BR112021004087A2 - processo para preparar inibidores de jak e seus intermediários - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA PREPARAR INIBIDORES DE JAK E SEUS INTERMEDIÁRIOS. A invenção se refere a um processo para a preparação de compostos que são úteis como intermediários para a preparação de agentes medicinais que possuem atividade inibidora para JAK.

Description

PATENTE Pauta do Advogado No. P-344-PCT Número do cliente: 27038

PROCESSO PARA PREPARAR INIBIDORES DE JAK E SEUS INTERMEDIÁRIOS

HISTÓRICO DA INVENÇÃO Campo da invenção

[001] A invenção se refere a um processo para a preparação de compostos que são úteis como intermediários para a preparação de agentes medicinais. Em particular, a invenção se refere à preparação de intermediários para inibidores de JAK. Estado da Técnica

[002] A família JAK é composta por quatro membros, JAK1, JAK2, JAK3, e tirosina quinase 2 (TYK2). A ligação da citocina a um receptor de citocina dependente de JAK induz a dimerização do receptor, que resulta na fosforilação de resíduos de tirosina na JAK quinase, efetuando a ativação de JAK. As JAKs fosforiladas, por sua vez, se ligam e fosforilam várias proteínas STAT que dimerizam, internalizam no núcleo da célula e modulam diretamente a transcrição do gene, levando, entre outros efeitos, a efeitos downstream associados com a doença inflamatória. As JAKs em geral se associam com receptores de citocina em pares como homodímeros e heterodímeros. Cada um dos quatro membros da família JAK está envolvido na sinalização de pelo menos uma das citocinas associadas com a inflamação. Consequentemente, um inibidor químico com atividade abrangente contra todos os membros da família JAK poderia modular uma ampla variedade de vias pró-

inflamatórias que contribuem para doenças pulmonares inflamatórias, como asma grave, DPOC, e disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD). Portanto, seria desejável ter um processo eficiente para preparar inibidores de JAK específicos.

RESUMO DA INVENÇÃO

[003] A invenção se refere a um processo para a preparação de compostos que são úteis como intermediários para a preparação de agentes medicinais que possuem atividade inibidora para JAK

[004] Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um processo para preparação de um composto da fórmula J-15 ou seu sal: em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; e PG3 é um grupo de proteção amino; o processo compreendendo: (a) reagir um composto da fórmula J-14:

ou seu sal, com hidrazina para obter o composto da J- 15 e (b) opcionalmente formar um sal do composto J-15.

[005] Em outro aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula J-14: ou seu sal, em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; e PG3 é um grupo de proteção amino.

[006] Em outro aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula J-15: ou seu sal, em que

X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; e PG3 é um grupo de proteção amino.

[007] Em outro um aspecto, a invenção fornece um processo para preparação de um composto da fórmula J-16 ou seu sal.

em que PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; PG3 é um grupo de proteção amino; PG4 é um grupo de proteção hidroxil; e R é H ou F; o processo compreendendo: (a) reagir um composto da fórmula J-13: em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; e Y é um grupo de saída; com um composto da fórmula J-11:

na presença de uma base, para obter um composto da fórmula J-14:

e, opcionalmente, formar um sal do composto J-14; (b) reagir o composto da fórmula J-14 ou seu sal, com hidrazina, para obter um composto da fórmula J-15:

e, opcionalmente, formar um sal do composto J-15; (c) reagir o composto da fórmula J-15 ou seu sal, com um composto da fórmula J-5, J-6 ou J-7:

J-5 J-6 J-7 em que Ra e Rb são cada selecionados independentemente de C1-8 alquil, em que Ra e Rb podem opcionalmente ser unidos para formular um anel de 4 a 8 membros, na presença de uma base, um catalisador de paládio e um ligante fosfina para obter o composto da fórmula J-16 e, opcionalmente, formar um sal do composto J-16.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[008] Em outro um aspecto, a invenção fornece um processo para preparação de um composto da fórmula J-15 ou de seu sal: em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; e PG3 é um grupo de proteção amino; o processo compreendendo: (a) reagir um composto da fórmula J-14: ou seu sal, com hidrazina para obter o composto da J- 15 e (b) opcionalmente formar um sal do composto J-15. Em alguns aspectos, a reação com hidrazina é realizada a cerca de 60°C. Em alguns aspectos, a reação com hidrazina é realizada a 60°C ± 20°C.

[009] Em alguns aspectos, X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo alquil ou benzil em que o grupo benzil é opcionalmente substituído; PG2 é selecionado a partir do grupo que consiste em grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; e PG3 é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil.

[0010] Em alguns aspectos, X é Br. Em alguns aspectos, X é Br, PG1 é benzil, PG2 é terc-butoxicarbonil e PG3 é benzil.

[0011] Em alguns aspectos, o composto J-14 ou seu sal, é preparado por: (a) reagir um composto da fórmula J-13: em que Y é um grupo de saída, com um composto da fórmula J-11: na presença de uma base, para obter J-14, e (b) opcionalmente formar um sal do composto J-14.

[0012] Em alguns aspectos, Y é Cl.

[0013] Em outro aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula J-14:

ou seu sal, em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; e PG3 é um grupo de proteção amino.

[0014] Em alguns aspectos, X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo alquil ou benzil em que o grupo benzil é opcionalmente substituído; PG2 é selecionado a partir do grupo que consiste em grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; e PG3 é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil.

[0015] Em outro aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula I-14: I-14 ou seu sal.

[0016] Em outro aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula J-15:

ou seu sal, em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; e PG3 é um grupo de proteção amino.

[0017] Em alguns aspectos, X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo alquil ou benzil em que o grupo benzil é opcionalmente substituído; PG2 é selecionado a partir do grupo que consiste em grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; e PG3 é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil.

[0018] Em outro aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula I-15: I-15 ou seu sal.

[0019] Em outro um aspecto, a invenção fornece um processo para preparação de um composto da fórmula J-16 ou seu sal.

em que PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; PG3 é um grupo de proteção amino; PG4 é um grupo de proteção hidroxil; e R é H ou F; o processo compreendendo: (a) reagir um composto da fórmula J-13: em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; e Y é um grupo de saída; com um composto da fórmula J-11: na presença de uma base, para obter um composto da fórmula J-14:

e, opcionalmente, formar um sal do composto J-14; (b) reagir o composto da fórmula J-14 ou seu sal, com hidrazina, para obter um composto da fórmula J-15: e, opcionalmente, formar um sal do composto J-15; (c) reagir o composto da fórmula J-15 ou seu sal, com um composto da fórmula J-5, J-6 ou J-7: J-5 J-6 J-7 em que Ra e Rb são cada selecionados independentemente de C1-8 alquil, em que Ra e Rb podem opcionalmente ser unidos para formular um anel de 4 a 8 membros, na presença de uma base, um catalisador de paládio e um ligante fosfina para obter o composto da fórmula J-16 e, opcionalmente, formar um sal do composto J-16.

[0020] Em alguns aspectos, a etapa (c) é conduzida na presença de um reagente diboron. Em alguns aspectos, a etapa (c) é conduzida na presença de um reagente tetra- hidroxidiboron ou um éster diborônico. Em algumas modalidades, o catalisador é o produto da reação de bis(pinacolato)diboron com hidrofluoreto de fluoreto de potássio. Em algumas modalidades, o catalisador é obtido pela reação de bis(pinacolato)diboron em propan-2-ol com hidrofluoreto de fluoreto de potássio em água seguida por filtração e secagem dos sólidos obtidos.

[0021] Em alguns aspectos, a reação com hidrazina na etapa (b) é conduzida a 60°C ± 20°C.

[0022] Em alguns aspectos, X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo alquil ou benzil em que o grupo benzil é opcionalmente substituído; PG2 é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; PG3 é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; PG4 é selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo silil, um grupo acil e um grupo arilmetil. Em alguns aspectos, X é Br. Em alguns aspectos, X é Br, PG1 é benzil, PG2 é terc- butoxicarbonil, PG3 é benzil e PG4 é benzil.

[0023] Em alguns aspectos, Y é Cl.

[0024] Em alguns aspectos, o catalisador de paládio e o ligante fosfina da etapa (c) são bis(di-terc-butil(4- dimetilaminofenil)fosfina)dicloropaládio(II).

[0025] No presente processo, o composto J-13: é reagido com um composto da fórmula J-11:

na presença de uma base, para obter um composto da fórmula J-14: .

[0026] Tipicamente, a reação é conduzida em um solvente como acetonitrila na presença de um excesso (por exemplo, 3 a 7 equivalentes) de uma base como a trimetilamina. Um a dois equivalentes de J-13 são tipicamente usados.

[0027] No presente processo, o composto J-14 ou seu sal é reagido com hidrazina para obter um composto da fórmula J- 15: .

[0028] Tipicamente, a reação é conduzida em um solvente como THF e é usado o excesso de hidrazina, por exemplo, entre 2 e 10 equivalentes. A reação é aquecida a aproximadamente 60°C até a conclusão, tipicamente entre 0,5 e 6 horas.

[0029] No presente processo, o composto J-15 ou seu sal é reagido com um composto da fórmula J-5, J-6 ou J-7:

J-5 J-6 J-7 na presença de uma base, um catalisador de paládio e um ligante fosfina para obter o composto da fórmula J-16: .

[0030] A reação é tipicamente conduzida pelo contato de J-16 com entre cerca de 1 e cerca de 1,5 equivalente de J- 5, J-6 ou J-7 na presença de uma quantidade catalítica de um catalisador de paládio e ligante fosfina (entre cerca de 0,005 e cerca de 0,1 equivalente) e entre cerca de 2 e cerca de 6 equivalentes de uma base. Conduzir a reação na presença de um catalisador adicional aumenta o rendimento do produto J-16. O catalisador adicional pode ser um reagente diboron. O catalisador adicional pode ser tetra-hidroxidiboron, um éster diborônico ou o produto da reação de bis(pinacolato)diboron com hidrofluoreto de fluoreto de potássio, conforme ilustrado na Preparação 4.

[0031] Os catalisadores de paládio adequados incluem bis(di-terc-butil(4- dimetilaminofenil)fosfina)dicloropaládio(II), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0) (Pd2dba3), acetato de paládio (II) (Pd(OAc)2), dicloro(1,1’-bis(difenilfosfino)- ferroceno)dipaládio(II) (Pd(dppf)Cl2), dicloro bis(trifenilfosfina)-paládio(II) (Pd(PPh3)2Cl2), e similares, onde as abreviações comuns são fornecidas entre parênteses. Os ligantes fosfina úteis na presente reação incluem triciclo-hexilfosfina (PCy3), triciclo-hexilfosfina tetrafluorborato (PCy3HBF4), 1,1'-bis(difenilfosfino)- ferroceno (dppf), 1,1'-bis(di-terc-butilfosfino)ferroceno, tri(2-furil)fosfina, 1,3-bis(difenilfosfino)propano (dppp), 1,5-bis(difenilfosfino)pentano (dpppe), tri-terc- butilfosfina (P(t-Bu)3), e 9,9-dimetil-4,5- bis(difenilfosfino)xanteno (Xantphos).

