TWI808083B - Jak抑制劑化合物之結晶型式 - Google Patents

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Abstract

本發明提供5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚之草酸鹽及琥珀酸鹽結晶水合物。本發明亦提供包含該等結晶水合物之醫藥組合物、使用該等結晶水合物治療呼吸道疾病及其他疾病之方法，及適用於製備該等結晶草酸鹽及琥珀酸鹽水合物之方法。

Description

JAK抑制劑化合物之結晶型式
本發明係關於適用於治療呼吸道疾病及其他疾病之JAK抑制劑化合物之結晶鹽型式。本發明亦係關於包含此類化合物之醫藥組合物、使用該等鹽型式治療例如呼吸道疾病及眼部疾病之方法，及適用於製備此類結晶鹽型式之方法及中間物。
細胞介素為細胞間信號傳導分子，其包括趨化因子、干擾素、介白素、淋巴介質及腫瘤壞死因子。細胞介素對於正常細胞生長及免疫性調節為關鍵的且亦驅動免疫介導之疾病且有助於惡性細胞生長。許多細胞介素之較高含量已涉及大量疾病或病況，特定言之表徵為炎症之彼等疾病之病變。涉及疾病之多種細胞介素依賴於酪胺酸激酶(JAK)之傑納斯(Janus)家族而在整個信號傳導路徑起作用，該酪胺酸激酶經由轉錄因子之信號轉導子及轉錄活化因子(STAT)家族來傳導信號。
JAK家族包含四個成員JAK1、JAK2、JAK3及酪胺酸激酶2 (TYK2)。細胞介素結合至JAK依賴性細胞介素受體誘導受體二聚合，其使得JAK激酶上之酪胺酸殘基磷酸化，從而影響JAK活化。磷酸化JAK轉而結合各種STAT蛋白質並使其磷酸化，該等蛋白質在細胞核中二聚合、內化且直接調節基因轉錄，在其他作用中，導致與發炎疾病相關的下游作用。JAK通常與細胞介素受體成對締合作為均二聚體或雜二聚體。特定細胞介素與特定JAK配對相關。JAK家族之四個成員中之每一者涉及與發炎相關的細胞介素中之至少一者之信號傳導。
哮喘為氣管之慢性疾病，其無預防或治癒方法。該疾病表徵為氣管發炎、纖維化、高反應性及重塑，其皆促成氣流限制。全世界估計有3億人罹患哮喘，且據估計，截至2025年，患有哮喘的人數將增長超過1億。雖然大多數患者可使用吸入皮質類固醇實現對哮喘症狀之控制，該等吸入皮質類固醇可與白三烯修飾劑及/或長效β促效劑組合，但仍有一部分患有重度哮喘之患者之疾病不受習知療法控制。涉及經由JAK-STAT路徑傳導信號之哮喘發炎之細胞介素包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、IL-13、IL-23、IL-31、IL-27、胸腺基質淋巴生成素(TSLP)、干擾素-γ (IFNγ)及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。氣管發炎為除哮喘以外之其他呼吸疾病所特有的。慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化症(CF)、肺炎、間質性肺病(包括特發性肺纖維化)、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、支氣管炎、氣腫及阻塞性細支氣管炎亦為呼吸道疾病，咸信其中之病理生理學與JAK信號傳導細胞介素相關。
炎症在許多眼部疾病中起重要作用，包括眼色素層炎、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、乾眼病、年齡相關之黃斑變性及異位性角膜結膜炎。眼色素層炎涵蓋多種眼內發炎病況且通常為自體免疫性的，在無已知感染性觸發的情況下出現。估計該病況在美國影響約2百萬患者。在一些患者中，與眼色素層炎相關之慢性發炎引起組織破壞，且在美國其為失明之第五個主要原因。在眼色素層炎患者眼睛中較高的經由JAK-STAT路徑傳導信號之細胞介素包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-23及IFN-γ。(Horai及Caspi,J Interferon Cytokine Res ,2011 ,31 , 733-744；Ooi等人,Clinical Medicine and Research ,2006 ,4 , 294-309)。用於眼色素層炎之現有療法通常為次佳的，且許多患者控制不良。類固醇儘管通常有效，但卻與白內障及增加之眼內壓/青光眼相關。
糖尿病性視網膜病變(DR)由對視網膜中之血管的損傷引起。在患有糖尿病之人群中其為最常見的視力喪失原因。血管生成路徑以及發炎路徑在疾病中起重要作用。通常，DR將發展為糖尿病性黃斑水腫(DME)，患有糖尿病之患者中視覺喪失之最常見原因。估計該病況僅在美國就影響約一百五十萬患者，其中約20%患有影響雙眼的疾病。咸信，經由JAK-STAT路徑傳導信號之細胞介素(諸如IL-6)以及其產生部分地藉由JAK-STAT路徑信號傳導驅動之其他細胞介素(諸如IP-10及MCP-1 (或者稱為CCL2))在與DR/DME相關的炎症中起作用(Abcouwer,J Clin Cell Immunol ,2013 ,增刊 1 , 1-12；Sohn等人,American Journal of Opthalmology ,2011 ,152 , 686-694；Owen及Hartnett,Curr Diab Rep ,2013 ,13 , 476-480；Cheung等人,Molecular Vision ,2012 ,18 , 830-837；Dong等人,Molecular Vision ,2013 ,19 , 1734-1746；Funatsu等人,Ophthalmology ,2009 ,116 , 73-79)。針對DME之現有療法為次佳的：玻璃體內抗VEGF治療僅在一部分患者中有效，且類固醇與白內障及增加之眼內壓相關。
乾眼病(DED)為影響美國約5百萬患者之多因素病症。咸信眼表面炎症在此疾病之發展及傳播中起重要作用。已注意到在患有DED之患者眼液中較高含量之細胞介素，諸如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6及IFN-γ。(Stevenson等人,Arch Ophthalmol ,2012 ,130 , 90-100)，且含量通常與疾病嚴重程度有關。亦認為年齡相關之黃斑變性及異位性角膜結膜炎與JAK依賴性細胞介素相關。
