TWI808250B - 用於製備jak抑制劑之方法及其中間體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種製備化合物之方法，該等化合物可用作用於製備對JAK具有抑制活性之藥劑之中間體。

Description

用於製備JAK抑制劑之方法及其中間體
本發明係關於一種製備化合物之方法，該等化合物可用作用於製備藥劑之中間體。特定言之，本發明係關於製備JAK抑制劑之中間體。
JAK家族包括四個成員，JAK1、JAK2、JAK3及酪胺酸激酶2 (TYK2)。細胞激素與JAK依賴性細胞激素受體之結合誘導受體二聚合，其導致JAK激酶上之酪胺酸殘基之磷酸化，從而實現JAK活化。經磷酸化之JAK繼而結合各種STAT蛋白並將其磷酸化，該等蛋白質二聚合、於細胞核中內部化及直接調節基因轉錄，尤其導致與發炎性疾病相關聯之下游效應。JAK通常與呈均二聚體或異二聚體對之細胞激素受體相關聯。JAK家族之四個成員各者牽涉與發炎相關聯之細胞激素中之至少一者之信號傳導。因此，具有針對JAK家族之所有成員之泛活性之化學抑制劑可調節寬範圍之促發炎路徑，該等路徑有助於肺發炎性疾病，諸如嚴重哮喘、COPD及慢性肺同種異基因移植功能障礙(CLAD)。因此期望具有用於製備特異性JAK抑制劑之有效方法。
本發明係關於一種製備化合物之方法，該等化合物可用作用於製備具有對JAK之抑制活性之藥劑之中間體。
因此，於一態樣中，本發明提供一種製備式J-15 化合物或其鹽之方法： 其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基；且 PG3 為胺基保護基； 該方法包括： (a)使式J-14 化合物： 或其鹽與肼反應以得到該式J-15 化合物及 (b)視情況形成化合物J-15 之鹽。
於另一態樣中，本發明提供式J-14 化合物： 或其鹽，其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基；且 PG3 為胺基保護基。
於另一態樣中，本發明提供式J-15 化合物： 或其鹽， 其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基；且 PG3 為胺基保護基。
於另一態樣中，本發明提供一種製備式J-16 化合物或其鹽之方法： 其中 PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基； PG3 為胺基保護基； PG4 為羥基保護基；且 R為H或F； 該方法包括： (a)在鹼之存在下使式J-13 化合物： 其中X係選自由Br、I及Cl組成之群；且Y為離去基團；與式J-11 化合物反應： 以得到式J-14 化合物： 及視情況形成化合物J-14 之鹽； (b)使該式J-14 化合物或其鹽與肼反應以得到式J-15 化合物： 及視情況形成化合物J-15 之鹽； (c)在鹼、鈀觸媒及膦配位體之存在下使該式J-15 化合物或其鹽與式J-5 、J-6 或J-7 化合物反應： 其中Ra 及Rb 各者係獨立地選自C1-8 烷基，其中Ra 及Rb 可視情況連接以形成4至8員環；以得到該式J-16 化合物，及視情況形成化合物J-16 之鹽。
相關申請案之交互參照 本申請案主張2018年9月4日申請之美國臨時申請案第62/726,600號之權益，其揭示內容之全文以引用的方式併入本文中。
於一態樣中，本發明提供一種製備式J-15 化合物或其鹽之方法： 其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基；且 PG3 為胺基保護基； 該方法包括： (a)使式J-14 化合物： 或其鹽與肼反應以得到該式J-15 化合物及 (b)視情況形成化合物J-15 之鹽。
於一些態樣中，在約60℃下進行該與肼之反應。於一些態樣中，在60℃±20℃下進行該與肼之反應。
於一些態樣中，X係選自由Br、I及Cl組成之群；PG1 為烷基或苄基，其中該苄基視情況經取代；PG2 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群；且PG3 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群。
於一些態樣中，X為Br。於一些態樣中，X為Br，PG1 為苄基，PG2 為第三丁氧羰基且PG3 為苄基。
於一些態樣中，藉由以下製備化合物J-14 或其鹽： (a)在鹼之存在下使式J-13 化合物： 其中Y為離去基團，與式J-11 化合物反應： 以得到J-14 ，及 (b)視情況形成化合物J-14 之鹽。
於一些態樣中，Y為Cl。
於另一態樣中，本發明提供式J-14 化合物： 或其鹽，其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基；且 PG3 為胺基保護基。
於一些態樣中，X係選自由Br、I及Cl組成之群；PG1 為烷基或苄基，其中該苄基視情況經取代；PG2 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群；且PG3 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群。
於另一態樣中，本發明提供式I-14 化合物： 或其鹽。
於另一態樣中，本發明提供式J-15 化合物： 或其鹽， 其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基；且 PG3 為胺基保護基。
於一些態樣中，X係選自由Br、I及Cl組成之群；PG1 為烷基或苄基，其中該苄基視情況經取代；PG2 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群；且PG3 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群。
於另一態樣中，本發明提供式I-15 化合物： 或其鹽。
於另一態樣中，本發明提供一種製備式J-16 化合物或其鹽之方法： 其中 PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基； PG3 為胺基保護基； PG4 為羥基保護基；且 R為H或F； 該方法包括： (a)在鹼之存在下使式J-13 化合物： 其中X係選自由Br、I及Cl組成之群；且Y為離去基團；與式J-11 化合物反應： 以得到式J-14 化合物： 及視情況形成化合物J-14 之鹽； (b)使該式J-14 化合物或其鹽與肼反應以得到式J-15 化合物： 及視情況形成化合物J-15 之鹽； (c)在鹼、鈀觸媒及膦配位體之存在下使該式J-15 化合物或其鹽與式J-5 、J-6 或J-7 化合物反應： 其中Ra 及Rb 各者係獨立地選自C1-8 烷基，其中Ra 及Rb 可視情況連接以形成4至8員環；以得到該式J-16 化合物，及視情況形成化合物J-16 之鹽。
於一些態樣中，在二硼試劑之存在下進行步驟(c)。於一些態樣中，在四羥基二硼或二羥基硼酸酯之存在下進行步驟(c)。於一些實施例中，該觸媒為雙(頻哪醇基)二硼與氟化鉀氫氟化物之反應產物。於一些實施例中，藉由含於丙-2-醇中之雙(頻哪醇基)二硼與含於水中之氟化鉀氫氟化物反應接著過濾及乾燥所獲得之固體來獲得該觸媒。
於一些態樣中，在60℃±20℃下進行步驟(b)中之該與肼之反應。
於一些態樣中，X係選自由Br、I及Cl組成之群；PG1 為烷基或苄基，其中該苄基視情況經取代；PG2 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群；PG3 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群；PG4 係選自由矽基、醯基及芳基甲基組成之群。於一些態樣中，X為Br。於一些態樣中，X為Br，PG1 為苄基，PG2 為第三丁氧羰基，PG3 為苄基且PG4 為苄基。
於一些態樣中，Y為Cl。
於一些態樣中，該步驟(c)之鈀觸媒及膦配位體為雙(二第三丁基(4-二甲胺基苯基)膦)二氯鈀(II)。
於本方法中，在鹼之存在下使化合物J-13 ： 與式J-11 化合物反應： 以得到式J-14 化合物：。
通常，於溶劑(諸如乙腈)中，在過量(例如3至7當量)鹼(諸如三甲胺)之存在下進行該反應。通常使用1至2當量之J-13 。
於本方法中，使化合物J-14 或其鹽與肼反應以得到式J-15 化合物：。
通常，於溶劑(諸如THF)中進行該反應及使用過量肼，例如介於2與10當量之間。將該反應在約60℃下加熱直至完成，通常介於0.5與6小時之間。
於本方法中，在鹼、鈀觸媒及膦配位體之存在下使化合物J-15 或其鹽與式J-5 、J-6 或J-7 化合物反應： 以得到式J-16 化合物：。
通常藉由在催化量之鈀觸媒及膦配位體(在約0.005當量與約0.1當量之間)及約2與約6當量之間之鹼的存在下使J-15 與約1當量與約1.5當量之間之J-5 、J-6 或J-7 接觸來進行該反應。在額外觸媒之存在下進行該反應增加產物J-16 之產率。該額外觸媒可為二硼試劑。該額外觸媒可為四羥基二硼、二羥基硼酸酯或雙(頻哪醇基)二硼與氟化鉀氫氟化物之反應產物，如製備4中所述。
適宜鈀觸媒包括雙(二-第三丁基(4-二甲胺基苯基)膦)二氯鈀(II)、三(二亞苄基丙酮)二鈀(0) (Pd2 dba3 )、乙酸鈀(II) (Pd(OAc)2 )、二氯(1,1’-雙(二苯基膦基)-二茂鐵)二鈀(II) (Pd(dppf)Cl2 )、二氯雙(三苯基膦)-鈀(II) (Pd(PPh3 )2 Cl2 )及類似者，其中於括弧內提供常見縮略語。可用於本反應之膦配位體包括三環己基膦(PCy3 )、四氟硼酸三環己基膦(PCy3 HBF4 )、1,1'-雙(二苯基膦基)-二茂鐵(dppf)、1,1'-雙(二-第三丁基膦基)二茂鐵、三(2-呋喃基)膦、1,3-雙(二苯基膦基)丙烷(dppp)、1,5-雙(二苯基膦基)戊烷(dpppe)、三-第三丁基膦(P(t -Bu)3 )及9,9-二甲基-4,5-雙(二苯基膦基)二苯并哌喃(Xantphos)。
用於偶合反應之典型鹼包括氟化鉀、碳酸銫及氟化銫。或者，碳酸鈉、碳酸鉀、乙酸鈉、第三丁醇鉀、1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)或1,4-二氮雜二環[2.2.2]辛烷(DABCO)可用於該鹼。通常於惰性稀釋劑(諸如四氫呋喃、N,N -二甲基甲醯胺、N,N -二甲基乙醯胺或N -甲基吡咯啶酮)中進行該反應。適宜混合溶劑體系包括四氫呋喃及水、四氫呋喃及N,N -二甲基甲醯胺、四氫呋喃及N -甲基吡咯啶酮、丙酮及水、乙醇及水、及異丙醇及水。通常在約40℃與約120℃之間之溫度下進行該反應持續約1小時至約20小時或直至反應實質完成。藉由習知程序單離呈固體之產物J-16 。
定義 當描述本發明(包括其各種態樣及實施例)時，除非另有指定，否則下列術語具有下列含義。
術語「烷基」意指單價飽和烴基，其可係直鏈或分支鏈或其組合。除非另有指定，否則此等烷基通常含有1至10個碳原子。舉例而言，代表性烷基包括甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基(n-Pr)或(nPr)、異丙基(i-Pr)或(iPr)、正丁基(n-Bu)或(nBu)、第二丁基、異丁基、第三丁基(t-Bu)或(tBu)、正戊基、正己基、2,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-乙基丁基、2,2-二甲基戊基、2-丙基戊基及類似者。
當意欲將碳原子之特定數目用於特定術語時，在該術語之前顯示該碳原子之數目。例如，術語「C1-3 烷基」意指具有1至3個碳原子之烷基，其中該等碳原子係呈任何化學上可接受之構型，包括直鏈或分支鏈構型。.