[0032] As bases típicas para a reação de acoplamento incluem fluoreto de potássio, carbonato de césio e fluoreto de césio. Alternativamente, carbonato de sódio, carbonato de potássio, acetato de sódio, terc-butóxido de potássio, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), ou 1,4- diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO) podem ser usados para a base. A reação é tipicamente conduzida em um diluente inerte, como tetra-hidrofurano, N,N-dimetilformamida, N,N- dimetiacetamida ou N-metilpirrolidona. Os sistemas de solventes misturados adequados incluem tetra-hidrofurano e água, tetra-hidrofurano e N,N- dimetilformamida, tetra-hidrofurano e N-metilpirrolidona, acetona e água, etanol e água, e isopropanol e água. A reação é tipicamente conduzida a uma temperatura entre cerca de 40 e cerca de 120 oC por cerca de 1 a cerca de 20 horas ou até que a reação esteja substancialmente completa. O produto J-16 é isolado como um sólido por procedimentos convencionais. Definições

[0033] Na descrição desta invenção, incluindo seus vários aspectos e modalidades, os termos abaixo têm os seguintes significados, a menos que indicado de outro modo.

[0034] O termo “alquil” significa um grupo hidrocarboneto saturado monovalente que pode ser linear ou ramificado ou suas combinações. A menos que definido de outro modo, esses grupos alquil tipicamente contêm de 1 a 10 átomos de carbono. Grupos alquil representativos incluem, a título de exemplo, metil (Me), etil (Et), n-propil (n-Pr) ou (nPr), isopropil (i-Pr) ou (iPr), n‑butil (n-Bu) ou (nBu), sec-butil, isobutil, terc-butil (t-Bu) ou (tBu), n-pentil, n-hexil, 2,2-dimetilpropil, 2-metilbutil, 3‑metilbutil, 2- etilbutil, 2,2-dimetilpentil, 2‑propilpentil e similares.

[0035] Quando um número específico de átomos de carbono se destina a um termo em particular, o número de átomos de carbono é mostrado antes do termo. Por exemplo, o termo “C1- 3 alquil” significa um grupo alquil que possui de 1 a 3 átomos de carbono, em que os átomos de carbono estão em qualquer configuração quimicamente aceitável, incluindo configurações lineares ou ramificadas.

[0036] O termo “cicloalquil” significa um grupo carbocíclico saturado monovalente que pode ser monocíclico ou multicíclico. A menos que definido de outro modo, esses grupos cicloalquil tipicamente contêm de 3 a 10 átomos de carbono. Os grupos cicloalquil representativos incluem, a título de exemplo, ciclopropil (cPr), ciclobutil (cBu),

ciclopentil, ciclo-hexil, ciclo-heptil, ciclo-octil, adamantil e similares.

[0037] O termo "cpropil’ significa ciclopropil.

[0038] O termo "heterociclil", "heterociclo", "heterocíclico" ou "anel heterocíclico" significa um grupo cíclico não aromático, monovalente saturado ou parcialmente insaturado, tendo um total de 3 a 10 átomos no anel, em que o anel contém de 2 a 9 átomos de carbono no anel e de 1 a 4 heteroátomos no anel selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Os grupos heterocíclicos podem ser monocíclicos ou multicíclicos (isto é, fundidos ou ligados por pontes). Os grupos representativos de heterocíclicos incluem, por exemplo, pirrolidinil, piperidinil, piperazinil, imidazolidinil, morfolinil, tiomorfolil, indolin-3-il, 2-imidazolinil, tetra-hidropiranil, 1,2,3,4- tetra-hidroisoquinolin-2-il, quinuclidinil, 7- azanorbornanil, nortropanil e similares, onde o ponto de fixação está em qualquer átomo de carbono ou nitrogênio disponível no anel. Quando o contexto torna o ponto de fixação do grupo heterocíclico evidente, tais grupos podem, alternativamente, ser referidos como espécies não valentes, isto é, pirrolidina, piperidina, piperazina, imidazol, tetra-hidropirano, etc.

[0039] O termo “halo” significa flúor, cloro, bromo ou iodo.

[0040] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade suficiente para efetuar o tratamento, quando administrada a um paciente com necessidade de tratamento.

[0041] O termo “para tratar” ou “tratamento” significa prevenir, melhorar ou suprimir a condição médica, doença ou distúrbio médico que está sendo tratado (p. ex., uma doença respiratória) em um paciente (em particular, um humano); ou aliviar os sintomas da doença ou distúrbio médico.

[0042] O termo “sal aceitável do ponto de vista farmacêutico” significa que é aceitável para administração a um paciente ou mamífero, como um humano (p. ex., sais que possuem segurança aceitável para uso em mamíferos em um determinado regime de dosagem). Os sais representativos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico incluem sais de ácido acético, ascórbico, benzenossulfônico, benzoico, canforssulfônico, cítrico, etanossulfônico, edisílico, fumárico, gentísico, glicônico, glicurônico, glutâmico, hipúrico, bromídrico, clorídrico, isetiônico, lático, lactobiônico, maleico, málico, mandélico, metanossulfônico, múcico, naftalenossulfônico, naftaleno-1,5-dissulfônico, naftaleno-2,6-dissulfônico, nicotínico, nítrico, orótico, pamoico, pantotênico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenossulfônico e xinafoico e similares.

[0043] O termo "seu sal" significa um composto formado quando o hidrogênio de um ácido é substituído por um cátion, como um cátion de metal ou um cátion orgânico e similares. Por exemplo, o cátion pode ser uma forma protonada de um composto, ou seja, uma forma onde um ou mais grupos amino foram protonados por um ácido. Tipicamente, o sal é um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, embora isto não seja necessário para sais de compostos intermediários que não são indicados para administração a um paciente.

[0044] O termo "grupo de proteção amino" significa um grupo de proteção adequado para prevenir reações indesejáveis em um nitrogênio de amino. Os grupos representativos de proteção amino incluem, mas não estão limitados a, formil; grupos acil, por exemplo, grupos alcanoil, tais como grupos acetil e trifluoracetil; grupos alcoxicarbonil, tais como terc-butoxicarbonil (Boc); grupos arilmetoxicarbonil, como benziloxicarbonil (Cbz) e 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc); p-nitrobenziloxicarbonil (PNZ), 2,4-diclorobenziloxicarbonil, e 5-benzisoxazolilmetoxicarbonil, grupos arilmetil, tais como benzil (Bn), 4-metoxibenzil, tritil (Tr), e 1,1-di-(4'- metoxifenil)metil; grupos silil, tais como grupos trimetilsilil (TMS), terc-butildimetilsilil (TBDMS), [2- (trimetilsilil)-etoxi]metil (SEM); e similares.

[0045] O termo "grupo de proteção do ácido carboxílico" significa um grupo de proteção adequado para prevenir reações indesejáveis em um ácido carboxílico. Os grupos representativos de proteção do ácido carboxílico incluem, mas não estão limitados a, ésteres, tais como metil, etil, terc-butil, benzil (Bn), p-metoxibenzil (PMB), 9- fluorenilmetil (Fm), trimetilsilil (TMS), terc- butildimetilsilil (TBS, TBDMS), difenilmetil (benzidril, DPM ), e similares.

[0046] O termo "grupo de proteção hidroxil" significa um grupo de proteção adequado para prevenir reações indesejáveis em um grupo hidroxil. Os grupos representativos de proteção hidroxil incluem, mas não estão limitados a, grupos tri(C1-6 alquil)silil, tais como trimetilsilil (TMS),

trietilsilil (TES), terc-butildimetilsilil (TBS) e semelhantes; ésteres (grupos acil) incluindo grupos C1-6 alcanoil, tais como formil, acetil e semelhantes; grupos arilmetil, tais como benzil (Bn), p-metoxibenzil (PMB), 9- fluorenilmetil (Fm), difenilmetil (benzidril, DPM) e similares.

[0047] Os numerosos grupos de proteção, e a sua introdução e remoção, estão descritos em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York

EXEMPLOS

[0048] Os exemplos sintéticos a seguir são fornecidos para ilustrar a invenção, e não devem ser interpretados de qualquer forma como uma limitação do escopo da invenção. Nos exemplos abaixo, as abreviações têm os seguintes significados, a menos que seja indicado de outra forma. As abreviações não definidas abaixo têm seus significados geralmente aceitos. ACN = acetonitrila DMF = N,N-dimetilformamida EtOAc = acetato de etila EtOH = etanol NaHMDS = bis(trimetilsilil)amida de sódio MeTHF = 2-metiltetra-hidrofurano MTBE = terc-butil metil éter psi = libras por polegada quadrada Rt = tempo de retenção

[0049] Os reagentes e solventes foram adquiridos de fornecedores comerciais (Aldrich, Strem Chemicals, Inc.,

etc.) e usados sem purificação adicional. O progresso das misturas de reação foi monitorado por cromatografia líquida de alta eficiência analítica e espectrometria de massa. As proporções de produtos endo/exo foram determinadas por análise HPLC usando os protocolos descritos abaixo. As misturas reacionais foram trabalhadas como descrito especificamente em cada reação; comumente foram purificadas por métodos de extração e outros métodos de purificação, como cristalização e precipitação dependentes de temperatura e solvente. A caracterização dos produtos da reação foi feita rotineiramente usando espectrometria de massa e 1H- RMN. Para medição por RMN, as amostras foram dissolvidas em solventes deuterados (DMSO-d6 ou CDCl3), e espectros de 1H- RMN foram adquiridos com um instrumento Varian Gemini 2000 (400 MHz) em condições de observação padrão. A identificação espectrométrica de massa de compostos foi realizada usando um instrumento Agilent (Palo Alto, CA) modelo 1100 LC/MSD. Condições Gerais de HPLC Coluna: Zorbax SB-Aq, 5 m. 4,6 x 250 mm Temperatura da coluna: 40 ºC Vazão do fluxo: 1,0 ml/min. Fases móveis: A = Água/ACN (98:2) + 0,1% TFA B = Água/ACN (10:90) + 0,1% TFA, Volume de injeção: 10 L Comprimento de onda do detector: 214 nm Método de HPLC 1

[0050] Os compostos brutos foram dissolvidos em água/ACN (50:50) em cerca de 1 mg/mL e analisados usando o seguinte gradiente durante 20 minutos (tempo (min)/% B): 0/10, 2,5/20, 9/75, 15/90, 17/90, 18/10, 20/10. Método de HPLC 2

[0051] Os compostos foram dissolvidos em água/ACN (90:10) em cerca de 1 mg/mL e analisados usando o seguinte gradiente durante 30 minutos (tempo (min)/% B): 0/10, 13/10, 23/65, 28/90, 29/90, 30/10. Método de HPLC 3

[0052] Os compostos foram dissolvidos em água/ACN (90:10) em cerca de 1 mg/mL e analisados usando o seguinte gradiente durante 55 minutos (tempo (min)/% B): 0/10, 10/20, 46/75, 47/90, 50/10, 55/10. Preparação 1: 4-(benziloxi)-2-etilfenil)trifluoro-λ4- borano, sal de potássio I-5 BnO BnO