2016年11月02日申請之共同受讓之美國申請案第15/341,226號揭示適用作JAK抑制劑之二胺化合物。特定言之，化合物5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚(化合物1 )在申請案中尤其揭示為強力泛JAK抑制劑。
為了有效地將此化合物用作治療劑，將需要具有結晶固態鹽型式。舉例而言，其極宜具有在適當高溫下熱穩定之物理型式，從而促進材料之加工及儲存。結晶固體通常優於非晶型式以提高製品之純度及穩定性。然而，有機化合物之結晶型式的形成高度不可預測。尚不存在可靠方法來預測有機化合物之何種型式(若存在)將結晶。 此外，尚不存在方法來預測何種結晶型式(若存在)具有用作藥劑所需之物理特性。
先前未曾報導化合物1 之結晶鹽型式。因此需要化合物1 之結晶鹽型式。
本發明提供5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚(1 )之草酸鹽及琥珀酸鹽結晶水合物。
已發現5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚之草酸鹽結晶水合物的熔化溫度在約266℃至約276℃之範圍內，且在室溫下暴露於約30%與約90%之間的相對濕度範圍時呈現約1%之總水分吸收率。
已發現5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚之琥珀酸鹽結晶水合物的熔化溫度在約180℃至約190℃之範圍內，且在室溫下暴露於約5%與約90%之間的相對濕度範圍時呈現約2%之總水分吸收率。
在其他用途當中，本發明之結晶固體型式預期適用於製備供治療或改善能夠用JAK抑制劑治療之疾病，特定言之呼吸道疾病用的醫藥組合物。因此，在其組合物態樣之另一態樣中，本發明提供一種包含醫藥學上可接受之載劑及選自以下之活性劑之醫藥組合物：5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚之草酸鹽結晶水合物及5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚之琥珀酸鹽結晶水合物。
本發明亦提供一種治療哺乳動物之呼吸道疾病，特定言之哮喘的方法，該方法包含向該哺乳動物投與結晶固體型式或本發明之醫藥組合物。在單獨且不同的態樣中，本發明亦提供適用於製備本發明之結晶型式之合成方法。
本發明進一步提供一種治療哺乳動物之眼部發炎疾病的方法，該方法包含向該哺乳動物眼部投與結晶固體型式或本發明之醫藥組合物。
本發明亦提供一種如本文所描述用於醫學治療中之本發明之結晶固體型式，以及本發明之結晶固體型式在製造供治療哺乳動物之呼吸道疾病用的調配物或藥劑中之用途。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2017年5月1日申請之美國臨時申請案第62/492,571號之權益，該申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
定義 除非另外指明，否則當描述本發明(包括其各個態樣及實施例)時，以下術語具有以下含義。
術語「治療有效量」意謂當向需要治療之患者投與時足以實現治療之量。
術語「治療(treating/treatment)」意謂預防、改善或遏制患者(特定言之人類)正在治療之醫學病況、疾病或病症(例如呼吸道疾病)；或減輕醫學病況、疾病或病症之症狀。
術語「水合物」意謂由本發明之水分子及化合物分子形成之通常呈結晶型式的複合物或聚集物，其中水分子與化合物分子之比率可小於1:1或大於1:1。
術語「約」意謂指定值的± 5%。
必須注意，如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，除非內容另外明確指示，否則單數型式「一(a/an)」、「一個」及「該」可包括複數個參考物。
命名規則 化合物1 根據如實施於ChemDraw軟體(PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA)中之IUPAC規則命名為5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚。
此外，在化合物1 之結構中之四氫咪唑并吡啶部分之咪唑并部分以互變異構型式存在，如下文針對實例1之化合物片段所說明。
根據IUPAC規則，此等圖示產生咪唑部分之原子之不同編號：2-(1H -吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶(結構A)與2-(1H -吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-3H -咪唑并[4,5-c]吡啶(結構B)。應瞭解，雖然結構係以具體型式展示或命名，但本發明亦包括其互變異構體。
本發明之結晶型式 在一個態樣中，本發明提供5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚(1 )之草酸鹽結晶水合物。
在一個態樣中，結晶草酸鹽水合物表徵為在以下之2θ值處具有顯著繞射峰值(在其他峰值中)之粉末X射線繞射(PXRD)圖案：6.77±0.20、12.13±0.20、13.54±0.20、17.23±0.20及18.00±0.20。結晶草酸鹽水合物可進一步表徵為在選自以下之2θ值處具有兩個或更多個額外繞射峰值，包括三個或更多個額外繞射峰值之PXRD圖案：11.56±0.20、14.29±0.20、19.51±0.20、21.38±0.20及23.63±0.20。在另一態樣中，結晶草酸鹽水合物表徵為在以下之2θ值處具有繞射峰值之PXRD圖案：6.77±0.20、11.56±0.20、12.13±0.20、13.54±0.20、14.29±0.20、17.23±0.20、18.00±0.20、19.51±0.20、21.38±0.20及23.63±0.20。
如粉末X射線繞射之領域中所熟知，與相對峰高度相比，PXRD光譜之峰值位置對實驗細節(諸如樣品製備及儀器幾何結構之細節)相對更不敏感。因此，在一個態樣中，結晶草酸鹽水合物表徵為粉末x射線繞射圖案，其中峰值位置實質上與圖1中所示之彼等峰值位置一致。
在另一態樣中，當暴露於高溫時，結晶草酸鹽水合物藉由其行為表徵。如圖2中所表明，在每分鐘10℃之加熱速率下記錄之差示掃描熱量測定(DSC)跡線呈現去溶劑化吸熱，其具有在約59℃下之起始及在約97℃下之峰值及吸熱熱流中之峰值(鑑別為熔融轉化)在約266℃至約276℃之範圍內，包括在約268℃與約273℃之間。圖3之熱解重量分析(TGA)跡線展示在約26℃之溫度下之去溶劑化起始及在約250℃之溫度下之分解起始。綜合而言，DSC及TGA跡線表明熔融轉化伴隨著分解。TGA特徵曲線展示在約25℃與約75℃之間約5.5%的重量損失。
