaio. Ensaio 8: Farmacocinética ocular em olhos de coelho [001.33] O objetivo deste ensaio foi determinar a farmacocinética do composto de teste em tecidos oculares de coelhos. Formulação da solução

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[00134] O composto da invenção, 5-etil-2-fluoro-4-(3(5-(l-metilpiperidin-4-il)-4,5,6,7-tetraidro-1 H-imidazo[4,5c]piridin-2-il)-lH-indazol-6-il)fenol (1) foi dissolvido em 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina a 10% para obter uma concentração-alvo de 4 mg/ml ou em água purificada para obter uma concentração-alvo de 1 mg/ml. Foi administrada injeção bilateral intravítrea (50 μΐ/olho) da solução do composto de teste a coelhos brancos da Nova Zelândia em dois grupos de dose, 200 pg/olho e 50 ug/olho, respectivamente, para as formulações de ciclodextrina e veículo água, respectivamente. A concentração do· composto do teste foi medida nos tecidos oculares: vítreo aquoso, retina/coroide e corpo íris-ciliar em pontos de tempo predeterminados após a injeção (30 min., 4 h, ?i. d, 3 d, 7 d, 14 d) . Dois coelhos (quatro olhos) foram dosados para cada ponto de tempo. No tecido vítreo, o composto 1 apresentou uma diminuição de duas fases na concentração caracterizada por uma diminuição inicial da concentração com meia-vida de aproximadamente 12 horas e finalmente uma meia-vida terminal de aproximadamente 3,6 dias. Foi verificado que o composto se distribuía rapidamente na região da retina e coroide também e mostra um perfil farmacocinético similar como no tecido vítreo.

Formulação· de suspensão

[00135] Foi preparada uma formulação de suspensão ao combinar o composto 1 do Exemplo 1 com 0,5% de hidróxipropilmetilcelulose (HPMC E5) + 0,02% de Tween 80 para atingir uma concentração-alvo de 10 mg/ml. Foi administrada injeção intravítrea bilateral (50 μΐ/olho) da suspensão do composto do teste a coelhos brancos da Nova

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Zelândia (500 μΐ/olho). A concentração do composto do teste foi medida após a injeção nos tecidos oculares como no ensaio de formulação de suspensão a 30 min., 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas e 8 semanas pós-injeção. O composto mostrou uma redução linear na concentração do fármaco no tecido vítreo de 3 0 min. a 6 semanas com uma taxa de depuração do fármaco de aproximadamente 3 pg/ml/dia. O comportamento é coerente com a solubilidade do composto 1 no veículo e o comportamento farmacocinético ocular na formulação da solução. A concentração do fármaco no plasma foi medida e encontrada como sendo pelo menos 3 ordens de magnitude inferior à concentração no tecido vítreo.

Ensaio 9: Ensaio farmaoodinâmico: inibição do pSTAT3 induzido por IL6 em ratos

[00136] A capacidade de uma única administração intravitrea do composto do teste em inibir o pSTAT3 induzido por IL-6 foi medida em homogenados de retina/coroide de ratos.

[00137] Foram, preparadas formulações de suspensão ao combinar o composto 1 do Exemplo 1 com. 0,5% de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC E5 LV), 0,02% de Tween 80 e 0,9 mg/ml de cloreto de sódio em água purificada para atingir concentrações-alvo de 3 e 10 mg/ml.

[00138] Ratos fêmeas da raça Lewis receberam dose intravítrea (IVT) (5 μΐ/olho) com as formulações da suspensão ou com o veículo do fármaco. Três dias depois, foi administrado IL-6 (Peprotech; 0,1 mg/ml; 5 μΐ/olho) ou veículo de maneira intravítrea. para induzir o pSTAT3. Os tecidos oculares foram dissecados uma hora após a segunda injeção IVT com IL-6. Os tecidos da retina/coroide foram

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 86/107 homogeneizados e os níveis de pSTAT3 foram medidos usando um ELISA (Tecnologia de Sinalização Celular). A percentagem de inibição de pSTAT3 induzida por IL-6 foi calculada em comparação com os grupos veículo/veículo e veículo/IL-6. A inibição de mais de 100% reflete uma redução dos níveis de pSTAT3 para abaixo dos valores observados no grupo veículo/veículo.