術語「環烷基」意指單價飽和碳環基，其可係單環或多環。除非另有指定，否則此等環烷基通常含有3至10個碳原子。舉例而言，代表性環烷基包括環丙基(cPr)、環丁基(cBu)、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、金剛烷基及類似者。
術語「環丙基(cpropyl)」意指環丙基(cyclopropyl)。
術語「雜環基」、「雜環(heterocycle/heterocyclic/heterocyclic ring)」意指具有3至10個總環原子之單價飽和或部分不飽和環狀非芳族基，其中該環含有2至9個碳環原子及選自氮、氧及硫之1至4個環雜原子。雜環基可係單環或多環(即，稠合或橋接)。舉例而言，代表性雜環基包括吡咯啶基、哌啶基、哌嗪基、咪唑啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基、吲哚啉-3-基、2-咪唑啉基、四氫哌喃基、1,2,3,4-四氫異喹啉-2-基、奎寧環基、7-氮雜降莰烷基(7-azanorbornanyl)、降莨菪鹼基(nortropanyl)及類似者，其中該連接點係在任何可得碳或氮環原子上。在上下文使雜環基之連接點明顯之情況下，或者可將此等基團稱作非價物質，即，吡咯啶、哌啶、哌嗪、咪唑、四氫哌喃等。
術語「鹵基」意指氟、氯、溴或碘。
術語「治療上有效量」意指當對需要治療之患者投與時足以實現治療之量。
術語「治療(treating/treatment)」意指預防、改善或抑制患者(特定言之人類)之正在治療之醫學病狀、疾病或病症(例如，呼吸疾病)；或減輕該醫學病狀、疾病或病症之症狀。
術語「醫藥上可接受之鹽」意指用於對患者或哺乳動物(諸如人類)投與可接受之鹽(例如，針對給定劑量方案具有可接受之哺乳動物安全性之鹽)。代表性醫藥上可接受之鹽包括以下之鹽：乙酸、抗壞血酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、檸檬酸、乙磺酸、乙二磺酸(edisylic)、富馬酸、龍膽酸、葡糖酸、葡萄糖醛酸、麩胺酸、馬尿酸、氫溴酸、氫氯酸、羥基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲磺酸、黏酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸、菸鹼酸、硝酸、乳清酸、撲酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、對甲苯磺酸及辛那酸(xinafoic acid)及類似者。
術語「其鹽」意指當酸之氫經陽離子(諸如金屬陽離子或有機陽離子及類似者)置換時形成之化合物。例如，陽離子可為化合物之質子化形式，即，一或多個胺基已藉由酸質子化之形式。通常，該鹽為醫藥上可接受之鹽，雖然此對於不意欲對患者投與之中間體化合物之鹽係不必需。
術語「胺基保護基」意指適用於防止胺基氮處之非所需反應之保護基。代表性胺基保護基包括(但不限於)甲醯基；醯基，例如烷醯基，諸如乙醯基及三氟乙醯基；烷氧羰基，諸如第三丁氧羰基(Boc)；芳基甲氧羰基，諸如苄氧羰基(Cbz)、9-茀基甲氧羰基(Fmoc)、對硝基苄氧羰基(PNZ)、2,4-二氯苄氧羰基及5-苯并異噁唑基甲氧羰基；芳基甲基，諸如苄基(Bn)、4-甲氧基苄基、三苯甲基(Tr)及1,1-二-(4’-甲氧基苯基)甲基；矽基，諸如三甲基矽基(TMS)、第三丁基二甲基矽基(TBDMS)、[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基(SEM)；及類似者。
術語「羧酸保護基」意指適用於防止在羧酸處之非所需反應之保護基。代表性羧酸保護基包括(但不限於)酯，諸如甲基、乙基、第三丁基、苄基(Bn)、對甲氧基苄基(PMB)、9-茀基甲基(Fm)、三甲基矽基(TMS)、第三丁基二甲基矽基(TBS、TBDMS)、二苯基甲基(二苯甲基，DPM)及類似者。
術語「羥基保護基」意指適用於防止羥基之非所需反應之保護基。代表性羥基保護基包括(但不限於)矽基，包括三(C1-6 烷基)矽基，諸如三甲基矽基(TMS)、三乙基矽基(TES)、第三丁基二甲基矽基(TBS)及類似者；酯(醯基)包括C1-6 烷醯基，諸如甲醯基、乙醯基及類似者；芳基甲基，諸如苄基(Bn)、對甲氧基苄基(PMB)、9-茀基甲基(Fm)、二苯基甲基(二苯甲基，DPM)及類似者。
許多保護基及其引入及移除述於T. W. Greene及P.G.M. Wuts，Protecting Groups in Organic Synthesis ，第三版，Wiley, New York中。
實例 提供下列合成實例以說明本發明，且不以任何方式解釋為限制本發明之範圍。於以下實例中，除非另有指定，否則下列縮寫具有下列含義。以下未定義之縮寫具有其一般接受之含義。 ACN     =      乙腈 DMF     =N ,N -二甲基甲醯胺 EtOAc  =      乙酸乙酯 EtOH    =      乙醇 NaHMDS =   雙(三甲基矽基)醯胺鈉 MeTHF         = 2-甲基四氫呋喃 MTBE   =      第三丁基甲基醚 psi        =      磅/平方英寸 Rt =      滯留時間
試劑及溶劑係購自商業供應商(Aldrich, Strem Chemicals, Inc.等)且無需進一步純化即可使用。藉由分析型高效液相層析法及質譜法監測反應混合物之進程。使用下述方案藉由HPLC分析測定產物之內/外(Endo/exo )比率。如各反應中特定敘述處理反應混合物；其通常藉由萃取及其他純化方法(諸如溫度依賴性及溶劑依賴性結晶，及沉澱)純化。反應產物之表徵常規藉由質譜法及1 H-NMR光譜法進行。針對NMR量測，將樣品溶解於氘化溶劑(DMSO-d 6 或CDCl3 )中，及利用Varian Gemini 2000儀器(400 MHz)在標準觀察條件下獲取1 H-NMR光譜。使用Agilent (Palo Alto, CA)型號1100 LC/MSD儀器進行化合物之質譜識別。
一般 HPLC 條件 管柱：               Zorbax SB-Aq，5 μm. 4.6 x 250 mm 管柱溫度：         40℃ 流率：               1.0 mL/min 流動相：            A =水/ACN (98:2) + 0.1% TFA B =水/ACN (10:90) + 0.1% TFA, 注射體積：         10 μL 檢測器波長：      214 nm
HPLC 方法 1 將粗製化合物以約1 mg/mL溶解於水/ACN (50:50)中及使用下列梯度歷時20分鐘(時間(分鐘)/ % B)分析：0/10、2.5/20、9/75、15/90、17/90、18/10、20/10。
HPLC 方法 2 將化合物以約1 mg/mL溶解於水/ACN (90:10)中及使用下列梯度歷時30分鐘(時間(分鐘)/ % B)分析：0/10、13/10、23/65、28/90、29/90、30/10。
HPLC 方法 3 將化合物以約1 mg/mL溶解於水/ACN (90:10)中及使用下列梯度歷時55分鐘(時間(分鐘)/ % B)分析：0/10、10/20、46/75、47/90、50/10、55/10。
製備 1 ： 4-( 苄氧基 )-2- 乙基苯基 ) 三氟 -λ4 - 硼烷，鉀鹽 I-5 (a) 1-(苄氧基)-3-乙基苯(I-2) 在室溫下，向經攪拌之含於ACN (250 mL，10 vol)中之3-乙基苯酚(I-1) (25.0 g，204.0 mmol)之溶液中添加碳酸鉀(42.0 g，306 mmol)。將所得反應物料在室溫下攪拌15分鐘，接著以逐滴方式添加苄基溴(24.0 mL，204 mmol)。將所得反應混合物在室溫下攪拌6小時。於完成反應(TLC監測)後，將所得反應物料倒入水(1.0 L)中，接著將化合物用EtOAc (2 x 2L)萃取。將合併之有機物用冷水、鹽水溶液洗滌及經硫酸鈉乾燥、過濾及在減壓下蒸發。然後藉由管柱層析法在矽膠上(100至200M)藉由使用溶離劑2% EtOAc/己烷純化粗產物，以得到呈淺黃色油狀化合物之所需產物(I-2 ) (35.0 g，81%)。1 H NMR (400 MHz，氯仿-d) δ 7.46-7.44 (m, 2H), 7.39 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.34-7.31 (m, 1H), 7.21 (t, J = 7.6 Hz), 6.86-6.80 (m, 3H), 5.07 (s, 2H), 2.64 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.24 (t, J = 7.6 Hz, 3H)。
(b) 4-(苄氧基)-1-溴-2-乙基苯(I-3) 將N-溴琥珀醯亞胺(32.0 g，181 mmol)分數份添加至1-(苄氧基)-3-乙基苯(I-2) (35.0 g，164 mmol)於ACN (525 mL，15 vol)中之冰冷攪拌溶液中歷時15分鐘之時間。將所得反應混合物在室溫攪拌1小時。於完成反應(TLC監測)後，將所得反應物料倒入冰冷水(1.50 L)中，接著將化合物用EtOAc (2 x 1L)萃取。將合併之有機物用水洗滌及經硫酸鈉乾燥、過濾及在減壓下蒸發以獲得粗產物。將正己烷(250 mL)添加至粗物質中，產生漿液，接著通過燒結漏斗過濾。將母液在減壓下蒸發以獲得呈淺黃色油狀化合物之所需產物I-3 (42.0 g，87%)。1 H NMR (400 MHz，氯仿-d) δ 7.52-7.29 (m, 7H), 6.88 (s, 1H), 6.68 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 2.69 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.5 Hz, 3H)。
(c) 2-(4-(苄氧基)-2-乙基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環(dioxaborolane)(I-4) 將4-(苄氧基)-1-溴-2-乙基苯(I-3) (42.0 g，144 mmol)、雙(頻哪醇基)二硼(44.0 g，173 mmol)及乙酸鉀(28 g，288 mmol)於二噁烷(440 mL)中之攪拌溶液藉由N2 (g)吹洗15分鐘脫氣，接著添加PdCl2 (dppf).DCM複合物(11.0 g，15 mmol)。將所得反應混合物加熱至80℃持續16小時。於完成反應(TLC監測)後，將反應物料通過矽藻土床過濾及將母液在減壓下蒸發，以獲得粗產物。藉由管柱層析法在矽膠上(100至200M)藉由使用溶離劑1% EtOAc/己烷純化粗製殘餘物，以得到呈淺黃色油狀化合物之所需產物(I-4) (32.0 g，66%)。1 H NMR (400 MHz，氯仿-d) δ 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.45-7.36 (m, 5H), 6.84-6.78 (m, 2H), 5.08 (s, 2H), 2.91 (q, J = 7.6 Hz), 1.33 (s, 12H), 1.19 (t, J = 7.6 Hz, 3H)。
(d) (4-(苄氧基)-2-乙基苯基)三氟-λ4 -硼烷，鉀鹽(I-5) 向經攪拌之含於丙酮:甲醇(200 mL，1:1比率，10 vol)中之化合物2-(4-(苄氧基)-2-乙基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環(I-4) (20 g，59.0 mmol)之溶液中添加3M氟化氫鉀之溶液(23.0 g，295 mmol，溶解於98.0 mL水中)。將所得反應混合物在室溫下攪拌16小時。於完成反應(TLC監測)後，將所得反應物料在減壓下蒸發。將因此獲得之固體溶於水(100 mL)中及在室溫下攪拌30分鐘。將所得反應物料通過燒結漏斗過濾，用正己烷洗滌及在減壓下乾燥，以得到呈白色固體之所需產物(I-5) (14.0 g，74%)。1 H NMR (400 MHz，氯仿-d) δ 7.43 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.30 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.0 Hz), 6.58 (s, 1H), 6.53 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 2.65 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.07 (t, J = 7.4 Hz, 3H)。