HO Br I-1 I-2 I-3 BnO BnO

O B BF3K

O I-5 I-4 (a) 1-(benziloxi)-3-etilbenzeno (I-2)

[0053] A uma solução agitada de 3-etilfenol (I-1) (25,0 g, 204,0 mmol) em ACN (250 mL, 10 vol) foi adicionado carbonato de potássio (42,0 g, 306 mmol) à temperatura ambiente. A mistura reacional resultante foi agitada à temperatura ambiente por 15 minutos, seguida pela adição de brometo de benzila (24,0 mL, 204 mmol) gota a gota. A mistura reacional resultante foi agitada durante 6 horas à temperatura ambiente. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC), a massa reacional resultante foi despejada em água (1,0 L) seguida pela extração do composto com EtOAc (2 x 2L). Os orgânicos combinados foram lavados com água fria, solução de salmoura e secados em sulfato de sódio, filtrados e evaporados sob pressão reduzida. O produto bruto foi então purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (100-200M) usando eluentes 2% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-2) como um composto oleoso amarelo claro (35,0 g, 81%). 1H NMR (400 MHz, clorofórmio-d) δ 7,46-7,44 (m, 2H), 7,39 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,34-7,31 (m, 1H), 7,21 (t, J = 7,6 Hz), 6,86-6,80 (m, 3H), 5,07 (s, 2H), 2,64 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,24 (t, J = 7,6 Hz, 3H). (b) 4-(benziloxi)-1-bromo-2-etilbenzeno (I-3)

[0054] A uma solução gelada de 1-(benziloxi)-3- etilbenzeno (I-2) (35,0 g, 164 mmol) em ACN (525 mL, 15 vol) foi adicionado N-bromossuccinimida (32,0 g, 181 mmol) em porções ao longo de um período de 15 minutos. A mistura reacional resultante foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC), a massa reacional resultante foi despejada em água gelada (1,50 L) seguida pela extração do composto com EtOAc (2 x 1L). Os orgânicos combinados foram lavados com água fria e secados em sulfato de sódio, filtrados e evaporados sob pressão reduzida para obter o produto bruto. Foi adicionado n-Hexano (250 mL) ao material bruto, resultando em uma pasta, seguido por filtração por meio de um funil sinterizado. O licor-mãe foi evaporado sob pressão reduzida para obter o produto desejado I-3 como um composto oleoso amarelo claro

(42,0 g, 87%). 1H NMR (400 MHz, clorofórmio-d) δ 7,52-7,29 (m, 7H), 6,88 (s, 1H), 6,68 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,04 (s, 2H), 2,69 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,20 (t, J = 7,5 Hz, 3H). (c) 2-(4-(benziloxi)-2-etilfenil)-4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-dioxaborolano (I-4)

[0055] Uma solução agitada de 4-(benziloxi)-1-bromo-2- etilbenzeno (I-3) (42,0 g, 144 mmol), bis(pinacolato)diboron (44,0 g, 173 mmol) e acetato de potássio (28 g, 288 mmol) em dioxano (440 mL) foi desgaseificada por purga de N2 (g) durante 15 minutos, seguida pela adição de complexo PdCl2 (dppf).DCM (11,0 g, 15 mmol). A mistura reacional resultante foi aquecida até 80°C por 16 horas. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC), a massa reacional foi filtrada por leito Celite, o licor-mãe foi evaporado sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O resíduo bruto foi então purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (100-200M) usando eluentes 1% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-4) como um composto oleoso amarelo claro (32,0 g, 66%). 1H NMR (400 MHz, clorofórmio-d) δ 7,74 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,45-7,36 (m, 5H), 6,84-6,78 (m, 2H), 5,08 (s, 2H), 2,91 (q, J = 7,6 Hz), 1,33 (s, 12H), 1,19 (t, J = 7,6 Hz, 3H). (d) (4-(benziloxi)-2-etilfenil)trifluoro-λ4-borano, sal de potássio (I-5)

[0056] A uma solução agitada do composto 2-(4- (benziloxi)-2-etilfenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolano (I-4) (20 g, 59,0 mmol), em acetona:metanol (200 mL, proporção 1:1, 10 vol), foram adicionados 3M de solução de fluoreto de hidrogênio de potássio (23,0 g,

295 mmol, dissolvidos em 98,0 mL de água). A mistura reacional resultante foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC), a massa reacional resultante foi evaporada sob pressão reduzida. O sólido assim obtido foi retirado em água (100 mL) e agitado à temperatura ambiente durante 30 minutos. A massa reacional resultante foi filtrada através de um funil sinterizado, lavada com n-hexano e seca sob pressão reduzida para fornecer o produto desejado (I-5) como um sólido branco (14,0 g, 74%). 1H NMR (400 MHz, clorofórmio-d) δ 7,43 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,37 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,30 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,22 (d, J = 8,0 Hz), 6,58 (s, 1H), 6,53 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,00 (s, 2H), 2,65 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 1,07 (t, J = 7,4 Hz, 3H). Preparação 2: 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil- 3,4,6,7-tetra-hidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6- dicarboxilato (I-11) (a) (S)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico, sal cloridrato (I-7)

[0057] A uma suspensão agitada gelada de L-histidina (I- 6) (5,0 kg, 32,14 mol) em água (40 L, 8 vol.) foi adicionado ácido clorídrico concentrado (3,93 L, 33,75 mol), seguido pela adição de formaldeído (5,50 L, 67,5 mol, 37% de solução aquosa) gota a gota. A solução resultante foi agitada por 30 minutos à mesma temperatura e então aquecida a 80°C por 8 horas. O progresso da reação foi monitorado por LCMS. A água foi removida sob pressão reduzida para obter o produto bruto, e o produto bruto resultante foi agitado durante 2 horas em tolueno (20 L). Os orgânicos foram removidos sob pressão reduzida para remover o excesso de água e o composto foi seco azeotropicamente. O material resultante foi então retirado em éter dietílico (20 L) e agitado durante 2 horas. O material sólido foi então filtrado e seco ao ar para obter o produto desejado (I-7) como um sólido esbranquiçado (6,50 Kg, 85%). 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8,69 (s, 1H), 4,56 (d, J = 15,4 Hz, 1H), 4,42 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 5,5, 5,2 Hz, 1H), 3,42 (dd, J = 5,0, 17,0 Hz, 1H), 3,11 (dd, J = 10,2, 16,8 Hz, 1H). (b) (S)-3,5-bis(terc-butoxicarbonil)-4,5,6,7-tetra- hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-ácido carboxílico (I-8)

[0058] A uma solução gelada agitada de (S)-4,5,6,7- tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicloridrato de ácido carboxílico (I-7) (6,10 Kg, 25,40 mol) em 1,4-dioxano (48 L, 8 vol) e água (48 L, 8 vol) foi adicionada trietilamina (12,36 L, 89 mol) gota a gota, seguida pela adição de dicarbonato de di-terc-butil (18,07 L, 78,74 mol, dissolvido em 5 L de 1,4-dioxano) ao longo de um período de 30 minutos. A mistura reacional resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC e LCMS), a mistura reacional amarelada foi diluída com água (10 L) e lavada sucessivamente com éter dietílico (2 x 10 L) e EtOAc (2 x 7,50 L). A fase orgânica foi descartada. A camada aquosa foi resfriada e levada a um pH ~3 com solução de 6N HCl; a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 L). Os orgânicos combinados foram lavados com solução de salmoura, secados em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida. O material oleoso foi cristalizado a partir de 30% EtOAc:Hexanos para obter o produto desejado (I-8) como um sólido esbranquiçado (5,1 Kg, 55%). (m/z): [M+H]+ calculado para 368,18 de C17H25N3O6 foram encontrados 368,21. (c) 6-benzil 3,5-di-terc-butil (S)-6,7-di-hidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-3,5,6(4H)-tricarboxilato (I-9)

[0059] A uma solução gelada de ácido (S)-3,5-bis(terc- butoxicarbonil)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico (I-8) (5,1 Kg, 13,88 mol) em DCM (51 L, 10 vol) foi adicionado sequencialmente bicarbonato de sódio aquoso saturado (41,0 L, 8 vol), iodeto de tetra- butil amônio (5,13 Kg, 13,88 mol) e brometo de benzila (2,47 L, 20,82 mol). A mistura reacional resultante foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC e LCMS), a solução bifásica foi separada. A camada aquosa foi extraída com DCM (3 x 10 L). Os orgânicos combinados foram lavados com solução de salmoura e secados em sulfato de sódio, filtrados e concentrados sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna por meio de sílica gel (100-200M) usando eluentes 40% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-9) como óleo viscoso (4,50 Kg, 72%). (m/z): [M+H]+ calculado para 458,22 de C24H31N3O6 foram encontrados 458,60.

(d) 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3,4,6,7-tetra-hidro- 5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato (I-10)

[0060] A uma solução gelada de 6-benzil 3,5-di-terc- butil (S)-6,7-di-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-3,5,6(4H)- tricarboxilato (I-9)(4,50 Kg, 9,84 mol) em IPA (45 L, 10 vol) foi adicionado hidróxido de amônio (36 L, 8 vol) gota a gota. A mistura reacional resultante foi adicionalmente agitada em temperatura ambiente pelas próximas 16 horas. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC e LCMS), a mistura resultante foi diluída com água (25 L) seguida pela extração com EtOAc (3 x 20 L). Os orgânicos combinados foram lavados com solução de salmoura e secados em sulfato de sódio, filtrados e concentrados sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna por meio de sílica gel (100-200M) usando eluentes 2% MeOH em DCM para obter o produto desejado (I-10) como um óleo viscoso espesso (2,70 Kg, 77%). (m/z): [M+H]+ calculado para 358,17 de C19H23N3O4 foram encontrados 358,33. (e) 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-3,4,6,7- tetra-hidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato (I- 11)

[0061] A uma solução gelada de 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3,4,6,7-tetra-hidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6- dicarboxilato (I- 10) (2,70 kg, 7,55 mol) em DCM (32,4 L, 12 vol) foi adicionado hidróxido de sódio 1 N aquoso (24,3 L, 9 vol) seguido pela adição sequencial de iodeto de tetra- butil amônio (2,80 Kg, 7,55 mol) e brometo de benzila (0,99 L, 8,31 mol). A mistura reacional resultante foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. Após a conclusão da reação

(monitoramento de TLC e LCMS), a solução bifásica foi separada. A camada aquosa foi extraída com DCM (3 x 10 L). Os orgânicos combinados foram lavados com solução de salmoura e secados em sulfato de sódio, filtrados e concentrados sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (100- 200M) usando eluentes 40% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-11) como óleo viscoso (1,70 Kg, 63%). (m/z): [M+H]+ calculado para 448,22 de C26H29N3O4 foram encontrados 448,20. Preparação 3: 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-2- (6-bromo-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetra-hidro-5H- imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato (I-15) (a) Cloreto de 4-bromo-2-fluorobenzoil (I-13)

