BR112021007788A2 - composto inibidor de jak 2-azabiciclo hexano - Google Patents

Abstract

COMPOSTO INIBIDOR DE JAK 2-AZABICICLO HEXANO. A invenção fornece um composto de fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, que é útil como um inibidor de JAK. A invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo o composto, métodos de uso do composto para tratar doenças suscetíveis a um inibidor de JAK e processos úteis para preparar o composto.

Description

PATENTE Pauta do Advogado No.: P-345-PCT Número do cliente: 27038 COMPOSTO INIBIDOR DE JAK 2-AZABICICLO HEXANO

HISTÓRICO DA INVENÇÃO Campo da invenção

[001] A invenção é dirigida a um composto inibidor da JAK quinase útil para o tratamento de doenças inflamatórias, especialmente doenças oculares. A invenção também é dirigida a composições farmacêuticas compreendendo um composto, métodos de uso deste composto para tratar doenças oculares e processos úteis para a preparação do composto.

Estado da técnica

[002] As citocinas são moléculas sinalizadoras intercelulares que incluem quimiocinas, interferons, interleucinas, linfocinas e fator de necrose de tumores. As citocinas são essenciais para o crescimento celular normal e imunorregulação, mas também guiam doenças imunomediadas e contribuem para o crescimento de células malignas. Os níveis elevados de muitas citocinas têm sido implicados na patologia de muitas doenças ou condições, especialmente aquelas doenças caracterizadas por inflamação. Muitas das citocinas implicadas na doença agem por meio de vias de sinalização dependentes da família Janus de tirosina quinases (JAKs) que sinalizam por meio da família de transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) de fatores de transcrição.

[003] A família JAK compreende quatro membros, JAK1, JAK2, JAK3 e tirosina quinase 2 (TYK2). A ligação de citocina a um receptor de citocina dependente de JAK induz a dimerização do receptor, o que resulta na fosforilação de resíduos de tirosina na quinase JAK, efetuando a ativação de JAK. As JAKs fosforiladas, por sua vez, se ligam e fosforilam várias proteínas STAT que dimerizam, internalizam no núcleo da célula e modulam diretamente a transcrição do gene, levando, entre outros efeitos, aos efeitos posteriores associados à doença inflamatória. As JAKs em geral se associam com receptores de citocina em pares como homodímeros e heterodímeros. As citocinas específicas estão associadas com pareamentos específicos de JAK. Cada um dos quatro membros da família JAK está envolvido na sinalização de pelo menos uma das citocinas associadas com a inflamação.

[004] À inflamação desempenha um papel proeminente em muitas doenças oculares, incluindo uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia retiniana e ceratoconjuntivite atópica. A uveíte abrange várias condições inflamatórias intraoculares e costuma ser autoimune, surgindo sem um gatilho infeccioso conhecido. Estima-se que a condição afete cerca de 2 milhões de pacientes nos Estados Unidos. Em alguns pacientes, a inflamação crônica associada à uveíte leva à destruição do tecido e é a quinta causa de cegueira nos Estados Unidos. As citocinas elevadas nos olhos de pacientes com uveíte que sinalizam pela via JAK-STAT incluem IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-23 e IFN-y. (Horai e Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744; Ooi et al, Clinical Medicine and Research, 2006, 4, 294-309). As terapias existentes para uveíte costumam ser abaixo do ideal e muitos pacientes são controlados de maneira deficiente. Os esteroides, embora muitas vezes eficazes, estão associados a cataratas e aumento da pressão intraocular/glaucoma.

[005] A retinopatia diabética (RD) é causada por danos aos vasos sanguíneos da retina. É a causa mais comum de perda de visão entre pessoas com diabetes. A angiogênese, assim como as vias inflamatórias, desempenha um papel importante na doença. Muitas vezes, a RD progride para edema macular diabético (EMD), a causa mais frequente de perda de visão em pacientes com diabetes. Estima-se que a condição afete cerca de 1,5 milhão de pacientes apenas nos EUA, dos quais cerca de 20% têm doenças que afetam ambos os olhos. Acredita-se que as citocinas que sinalizam através da via JAK-STAT, como a IL-6, assim como outras citocinas, como a IP-10 e a MCP-1 (também conhecida como CCL2), cuja produção é impulsionada em parte pela via de sinalização JAK-STAT desempenham um papel na inflamação associada com DR/EMD (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 1- 12; Sohn et al., American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686- 694; Owen e Hartnett, Curr Diab Rep, 2013, 13, 476- 480; Cheung et al, Molecular Vision, 2012, 18, 830- 837; Dong et al, Molecular Vision, 2013, 19, 1734- 1746; Funatsu et al, Ophthalmology, 2009, 116, 73- 79). As terapias existentes para o EMD são subótimas: os tratamentos anti-VEGF intravítreos só são eficazes em uma fração dos pacientes e os esteroides estão associados às cataratas e ao aumento da pressão intraocular.

[006] A doença do olho seco (DED) é uma doença multifatorial que afeta aproximadamente 5 milhões de pacientes nos Estados Unidos. Acredita-se que a inflamação da superfície ocular desempenhe um papel importante no desenvolvimento e propagação desta doença. Foram observados níveis elevados de citocinas como IL-l, IL-2, IL-4, IL-5 IL-6 e IFN-y nos fluidos oculares de pacientes com DED. (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), e os níveis frequentemente correlacionados com a gravidade da doença. Acredita-se que a degeneração macular relacionada à idade e a ceratoconjuntivite atópica também estejam associadas às citocinas dependentes de JAK.

[007] A oclusão da veia retiniana (RVO) é uma doença visualmente incapacitante de alta prevalência. A obstrução do fluxo sanguíneo retiniano pode causar danos à vasculatura retiniana, hemorragia e isquemia tecidual. Embora as causas de RVO sejam multifatoriais, os mediadores vasculares e inflamatórios têm se mostrado importantes (Deobhakta et al, International Journal of Inflammation, 2013, artigo ID 438412). As citocinas que sinalizam através da via JAK-STAT, como IL-6 e IL-13, assim como outras citocinas, como MCP-1 cuja produção é conduzida em parte pela sinalização da via JAK-STAT, foram detectadas em níveis elevados em tecidos oculares de pacientes com RVO (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63 (12), 905-911). Embora muitos pacientes com RVO sejam tratados por fotocoagulação, esta é uma terapia inerentemente destrutiva. Os agentes anti-VEGF também são usados, mas são eficazes apenas em uma fração dos pacientes. Foi demonstrado que os medicamentos esteroides que reduzem o nível de inflamação no olho (implantes de acetonida triancinolona e dexametasona) fornecem resultados benéficos para pacientes com certas formas de RVO, mas também foi demonstrado que eles provocam cataratas e aumento da pressão intraocular/glaucoma.

[008] Permanece a necessidade de um potente inibidor de pan-JAK para o tratamento de doenças oculares.

RESUMO DA INVENÇÃO

[009] En um aspecto, a invenção fornece um composto inibidor de JAK útil para o tratamento de doenças inflamatórias oculares.

[0010] Em especial, em um aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula:

F HO. 1

TD | y Hi N 1 doravante composto 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

[0011] A invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0012] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença ocular em um mamífero, o método compreendendo a administração ao mamífero do composto 1, ou uma composição farmacêutica da invenção. Em um aspecto, a doença ocular é selecionada a partir do grupo consistindo em uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade,

oclusão da veia retiniana e ceratoconjuntivite atópica. Em especial, a doença ocular é edema macular diabético Ou uveíte.

[0013] Em aspectos separados e distintos, a invenção também fornece processos sintéticos aqui descritos, que são úteis para a preparação do composto 1.

[0014] A invenção também fornece o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste conforme descrito neste documento para uso em terapia médica, assim como o uso do composto da invenção na fabricação de uma formulação Ou medicamento para o tratamento de doenças oculares.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0015] As estruturas químicas são nomeadas neste documento de acordo com as convenções da IUPAC como implementado no programa ChemDraw (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA).

[0016] Além disso, a porção imidazo da porção tetrahidroimidazopiridina na estrutura do presente composto existe em formas tautoméricas. O composto pode ser representado de forma equivalente como

F HO. CX O / TO) . HN-N ON

[0017] De acordo com a convenção IUPAC, essas representações dão origem a diferentes numerações dos átomos da porção tetrahidroimidazopiridina. Por conseguinte, esta estrutura é designada ((1S,5R)-2-azabiciclo[3.1.0]hexan-1- 11) (2- (6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-lH-

indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin- 5-il)metanona. Também pode ser designada: ((18,5R) -2- azabiciclo[3.1.0]hexan-1-il) (2- (6- (2-etil-5-fluoro-4- hidroxifenil)-4-fluoro-lH-indazol-3 —il)-1,4,6,7-tetra- hidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona. Deve-se compreender que, embora as estruturas sejam apresentadas ou nomeadas, em uma forma especial, a invenção também inclui seu tautômero.

[0018] Os compostos da invenção contêm vários grupos básicos e, portanto, os compostos podem existir como a base livre ou em várias formas de sal, como uma forma de sal monoprotonado, uma forma de sal diprotonado ou suas misturas. Todas estas formas estão incluídas no escopo desta invenção, salvo indicação em contrário.

[0019] Esta invenção também inclui compostos marcados isotopicamente de fórmula 1, isto é, compostos de fórmula 1 onde um átomo foi substituído ou enriquecido com um átomo com o mesmo número atômico, mas uma massa atômica diferente da massa atômica que predomina na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados em um composto de fórmula 1 incluem, mas não estão limitados a 2H, 3H, UC, 4C, MC, 13N, 12N, 150, VO, 180 e 1!8F, De especial interesse são os compostos de fórmula 1 enriquecidos em trítio ou carbono-14, compostos esses que podem ser usados, por exemplo, em estudos de distribuição em tecidos. Também são de especial interesse os compostos de fórmula 1 enriquecidos em deutério, especialmente em um local de metabolismo, cujos compostos se espera que tenham maior estabilidade metabólica. Além disso, são de especial interesse os compostos de fórmula 1 enriquecidos em um isótopo emissor de pósitrons, como !'C, 186F, 150 e !?N, cujos compostos podem ser usados, por exemplo, em estudos de tomografia de emissão de pósitrons (PET).

Definições

[0020] Ao descrever esta invenção, incluindo seus vários aspectos e modalidades, o seguinte

[0021] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade suficiente para efetuar o tratamento quando administrada a um paciente em necessidade de tratamento.

[0022] O termo “para tratar” ou “tratamento” significa atenuar ou suprimir a doença ou distúrbio médico a ser tratado (p. ex., uma doença respiratória) um paciente (em especial, um humano) ou aliviar os sintomas da condição, doença ou distúrbio médico.

[0023] O termo "sal aceitável do ponto de vista farmacêutico" significa um sal que é aceitável para a administração a um paciente ou a um mamífero, como um humano (por exemplo, sais com segurança aceitável em mamíferos para um determinado regime de dosagem). Os sais representativos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico incluem sais de ácido acético, ascórbico, benzenossulfônico, benzoico, canforsulfônico, cítrico, etanossulfônico, edisílico, fumárico, gentísico, glicônico, glicurônico, glutâmico, hipúrico, bromídrico, clorídrico, isetionônico, lático, lactobiônico, maleico, málico, mandélico, metanossulfônico, múcico, naftalenossulfônico, naftaleno-1l,5-dissulfônico, naftaleno-2,6-dissulfônico, nicotínico, nítrico, orótico,

pamoico, pantotênico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenossulfônico e xinafoico e semelhantes.

[0024] O termo "seu sal" significa um composto formado quando o hidrogênio de um ácido é substituído por um cátion, como um cátion de metal ou um cátion orgânico e semelhantes. Por exemplo, o cátion pode ser uma forma protonada de um composto de fórmula 1, isto é, uma forma em que um ou mais grupos amino foram protonados por um ácido. Normalmente, o sal é um sal farmaceuticamente aceitável, embora isto não seja necessário para sais de compostos intermediários que não se destinam à administração a um paciente.

[0025] O termo "grupo de proteção de amino" significa um grupo de proteção adequado para prevenir reações indesejadas em um nitrogênio de amino. Os grupos de proteção de amino representativos incluem, mas não estão limitados a formil; grupos acilo, por exemplo grupos alcanoílo, como acetilo e trifluoroacetilo; grupos alcoxicarbonilo, como terc-butoxicarbonilo (Boc); grupos arilmetoxicarbonilo, como benziloxicarbonilo (Cbz) e 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc); grupos arilmetil, como benzil (Bn), tritil (Tr) e 1,1-di-(4'" -metoxifenil)metil; grupos sililo, como trimetilsililo (TMS), terc-butildimetilsililo (TBDMS), [2- (trimetilsilil)etoxi]lmetilo (SEM); e semelhantes.

[0026] São descritos numerosos grupos de proteção, além de sua introdução e remoção, em T. W. Greene e P.G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, terceira edição, Wiley, Nova York

Procedimentos sintéticos gerais

[0027] O composto 1 e seus intermediários podem ser preparados de acordo com os seguintes métodos e procedimentos gerais, usando materiais de partida e reagentes disponíveis comercialmente ou rotineiramente preparados. Além disso, os compostos com um átomo ácido ou básico ou grupo funcional podem ser usados ou podem ser produzidos como um sal, salvo indicação em contrário (em alguns casos, o uso de um sal em uma reação especial exigirá a conversão do sal em uma forma de não sal, por exemplo, uma base livre, usando procedimentos de rotina antes de conduzir a reação).

[0028] Embora uma determinada modalidade desta invenção possa ser mostrada ou descrita nos procedimentos a seguir, aqueles que são versados na técnica vão reconhecer que outras modalidades desta invenção também podem ser preparadas com tais procedimentos ou ao usar outros métodos, reagentes e materiais conhecidos por aqueles que são versados na técnica. Em especial, será compreendido que o composto 1 pode ser preparado por uma variedade de vias de processo nas quais os reagentes são combinados em ordens diferentes para fornecer diferentes intermediários no caminho para a produção de produtos finais.

[0029] A preparação do composto 1 é descrita em detalhes nos exemplos em anexo. As principais etapas estão resumidas no Esquema 1. Rà pode ser hidroxil, caso em que o composto 7-PG é acoplado ao intermediário 6 em condições típicas de formação de ligação amida na presença de um reagente de ativação, como HATU, HOBT e semelhantes. De forma alternativa, Rà pode ser um grupo abandonador, como Cl.

Esquema 1

HAN F Ny F BnO. MAO Bo BnO. O F 2 O F Br ço” DO d Pá / 7 2

NHNO O ANN 3 4

F F BnO. Ho.

O F O F — O Oo — CÇ PO / / HN-N N HNN 6

F HO. pe SO ; F RN bh ”. N N N ÇA 7 CIO) x» HN-N N 7-PG 1

[0030] Após o acoplamento do composto 6 com 7-PG, o grupo de proteção "PG" é removido para fornecer o composto

1. O grupo de proteção pode ser selecionado a partir de grupos de proteção de amino como definido acima. Por exemplo, PG pode ser um grupo protetor de Boc, caso em que a desproteção pode ser conduzida na presença de um ácido forte, como TFA ou HCl.

[0031] O intermediário 3 pode ser preparado conforme descrito na seção experimental. Um método alternativo de preparação do intermediário protegido por chave 5 é ilustrado no Esquema 2.

Esquema 2

HAN MN ODicsn Br Foo B F Br pr A Bo Ce > — QRO NHK O mi NÃ 7 ANN E 8 9 10 Fr F Bro. BnO. De É O F v Br HN-N ON

[0032] O aldeído de bromoindazol 8 pode ser reagido com o composto de imina protegido com benzil 2 para fornecer o intermediário 9. A reação é tipicamente conduzida na presença de bissulfito de sódio, a uma temperatura entre cerca de 130 ºC e cerca de 140 ºC por entre cerca de 1 e cerca de 6 horas ou até que a reação esteja substancialmente completa. O composto 9 é reduzido usando um agente redutor, como borohidreto de sódio para fornecer o composto 10, que é combinado com feniltrifluoroborato protegido 11 sob condições de acoplamento Suzuki-Miyaura típicas para fornecer o intermediário 5. A reação é tipicamente conduzida em temperatura elevada na presença de um catalisador de paládio. O parceiro Suzuki 11, mostrado no Esquema 2, como sal de potássio de trifluoroborato pode ser preparado ao reagir o boronato correspondente (intermediário 1-5 na Preparação 1 a seguir) com o difluoreto de hidrogênio potássio para fornecer o intermediário 11. Por outro lado, o intermediário boronato pode ser usado no lugar do trifluoroborato 11.