製備 2 ： (S)-3- 苄基 -3,4,6,7- 四氫 -5H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -5,6- 二甲酸 6- 苄酯 5-( 第三丁酯 ) (I-11) (a) (S)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸鹽酸鹽(I-7) 以逐滴方式向冰冷經攪拌之含於水(40 L，8 vol.)中之L-組胺酸(I-6) (5.0 kg，32.14 mol)之懸浮液中添加濃鹽酸(3.93 L，33.75 mol)，接著添加甲醛(5.50 L，67.5 mol，37%水溶液)。將所得溶液在相同溫度下攪拌30分鐘及然後在80℃下加熱8小時。藉由LCMS監測反應進程。在減壓下移除水以獲得粗產物，及將所得粗製物於甲苯(20 L)中攪拌2小時。在減壓下移除有機物以移除過量水及將化合物共沸乾燥。然後將所得物質溶於乙醚(20 L)中及攪拌2小時。然後將固體物質過濾及空氣乾燥，以獲得呈灰白色固體之所需產物(I-7) (6.50 Kg，85%)。1 H NMR (400 MHz, D2 O) δ 8.69 (s, 1H), 4.56 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.20 (dd, J = 5.5, 5.2 Hz, 1H), 3.42 (dd, J = 5.0, 17.0 Hz, 1H), 3.11 (dd, J = 10.2, 16.8 Hz, 1H)。
(b) (S)-3,5-雙(第三丁氧羰基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸(I-8) 向冰冷經攪拌之含於1,4-二噁烷(48 L，8 vol)及水(48 L，8 vol)中之(S)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸二鹽酸鹽(I-7) (6.10 Kg，25.40mol)之溶液中逐滴添加三乙胺(12.36 L，89 mol)，接著歷時30分鐘之時間添加二碳酸二第三丁酯(18.07 L，78.74 mol，溶解於5 L 1,4-二噁烷中)。將所得反應混合物在室溫下攪拌16小時。於完成反應(TLC及LCMS監測)後，將微黃色反應混合物用水(10 L)稀釋及用乙醚(2 x 10 L)及EtOAc (2 x 7.50 L)連續洗滌。丟棄有機相。將水層冷卻及用6N HCl溶液調至pH約3；將水相用EtOAc (3 x 10 L)萃取。將合併之有機物用鹽水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，及在減壓下濃縮。將油性殘餘物自30% EtOAc:己烷結晶，以得到呈灰白色固體之所需產物(I-8) (5.1 Kg，55%)。(m/z)：[M+H]+針對C17 H25 N3 O6 計算值368.18，實測值368.21。
(c) (S)-6,7-二氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-3,5,6(4H)-三甲酸6-苄酯3,5-二-第三丁酯(I-9) 向含於DCM (51 L，10 vol)中之(S)-3,5-雙(第三丁氧羰基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸(I-8) (5.1 Kg，13.88 mol)之冰冷溶液中依序添加飽和碳酸氫鈉水溶液(41.0 L，8 vol)、四丁基碘化銨(5.13 Kg，13.88 mol)及苄基溴(2.47 L，20.82 mol)。將所得反應混合物在室溫下攪拌16小時。於完成反應(TLC及LCMS監測)後，分離兩相溶液。將水層用DCM (3 x 10 L)萃取。將合併之有機物用鹽水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾及在減壓下濃縮，以獲得粗產物，藉由管柱層析法通過矽膠(100至200M)藉由使用溶離劑 40% EtOAc/己烷純化該粗產物，以得到呈黏性油之所需產物(I-9) (4.50 Kg，72%)。(m/z)：[M+H]+針對C24 H31 N3 O6 計算值458.22，實測值458.60。
(d) (S)-3,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯)(I-10) 向含於IPA (45 L，10 vol)中之(S)-6,7-二氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-3,5,6(4H)-三甲酸6-苄酯3,5-二-第三丁酯(I-9) (4.50 Kg，9.84 mol)之冰冷溶液中逐滴添加氫氧化銨(36 L，8 vol)。將所得反應混合物進一步在室溫下再攪拌16小時。於完成反應(TLC及LCMS監測)後，將所得混合物用水(25 L)稀釋，接著用EtOAc (3 x 20 L)萃取。將合併之有機物用鹽水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾及在減壓下濃縮，以得到粗產物，藉由管柱層析法通過矽膠(100至200M)藉由使用溶離劑2% MeOH/DCM純化該粗產物，以得到呈稠黏性油之所需產物(I-10) (2.70 Kg，77%)。(m/z)：[M+H]+針對C19 H23 N3 O4 計算值358.17，實測值358.33。
(e) (S)-3-苄基-3,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯)(I-11) 向含於DCM (32.4 L，12 vol)中之(S)-3,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯)(I-10) (2.70 kg，7.55 mol)之冰冷溶液中添加1N氫氧化鈉水溶液(24.3 L，9 vol)，接著依序添加四丁基碘化銨(2.80 Kg，7.55 mol)及苄基溴(0.99 L，8.31 mol)。將所得反應混合物在室溫下攪拌2小時。於完成反應(TLC及LCMS監測)後，分離兩相溶液。將水層用DCM (3 x 10 L)萃取。將合併之有機物用鹽水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾及在減壓下濃縮，以得到粗產物，藉由管柱層析法在矽膠(100至200M)上藉由使用溶離劑40% EtOAc/己烷純化該粗產物，以獲得呈黏性油之所需產物(I-11) (1.70 Kg，63%)。(m/z)：[M+H]+針對C26 H29 N3 O4 計算值448.22，實測值448.20。
製備 3 ： (S)-3- 苄基 -2-(6- 溴 -1H- 吲唑 -3- 基 )-3,4,6,7- 四氫 -5H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -5,6- 二甲酸 6- 苄酯 5-( 第三丁酯 ) (I-15) (a) 4-溴-2-氟苯甲醯氯(I-13) 以逐滴方式向冰冷經攪拌之含於DCM (12.5 L，15 vol)中之4-溴-2-氟苯甲酸(I-12) (1.25 Kg，5.71 mol)之溶液中添加草醯氯(0.98 L，11.42 mol)。將所得反應混合物在相同溫度下攪拌10分鐘。然後以逐滴方式將DMF (150 mL)添加至反應混合物中。允許將所得反應物料升溫至室溫並攪拌2小時。於完成反應(藉由TLC監測)後，在減壓下在氮氣氛圍下移除過量草醯氯，以獲得粗產物(I-13) (1.08 Kg，80%)，將該粗產物用於下個步驟無需進一步純化。
(b) (S)-3-苄基-2-(4-溴-2-氟苯甲醯基)-3,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯)(I-14) 在室溫下，向經攪拌之含於ACN (13.6 L，8 vol)中之(S)-3-苄基-3,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯)(I-11) (1.70 Kg，3.80 mol)之溶液中添加三乙胺(2.11 L，15.2 mol)，接著添加4-溴-2-氟苯甲醯氯(I-13) (1.08 Kg，4.56 mol含於3.4 L ACN中，2 vol)。於完成添加後，所得反應混合物顏色自淺黃色變成棕色。將所得反應混合物在相同溫度下攪拌30分鐘，及藉由TLC監測反應進程。將所得反應混合物用冰冷水(10 L)淬滅，接著用EtOAc (3 x 5 L)萃取及將合併之有機物用鹽水溶液洗滌。將有機物經硫酸鈉乾燥，過濾及在減壓下濃縮得到粗產物，藉由管柱層析法在矽膠(100至200M)上藉由使用溶離劑20% EtOAc於己烷中純化該粗產物，以獲得所需產物(I-14) (1.74 Kg，71%)。(m/z)：[M+H]+針對 C33 H31 BrFN3 O5 計算值648.14，實測值648.20。
(c) (S)-3-苄基-2-(6-溴-1H-吲唑-3-基)-3,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯)(I-15) 在室溫下，向經攪拌之含於THF (26.0 L，15 vol)中之(S)-3-苄基-2-(4-溴-2-氟苯甲醯基)-3,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯)(I-14) (1.74 Kg，2.68 mol)之溶液中添加水合肼(0.705 L，13.4 mol)。將所得反應混合物在60℃下加熱3小時。於完成反應(TLC監測)後，將所得反應物料倒入冰冷水(10 L)中，接著將化合物用EtOAc (3 x 10L)萃取。將合併之有機物用鹽水洗滌及經硫酸鈉乾燥，過濾及在減壓下蒸發以得到粗產物，藉由管柱層析法在矽膠(100至200M)上藉由使用溶離劑20% EtOAc/己烷純化該粗產物，以獲得呈灰白色固體之所需產物(I-15) (1.12 Kg，65%)。(m/z)：[M+H]+針對C33 H32 BrN5 O4 計算值642.16，實測值642.21。
製備 4 ： (S)-3- 苄基 -2-(6-(4-( 苄氧基 )-2- 乙基苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-3,4,6,7- 四氫 -5H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -5,6- 二甲酸 6- 苄酯 5-( 第三丁酯 ) (I-16) 將雙(頻哪醇基)二硼(250 g，984 mmol)連同丙-2-醇(1882 mL，2.46E+04 mmol)放入先前使用氟化物化學品蝕刻之5 L 3頸單壁燒瓶中及將混合物攪拌直至完全溶解。溶解係吸熱(-4℃)。於先前使用氟化物化學品蝕刻之4 L愛倫美氏(Erlenmeyer)瓶中，將氟化鉀氫氟化物(538 g，6891 mmol)溶解於水(2306 mL，1.28E+05 mmol)中以形成3M溶液。溶解係吸熱(-12℃)。然後將溶液過濾以自KHF2 移除少量不可溶物質。一旦兩種溶液完全溶解，將愛倫美氏瓶之內容物歷時15分鐘逐份放入單壁燒瓶中。觀察到適度放熱(+10℃)。在添加期間溶液變成稠且半透明半不透明灰色漿液及增加攪拌以保持內容物充分混合。將混合物攪拌1.5小時，及然後通過粗玻璃熔結漏斗(4 L，先前經蝕刻)過濾。過濾需要30至45分鐘完成。丟棄澄清兩相濾液。將白色固體在過濾器上乾燥10分鐘(觀察到濾餅開裂)。將固體轉移回清潔的5 L 3頸單壁燒瓶中及用水(1330 mL，7.38E+04 mmol)再漿化。將漿液攪拌2小時，之後其形成澄清均勻水凝膠。將溶液再攪拌1小時，屆時將固體/凝膠使用4 L粗玻璃漏斗(先前經蝕刻)過濾掉。允許將固體在過濾器上乾燥30分鐘。將固體轉移回清潔的5 L 3頸單壁燒瓶中及於丙酮(1084 mL，1.48E+04 mmol)中再漿化。將白色/灰色漿液攪拌1小時及然後在4 L粗玻璃漏斗(先前經蝕刻)上過濾。過濾需要20分鐘完成，及然後在漏斗上再乾燥1小時。在此期間，偶爾攪動固體以確保均勻乾燥。淺白色粉末於乾燥後保留在過濾器上。將固體在55℃下在真空下隨著緩慢氮氣排放乾燥20小時，以得到疏鬆白色固體(收集200.3 g)。