[0062] A uma solução gelada agitada de ácido 4-bromo-2- fluorobenzoico (I-12) (1,25 Kg, 5,71 mol) em DCM (12,5 L, 15 vol), foi adicionado cloreto de oxalil (0,98 L, 11,42 mol) gota a gota. A mistura reacional resultante foi agitada durante 10 minutos à mesma temperatura. DMF (150 mL) foi então adicionada gota a gota à mistura reacional. A massa reacional resultante foi deixada aquecer à temperatura ambiente e agitada por 2 horas. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC), o excesso de cloreto de oxalil foi removido sob pressão reduzida em uma atmosfera de nitrogênio para obter o produto bruto (I-13) (1,08 Kg, 80%), que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. (b) 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-2-(4-bromo- 2-fluorobenzoil)-3,4,6,7-tetra-hidro-5H-imidazo[4,5- c]piridina-5,6-dicarboxilato (I-14)

[0063] A uma solução gelada de 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-3,4,6,7-tetra-hidro-5H-imidazo [4,5- c]piridina-5,6-dicarboxilato (I-11) (1,70 Kg, 3,80 mol) em ACN (13,6 L, 8 vol) foi adicionada trietilamina (2,11 L, 15,2 mol) seguida pela adição de cloreto de 4-bromo-2- fluorobenzoil (I-13) (1,08 Kg, 4,56 mol em 3,4 L ACN, 2 vol) à temperatura ambiente. Após a conclusão da adição, a cor da mistura reacional mudou de amarelo claro para marrom. A mistura reacional resultante foi agitada à mesma temperatura por 30 horas e o progresso da reação foi monitorado por TLC. A mistura reacional resultante foi extinta com água gelada (10 L), seguida por extração com EtOAc (3 x 5 L) e os orgânicos combinados foram lavados com solução de salmoura. Os orgânicos foram secados em sulfato de sódio, filtrados e concentrados sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (100-200M) usando eluentes 20% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-14) (1,74 Kg, 71%). %). (m/z): [M+H]+ calculado para 648,14 de C33H31BrN3O5 foi encontrado 648,20.

(c) 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-2-(6-bromo- 1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetra-hidro-5H-imidazo[4,5- c]piridina-5,6-dicarboxilato (I-15)

[0064] A uma solução gelada de 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-2- (4-bromo-2-fluorobenzoil)-3,4,6,7-tetra- hidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato (I-14) (1,74 Kg, 2,68 mol) em THF (26,0 L, 15 vol) foi adicionado hidrato de hidrazina (0,705 L, 13,4 mol) à temperatura ambiente. A mistura reacional resultante foi aquecida a 60°C por 3 horas. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC), a massa reacional resultante foi despejada em água gelada (10 L) seguida pela extração do composto com EtOAc (3 x 10L). Os orgânicos combinados foram lavados com solução de salmoura e secados em sulfato de sódio, filtrados e evaporados sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (100-200M) usando eluentes 20% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-15) como sólido esbranquiçado (1,12 Kg, 65%). (m/z): [M+H]+ calculado para 642,16 de C33H32BrN5O4 foi encontrado 642,21. Preparação 4: 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-2- (6-(4-(benziloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7- tetra-hidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato (I- 16)

[0065] Bis(pinacolato)diboron (250 g, 984 mmol) foi carregado em um frasco de parede única de 3 gargalos de 5 L previamente gravado usando química de fluoreto, junto com propan-2-ol (1882 mL, 2,46E+04 mmol) e a mistura foi agitada até se dissolver completamente.

A dissolução foi endotérmica (-4 °C). Em um frasco Erlenmeyer de 4 L, previamente gravado usando química de fluoreto, foi dissolvido hidrofluoreto de fluoreto de potássio (538 g, 6891 mmol) em água (2.306 mL, 1,28E+05 mmol) para formar 3M de solução.

A dissolução foi endotérmica (-12 °C). A solução foi então filtrada para remover uma pequena quantidade de material insolúvel de KHF2. Assim que ambas as soluções foram dissolvidas completamente, o conteúdo do frasco Erlenmeyer foi carregado no frasco de parede única, em partes, durante 15 minutos.

Foi observada uma exotermia moderada (+10 ° C). A solução tornou-se uma pasta cinzenta semi-opaca espessa e translúcida durante a adição, e a agitação foi aumentada para manter o conteúdo bem misturado.

A mistura foi agitada durante 1,5 h e, em seguida, filtrada através de um funil de vidro sinterizado grosso (4 L, previamente gravado). A filtração demorou 30 a 45 minutos para ser concluída.

O filtrado bifásico límpido foi descartado.

Os sólidos brancos foram secados por 10 minutos no filtro (foi observada rachadura do material insolúvel). Os sólidos foram transferidos de volta para um frasco de parede única de 3 gargalos de 5 L limpo e novamente suspensos com água (1330 mL, 7,38E+04 mmol). A pasta foi agitada por 2 horas, sendo que após esse tempo, formou-se um hidrogel homogêneo límpido.

A solução foi agitada por mais 1 h e, depois, os sólidos/gel foram filtrados usando um funil de vidro grosso de 4 L (previamente gravado). Os sólidos foram deixados secar no filtro por 30 minutos. Os sólidos foram transferidos de volta para um frasco de parede única de 3 gargalos de 5 L limpo e novamente suspensos em acetona (1084 mL, 1,48E+04 mmol). A pasta branca/cinza foi agitada durante 1 h e foi filtrada em um funil de vidro grosso de 4 L (previamente gravado). A filtração demorou 20 minutos para ser concluída, e foi então secada no funil por mais 1 h. Durante esse tempo, os sólidos foram ocasionalmente agitados para garantir a secagem homogênea. Um pó branco claro permaneceu após a secagem no filtro. Os sólidos foram secos por 20 h a 55 ˚C sob vácuo com uma sangria lenta de nitrogênio para se obter um sólido branco fofo (200,3 g foram coletados).

[0066] A uma solução agitada de 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-2- (6-bromo-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetra- hidro-5H-imidazo[4,5-c] piridina-5,6-dicarboxilato (I-15) (10,0 g, 16,0 mmol) em 2-metil tetra-hidrofurano (100 mL, 10 vol) foram adicionados (4-(benziloxi)-2- etilfenil)trifluoro-λ4-borano, sal de potássio (I-5) (8,0 g, 20 mmol) e o sólido branco fofo obtido acima (0,20 g). A mistura reacional resultante foi desgaseificada com nitrogênio por 30 minutos. A esta solução, foi adicionada uma solução aquosa preparada de carbonato de césio (20,0 g, 62,0 mmol em 60 mL de água, 6 vol). A mistura reacional resultante foi desgaseificada adicionalmente por 15 minutos, seguida pela adição de bis(di-terc-butil(4- dimetilaminofenil)fosfina)dicloropaládio(II) (0,66 g, 0,93 mmol), e a mistura de reação foi evacuada sob vácuo e lavada por nitrogênio. A mistura reacional resultante foi aquecida a 110°C por 20 horas. Após a conclusão da reação (monitoramento de TLC e LCMS), a mistura reacional resultante foi resfriada à temperatura ambiente e filtrada em leito Celite, então, lavada adicionalmente com EtOAc (3 x 0,5 L). Os orgânicos combinados foram lavados com solução de hidróxido de sódio 1 N (3 x 0,5 L). Os orgânicos combinados foram lavados com solução de salmoura e secados em sulfato de sódio, filtrados e evaporados sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (100-200M) usando eluentes 20% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-16) (como mistura de N-benzil regioisômeros) como sólido amarelo claro (8,0 g, 66%). (m/z): [M+H]+ calculado para 774,36 de C48H47N5O5 foram encontrados 774,59. Preparação 5: (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo [4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico, cloridrato (I-18) (a) benzil (S)-3-benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2- etilfenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxilato, cloridrato (I-17)

[0067] 6-Benzil 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-2-(6-(4- (benziloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetra- hidro-5H-imidazo [4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato (I-16) (1,0 g, 1,292 mmol) foi dissolvido em dioxano (8 mL) e água (1,5 mL), em seguida foram adicionados 4 M de solução de cloreto de hidrogênio em dioxano (7 mL, 28,0 mmol) e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). A mistura reacional foi então congelada e liofilizada, e o produto bruto (I-17) foi usado diretamente na próxima reação (foi assumido rendimento quantitativo). (m/z): [M+H]+ calculado para 674,31 de C43H39N5O3 foram encontrados 674,3. (b) (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo [4,5-c]piridina-6-ácido carboxílico, cloridrato (I-18)

[0068] Benzil (S)-3-benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2- etilfenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxilato, cloridrato (I-17) (0,918 g, 1,292 mmol) foi dissolvido em 2-Propanol (15 mL), solução de cloreto de hidrogênio, 5 M em água (0,258 mL, 1,292 mmol) e água (0,25 mL) a 50 °C, então, foi adicionado paládio, 10% em peso, sobre carbono, 50% de água (0,138 g, 0,065 mmol). O frasco de reação foi então purgado com nitrogênio, um balão de hidrogênio foi anexado e a mistura reacional foi agitada a 50 °C por 4 dias com o balão de hidrogênio sendo reabastecido conforme necessário (progresso da reação monitorado por LCMS). Todos os sólidos foram então removidos por filtração e a solução resultante foi concentrada. O resíduo foi dissolvido em 1:1 ACN/Água, congelado e liofilizado. O pó resultante (I-18) foi usado sem purificação adicional (foi assumido rendimento quantitativo). (m/z): [M+H]+ calculado para 404,17 de C22H21N5O3 foram encontrados 404,2.