[0033] Por conseguinte, em um aspecto do método, a invenção fornece um processo de preparação de um composto de fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo o processo compreendendo a reação de um composto de fórmula 6 com um composto de fórmula 7-PG, seguido pela remoção do grupo protetor PG, e a título facultativo preparar um sal farmaceuticamente aceitável do composto 1 para fornecer um composto de fórmula 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

Composições farmacêuticas

[0034] O composto 1 e os sais farmaceuticamente aceitáveis deste são tipicamente usados na forma de uma composição ou formulação farmacêutica. Estas composições farmacêuticas podem ser vantajosamente administradas a um paciente por qualquer via de administração aceitável, incluindo, mas não se limitando a, oral, inalação, injeção óptica, tópica (incluindo transdérmica), modos de administração retal, nasal e parenteral.

[0035] Consequentemente, em um de seus aspectos de composição, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica compreendendo um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável e o composto 1, onde, conforme definido acima, "composto 1" significa o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. A título facultativo, tais composições farmacêuticas podem conter outros agentes terapêuticos e/ou de formulação, se desejado. Ao discutir as composições e seus usos, o composto 1 também pode ser referido aqui como o "agente ativo".

[0036] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma composição farmacêutica compreendendo o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é adequada para aplicação no olho. Em alguns aspectos, a composição é adequada para injeção no olho. Em alguns aspectos, a composição é adequada para injeção intravítrea. Em alguns aspectos, a composição é uma suspensão. Em alguns aspectos, a composição é uma suspensão cristalina.

[0037] As composições farmacêuticas da invenção tipicamente contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto 1. Os versados na técnica reconhecerão, no entanto, que uma composição farmacêutica pode conter mais do que uma quantidade terapeuticamente eficaz, ou seja, composições a granel, ou menos do que uma quantidade terapeuticamente eficaz, ou seja, doses unitárias individuais projetadas para administração múltipla para atingir uma quantidade terapeuticamente eficaz quantidade.

[0038] Normalmente, estas composições farmacêuticas conterão cerca de 0,01 a 95%, em peso, do agente ativo, incluindo, por exemplo, a partir de cerca de 0,05 a 30%, em peso, do agente ativo e a partir de cerca de 0,1% a cerca de 10% em peso do agente ativo.

[0039] Qualquer carreador ou excipiente convencionais pode ser usado nas composições farmacêuticas da invenção. A escolha de um determinado carreador ou excipiente, Ou combinações de carreadores ou excipientes, dependerá do modo de administração a ser usado para tratar um paciente em especial ou tipo de condição médica ou estado de doença. Neste contexto, o preparo de uma composição farmacêutica adequada para um determinado modo de administração está bem dentro do escopo daqueles que são versados na técnica farmacêutica. Além disso, os carreadores ou excipientes usados nas composições farmacêuticas desta invenção estão comercialmente disponíveis. Por meio de outra ilustração, as técnicas de formulação convencionais estão descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20º edição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); e H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7º edição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).

[0040] Exemplos representativos de materiais que podem servir como carreadores aceitáveis do ponto e vista farmacêutico incluem, mas não estão limitados aos seguintes: açúcares, como lactose, glicose e sacarose; amidos, como o amido de milho e fécula; celulose, como celulose microcristalina, e seus derivados, como a carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, como a manteiga de cacau e ceras de supositórios; óleos, como óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, como propilenoglicol; polióis, como a glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres, como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes, como o hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água apirogênica; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções tamponadas com fosfato e outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas em composições farmacêuticas.

[0041] As composições farmacêuticas são geralmente preparadas ao agitar ou misturar completa e eficientemente o agente ativo com um carreador e um ou mais ingredientes opcionais aceitos do ponto de vista farmacêutico. A mistura agitada uniformemente resultante pode em seguida ser moldada ou carregada em comprimidos, cápsulas, comprimidos e semelhantes usando procedimentos e equipamentos convencionais.

[0042] As composições farmacêuticas da invenção são preferencialmente embaladas em uma forma de dosagem unitária. O termo "forma de dosagem unitária" refere-se a uma unidade fisicamente discreta adequada para dosar um paciente, isto é, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de agente ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado sozinho ou em combinação com uma ou mais unidades adicionais. Por exemplo, estas formas de dosagem unitária podem ser cápsulas, comprimidos, pílulas e semelhantes, ou embalagens unitárias adequadas — para administração ocular ou parenteral.

[0043] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção são adequadas para administração oral. As composições farmacêuticas adequadas para administração oral podem estar na forma de cápsulas, comprimidos, pílulas, pastilhas, hóstias, drágeas, pós, grânulos; ou como uma solução ou suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou água-em-óleo; Ou como um elixir ou xarope; e similar; cada um contendo uma quantidade predeterminada de composto 1 como ingrediente ativo.

[0044] Quando destinadas à administração oral em uma forma de dosagem sólida (isto é, como cápsulas, comprimidos, pílulas e semelhantes), as composições farmacêuticas da invenção compreenderão tipicamente o agente ativo e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Opcionalmente, estas formas de dosagem sólidas podem compreender: cargas ou extensores, como amidos, celulose microcristalina, lactose, fosfato dicálcico, sacarose, glicose, manitol e/ou ácido silícico; aglutinantes, como carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e/ou acácia; umectantes, como glicerol; agentes desintegrantes, como croscarmelose sódica, ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos e/ou carbonato de sódio; agentes retardadores de solução, como parafina; aceleradores de absorção, como compostos de amônio "quaternário; agentes umidificante, como álcool cetílico e/ou monoestearato de glicerol; absorventes, como caulino e/ou argila bentonite; lubrificantes, como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, laurilsulfato de sódio e/ou suas misturas; agentes corantes e agentes tamponantes.

[0045] Agentes de liberação, umidificantes, de revestimento, adoçantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes nas composições farmacêuticas da invenção. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem:

antioxidantes solúveis em água, como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfato de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; antioxidantes solúveis em óleo, como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol e semelhantes; e agentes quelantes de metais, como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetraacético, sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes. Os agentes de revestimento para comprimidos, cápsulas, pílulas e semelhantes incluem aqueles usadospara revestimentos entéricos, como acetato ftalato de celulose, acetato ftalato de polivinil, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, ácido metacrílico, copolímeros de éster de ácido metacrílico, acetato trimelitato de celulose, carboximetil etil celulose, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulose e semelhantes.

[0046] As composições farmacêuticas da invenção também podem ser formuladas para fornecer liberação lenta ou controlada do agente ativo usando, a título de exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em proporções variáveis ou outras matrizes poliméricas, lipossomas e/ou microesferas. Além disso, as composições farmacêuticas da invenção podem conter, a título facultativo, agentes opacificantes e podem ser formuladas de modo a liberar o ingrediente ativo apenas, ou preferencialmente, em uma determinada parte do trato gastrointestinal, a título facultativo, de forma retardada. Exemplos de composições de incorporação que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras. O agente ativo também pode estar na forma microencapsulada, se adequado, com um ou mais dos excipientes descritos acima.

[0047] As formas de dosagem líquidas adequadas para administração oral incluem, a título de ilustração, emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. As formas de dosagem líquidas tipicamente compreendem o agente ativo e um diluente inerte, como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsionantes, como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3- butilenoglicol, óleos (esp., caroço de algodão, amendoim, milho, gérmen, azeite, óleos de mamona e gergelim), ácido oleico, glicerol, álcool tetrahidrofurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano e suas misturas. De forma alternativa, certas formulações líquidas podem ser convertidas, por exemplo, por secagem por pulverização, em um pó, usado para preparar formas de dosagem sólidas por procedimentos convencionais.

[0048] As suspensões, além do ingrediente ativo, podem conter agentes de suspensão, como, por exemplo, álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto, e suas misturas.

[0049] O composto 1 também pode ser administrado por via parenteral (por exemplo, por injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal). Para administração parenteral, o agente ativo é tipicamente misturado com um veículo adequado para administração parenteral incluindo, a título de exemplo, soluções aquosas estéreis, soro fisiológico, álcoois de baixo peso molecular, como propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, gelatina, ésteres de ácidos graxos como oleato de etilo e semelhantes. As formulações parenterais também podem conter um ou mais antioxidantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, umectantes, emulsificantes, agentes tamponantes ou dispersantes. Estas formulações podem ser tornadas estéreis pelo uso de um meio injetável estéril, um agente esterilizante, filtração, irradiação ou calor.

[0050] O composto 1 também pode ser formulado como uma suspensão aquosa estéril ou solução para injeção ocular. Excipientes úteis que podem ser incluídos em tal formulação aquosa incluem polissorbato 80, polímeros de celulose,como carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, metilcelulose, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de sódio, cloreto de magnésio, acetato de sódio, citrato de sódio, histidina, ora-trehalose di-hidratado, sacarose, polissorbato 20, hidroxipropil-B-ciclodextrina, cloreto de benzalcônio, Amberlite IRP-69, éteres “de polioxietilenoglicol (lauril, estearil e oleil), sal de sódio de ácido etilenodiaminotetraacético, taurocolato de sódio, saponinas e cremofor EL, policarbofil-cisteína, goma xantana, goma gelana, ácido hialurônico, lipossomas e fosfato de sódio. Intensificadores de permeabilidade, surfactantes, ácidos biliares, ciclodextrinas, como 2- hidroxipropil-fB-ciclodextrina, e agentes quelantes podem ser incluídos na formulação. Os oligonucleotídeos cilíndricos com uma superfície externa hidrofílica e uma superfície interna lipofílica que têm a capacidade de formar complexos com um agente ativo também podem ser incluídos na formulação. O álcool benzílico pode servir como conservante e o cloreto de sódio pode ser incluído para ajustar a tonicidade. Além disso, o ácido clorídrico e/ou hidróxido de sódio podem ser adicionados à solução para ajustar o pH. As formulações aquosas para injeção ocular podem ser preparadas sem conservantes.

[0051] À formulação ocular pode permitir a liberação sustentada do ingrediente ativo para o olho. A formulação ocular pode ser formulada como uma emulsão (óleo em água ou água em óleo), uma suspensão ou uma pomada. A formulação de suspensão pode conter o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como uma forma cristalina, por exemplo, Forma 1 ou Forma 2, ou em um estado amorfo.

[0052] O composto 1 também pode ser formulado para ser adequado para dosagem de colírio ou como um implante intravítreo. O implante pode permitir a entrega de níveis terapêuticos “constantes de fármaco. Os implantes de reservatório são normalmente feitos com um núcleo de fármaco peletizado cercado por substâncias não reativas, como silício, etileno vinil acetato (EVA) ou álcool polivinílico (PVA); esses implantes não são biodegradáveis e podem fornecer quantidades contínuas de um medicamento por meses a ano. Também podem ser usados implantes de matriz. Eles são normalmente usados para administrar uma dose de ataque seguida por doses decrescentes do fármaco durante um período de 1 dia a 6 meses. Eles são mais comumente feitos de copolímeros de ácido poli-láctico (PLA) e/ou ácido poli- láctico-glicólico (PLGA), que se degradam em água e dióxido de carbono. A iontoforese também pode ser usada. A iontoforese é uma técnica não invasiva na qual uma pequena corrente elétrica é aplicada para potencializar a penetração do fármaco ionizado na pele.

[0053] A tecnologia de célula encapsulara (TCE), que é um sistema de liberação baseado na célula também pode ser usado para liberar o agente terapêutico nos olhos. Tipicamente, as células geneticamente modificadas são acondicionadas em um tubo oco de membrana semipermeável, o que impede a entrada de células imunes e permite que os nutrientes e as moléculas terapêuticas se dispersem livremente pela membrana. As duas extremidades do corte do polímero estão seladas e uma alça de titânio é colocada na extremidade de ancoragem, que é implantada na parte plana e ancorada na esclera.

[0054] O composto 1 pode ser formulado em qualquer forma que permita a liberação na parte posterior do olho. Os exemplos de modos de liberação são conhecidos na literatura (Kuno et al, Polymers, 2011, 3, 193-221, del Amo et al, Drug Discovery Today, 2008, 13, 135-143, Short, Toxicologic Pathology, 2008, 36, 49-62). Tais modos de liberação incluem, mas não estão limitados a liberação supracoroide, o que permite a liberação no coroide e na retina através do espaço supracoroide, liberação sub-Tenon, liberação periocular, lentes de contato, plugues pontuais e plugues de esclera. O composto 1 também pode ser liberado por injeção periocular, supraescleral, retrobulbar, peribulbar ou subconjuntival.

[0055] O composto 1 pode ser liberado como uma emulsão, micro ou nanoesferas poliméricas, lipossomos, micro ou nanopartículas, microesferas, micelas ou dendrímeros. Podem ser usados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, como o ácido politáctico e PLGA. O composto 1 pode ser encapsulado.

[0056] Além disso, o composto 1 pode ser formulado para administração tópica na pele como pomada Ou creme. As formulações de pomada são preparações semissólidas com uma base de um material gorduroso ou oleoso que, em geral, é clara. Os materiais oleosos adequados para uso em formulações de pomada: petrolato (vaselina), cera de abelha, manteiga de cacau, manteiga de karité e álcool cetílico. As pomadas podem, adicionalmente, incluir emolientes e potencializadores de penetração, se for desejado.

[0057] As formulações de creme podem ser preparadas como emulsões, compreendendo uma fase oleosa e uma fase aquosa, geralmente incluindo água purificada. Os componentes de formulações em creme podem incluir: bases de óleo, como petrolato, óleos minerais, óleos vegetais e animais, e triglicerídeos; bases de creme, como álcoois de lanolina, ácido esteárico e álcool cetoestearílico; à base de gel, como álcool polivinílico; solventes, como propilenoglicol e polietilenoglicol; emulsificantes, como os polissorbatos, estearatos, como estearato de glicerila, octilidroxistearato, estearato de polioxil, éteres estearílicos de PEG, palmitato de isopropila e monoestearato de sorbitano; estabilizadores, como polissacarídeos e sulfito de sódio; emolientes (ou seja, hidratantes), como triglicerídios de cadeia média, miristato de isopropila e dimeticona; agentes enrijecedores, como álcool cetílico e álcool estearílico; agentes antimicrobianos, como metilparabeno, propilparabeno, fenoxietanol, ácido sórbico, diazolidinil, ureia e hidroxianisol butilado; potencializadores de penetração, como N-metilpirrolidona, propilenoglicol, monolaurato de polietilenoglicol e similares e agentes quelantes, como EDTA dissódico.

[0058] De forma alternativa, as composições farmacêuticas da invenção são formuladas para administração por inalação. As composições farmacêuticas adequadas para administração por inalação estarão na forma de aerossol ou pó. Estas composições são geralmente administradas por dispositivos bem conhecidos, como inalador dosimetrado, inalador de pó seco, nebulizador ou dispositivo semelhante.

[0059] Quando administradas por inalação usando um recipiente pressurizado, as composições farmacêuticas da invenção incluirão o ingrediente ativo e um propelente adequado, como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás apropriado. Além disso, a composição farmacêutica pode estar na forma de cápsula ou cartucho (preparada, por exemplo, a partir da gelatina) compreendendo o composto 1 e um pó adequado para uso em inalador de pó. As bases em pó adequadas incluem, por exemplo, lactose ou amido.

[0060] Os seguintes exemplos não limitantes ilustram composições — farmacêuticas representantes da presente invenção.

Forma farmacêutica de comprimido oral sólido

[0061] O composto 1, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, é misturado a seco com celulose microcristalina, polivinil pirrolidona e croscarmelose sódica na proporção de 4:5:1:1 e prensado em comprimidos para fornecer uma dose unitária de, por exemplo, 5 mg, 20 mg ou 40 mg de agente ativo por comprimido.

Forma farmacêutica de cápsula oral sólida

[0062] O composto 1, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico é misturado a seco com celulose microcristalina, polivinil pirrolidona e croscarmelose sódica na proporção de 4:5:1:1 e carregado em cápsulas de gelatina ou hidroxipropilmetilcelulose para fornecer uma dose unitária de, por exemplo, 5 mg, 20 mg ou 40 mg de agente ativo por cápsula.