向經攪拌之含於2-甲基四氫呋喃(100 mL，10 vol)中之(S)-3-苄基-2-(6-溴-1H-吲唑-3-基)-3,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯)(I-15) (10.0 g，16.0 mmol)之溶液中添加(4-(苄氧基)-2-乙基苯基)三氟-λ4 -硼烷鉀鹽(I-5) (8.0 g，20 mmol)及以上獲得之疏鬆白色固體(0.20 g)。將所得反應混合物用氮氣脫氣30分鐘。向此溶液中添加經製備之碳酸銫水溶液(20.0 g，62.0 mmol含於60 mL水中，6 vol)。將所得反應混合物進一步脫氣15分鐘，接著添加雙(二-第三丁基(4-二甲胺基苯基)膦)二氯化鈀(II) (0.66 g，0.93 mmol)，及將反應混合物在真空下排空及藉由氮氣沖洗。將所得反應混合物在110℃下加熱20小時。於完成反應(TLC及LCMS監測)後，將所得反應混合物冷卻至室溫及通過矽藻土床過濾，然後進一步用EtOAc (3 x 0.5 L)洗滌。將合併之有機物用1N氫氧化鈉溶液(3 x 0.5 L)洗滌。然後將合併之有機物用鹽水洗滌及經硫酸鈉乾燥，過濾及在減壓下蒸發以得到粗產物，藉由管柱層析法在矽膠(100至200M)上藉由使用溶離劑20% EtOAc/己烷純化該粗產物，以獲得呈淺黃色固體之所需產物(I-16) (作為N-苄基區域異構體之混合物) (8.0 g，66%)。(m/z)：[M+H]+針對C48 H47 N5 O5 計算值774.36，實測值774.59。
製備 5 ： (S)-2-(6-(2- 乙基 -4- 羥基苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 甲酸鹽酸鹽 (I-18) (a) (S)-3-苄基-2-(6-(4-(苄氧基)-2-乙基苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸苄酯鹽酸鹽(I-17) 將(S)-3-苄基-2-(6-(4-(苄氧基)-2-乙基苯基)-1H-吲唑-3-基)-3,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯)(I-16) (1.0 g，1.292 mmol)溶解於二噁烷(8 mL)及水(1.5 mL)中，然後添加4M氯化氫二噁烷溶液(7 mL，28.0 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌3小時(藉由LCMS監測反應進程)。然後將反應混合物冷凍及凍乾，及將粗產物(I-17) 直接用於下個反應(假設定量產率)。(m/z)：[M+H]+針對C43 H39 N5 O3 計算值674.31，實測值674.3。
(b) (S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸鹽酸鹽(I-18) 在50℃下，將(S)-3-苄基-2-(6-(4-(苄氧基)-2-乙基苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸苄酯鹽酸鹽(I-17) (0.918 g，1.292 mmol)溶解於2-丙醇(15 mL)、5M氯化氫水溶液(0.258 mL，1.292 mmol)及水(0.25 mL)中，然後添加10重量%碳載鈀，50%水(0.138 g，0.065 mmol)。然後將反應燒瓶用氮氣淨化，附接氫氣球，及將反應混合物在50℃下攪拌4天，其中視需要補充氫氣球(藉由LCMS監測反應進程)。然後藉由過濾移除所有固體及將所得溶液濃縮。將殘餘物溶解於1:1 ACN/水中，冷凍及凍乾。使用所得粉末(I-18) 無需進一步純化(假設定量產率)。(m/z)：[M+H]+針對C22 H21 N5 O3 計算值404.17，實測值404.2。
製備 6 ： (S)-2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 異丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 甲酸 (I-19) 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸HCl(I-18) (0.25 g，0.568 mmol)懸浮於DMF (2.5 mL)及丙酮(2.5 mL)中，然後添加乙酸(0.098 mL，1.705 mmol)及氰基硼氫化鈉(0.179 g，2.84 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌24小時(藉由LCMS監測反應進程)。將反應混合物濃縮，然後藉由逆相層析法(5至70% ACN/水梯度，50 g C18aq管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(149 mg，47%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C25 H27 N5 O3 計算值446.21，實測值446.3。
製備 7 ： (S)-2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 甲酸 (I-20) 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸HCl(I-18) (0.160 g，0.364 mmol)及丙醛(0.039 mL，0.546 mmol)溶解於甲醇(3.0 mL)中，然後添加氰基硼氫化鈉(0.069 g，1.091 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌24小時(藉由LCMS監測反應進程)。將反應混合物濃縮及藉由逆相層析法(5至70% ACN/水梯度，50g C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(78 mg，38%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C25 H27 N5 O3 計算值446.21，實測值446.3。
製備 8 ： (S)-2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 甲基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 甲酸 (I-21) 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸HCl(I-18) (0.160 g，0.364 mmol)及37重量%甲醛水溶液(0.032 mL，0.436 mmol)溶解於甲醇(3.0 mL)中，然後添加氰基硼氫化鈉(0.069 g，1.091 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌4小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加硼氫化鈉(14 mg，0.364 mmol)以淬滅任何過量甲醛，然後將反應混合物濃縮。藉由逆相層析法(5至70% ACN/水梯度，50 g C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(110 mg，57%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C23 H23 N5 O3 計算值418.18，實測值418.2。
製備 9 ： (R)-2-(3- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙 -1- 醇二鹽酸鹽 (I-24) (a) (R)-4-(2-羥乙基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸第三丁酯(I-23) 將(R)-1-boc-2-甲基哌嗪(0.2 g，0.999 mmol)、DIPEA (0.698 mL，3.99 mmol)及2-溴乙醇(0.085 mL，1.198 mmol)溶解於DMF (5 mL)中及將反應混合物在60℃下攪拌16小時(藉由LCMS監測反應進程)。將反應混合物濃縮，然後將10 mL乙醚添加至殘餘物。將溶液音波處理直至殘餘物凝膠消失及固體形成。然後將醚溶液自固體傾析除掉。然後將固體直接用於下個反應中(假設定量產率)。(m/z)：[M+H]+針對C12 H24 N2 O3 計算值245.18，實測值245.4。
(b) (R)-2-(3-甲基哌嗪-1-基)乙-1-醇二鹽酸鹽(I-24) 將(R)-4-(2-羥乙基)-2-甲基哌嗪-1-甲酸第三丁酯(0.244 g，0.999 mmol)溶解於二噁烷(3.0 mL)及水(0.5 mL)中，然後添加4M氯化氫二噁烷溶液(2.0 mL，65.8 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌3小時(藉由LCMS監測反應進程)。將反應混合物冷凍及凍乾，及使用所得產物無需純化(假設定量產率)。(m/z)：[M+H]+針對C7 H16 N2 O計算值145.13，實測值145.4。
實例 1 ： (S)-(2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 )(4-(2- 羥乙基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲酮 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-丙基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA(I-20) (40 mg，0.071 mmol)、n-(2-羥乙基)哌嗪(0.018 mL，0.143 mmol)及DIPEA (0.025 mL，0.143 mmol)溶解於DMF (1.5 mL)中，然後添加HATU (40.8 mg，0.107 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌3小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(0.011 mL，0.357 mmol)以裂解非所需副產物，然後將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由製備型HPLC (5至70% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(31 mg，56%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C31 H39 N7 O3 計算值558.31，實測值558.3。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.10 (s, 1H), 12.27 (d, J = 48.92 Hz, 1H), 9.40 (s, 1H), 8.28 (t, J = 8.10 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.04 (m, 2H), 6.71 (d, J = 2.46 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 2.50, 8.23 Hz, 1H), 4.44 (t, J = 5.31 Hz, 1H), 4.11 (q, J = 5.26, 2H), 3.96 (m, 1H), 3.86-3.52 (m, 6H), 3.49 (q, J = 6.01 Hz, 2H), 2.95 (m, 2H), 2.48 (q, J = 7.48 Hz, 2H), 2.42-2.21 (m, 4H), 2.37 (t, J = 6.20 Hz, 2H), 1.42 (m, 2H), 1.00 (t, J = 7.52 Hz, 3H), 0.81 (m, 3H)。
實例 2 ： ((S)-2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 )((1S,4S)-5- 甲基 -2,5- 二氮雜雙環 [2.2.1] 庚 -2- 基 ) 甲酮 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-丙基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA(I-20) (40 mg，0.071 mmol)、(1S,4S)-5-甲基-2,5-二氮雜雙環[2.2.1]庚烷二氫溴化物(29.4 mg，0.107 mmol)及DIPEA (0.062 mL，0.357 mmol)溶解於DMF (1.5 mL)中，然後添加HATU (40.8 mg，0.107 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌3小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(0.011 mL，0.357 mmol)以裂解非所需副產物，然後將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由製備型HPLC (5至70% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(32 mg，59%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C31 H37 N7 O2 計算值540.30，實測值540.3。