Preparação 6: de (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-ácido carboxílico (I-19)

[0069] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-ácido carboxílico, HCl (I-18) (0,25 g, 0,568 mmol) foi suspenso em DMF (2,5 mL) e acetona (2,5 mL), em seguida, foram adicionados ácido acético (0,098 mL, 1,705 mmol) e cianoboro-hidreto de sódio (0,179 g, 2,84 mmol), e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). A mistura reacional foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (5-70% ACN/gradiente de água, 50 g coluna C18aq) para fornecer o sal de TFA do composto título (149 mg, 47% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 446,21 de C25H27N5O3 foram encontrados 446,3. Preparação 7: (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico (I-20)

[0070] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-ácido carboxílico HCl (I-18) (0,160 g, 0,364 mmol) e propionaldeído (0,039 mL, 0,546 mmol) foram dissolvidos em metanol (3,0 mL), então foi adicionado cianoborohidreto de sódio (0,069 g, 1,091 mmol) e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). A mistura reacional foi concentrada e o produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (5-70% ACN/gradiente de água, 50 g coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto título (78 mg, 38% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 446,21 de C25H27N5O3 foram encontrados 446,3. Preparação 8: (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico (I-21)

[0071] (S)-2-(6- (2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo [4,5-c]piridina-6-ácido carboxílico, HCl (I-18) (0,160 g, 0,364 mmol) e solução de formaldeído, 37% em peso, em água (0,032 mL, 0,436 mmol)

foram dissolvidos em metanol (3,0 mL), então foi adicionado cianoborohidreto de sódio (0,069 g, 1,091 mmol) e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Boro-hidreto de sódio (14 mg, 0,364 mmol) foi adicionado para extinguir o excesso de formaldeído e, em seguida, a mistura reacional foi concentrada. O produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (5-70% ACN/gradiente de água, 50 g coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto título (110 mg, 57% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 418,18 de C23H23N5O3 foram encontrados 418,2. Preparação 9: (R)-2-(3-metilpiperazin-1-yl)etan-1-ol, dicloridrato (I-24) (a) terc-butil (R)-4-(2-hidroxietil)-2- metilpiperazina-1-carboxilato (I-23)

[0072] (R)-1-boc-2-metil-piperazina (0,2 g, 0,999 mmol), DIPEA (0,698 mL, 3,99 mmol) e 2-bromoetanol (0,085 mL, 1,198 mmol) foram dissolvidos em DMF (5 mL) e a mistura reacional foi agitada a 60 °C durante 16 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). A mistura reacional foi concentrada e, em seguida, 10 mL de éter dietílico foram adicionados ao resíduo. A solução foi sonicada até o gel residual ter desaparecido e um sólido se formado. A solução de éter foi então decantada do sólido. O sólido foi então usado diretamente na próxima reação (o rendimento quantitativo foi assumido). (m/z): [M+H]+ calculado para 245,18 de C12H24N2O3 foram encontrados 245,4. (b) (R)-2-(3-metilpiperazin-1-yl)etan-1-ol, dicloridrato (I-24)

[0073] Terc-butil (R)-4-(2-hidroxietil)-2- metilpiperazina-1-carboxilato (0,244 g, 0,999 mmol) foi dissolvido em dioxano (3,0 mL) e água (0,5 mL), em seguida a solução de cloreto de hidrogênio, 4 M em dioxano (2,0 mL, 65,8 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). A mistura de reação foi congelada e liofilizada, e o produto resultante foi usado sem purificação (foi assumido rendimento quantitativo). (m/z): [M+H]+ calculado para 145,13 de C7H16N2O foi encontrado 145,4. Exemplo 1: (S)-(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridin-6-il)(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)metanona 1

[0074] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-propil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina- 6-ácido carboxílico, TFA (I-20) (40 mg, 0,071 mmol), n-(2- hidroxietil)piperazina (0,018 mL, 0,143 mmol) e DIPEA (0,025 mL, 0,143 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,5 mL), em seguida, HATU (40,8 mg, 0,107 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante

3 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (0,011 mL, 0,357 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e, em seguida, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-70% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (31 mg, 56% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 558,31 de C31H39N7O3 foram encontrados 558,3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,10 (s, 1H), 12,27 (d, J = 48,92 Hz, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,28 (t, J = 8,10 Hz, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,04 (m, 2H), 6,71 (d, J = 2,46 Hz, 1H), 6,64 (dd, J = 2,50, 8,23 Hz, 1H), 4,44 (t, J = 5,31 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 5,26, 2H), 3,96 (m, 1H), 3,86-3,52 (m, 6H), 3,49 (q, J = 6,01 Hz, 2H), 2,95 (m, 2H), 2,48 (q, J = 7,48 Hz, 2H), 2,42-2,21 (m, 4H), 2,37 (t, J = 6,20 Hz, 2H), 1,42 (m, 2H), 1,00 (t, J = 7,52 Hz, 3H), 0,81 (m, 3H). Exemplo 2: ((S) -2- (6- (2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridin-6-il) ((1S, 4S)-5-metil-2,5-diazabiciclo[2.2.1] heptan-2-il)metanona 2

[0075] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-propil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico, TFA (I-20) (40 mg,

0,071 mmol), (1S,4S)-5-Metil-2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptano di-hidrobrometo (29,4 mg, 0,107 mmol), e DIPEA (0,062 mL, 0,357 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,5 mL), em seguida, HATU (40,8 mg, 0,107 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (0,011 mL, 0,357 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e, em seguida, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-70% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (32 mg, 59% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 540,30 de C31H37N7O2 foram encontrados 540,3. Exemplo 3: ((S) -2,4-dimetilpiperazin-1-il)((S)-2-(6- (2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7- tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona 3 (a) terc-butil (S)-4-((S)-2-(6-(2-etil-4- hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetra-hidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carbonil)-3-metilpiperazina-1- carboxilato (I-25)

[0076] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-metil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina- 6-ácido carboxílico, TFA (I-21) (55 mg, 0,103 mmol), (s)-4- n-boc-2-metilpiperazina (41,5 mg, 0,207 mmol) e DIPEA

(0,036 mL, 0,207 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,5 mL), em seguida, HATU (59,0 mg, 0,155 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (0,016 mL, 0,517 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e, em seguida, a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (5-70% ACN/gradiente de água, 50 g coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (54 mg, 72% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 600,33 de C33H41N7O4 foram encontrados 600,3. (b) ((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-metil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il) ((S)-2-metilpiperazin-1-il)metanona (I-26)

[0077] Terc-butil (S)-4-((S)-2-(6-(2-etil-4- hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetra-hidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carbonil)-3-metilpiperazina-1- carboxilato, TFA (I-25) (0,126 g, 0,177 mmol) foi dissolvido em dioxano (1,5 mL) e água (0,3 mL), em seguida, solução de cloreto de hidrogênio, 4 M em dioxano (1,5 mL, 6,00 mmol) foi adicionada e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). A mistura reacional foi então congelada e liofilizada, e o pó resultante foi usado diretamente na próxima reação (foi assumido rendimento quantitativo). (m/z): [M+H]+ calculado para 500,27 de C28H33N7O2 foram encontrados 500,3.

(c) ((S)-2,4-dimetilpiperazin-1-il)((S)-2-(6-(2-etil- 4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetra- hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona

[0078] ((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-metil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il)((S)-2-metilpiperazin-1-il)metanona, dicloridrato (0,101 g, 0,176 mmol) e solução de formaldeído, 37% em peso em água (0,016 mL, 0,212 mmol) foram dissolvidos em metanol (3,0 mL), em seguida, foi adicionado cianoboro-hidreto de sódio (0,055 g, 0,882 mmol) e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Boro-hidreto de sódio (7 mg, 0,176 mmol) foi adicionado para extinguir qualquer formaldeído restante. A mistura reacional foi concentrada, então o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-60% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (28 mg, 21% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 514,29 de C29H35N7O2 foram encontrados 514,3. Exemplo 4: (S)-(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H- imidazo[4,5 -c]piridin-6-il) (4-metil-1,4-diazepan-1- il)metanona 4

[0079] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico, TFA (I-19) (50 mg, 0,089 mmol), 1-metil-homopiperazina (0,022 mL, 0,179 mmol) e DIPEA (0,031 mL, 0,179 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,5 mL), em seguida, HATU (51,0 mg, 0,134 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (0,014 mL, 0,447 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos.

A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (2-70% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (29 mg, 42% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 542,32 de C31H39N7O2 foram encontrados 542,3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,08 (s, 1H), 12,21 (d, J = 29,9 Hz, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,27 (d, J = 8,33 Hz, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,04 (t, J = 8,05, 2H), 6,71 (d, J = 2,53 Hz, 1H), 6,64 (dd, J = 2,54, 8,23 Hz, 1H), 4,11 (m, 3H), 3,91-3,52 (m, 6H), 2,97 (m, 1H), 2,91-2,53 (m, 4H), 2,49 (q, J = 7,46, 2H), 2,23 (d, J = 13,9 Hz, 3H), 1,76 (m, 2H), 1,0 (m, 9H). Exemplo 5: (S) - (2- (6- (2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridin-6-il)((R)-4-(2-hidroxietil)-2-metilpiperazin-1- il) metanona

[0080] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-metil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina- 6-ácido carboxílico, TFA (I-21) (55 mg, 0,103 mmol), (R)-2- (3-metilpiperazin-1-il)etan-1-ol, dicloridrato (I-24) (33,7 mg, 0,155 mmol) e DIPEA (0,090 mL, 0,517 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,5 mL), em seguida, HATU (59,0 mg, 0,155 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas ( o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (0,016 mL, 0,517 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e, em seguida, a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos.

A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-70% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (22 mg, 28% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 544,30 de C30H37N7O3 foram encontrados 544,3. Exemplo 6: ((S)-3-(dimetilamino)pirrolidin-1-il) ((S)- 2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil- 4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona

6

[0081] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico, TFA (I-19) (50 mg, 0,089 mmol), (S)-(-)-3-(dimetilamino)pirrolidina (0,023 mL, 0,179 mmol) e DIPEA (0,031 mL, 0,179 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,5 ml), em seguida, HATU (51,0 mg, 0,134 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (0,014 mL, 0,447 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-70% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (37 mg, 53% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 542,32 de C31H39N7O2 foram encontrados 542,3. Exemplo 7: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)(2-(6- (2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil- 4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona 7

[0082] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico, TFA (I-19) (50 mg, 0,089 mmol), 3-(Dimetilamino)azetidina dicloridrato(23,20 mg, 0,134 mmol) e DIPEA (0,078 mL, 0,447 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,5 mL), em seguida, HATU (51,0 mg, 0,134 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (0,014 mL, 0,447 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-70% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (25 mg, 37% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 528,30 de C30H37N7O2 foram encontrados 528,3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,09 (s, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,27 (d, J = 8,31, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,04 (m, 2H), 6,71 (d, J = 2,54, 1H), 6,64 (dd, J = 2,53, 8,26, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,06 (m, 2H), 3,82 (m, 2H), 3,64 (m, 2H), 3,03 (m, 2H), 2,74 (m, 2H), 2,47 (q, J = 7,56, 2H), 2,07 (d, J = 3,69, 6H), 1,07 (m, 6H), 1,00 (t, J = 7,50, 3H). Preparação 10: 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-1-benzil-2- (6-(4-(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1H-indazol-3-il)- 1,4,6,7-tetra-hidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6- dicarboxilato

[0083] A uma solução agitada de 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-1-benzil-2- (6-bromo-1H-indazol-3-yl)-1,4,6,7-tetra-

hidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato (1,12 kg, 1,74 mol) em 2-metiltetra-hidrofurano (11,2 L, 10 Vol.) foram adicionados ((4-(benziloxi)-2-etil-5- fluorofenil)trifluoroborano, sal de potássio) (0,702 Kg, 2,1 mol) e o sólido branco fofo isolado na Preparação 4 (0,223 Kg, 1,04 mol). A mistura reacional resultante foi desgaseificada com gás de nitrogênio pelos próximos 30 minutos por meio da entrada de um gotejador.

A esta solução, foi adicionada uma solução aquosa preparada de Cs2CO3 (2,27 Kg, 6,96 mol em 7,30 mL de H2O, 6 vol). A mistura reacional resultante foi desgaseificada adicionalmente ao longo dos próximos 15 min.