Formulação líquida

[0063] Uma formulação líquida compreendendo o composto 1 (0,1%), água (98,9%) e ácido ascórbico (1,0%) é formada pela adição de um composto da invenção a uma mistura de água e ácido ascórbico.

Forma farmacêutica oral com revestimento entérico

[0064] O composto 1 é dissolvido em uma solução aquosa contendo polivinil pirrolidona e aplicada como revestimento em spray em pérolas de celulose microcristalina ou de açúcar numa proporção de 1:5 p/p ingrediente ativo/pérolas e então um ganho de aproximadamente 5% de um revestimento entérico compreendendo um copolímero acrílico é aplicado. As pérolas com revestimento entérico são carregadas em cápsulas de gelatina ou hidroxipropilmetilcelulose para fornecer uma dose unitária de, por exemplo, 30 mg de agente ativo por cápsula.

Forma farmacêutica oral com revestimento entérico

[0065] Un revestimento entérico, compreendendo — uma combinação de Eudragit-LO e Eudragit-So ou acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulose, é aplicado a uma forma de dosagem oral em comprimido ou a uma forma de dosagem oral em cápsula descrita acima.

Formulação aquosa para injeção ocular

[0066] Cada ml de uma suspensão aquosa estéril inclui de 5 mg a 50 mg de composto 1, cloreto de sódio para tonicidade, 0,99% (p/v) de álcool benzílico como conservante, 0,75% de carboximetilcelulose de sódio e 0,04% de polissorbato. É possível incluir hidróxido de sódio ou ácido clorídrico para ajustar o pH a 5 a 7,5.

Formulação aquosa para injeção ocular

[0067] Uma suspensão aquosa estéril sem conservantes inclui de 5 mg/ml a 50 mg/ml do composto 1 em fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 40 mM, 0,03% de polissorbato e 5% de sacarose.

Formulação de pomada para administração tópica

[0068] O composto 1 é combinado com vaselina, triglicerídeo Cg-C10, octilhidroxiestearato e N- metilpirrolidona em uma proporção para fornecer uma composição contendo 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Formulação de pomada para administração tópica

[0069] O composto 1 é combinado com o petrolato branco, propilenoglicol, mono e di-glicerídeos, parafina, hidroxitolueno butilado e edta cálcio dissódico em uma proporção para fornecer uma composição contendo de 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Formulação de pomada para administração tópica

[0070] O composto 1 é combinado com óleo mineral, parafina, carbonato de propileno, petrolato branco e cera branca para fornecer uma composição contendo de 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Formulação de creme para administração tópica

[0071] O óleo mineral é combinado com o composto 1, propilenoglicol, palmitato isopropílico, polissorbato 60, álcool cetílico, monoestearato de sorbitano, estearato de polioxila 40, ácido sórbico, metilparabeno e propilparabeno para formar uma fase oleosa, que é combinada com água purificada por mistura de cisalhamento para fornecer uma composição contendo 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Formulação de creme para administração tópica

[0072] Uma formulação de creme compreendendo o composto 1, álcool benzílico, álcool cetílico, ácido cítrico anidro, mono e diglicerídeos, álcool oleílico, propilenoglicol, cetostearil sulfato de sódio, hidróxido de sódio, álcool estearílico, triglicerídios e água contém de 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Formulação de creme para administração tópica

[0073] Uma formulação de creme compreendendo o composto 1, álcool cetoestearílico, miristato de isopropila,

propilenoglicol, cetomacrogol 1000, dimeticona 360, ácido cítrico, citrato de sódio e água purificada, com imidureia, metilparabeno, propilparabeno, como conservantes, contém de 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Composição do pó seco

[0074] O composto micronizado 1 (1 g) é misturado com lactose moída (25 g). Esta mistura combinada é então carregada em blisters individuais de uma embalagem de blister destacável em uma quantidade suficiente para fornecer entre cerca de 0,1 mg e cerca de 4 mg de composto 1 por dose. O conteúdo dos blisters é administrado com um inalador de pó seco.

Composição do inalador dosimetrado

[0075] O composto micronizado 1 (10 g) é disperso em uma solução preparada por dissolução de lecitina (0,2 g) em água desmineralizada (200 ml). A suspensão resultante é seca por pulverização e, em seguida, micronizada para formar uma composição micronizada que compreende partículas com um diâmetro médio inferior a cerca de 1,5 um. A composição micronizada é então carregada em cartuchos de inalador dosimetrado contendo 1,1,1,2-tetrafluoroetano pressurizado em uma quantidade suficiente para fornecer cerca de 0,1 mg a cerca de 4 mg do composto 1 por dose quando administrado pelo inalador dosimetrado.

Composição do nebulizador

[0076] O composto 1 (25 mg) é dissolvido numa solução contendo 1,5-2,5 equivalentes de ácido clorídrico, seguido pela adição de hidróxido de sódio para ajustar o pH a 3,5 a 5,5 e 3% em peso de glicerol. A solução é bem agitada até que todos os componentes estejam dissolvidos. A solução é administrada com um dispositivo nebulizador que fornece cerca de 0,1 mg a cerca de 4 mg do composto 1 por dose.

Utilidade

[0077] O composto 1 demonstrou ser um inibidor potente da família de enzimas JAK: JAKl, JAK2, JAK3 e TYK2.

Doenças oculares

[0078] Foi demonstrado que muitas doenças oculares estão associadas a elevações de citocinas pró-inflamatórias que dependem da via JAK-STAT. Uma vez que o composto 1 exibe inibição potente em todas as quatro enzimas JAK, espera-se que iniba potentemente a sinalização e os efeitos patogênicos de numerosas citocinas (como IL-6, IL-2 e IFN-y), que sinalizam por meio de JAK, assim como para prevenir o aumento de outras citocinas (como MCP-1 e IP-10), cuja produção é impulsionada pela sinalização da via JAK-STAT.

[0079] Conforme ilustrado na seção de ensaios, o composto 1 exibiu atividade em ensaios celulares, incluindo ensaios que registram a inibição dos efeitos a jusante da elevação de citocinas.

[0080] Além disso, a dosagem intravítrea do composto 1 demonstrou inibição significativa de pSTAT3 induzido por IL- 6 na retina/tecido coroide de rato.

[0081] Espera-se que a inibição ocular de JAK na ausência de níveis sistêmicos significativos resulte em potente atividade anti-inflamatória local no olho sem efeitos adversos de origem sistêmica. Espera-se, portanto, que o composto 1 seja benéfico em uma série de doenças oculares que incluem, mas não estão limitadas a, uveíte,

retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia retiniana e ceratoconjuntivite atópica.

[0082] Em especial, uveíte (Horai e Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744), retinopatia diabética (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Supl 1, 1-12), edema macular diabético (Sohn et al., American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686-694), doença do olho seco (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), oclusão da veia retiniana (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63 (12), 905-911) e degeneração macular relacionada à idade (Knickelbein et al, Int Ophthalmol Clin, 2015, 55 (3), 63-78) são caracterizadas pela elevação de certas citocinas pró-inflamatórias que sinalizam pela via JAK-STAT. Consequentemente, espera-se que o composto 1 seja capaz de aliviar a inflamação ocular associada e reverter a progressão da doença ou proporcionar alívio dos sintomas nestas doenças.

[0083] Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença ocular em um mamífero, O método compreendendo a administração de uma composição farmacêutica que compreende o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um carreador farmacêutico para o olho do mamífero. Em um aspecto, a doença ocular é uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração “macular relacionada à idade, oclusão da veia retiniana Ou ceratoconjuntivite atópica. Em um aspecto, o método compreende a administração do composto 1 por injeção intravítrea.

Doença inflamatória da pele

[0084] Doenças inflamatórias da pele, como dermatite atópica, foram associadas à elevação de citocinas pró- inflamatórias que dependem da via JAK-STAT, em especial, IL- 4, IL-5, IL-l10, IL-l13 e IFNy. Portanto, espera-se que o composto 1 seja benéfico em uma série de condições inflamatórias dérmicas ou pruriginosas que incluem, mas não estão limitadas a, dermatite atópica, alopecia areata, vitiligo, linfoma cutâneo de células T, prurigo nodular, líquen plano, amiloidose cutânea primária localizada, pênfigo bolhoso, manifestações cutâneas de doença do enxerto contra hospedeiro, penfigoide, lúpus discoide, granuloma anular, líquen simplex crônico, prurido vulvar/escrotal/perianal, líquen escleroso, prurido pós- neuralgia herpética, líquen planopilar e foliculite decalvante. Em especial, alopecia areata (Xing et al., Nat Med. 2014 Set;20(9):1043-9), vitiligo (Craiglow et al, JAMA Dermatol. 2015 Out;151(10):1110-2), linfoma cutâneo de células T (Netchiporouk et al., Cell Cycle. 2014;13(21):3331-5), prurigo nodularis (Sonkoly et al., O Allergy Clin Immunol. 2006 Fev;117(2):411-7), líquen plano (Welz-Kubiak et al., J Immunol Res. 2015;2015:854747), amiloidose cutânea localizada primária (Tanaka et al., Br U Dermatol. 2009 Dez; 161(6):1217-24), pênfigo bolhoso (Feliciani et al., Int J Immunopathol Pharmacol. 1999 Maio- Agosto; 12(2):55-61) e manifestações dérmicas da doença do enxerto versus hospedeiro (Okiyama et al., J Invest Dermatol.

2014 Abr;134(4):992-1000) são caracterizados pela elevação de certas citocinas que sinalizam via ativação de JAK. Consequentemente, espera-se que o composto 1 seja capaz de aliviar a inflamação dérmica associada ou o prurido provocado por essas citocinas.

[0085] Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença inflamatória da pele em um mamífero (por exemplo, um humano), o método compreendendo a aplicação de uma composição farmacêutica que compreende o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e um carreador farmacêutico para a pele do mamífero. Em uma modalidade, a doença inflamatória de pele é a dermatite atópica.

[0086] O composto 1 também pode ser usado em combinação com antibióticos gram-positivos, como mupirocina e ácido fusídico, para tratar doenças inflamatórias da pele. Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença inflamatória da pele em um mamífero, o método compreendendo a aplicação do composto 1 e um antibiótico gram-positivo na pele do mamífero. Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, um antibiótico gram-positivo e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Doenças respiratórias

[0087] Citocinas que sinalizam através da via JAK-STAT, em especial IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-l11, IL- 13, IL-23, IL-3l1, IL-27, a linfopoietina estromal tímica (TSLP), oO interferon-y (IFNy) e o fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) também foram implicados na inflamação da asma e em outras doenças respiratórias inflamatórias. Conforme descrito acima, o composto 1 mostrou ser um inibidor potente das enzimas JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2 e também demonstrou inibição potente de citocinas pró-inflamatórias em ensaios celulares.

[0088] A atividade anti-inflamatória dos inibidores de JAK foi amplamente demonstrada em modelos pré-clínicos de asma (Malaviya et al., Int Immunopharmacol, 2010, 10, 829,- 836; Matsunaga et al., Biochem and Biophys Res Commun, 2011, 404, 261-267; Kudlacz et al., Eur J Pharmacol, 2008, 582, 154-161.) Consequentemente, espera-se que o composto 1 seja útil para o tratamento de distúrbios respiratórios inflamatórios, em especial, asma. A inflamação e fibrose do pulmão é característica de outras doenças respiratórias além de asma como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC), pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema e bronquiolite obliterante. Espera-se, portanto, que o composto 1 seja útil para o tratamento da doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante e sarcoidose.

[0089] Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença respiratória em um mamífero (por exemplo, um humano), o método compreendendo a administração ao mamífero do composto 1 ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0090] En um aspecto, a doença respiratória é asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, pneumonite, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC), pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante ou sarcoidose. Em outra modalidade, a doença respiratória é asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica.

[0091] Em um aspecto adicional, a doença respiratória é uma infecção pulmonar, uma infecção helmíntica, hipertensão arterial pulmonar, sarcoidose, linfangioleiomiomatose, bronquiectasia ou uma doença pulmonar infiltrativa. Em ainda outro aspecto, a doença respiratória é pneumonite induzida por fármacos, pneumonite induzida por fungos, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonite de hipersensibilidade, granulomatose eosinofílica com poliangiite, pneumonia eosinofílica aguda idiopática, pneumonia eosinofílica crônica idiopática, síndrome hipereosinofílica, síndrome de Lóffler, bronquiolite obliterante com pneumonia em organização ou pneumonite induzida por inibidor de checkpoint imunológico.

[0092] A invenção fornece ainda um método de tratamento de asma em um mamífero, o método compreendendo a administração ao mamífero de uma composição farmacêutica que compreende o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0093] Também se espera que o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste seja útil para tratar doenças pulmonares eosinofílicas. Inflamação eosinofílica das vias aéreas que é uma característica de doenças coletivamente denominadas doenças pulmonares eosinofílicas (Cottin et al., Clin. Chest. Med., 2016, 37(3), 535-56). As doenças eosinofílicas foram associadas à sinalização de IL- 4, IL-13 e IL-5. As doenças pulmonares eosinofílicas incluem infecções (especialmente infecções helmínticas), pneumonite induzida por fármacos (induzidas por exemplo, por fármacos como antibióticos, fenitoína ou l-triptofano), pneumonite induzida por fungos (p. ex., aspergilose broncopulmonar alérgica), pneumonite por hipersensibilidade e granulomatose eosinofílica com poliangeíte (anteriormente conhecida como síndrome de Churg-Strauss). Doenças pulmonares eosinofílicas de etiologia desconhecida incluem pneumonia eosinofílica aguda idiopática, pneumonia eosinofílica crônica idiopática, síndrome hipereosinofílica e síndrome de Lóffler.

[0094] O composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste também pode ser útil para tratar HAP. Um polimorfismo no gene IL-6 foi associado a níveis elevados de IL-6 e a um risco aumentado de desenvolver hipertensão arterial pulmonar (HAP) (Fang et al., J Am Soc Hypertens., 2017, 11(3), 171- 177). Corroborando o papel da IL-6 na HAP, a inibição da cadeia do receptor da IL-6 gpl30 melhorou a doença em um modelo de HAP de rato (Huang et al., Can U Cardiol., 2016, 32(11), 1356.el- 1356.e10).

[0095] O composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste também pode ser útil para tratar doenças pulmonares não alérgicas, como sarcoidose e linfangioleiomiomatose. Citocinas como IFNy, IL-12 e IL-6 foram implicadas em uma variedade de doenças pulmonares não alérgicas, como sarcoidose e linfangioleiomiomatose (El- Hashemite et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2005, 33, 227-230, and El-Hashemite et al., Cancer Res., 2004, 64, 3436-3443).

[0096] O composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo também pode ser útil para tratar bronquiectasia e doenças pulmonares infiltrativas que são doenças associadas à inflamação neutrofílica crônica. Certas citocinas estão associadas à inflamação neutrofílica (por exemplo, IL-6, IFNU).

[0097] A ativação patológica de células T é fundamental na etiologia de várias doenças respiratórias. As células T autorreativas desempenham um papel na bronquiolite obliterante com pneumonia em organização (também chamada BOOP). Similar à BOOP, a etiologia das rejeições de transplante pulmonar está associada a uma ativação aberrante da ativação das células T dos receptores pelo pulmão transplantado do doador. As rejeições de transplante pulmonar podem ocorrer cedo como disfunção primária do enxerto (PGD), pneumonia em organização (PO), rejeição aguda (RA) ou bronquiolite linfocítica (BL) ou podem ocorrer anos após o transplante pulmonar como disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD). A CLAD era anteriormente conhecida como bronquiolite obliterante (BO), mas agora é considerado uma síndrome que pode ter diferentes manifestações patológicas incluindo BO, CLAD restritiva (rCLAD ou RAS) e disfunção neutrofílica do enxerto.

A disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD) é um grande desafio para o manejo a longo prazo dos receptores de transplante pulmonar, pois faz com que o pulmão transplantado perca sua funcionalidade progressivamente (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185-191). A CLAD é pouco sensível ao tratamento e, portanto, permanece a necessidade de compostos eficazes capazes de prevenir ou tratar esta condição.

Várias citocinas dependentes de JAK, como IFNI e IL-5 são superreguladas na CLAD e na rejeição do transplante de pulmão (Berastegui et al, Clin Transplant. 2017, 31, el2898). Além disso, altos níveis de quimiocinas CXCR3 pulmonares como CXCL9 e CXCL10 que estão downstream (a jusante) à sinalização de IFN dependente de JAK estão relacionados a piores desfechos nos pacientes submetidos a transplante de pulmão (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). Foi demonstrado que a inibição de JAK é eficaz na rejeição do transplante renal (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). Portanto, o composto 1 tem potencial para ser eficaz no tratamento ou prevenção da rejeição do transplante de pulmão e CLAD.