[00139] Com um pré-tratamento de 3 dias antes do desafio com IL-6, a dose de 15 pg e a dose de 50 pg de composto da invenção administradas pela formulação da suspensão inibiram o pSTAT3 induzido pela IL-6, em 33% e 109% respectivamente nos tecidos da retina/coroide.

Ensaio 10: Ensaio farmacodinâmico: inibição do IP-10 induzido por IFNy em coelhos

[00140] A capacidade de uma única administração intravítrea do composto do teste para inibir os níveis da proteína IP-10 induzida por gamainterferona (IFNy) foi medida nos tecidos vítreo e da retina/coroide.

[00141] Foram, preparadas formulações da solução nas concentrações de 1 mg/ml e 4 mg/ml do composto 1 do Exemplo 1 como no Ensaio 8. Foi preparada uma formulação de suspensão ao combinar o composto cristalino 1 do Exemplo 1 com 0,5% de hidroxipropilm.etilcelul.ose (HPMC E5 LV) , 0,02%; de Tween 80 e 9 mg/ml de cloreto de sódio em água purificada para atingir uma concentração-alvo de 20 mg/ml.

[00142] Foram usados coelhos machos brancos da Nova Zelândia. (Liveon Biolabs, índia) para, os estudos. Os animais foram aclimatados após a chegada às instalações de pesquisa (Jubilant Biosys Ltd., índia). Cada coelho recebeu um total de duas injeções intravítreas (IVT) com um volume de dose

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 87/107 total de 50 μΐ por olho. A primeira injeção IVT (45 μΐ por olho) forneceu o compos to de teste ou o veículo em um determinado momento (ou seja, 24 horas para as formulações da solução ou 1 semana para a formulação da suspensão) . A segunda injeção de IVT (5 μΐ/olho) forneceu IFNy (1 pg/olho; solução estoque 1 mg/ml; Kingfisher Biotech) ou veículo para a indução de IP-10. Resumindo, no dia das injeções, os coelhos foram anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina (35 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Assim que estivessem profundamente anestesiados, cada olho foi lavado com soro fisiológico estéril e foram feitas injeções IVT usando uma seringa de insulina 0,5 ml (50 unidades = 0,5 ml) com uma agulha de calibre 31 no lado supranasal de ambos os olhos ao marcar a posição com um paquimet.ro fixo Braunstein (2 3/4) 3,5 mm distante do músculo reto e 4 mm do limbo.

[00143] Os tecidos foram coletados 24 horas após a segunda injeção IVT com IFNy. 0 humor vítreo (VH) e os tecidos retina/coroide (R/C) foram coletados e homogeneizados e os níveis da proteína IP-10 foram, medidos usando um kit ELISA para coelho CXCL10 (IP-10) (Kingfisher Biotech). A percentagem de inibição de IP-10 induzida por IFNy foi calculada em. comparação com os grupos veículo/veículo e veículo/IFNy.

[00144] Quando administrado como uma solução, com um pré-tratamento de 24 horas antes do desafio com IFNv, 45 pg do composto 1 inibiu IP-10 induzido por IFNy, em 70% e 86% no humor vítreo e tecido da retina/coroide, respectivamente, enquanto 180 pg do composto inibiu o IP-10 induzido por IFNy, em 91% e 100% no humor vítreo e tecido da retina/coroide, respectivamente.

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[00145] Coni um pré-tratamento de 1 semana antes do desafio com ΙΕΝγ, a formulação da suspensão do composto cristalino 1 inibiu IP-10 induzido pelo IFNy em. 100% no humor vítreo e nos tecidos da retina/coroide, r e s p e c t .i vame n t e .