本發明結晶草酸鹽水合物已表明具有可逆的吸附/解吸附型態，其具有輕微吸濕性傾向。草酸鹽水合物在室溫下暴露於約30%與約90%之間的相對濕度範圍時呈現約1%之總水分吸收率，如圖4中所示。在約0%與15%相對濕度之間觀測到可逆的水合作用/脫水轉化。在吸附及解吸附之兩個循環中未觀測到滯後。
在另一態樣中，本發明提供5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚(1 )之琥珀酸鹽結晶水合物。
在一個態樣中，結晶琥珀酸鹽水合物表徵為在以下之2θ值處具有顯著繞射峰值(在其他峰值中)之粉末X射線繞射(PXRD)圖案：4.81±0.20、9.66±0.20、14.93±0.20及16.78±0.20。結晶琥珀酸鹽水合物可進一步表徵為在選自以下之2θ值處具有兩個或更多個額外繞射峰值，包括三個或更多個額外繞射峰值之PXRD圖案：10.46±0.20、16.21±0.20、17.45±0.20、22.87±0.20及24.77±0.20。在另一態樣中，結晶草酸鹽水合物表徵為在以下之2θ值處具有繞射峰值之PXRD圖案：4.81±0.20、9.66±0.20、10.46±0.20、14.93±0.20、16.21±0.20、16.78±0.20、17.45±0.20、22.87±0.20及24.77±0.20。在又一態樣中，結晶琥珀酸鹽水合物表徵為粉末x射線繞射圖案，其中峰值位置實質上與圖5中所示之彼等峰值位置一致。
當暴露於高溫時，結晶琥珀酸鹽水合物亦藉由其行為表徵。如圖6中所表明，在每分鐘10℃之加熱速率下記錄之差示掃描熱量測定(DSC)跡線呈現兩種去溶劑化吸熱：一種具有在約20℃下之起始及在約50℃下之峰值，第二種去溶劑化吸熱具有在約103℃下之起始及在約129℃下之峰值。DSC跡線進一步呈現吸熱熱流中之峰值(鑑別為熔融轉化)在約180℃至約190℃之範圍內，包括在約183℃與約188℃之間。圖7之熱解重量分析(TGA)跡線展示在約200℃之溫度下的分解起始。
已證明結晶琥珀酸鹽水合物具有可逆的吸附/解吸附型態，其具有輕微吸濕性傾向。琥珀酸鹽水合物在室溫下暴露於約5%與約90%之間的相對濕度範圍時呈現約2%之總水分吸收率，如圖8中所示。在吸附及解吸附之兩個循環中未觀測到滯後。
合成程序 化合物1 可由易於得到的起始物質使用以下實例中所描述之程序或使用本申請案之先前技術章節中所列之共同受讓之美國申請案中所描述的程序來製備。
本發明之結晶草酸鹽水合物宜藉由在室溫下將化合物1 與草酸之等莫耳混合物溶解於四氫呋喃與水之1:1混合物中，接著添加四氫呋喃:水:乙腈之1:1:2混合物作為反溶劑以產生懸浮液來製備。在室溫下將所得反應混合物攪拌約一天，用乙腈洗滌，並乾燥以得到結晶水合物型式。
本發明結晶琥珀酸鹽水合物可藉由三階段方法製備。第一，在室溫下將化合物1 與琥珀酸之等莫耳混合物懸浮於異丙醇中並攪拌約一天。將所得固體過濾，用異丙醇洗滌，並乾燥以得到第一中間物結晶固體。第二，在約150℃下將分離之第一中間物結晶固體乾燥約30分鐘以得到第二中間物結晶固體。第三，在室溫下使第二中間物固體在約80%至90%相對濕度下平衡約一天以得到結晶琥珀酸鹽水合物型式。
因此在一方法態樣中，本發明提供一種製備5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚之草酸鹽結晶水合物之方法，該方法包含：(a)在室溫下將5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚:草酸之1:1混合物溶解於四氫呋喃:水之1:1混合物中，(b)添加四氫呋喃:水:乙腈之1:1:2混合物以產生懸浮液，(c)攪拌該懸浮液約一天，及(d)將結晶草酸鹽水合物與懸浮液分離。
醫藥組合物 本發明之結晶固體型式通常以醫藥組合物或調配物型式使用。此類醫藥組合物可有利地藉由吸入向患者投與。另外，可藉由任何可接受之投與途徑投與醫藥組合物，包括但不限於經口、局部(包括經皮)、經直腸、經鼻及非經腸投與模式。
因此，在本發明組合物態樣中之一者中，本發明係關於一種包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑及化合物1 之結晶草酸鹽水合物或結晶琥珀酸鹽水合物的醫藥組合物。視情況，必要時此等醫藥組合物可含有其他治療劑及/或調配劑。當論述組合物及其用途時，本發明之結晶固體型式在本文中亦可稱作「活性劑」。
本發明之醫藥組合物通常含有治療有效量之本發明結晶型式。然而，熟習此項技術者將認識到，醫藥組合物可含有大於治療有效量(亦即，主體成分)或小於治療有效量(亦即，經設計用於多次投與以獲得治療有效量之單個單位劑量)。
通常，此類醫藥組合物將含有約0.01至約95重量%之活性劑；包括例如約0.05至約30重量%；及約0.1重量%至約10重量%之活性劑。
任何習知載劑或賦形劑可用於本發明之醫藥組合物中。選擇特定載劑或賦形劑，或載劑或賦形劑之組合將視用於治療特定患者或特定類型之醫學病狀或疾病病況的投藥模式而定。就此而言，對於特定投藥模式，適合醫藥組合物之製備完全在熟習醫藥技術者之範疇內。另外，本發明之醫藥組合物中所使用之載劑或賦形劑為可商購的。作為進一步說明，習知調配技術描述於Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000)；及H.C. Ansel等人, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第7版, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999)中。
可充當醫藥學上可接受之載劑之材料的代表性實例包括但不限於以下：糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素，諸如微晶纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如丙三醇、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原質水；等張鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；及其他用於醫藥組合物中之無毒相容物質。