Eventos de ativação de células T semelhantes, conforme descritos como a base para a rejeição de transplante de pulmão, também são considerados o principal fator de doença do enxerto de pulmão contra hospedeiro (DECH), que pode ocorrer após transplantes de células-tronco hematopoiéticas.

Similar à CLAD, a DECH pulmonar é uma condição progressiva com desfechos extremamente ruins e não existe tratamento atualmente aprovado.

Um estudo de pesquisa multicêntrico retrospectivo de 95 pacientes com DECH aguda ou crônica refratária à esteroide que receberam o inibidor sistêmico de JAK ruxolitinibe como terapia de resgate demonstrou resposta completa ou parcial para ruxolitinibe na maioria dos pacientes, incluindo aqueles com DECH pulmonar (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). Mais recentemente, a pneumonite induzida pelo inibidor do checkpoint imunológico, outra doença pulmonar mediada por células T, surgiu com o aumento do uso de inibidores do checkpoint imunológico. Os pacientes com câncer tratados com esses agentes estimulantes de células T podem desenvolver pneumonite fatal. O composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste tem o potencial de apresentar um novo tratamento para essas doenças respiratórias graves mal atendidas.

Doenças gastrointestinais

[0098] Como inibidor de JAK, o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis para uma variedade de outras doenças. O composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico deste podem ser úteis para várias indicações inflamatórias gastrointestinais que incluem, mas não estão limitados a, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa (proctosigmoidite, pancolite, proctite ulcerativa e colite do lado esquerdo), doença de Crohn, colite colagenosa, colite linfocítica, doença de Behcet, doença celíaca, colite induzida por inibidor do ponto de verificação imunológico, ileíte, esofagite eosinofílica, colite relacionada à doença do enxerto versus hospedeiro e colite infecciosa. Colite ulcerativa (Reimund et al., J Clin Immunology, 1996, 16,

1144-150), doença de Crohn (Woywodt et al., Eur O Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), colite colagenosa (Kumawat et al., Mol Immunology, 2013, 55, 355- 364), colite linfocítica (Kumawat et al., 2013), esofagite eosinofílica (Weinbrand-Goichberg et al., Immunol Res, 2013, 56, 249-260), colite relacionada à doença do enxerto versus hospedeiro (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 3268-3276)

colite infecciosa (Stallmach et al., Int J Colorectal Dis, 2004, 19, 308-315), doença de Behçet (Zhou et al., Autoimmun Rev, 2012, 11, 699-704), doença celíaca (de Nitto et al., World J Gastroenterol, 2009, 15, 4609-4614), colite induzida por inibidor de checkpoint (ponto de verificação) imunológico (p. ex., colite induzida por inibidor de CTLA- 4; (Yano et al., J Translation Med, 2014, 12, 191), ou colite induzida por inibidor de PD-l1 ou PD-L1) e ileíte (Yamamoto et al., Dig Liver Dis, 2008, 40, 253-259) são caracterizadas pela elevação dos níveis de algumas citocinas pró- inflamatórias.

Como muitas citocinas pró-inflamatórias sinalizam via ativação de JAK, o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser capazes de aliviar a inflamação e fornecer alívio para seus sintomas.

Em especial, o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser úteis para a indução e manutenção da remissão da colite ulcerativa inespecífica, e para o tratamento da doença de Crohn, colite induzida por inibidor de checkpoint (ponto de verificação) imunológico, e os efeitos adversos gastrintestinais da doença do enxerto versus hospedeiro.

Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um método para tratar uma doença gastrointestinal inflamatória em um mamífero (por exemplo, humano), o método compreendendo a administração ao mamífero do composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico e o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Outras doenças

[0099] O composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste também pode ser útil para tratar outras doenças, como outras doenças inflamatórias, doenças autoimunes ou cânceres.

[00100] O composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste pode ser útil para tratar um ou mais dentre artrite, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, rejeição de transplante, xeroftalmia, artrite psoriática, diabetes, diabetes dependente de insulina, doença do neurônio motor, síndrome mielodisplásica, dor, sarcopenia, caquexia, choque séptico, lúpus eritematoso sistêmico, leucemia, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, espondilite anquilosante, mielofibrose, linfoma de células B, carcinoma hepatocelular, doença de Hodkins, câncer de mama, mieloma múltiplo, melanoma, linfoma não Hodgkin, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células claras do ovário, tumor de ovário, tumor de pâncreas, policitemia vera, síndrome de Sjoegrens, sarcoma de tecidos moles, sarcoma, esplenomegalia, linfoma de células T e talassemia maior.

Terapia combinada

[00101] O composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste pode ser usado em combinação com um ou mais agentes que atuam pelo mesmo mecanismo ou por diferentes mecanismos para tratar uma doença. Os diferentes agentes podem ser administrados em sequência ou simultaneamente, em composições separadas ou na mesma composição. Classes úteis de agentes para terapia de combinação incluem, mas não estão limitados a, antiangiogênicos, esteroides, anti- inflamatórios, inibidores da calicreína plasmática, inibidores do ligante do fator de crescimento da placenta, inibidores do ligante VEGF-A, inibidores do ligante-2 da angiopoietina, proteína tirosina fosfatase inibidor beta, estimuladores de receptor de tirosina quinase Tek, inibidores de calcineurina, inibidores de ligante de VEGF, inibidores de complexo 1 mTOR, inibidores de mTOR, antagonistas de IL-17, moduladores de calmodulina, antagonistas de receptor de FGF, antagonistas de receptor de PDGF, antagonistas de receptor de VEGF, inibidores de ligante de TNF alfa, agentes de ligação de TNF, estimuladores de proteoglicano 4, inibidores de ligante de VEGF-C, inibidores de ligante de VEGF-D, antagonistas de CD126, inibidores de cascata de complemento, agonistas de glicocorticoide, inibidores de fator C5 de complemento, antagonistas de receptor de canabinoide, moduladores de receptor 1 de esfingosina-l-fosfato, moduladores do receptor 3 de esfingosina-l-fosfato, moduladores do receptor 4 de esfingosina-l-fosfato, moduladores do receptor 5 de esfingosina-l-fosfato, inibidores de acetaldeído desidrogenase, inibidores da tirosina quinase Fl1t3, inibidores da tirosina quinase Kit, inibidores da proteína quinase C, ligantes do hormônio adrenocorticotrófico, inibidores do ligante do fator 1 derivado da célula do estroma, agonistas da imunoglobulina Gl, inibidores do ligante beta da interleucina-l1, estimuladores da mucina; moduladores do fator nuclear kappa B, estimuladores da proteína 4 do linfócito T citotóxico, inibidores da glicoproteína CD28 da superfície das células T, estimuladores da lipoproteína lipase; agonistas de PPAR alfa, agonistas de receptor de adenosina A3, antagonistas de receptor de angiotensina II, antagonistas de receptor de VEGF, ligantes beta de interferon, moduladores SMAD-2; inibidores do ligante de TGF beta 1, agonistas do receptor de somatostatina, inibidores da subunidade alfa do receptor IL-2, inibidores do ligante VEGF-B, ligantes de timosina beta 4, antagonistas do receptor de angiotensina II AT-1, antagonistas da quimiocina CCR2, inibidores da membrana de cobre amina oxidase, antagonistas de CDlla, inibidores de ICAM-1, antagonistas do fator de crescimento semelhante à insulina 1, inibidores da calicreína, estimuladores da fucosiltransferase 6, moduladores da fucose sintetase de GDP, inibidores do gene GHR, inibidores do gene IGF1l, antagonistas do receptor VEGF-l, agonistas da albumina, antagonistas da IL-2, antagnonistas de CSF-1; antagonistas do receptor PDGF, antagonistas do receptor VEGF-2, inibidores de mTOR, agonistas PPAR alfa, inibidores de Rho GTPase, inibidores de proteína quinase associado a Rho, inibidores de complemento C3, inibidores de fator de transcrição EGR-1, moduladores de fator nuclear eritroide 2 relacionado, inibidores do fator nuclear kappa BB, antagonistas da integrina alfa-V/beta-3, agonistas do receptor da eritropoietina, agonistas do peptídeo 1 semelhante ao glucagon, estimuladores do gene TNFRSFI1A, inibidores do ligante 2 da angiopoietina, inibidores da antiplasmina alfa-2, antagonistas do colágeno, inibidores da fibronectina, antagonistas da lamina, estimuladores da plasmina, ligantes do fator de crescimento do nervo, antagonistas do receptor FGFl, antagonistas do receptor FGF3, inibidores da tirosina quinase itk, inibidores da tirosina quinase Lck, inibidores do receptor da tirosina quinase Ltk, antagonistas do receptor PDGF alfa, antagonistas do receptor PDGF beta, inibidores da proteína tirosina quinase, antagonistas do receptor VEGF-3, inibidores de membrana de cobre amina oxidase, agonistas do receptor de somatostatina 2, agonistas do receptor de somatostatina 4, agonistas do receptor de somatostatina 5, inibidores de proteína quinase C alfa, inibidores de proteína quinase C beta, inibidores de proteína quinase C delta inibidor de proteína quinase C inibidor de épsilon proteína quinase C eta inibidor, inibidor de proteína quinase C teta, moduladores de anquirina, estimuladores de mucina, agonistas de purinoceptor P2Y2, inibidores da proteína alfa-l1 da junção da folga, antagonistas da quimiocina CCR3; inibidores de ligante de eotaxina, inibidores de canal de sódio sensível a amilorida, antagonistas de receptor de PDGF, inibidores de proteína tirosina quinase, inibidores de proteína de epitélio de pigmento retiniana, inibidores de metaloprotease de matriz, antagonistas de receptor de PDGF, antagonistas de receptor de PDGF beta, inibidores de ligante de PDGF-B, antagonistas de receptor de hormônio de crescimento, células inibidoras de molécula de adesão, moduladores de integrina, antagonistas de quimiocina CXCR4, inibidores de proteína contendo domínio de bobina enrolada, moduladores de Hsp 90, inibidores de proteína quinase associado a Rho, inibidores de gene VEGF, inibidores de endoglin, antagonistas de quimiocina CCR3, moduladores de canal de potássio maxi K, estimuladores de canal de potássio maxi K, agonistas de PGF2 alfa, agonistas do receptor prostanoide, moduladores do canal 2 de cloreto controlado por voltagem, antagonistas do receptor C5a do complemento, inibidores da inosina monofosfato desidrogenase, inibidores do ligante da interleucina 18, estimuladores do canal catiônico TRP M8, agonistas do receptor CNTF, inibidores do gene TRPV1, estimuladores de desoxirribonuclease I, inibidores do gene IRS1, inibidores de proteína quinase associado a Rho, inibidores de poli ADP ribose polimerase 1, inibidores de poli ADP ribose polimerase 2, inibidores de poli ADP ribose polimerase 3, agonistas de VR1 vaniloide, estimuladores do gene NFAT5S, estimuladores de mucina, inibidores de tirosina quinase Syk, agonistas do adrenoceptor alfa 2, inibidores de ciclooxigenase, inibidores de deposição de proteína amiloide, inibidores de glicogênio sintase quinase-3 estimuladores "PARP, inibidores de deposição de tau, inibidores do gene DDITA4, moduladores de síntese de hemoglobina, inibidores do ligante beta da interleucina-1l, antagonistas do TNF, estimuladores do canal de potássio controlado por voltagem KCNQ, antagonistas do receptor NMDA, inibidores da ciclooxigenase 1, inibidores da ciclooxigenase, agonistas do receptor 5-HT la, inibidores do canal de cálcio, moduladores do ligante FGF-2, inibidores de fosfoinositídeo 3-quinase, antagonistas de CD44, moduladores de hialuronidase, agonistas de ácido hialurônico, antagonistas de IL-l, antagonistas de receptor de IL-1 tipo I, inibidores de fator P de complemento, antagonistas de tubulina, antagonistas de beta amiloide, estimuladores de gene IL2, inibidores de I-kappa B quinase beta, moduladores do fator nuclear kappa B, inibidores do ativador do plasminogênio 1, ligante FGF-2, moduladores da protease e moduladores da corticotropina.

[00102] Agentes específicos que podem ser usados em combinação com o composto 1 incluem, mas não estão limitados a, lanadelumab, aflibercept, RG-7716, AKB-9778 ciclosporina, bevacizumab, everolimus, secucinumab, acetonido de fluocinolona, RP-101, lactato de esqualamina, lubricina humana recombinante, OPT-302, sarilumabe, dexametasona, eculizumabe, fingolimode, adalimumabe, reproxalape, midostaurina, corticotropina, pegol olaptesado, canacinumabe, recoflavona, abatacepte, fenofibrato, piclidenosona, OpRegen, candesartana, golimumabe, pegaptanibe, interferon-beya, disitertida, acetato de octreotida, anecortave, basiliximab, acetonido de triancinolona supracoroidal, RGN-259, difluprednato, HL-036, avacincaptad pegol de sódio, irbesartan, propagermânio, acetonido de triancinolona, azitromicina, BI-1467335, lifitegrast, etabonato de loteprednol, teprotumumabe, KVD-

001, TZ-101, atesidorsen, Nov-03, bevacizumabe, AVA-101, RU- 101, voclosporin, vorolanibe, sirolimus, fenofibrato de colina, VX-210, APL-2, CPC-551, elamipretida, SF-0166, cibinetida, elamipretida, liraglutida, EYS-606, nesvacumabe, aflibercepte, ocriplasmina, filgotinibe, cenegermin, adipocel, brolucizumabe, ranibizumabe, aflibercepte, terapia fotodinâmica de padeliporfina, pazopanib, ASP-8232, veldoreotida, sotrastaurina, egol de abicipar, diquafosol tetrassódico, HCB-1019, conbercept, bertilimumabe, SHP-659, THR-317, ALK-001, PAN-90806, interferon alfa-2b, fluocinolona, malato de sunitinibe, emixustat, hI-conl, TB- 403, minociclina, células MAO9-hRPE, pegpleranibe sódico, luminato de pegvisomante, burixafor, H-1129, carotuximabe, AXP-1275, ranibizumabe, isopropil unoprostona, tesidolumabe, micofenolato de sódio com revestimento entérico, tadekinig alfa, acetonido de triancinolona,ciclosporina, ST-266, AVX- 012, NT-501-ECT, tivanisiran, verteporfina, dornase alfa, aganirsen, ripasudil, fosfato de rucaparibe, zucapsaicina, tetratiomolibdato, diclofenaco, LHA-510, AGN-195263, tacrolimus, rebamipide, R-348, tartrato de brimonidina, vizomitina, T-89, LME-636, BI-1026706, rimexolona, tobramicina, TOP-1630, talaporfina, bromfenaco sódico, acetonido de triancinolona, davunetida, etabonato de loteprednol, XED-60, EG-Mirotin, APD-209, adenovir, PE- 04523655, hidroxicarbamida, navamepent, retinalamina, CNTO- 2476, ranibizumab, flupirtina, B27PD, S-646240, GLY-230, hidralazina, nepafenaco, DexNP, Trehalose, ácido hialurônico, depósito de liberação sustentada de dexametasona-Ca, naluzotano, hialuronidase, hialuronato de sódio, isunakinra, somatostatina, CLG-561, OC-10X, UCA-002, fator de crescimento epidérmico humano recombinante, pemirolast, VM-100, MB-113l16, luminol alfa monossódico, ranibizumabe, IMD-1041, LMG-324, HE-10, cinialuronato de sódio, BDM-E, células precursoras mesenquimais, dissulfiram, CTC-96, PG-101, Beifushu, quimotripsina.

[00103] Também é fornecida, neste documento, uma composição farmacêutica que compreende o composto 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e um ou mais outros agentes “terapêuticos. O agente terapêutico pode ser selecionado da classe de agentes especificada acima e da lista de agentes específicos descritos acima. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para entrega ocular. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um líquido ou uma composição em suspensão.

[00104] Além disso, em um aspecto do método, a invenção fornece um método para tratar uma doença ou desordem em um mamífero compreendendo a administração ao mamífero do composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico deste e um ou mais agentes terapêuticos.