實例 3 ： ((S)-2,4- 二甲基哌嗪 -1- 基 )((S)-2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 甲基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 ) 甲酮 3 (a) (S)-4-((S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-甲基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羰基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸第三丁酯(I-25) 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-甲基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA(I-21) (55 mg，0.103 mmol)、(s)-4-n-boc-2-甲基哌嗪(41.5 mg，0.207 mmol)及DIPEA (0.036 mL，0.207 mmol)溶解於DMF (1.5 mL)中，然後添加HATU (59.0 mg，0.155 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌16小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(0.016 mL，0.517 mmol)以裂解非所需副產物，然後將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由逆相層析法(5至70% ACN/水梯度，50 g C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(54 mg，72%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C33 H41 N7 O4 計算值600.33，實測值600.3。
(b) ((S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-甲基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)((S)-2-甲基哌嗪-1-基)甲酮(I-26) 將(S)-4-((S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-甲基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羰基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸第三丁酯TFA(I-25) (0.126 g，0.177 mmol)溶解於二噁烷(1.5 mL)及水(0.3 mL)中，然後添加氯化氫於二噁烷中之4M溶液(1.5 mL，6.00 mmol)及將反應混合物在室溫攪拌2小時(藉由LCMS監測反應進程)。將反應混合物冷凍及凍乾，及將所得粉末直接用於下個反應(假設定量產率)。(m/z)：[M+H]+針對C28 H33 N7 O2 計算值500.27，實測值500.3。
(c) ((S)-2,4-二甲基哌嗪-1-基)((S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-甲基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)甲酮 將((S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-甲基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)((S)-2-甲基哌嗪-1-基)甲酮二鹽酸鹽(0.101 g，0.176 mmol)及37重量%甲醛水溶液(0.016 mL，0.212 mmol)溶解於甲醇(3.0 mL)中，然後添加氰基硼氫化鈉(0.055 g，0.882 mmol)及將反應混合物在室溫攪拌16小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加硼氫化鈉(7 mg，0.176 mmol)以淬滅任何剩餘甲醛。將反應混合物濃縮，然後藉由製備型HPLC (5至60% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，得到標題化合物之TFA鹽(28 mg，21%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C29 H35 N7 O2 計算值514.29，實測值514.3。
實例 4 ： (S)-(2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 異丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 )(4- 甲基 -1,4- 二氮雜環庚烷 -1- 基 ) 甲酮 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-異丙基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA(I-19) (50 mg，0.089 mmol)、1-甲基高哌嗪(0.022 mL，0.179 mmol)及DIPEA (0.031 mL，0.179 mmol)溶解於DMF (1.5 mL)中，然後添加HATU (51.0 mg，0.134 mmol)，及將反應混合物在室溫攪拌3小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(0.014 mL，0.447 mmol)以裂解非所需副產物，及將溶液在室溫攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮，及藉由製備型HPLC (2至70% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，得到標題化合物之TFA鹽(29 mg，42%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C31 H39 N7 O2 計算值542.32，實測值542.3。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.08 (s, 1H), 12.21 (d, J = 29.9 Hz, 1H), 9.40 (s, 1H), 8.27 (d, J = 8.33 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.04 (t, J = 8.05, 2H), 6.71 (d, J = 2.53 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 2.54, 8.23 Hz, 1H), 4.11 (m, 3H), 3.91-3.52 (m, 6H), 2.97 (m, 1H), 2.91-2.53 (m, 4H), 2.49 (q, J = 7.46, 2H), 2.23 (d, J = 13.9 Hz, 3H), 1.76 (m, 2H), 1.0 (m, 9H)。
實例 5 ： ((S)-2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 甲基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 )((R)-4-(2- 羥乙基 )-2- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 甲酮 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-甲基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA(I-21) (55 mg，0.103 mmol)、(R)-2-(3-甲基哌嗪-1-基)乙-1-醇二鹽酸鹽(I-24) (33.7 mg，0.155 mmol)及DIPEA (0.090 mL，0.517 mmol)溶解於DMF (1.5 mL)中，然後添加HATU (59.0 mg，0.155 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌16小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(0.016 mL，0.517 mmol)以裂解非所需副產物，然後將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮，及藉由製備型HPLC (5至70% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(22 mg，28%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C30 H37 N7 O3 計算值544.30，實測值544.3。
實例 6 ： ((S)-3-( 二甲胺基 ) 吡咯啶 -1- 基 )((S)-2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 異丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 ) 甲酮 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-異丙基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA(I-19) (50 mg，0.089 mmol)、(S)-(-)-3-(二甲胺基)吡咯啶(0.023 mL，0.179 mmol)及DIPEA (0.031 mL，0.179 mmol)溶解於DMF (1.5 ml)中，然後添加HATU (51.0 mg，0.134 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌3小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(0.014 mL，0.447 mmol)以裂解非所需副產物，及將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由製備型HPLC (5至70% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(37 mg，53%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C31 H39 N7 O2 計算值542.32，實測值542.3。