典型地藉由將活性劑與醫藥學上可接受之載劑及一或多種視情況選用之成分充分且緊密地混合或摻合來製備醫藥組合物。隨後可使用習知程序及設備將所得均勻摻合之混合物成形為錠劑、膠囊、丸劑及其類似物或裝載至其中。
在一個態樣中，醫藥組合物適用於吸入投與。用於吸入投與之醫藥組合物典型地呈氣霧劑或粉劑型式。此類組合物一般使用吸入劑遞送裝置投與，諸如乾粉吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)、噴霧器吸入器或類似遞送裝置。
在一特定實施例中，醫藥組合物藉由用乾粉吸入器吸入來投與。此類乾粉吸入器通常以在吸氣期間分散於患者之氣流中之自由流動粉劑型式投與醫藥組合物。為了獲得自由流動粉劑組合物，治療劑典型地與諸如乳糖、澱粉、甘露糖醇、右旋糖、聚乳酸(PLA)、聚乳酸交酯-共-乙交酯(PLGA)或其組合之適合的賦形劑一起調配。典型地，使治療劑微粉化且與適合的載劑組合以形成適用於吸入之組合物。
適用於乾粉吸入器之代表性醫藥組合物包含乳糖及呈微粉化型式之本發明之結晶固體型式。此類乾粉組合物可例如藉由將乾燥研磨乳糖與治療劑組合，且隨後乾摻合該等組分來製得。隨後典型地將組合物裝載至乾粉施配器中或與乾粉遞送裝置一起使用之吸入套筒或膠囊中。
適用於藉由吸入投與治療劑之乾粉吸入器遞送裝置描述於此項技術中且此類裝置之實例為可商購的。舉例而言，代表性乾粉乾粉吸入器遞送裝置或產品包括Aeolizer (Novartis)；Airmax (IVAX)；ClickHaler (Innovata Biomed)；Diskhaler (GlaxoSmithKline)；Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline)；Ellipta (GlaxoSmithKline)；Easyhaler (Orion Pharma)；Eclipse (Aventis)；FlowCaps (Hovione)；Handihaler (Boehringer Ingelheim)；Pulvinal (Chiesi)；Rotahaler (GlaxoSmithKline)；SkyeHaler/Certihaler (SkyePharma)；Twisthaler (Schering-Plough)；Turbuhaler (AstraZeneca)；Ultrahaler (Aventis)；及其類似物。
在另一特定實施例中，醫藥組合物使用定量吸入器藉由吸入來投與。此類定量吸入器典型地使用壓縮推進劑氣體，排出量測量之治療劑。因此，使用定量吸入器投與之醫藥組合物典型地包含治療劑於液化推進劑中之溶液或懸浮液。可採用任何適合的液化推進劑，包括氫氟烷烴(HFA)，諸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)及1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷(HFA 227)；及氯氟碳化物，諸如CCl3 F。在一特定實施例中，推進劑為氫氟烷烴。在一些實施例中，氫氟烷烴調配物含有共溶劑，諸如乙醇或戊烷；及/或界面活性劑，諸如脫水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂及丙三醇。
適用於定量吸入器之代表性醫藥組合物包含約0.01重量%至約5重量%本發明化合物；約0重量%至約20重量%乙醇；及約0重量%至約5重量%界面活性劑；其中剩餘部分為HFA推進劑。此類組合物典型地藉由向含有治療劑、乙醇(若存在)及界面活性劑(若存在)之適合容器中添加經冷卻或經加壓之氫氟烷烴來加以製備。為製備懸浮液，將治療劑微粉化，且隨後與推進劑組合。隨後將組合物裝載至典型地形成定量吸入器裝置之一部分的氣霧劑罐中。
適用於藉由吸入投與治療劑之定量吸入器裝置描述於此項技術中且此類裝置之實例為可商購的。舉例而言，代表性定量吸入器裝置或產品包括AeroBid吸入器系統(Forest Pharmaceuticals)；Atrovent吸入氣霧劑(Boehringer Ingelheim)；Flovent (GlaxoSmithKline)；Maxair吸入器(3M)；Proventil吸入器(Schering)；Serevent吸入氣霧劑(GlaxoSmithKline)；及其類似物。
在另一特定態樣中，醫藥組合物使用噴霧器吸入器藉由吸入來投與。此類噴霧器裝置典型地產生使醫藥組合物噴霧為進入患者之呼吸道之霧狀物的高速空氣流。因此，當適用於噴霧器吸入器調配時，可使治療劑溶解於適合載劑中以形成溶液。或者，治療劑可經微粉化或奈米研磨且與適合載劑組合以形成懸浮液。
適用於噴霧器吸入器之代表性醫藥組合物包含溶液或懸浮液，其包含約0.05 μg/mL至約20 mg/mL本發明化合物及與霧化調配物相容之賦形劑。在一個實施例中，溶液之pH為約3至約8。
適用於藉由吸入投與治療劑之噴霧器裝置描述於此項技術中且此類裝置之實例為可商購的。舉例而言，代表性噴霧器裝置或產品包括Respimat Softmist吸入器(Boehringer Ingelheim)；AERx肺部遞送系統(Aradigm Corp.)；PARI LC Plus可再用噴霧器(Pari GmbH)；及其類似物。
在又一態樣中，本發明之醫藥組合物可替代地以意欲用於經口投與之劑量型式製備。用於經口投藥之適合醫藥組合物可呈膠囊、錠劑、丸劑、口含錠、扁囊劑、糖衣藥丸、散劑、顆粒型式；或呈於水性或非水性液體中之溶液或懸浮液型式；或呈水包油或油包水液體乳液型式；或呈酏劑或糖漿型式；及其類似型式；各自含有預定量之本發明化合物作為活性成份。
當意欲以固體劑量型式經口投與時，本發明之醫藥組合物將典型地包含活性劑及一或多種醫藥學上可接受之載劑，諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣。視情況或替代地，此類固體劑量型式亦可包含：填充劑或增量劑、黏合劑、保濕劑、溶液阻滯劑、吸收加速劑、濕潤劑、吸附劑、潤滑劑、著色劑及緩衝劑。釋放劑、濕潤劑、包衣劑、甜味劑、調味劑及芳香劑、防腐劑及抗氧化劑亦可存在於本發明之醫藥組合物中。
結晶固體型式亦可調配為用於眼部注射之無菌水性懸浮液或水溶液。可包括於此類水性調配物中之適用賦形劑包括聚山梨醇酯80、羧基甲基纖維素、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、醋酸鈉、檸檬酸鈉、組胺酸、α-α-二水合海藻糖、蔗糖、聚山梨醇酯20、羥基丙基-β-環糊精及磷酸鈉。苯甲醇可充當防腐劑，且可包括氯化鈉以調節張力。另外，可將鹽酸及/或氫氧化鈉添加至溶液中以供pH調節。用於眼部注射之水性調配物可製備成無防腐劑。