Ensaio 11: Farmacocinética no plasma e no pulmão em camundongos

[00146] Os níveis plasmático e de pulmão do composto do teste e sua proporção foram determinados da. seguinte forma. Foram usados BALB/c de camundongos de Charles River Laboratories no ensaio. Os compostos do teste foram individualmente formulados em 20% de propilenoglicol em tampão de citrato com pH 4 em uma concentração de 0,2 mg/ml e 50 μΐ da solução administrada foi introduzida na traqueia de um camundongo por aspiração. Em vários momentos [normalmente 0,167, 2, 6, 24 h) pós-administração, foram retiradas amostras de sangue através de punção cardíaca e pulmões intatos foram retirados dos ratos. As amostras de sangue foram, centrifugadas (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos a aproximadamente 12.000 rpm a 4 °C para coletar o plasma. Os pulmões foram acolchoados a seco, pesados e homogeneizados em uma diluição de 1:3 em água estéril. Os níveis plasmáticos e de pulmão do composto do teste foram determinados por análise LC-MS contra padrões analíticos construídos em uma curva padrão na matriz do teste. Foi determinada uma razão pulmão para plasma como a proporção de ASC do pulmão em pg h/ml para, a ASC plasmática em. pg h/ml, onde a ASC está convencionalmente definida como a. área, sob a curva do composto do teste versus tempo.

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[00147 ] O composto da invenção exibiu exposição no pulmão cerca de 55 vezes maior do que a exposição no plasma no camundongo.

Ensaio 12: Modelo Murino (Camundongo) de indução de pSTAT6 induzida por IL-13 em tecido pulmonar

[00148] IL-13 é uma citocina importante subjacente à fisiopatologia da asma (Kudlacz et al. Eur. J. Pharmacol, 2008, 582, 154-161) . IL-13 se liga aos receptores de superfície celular ativando os membros da família de Janus quinases (JAK) que então fosforilam STAT6 e subsequentemente ativa as vias de transcrição. No modelo descrito, uma dose de IL-13 foi entregue localmente nos pulmões do camundongo para induzir a fosforilação de STAT6 (pSTAT6) que é então

medida como o ponto final (resultado	z · adultos	balb/c	de Harlan
[00149] Foram	US 8. όΐΟ S CS.iTi LiRÓ-OnCJC1 8
no ensaio. No di	ci d Ο Θ5 LUGO; OS	animais	foram	levemente

anestesiados com isoflurano e receberam administração de veículo ou composto do teste (0,5 mg/ml, 50 μΐ de volume total, ao longo de várias respirações) via aspiração oral. Os animais foram colocados em decúbito lateral pós-dose e monitorados para a plena recuperação da anestesia antes de serem, devolvidos à sua gaiola. Quatro horas mais tarde, os animais foram novamente anestesiados brevemente e desafiados com qualquer veículo ou IL-13 (0,03 pg dose total liberada, 50 μΐ volume total) através de aspiração oral antes de serem monitorados durante a recuperação da anestesia e devolvidos à sua gaiola. Uma hora, após a administração de IL-13 ou veículo, os pulmões foram coletados para detecção de pSTAT6 usando um ELISA. anti-STAT6 (anticorpo captura/revestimento mAb de coelho; anticorpo detecção/captura mAb de camundongo:

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 90/107 anti-pSTAT6-pY641; anticorpo secundário: anti-camundongo IgGHRP) e analisados para a concentração total do fármaco como descrito acima no ensaio 11.

[00150] A atividade no modelo é evidenciada por uma diminuição no nível de pSTAT6 presente no pulmão dos animais tratados em 5 horas em comparação aos animais tratados com veículos, controles desafiados com IL-13. A diferença entre os animais controle que foram tratados com veículo, desafiados com. IL-13 e os animais controle que foram tratados com. veículo, desafiados com. veículo ditaram 0 a 100% de efeito inibitório, respectivamente, em qualquer experimento. O composto da invenção exibiu cerca de 60% de inibição da fosforilação do STAT6 às 4 horas após o desafio com IL-13.