實例 7 ： (S)-(3-( 二甲胺基 ) 氮雜環丁烷 -1- 基 )(2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 異丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 ) 甲酮 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-異丙基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA(I-19) (50 mg，0.089 mmol)、3-(二甲胺基)氮雜環丁烷二鹽酸鹽(23.20 mg，0.134 mmol)及DIPEA (0.078 mL，0.447 mmol)溶解於DMF (1.5 mL)中，然後添加HATU (51.0 mg，0.134 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌3小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(0.014 mL，0.447 mmol)以裂解非所需副產物，及將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由製備型HPLC (5至70% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(25 mg，37%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C30 H37 N7 O2 計算值528.30，實測值528.3。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.09 (s, 1H), 9.40 (s, 1H), 8.27 (d, J = 8.31, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.04 (m, 2H), 6.71 (d, J = 2.54, 1H), 6.64 (dd, J = 2.53, 8.26, 1H), 4.26 (m, 1H), 4.06 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.64 (m, 2H), 3.03 (m, 2H), 2.74 (m, 2H), 2.47 (q, J = 7.56, 2H), 2.07 (d, J = 3.69, 6H), 1.07 (m, 6H), 1.00 (t, J = 7.50, 3H)。
製備 10 ： (S)-1- 苄基 -2-(6-(4-( 苄氧基 )-2- 乙基 -5- 氟苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-1,4,6,7- 四氫 -5H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -5,6- 二甲酸 6- 苄酯 5-( 第三丁酯 ) 向經攪拌之含於2-甲基四氫呋喃(11.2 L，10 Vol.)中之(S)-1-苄基-2-(6-溴-1H-吲唑-3-基)-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯) (1.12 Kg，1.74 mol)之溶液中添加((4-(苄氧基)-2-乙基-5-氟苯基)三氟硼烷鉀鹽) (0.702 Kg，2.1 mol)及於製備4中單離之疏鬆白色固體(0.223 Kg，1.04 mol)。將所得反應混合物通過滴管入口用氮氣再脫氣30分鐘。向此溶液中添加經製備之Cs2 CO3 之水溶液(2.27 Kg，6.96 mol含於7.30 L H2 O中，6 vol)。將所得反應混合物進一步脫氣歷時接下來15分鐘。將Pd(amphos) (0.74 Kg，1.04 mol)添加至所得反應混合物中及將反應混合物在真空下排空及用氮氣沖洗。將所得反應混合物加熱至90℃持續20小時。於完成反應後，將所得反應混合物冷卻至室溫及通過矽藻土床過濾，及用乙酸乙酯(3 x 7.5 L)洗滌。將合併之有機物用1N NaOH溶液(3 x 3 L)洗滌。將合併之有機物用鹽水洗滌及經Na2 SO4 乾燥，過濾及在減壓下蒸發以得到粗物質，將該粗物質利用管柱層析法在矽膠(100至200M)上藉由使用溶離劑20%乙酸乙酯/己烷純化，以獲得作為區域異構體之混合物之呈灰白色固體之標題產物(1.10 Kg，80%)。(m/z )：[M+H]+ 針對C48 H46 FN5 O5 計算值792.92，實測值792.34。
製備 11 ： (S)-1- 苄基 -2-(6-(4-( 苄氧基 )-2- 乙基 -5- 氟苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-4,5,6,7- 四氫 -1H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 甲酸苄酯 2 苯磺酸 在氮氣下，向含於2-甲基四氫呋喃(10,050 mL)及乙酸異丙酯(4,321.5 mL)中之(S)-1-苄基-2-(6-(4-(苄氧基)-2-乙基-5-氟苯基)-1H-吲唑-3-基)-1,4,6,7-四氫-5H-咪唑并[4,5-c]吡啶-5,6-二甲酸6-苄酯5-(第三丁酯) (1,005 g，1269 mmol)之溶液中添加苯磺酸(703 g，4,442 mmol)。將所得反應混合物在50℃下攪拌歷時15小時。向完成之反應中添加乙酸異丙酯(5,728.5 mL)。將漿液冷卻至20℃及保持1小時。然後將稠化之漿液在氮氣壓力下過濾。然後將濾餅用乙酸異丙酯(5,000 mL)沖洗及在氮氣壓力下在25℃下乾燥歷時2小時，接著在60℃下在高真空下利用氮氣排放進一步乾燥歷時16小時，以得到呈灰白色自由流動固體之標題化合物(1,210 g，95%產率)。(m/z )：[M+H]+ 針對C43 H38 FN5 O3 計算值692.81，實測值692.88。
製備 12 ： (S)-1- 苄基 -2-(6-(4-( 苄氧基 )-2- 乙基 -5- 氟苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 異丙基 -4,5,6,7- 四氫 -1H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 甲酸苄酯 向含於丙酮(12.0 L)中之分子篩(1.21 Kg)之懸浮液中添加(S)-1-苄基-2-(6-(4-(苄氧基)-2-乙基-5-氟苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸苄酯2苯磺酸(1.20 Kg，1,190 mmol)及乙酸(26 mL，446 mmol)。允許將懸浮液在25℃下攪拌歷時30分鐘以得到不均勻灰白色至黃色不均勻混合物。向反應混合物中添加三乙醯氧基硼氫化鈉(492 g，2,321 mmol)及在25℃下攪拌歷時1小時。將反應混合物通過矽藻土過濾及將濾餅用2-甲基四氫呋喃(500 mL)洗滌。將濾液用2-甲基四氫呋喃(8.0 L)稀釋及藉由蒸餾丙酮交換溶劑。向洗滌溶液中添加飽和碳酸氫鈉(3,025 mL)及將混合物攪拌1小時，停止攪拌，歷時15分鐘分離層，丟棄水層(pH=7.5)及重複洗滌，此次在層分離之前允許2小時攪拌時間。將有機層蒸餾降至2.0 L，添加乙酸異丙酯(8.0 L)及藉由蒸餾2-甲基四氫呋喃交換溶劑以得到漿液。將漿液在20℃下攪拌歷時1小時，然後在氮氣壓力下過濾以得到呈灰白色固體之標題化合物(795 g，91%產率)。(m/z )：[M+H]+ 針對C46 H44 FN5 O3 計算值734.89，實測值734.96。
製備 13 ： (S)-2-(6-(2- 乙基 -5- 氟 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 異丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 甲酸 2HCl 在50℃下，向經脫氣之經攪拌之(S)-1-苄基-2-(6-(4-(苄氧基)-2-乙基-5-氟苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-異丙基-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸苄酯(760 g，1,036 mmol)、丙-2-醇(3,800 mL)及1M氯化氫(aq) (2589 mL，2,589 mmol)之均勻溶液中立即添加10重量% Pd/C，50重量% H2 O (76 g，35.7 mmol)，接著通過反應混合物氫氣鼓泡歷時4小時。將反應混合物通過矽藻土(200克)墊過濾。向澄清暗黃色濾液中添加SiliaMetS Thiol (76 g，呈白色固體)及在50℃下攪拌歷時1小時以清除剩餘鈀。將SiliaMetS Thiol通過0.2微米過濾器過濾掉以得到淺黃色均勻濾液，然後SiliaMetS Thiol係亮橙色。向該濾液中添加乙酸異丙酯(7,600 mL)及將其在旋轉蒸發儀上濃縮至約3.0升。向呈渾濁懸浮液之濃縮溶液中添加乙酸異丙酯(7,600 mL)，接著濃縮至約3.0升。然後向呈稠漿液之濃縮物中添加乙酸異丙酯(7,600 mL)，此時漿液係自由流動且可過濾。將漿液過濾及將濾餅用乙酸異丙酯(3,000 mL)沖洗，在高真空下乾燥歷時1小時，然後在高真空下利用氮氣排放在50℃下進一步乾燥歷時18小時以得到標題化合物(472 g，81%產率)。(m/z )：[M+H]+ 針對C25 H26 FN5 O3 計算值464.51，實測值464.58。
實例 8 ： (S)-(3-( 二甲胺基 ) 氮雜環丁烷 -1- 基 )(2-(6-(2- 乙基 -5- 氟 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 異丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 ) 甲酮 向冷卻至-20℃之經攪拌之含於N,N-二甲基乙醯胺(2,436 mL)中之(S)-2-(6-(2-乙基-5-氟-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-異丙基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸2HCl (470 g，876 mmol)及N,N-二甲基氮雜環丁烷-3-胺2HCl (197 g，1,139 mmol)的溶液中歷時不少於15分鐘添加DIPEA (413 mL，2,366 mmol) (放熱添加造成批次溫度上升至-9.1℃)。將批次冷卻回至-15℃及添加HCTU (453 g，1095 mmol)。將混合物歷時1小時升溫至20℃及再保持1小時。向完成之反應混合物中添加乙酸異丙酯(5.0 L)及1M HCl (2.0 L)及將混合物攪拌歷時15分鐘，分離層以將雜質萃取至乙酸異丙酯層中。將含有產物之水層用乙酸異丙酯(各5.0 L)再萃取3次。於第4次萃取後，將水層添加至2-甲基四氫呋喃接著飽和碳酸氫鈉溶液(約2.2 L，以調整pH=8)中，攪拌15分鐘，及分離層，丟棄水層。將有機層溶劑交換成乙腈及在2.35 L之最終體積下攪拌，此時產物呈非晶型可過濾固體沉澱出溶液。然後將漿液在氮氣壓力下過濾以得到345克粗產物。將粗產物(345 g)溶解於甲醇(1.035 L)中，保持在55℃下攪拌歷時15小時以使產物自溶液結晶出來。將漿液冷卻至10℃及保持在該溫度下，攪拌歷時2小時。將稠漿液在氮氣壓力下歷時2小時在20℃下過濾，接著在高真空下利用氮氣排放在65℃下進一步乾燥歷時18小時以得到呈灰白色至白色自由流動固體之標題化合物(253 g，53%產率)。(m/z )：[M+H]+ 針對C30 H36 FN7 O2 計算值546.66，實測值546.73。
製備 14 ： (S)-5- 乙基 -2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 甲酸 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸HCl (0.100 g，0.227 mmol) (I-18 )及乙醛(0.019 mL，0.341 mmol)溶解於甲醇(3.0 mL)中，然後添加氰基硼氫化鈉(0.057 g，0.909 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌16小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加硼氫化鈉(9 mg，0.227 mmol)以淬滅任何剩餘乙醛，然後將反應混合物濃縮。然後藉由逆相層析法(5至70% ACN/水梯度，40 g C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(62 mg，50%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C24 H25 N5 O3 計算值432.20，實測值432.1。