替代調配物亦可包括控制釋放調配物、用於經口投與之液體劑量型式、經皮貼片及非經腸調配物。製備此類替代調配物之習知賦形劑及方法描述於例如上文Remington之參考文獻中。
以下非限制性實例說明了本發明之代表性醫藥組合物。
乾粉組合物 將本發明之微粉化固體型式(1 g)與經研磨乳糖(25 g)摻合。隨後將此摻合混合物以每劑量足以提供約0.1 mg至約4 mg之間的式I化合物的量裝載至可剝離泡殼封裝之單獨泡殼中。使用乾粉吸入器投與泡殼之內含物。
乾粉組合物 將本發明之微粉化固體型式(1 g)與經研磨乳糖(20 g)摻合以形成化合物與經研磨乳糖之重量比為1:20的主體成分。將摻合組合物封裝於每劑量能夠遞送約0.1 mg至約4 mg式I化合物之間的乾粉吸入裝置中。
定量吸入器組合物 將本發明之微粉化固體型式(10 g)分散於藉由將卵磷脂(0.2 g)溶解於去礦物質水(200 mL)中所製備之溶液中。噴霧乾燥所得懸浮液，且隨後經微粉化以形成包含平均直徑小於約1.5 μm之粒子的微粉化組合物。隨後將微粉化組合物以在藉由定量吸入器投與時每劑量足以提供約0.1 mg至約4 mg式I化合物的量裝載至含有加壓1,1,1,2-四氟乙烷之定量吸入器套筒中。
噴霧器組合物 將本發明之固體型式(25 mg)溶解於含有1.5-2.5當量鹽酸之溶液中，接著添加氫氧化鈉以將pH調節至3.5至5.5及3重量%甘油。充分攪拌溶液直至所有組分溶解為止。使用每劑量提供約0.1 mg至約4 mg式I化合物之噴霧器裝置投與溶液。
用於眼部注射之水性調配物 每mL無菌水性懸浮液包括5 mg至50 mg本發明之固體型式、用於張力之氯化鈉、作為防腐劑之0.99% (w/v)苯甲醇、0.75%羧甲基纖維素鈉及0.04%聚山梨醇酯。可包括氫氧化鈉或鹽酸以將pH調節至5至7.5。
用於眼部注射之水性調配物 無菌無防腐劑水性懸浮液包括含5 mg/mL至50 mg/mL本發明固體型式之10 mM磷酸鈉、40 mM氯化鈉、0.03%聚山梨醇酯20及5%蔗糖。
效用 本發明化合物5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚(化合物1 )已展示為酶類JAK家族：JAK1、JAK2、JAK3及TYK2之強力抑制劑。
呼吸道疾病 另外，如以下分析中所述，已證明化合物1 對涉及哮喘及其他呼吸道疾病之促炎性及促纖維變性細胞介素之強力抑制。化合物之吸收率及分佈已描繪於臨床前分析中。在小鼠中，化合物呈現在肺臟中之暴露量比在血漿中之暴露量高約55倍。重要的係，小鼠肺臟中之化合物1 之濃度已展示與所預測的JAK酶抑制之藥效動力學作用相關。特定言之，已展示化合物抑制小鼠肺臟組織中之促炎性細胞介素IL-13之作用。特定而言，證明化合物對肺臟組織中IL-13誘導之STAT6磷酸化之抑制，該抑制提供局部肺臟JAK靶標活體內參與之證據。當在投與測試化合物之後4小時投與促炎性細胞介素IL-13時觀測到此作用，提供肺臟中之顯著滯留之其他證據。
JAK抑制劑之消炎劑活性已穩固地表明於哮喘之臨床前模型中(Malaviya等人,Int Immunopharmacol ,2010 ,10 , 829,-836；Matsunaga等人,Biochem and Biophys Res Commun ,2011 ,404 , 261-267；Kudlacz等人,Eur J Pharmacol ,2008 ,582 , 154-161)。因此，本發明化合物預期適用於治療發炎性呼吸道病症，特定言之哮喘。肺臟之發炎及纖維化為除哮喘以外之其他呼吸疾病所特有的，諸如慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化症(CF)、肺炎、間質性肺病(包括特發性肺纖維化)、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、支氣管炎、氣腫及阻塞性細支氣管炎。 因此，本發明化合物亦預期適用於治療慢性阻塞性肺病、囊腫性纖維化症、肺炎、間質性肺病(包括特發性肺纖維化)、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、支氣管炎、氣腫及阻塞性細支氣管炎。如上文所述，對於呼吸道疾病之治療，固體型式特別適用於藉由吸入投與。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種治療哺乳動物(例如人類)之呼吸道疾病之方法，該方法包含向該哺乳動物投與治療有效量之本發明化合物或包含醫藥學上可接受之載劑及本發明之固體型式的醫藥組合物。
在一個態樣中，呼吸疾病為哮喘、囊腫性纖維化症、肺炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊腫性纖維化(CF)、肺炎、間質性肺病(包括特發性肺纖維化)、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、支氣管炎、氣腫或阻塞性細支氣管炎。在另一態樣中，呼吸疾病為哮喘或慢性阻塞性肺病。在另一態樣中，本發明之固體型式藉由吸入投與。
本發明進一步提供一種治療哺乳動物之哮喘的方法，該方法包含向該哺乳動物投與本發明之固體型式或包含醫藥學上可接受之載劑及本發明之固體型式的醫藥組合物。
當用於治療哮喘時，雖然本發明化合物通常將以單次日劑量或每天多劑量型式投與，但可使用其他投與型式。每劑量投與之活性劑之量或每天投與之總量通常將由醫師鑒於相關情形確定，包括待治療之病況、所選投與途徑、投與的實際化合物及其相對活性、個體病患之年齡、體重及反應、患者症狀之嚴重程度，及類似者。
除了已證明對與炎症相關之細胞介素之強力抑制以外，亦已證明化合物1 對T細胞活化之抑制及嚙齒動物肺臟嗜酸性球增多症及嗜中性球增多症檢定中之活性。因此，咸信本發明之固體型式適用於治療其他呼吸道病況。
其他呼吸道病況包括肺部感染、蠕蟲感染、肺部動脈高血壓、類肉瘤病、肺淋巴血管平滑肌增生症、支氣管擴張症及浸潤性肺病。咸信固體型式亦適用於治療藥物誘發之肺炎、真菌誘發之肺炎、過敏性支氣管肺麴菌病、過敏性肺炎、嗜酸性肉芽腫伴多血管炎、特發性急性嗜酸性肺炎、特發性慢性嗜酸性肺炎、嗜伊紅白血球增多症候群、呂弗勒症候群(Löffler syndrome)、阻塞性細支氣管炎伴機化性肺炎及免疫檢查點抑制劑誘發之肺炎。