[00105] Quando usado em combinação terapêutica, os agentes poderão ser formulados em uma única composição farmacêutica, ou os agentes podem ser fornecidos em diferentes composições que são administradas simultaneamente ou em tempos distintos, pela mesma via ou por diferentes vias de administração. Tais composições podem ser acondicionadas separadamente ou podem ser acondicionadas como um kit. Os dois ou mais agentes terapêuticos no kit podem ser administrados pela mesma via de administração ou por diferentes vias de administração.

EXEMPLOS

[00106] Os exemplos sintéticos e biológicos a seguir são fornecidos para ilustrar a invenção, e não são para serem interpretados de qualquer forma como uma limitação do escopo da invenção. Nos exemplos abaixo, as abreviações têm os seguintes significados, a menos que seja indicado de outra forma. As abreviações não definidas abaixo têm seus significados geralmente aceitos.

ACN = acetonitrila Boc = terc-butiloxicarbonil DCC = dicicloexilcarbodiimida DIPEA = N,N-di-isopropietilamina DMAC = dimetilacetamida DMF = N,N-dimetilformamida DMSO = dimetilsulfóxido EtOAC = acetato de etila HATU= hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-O- (7T-azabenzotriazol-1-il)urônio LDA = di-isopropilamida de lítio min. = minuto(s) MTBE = éter metil terc-butílico NBS = N-bromossuccinimida NMP = N-Metil-2-pirrolidona RT (TA) = temperatura ambiente THF = tetrahidrofurano bis (pinacolato)diboro = 4,4,5,5,4'7,4",57,5'"- octametil-[2,2' ]bi[[1,3,2]dioxaborolanil

Pd (dppf) Cl2-CH2Cl2 = complexo de dicloro(1,1'- bis (difenilfosfino)-ferroceno) -dipaládio(1II) com diclorometano

[00107] Os reagentes e solventes foram adquiridos de fornecedores comerciais (Aldrich, Fluka, Sigma etc.) e usados sem purificação adicional. O progresso das misturas de reação foi monitorado por cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia líquida analítica de alto desempenho (anál. HPLC) e espectrometria de massa. As misturas de reação foram elaboradas conforme descrito especificamente em cada reação; comumente eles eram purificados por extração e outros métodos de purificação, como temperatura e cristalização dependente de solvente e precipitação. Além disso, as misturas da reação foram purificadas por cromatografia em coluna ou HPLC/CLAE preparativa, geralmente usando empacotamento C18 ou BDS de coluna e eluentes convencionais. As condições típicas de HPLC/CLAE preparativa estão descritas abaixo.

[00108] A caracterização dos produtos da reação foi rotineiramente realizada por espectrometria de massa e 'H-NMR. Para análise &de NMR, as amostras foram dissolvidas em solvente deuterado (como CD3;OD, CDCl3 ou ds-DMSO) e os espectros de 'H-NMR foram adquiridos com um instrumento Varian Gemini 2000 (400 MHz) sob condições de observação padrão. A identificação de compostos por espectrometria de massa foi realizada por um método de ionização por eletrospray (ESMS) com um instrumento Applied Biosystems (Foster City, CA) modelo API 150 EX ou um instrumento 3100

Waters (Milford, MA), acoplado a sistemas de autopurificação. Condições preparativas de HPLC

[00109] Coluna: C18, 5 Um. 21,2 x 150 mm ou C18, 5 [m 21 x 250 ou Ccl4, 5 Om 21x150 mm Temperatura da coluna: Temperatura ambiente Taxa de vazão: 20,0 ml/min. Fases móveis: A = Água + 0,05% TFA B = ACN + 0,05% TFA, Volume de injeção: (100-1500 ul) Comprimento de onda do detector: 214 nm

[00110] Os compostos brutos foram dissolvidos em 1:1 de água:ácido acético em cerca de 50 mg/ml. Um teste de 4 minutos de escala analítica foi realizado usando uma coluna Cc18 2,1 x 50 mm, seguida de um teste de escala preparativa de 15 ou 20 minutos usando injeção de 100 []l com o gradiente baseado na % de retenção de B do teste da escala analítica. HDOs gradientes precisos dependiam da amostra. Amostras com impurezas com tempos de retenção próximos foram verificadas com uma coluna C18 21 x 250 mm e/ou coluna Cl14 21 x 150 mm para melhor separação. As frações com o produto desejado foram identificadas por análise de espectrometria de massa. Preparação 1: 2-(4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)- 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (1-5) F F F F í HO. BnO. BnO. Bno. mo EO, Oy: Br Br E 11 1-2 1-3 1-4 1-5 (a) 2- (benziloxi)-4-bromo-l-fluorobenzeno (1-2)

[00111] Duas reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. Uma mistura de 5-bromo-2- fluorofenol (1-1) (850 g, 4,5 mol), brometo de benzil (837 g, 4,9 mol) e carbonato de potássio (923 g, 6,7 mol) em ACN (5 1) foi agitada a 20 ºC por 12 h. As reações foram combinadas e concentradas, diluídas com água (8 1) e extraídas com EtOAc (3 x 3 1). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura (3 1), seca sobre sulfato de sódio e concentrada. O produto em bruto foi purificado através de uma almofada de gel de sílica (eluída com 3:1 éter de petróleo:EtOAc) para fornecer o intermediário do título (1,83 kg, rendimento de 73%) como um sólido branco. 1H NMR (400 MHz, CDCl3;) [007,38-7,46 (m, 5H), 7,15 (dd, J = 7,6, 2,0 Hz, 1H), 6,98-7,15 (m, 1H), 5,12 (s, 2H).

(b) 2- (benziloxi)-4-etil-l1-fluorobenzeno (1-3)

[00112] Seis reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. A uma solução do produto da etapa anterior (200 g, 711 mmol) em THF (100 ml) foi adicionado carbonato de potássio (197 g, 1,4 mol). A mistura de reação foi purgada com nitrogênio 3 vezes, seguida pela adição de Pd(dppf)Cl:-CH2Cl2 (11,6 g, 14,2 mmol). A mistura de reação foi resfriada a O ºC, foi adicionado dietilzinco (1 M, 1,07 1) gota a gota e a mistura de reação foi agitada a 70 ºC durante 1 h. As reações foram combinadas, resfriadas a 20 ºC e vertidas em água (7 1) lentamente. Foi adicionado à mistura aq. 4 M HCl para pH 6. A camada orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 2 1). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura (5 1), seca sobre sulfato de sódio, concentrada e purificada através de uma almofada de gel de sílica (eluída com 50:1 éter de petróleo: EtOAc)) para fornecer o intermediário do título (900 g, 92% de rendimento) como um óleo amarelo claro. 'H NMR (400 MHz, CDCl3) [07,29-7,43 (m, 5H), 6,94-6,97 (m, 1H), 6,82 (dy, J = 8,0 Hz, 1H), 6,70 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 2,52- 2,58 (my, 2H), 1,17 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

(c) 1- (benziloxi)-4-bromo-5-etil-2-fluorobenzeno (1-4)

[00113] Quatro reações foram realizadas em paralelo e combinadas. Foi adicionado NBS (249 g, 1,4 mol) em porções a uma solução de 2- (benziloxi)-4-etil-l-fluorobenzeno (1-3) (293 g, 1,3 mol) em ACN (1 1) a 20 ºC. A mistura de reação foi agitada a 20 ºC durante 2 h. As misturas de reação foram combinadas e concentradas. O resíduo foi diluído com água (5 1) e extraído com EtOAc (2 x 5 1). A fase orgânica foi lavada com salmoura (4 1), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em gel de sílica (eluído com éter de petróleo: EtOAc 100:1-10:1) para fornecer o intermediário do título (1,4 kg, 89% de rendimento) como um óleo amarelo claro. 'H NMR (400 MHz, CDCl3) [17,29-7,38 (m, 5H), 7,2 (dy, J= 10,4 Hz, 1H), 6,8 (dy, J= 8,8 Hz, 1H), 5,06 (s, 2H), 2,6 (q, J= 7,6 Hz, 2 H), 1,1 (t, J= 7,6 Hz, 3H).

(d) 2- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (1-5)

[00114] Sete reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. Foram adicionados acetato de potássio (190 g, 1,9 mol), bis (pinacolato) diboro (181 g, 712 mmol) e Pd(dppf)Cl:-CHCl2 (10,6 g, 12,9 mmol) a uma solução do produto da etapa anterior (200 g, 647 mmol) em dioxano (2 1) sob nitrogênio a 20 ºC. A mistura foi agitada a 120 ºC durante 2 h. As misturas de reação foram combinadas, concentradas, diluídas com água (5 1) e extraídas com EtOAc (3 x 4 1). A fase orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em gel de sílica (eluído com éter de petróleo: EtOAc 1:0 - 5:1) para fornecer o composto do título (1,35 kg, rendimento de 84%) como um sólido branco. 'H NMR (400 MHz, CDCl3) [17,33-7,51 (m, 6H), 6,82 (dy, J = 7,6 Hz, 1H), 5,17 (s, 2H), 2,85 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,33 ( s, 12H), 1,15 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

Preparação 2: 1l-benzil-4-imino-l,4-dihidropiridin-3- amina (2) H2N MNA Den 2

[00115] Foi adicionado brometo de benzil (596 g, 3,49 mol) em porções a uma solução de piridina-3,4-diamina (400 g, 3,67 mol) em ACN (3 1) a O ºC e a mistura de reação foi agitada durante 30 min. e em seguida, a 20 ºC por 12 h, e filtrado. O bolo de filtração foi lavado com ACN (500 ml) e seco para fornecer o sal de HBr do composto do título (600 g, 2,14 mol, 58% de rendimento) como um pó branco. 'H NMR (400 MHz, MeOD) [117,83 (dy, J = 5,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,32-7,40 (my, 5H), 6,76 (dy, J = 6,8 Hz, 1H), 5,28 ( s, 2H).

Preparação 3: 6-(4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)- 4-fluoro-lH-indazol-3-carbaldeído (3)

F BnO.

BO A F Brno F Br. F 15 BnO. " OEt 5 O F > F — OEt O OEt O OEt Fo OEt 7 OEt

F O NAN 3-1 3-2 3-3

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NHNO O 3 (a) 1- (4-bromo-2,6-difluorofenil)-2,2-dietoxietan-l1- ona (3-1)

[00116] Nove reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. Uma solução de 1l-bromo-3,5- difluorobenzeno (100 g, 518 mmol) em THF (700 ml) foi desgaseificada e purgada com nitrogênio três vezes. Em seguida, 2 M LDA (311 ml) foi adicionado a -70 ºC ea mistura de reação foi agitada a -70 ºC durante 0,5 h sob nitrogênio. Uma solução de etil 2,2-dietoxiacetato (96 g, 544 mmol) em THF (200 ml) foi adicionada gota a gota a -70 ºC sob nitrogênio e a mistura de reação foi agitada durante 1 h. As reações foram combinadas e vertidas em cloreto de amônio saturado com gelo (10 1) em porções e extraídas com EtOAc (3 x 3 1). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura (5 1), seca sobre sulfato de sódio, concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (eluída com éter de petróleo EtOAc 1:0 - 100:1) para fornecer o composto do título (1,26 kg, rendimento de 84%) como um óleo amarelo. 'H NMR (400 MHz, CDCl3) O 7,12 (df, J = 7,2 Hz, 2H), 5,15 (s, 1H), 3,61-3,7 (my, 4H), 1,2 (t, J = 7,2 Hz, 6H).

(b) 1- (4" - (benziloxi)-2'-etil-3,5,5'"-trifluoro-[1,1'- bifenil]-4-1il1)-2,2-dietoxietan-l-ona (3-2)

[00117] Cinco reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. Foi adicionada água (150 ml), carbonato de sódio (84,8 g, 800 mmol) e 2-(4-(benziloxi)-2- etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (1-5) (190 g, 533 mmol) a uma mistura de 1-(4-bromo-2,6- difluorofenil)-2,2-dietoxietan-l-ona (3-1) (189 gq, 586 mmol) em etanol (150 ml) e tolueno (1,5 1) a 20 ºC. A suspensão foi desgaseificada sob vácuo e purgada com nitrogênio várias vezes. Foi adicionado Pd(dppf)Cl:-CH2Cl2 (13 g, l16 mmol) e a mistura de reação foi purgada com nitrogênio várias vezes e agitada a 120 ºC durante 2 h. As reações foram combinadas, resfriadas a 20 ºC, vertidas em água (5 1) e extraídas com EtOAc (3 x 4 1). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (5 l1), secas sobre sulfato de sódio, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em gel de sílica (eluída com éter de petróleo: EtOAc 100:1-5:1) para fornecer o intermediário do título (880 g, rendimento de 70%) como um óleo amarelo. 'H NMR (400 MHz, CDCl3)" 7,36- 7,48 (m, 5H), 6,94-6,96 (m, 2H), 6,86-6,92 (m, 2H), 5,29 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 3,67 -3,77 (m, 4H), 2,52 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,25 (t, J = 6,8 Hz, 6H), 1,07 (t, J = 7,2 Hz, 3H).

(c) 6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3- (dietoximetil)-4-fluoro-lH-indazol (3-3)

[00118] Quatro reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. Foi adicionada hidrazina monohidratada (47,6 g, 931 mmol) a uma solução do produto da etapa anterior (220 g, 466 mmol) em THF (2 1) a 20 ºC. A mistura de reação foi agitada a 100 ºC durante 12 h. Quatro reações foram combinadas e resfriadas a 20 ºC e concentradas. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (5 1) e lavado com HCl 0,1 M (2x 1,51). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,5 1), secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas para fornecer o intermediário do título (900 g, em bruto) como goma amarela, que foi usada diretamente na próxima etapa. 'H NMR (400 MHz, CDCl3)| 7,36-7,48 (m, 5H), 6,94-6,96 (m, 2H), 6,86-6,92 (m, 2H), 5,29 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 3,67 -3,77 (m, 4H), 2,52 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,25 (t, J=6,8 Hz, 6H), 1,07 (t, J= 7,2 Hz, 3H).

(d) 6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro- lH-indazol-3-carbaldeído (3)

[00119] Três reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. A uma solução do produto da etapa anterior (300 g, 643 mmol) em acetona (1,5 1) foi adicionado HCl 4 M (16 ml) gota a gota a 20 ºC e a mistura de reação foi agitada a 20 ºC durante 0,17 h. As reações foram combinadas, concentradas, diluídas com MTBE (1 1) e filtradas. O bolo de filtração foi lavado com MTBE (2 x 300 ml) e seco sob pressão reduzida para fornecer o intermediário do título (705 g, em bruto) como um sólido amarelo, que foi usado diretamente na próxima etapa. (m/z): [M + H]* calculado para CosHigF2N202 393,13 encontrado 393,1. 'H NMR (400 MHz DMSO-ds) O 14,51 (s, 1H), 10,17 (dy, J = 3,6 Hz, 1H), 7,50 (dy, J = 7,2 Hz, 2H), 7,40-7,42 (m, 48), 7,24 (dy, J = 8,4 Hz, 1H), 7,15 (dy, J = 12,4 Hz, 1H), 7,06 (dy, J = 8,4 Hz, 1H), 5,25 (s, 2H), 2,52-2,53 (my, 2H ), 1,03 (t, J = 7,6 Hz, 3H). Preparação 4: 5-benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2-etil-5- fluorofenil)-4-fluoro-lH-indazol-3-il)-5H-imidazo[4,5- clpiridina (4) HoN F MN an F BnO. — BnO. U 2. O F — F .Bn Po xo NHK O une NÃ 7 3 4

[00120] Quatro reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. Foram adicionados bissulfito de sódio (68,6 g, 659 mmol) e l-benzil-4-imino-1,4- dihidropiridin-3-amina (2) (136 g, 484 mmol) a uma solução de 6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-lH- indazol-3-carbaldeído (3), o produto da Preparação 3 (172 g, 440 mmol) em DMF (1,1 1) a 20 ºC e a reação mistura foi agitada a 150 ºC durante 2 h. Quatro reações foram combinadas e a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi vertido em água (10 1) e filtrado. O bolo de filtração foi seco sob pressão reduzida para fornecer o intermediário do título (990 g, em bruto) como um sólido amarelo, que foi usado diretamente sem purificação. (m/z): [M + H]* calculado para C3asHo7F2NsSO 572,2 encontrado 572,3.