實例 9 ： (S)-(3-( 二甲胺基 ) 氮雜環丁烷 -1- 基 )(5- 乙基 -2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 ) 甲酮 將(S)-5-乙基-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA (30 mg，0.055 mmol)、3-(二甲胺基)氮雜環丁烷二鹽酸鹽(14.28 mg，0.082 mmol)及DIPEA (0.048 mL，0.275 mmol)溶解於DMF (1.50 mL)中，然後添加HATU (31.4 mg，0.082 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌1小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(5.18 µl，0.165 mmol)以裂解非所需副產物，然後將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由製備型HPLC (5至60% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(25 mg，63%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C29 H35 N7 O2 計算值514.29，實測值514.2。
實例 10 ： (S)-(3-( 二甲胺基 )-3- 甲基氮雜環丁烷 -1- 基 )(5- 乙基 -2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 ) 甲酮 將(S)-5-乙基-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA (30 mg，0.055 mmol)、N,N,3-三甲基氮雜環丁烷-3-胺鹽酸鹽(12.43 mg，0.082 mmol)及DIPEA (0.048 mL，0.275 mmol)溶解於DMF (1.50 mL)中，然後添加HATU (31.4 mg，0.082 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌1小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(5.18 µl，0.165 mmol)以裂解非所需副產物，然後將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由製備型HPLC (5至60% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(25 mg，62%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C30 H37 N7 O2 計算值528.30，實測值528.2。
實例 11 ： (S)-(3-( 二甲胺基 )-3- 甲基氮雜環丁烷 -1- 基 )(2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 異丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 ) 甲酮 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-異丙基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸(40 mg，0.090 mmol) (I-19 )、N,N,3-三甲基氮雜環丁烷-3-胺鹽酸鹽(20.29 mg，0.135 mmol)及DIPEA (0.047 mL，0.269 mmol)溶解於DMF (1.50 mL)中，然後添加HATU (51.2 mg，0.135 mmol)及將反應混合物在室溫攪拌16小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(8.45 µl，0.269 mmol)以裂解非所需副產物，然後將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由製備型HPLC (5至60% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，得到標題化合物之TFA鹽(26 mg，38%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C31 H39 N7 O2 計算值542.32，實測值542.2。
實例 12 ： (S)-(3-( 二甲胺基 ) 氮雜環丁烷 -1- 基 )(2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 ) 甲酮 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-丙基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA (30 mg，0.054 mmol) (I-20 )、3-(二甲胺基)氮雜環丁烷二鹽酸鹽(13.92 mg，0.080 mmol)及DIPEA (0.047 mL，0.268 mmol)溶解於DMF (1.50 mL)中，然後添加HATU (30.6 mg，0.080 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌1小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(5.05 µl，0.161 mmol)以裂解非所需副產物，然後將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由製備型HPLC (5至60% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(26 mg，63%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C30 H37 N7 O2 計算值528.30，實測值528.2。
實例 13 ： (S)-(3-( 二甲胺基 )-3- 甲基氮雜環丁烷 -1- 基 )(2-(6-(2- 乙基 -4- 羥苯基 )-1H- 吲唑 -3- 基 )-5- 丙基 -4,5,6,7- 四氫 -3H- 咪唑并 [4,5-c] 吡啶 -6- 基 ) 甲酮 將(S)-2-(6-(2-乙基-4-羥苯基)-1H-吲唑-3-基)-5-丙基-4,5,6,7-四氫-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸TFA (30 mg，0.054 mmol) (I-20 )、N,N,3-三甲基氮雜環丁烷-3-胺鹽酸鹽(12.12 mg，0.080 mmol)及DIPEA (0.047 mL，0.268 mmol)溶解於DMF (1.50 mL)中，然後添加HATU (30.6 mg，0.080 mmol)及將反應混合物在室溫下攪拌1小時(藉由LCMS監測反應進程)。添加肼(5.05 µl，0.161 mmol)以裂解非所需副產物，然後將溶液在室溫下攪拌10分鐘。然後將反應混合物濃縮及藉由製備型HPLC (5至60% ACN/水梯度，C18管柱)純化粗產物，以得到標題化合物之TFA鹽(18 mg，44%產率)。(m/z)：[M+H]+針對C31 H39 N7 O2 計算值542.32，實測值542.2。
生物檢定 已於下列生物檢定中之一或多者中表徵本發明之化合物。
檢定 1 ：生物化學 JAK 激酶檢定 於常見激酶反應緩衝液(50 mM HEPES，pH 7.5，0.01% Brij-35，10 mM MgCl2 及1 mM EGTA)中進行一組四種LanthaScreen JAK生物化學檢定(JAK1、2、3及Tyk2)。重組GST標記之JAK酵素及GFP標記之STAT1肽受質係獲自Life Technologies。
將經連續稀釋之化合物於白色384孔微量盤(Corning)中在環境溫度下用四種JAK酵素各者及受質預培育1小時。隨後以10 μL總體積(含有1% DMSO)添加ATP以啟動激酶反應。JAK1、2、3及Tyk2之最終酵素濃度各自為4.2 nM、0.1 nM、1 nM及0.25 nM；使用之對應Km ATP濃度為25 μM、3 μM、1.6 μM及10 μM；同時針對所有四種檢定之受質濃度為200 nM。允許在環境溫度下繼續進行激酶反應1小時，之後添加10 μL含於TR-FRET稀釋緩衝液(Life Technologies)中之EDTA (10 mM最終濃度)及Tb-抗pSTAT1 (pTyr701)抗體(Life Technologies，2 nM最終濃度)之製劑。允許將板在環境溫度下培育1小時，之後在EnVision讀取器(Perkin Elmer)上讀取。記錄及利用發射比率信號(520 nm/495 nm)以基於DMSO及背景對照計算抑制%值。
針對劑量反應分析，將抑制%數據對化合物濃度作圖，及利用Prism軟體(GraphPad Software)自4-參數穩健擬合模型測定IC50 值。將結果表示為pIC50 (IC50 之負對數)及隨後使用Cheng-Prusoff方程式轉化成pKi (解離常數Ki之負對數)。
於四個JAK檢定各者中具有較低Ki 值或較高pKi 值之測試化合物顯示JAK活性之更大抑制。
檢定 2 ：經 IL-2 刺激之 pSTAT5 於 Tall-1 T 細胞中之抑制 於Tall-1人類T細胞系(DSMZ)中使用AlphaLisa量測測試化合物抑制經介白素-2 (IL-2)刺激之STAT5磷酸化之效力。因為IL-2通過JAK1/3信號傳導，此檢定提供JAK1/3細胞效力之量度。
經由AlphaLISA SureFire Ultra pSTAT5 (Tyr694/699)套組(PerkinElmer)量測經磷酸化之STAT5。
將來自Tall-1細胞系之人類T細胞於37℃，5% CO2 加濕培育箱中於補充有15%熱滅活胎牛血清(FBS，Life Technologies)、2 mM麩丙胺酸二肽(Glutamax) (Life Technologies)、25 mM HEPES (Life Technologies)及1X盤尼西林(Pen)/鏈黴素(Strep) (Life Technologies)之RPMI (Life Technologies)中培育。將化合物於DMSO中連續稀釋及以聲學方式分配至空孔。分配(4 μL/孔)檢定培養基(補充有10% FBS (ATCC)之無酚紅DMEM (Life Technologies))及將板在900 rpm下振盪10分鐘。將細胞於檢定培養基(4 µL/孔)中以45,000個細胞/孔接種，及在37℃，5% CO2 下培育1小時，接著添加含於預加溫檢定培養基(4 μL)中之IL-2 (R&D Systems；最終濃度300 ng/mL)持續30分鐘。於細胞激素刺激後，將細胞用含有1x PhosStop及完全錠劑(Roche)之6 μl 3x AlphaLisa裂解緩衝液(PerkinElmer)裂解。將裂解物在室溫(RT)下在900 rpm下振盪10分鐘。經由pSTAT5 AlphaLisa套組(PerkinElmer)量測經磷酸化之STAT5。在經綠光濾波＜100 lux光下將新鮮製備之受體珠混合物分配至裂解物(5 μL)。將板在900 rpm下振盪2分鐘，短暫旋轉下來，及在RT下於暗處培育2小時。在經綠光濾波＜100 lux光下分配供體珠(5 μL)。將板在900 rpm下振盪2分鐘，短暫旋轉下來，及在RT下於暗處培育過夜。使用EnVision板讀取器(PerkinElmer)在經綠光濾波＜100 lux光下利用在689 nm處之激發及在570 nm處之發射量測發光。
為測定測試化合物對IL-2反應之抑制效力，於人類T細胞系中量測結合至pSTAT5之珠之平均發射強度。自分析信號強度對化合物濃度之抑制曲線來測定IC50 值。將數據表示為pIC50 (負十進位對數IC50 )值(平均值±標準差)。
活體外檢定結果 於上述四種JAK酵素檢定(JAK1、JAK2、JAK3及Tyk2)及BEAS-2B細胞效力檢定中測試本發明之化合物。表 1
實例編號 JAK1 pKi JAK2 pKi JAK3 pKi Tyk2 pKi Tall-1 pIC50
1 10.2 10.3 9.8 9.0 8.8
2 10.3 10.2 9.8 8.9 8.4
3 10.2 10.4 10.2 9.3 8.8
4 10.1 10.4 10.1 9.0 8.6
5 10.3 10.5 10.1 9.2 8.8
6 10.2 10.4 10.0 9.0 8.7
7 10.2 10.5 10.2 9.1 8.6
8 10.4 10.8 10.1 9.5 8.8
9 10.3 10.7 10.3 9.2 8.7
10 10.4 10.6 10.2 9.1 8.6
11 10.0 10.8 9.9 9.1 8.7