JAK信號傳導細胞介素亦在T細胞活化中起主要作用，該T細胞為對許多免疫過程重要的免疫細胞亞類。病理性T細胞活化對於多種呼吸道疾病的病因具決定性。自身反應性T細胞在阻塞性細支氣管炎伴機化性肺炎(亦稱為COS)中起作用。類似於COS，肺移植排斥反應之病因與受體T細胞因為移植供體肺所致之異常T細胞活化有關。肺移植排斥反應可早期以原發性移植物功能障礙(PGD)、機化性肺炎(OP)、急性排斥反應(AR)或淋巴細胞性細支氣管炎(LB)型式發生，或其可在肺移植後數年以慢性肺同種異體移植物功能障礙(CLAD)型式發生。CLAD先前已知為阻塞性細支氣管炎(BO)，但現在視為可具有不同病理學表現之症候群，包括BO、限制性CLAD (rCLAD或RAS)及嗜中性球同種異體移植物功能障礙。慢性肺同種異體移植物功能障礙(CLAD)為肺移植受體長期管理中之主要挑戰，此係由於其導致移植肺逐漸失去功能(Gauthier等人, Curr Transplant Rep.,2016 , 3(3), 185-191)。CLAD對治療之反應不佳，且因此，仍需要能夠預防或治療此病況之有效化合物。諸如IFNγ及IL-5之若干JAK依賴性細胞介素在CLAD及肺移植排斥反應中上調(Berastegui等人,Clin Transplant . 2017 , 31, e12898)。此外，在JAK依賴性IFN信號傳導下游之CXCR3趨化因子(諸如CXCL9及CXCL10)的高肺含量與肺移植患者之惡化結果有關(Shino等人,PLOS One ,2017 , 12 (7), e0180281)。全身性JAK抑制已展示為在腎移植排斥反應中有效(Vicenti等人,American Journal of Transplantation ,2012 , 12, 2446-56)。因此，JAK抑制劑具有有效治療或預防肺移植排斥反應及CLAD之潛力。如描述為肺移植排斥反應之基礎的類似T細胞活化事件亦視為造血幹細胞移植後可能發生的肺移植物抗宿主病(GVHD)的主要驅動因素。類似於CLAD，肺GVHD為一種具有極其不良後果之慢性進行性病況且目前尚無經批准之治療。對95位接受全身性JAK抑制劑盧佐替尼(ruxolitinib)作為補救治療之患有類固醇難治性急性或慢性GVHD的患者之回溯性多中心調查研究表明，大多數患者(包括患有肺GVHD之患者)對盧佐替尼完全或部分反應(Zeiser等人,Leukemia ,2015 , 29, 10, 2062-68)。由於全身性JAK抑制與嚴重不良事件及小治療指數相關，因此需要吸入肺部定向之非全身性JAK抑制劑以預防及/或治療肺移植排斥反應或肺GVHD。
因此，本發明進一步提供一種治療哺乳動物之上述其他呼吸道病況之方法，該方法包含向該哺乳動物投與本發明之固體型式或包含醫藥學上可接受之載劑及本發明之固體型式的醫藥組合物。
眼部疾病 許多眼部疾病已顯示與依賴於JAK-STAT路徑之促炎性細胞介素升高相關。由於本發明化合物在所有四種JAK酶下呈現強力抑制，因此預期強力抑制經由JAK傳導信號之多種細胞介素(諸如IL-6、IL-2及IFN-γ)之信號傳導及致病作用，以及防止其產生藉由JAK-STAT路徑信號傳導驅動之其他細胞介素(諸如MCP-1及IP-10)之增加。
特定言之，化合物1 在檢定3至7中所描述之細胞檢定中呈現6.7或更大的pIC50 值(IC50 值為200 nM或更小)以用於抑制IL-2、IL-4、IL-6及IFNγ信號傳導，該等檢定包括記錄抑制細胞介素升高之下游作用的檢定。
檢定12之藥物動力學研究證明在單次玻璃體內注射實例2之結晶化合物1的懸浮液之後持續暴露於家兔眼睛中及比玻璃體組織中觀測到的低至少三個數量級之血漿濃度。檢定13及14表明化合物在大鼠及家兔中之藥效動力學作用。
因此，預期本發明之固體型式有益於多種眼部疾病，包括但不限於眼色素層炎、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、乾眼病、年齡相關之黃斑變性及異位性角膜結膜炎。
特定言之，眼色素層炎(Horai及Caspi,J Interferon Cytokine Res ,2011 ,31 , 733-744)、糖尿病性視網膜病變(Abcouwer,J Clin Cell Immunol ,2013 ,增刊 1 , 1-12)、糖尿病性黃斑水腫(Sohn等人,American Journal of Opthamology ,2011 ,152 , 686-694)、乾眼病(Stevenson等人,Arch Ophthalmol ,2012 ,130 , 90-100)及年齡相關之黃斑變性(Knickelbein等人,Int Ophthalmol Clin ,2015 ,55 ( 3 ) , 63-78)表徵為經由JAK-STAT路徑傳導信號之特定促炎性細胞介素升高。因此，本發明之固體型式可能能夠減輕相關眼部炎症並逆轉疾病進程或緩解症狀。
視網膜靜脈栓塞(RVO)為非常盛行的視覺致殘性疾病。視網膜血流堵塞可導致視網膜血管結構損傷、出血及組織局部缺血。儘管RVO的原因係多因素的，但血管以及炎性介質兩者皆顯示出重要性(Deobhakta等人,International Journal of Inflammation ,2013 , 文章ID 438412)。已檢測到經由JAK-STAT路徑傳導信號之細胞介素(諸如IL-6及IL-13)以及其產生部分地藉由JAK-STAT路徑信號傳導驅動之其他細胞介素(諸如MCP-1)在患有RVO的患者眼部組織中之含量較高(Shchuko等人,Indian Journal of Ophthalmology ,2015 , 63(12), 905-911)。因此，本發明之固體型式可能能夠減輕相關眼部炎症並逆轉疾病進程或緩解此疾病之症狀。雖然患有RVO之許多患者藉由光致凝固治療，但此為本質上地破壞性治療。亦使用抗VEGF劑，但其僅在一部分患者中有效。降低眼部炎症水準之類固醇藥品(曲安奈德(Triamcinolone acetonide)及地塞米松(dexamethasone)植入物)亦已展示對患有特定型式之RVO的患者提供有益結果，但其亦已展示導致白內障及增加之眼內壓/青光眼。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種治療哺乳動物之眼部疾病的方法，該方法包含向該哺乳動物眼部投與本發明之固體型式。在一個態樣中，眼部疾病為眼色素層炎、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、乾眼病、年齡相關之黃斑變性或異位性角膜結膜炎。在一個態樣中，眼部疾病為視網膜靜脈栓塞。