Foi adicionado Pd (anfos) (0,74 Kg, 1,04 mol) à mistura reacional resultante e a mistura reacional foi evacuada sob vácuo e lavada com nitrogênio.

A mistura reacional resultante foi aquecida a 90 °C durante 20 horas.

Após a conclusão da reação, a mistura reacional resultante foi resfriada à temperatura ambiente e filtrada em leito Celite e lavada com acetato de etila (3 x 7,5 L). Os orgânicos combinados foram lavados com solução de 1N NaOH (3 x 3 L). Os orgânicos combinados foram lavados com solução de salmoura e secados em Na2SO4, filtrados e evaporados sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (100- 200M) usando eluentes 20% de acetato etílico em hexano para obter o produto do título como uma mistura de regioisômeros como um sólido esbranquiçado (1,10 Kg, 80%). (m/z): [M+H]+ calculado para 792,92 de C48H46FN5O5 foi encontrado 792,34. Preparação 11: Benzil (S)-1-benzil-2-(6-(4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-

tetra-hidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxilato, 2 ácido benzenossulfônico

[0084] A uma solução de 6-benzil 5-(terc-butil) (S)-1- benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1H- indazol-3-il)-1,4,6,7-tetra-hidro-5H-imidazo[4,5- c]piridina-5,6-dicarboxilato (1.005 g, 1269 mmol) em 2- metiltetra-hidrofurano (10.050 mL) e acetato de isopropila (4.321,5 mL) sob nitrogênio foi adicionado ácido benzenossulfônico (703 g, 4,442 mmol). A mistura reacional resultante foi agitada a 50°C por 15 horas. À reação concluída foi adicionado acetato de isopropila (5.728,5 mL). A pasta foi resfriada até 20 °C e mantida durante 1 hora. A pasta espessa foi então filtrada sob pressão de nitrogênio. O material insolúvel foi então enxaguado com acetato de isopropil (5.000 mL) e seco sob pressão de nitrogênio a 25 ºC durante 2 horas, seguido por secagem adicional a 60 ºC durante 16 horas sob alto vácuo com sangria de nitrogênio para proporcionar o composto do título como um sólido esbranquiçado de fluxo livre (rendimento de 1.210 g, 95%). (m/z): [M+H]+ calculado para 692,81 de C43H38FN5O3 foi encontrado 692,88. Preparação 12: Benzil (S)-1-benzil-2-(6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1H-indazol-3-il)-5-

isopropil-4,5,6,7-tetra-hidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina-6- carboxilato

O O O O F O N F O NH N N N HN N N HN N

[0085] A uma suspensão de peneiras moleculares (1,21 Kg) em acetona (12,0 L) foram adicionados benzil (S)-1-benzil- 2-(6-(4-(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1H- indazol-3- il)-4,5,6,7-tetra-hidro-1H-imidazo [4,5-c]piridina-6- carboxilato, 2 ácido Benzenossulfônico (1,20 kg, 1.190 mmol) e ácido acético (26 mL, 446 mmol). A suspensão foi deixada a agitar a 25 ºC ao longo de 30 minutos para produzir uma mistura heterogênea de cor esbranquiçada a amarela. À mistura reacional foi adicionado triacetoxiboro-hidreto de sódio (492 g, 2.321 mmol) e agitada a 25 ºC durante 1 hora. A mistura reacional foi filtrada em celite e o material insolúvel foi lavado com 2-metiltetra-hidrofurano (500 mL). O filtrado foi diluído com 2-metiltetra-hidrofurano (8,0 L) e o solvente trocado por destilação de acetona. Para lavar a solução foi adicionado bicarbonato de sódio saturado (3.025 mL) e a mistura foi agitada durante 1 hora, a agitação foi interrompida, as camadas foram separadas durante 15 minutos, a camada aquosa (pH = 7,5) foi descartada e a lavagem foi repetida desta vez permitindo 2 horas de agitação antes da separação das camadas. A camada orgânica foi destilada até 2,0 L, foi adicionado acetato de isopropilo (8,0 L) e o solvente foi trocado por destilação de 2- metiltetra-hidrofurano para produzir uma pasta. A pasta foi agitada a 20 ºC ao longo de 1 hora, em seguida, filtrada sob pressão de nitrogênio para se obter o composto do título como um sólido esbranquiçado (795 g, 91% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 734,89 de C46H44FN5O3 foi encontrado 734,96. Preparação 13: (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4- hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetra- hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-ácido carboxílico, 2HCl

[0086] A uma solução homogênea, desgaseificada e agitada de benzil (S)-1-benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2-etil-5- fluorofenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetra- hidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxilato (760 g, 1,036 mmol), propan-2-ol (3.800 mL) e cloreto de hidrogênio 1M (aq) (2589 mL, 2.589 mmol) a 50oC foi adicionado a 10% em peso de Pd/C, 50% em peso de H2O (76 g, 35,7 mmol) imediatamente seguido pelo borbulhamento de gás hidrogênio através da mistura reacional durante 4 horas. Mistura reacional filtrada em bloco Celite (200 gramas). Ao filtrado amarelo escuro límpido foi adicionado SiliaMetS Thiol (76 g, como um sólido branco) e agitado a 50oC durante 1 hora para limpar o restante do paládio. O SiliaMetS Thiol foi removido por filtração através de um filtro de 0,2 mícron para produzir um filtrado homogêneo de cor amarela clara, SiliaMetS Thiol era então laranja brilhante. Ao filtrado foi adicionado acetato de isopropila (7.600 mL) e foi concentrado em rotovap para aproximadamente 3,0 litros. À solução concentrada, como uma suspensão turva, foi adicionado acetato de isopropila (7.600 mL) seguido por concentração de aproximadamente 3,0 litros. Ao concentrado, a seguir como uma pasta espessa, foi adicionado acetato de isopropil (7.600 mL), ponto em que a pasta fluiu livremente e foi filtrável. A pasta foi filtrada e o material insolúvel enxaguado com acetato de isopropil (3.000 mL), seco sob alto vácuo ao longo de 1 hora, em seguida, seco ainda sob alto vácuo com sangria de nitrogênio a 50oC ao longo de 18 horas para se obter o composto do título (472 g, 81% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 464,51 de C25H26FN5O3 foi encontrado 464,58. Exemplo 8: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)(2-(6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5- isopropil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il)metanona

[0087] A uma solução agitada de (S)-2-(6-(2-etil-5- fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil- 4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-ácido carboxílico, 2HCl (470 g, 876 mmol) e N, N-dimetilazetidin- 3-amina, 2HCl (197 g, 1,139 mmol) em N, N-dimetilacetamida (2.436 mL) resfriada a -20 ºC, foi adicionado DIPEA (413 mL,

2.366 mmol) por não menos que 15 minutos (a adição exotérmica fez com que a temperatura do lote subisse para -9,1oC). O lote foi resfriado de volta a -15 ºC e HCTU (453 g, 1095 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida a 20oC durante 1 hora e mantida por mais uma hora. Na mistura reacional concluída foi adicionado acetato de isopropil (5,0 L) e 1M HCl (2,0 L) e a mistura foi agitada durante 15 minutos, as camadas foram separadas para extrair impurezas para a camada de acetato de isopropil.

A camada aquosa que continha o produto foi extraída três vezes adicionais com acetato de isopropil (5,0 L cada). Após a 4ª extração, a camada aquosa foi adicionada a 2-metiltetra-hidrofurano, seguido por solução saturada de bicarbonato de sódio (~2,2 L, para ajustar o pH = 8), agitada 15 minutos, as camadas foram separadas e a camada aquosa descartada.

A camada orgânica foi trocada com solvente por acetonitrila e agitada em um volume final de 2,35 L, momento em que o produto precipitou da solução como sólidos amorfos filtráveis.

A pasta espessa foi então filtrada sob pressão de nitrogênio para obter 345 gramas de produto bruto.

O produto bruto (345 g) foi dissolvido em metanol (1,035 L) com agitação a 55 ºC e foi mantido durante 15 horas para cristalizar o produto da solução.

A pasta foi resfriada até 10 °C e mantida nessa temperatura com agitação durante 2 horas.

A pasta espessada foi filtrada sob pressão de nitrogênio ao longo de 2 horas a 20 ºC seguida por secagem adicional sob alto vácuo com sangria de nitrogênio a 65 ºC ao longo de 18 horas para se obter o composto do título como um sólido esbranquiçado a branco de fluxo livre (253 g, rendimento de 53%). (m/z): [M+H]+ calculado para 546,66 de C30H36FN7O2 foi encontrado 546,73. Preparação 14: (S) -5-etil-2-(6-(2-etil-4- hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H- imidazo [4,5-c]piridina-6-ácido carboxílico

[0088] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c] piridina-6-ácido carboxílico, HCl (0,100 g, 0,227 mmol) (I-18) e acetaldeído (0,019 mL, 0,341 mmol) foram dissolvidos em metanol (3,0 mL), em seguida, foi adicionado cianoborohidreto de sódio (0,057 g, 0,909 mmol) e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Boro-hidreto de sódio (9 mg, 0,227 mmol) foi adicionado para extinguir qualquer acetaldeído restante, em seguida, a mistura reacional foi concentrada. O produto bruto foi então purificado por cromatografia de fase reversa (5-70% ACN/gradiente de água, 40 g coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (62 mg, 50% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 432,20 de C24H25N5O3 foram encontrados 432,1. Exemplo 9: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)(5-etil- 2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7- tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona

HO O N N N N HN N N

H 9

[0089] (S)-5-etil-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico, TFA (30 mg, 0,055 mmol), 3-

(dimetilamino)azetidina dicloridrato(14,28 mg, 0,082 mmol) e DIPEA (0,048 mL, 0,275 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,50 mL), em seguida, HATU (31,4 mg, 0,082 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (5,18 µL, 0,165 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e, em seguida, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-60% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (25 mg, 63% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 514,29 de C29H35N7O2 foram encontrados 514,2. Exemplo 10: (S)-(3-(dimetilamino)-3-metilazetidin-1- il)(5-etil-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)- 4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona

HO O N N N N N

HN N H 10

[0090] (S)-5-etil-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H- indazol-3-il)-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo [4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico, TFA (30 mg, 0,055 mmol), cloridrato de N,N,3-trimetilazetidin-3-amina (12,43 mg, 0,082 mmol) e DIPEA (0,048 mL, 0,275 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,50 mL), em seguida HATU (31,4 mg, 0,082 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (5,18 µL, 0,165 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e, em seguida, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-60% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (25 mg, 62% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 528,30 de C30H37N7O2 foram encontrados 528,2. Exemplo 11: (S)-(3-(dimetilamino)-3-metilazetidin-1- il)(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil) -1H-indazol-3-il)-5- isopropil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il)metanona 11

[0091] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-ácido carboxílico (40 mg, 0,090 mmol) (I-19) cloridrato de N,N,3-trimetilazetidin-3-amina (20,29 mg, 0,135 mmol) e DIPEA (0,047 mL, 0,269 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,50 mL), em seguida HATU (51,2 mg, 0,135 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (8,45 µL, 0,269 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e, em seguida, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-60% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (26 mg, 38% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 542,32 de C31H39N7O2 foram encontrados 542,2. Exemplo 12: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il)(2-(6- (2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7- tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona 12