Ensaio 13: Modelo de Murino de inflamação eosinofílica do pulmão induzida por Alternaria alternata

[00151] A. eosinofilia das vias aéreas é uma marca da asma humana. Alternaria alternate é um aeroalérgeno fúngico que pode agravar a asma em. humanos e induz inf lamação eosinofílica em pulmões de ratos [Havaux et al. Clin Exp Immunol. 2005, 139(2) :179-88) . Nos camundongos, foi demonstrado que Alternaria ativa indiretamente as células linfoides inatas tipo 2 residentes do tecido no pulmão, que respondem (p. ex., IL-2 e IL-7) e liberam citocinas dependentes de JAK (p. ex. , IL-5 e IL-13) e coordenam a inflamação eosinofílica (Bartemes et al. J Immunol. 2012, 188 (3) :1503-13) .

[00152] Foram usados camundongos C57 de sete a. nove semanas de vida da Taconic no estudo. No dia do estudo, os animais foram levemente anestesiados com isoflurano e

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 91/107 receberam administração de veiculo ou composto do teste (0,1-1,0 mg/ml, 50 pi do volume total ao longo de várias respirações) via aspiração orofaríngea. Os animais foram colocados em decúbito lateral pós-dose e monitorados para a plena recuperação da anestesia antes de serem, devolvidos à sua gaiola. Uma hora depois, os animais foram novamente

anestesiados br	evemente	e desafiados com veículo <:	2U extr	ato
de Alternaria	(200 pg	de dose total liberada,	50 pl	de
volume total)	através	d e a s P i r a ç ã o o r o f a r í n g e a	antes	de

serem monitorados durante a recuperação da anestesia e devolvidos à sua gaiola. Quarenta e oito horas após a administração de Alternaria, foi coletado fluido da lavagem broncoalveolar (BALF) e os eosinófilos foram contados no BALF utilizando o Advia 120 Hematology System. (Siemens) .

L 00153j A atividade no modelo é evidenciada por uma diminuição no nivel de eosinófilos presentes no BALF dos animais tratados em 48 horas em. comparação aos animais tratados com veículos, controles desafiados com. Alternaria. Os dados são expressos como percentagem de inibição da resposta dos eosinófilos da BALF tratados com veiculo e desafiados com Alternaria. Para calcular a percentagem de inibição, o número de eosinófilos de BALF para cada condição foi convertido em percentagem da média de eosinófilos de BA.LF tratados com veiculo, desafiado com Alternaria e subtraídos de 100%. O composto da invenção exibiu cerca de 88% de inibição das contagem de eosinófilos de BALF 48 horas aoós o desafio com. alternaria.

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Ensaio 14: Modelo de Murino da inflamação neutrofílica das vias aéreas induzida pelo coquetel LPS/G-CSF/lL-e/lFNy do modelo de pulmão

[00154] A neutrofilia das vias respiratórias é uma marca de uma gama de doenças respiratórias em. humanos. 0 composto 1 foi testado em um modelo de inflamação neutrofílica das vias aéreas usando um coquetel de LPS/GCSF/IL-6/IFNy para induzir a neutrofilia das vias aéreas.

[00155] Foram. usados camundongos machos Balb/C (selvagem) com sete a nove semanas de vida do Jackson Laboratory no estudo. No dia do estudo, os animais foram levemente anestesiados com isoflurano e receberam administração de veículo ou composto do teste (1,0 mg/ml, 50 μΐ do volume total ao longo de várias respirações) via aspiração orofaringea. Os animais foram colocados em decúbito lateral pós-dose e monitorados para a plena recuperação da anestesia antes de serem devolvidos à sua gaiola. Uma hora depois, os animais foram mais uma vez brevemente anestesiados e desafiados com veículo ou LPS; 0,01 mg/kg/G-CSF; 5 pg/IL~6; 5 pg/IFNy; 5 ug (100 ul de volume total) via aspiração orofaringea (AO). Vinte e quatro horas após a administração do coquetel LPS/G-CSF/IL-6/IFNy, foi coletado o fluido da lavagem broncoalveolar (BALF) e os neutrófilos foram contados.

[00156] Com o tratamento A.0 com o composto 1, houve uma redução estatisticamente significativa dos neutrófilos das vias aéreas (84% em relação aos camundongos tratados com. veículo), demonstrando que o bloqueio da sinalização dependente de JAK tem efeitos na inflamação neutrofílica das VldS cL ΘI? Θ cL S .