實例 提供以下合成及生物實例以說明本發明，且不以任何方式解釋為限制本發明之範疇。除非另外指示，否則在以下實例中，以下縮寫具有以下含義。以下未定義之縮寫具有其一般可接受之含義。 CAN =乙腈 CPME =環戊基甲醚 DCM =二氯甲烷 DIPEA =N,N -二異丙基乙胺 DMAc =二甲基乙醯胺 DMF =N ,N -二甲基甲醯胺 EtOAc =乙酸乙酯 h =小時 IPAc =乙酸異丙酯 KOAc =乙酸鉀 MeOH =甲醇 MeTHF = 2-甲基四氫呋喃 min =分鐘 MTBE =甲基第三丁基醚 NMP =N -甲基-2-吡咯啶酮 Pd(amphos)2 Cl2 =雙(二-第三丁基(4-二甲胺基苯基)-膦)二氯鈀(II) Pd(dppf)Cl2 =二氯(1,1'-雙(二苯膦基)-二茂鐵)二鈀(II) Pd(PPh3 )4 =肆(三苯膦)鈀(0) Pd(t-Bu3 P)2 =雙(三-第三丁基膦)鈀(0) RT =室溫 TEA =三乙胺 TFA =三氟乙酸 THF =四氫呋喃 雙(頻哪醇根基)二硼= 4,4,5,5,4',4',5',5'-八甲基-[2,2']聯[[1,3,2]二氧硼㖦基]
試劑及溶劑購自商業供應商(Aldrich、Fluka、Sigma等)且未經進一步純化即使用。藉由薄層層析(TLC)、分析型高效液相層析(anal. HPLC)及質譜分析監測反應混合物之進展。如在各反應中尤其描述來處理反應混合物；通常藉由萃取及其他純化方法(諸如溫度依賴性及溶劑依賴性結晶及沈澱)來純化反應混合物。另外，藉由管柱層析或藉由製備型HPLC，通常地使用C18或BDS管柱填充及習知溶離劑來常規純化反應混合物。 下文描述典型的製備型HPLC條件。
藉由質譜及1 H-NMR光譜常規地進行反應產物之表徵。對於NMR分析，將樣品溶解於氘化溶劑(諸如CD3 OD、CDCl3 或d 6 -DMSO)中，且在標準觀測條件下用Varian Gemini 2000儀器(400 MHz)獲得1 H-NMR光譜。藉由電噴霧電離法(ESMS)用耦接至自動純化系統之Applied Biosystems (Foster City, CA)型號API 150 EX儀器或Waters (Milford, MA) 3100儀器，來進行化合物之質譜鑑定。
製備型 HPLC 條件 管柱：C18，5 μm。21.2 × 150 mm或C18，5 μm 21 × 250或C14，5 μm 21 × 150 mm 管柱溫度：室溫 流動速率：20.0 mL/min 移動相：A =水+ 0.05% TFA B = ACN + 0.05 % TFA， 注射體積：(100-1500 µL) 偵測器波長：214 nm
將粗製化合物以約50 mg/mL溶解於1:1水:乙酸中。使用2.1 × 50 mm C18管柱進行4分鐘分析規模之測試操作，接著使用100 µL注射液用基於分析規模之測試操作的B滯留%進行15或20分鐘製備型規模操作。準確梯度依賴於樣品。用21 × 250 mm C18管柱及/或21 × 150 mm C14管柱檢測具有緊密操作雜質之樣品以進行最佳分離。藉由質譜分析鑑定含有所期望產物之溶離份。
分析型 HPLC 條件 方法 A 管柱：Agilent Zorbax Bonus-RP C18，150 × 4.60 nm，3.5微米 管柱溫度：40℃ 流動速率：1.5 mL/min 注射體積：5 μL 樣品製備：溶解於1:1 ACN:1 M HCl中 移動相：A =水:TFA (99.95:0.05) B = ACN:TFA (99.95:0.05) 偵測器波長：254 nm及214 nm 梯度：總共26分鐘(時間(分鐘)/% B)：0/5、18/90、22/90、22.5/90、26/5
方法 B 管柱：Agilent Poroshell 120 Bonus-RP，4.6 × 150 mm，2.7 μm 管柱溫度：30℃ 流動速率：1.5 mL/min 注射體積：10 μL 移動相：A = ACN:水:TFA (2:98:0.1) B = ACN:水:TFA (90:10:0.1) 樣品製備：溶解於移動相B中 偵測器波長：254 nm及214 nm 梯度：總共60分鐘(時間(分鐘)/% B)：0/0、50/100、55/100、55.1/0、60/0
方法 C 管柱：Agilent Poroshell 120 Bonus-RP，4.6 × 150 mm，2.7 μm 管柱溫度：30℃ 流動速率：1.5 mL/min 注射體積：10 μL 移動相：A = ACN:水:TFA (2:98:0.1) B = ACN:水:TFA (90:10:0.1) 樣品製備：溶解於移動相B (0.15 mL)中隨後用移動相A (0.85 mL)稀釋 偵測器波長：245 nm 梯度：總共46分鐘(時間(分鐘)/% B)：0/0、25/50、35/100、40/100、40.1/0、46/0
製備 1 ： 1 - 苯甲基 - 4 - 亞胺基 - 1 , 4 - 二氫吡啶 - 3 - 胺 在25℃至15℃下，將吡啶-3,4-二胺(445 g，4.078 mol)與ACN (11.0 L)之混合物攪拌80 min。在20 min內添加苯甲基溴(485 mL，4.078 mol)，並在20℃下將反應混合物攪拌隔夜。將反應混合物冷卻至10℃並過濾。向反應器中添加冷卻至10℃之ACN (3 L)。用反應器清洗液洗滌濾餅，且用升溫至25℃之ACN (3 L)再次洗滌。在過濾器上將固體在氮氣下乾燥24 h，在55℃下在真空下乾燥2 h，且接著在RT下乾燥隔夜及4天，以得到標題化合物之HBr鹽(1102.2 g，3.934 mol，96%產率)。HPLC方法A滯留時間4.12 min。
製備 2 ： 5 - 苯甲基 - 2 -( 6 - 溴 - 1H - 吲唑 - 3 - 基 )- 5H - 咪唑并 [ 4 , 5 - c ] 吡啶 (a) 5-苯甲基-2-(6-溴-1H -吲唑-3-基)-5H -咪唑并[4,5-c]吡啶 將6-溴-1H -吲唑-3-甲醛(550 g，2.444 mol)、1-苯甲基-4-亞胺基-1,4-二氫吡啶-3-胺HBr (721 g，2.333 mol)及DMAc (2.65 L)之溶液攪拌60 min且添加亞硫酸氫鈉(257 g，2.468 mol)。將反應混合物加熱至135℃並保持3 h，且使其冷卻至20℃並在20℃下保持隔夜。添加乙腈(8 L)且在15℃下攪拌反應混合物4 h。在壓力過濾器上以中等過濾速率過濾漿液。向反應器中添加ACN (1 L)，用ACN反應器洗液洗滌濾餅且在氮氣下乾燥隔夜，且隨後在真空下在50℃下乾燥24 h以得到呈緻密濕潤米色/棕色固體狀之標題化合物之HBr鹽(1264 g，2.444 mol，100%產率，94%純度)。HPLC方法A滯留時間8.77 min。