Preparação 5: 5-benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2-etil-5- fluorofenil)-4-fluoro-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro- lH-imidazo[4,5-c]piridina (5) BnO. À r BnO. É F .Bn O F Q > — O NO ÊO um NÃ 7 TIO

N HW ON 4 5

[00121] Três reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. Foi adicionado borohidreto de sódio (267 g, 6,9 mol) em porções a uma mistura de 5-benzil- 2-(6- (4- (benziloxi) -2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-lH- indazol-3-il)-5H-imidazo[4,5-c]piridina (4), o produto da Preparação 4 (330 g, 577 mmol) em metanol (1,5 1) e THF (1 1) a 20 ºC ea mistura de reação foi agitado a 20 ºC por 24 h. Três reações foram combinadas e a mistura de reação foi adicionada a água (10 1), agitada por 10 min. e filtrada. O filtrado foi extraído com EtOAc (2 x 5 1) e a fase orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada sob vácuo. O produto em bruto foi diluído com EtOAc (2 1), agitado durante 30 min. e filtrado. O bolo do filtro foi lavado com MTBE (3 x 200 ml) para fornecer o intermediário do título (275 g, rendimento de 28%) como um sólido amarelo claro. (m/z): [M + H]* calculado para C3sH31F2N5O 576,25 encontrado 576,3. !H NMR (400 MHz, DMSO-ds) 007,50-7,52 (my, 2H), 7,35-7,43 (my, 7H), 7,23-7,25 (mM, 3H) 7,15 (df, J = 12,0 Hz, 1H), 6,81 (dy, J = 12,0 Hz, 1H), 5,25 (s, 2H), 3,72 (s, 2H), 3,43 (br. s, 2H), 2,78 (br. s, 2H), 2,66 (br. s, 2H ), 2,55 (q, 2H), 1,04 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

Preparação 6: 5-etil-2-fluoro-4- (4-fluoro-3- (4,5,6,7- tetrahidro-lH-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-lH-indazol-6- il)fenol (6)

F F BnO. HO.

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HNK N NA N 6

[00122] Cinco reações foram realizadas em paralelo e combinadas para processamento. Em uma mistura de 5-benzil- 2- (6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-l1H- indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-lH-imidazo[4,5-c]piridina (5), o produto da Preparação 5 (55 g, 95,5 mmol) em THF (500 ml) e metanol (500 ml) foi adicionado paládio sobre carbono (15 gq, 9,6 mmol) e aq. 12 M HCl (10 mL). A suspensão foi desgaseificada sob vácuo, purgada com hidrogênio várias vezes e agitada sob hidrogênio (50 psi) a 50 ºC por 12 h. As reações foram combinadas e a mistura de reação foi filtrada. O filtrado foi concentrado sob vácuo para fornecer o sal de HCl do intermediário do título (150 g, em bruto) como um sólido esbranquiçado. (m/z): [M + H]* calculado para C2a1H19F2N5O 396,16 encontrado 396,2. 'H NMR (400 MHz, MeOD 7,43 (s, 1H), 7,07 (df, J= 11,6 Hz, 1H), 6,97 (dy, J= 11,6 Hz, 1H), 6,91 (dy, J = 8,8 Hz, 1H), 4,57 (s, 2H), 3,74 (s 2H), 3,24 (s, 2H), 2,55 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,08 (t, J = 7,6 Hz, 3H). Exemplo 1: (18, 5R)-2-azabiciclo[3.1.0]hexan-1-i1l(2- (6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-lH-indazol-3-

il) -6,7-di-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-5(4H)-il)metanona (1)

F F Ho. no. —. -

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H H 6 1

[00123] Foram adicionados HATU (45,3 mg, 0,119 mmol) e DIPEA (0,076 ml, 0,433 mmol) a uma mistura de 5-etil-2- fluoro-4- (4-fluoro-3-(4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5- c]lpiridin-2-il)-l1H-indazol-6-il)fenol (21,4 mg, 0,054 mmol) (6) e ácido (1s, 5r) -2- (terc-butoxicarbonil)-2- azabiciclo[3.1.0]hexano-l-carboxílico (24,6 mg, 0,108 mmol) em DMF (0,5 ml) e a solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Foram adicionados MeoOH (2,00 ml) e água (0,500 ml) à mistura de reação; em seguida, foi adicionado hidróxido de lítio (7,78 mg, 0,325 mmol) e a solução foi agitada a 65 ºC durante 1 hora. A solução foi então concentrada e TFA (0,500 ml) foi adicionado ao resíduo. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos, depois foi concentrada. O produto em bruto foi então purificado por HPLC preparativa (5-65% de acetonitrila em gradiente de água com 0,1% de TFA, coluna Zorbax Bonus-RP), para fornecer o sal de TFA do composto do título (19,4 mg, 57% de rendimento). (m/z): [M + H]* calculado para Co7HasF2Nç6O2 505,18 encontrado 505,2. 'H NMR (400 MHz, DMSO-ds) 5 13,62 (s, 1H), 12,44 (s, 1H), 9,92 (s, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,03 (dy, J = 11,9 Hz, 1H) , 6,90 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 6,82 (df, J = 11,3 Hz, 1H), 4,59 (m, 2H),

3,96 (m, 1H), 3,79 (m, 1H), 3,27 (m, 1H), 2,89 (m, 1H), 2,72 (m, 2H), 2,47 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 2,06 (my, 2H), 1,92 (Mm, 1H), 1,30 (m, 2H), 1,00 (t, J = 7,5, 3H). Preparação 7: 1- (benziloxi) -4-bromo-5-etil-2- fluorobenzeno

F BnO: O. (a) 5-etil-2-fluorofenol

[00124] Uma mistura do composto 5-bromo-2-fluorofenol (80 g, 419 mmol) em tetra-hidrofurano seco (800 ml) foi desgaseificada e purgada com nitrogênio três vezes, e foi adicionado Pd(t-Bu3P)> (4,28 g, 8,38 mmol). Foi adicionado à mistura gota a gota dietilzinco (114 g, 921 mmol) a 25 ºCe a mistura de reação foi agitada a 50 ºC durante 12 h sob nitrogênio e lentamente vertida em água gelada (1 1). EtOAc (350 ml) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada durante 20 min. e filtrada. O bolo do filtro foi lavado com EtOAc (3 x 500 Ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (600 ml), secas sobre sulfato de sódio, concentradas e purificadas por cromatografia em gel de sílica para fornecer o intermediário do título (85 g, em bruto) como um óleo amarelo. (b) 2- (benziloxi) -4-etil-l1-fluorobenzeno

[00125] A uma solução do produto da etapa anterior (85 g, 606 mmol) em ACN (850 ml) foi adicionado brometo de benzil (124 q, 728 mmol) e KxCO3 (126 g, 909 mmol). A mistura de reação foi agitada a 25 ºC durante 12 h, vertida em água (1

1) e extraída com EtoOAc (4 x 500 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (600 ml), secas sobre sulfato de sódio, concentradas e purificadas por cromatografia em gel de sílica para fornecer o intermediário do título (100 g, em bruto) como um óleo amarelo.

(c) 1- (benziloxi)-4-bromo-5-etil-2-fluorobenzeno

[00126] Foi adicionada N-bromossuccinimida (85 g, 477 mmol) em porções a uma solução do produto da etapa anterior (100 g, 434 mmol) em ACN (1,0 1). A mistura de reação foi agitada a 25 ºC durante 5 h, vertida em água (1,3 1) e extraída com EtOAc (3 x 500 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (800 ml), secas sobre sulfato de sódio, concentradas e purificadas por cromatografia em gel de sílica para fornecer o intermediário do título (83 g) como um óleo amarelo. 'H NMR (CDCl3, 400 MHz) 5 (ppm) 7,27-7,43 (m, 6H), 6,86 (dy, J = 8,4 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 2,64 (q, J = 7,6 Hz, 2H ), 1,15 (t, J = 7,2 Hz, 1H).

Preparação 8: 2-(4-(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)- 4,4,5,5-tetrametil-1l,3,2-dioxaborolano

F BnO. O. 8 e

[00127] Uma mistura do composto da Preparação 7 (83 g, 268 mmol), bis (pinacolato) diboro (102 g, 402 mmol) e KOAc (79,0 g, 805 mmol) em dioxano (830 ml) foi desgaseificada e purgada com nitrogênio 3 vezes, e foi adicionado Pd(dppf)Cl> (3,93 g, 5,37 mmol). A mistura de reação foi agitada a 120

ºC durante 4 h sob nitrogênio. A mistura foi resfriada a 25 ºC, vertida em água (1 1) e extraída com EtOAc (3 x 500 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (800 ml), secas sobre sulfato de sódio e purificadas por cromatografia em gel de sílica. O produto foi lavado com metanol (200 ml), filtrado e o bolo de filtração foi seco para fornecer o composto do título (65 g) como um sólido branco. 'H NMR (CDCl3, 400 MHz) 5 (ppm) 7,26-7,42 (m, 5H), 6,74 (df, J= 7,6 Hz, 1H), 5,08 (s, 2H), 2,76 (q, J = 7,2 Hz, 2H ), 1,25 (s, 12 E), 1,06 (t, J= 7,6 Hz, 3H).

Preparação 9: 1l-benzil-4-imino-l,4-dihidropiridin-3- amina H2oN pl da

[00128] Foi adicionado brometo de benzil (306 g, 1,79 mol) a uma solução de piridina-3,4-diamina (200 g, 1,8 mol) em ACN (17,0 1) e a mistura de reação foi agitada a 15 ºC por 12 h, filtrada e o bolo de filtração foi seco sob vácuo para fornecer o composto do título (250 g) como um sólido branco. 'H NMR (ds-DMSO, 400 MHz) 5 (ppm) 8,02 (dd, J = 7,2, 1,6 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,34-7,41 (m, 5H), 6,79 (dy J = 6,8 Hz, 1H), 5,62 (s, 2H), 5,36 (s, 2H).

Preparação 10: 5-benzil-2-(6-bromo-lH-indazol-3-il)- S5H-imidazo[4,5-c]piridina Br.

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INS NA (a) 6-bromo-1H-indazol-3-il-carbaldeído

[00129] Foi adicionada gota a gota uma solução de NaNO, (704 gq, 10,2 mol) em água (1 1) a uma solução de 6-bromo-1H- indol (400 g, 2,0 mol) em acetona (7 1) a 10 ºC. A mistura de reação foi agitada a 10 ºC durante 30 min., HCl 3M aquoso (437 ml) foi adicionado lentamente com agitação vigorosa, mantendo a temperatura interna entre 10 e 25 ºC. A solução foi agitada a 20 ºC durante 3 h e concentrada enquanto se mantinha a temperatura abaixo de 35 “ºC. O sólido foi recolhido por filtração. O bolo de filtração foi lavado com 1:2 éter de petróleo:MTBE (800 ml). Os sólidos foram recolhidos por filtração e secos sob vácuo para proporcionar o intermediário do título (450 g) como um sólido marrom- preto. !'H NMR (CH;OD, 400 MHz) 5 (ppm) 7,77 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H), 7,22 (dd, J = 8,4, 2,4 Hz, 1H), 5,70 (s, 1H ).

(b) 5-benzil-2- (6-bromo-lH-indazol-3-il)-5H- imidazo[4,5-c]piridina

[00130] Para uma solução agitada de 6-bromo-lH-indazol- 3-il-carbaldeído (150,0 g, 666 mmol) e l1-benzil-4-imino-1,4- dihidropiridin-3-amina (127,5 g, 639,9 mmol) em DMF (750 ml) foi carregado NaHSO3 (83,2 g, 799,9 mmol) e a mistura de reação foi agitada durante 6 h a 140 ºC e vertida em água (3,5 1). O precipitado foi filtrado e lavado com água (1 1)

para fornecer o composto em epígrafe (180 gq) como um sólido marrom-preto. 'H NMR (ds-DMSO, 400 MHz) 5 (ppm) 8,69 (s, 1H) 8,71 (df, J = 7,2 Hz, 1H) 8,37 (dy, J = 8,4 Hz, 1H) 8,07 (d, J= 6,4 Hz, 1H) 7,97 (s, 1H) 7,38-7,43 (m, 3H) 7,50-7,54 (m, 4H) 5,87 (s, 2H). Preparação 11: B5-benzil-2-(6-bromo-lH-indazol-3-il)- 4,5,6,7-tetrahidro-lH-imidazo[4,5-c]piridina Br. —N N

[00131] Foi adicionado NaBH. (12,9 g, 341,3 mmol) em porções a uma solução de 5-benzil-2-(6-bromo-lH-indazol-3- il) -5H-imidazo[4,5-c]piridina (23,0 g, 56,9 mmol) em MeOH (200 ml) e THF (1 1) e a mistura de reação foi agitada a 50 ºC durante 2 h. Foi adicionado ácido acético (10 eq), a solução foi concentrada até à secura e purificada por cromatografia em gel de sílica (30 g de sílica, 0-10% de Meo0OH / DCM com 0,1% de TEA) para fornecer o composto do título (6,0 g). !'H NMR (ds-DMSO, 400 MHz) 5 (ppm) 8,24 (d, = 8,0 Hz, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,28 - 7,37 (m, 7H), 3,74 (s, 2H), 3,48 (s largo, 2H), 2,80 (s, 2H), 2,66 (s, 2H). Preparação 12: 5-benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2-etil-5- fluorofenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-1H- imidazo[4,5-c]piridina

F BnO. O

HNK N

(a) terc-butil 5-benzil-2-(6-bromo-1-(terc- butoxicarbonil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-lH- imidazo[4,5-c ]piridina-l-carboxilato

[00132] Duas reações foram realizadas em paralelo. Uma suspensão de 5-benzil-2-(6-bromo-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7- tetrahidro-lH-imidazo[4,5-c]piridina (80 g, 196 mmol ), dicarbonato de di-terc-butil (128 g, 587,8 mmol, 135 ml) e TEA (79,3 g, 784 mmol, 109 ml) em DCM (1 1) foi agitada a 20 ºC durante 12 h. As duas suspensões de reação foram combinadas, concentradas até a secura e purificadas por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo: EtOAc 10:1 —- 0:1) para fornecer o intermediário do título (170,0 g).

(b) 5-benzil-2- (6-bromo-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7- tetrahidro-lH-imidazo[4,5-c]piridina

[00133] Duas reações foram realizadas em paralelo. Uma solução do produto da etapa anterior (85 g, 140 mmol) e HCl 4M em MeOH (400 ml) em DCM (400 ml) foi agitada a 25 ºC durante 12 h. As misturas de reação foram combinadas e concentradas até a secura, DCM (250 ml) foi adicionado com agitação e a mistura de reação foi agitada durante 30 min. e filtrada. O bolo do filtro foi lavado com DCM (2 x 20 ml) e seco para fornecer o composto do título (85 g) como um sólido esbranquiçado.

(c) 5-benzil-2-(6-(4- (benziloxi)-2-etil-5- fluorofenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-l1H- imidazo[4,5-c]piridina

[00134] Oitenta e cinco reações foram realizadas em paralelo. O produto da etapa anterior (1,0 g, 2,5 mmol), 2-

(4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-dioxaborolano (873 mg, 2,5 mmol) e Pd(PPh3). (227 mg, 196 umol) foram dissolvidos em uma mistura de água (4 ml) e dioxano (10 ml). O frasco de reação foi borbulhado com nitrogênio por 2 min. e NasxCO3z (779 mg, 7,4 mmol) foi adicionado rapidamente sob nitrogênio. A mistura de reação foi aquecida a 130 ºC durante 1,5 h. As 85 misturas de reação foram combinadas e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em DCM (500 ml) e purificado por cromatografia em gel de sílica (150 g de sílica, eluída com DCM: THF (6:1 a 3:1)) para fornecer o composto do título (50 g) como um sólido esbranquiçado.