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Ensaio 15: Inibição de quimiocinas CXCL9 e CXCL10 induzida por IFNy e IL-27 em culturas de vias aéreas 3D em humanos

[01)157 j Foram obtidas cm tux as de Lec.i.ctos EpiAixway de Mattek (AIR-100). As culturas foram provenientes de doadores asmáticos. Em uma inserção de cultura de células, as células epiteliais de brônquios/traqueias foram cultivadas diferenciada sobre um suporte de membrana porosa, permitindo uma interface ar-liquido com meio de cultura aquecido abaixo das células e uma atmosfera gasosa de teste acima. Os tecidos foram cultivados em meios de manutenção (Mattek, AIR-100-MM) em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% de COo. Foram testados quatro doadores. No dia 0, as culturas de tecidos foram tratadas com compostos de teste a 10 μΜ, 1 μΜ e/ou 0,1 μΜ. Os compostos foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO, sigma) para uma concentração final de 0,1%. DMSO a 0,1% foi usado como um controle do veiculo. Os compostos de teste foram incubados com. as culturas durante 1 hora a. 37 °C, 5% de CO2, seguidos pela adição de meios pré-aquecidos contendo IFNy (R&D Systems) ou IL-27 (R&D Systems) a uma concentração final de 100 ng/ml. As culturas de tecidos foram mantidas durante 8 dias. Os meios foram substituídos a cada 2 dias com. meios frescos contendo os compostos e IFNy ou IL-27. No Dia 8, as culturas de tecido e sobrenadantes foram coletados para análise. As amostras de sobrenadante foram, analisadas para CXCL10 (IP10) e CXCL9 (MIG) utilizando análise luminex (EMD Millipore). Os dados são expressos em % inibição + /- desvio padrão (±STDV). A percentagem de inibição foi determinada pela potência inibitória do composto contra a secreção de

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CXCL10 ou CXCL9 induzida por IFNy ou IL-27 em comparação com as células tratadas com veículo. Os dados são a média de 3 ou 4 doadores. 0 composto 1 foi capaz de inibir a secreção de CXCL10 induzida por IFNy em 99% ±2,0 (a 10 μΜ) , 71% ±19 (a 1 μΜ) e 17% ±12 (a 0,1 μΜ) em comparação com. o controle de veículo. O composto 1 foi capaz de inibir a secreção de CXCL9 induzida por IFNy em 100% ±0,3 (a 10 μΜ), 99% ±0,9 (a 1 μΜ) e 74% ±17 (a 0,1 μΜ) em comparação com o controle de veículo. O composto 1 foi capaz de inibir a secreção de CXCLlO induzida por IL—2 1 em 108% ±11 (a 10 μΜ), 98% ±10 (a 1 μΜ) e 73% ±8,5 (a 0,1 μΜ) em comparação com o controle de veículo. O composto 1 foi capaz de inibir a secreção de CXCL9 induzida por IL-27 em 100% ±0 (a 3,7 μΜ) , 95% ±10 (a 1 μΜ) e 75% ±3,5 (a 0,1 μΜ) em comparação com o controle de veículo.

Ensaio 16: Ensaio de sobrevida de eosinófilos mediada por IL-5

[00158] A potência do composto de teste para sobrevida de eosinófilos mediada por IL-5 foi medida em eosinófilos humanos isolados do sangue humano (AllCells). Como a IL-5 sinaliza por meio da JAK, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK.