12 10.5 10.6 10.3 9.0 8.7
13 10.3 10.5 9.8 9.0 8.6
檢定 3 ：肺組織中之 IL-13 誘導之 pSTAT6 誘導之鼠科 ( 小鼠 ) 模型 IL-13為哮喘之病理生理學基礎之重要細胞激素(Kudlacz等人，Eur. J. Pharmacol ,2008 ,582 ,154-161)。IL-13結合至Janus激酶家族(JAK)之細胞表面受體活化成員，其然後將STAT6磷酸化及隨後活化另外轉錄路徑。於所述模型中，將一劑量之IL-13局部遞送至小鼠之肺以誘導STAT6之磷酸化(pSTAT6)，然後量測其作為終點。
於該檢定中使用來自Harlan之成年Balb/c小鼠。在研究當天，將動物用異氟醚輕微麻醉及經由口吸入投與媒劑或測試化合物(1 mg/mL，歷時若干次呼吸50 µL總體積)。於給藥後將動物以側臥放置及在返回其家籠之前監測自麻醉完全恢復。四小時後，將動物再次短暫麻醉及經由口吸入用媒劑或IL-13 (0.03 µg總遞送劑量，50 µL總體積)刺激，之後監測自麻醉恢復並返回其家籠。於媒劑或IL-13投與1小時後，收集全血及肺用於於肺勻漿中使用Perkin Elmer AlphaLISA®SureFire ®Ultra™ HV p-STAT6 (Tyr641)檢定套組之pSTAT6檢測及用於肺及血漿二者中之總藥物濃度分析二者。將血液樣品在約12,000 rpm下在4℃下離心(Eppendorf離心機，5804R) 4分鐘以收集血漿。將肺於DPBS (杜貝克氏(Dulbecco’s)磷酸鹽緩衝鹽水)中沖洗，墊乾，急速冷凍，稱量及於0.1%甲酸/HPLC水中以1:3稀釋均質化。針對於測試矩陣中構造成標準曲線之分析標準藉由LC-MS分析測定測試化合物之血漿及肺含量。在5小時時以肺濃度(單位ng/g)與血漿濃度(單位ng/mL)之比率測定肺與血漿比率。
模型之活性藉由在5小時時存在於經處理動物之肺中之pSTAT6之含量相較於經媒劑處理之經IL-13刺激之對照動物減少來證實。於任何給定實驗中經媒劑處理之經IL-13刺激之對照動物與經媒劑處理之經媒劑刺激之對照動物之間之差異指示各自0%及100%抑制效應。檢定中所測試之化合物展示於IL-13刺激後5小時時STAT6磷酸化之抑制，如下所記載。表 2 ：觀察到之 pSTAT6 抑制及血漿 / 肺暴露
化合物 在5 小時時之肺濃度(ng/g) 在5 小時時之血漿濃度(ng/mL) 在5 小時時之肺與血漿比率 在5 小時時之pSTAT6 抑制
1 13000±5720 10.3±3.9 1262 67
2 23450±12528 17.5±25 1340 72
3 6330±1131 15.4±7 411 76
4 17350±6625 22.0±23 788 67
5 5445±1862 13.0±3.7 418 73
6 11600±4682 11.3±5.7 1026 37
7 10155±1979 24.0±16.2 423 75
8 22138±5547 58±17 381 51
9 7750±1652 23±6 339 72
10 5130±2205 24±6 216 73
11 15000±3349 55±21 271 72
12 6940±4248 25±9 281 55
13 7465±3084 23±2.5 330 66
觀察到小鼠肺中所測試之化合物之顯著濃度證實，觀察到之IL-13誘導之pSTAT6誘導之抑制為測試化合物活性之結果。在5小時時肺與血漿比率顯示，化合物1至6展示較之於血漿中暴露於小鼠肺中顯著更多的暴露。
檢定 4 ：於人類外周血單核細胞中之 TSLP 激發之 TARC 釋放之抑制 胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)及胸腺及活化調節細胞激素(TARC)於哮喘氣道中過度表現，且與疾病嚴重度相關。於肺中，TSLP可藉由支氣管上皮細胞對過敏原及病毒感染反應而釋放。TSLP通過於寬範圍組織及細胞類型(包括上皮細胞、內皮細胞、嗜中性白血球、巨噬細胞及肥大細胞)中發現之IL-7Rα/TSLPR異二聚體信號傳導。TSLP與其受體之結合誘導活化JAK1及JAK2以將各種轉錄因子(包括STAT3及STAT5)磷酸化之構象改變。於免疫細胞中，此觸發一連串細胞內事件，該等事件導致細胞增殖、抗細胞凋亡、樹突狀細胞遷移及Th2細胞激素及趨化因子之產生。於外周血單核細胞(PBMC)中，TSLP具有藉由活化髓樣樹突狀細胞以吸引及刺激T細胞(藉由化學引誘物TARC介導之過程)之促發炎效應。
於此檢定中，顯示TSLP刺激誘導TARC自PBMC釋放，及此反應於用化合物處理後以劑量依賴性方式減弱。針對TARC釋放之抑制量測測試化合物之效力。
將來自3至5名供體之PBMC等分試樣(先前自全血單離及以等分試樣在-80℃下冷凍)在37℃下解凍及逐滴添加至於50 mL Falcon管中之40 mL經預加溫無菌過濾之完全RPMI培養基中。將細胞粒化及以2.24×106 個細胞/mL再懸浮於完全培養基中。將細胞於經組織培養物處理之96孔平底微量盤中以85 μL (190,000個細胞)/孔接種。允許將細胞在37℃與5% CO2 下靜置1小時。
接收化合物作為10 mM含於DMSO中之儲備溶液。進行3.7倍連續稀釋以在300X最終檢定測試濃度下產生含於DMSO中之測試化合物之9個濃度。於完全培養基中進行150倍中間稀釋以產生2X最終檢定測試濃度之化合物與0.2% DMSO。於1小時靜置時間後，針對33.33 μM至0.95 μM之最終檢定濃度範圍將95 μL 2X化合物添加至PBMC之各孔。將95 μL含0.2% DMSO之完全培養基添加至未經處理之對照孔中。在刺激之前在37℃與5% CO2 下將細胞用化合物預處理1小時。
將重組人類TSLP蛋白於含有0.1% BSA之無菌DPBS中以10 μg/mL復水並以等分試樣儲存在-20℃下。在緊接使用之前，將等分試樣解凍及於完全培養基中以20X最終檢定濃度製備。針對10 ng/mL之最終檢定濃度，將10 μL 20X TSLP添加至PBMC之各孔。將10 μL完全培養基添加至未經刺激之對照孔。在37℃與5% CO2 下在化合物之存在下將細胞刺激48小時。
於刺激後，收穫細胞培養物上清液及根據製造商之說明，使用人類CCL17/TARC Quantikine ELISA套組(R&D Systems #DDN00)，藉由酶聯免疫吸附檢定(ELISA)檢測TARC含量。
針對劑量反應分析，將log [測試化合物(M)]對各供體之反應%值作圖，及使用非線性回歸分析利用GraphPad Prism軟體使用具有可變斜率之4-參數s形劑量反應演算法測定IC50 值。將數據表示為自個別供體之pIC50 值計算之平均pIC50 (負十進位對數IC50 )值並捨入至一個小數位。表3中概述抑制之效力值。表 3 ：測試化合物抑制於人類外周血單核細胞中之 TSLP 激發之 TARC 釋放之效力 (pIC50 ) 值
化合物 pIC50 ± 標準差
1 7.1 ± 0.1
2 6.8 ± 0.2
3 7.3 ± 0.2
4 6.8 ± 0.1
5 7.5 ± 0.6
6 6.8 ± 0.2
7 7.2 ± 0.1
8 7.0 ± 0.1
雖然已參考其特定實施例描述本發明，但是熟習此項技術者應瞭解，可在不背離本發明之真正精神及範圍下作出各種改變及取代等效物。此外，可作出許多修改以使特定情況、材料、物質之組成、製程、製程步驟或多個步驟適應本發明之目標、精神及範圍。意欲所有此等修改係於其上所附之申請專利範圍之範圍內。此外，上文中所引用之所有公開案、專利及專利文檔之全文以引用的方式併入本文中，併入程度如同以引用的方式個別併入般。

Claims (21)

  1. 一種製備式J-15 化合物或其鹽之方法： 其中： X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基；且 PG3 為胺基保護基； 該方法包括： (a)使式J-14 化合物： 或其鹽與肼反應，得到式J-15 化合物及 (b)視情況形成化合物J-15 之鹽。
  2. 如請求項1之方法，其中該與肼之反應在60℃±20℃進行。
  3. 如請求項1或2之方法，其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為烷基或苄基，其中該苄基視情況經取代； PG2 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群；且 PG3 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群。
  4. 如請求項1或2之方法，其中X為Br，PG1 為苄基，PG2 為第三丁氧羰基且PG3 為苄基。
  5. 如請求項1或2之方法，其中化合物J-14 或其鹽係藉由以下製備： (a)使式J-13 化合物： 其中Y為離去基團，與式J-11 化合物在鹼存在下反應： 得到J-14 ，及 (b)視情況形成化合物J-14 之鹽。
  6. 如請求項5之方法，其中Y為Cl。
  7. 一種式J-14 化合物： 或其鹽，其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基；且 PG3 為胺基保護基。
  8. 如請求項7之化合物或其鹽，其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為烷基或苄基，其中該苄基視情況經取代； PG2 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群；且 PG3 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群。
  9. 如請求項7之化合物，其具有式I-14 ： 或其鹽。
  10. 一種式J-15 化合物： 或其鹽， 其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基；且 PG3 為胺基保護基。
  11. 如請求項10之化合物或其鹽，其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為烷基或苄基，其中該苄基視情況經取代； PG2 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群；且 PG3 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群。
  12. 如請求項10之化合物，其具有式I-15 ： 或其鹽。
  13. 一種製備式J-16 化合物或其鹽之方法： 其中 PG1 為羧酸保護基； PG2 為胺基保護基； PG3 為胺基保護基； PG4 為羥基保護基；且 R為H或F； 該方法包括： (a)使式J-13 化合物： 其中X係選自由Br、I及Cl組成之群；且Y為離去基團；與式J-11 化合物在鹼存在下反應： 得到式J-14 化合物： 及視情況形成化合物J-14 之鹽； (b)使該式J-14 化合物或其鹽與肼反應，得到式J-15 化合物： 及視情況形成化合物J-15 之鹽； (c)使該式J-15 化合物或其鹽與式J-5 、J-6 或J-7 化合物在鹼、鈀觸媒及膦配位體存在下反應： 其中Ra 及Rb 各獨立地選自C1-8 烷基，其中Ra 及Rb 可視情況連接形成4至8員環；得到該式J-16 化合物，及視情況形成化合物J-16 之鹽。
  14. 如請求項13之方法，其中步驟(c)係在二硼試劑或觸媒存在下進行。
  15. 如請求項14之方法，其中步驟(c)係在四羥基二硼、二硼酸酯或雙(頻哪醇基)二硼(bis(pinacolato)diboron)與氟化鉀氫氟化物反應產物存在下進行。
  16. 如請求項13至15中任一項之方法，其中步驟(b)中與肼之反應係在60℃±20℃進行。
  17. 如請求項13至15中任一項之方法，其中 X係選自由Br、I及Cl組成之群； PG1 為烷基或苄基，其中該苄基視情況經取代； PG2 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群； PG3 係選自由醯基、烷氧羰基、芳基甲基及矽基組成之群； PG4 係選自由矽基、醯基及芳基甲基組成之群。
  18. 如請求項13至15中任一項之方法，其中X為Br，PG1 為苄基，PG2 為第三丁氧羰基，PG3 為苄基，且PG4 為苄基。
  19. 如請求項13至15中任一項之方法，其中Y為Cl。
  20. 如請求項13至15中任一項之方法，其中步驟(c)之該鈀觸媒及膦配位體為雙(二第三丁基(4-二甲胺基苯基)膦)二氯鈀(II)。
  21. 如請求項13至15中任一項之方法，其中於步驟(c)中使用式J-5 化合物。
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