[0092] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-propil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina- 6-ácido carboxílico, TFA (30 mg, 0,054 mmol) (I-20) 3- (dimetilamino)azetidina dicloridrato (13,92 mg, 0,080 mmol) e DIPEA (0,047 mL, 0,268 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,50 mL), em seguida, HATU (30,6 mg, 0,080 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (5,05 µL, 0,161 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e, em seguida, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-60% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de

TFA do composto do título (26 mg, 63% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 528,30 de C30H37N7O2 foram encontrados 528,2. Exemplo 13: (S)-(3-(dimetilamino)-3-metilazetidin-1- il)(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil) -1H-indazol-3-il)-5- propil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il)metanona

HO O N N N N HN N N

H 13

[0093] (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3- il)-5-propil-4,5,6,7-tetra-hidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina- 6-ácido carboxílico, TFA (30 mg, 0,054 mmol) (I-20), cloridrato de N,N,3-Trimetilazetidin-3-amina (12,12 mg, 0,080 mmol) e DIPEA (0,047 mL, 0,268 mmol) foram dissolvidos em DMF (1,50 mL), em seguida HATU (30,6 mg, 0,080 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora (o progresso da reação foi monitorado por LCMS). Hidrazina (5,05 µL, 0,161 mmol) foi adicionada para clivar os subprodutos indesejados e, em seguida, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura reacional foi então concentrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparatória (5-60% ACN/gradiente de água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do composto do título (18 mg, 44% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 542,32 de C31H39N7O2 foram encontrados 542,2.

Ensaios biológicos

[0094] Os compostos da divulgação foram caracterizados em um ou mais dos seguintes ensaios biológicos. Ensaio 1: Ensaios bioquímicos de JAK quinase

[0095] Um painel de quatro ensaios bioquímicos LanthaScreen JAK (JAK 1, 2, 3 e Tyk2) foi realizado em um tampão de reação de quinase comum (HEPES 50 mM, pH 7,5, Brij- 35 0,01%, MgCl2 10 mM e EGTA 1 mM). As enzimas JAK marcadas com GST recombinante e o substrato de peptídeo STAT1 marcado com GFP foram adquiridos da Life Technologies.

[0096] Os compostos de diluição em série ou em separado foram pré-incubados com cada uma das quatro enzimas JAK e o substrato em microplacas com 384 poços brancas (Corning) à temperatura ambiente durante 1 hora. ATP foi adicionado subsequentemente para iniciar as reações de quinase em 10 l de volume total, com 1% de DMSO. As concentrações enzimáticas finais para JAK1, 2, 3 e Tyk2 são 4,2 nM, 0,1 nM, 1 nM e 0,25 nM, respectivamente; as concentrações correspondentes de Km ATP usadas são 25 M, 3 M, 1,6 M e 10 M; enquanto a concentração de substrato é de 200 nM para todos os quatro ensaios. As reações da quinase continuaram por 1 hora à temperatura ambiente antes de serem adicionados 10 μl de uma preparação de EDTA (10 mM de concentração final) e anticorpo Tb-anti-pSTAT1 (pTyr701) (Life Technologies, 2 nM concentração final) em tampão de diluição TR-FRET (Life Technologies). As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 1 hora antes de serem lidas no leitor EnVision (Perkin Elmer). Os sinais de taxa de emissão (520 nm/495 nm) foram registrados e usados para calcular a percentagem de valores de inibição com base no DMSO e nos controles de fundo.

[0097] Para análise de resposta-dose, os dados percentuais de inibição foram inseridos em um gráfico versus as concentrações de compostos, e os valores de IC50 foram determinados a partir de um modelo de ajuste robusto de 4 parâmetros com o programa Prism (GraphPad Software). Os resultados foram expressos como pIC50 (logaritmo negativo de IC50) e, posteriormente, convertidos em pKi (logaritmo negativo da constante de dissociação, Ki) usando a equação de Cheng-Prusoff.

[0098] Os compostos de teste com um valor de Ki inferior ou valor de pKi superior em cada um dos quatro ensaios de JAK mostram maior inibição da atividade de JAK. Ensaio 2: Inibição de pSTAT5 estimulada por IL-2 em células T Tall-1

[0099] A potência dos compostos de teste para inibição da fosforilação de STAT5 estimulada pela interleucina-2 (IL- 2) foi medida nas células T Tall-1 humanas usando AlphaLisa. Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK1/3, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK1/3.

[00100] STAT5 fosforilado foi medido através do kit pSTAT5 AlphaLISA kit (Tyr694/699) (PerkinElmer).

[00101] As células T humanas da linhagem celular Tall- 1 foram cultivadas a 37°C, em incubadora umidificada a 5% de CO2 em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 15% de Soro Fetal Bovino Inativado pelo Calor (SFB, Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM de HEPES (Life Technologies) e 1X Pen/Strep (Life

Technologies). Os compostos foram diluídos em série em DMSO e distribuídos acusticamente em poços vazios. Os meios de ensaio (DMEM sem fenol vermelho (Life Technologies) suplementados com FBS a 10% (ATCC)) foram distribuídos (4 μl/poço) e as placas foram agitadas a 900 rpm durante 10 minutos. As células foram semeadas a 45.000 células/poço nos meios de ensaio (4 μl/poço) e incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 1 hora, seguida pela adição de IL-2 (R&D Systems; concentração final 300 ng/ml) em meios de ensaio pré- aquecidos (4 μl) durante 30 minutos. Após a estimulação com citocinas, as células foram lisadas com 6 μl de tampão de lise 3x AlphaLisa (PerkinElmer) contendo 1x PhosStop e comprimidos Complete (Roche). O lisado foi agitado a 900 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente (TA). STAT5 fosforilado foi medido através do kit pSTAT5 AlphaLisa kit (PerkinElmer). A mistura de pérolas aceptoras recém- preparadas foi distribuída no lisado (5 μl) sob luz verde filtrada <100 lux. As placas foram agitadas a 900 rpm durante 2 minutos, giradas levemente e incubadas durante 2 horas a TA no escuro. As pérolas doadoras foram distribuídas (5 μl) sob luz verde filtrada <100 lux. As placas foram agitadas a 900 rpm durante 2 minutos, giradas levemente e incubadas durante a noite a TA no escuro. A luminescência foi medida com excitação a 689 nm e emissão a 570 nm usando um leitor de placas EnVision (PerkinElmer) sob luz verde filtrada <100 lux.

[00102] Para determinar a potência inibitória dos compostos de teste em resposta a IL-2, foi medida a intensidade de emissão mediana das pérolas ligadas a pSTAT5 em uma linhagem celular T humana. Os valores de IC50 foram determinados a partir da análise das curvas de inibição de intensidade versus concentração do composto. Os dados foram expressos em valores de pIC50 (logaritmo decádico negativo IC50) (média±desvio padrão). Resultados dos ensaios in vitro

[00103] Os compostos da divulgação foram testados nos quatro ensaios de enzima JAK; JAK1, JAK2, JAK3 e Tyk2, e o ensaio de potência celular BEAS-2B descrito acima. Tabela 1: J J Ta Número do AK1 AK2 J T ll-1 Exemplo p p AK3 pKi yk2 pKi pI Ki Ki C50 1 1 9 9 8. 1

0.2 0.3 .8 .0 8 1 1 9 8 8. 2

0.3 0.2 .8 .9 4 1 1 1 9 8. 3

0.2 0.4 0.2 .3 8 1 1 1 9 8. 4

0.1 0.4 0.1 .0 6 1 1 1 9 8. 5

0.3 0.5 0.1 .2 8 1 1 1 9 8. 6

0.2 0.4 0.0 .0 7 1 1 1 9 8. 7 0.2 0.5 0.2 .1 6

1 1 1 9 8. 8 0.4 0.8 0.1 .5 8 1 1 1 9 8. 9 0.3 0.7 0.3 .2 7 1 1 1 9 8. 10 0.4 0.6 0.2 .1 6 1 1 9 9 8. 11 0.0 0.8 .9 .1 7 1 1 1 9 8. 12 0.5 0.6 0.3 .0 7 1 1 9 9 8. 13 0.3 0.5 .8 .0 6 Ensaio 3: Modelo murino (camundongo) de indução de pSTAT6 induzida por IL-13 no tecido pulmonar

[00104] A IL-13 é uma importante citocina subjacente à fisiopatologia da asma (Kudlacz et al. Eur. J. Pharmacol, 2008, 582,154-161). A IL-13 se liga a receptores de superfície celular ativando membros da família Janus de quinases (JAK), que então fosforilam STAT6 e, subsequentemente, ativa outras vias de transcrição. No modelo descrito, uma dose de IL-13 foi administrada localmente nos pulmões de camundongos para induzir a fosforilação de STAT6 (pSTAT6), que é então medida como o desfecho.

[00105] Foram usados camundongos Balb/c de Harlan no ensaio. No dia do estudo, os animais foram levemente anestesiados com isoflurano e receberam o veículo ou composto de teste (1 mg/mL, volume total de 50 µL em várias respirações) por meio de aspiração oral. Os animais foram colocados em decúbito lateral após a dose e monitorados para recuperação total da anestesia antes de serem devolvidos à sua gaiola. Quatro horas depois, os animais foram novamente anestesiados brevemente e desafiados com o veículo ou IL-13 (0,03 µg de dose total administrada, 50 µL de volume total) por meio de aspiração oral antes de serem monitorados para recuperação da anestesia e devolvidos à sua gaiola. Uma hora após a administração de veículo ou IL-13, o sangue total e os pulmões foram coletados para detecção de pSTAT6 em homogenatos pulmonares usando um kit de ensaio Perkin Elmer AlphaLISA® SureFire® Ultra ™ HV p-STAT6 (Tyr641) e para análise de concentração total de droga no pulmão e no plasma. As amostras de sangue foram centrifugadas (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos a aproximadamente 12.000 rpm a 4 °C para coletar o plasma. Os pulmões foram enxaguados em DPBS (solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco), secos com absorventes, congelados rapidamente, pesados e homogeneizados a uma diluição de 1:3 em ácido fórmico a 0,1% em água para HPLC. Os níveis plasmáticos e pulmonares do composto de teste foram determinados por análise LC-MS contra padrões analíticos construídos em uma curva padrão na matriz do teste. Foi determinada uma razão pulmão para plasma como a proporção da concentração pulmonar em ng/g para a concentração plasmática em ng/mL em 5 horas.

[00106] A atividade no modelo é evidenciada por uma diminuição no nível de pSTAT6 presente nos pulmões dos animais tratados em 5 horas em comparação com os animais de controle desafiados com IL-13, tratados com veículo. A diferença entre os animais de controle que foram tratados com veículo, desafiados com IL-13 e os animais de controle que foram tratados com veículo, desafiados com o veículo ditou o efeito inibidor de 0% e 100%, respectivamente, em qualquer experimento.