Preparação 13: 5-etil-2-fluoro-4-(3-(4,5,6,7- tetrahidro-lH-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-lH-indazol-6- il) fenol

F HO. Õ HNK N

[00135] Uma mistura de 5-benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2- etil-5-fluorofenil)-lH-indazol-3-1il)-4,5,6,7-tetrahidro-lH- imidazo[4,5-c]piridina (44,5 g, 79,8 mmol), Pd(OH)2/C (25 g, 2,7 mmol, 50% de pureza) e TFA (44,5 g, 390 mmol, 28,9 ml) em MeOH (500 ml) foi agitada sob hidrogênio (50 Psi) durante 4 he filtrada. Pd(OH)2/C (25 g, 2,7 mmol, 50% de pureza) foi adicionado ao filtrado e a suspensão resultante foi agitada sob hidrogênio (50 Psi) a 25 ºC durante 12 h. A suspensão foi combinada com a suspensão de uma reação anterior na escala de 5,5 ge filtrada. O bolo do filtro foi lavado com 20:1 MeOH:TFA (2 x 200 ml). O filtrado combinado foi concentrado e HCl 4 M em MeOH (200 ml) foi adicionado ao resíduo com agitação. A suspensão resultante foi concentrada, empastada com MeOH (80 ml) e agitada durante 30 min. Precipitou um sólido branco. O sólido foi filtrado, o bolo do filtro foi lavado com MeOH (2 x 10 ml) e seco sob vácuo para fornecer o sal de HCl do composto do título (24,8 g) como um sólido esbranquiçado. (m/z): [M + H]* calculado para Ca1H2oFNsO 378,17 encontrado 378,1. 'H NMR (ds-DMSO, 400 MHz) 5 (ppm) 8,23 (dy, J = 8,4 Hz, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,35 (dy, J = 11,2 Hz, 1H), 6,90 - 6,97 (mM , 2H), 4,57 (s, 2H), 3,72 (t, J= 6,0 Hz, 2H), 3,22 (t, J= 6,0 Hz, 2H), 2,51 (q, J=7,6 Hz, 2H), 1,04 (t, J=7,6 Hz, 3H).

Exemplo 2: ((1S,5R)-2-azabiciclo[3.1.0]hexan-1-il) (2- (6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3 -il)- 1,4,6,7-tetra-hidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona c-1 PP. Ho,

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[00136] 5-etil-2-fluoro-4-(3-(4,5,6,7-tetrahidro-l1H- imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-lH-indazol-6-il)fenol (4,0 dg, 10,60 mmol), ácido (1s,5r) -2- (terc-butoxicarbonil)-2- azabiciclo[3.1.0]hexano-l-carboxílico (3,61 g, 15,90 mmol) e DIPEA (7,40 ml, 42,4 mmol) foram dissolvidos em DMF (60 ml); em seguida, foi adicionado HATU (8,06 g, 21,20 mmol) e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. Em seguida, foi adicionada hidrazina (0,665 ml, 21,20 mmol) para clivar subprodutos indesejados, a mistura de reação foi então concentrada para cerca de 20 ml. Esta solução foi gotejada em 200 ml de água para precipitar o produto, que foi então recolhido por filtração e seco sob vácuo. O sólido resultante foi dissolvido em dioxano (40 ml) e água (8 ml); depois adicionou-se ácido clorídrico 4M em dioxano (40 ml, 160 mmol) e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, a solução foi congelada e liofilizada, e o sólido resultante foi purificado por HPLC preparativa (gradiente de acetonitrila/água 5-70%, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (2,69 g, rendimento de 42%). (m/z): [M + H]* calculado para C2o7H2;FNsO2 487,55 encontrado 487,7. *'H NMR (400 MHz, DMSO-ds) 5 13,15 (s, 1H), 12,42 (s, 1H), 9,79 (s, 1H), 8,29 (dy, J = 8,4 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H) , 7,07 (df, J = 8,4 Hz, 1H), 6,99 (dy, J = 11,9 Hz, 1H), 6,88 (dy, J = 9,1 Hz, 1H), 4,51 (m, 2H), 3,92 (m, 2H) , 3,99 (m, 1H), 2,65 (my, 3H), 2,47 (q, JIJ = 7,5 Hz, 2H), 1,89 (m, 1H) 1,72 (m, 2H), 0,98 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 0,89 (m, 2H).

Ensaios biológicos

[00137] O composto 1 foi caracterizado em um ou mais dos seguintes ensaios biológicos.

Ensaio 1: Ensaios bioquímicos de JAK quinase

[00138] Un painel de quatro ensaios bioquímicos LanthaScreen JAK (JAK 1, 2, 3 e Tyk2) foi realizado em um tampão de reação de quinase comum (HEPES 50 mM, pH 7,5, Brij- 0,01%, MgCl>2 10 mM e EGTA 1 mM). As enzimas JAK marcadas com GST recombinante e o substrato de peptídeo STAT1 marcado com GFP foram adquiridos da Life Technologies.

[00139] O composto com diluição em série foi pré- incubado com cada uma das quatro enzimas JAK e o substrato em 384 microplacas de poço brancas (Corning) à temperatura ambiente durante lh. ATP foi adicionado subsequentemente para iniciar as reações de quinase em 10 ul de volume total, com 1% de DMSO. As concentrações enzimáticas finais para JAKI, 2, 3 e Tyk2 são 4,2nM, 0,1 nM, 1 nM e 0,25 nM, respectivamente; as concentrações correspondentes de Km ATP usadas são 25 uM, 3 uM, 1,6 UM e 10 UM; enquanto a concentração de substrato é de 200 nM para todos os quatro ensaios. As reações da quinase continuaram por 1 hora à temperatura ambiente antes de serem adicionados 10 pl de uma preparação de EDTA (10 mM de concentração final) e anticorpo Tb-anti-pSTAT1 (pTyr701) (Life Technologies, 2 nM concentração final) em tampão de diluição TR-FRET (Life Technologies). As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 1 hora antes de serem lidas no leitor EnVision (Perkin Elmer). Os sinais de taxa de emissão (520 nm/495 nm) foram registrados e usados para calcular a percentagem de valores de inibição com base no DMSO e nos controles de fundo.

[00140] Para análise de dose-resposta, os dados percentuais de inibição foram inseridos em um gráfico versus as concentrações de compostos, e os valores de ICso foram determinados a partir de um modelo de ajuste robusto de 4 parâmetros com o programa Prism (GraphPad Software). Os resultados foram expressos como pICso (logaritmo negativo de ICso) e, posteriormente, convertidos em pK:;i (logaritmo negativo da constante de dissociação, K:i) usando a equação de Cheng-Prusoff.

[00141] O composto 1 exibiu a seguinte potência enzimática.

Tabela 1 PK: PK: PK: PK: Lose | nz | 6 | 6 | Ensaio 2: Inibição de pSTAT5 estimulada por IL-2 em células T Tall-1

[00142] A potência dos compostos de teste para inibição da fosforilação de STAT5 estimulada pela interleucina-2 (IL- 2) foi medida nas células T Tall-l1 humanas usando AlphaLisa. Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK1/3, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK1/3.

[00143] STATS fosforilado foi medido através do kit pSTATS AlphaLISA (Tyr694/699) (PerkinElmer). As células T humanas da linhagem celular Tall-l foram cultivadas a 37 “ºC, em incubadora umidificada a 5% de CO, em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 15% de soro fetal bovino inativado pelo calor (SFB, Life Technologies), 2mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM de HEPES (Life Technologies) e 1X Pen/Strep (Life Technologies). os compostos foram diluídos em série em DMSO e distribuídos acusticamente em poços vazios. Os meios de ensaio (DMEM sem fenol vermelho (Life Technologies) suplementados com FBS a 10% (ATCC)) foram distribuídos (4 pl/poço) e as placas foram agitadas a 900 rpm durante 10 minutos. As células foram semeadas a 45.000 células/poço nos meios de ensaio (4 nul/poço) e incubadas a 37ºC, 5% de CO7 durante 1 hora, seguida pela adição de IL-2 (R&D Systems; concentração final 300 ng/ml) em meios de ensaio pré-aquecidos (4 pl) durante minutos. Após a estimulação com citocinas, as células foram lisadas com 6 pl de tampão de lise 3x AlphaLisa (PerkinElmer) contendo lx PhosStop e comprimidos Complete (Roche). O lisado foi agitado a 900 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente (TA). STATS fosforilado foi medido através do kit pSTATS AlphaLisa kit (PerkinElmer). A mistura de pérolas aceptoras recém-preparadas foi distribuída no lisado (5 ul) sob luz verde filtrada <100 lux. As placas foram agitadas a 900 rpm durante 2 minutos, giradas levemente e incubadas durante 2 horas a TA no escuro. As pérolas doadoras foram distribuídas (5 917l) sob luz verde filtrada <100 lux. As placas foram agitadas a 900 rpm durante 2 minutos, giradas levemente e incubadas durante a noite em TA no escuro. A luminescência foi medida com excitação a 689 nm e emissão a 570 nm usando um leitor de placa EnVision (PerkinElmer) sob luz verde filtrada de <100 lux.

[00144] Para determinar a potência inibitória dos compostos de teste em resposta a IL-2, a intensidade de emissão mediana das pérolas ligadas a pSTATS foi medida em uma linhagem celular T humana. Os valores de ICso foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da intensidade do sinal versus concentração do composto. Os dados foram expressos em valores de pICso (logaritmo decádico negativo ICso) (médiatdesvio padrão). O composto 1 exibiu um valor de pICso de 7,8 neste ensaio.

Ensaio 3: Ensaio de potência JAK celular: inibição de PSTAT6 estimulado por IL-13 em células BEAS-2B

[00145] O ensaio de potência celular AlphaScreen JAKI foi realizado ao medir a fosforilação de STAT6 induzida por interleucina-13 (IL-13, R&D Systems) em células epiteliais de pulmão humano BEAS-2B (ATCC). O anticorpo anti-STAT6 (Cell Signaling Technologies) foi conjugado com pérolas aceptoras AlphaScreen (Perkin Elmer), enquanto o anticorpo anti-pSTAT6 (pryr641) (Cell Signaling Technologies) foi biotinilado usando EZ-Link Sulfo-NHS-Biotina (Thermo Scientific).

[00146] As células BEAS-2B foram cultivadas a 37 “ºC em uma incubadora umidificada com 5% de CO, em meio 50% DMEM/50% F-12 (Life Technologies) suplementado com FBS a 10% (Hyclone), penicilina 100 U/ml, 100 pg/ml estreptomicina (Life Technologies) e GlutaMAX 2 mM (Life Technologies). No dia 1 do ensaio, as células foram semeadas a uma densidade de 7.500 células/poço em placas brancas com 384 poços revestidos com poli-D-lisina (Corning) com 25 ul de meio, e ficaram durante a noite na incubadora para aderência. No dia 2 do ensaio, o meio foi removido e substituído com 12 ul de tampão de ensaio (Hank's Balanced Salt Solution, 25 mM HEPES, e l mg/ml de albumina sérica bovina/BSA) contendo dose- respostas dos compostos em teste. O composto foi diluído em série em DMSO e, então, diluído 1000 vezes nos meios para chegar à concentração final de 0.1% de DMSO. As células foram incubadas com os compostos de teste a 37 ºC durante 1 h, seguida pela adição de 12 pl de IL-13 pré-aquecido (80 ng/ml em tampão de ensaio) para estimulação. Após incubação a 37ºC durante 30 min., o tampão do ensaio (contendo composto e IL-

13) foi removido, e 10 ul de tampão de lise celular (25 mM HEPES, 0,1% SDS, 1% NP-40, 5 mM de MgClo, 1,3 mM, 1 mM de EDTA, EGTA e suplementado com os inibidores de protease Ultra mini e PhosSTOP da Roche Diagnostics). As placas foram agitadas a temperatura ambiente por 30 minutos antes da adição dos reagentes de detecção. Uma mistura de pérolas aceptoras conjugadas anti-biotina-pSTAT6 e anti-STAT6 foi adicionada primeiro e incubada à temperatura ambiente durante 2 h, seguida pela adição de pérolas doadoras conjugadas a estreptavidina (Perkin Elmer). Após um mínimo de 2h de incubação, as placas de ensaio foram lidas no leitor de placa EnVision. Os sinais de luminescência AlphaScreen foram gravados e usados para calcular a valores percentuais de inibição com base em DMSO e controles de fundo.

[00147] Para análise de dose-resposta, os dados percentuais de inibição foram inseridos em um gráfico versus as concentrações de compostos, e os valores de ICso foram determinados a partir de um modelo de ajuste robusto de 4 parâmetros com o programa Prism. Os resultados também podem ser expressos como o logaritmo negativo do valor ICso, pICso. O composto 1 exibiu um valor de pICso de 8 neste ensaio.

[00148] Ensaio 4: Ensaio de potência JAK celular: Inibição de IL-2/anti-CD3 estimulada por IFNy em PBMCs humanos

[00149] À potência do composto de teste para a inibição de interleucina-2 (IL-2)/interferon gama estimulado por anti-CD3 (IFNy) foi medida em células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) isoladas de sangue total humano

(Stanford Blood Center). Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK, este ensaio oferece uma medida de potência celular de JAK.

(1) Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram isoladas de sangue total humano de dadores saudáveisusando um gradiente de Ficoll. As células foram cultivadas em 37 ºC, incubadora umidificada com 5% de CO; em RPMI (Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS, Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies ) e 1X Pen/Strep (Life Technologies). As células foram semeadas a 200.000 células/poço em meio (50 pl) e cultivadas por 1 h. O composto foi diluído em série em DMSO e depois diluído mais 500 vezes (para uma concentração de ensaio final 2x) no meio. As diluições do composto de teste (100 unul/poço) foram adicionadas às células e incubadas a 37 ºC, 5% de CO, por 1 h, seguido pela adição de IL-2 (R&D Systems; concentração final de 100 ng/ml) e anti -CD3 (BDBiosciences; concentração final 1 ug/ml) em meio de ensaio pré-aquecido (50 uL) por 24 h.

(2) Após estimulação com citocinas, as células foram centrifugadas a 500 g por 5 min. e os sobrenadantes removidos e congelados a -80 ºC. Para determinar a potência inibidora dos compostos de teste em resposta a IL-2/anti-CD3, as concentrações de IFNy no sobrenadante foram medidas via ELISA (RED Systems). Os valores de ICso foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da concentração de IFNy vs. concentração do composto. Os dados são expressos como valores de pICso (logaritmo decádico negativo TICs). O composto 1 exibiu um valor de pICso de cerca de 6,7 nesse ensaio.

Ensaio 5: Ensaio de potência JAK celular: Inibição de pSTAT5 estimulada por IL-2 em células T CD4+

[00150] A potência do composto de teste para a inibição da fosforilação de STATS estimulada por interleucina-2 (IL- 2) /anti-CD3 foi medida em células T CD4-positivas (CD4 +) em células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) isoladas de sangue total humano (Stanford Blood Center usando citometria de fluxo. Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK, este ensaio oferece uma medida de potência celular de JAK.

[00151] As células T CD4 + foram identificadas usando um anticorpo anti-CD4 conjugado com ficoeritrobilina (PE) (Clone RPA-T4, BD Biosciences), enquanto um anticorpo anti- pSTAT5 conjugado com Alexa Fluor 647 (pY694, Clone 47, BD Biosciences) foi usado para detectar STAT5 fosforilação.

(1) O protocolo do Ensaio 4 parágrafo (1) foi seguido, com a exceção de que a estimulação de citocina com IL-2/anti- CD3 foi realizada por 30 min. em vez de 24 h.

(2) Após a estimulação de citocinas, as células foram fixadas com solução de correção pré-aquecida (200 ul; BD Biosciences) por 10 min. a 37 ºC, 5% de CO», lavadas duas vezes com tampão DPBS (1 ml, Life Technologies) e ressuspensas em tampão Perm III gelado (1000 p1pl, BD Biosciences) durante 30 min. a 4 ºC. As células foram lavadas duas vezes com FBS a 2% em DPBS (tampão FACS) e, em seguida, ressuspensas em tampão FACS (100 upl) contendo PE anti-CD4 (diluição 1:50) e anti-CD3 anti-CD3Alexa Fluor 647 (diluição

1:5 ) por 60 min. em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes em tampão FACS antes de serem analisadas usando um citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences). Para determinar a potência inibidora do composto de teste em resposta a IL-2/anti-CD3, a intensidade fluorescente média (MFI) de pSTATS foi medida em células T CD4+. Os valores de ICso foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da MFI versus concentração dos compostos. Os dados são expressos como valores de pICso (logaritmo decádico negativo ICso). O composto 1 exibiu um valor de pICsoºo de cerca de 7,7 nesse ensaio.

Ensaio 6: Ensaio de potência JAK celular: inibição de CCL2 estimulado por IL-6 (MCP-1) em PBMCs humanas

[00152] A potência do composto de teste para a inibição da produção de CCL2 (MCP-1) estimulada por interleucina-6 (IL-6) foi medida em células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) isoladas de sangue total humano (Stanford Blood Center). Como a IL-6 sinaliza por meio de JAK, este ensaio fornece uma medida distal da potência celular de JAK.