[00159] Os eosinófilos humanos foram isolados do sangue humano fresco (AllCells) de doadores saudáveis. O sangue foi misturado com 4,5% de Dextrano (Sigma-Aldrich) em uma solução de cloreto a 0,9% (Sigma-Aldrich). As células vermelhas do sangue ficaram, em. repouso durante 3 5 minutos para sedimentar. A camada superior rica em leucócitos foi removida e sobreposta em Ficoll-Paque (GE Healthcare) e centrifugada a 600 g durante 30 minutos. O plasma e as

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7 / 7 9 camadas de células mononucleares foram removidos antes que a amada de granulócitos fosse lisada com àgua para remover qualquer contaminação de células vermelhas do sangue. Os eosinófilos foram posteriormente purificados usando kit de isolamento de eosinófilos humanos (Miltenyi Biotec). Uma fração dos eosinófilos purificados foi incubada com FITO anti-CDlb (Miltenyi Biotec) durante 10 minutos a 4 °C no escuro. A pureza foi analisada usando um citômetro de fluxo L S R11 (BD Bio s c r enc es) .

[001601 As células foram cultivadas a 37 °C, em incubadora umidificada a 5% de CCQ em RPMI 1640 (Life Technologies), suplementadas com 10% de Soro Fetal Bovino Inativado pelo Calor (SFB, Life Technologies), 2 mM de

Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e IX Pen/Strep (Life Technologies). As células foram semeadas em 10.000 células/poço nos meios (50 μΐ) . A placa foi centrifugada a 300 g durante 5 minutos e o sobrenadante foi removido. Os compostos foram diluídos em série em DMSO e, então, diluídos 500 vezes para uma concentração final de ensaio de 2x nos meios de ensaio. Os compostos do teste (50 μΙ/poço) foram adicionados às células e incubados a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 hora, seguida pela adição de IL-5 (R&D Systems; concentrações finais de 1 ng/ml e 10 ng/ml) em meios de ensaio pré-aquecido (50 μΐ) durante 72 horas.

[001611 Após a estimulação de citocinas, as células foram centrifugadas a 300 g durante 5 min. e lavadas duas vezes com DPBS frio (Life Technologies) . Para acessar a viabilidade e a apoptose, as células foram incubadas com iodeto de propideo (Thermo Fisher Scientific) e APC Annexin

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V (Bu Biosciences) e analisadas usando um citômetro de fluxo

LSRII (BD Biosciences). Os valores de IC50 foram determinada a partir da das curv elular percentual versus concentração de pICso (1C50 logaritmo decádico negativo). 0 composto 1 apresentou um vai de presença de 10 pg/ml um valor de pICso 6,5±0,2 na presença de 1 ng/ml de IL-5.

Ensaio 17: Ensaio farmacodinâmico: inibição de pSTATl induzido por ΙΕΝγ nos olhos de coelho

[00162] A capacidade de uma única administração intravitrea do composto do teste para inibir a fosforilação da proteína STAT1 (pSTATl) induzida por gamainterferona (ΙΕΝγ) foi medida nos tecidos vítreo e retina/coroide.

[00163] Foi preparada uma formulação de suspensão ao combinar o composto 1 do Exemplo 1 com 0,5% de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC E5 LV) , 0,02% de Tween 80 e 9 mg/ml de cloreto de sódio em. água purificada para atingir uma concentração-alvo de 20 mg/ml.

[00164] Foram usados coelhos machos brancos da Nova Zelândia (Liveon Biolabs, índia) para os estudos. Os animais foram aclimatados após a chegada às instalações de pesquisa (Jubilant Biosys Ltd., índia.) . Cada coelho recebeu um total de duas injeções intravítreas (IVT) com um volume de dose total de 50 μΐ por olho. A primeira injeção IVT (45 μΐ por olho) forneceu 0,9 mg do composto do teste ou veículo. Uma semana depois, uma. segunda injeção de IVT (5 μΐ por olho) forneceu ΙΕΝγ (1 pg/olho; solução estoque 1 mg/ml; Kingfisher Biotech) ou veículo para a indução da proteína IP-10. No dia das injeções, os coelhos foram anestesiados com uma injeção

Petição 870190110103, de 29/10/2019, pág. 97/107 intramuscular de cetamina (35 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg).