Os compostos testados no ensaio exibiram inibição da fosforilação de STAT6 5 horas após o desafio com IL-13 como documentado abaixo.

Tabela 2: Inibição de pSTAT6 e exposição plasmática/pulmonar observada

Concen Concen Prop tração tração orção Inib Comp pulmonar plasmática pulmão ição de osto (ng/g) em 5 (ng/mL) em 5 para pSTAT6 em h h plasma em 5 horas 5 h

13000± 10,3±3 1 1262 67 5720 ,9

23450± 17,5±2 2 1340 72 12528 5

6330±1 3 15,4±7 411 76 131

17350± 22,0±2 4 788 67 6625 3

5445±1 13,0±3 5 418 73 862 ,7

11600± 11,3±5 6 1026 37 4682 ,7

Concen Concen Prop tração tração orção Inib Comp pulmonar plasmática pulmão ição de osto (ng/g) em 5 (ng/mL) em 5 para pSTAT6 em h h plasma em 5 horas 5 h 10155± 24,0±1 7 423 75 1979 6,2 22138± 8 58±17 381 51 5547 7750±1 9 23±6 339 72 652 5130±2 10 24±6 216 73 205 15000± 11 55±21 271 72 3349 6940±4 12 25±9 281 55 248 7465±3 13 23±2,5 330 66 084

[00107] A observação de concentração significativa em compostos testados no pulmão de camundongo confirmou que a inibição observada da indução de pSTAT6 induzida por IL-13 foi um resultado da atividade do composto de teste. A proporção pulmão para plasma em 5 horas mostrou que os compostos 1 a 6 exibiram significativamente mais exposição no pulmão do que exposição no plasma em camundongos.

Ensaio 4: Inibição da liberação de TARC evocada por TSLP em células mononucleares do sangue periférico humano

[00108] A linfopoietina do estroma tímico (TSLP) e o timo e a quimiocina regulada por ativação (TARC) são superexpressos nas vias aéreas asmáticas e se correlacionam com a gravidade da doença. Nos pulmões, a TSLP pode ser liberada pelas células epiteliais brônquicas em resposta a alérgenos e infecções virais. A TSLP é sinalizada através de um heterodímero IL-7Rα/TSLPR encontrado em uma ampla variedade de tecidos e tipos de células, incluindo células epiteliais, células endoteliais, neutrófilos, macrófagos e mastócitos. A ligação de TSLP ao seu receptor induz uma mudança conformacional que ativa JAK1 e JAK2 para fosforilar vários fatores de transcrição, incluindo STAT3 e STAT5. Nas células imunológicas, isto desencadeia uma cascata de eventos intracelulares que resultam em proliferação celular, anti-apoptose, migração de células dendríticas e produção de citocinas Th2 e quimiocinas. Em células mononucleares do sangue periférico (PBMC), a TLSP tem um efeito pró- inflamatório ao ativar as células dendríticas mieloides para atrair e estimular as células T, um processo mediado pelo quimioatraente TARC.

[00109] Neste ensaio, foi demonstrado que a estimulação da TSLP induz a liberação de TARC das PBMCs e que esta resposta é atenuada de forma dose-dependente com o tratamento com composto. As potências dos compostos do teste foram medidas para inibição de liberação de TARC.

[00110] PBMCs (anteriormente isoladas do sangue total e congeladas em alíquotas a -80 °C) de 3 a 5 doadores foram descongeladas a 37 oC, e adicionadas gota a gota a 40 mL de meio RPMI completo, pré-aquecido e filtrado para se tornar estéril, em tubos Falcon de 50 mL. As células foram peletizadas e novamente suspensas em meio completo a 2,24×106 células/mL. As células foram semeadas a 85 L (190.000 células) por poço em uma microplaca de fundo plano de 96 poços tratada com cultura de tecido. As células foram deixadas em repouso por 1 hora a 37°C com 5% de CO2.

[00111] Os compostos foram recebidos como soluções estoque 10 mM em DMSO. Foram realizadas diluições em série de 3,7 vezes para gerar 9 concentrações do composto de teste em DMSO a 300 vezes a concentração de teste do ensaio final. Foram realizadas diluições intermediárias de 150 vezes em meio completo para gerar o composto a 2 vezes a concentração de teste do ensaio final com 0,2% de DMSO. Após o período de descanso de 1 hora, 95 L de 2X composto foram adicionados a cada poço de PBMC, para uma faixa de concentração de ensaio final de 33,33 M a 0,95 M. 95 L de 0,2% de DMSO em meio completo foram adicionados aos poços de controle não tratados. As células foram tratadas com o composto por 1 hora a 37°C com 5% de CO2 antes da estimulação.

[00112] A proteína TSLP humana recombinante foi reconstituída a 10 ug/mL em DPBS estéril com BSA a 0,1% e armazenada em alíquotas a -20 °C. Imediatamente antes do uso, uma alíquota foi descongelada e preparada a 20X a concentração final do ensaio em meio completo. 10 L de 20X TSLP foram adicionados a cada poço de PBMC, para uma concentração de ensaio final de 10 ng/mL. 10 L de meio completo foram adicionados aos poços de controle não estimulados. As células foram estimuladas na presença do composto por 48 horas a 37°C com 5% de CO2.

[00113] Após a estimulação, os sobrenadantes da cultura celular foram colhidos e os níveis de TARC foram detectados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), usando o Kit ELISA Humano CCL17/TARC Quantikine (R&D Systems # DDN00) de acordo com as instruções do fabricante.

[00114] Para a análise de resposta à dose, o log [composto de teste (M)] foi traçado versus os valores de resposta percentual para cada doador, e os valores de IC50 foram determinados usando uma análise de regressão não linear com o software GraphPad Prism usando o algoritmo de resposta à dose sigmoidal de 4 parâmetros com inclinação variável. Os dados foram expressos como valores médios de pIC50 (logaritmo decádico negativo IC50) calculados a partir de valores de pIC50 de doadores individuais e arredondados para a casa decimal. Os valores de potência para inibição estão resumidos na Tabela 3. Tabela 3: Valores de potência (pIC50) de compostos de teste para inibição da liberação de TARC evocada por TSLP em células mononucleares do sangue periférico humano Composto pIC50 ± desvio padrão 1 7,1 ± 0,1 2 6,8 ± 0,2 3 7,3 ± 0,2 4 6,8 ± 0,1 5 7,5 ± 0,6 6 6,8 ± 0,2

7 7,2 ± 0,1 8 7,0 ± 0,1

[00115] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a aspectos específicos ou suas modalidades, aqueles que são versados na técnica compreenderão que diversas alterações podem ser feitas ou equivalentes podem ser substituídos, sem se afastar do verdadeiro espírito e do escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação particular, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapas de processo, ao objetivo, espírito e escopo da presente invenção. Todas essas modificações estão destinadas a estar dentro do escopo das reivindicações. Além disso, todas as publicações, patentes e documentos de patente citados aqui são incorporados por referência em sua totalidade, como se cada documento tivesse sido incorporado individualmente por sua referência.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES:

1. Processo para preparação de um composto da fórmula J-15 ou de seu sal: caracterizado pelo fato de que X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; e PG3 é um grupo de proteção amino; o processo compreendendo: (a) reagir um composto da fórmula J-14: ou seu sal, com hidrazina para obter o composto da J- 15 e (b) opcionalmente formar um sal do composto J-15.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela reação com hidrazina ser conduzida a 60 °C ± 20 °C.

3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por

X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 ser um grupo alquil ou benzil em que o grupo benzil é opcionalmente substituído; PG2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; e PG3 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por X ser Br, PG1 ser benzil, PG2 ser terc-butoxicarbonil e PG3 ser benzil.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por o composto da fórmula J-14 ou seu sal ser preparado por: (a) reagir um composto da fórmula J-13: em que Y é um grupo de saída, com um composto da fórmula J-11: na presença de uma base, para obter J-14, e (b) opcionalmente formar um sal do composto J-14.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por Y ser Cl.

7. Composto da fórmula J-14: ou seu sal, caracterizado por X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; e PG3 é um grupo de proteção amino.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 7, ou seu sal, caracterizado por X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 ser um grupo alquil ou benzil em que o grupo benzil é opcionalmente substituído; PG2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; e PG3 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ter a fórmula I-14.

I-14 ou seu sal.

10. Composto da fórmula J-15: ou seu sal, caracterizado por X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; e PG3 é um grupo de proteção amino.

11. Composto, de acordo com a reivindicação 10, ou seu sal, caracterizado por X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 ser um grupo alquil ou benzil em que o grupo benzil é opcionalmente substituído; PG2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; e

PG3 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ter a fórmula I-15: I-15 ou seu sal.

13. Processo para preparação de um composto da fórmula J-16 ou de seu sal: caracterizado por PG1 é um grupo de proteção ácido carboxílico; PG2 é um grupo de proteção amino; PG3 é um grupo de proteção amino; PG4 é um grupo de proteção hidroxil; e R é H ou F; o processo compreendendo: (a) reagir um composto da fórmula J-13:

em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; e Y é um grupo de saída; com um composto da fórmula J-11:

na presença de uma base, para obter um composto da fórmula J-14:

e, opcionalmente, formar um sal do composto J-14; (b) reagir o composto da fórmula J-14 ou seu sal, com hidrazina, para obter um composto da fórmula J-15:

e, opcionalmente, formar um sal do composto J-15; (c) reagir o composto da fórmula J-15 ou seu sal, com um composto da fórmula J-5, J-6 ou J-7:

J-5 J-6 J-7 em que Ra e Rb são cada selecionados independentemente de C1-8 alquil, em que Ra e Rb podem opcionalmente ser unidos para formular um anel de 4 a 8 membros, na presença de uma base, um catalisador de paládio e um ligante fosfina para obter o composto da fórmula J-16 e, opcionalmente, formar um sal do composto J-16.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela etapa (c) ser conduzida na presença de um reagente diboron ou de um catalisador.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela etapa (c) ser conduzida na presença de tetra-hidroxidiboron, um éster diborônico ou o produto da reação de bis(pinacolato)diboron com hidrofluoreto de fluoreto de potássio.

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pela reação com hidrazina na etapa (b) ser conduzida a 60 °C ± 20 °C.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado por X é selecionado a partir do grupo que consiste em Br, I e Cl; PG1 ser um grupo alquil ou benzil em que o grupo benzil é opcionalmente substituído;

PG2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; PG3 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo acil, um grupo alcoxicarbonil, um grupo arilmetil e um grupo silil; PG4 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo silil, um grupo acil e um grupo arilmetil.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado por X ser Br, PG1 ser benzil, PG2 ser terc-butoxicarbonil, PG3 ser benzil e PG4 ser benzil.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado por Y ser Cl.

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado por o catalisador de paládio e o ligante fosfina da etapa (c) serem bis(di-terc- butil(4-dimetilaminofenil)fosfina)dicloropaládio(II).

21. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado por o composto da fórmula J-5 ser usado na etapa (c).