(1) O protocolo do Ensaio 4, parágrafo (1) foi seguido até a incubação com os compostos de teste. No presente ensaio, após os compostos de teste terem sido adicionados aos poços e incubados, foi adicionado IL-6 (R&D Systems; concentração final de 10 ng/ml) em meio de ensaio pré- aquecido (50 uL).

(2) Após estimulação com citocinas por 48 h, as células foram centrifugadas a 500 g por 5 min. e os sobrenadantes foram removidos e congelados a -80 ºC. Para determinar a potência inibidora do composto de teste em resposta a IL-6, as concentrações de CCL2 (MCP-l1) de sobrenadante foram medidas via ELISA (R&D Systems). Os valores de ICso foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da concentração de CCL2/MCP-1 vs. concentração do composto. Os dados são expressos como valores de pICso (logaritmo decádico negativo ICso). O composto 1 exibiu um valor de pICsoº de cerca de 6,5 nesse ensaio.

Ensaio 7: Ensaio farmacodinâmico: inibição do pSTAT3 induzido por IL6 em ratos

[00153] À capacidade de uma única administração intravítrea do composto de teste para inibir o pSTAT3 induzido por IL-6 foi medida em homogenatos de retina/coroide de rato.

[00154] Uma formulação de solução foi preparada dissolvendo o composto 1 em 1% HPMC E5 + 15% HPBCD, pH 7 para atingir uma concentração alvo de 10 mg/ml. Ratos Lewis fêmeas receberam, por via intravítrea (IVT) (5 pl por olho), o veículo, veículo mais IL-6 de rato (Peprotech; 0,5 ug) ou uma combinação de IL-6 mais composto (0,5 1ug IL-6 e 45 n1g composto 1). Os tecidos oculares foram dissecados uma hora após a injeção IVT. Os tecidos retina/coroide foram homogeneizados e os níveis de pSTAT3 foram medidos usando um AlphaLisa (PerkinElmer). A inibição percentual de pSTAT3 induzido por IL-6 foi calculada em comparação com o veículo e os grupos de IL-6.

[00155] Uma dose de 45 pg do composto 1 inibiu o pSTAT3 induzido por IL-6 em 84% nos homogenatos de retina/coroide.

Ensaio 8: Farmacocinética pulmonar e plasmática em camundongos

[00156] As concentrações plasmáticas e pulmonares do composto 1 e suas razões foram determinadas da seguinte maneira. Camundongos BALB/c de Charles River Laboratories foram usadosno ensaio. O composto 1 foi formulado em 20% de propilenoglicol em tampão citrato (pH 4) a uma concentração de 0,324 mg/ml como uma solução. Foram introduzidos 50 pl da formulação da solução na traqueia de um camundongo por aspiração oral. Em vários pontos de tempo (0,167, 2, 6 horas) após a dosagem, as amostras de sangue foram removidas por punção cardíaca e os pulmões intactos foram excisadosdos camundongos. As amostras de sangue foram centrifugadas (centrífuga Eppendorf, 5804R) por 4 minutos a aproximadamente 12.000 rpm a 4 ºC para coletar o plasma. Os pulmões foram acolchoados secos, pesadose homogeneizados em 0,6mlL de água estéril. As concentrações plasmáticas e pulmonares do composto 1 foram determinadas por análise LC- MS contra padrões analíticos construídos em uma curva padrão na matriz de teste. A exposição sustentada nos pulmões foi encontrada com uma AUC do pulmão (0-6h) de 43,5 pg h/g. A razão pulmão-para-plasma foi determinada como a razão da AUC do pulmão em uyg h/g para a AUC do plasma em pg h/ml (onde AUC é convencionalmente definida como a área sob a curva da concentração do composto de teste vs. tempo). A relação AUC pulmão/plasma foi de 59,6, destacando a alta exposição pulmonar versus plasma.

Ensaio 9: Triagem Kinome e coeficiente GINI

[00157] Os compostos 1 e C-1 foram rastreados em relação a outras quinases para avaliar seu perfil de seletividade.

[00158] As cepas de fago T7 marcadas com quinase cresceram em paralelo em blocos de 24 poços em um hospedeiro de E. coli derivada da cepa BL21. A bactéria E. coli foi cultivada em fase logarítmica e infectada com fago T7 de um estoque congelado (multiplicidade de infecção = 0,4) e incubada com agitação a 32 ºC até a ruptura da célula (90- 150 minutos). Os lisados foram centrifugados (6.000 x g) e filtrados (0,2 pum) para remover os resíduos celulares. As quinases restantes foram produzidas em células HEK-293 e posteriormente marcadas com DNA para detecção por qPCR.

[00159] Pérolas magnéticas revestidas com estreptavidina foram tratadas com pequenas moléculas ligantes biotiniladas durante 30 minutos à temperatura ambiente para gerar resinas de afinidade para os ensaios de quinase. As pérolas ligadas foram bloqueadas com excesso de biotina e lavadas com tampão de bloqueio (SeaBlock (Pierce), 1% de BSA, 0,05% de Tween 20, 1 mM de DTT) para remover o ligante não ligado e reduzir a ligação não específica do fago. As reações de ligação foram montadas ao combinar quinases, pérolas de afinidade ligadas e compostos de teste em tampão de ligação 1 x (20% de SeaBlock, 0,17x PBS, 0,05% de Tween 20, 6 mM de DTT). Os compostos do teste foram preparados como estoques de 40x em 100% de DMSO e diluídos diretamente no ensaio. Todas as reações foram realizadas em 384 poços em placas de polipropileno em um volume final de 0,04 ml. As placas de ensaio foram incubadas à temperatura ambiente com agitação durante 1 hora e as pérolas de afinidade foram lavadas com tampão de lavagem (1x PBS, 0,05% de Tween 20). As pérolas foram então ressuspendidas em tampão de eluição (1x PBS, 0,05% de Tween 20, 0,5 1uM de ligante de afinidade não-biotinilado) e incubadas à temperatura ambiente com agitação durante 30 minutos. A concentração de quinase nos eluatos foi medida por pPCR.

[00160] Os compostos foram filtrados a 1 p|WM e os resultados das interações de ligação da triagem primária nas Tabelas 2 e 3 são relatados como “% de inibição” (=100- ((sinal do composto de teste-sinal do controle positivo)/((sinal do controle negativo)-(sinal do controle positivo) )x100), onde o controle negativo é DMSO e o controle positivo é um composto de controle.

Tabela 2 Comp osto/Quin Ú E d ase LK DK7 DK9 SFIR | PHB6 |SK3B q 4 Pd d d d

ENSSNSNSSNANAS Tabela 3 Com KAC- SNK1 posto/Qu ALPH | LKA |LK RC YK

D inase A

ESSSSSSSSSS c-1 |8,5 |9 5 o 9,9 |8,9 |2 9 6

[00161] Verificou-se que o composto 1 exibe inibição de ligação significativamente menor para EPHB6, KIT, PAK4, SRC, CDK7 e CDK9 do que o composto C-1. O composto 1 também teve menor inibição de ligação para várias outras quinases.

[00162] Ambos os compostos 1 e C-l foram selecionados contra 35 quinases diferentes. O coeficiente de Gini foi determinado para ambos os compostos. O composto 1 tinha um coeficiente GINI de 0,60 e o composto C-l tinha um coeficiente GINI de 0,46. O coeficiente de Gini é usado para expressar a seletividade de um composto em relação a um painel de quinases (Graczyk, J. Med. Chem., 2007, 50, 5773- 5779). Um número maior corresponde a um composto mais seletivo.

[00163] A única diferença estrutural entre o composto 1 e o composto C-1 é a presença de um grupo flúor no núcleo. Esta diferença estrutural mostrou ter um efeito importante na seletividade do cinoma do composto.

[00164] Ensaio 10: Ensaio de viabilidade celular

[00165] Um ensaio de viabilidade/citotoxicidade celular luminescente CellTiter-Glo foi realizado em células epiteliais de pulmão humano BEAS-2B (ATCC) sob a condição de crescimento normal.

[00166] As células foram cultivadas a 37 ºC em uma incubadora umidificada com 5% de CO, em meio 50% DMEM/50% F- 12 (Life Technologies) suplementado com FBS a 10% (Hyclone), penicilina 100 U/ml, 100 ug/ml estreptomicina (Life

Technologies) e GlutaMAX 2 mM (Life Technologies). No dia 1 do ensaio, as células foram semeadas a uma densidade de 500 células/poço em placas de cultura de tecidos de 384 poços brancas (Corning) com 25 pl de meio e foram deixadas aderir durante a noite na incubadora. No dia 2 do ensaio, foram adicionados 5 1nl de meio contendo dose-respostas dos compostos de teste e incubadas a 37 ºC durante 48 h. Foram adicionados em seguida 30 1nl de solução de detecção CellTiter-Glo (Promega), misturados em um agitador orbital por 5 minutos e incubados por mais 10 minutos antes de serem lidos no leitor EnVision. Os sinais de luminescência foram registrados e os valores percentuais de controle de DMSO foram calculados.

[00167] Para a análise de dose-resposta, os dados de controle de DMSO percentuais foram plotados em relação às concentrações de composto para derivar curvas de dose- resposta por linha conectando cada ponto de dados. A concentração na qual cada curva cruza o limite de inibição de 15% é definida como CC15.

[00168] Espera-se que os compostos de teste que exibem um valor de CCis mais alto neste ensaio tenham menos probabilidade de causar citotoxicidade.

[00169] O composto 1 exibiu um —pCCis de <5 (correspondendo a um CC15s de> 10 uM, enquanto o composto C-1 exibiu um pCC15s de 5,8 (correspondendo a um CC15s de 1,58 puM). Portanto, o composto 1 é significativamente menos provável de causar citotoxicidade do que o composto C-1 com base neste ensaio.

[00170] A única diferença estrutural entre o composto 1 e o composto C-1 é a presença de um grupo flúor no núcleo. Esta diferença estrutural mostrou ter um efeito importante na citotoxicidade do composto.

Ensaio 10: Ensaio de potência JAK celular: Inibição de p-STAT3 estimulado por transinalização de IL-6 em células endoteliais microvasculares primárias da retina humana

[00171] A potência celular do composto de teste para a inibição da fosforilação STAT3 induzida (IL6+sIL6Ra) por transinalização de IL-6 foi medida em células endoteliais microvasculares retinianas humanas primárias (HRMECsS). A transinalização de IL-6 é mediada pelo receptor beta de IL- 6 (gpl30), que é acoplado intracelularmente às enzimas JAK. Após o engajamento e dimerização da gpl30, os JAKs são ativados e fosforilam diretamente STAT3. Assim, este ensaio fornece uma medida da potência celular de JAK. Foram semeadas HRMECs (Cell Systems, Kirkland WA) em placas de ensaio de 96 poços de fundo plano estéreis, tratadas com cultura de tecidos, revestidas com Attachment Factor" (Cell Systems, Kirkland WA) a uma densidade de 1x10º células por poço. As culturas de HRMEC foram cultivadas por 3 dias a 37 ºC, 95% de umidade, 5% de CO, em meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, fatores de crescimento Culture Boost!" e antibiótico BacOff6 (Cell Systems, Kirkland WA). O composto de teste foi diluído em série em DMSO e, em seguida, preparado em 1,11x concentração de ensaio final em meio de cultura completo. As células foram incubadas com 90 1pl de composto de teste 1,11x durante 1 hora a 37 ºC seguido pela adição de 10 pl 10x IL-6 / sIL6RM (PeproTech, Inc.;

concentração final 500 pM IL-6, 5 nM sIL6RaM) em meio de ensaio pré-aquecido por 30 minutos. Após a estimulação, os sobrenadantes foram removidos e o material celular foi coletado em 50 pl de tampão de lise (kit de ensaio AlphaLISAO SureFireê Ultra", PerkinElmer) contendo inibidores de fosfatase (PhosSTOP!"!, Roche) e armazenado a -80 “ºC até a análise. Para determinar a potência inibidora do composto de teste, os níveis de p-STAT3 foram medidos usando o kit de ensaio AlphaLISAGO SureFirebo Ultra"" p-STAT3 (Tyr705) (PerkinElmer) de acordo com as instruções do fabricante. Os valores de ICso foram determinados a partir de curvas de inibição de % p-STAT3 Alpha Signal vs. concentração de composto de teste (ajuste de curva realizado com GraphPad Prism 7.0). Os dados são expressos como pICso (logio negativo (concentração do composto de teste)). O composto 1 exibiu um pICso de 6,3 + 0,1 em três experiências independentes.

[00172] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a aspectos específicos ou suas modalidades, aqueles que são versados na técnica compreenderão que diversas alterações podem ser feitas ou equivalentes podem ser substituídos, sem se afastar do verdadeiro espírito e do escopo da invenção. Além disso, na medida do permitido pelos estatutos e pelos regulamentos aplicáveis sobre patentes, todas as publicações, patentes e pedidos citados aqui são incorporados por referência em sua totalidade, da mesma forma como se cada documento tivesse sido incorporado individualmente por sua referência.

O QUE SE REIVINDICA É:

1. Um composto de fórmula:

F HO. Õ O F H

N NOS | y

EN ON

NH ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico deste.

2. Um composto de fórmula:

F HO. Õ O F H

N NOS | y

EN ON NH .

3. Uma composição farmacêutica caracterizada por compreender o composto da reivindicação 1 ou 2, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

4, A composição farmacêutica da Reivindicação 3, caracterizada pela composição ser adequada para aplicação ocular.

5. A composição farmacêutica da Reivindicação 4, caracterizada pela composição ser adequada para injeção intravítrea.

6. A composição farmacêutica da Reivindicação 5, caracterizada pela composição ser uma suspensão.

7. Um processo para preparar um composto de fórmula 1

F HO. Õ O F H

N NOS | y

EN ON

NH 1 Ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, o processo caracterizado por compreender: (a) reação de um composto de fórmula 6:

F HO: As

N A o / | N HN-N H 6 com um composto de fórmula 7-PG: o PG

RAT WE N ” 7-PG caracterizado por Rº ser hidroxil ou um grupo abandonador e PG ser um grupo protetor de amino, para fornecer o composto 1-PG:

F HO. O F S&S PG

CX < yo.

ON HN-N H ; 1-PG (b) desproteger o composto 1-PG; e (c) a título facultativo, preparar um sal farmaceuticamente aceitável para fornecer um composto de fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

8. O processo da reivindicação 7, caracterizado por Rº ser hidroxilo.

9. O processo da reivindicação 8, caracterizado pela reação entre 6 e 7-PG ser conduzida na presença de HATU.

10. O processo da reivindicação 7, caracterizado por PG ser Boc.

11. O composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela utilização no tratamento de uma doença ocular num mamífero.

12. O composto da reivindicação 11, caracterizado pela doença ocular ser selecionada a partir do grupo consistindo em uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia retiniana e ceratoconjuntivite atópica.

13. O composto da reivindicação 12, caracterizado pela doença ocular ser edema macular diabético ou uveíte.

14. A utilização do composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizada pela fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ocular num mamífero.

15. A utilização da reivindicação 14, caracterizada pela doença ocular ser selecionada a partir do grupo consistindo em uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração “macular relacionada à idade, oclusão da veia retiniana e ceratoconjuntivite atópica.

16. A utilização da reivindicação 15, caracterizada pela doença ocular ser edema macular diabético ou uveíte.

17. Um método de tratamento de uma doença ocular em um mamífero, o método caracterizado por compreender a administração de uma composição farmacêutica, compreendendo o composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2 e um carreador farmaceuticamente aceitável, ao olho do mamífero.

18. O método da reivindicação 17, caracterizado pela doença ocular ser selecionada a partir do grupo consistindo em uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia retiniana e ceratoconjuntivite atópica.

19. O método da reivindicação 18, caracterizado pela doença ocular ser edema macular diabético ou uveíte.

RESUMO COMPOSTO INIBIDOR DE JAK 2-AZABICICLO HEXANO A invenção fornece um composto de fórmula 1

F HO. Õ O F H

N NOS | y

EN ON

NH 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, que é útil como um inibidor de JAK. A invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo o composto, métodos de uso do composto para tratar doenças suscetíveis a um inibidor de JAK e processos úteis para preparar o composto.