Assim que	estivessem	profundamente anestes	lados, cada olho
roí lavado	com soro	fisiológico estéril	e foram feitas
injeções I	VT usando	uma seringa de insu	lina 0,5 ml (50
unidades =	0,5 ml) cc	>m uma agulha de cal	ibre 31 no lado
supranasal	de ambos c	)S olhos ao marcar a	posição com um
paquímetro fixo Brau: músculo reto e 4 mM do	nstein (2 3/4) 3,5 limbo.	mM distante do

[00165] Os tecidos foram coletados 2 noras após a segunda injeção IVT com IFNy. Os tecidos da retina/coroide (R/C) foram coletados e homogeneizados e os níveis de pSTATl foram medidos por Western Blot quantitativo no instrumento ProteinSimple WES. A percentagem, de inibição de pSTATl induzida por IFNy foi calculada em comparação com os grupos veículo/veículo e veículo/IFNy.

[00166] Com um pré-tratamento de 1 semana antes do desafio com IFNy, a formulação da suspensão do composto 1 do Exemplo 1 inibiu o pSTATl induzido pelo IFNy em 85%.

[00167] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a aspectos específicos ou suas modalidades, aqueles que são versados na técnica compreenderão que diversas alterações podem ser feitas ou equivalentes podem ser substituídos, sem. se afastar do verdadeiro espírito e do escopo da invenção. Além disso, na medida do permitido pelos estatutos e pelos regulamentos aplicáveis sobre patentes, todas as publicações, patentes e pedidos citados aqui são incorporados por referência em sua totalidade, da mesma forma como se cada documento tivesse sido incorporado individualmente por sua referência.

Claims (20)

1. Uso de 5-etil-2-fluoro-4-(3-(5-(l-metilpiperidin-4il)-4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[ 4,5-c]piridin-2-il)-1Hindazol-6-il)fenol ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico caracterizado pelo fato de ser na produção de um medicamento para o tratamento de uma doença ocular em um mamífero.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença ocular é uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade ou ceratoconjuntivite atópica.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a doença ocular é uveíte ou edema macular diabético.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado por injeção.

5. Uso de 5-etil-2-fluoro-4-(3-(5-(l-metilpiperidin-4il)-4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1Hindazol-6-il)fenol ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico caracterizado pelo fato de ser na produção de um medicamento para o tratamento de uma doença respiratória em um mamífero, onde a doença pulmonar é uma infecção pulmonar, uma infecção helmíntica, hipertensão arterial pulmonar, sarcoidose, linfangioleiomiomatose, bronquiectasia ou uma doença pulmonar infiltrativa.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o medicamento é adequado para administração por inalação.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado

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2/3 pelo fato de que o medicamento é adequado para administração por inalador nebulizador.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento é adequado para administração por inalador de pó seco.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a doença respiratória é sarcoidose.

10. Uso de 5-etil-2-fluoro-4-(3-(5-(1-metilpiperidin-

4-il)-4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1Hindazol-6-il)fenol ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico caracterizado pelo fato de ser na produção de um medicamento para o tratamento de uma doença respiratória em um mamífero, onde a doença respiratória é uma pneumonite induzida por medicamentos, pneumonite induzida por fungos, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonite por hipersensibilidade, granulomatose eosinofílica com poliangeíte, pneumonia eosinofílica idiopática crônica, pneumonia eosinofílica idiopática aguda, síndrome hipereosinofílica, síndrome de Lôffler, bronquiolite obliterante com pneumonia em organização, ou pneumonite induzida por inibidor do ponto de verificação imunológico.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o medicamento é adequado para administração por inalação.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o medicamento é adequado para administração por inalador nebulizador.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o medicamento é adequado para administração por inalador de pó seco.

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14. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença respiratória é pneumonite por hipersensibilidade.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença respiratória é bronquiolite obliterante com pneumonia em organização.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença respiratória é pneumonite induzida por inibidor do ponto de verificação imunológico.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença respiratória é pneumonite induzida por medicamentos.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença respiratória é granulomatose eosinofilica com poliangeite.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença respiratória é pneumonia eosinofilica idiopática aguda ou pneumonia eosinofilica idiopática crônica.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença respiratória é pneumonite induzida por fungos, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonite por hipersensibilidade, sindrome hipereosinofilica ou sindrome de Lõffler.