將先前步驟之產物(1264 g，2.444 mol)、MeTHF (6 L)與水(2.75 L)之混合物加熱至65℃，且歷經5 min添加氫氧化鈉50 wt% (254 g，3.177 mol)，且在65℃下攪拌反應混合物1小時，冷卻至室溫，接著冷卻至5℃並保持2 h。過濾漿液並用MeTHF (1 L)洗滌反應器及濾餅。在過濾器上在氮氣下乾燥所得米色至黃色固體3天以得到呈米色/黃色固體狀之標題化合物(475 g，1.175 mmol，48%產率)。將母液(約8 L)濃縮至約2 L，於是固體開始沈澱。將漿液加熱至50℃，保持2 h，在2 h內冷卻至5℃，攪拌隔夜，並過濾。用MeTHF (100 mL)洗滌濾餅且在真空下在40℃下乾燥隔夜以得到額外標題化合物(140 g，0.346 mol，14%產率)。
在20℃下將在相同規模下與第二批產物組合之先前步驟之總產物(1500 g，3.710 mol)與MeTHF (4 L)的混合物攪拌2 h並過濾。用MeTHF (1.5 L)洗滌反應器及濾餅。在氮氣下乾燥所得米色至黃色固體3天以得到呈米黃色固體狀之標題化合物(1325 g，3.184 mol，86%產率(68%總產率)，97%純度)。HPLC方法A滯留時間8.77 min。
製備 3 ： 5 - 苯甲基 - 2 -( 6 - 溴 - 1H - 吲唑 - 3 - 基 )- 4 , 5 , 6 , 7 - 四氫 - 1H - 咪唑并 [ 4 , 5 - c ] 吡啶 向15 L燒瓶中添加5-苯甲基-2-(6-溴-1H -吲唑-3-基)-5H -咪唑并[4,5-c]吡啶(440 g，1.088 mol)，接著添加MeTHF (4.5 L)、甲醇(2.25 L)及水(1.125 L)。將漿液冷卻至20℃，攪拌1 h，並添加NaBH4 (247 g，6.530 mol)。在25℃下攪拌反應混合物18 h。添加水(1.125 L)，接著添加20 wt%氯化鈉溶液(1.125 L)，且攪拌混合物30 min，並使各層分離。排出水層。添加NaOH (522 g)與水(5 L)之預混合溶液且攪拌反應混合物60 min；使各層分離且排出水層。在相同規模下製備兩種額外批料。
在減壓下於夾套設定在50℃下、內部溫度為20℃之15 L夾套反應器中濃縮一中批料之有機層。將額外批料添加至反應器中且一次濃縮一種批料，產生體積約6 L之漿液。將漿液加熱至50℃，添加IPAc (6 L)並使混合物在60℃下保持1.5 h，冷卻至20℃持續10 h，加熱至60℃持續50 h，在5 h內冷卻至20℃，隨後冷卻至5℃並保持3 h。過濾混合物且用預冷卻至5℃之IPAc (1 L)與MeTHF (1 L)之預混合溶液洗滌反應器及濾餅。在氮氣下在過濾器上在40℃下乾燥固體3天以得到呈灰白色固體狀之標題化合物(1059 g，2.589 mol，79%產率)。材料在真空烘箱中在50-60℃下進一步乾燥8 h且在27℃下乾燥2天以得到標題化合物(1043 g，2.526 mol，77%產率，99%純度)。HPLC方法A滯留時間6.73 min。
製備 4 ： ( 4 -( 苯甲氧基 )- 2 - 乙基 - 5 - 氟苯基 ) 三氟硼酸鉀 (a) 2-(4-(苯甲氧基)-2-乙基-5-氟苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼㖦 用氮氣吹掃1-(苯甲氧基)-4-溴-5-乙基-2-氟苯(520 g，1682 mmol)與二噁烷(5193 mL)之混合物，且接著添加雙(頻哪醇根基)二硼(641g，2523 mmol)，接著添加乙酸鉀(495 g，5046 mmol)。用氮氣吹掃反應混合物；添加Pd(dppf)Cl2 (41.2 g，50.5 mmol)；用氮氣吹掃反應混合物，在氮氣下在103℃下加熱5 h；並冷卻至室溫。藉由真空蒸餾濃縮反應混合物且分配於乙酸乙酯(5204 mL)與水(5212 mL)之間。經由矽藻土過濾反應混合物；用鹽水(2606 mL)洗滌有機層，接著藉由真空蒸餾移除溶劑以得到呈黏稠黑色油狀之粗產物(約800 g)。
使粗產物溶解於DCM (1289 mL)中且藉由矽膠層析(於己烷中預漿化之2627 g氧化矽，用20%乙酸乙酯/己烷(10.35 L)溶離)純化。藉由真空蒸餾移除溶劑，得到淡黃色油狀物(600 g)。HPLC方法B滯留時間33.74 min。
(b) (4-(苯甲氧基)-2-乙基-5-氟苯基)三氟硼酸鉀 將先前步驟之產物(200 g，561 mmol)與丙酮(1011 mL)混合直至完全溶解為止且添加甲醇(999 mL)，接著添加溶解於水(1310 mL)中之3 M二氟化氫鉀(307 g，3930 mmol)。攪拌反應混合物3.5 h。藉由真空蒸餾移除大部分有機溶劑。添加水(759 mL)且攪拌所得黏稠漿液30 min並過濾。用水(506 mL)洗滌濾餅且在過濾器上乾燥固體30 min。固體於丙酮(1237 mL)中漿化且攪拌1 h。過濾所得漿液且用丙酮(247 mL)洗滌固體。藉由真空蒸餾濃縮丙酮溶液，且藉由緩慢添加甲苯(2983 mL)保持恆定體積(2 L)直至蒸餾出所有丙酮及水為止。藉由旋轉蒸發將甲苯溶液蒸餾成黏稠黃色漿液，在此期間產物沈澱為白色固體。將甲苯之額外部分(477 mL)添加至混合物中且攪拌1 h。隨後過濾混合物且用甲苯(179 mL)沖洗，並在真空下在50℃下乾燥24 h以得到呈自由流動的蓬鬆淺灰白色固體狀之標題化合物(104 g，310 mmol，55%產率)。HPLC方法B滯留時間27.71 min。
製備 5 ： 5 - 苯甲基 - 2 -( 6 -( 4 -( 苯甲氧基 )- 2 - 乙基 - 5 - 氟苯基 )- 1H - 吲唑 - 3 - 基 )- 4 , 5 , 6 , 7 - 四氫 - 1H - 咪唑并 [ 4 , 5 - c ] 吡啶 (a) 5-苯甲基-2-(6-(4-(苯甲氧基)-2-乙基-5-氟苯基)-1H -吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶 將雙(頻哪醇)二硼(250 g，984 mmol)與IPA (1.88 L)之混合物攪拌至溶解，且隨後在10 min內逐份添加二氟化氫鉀(538 g，6.891 mol)於水(2.31 L)中之溶液。攪拌反應混合物1 h並過濾。用水(1.33 L)漿化凝膠類固體直至混合物形成澄清水凝膠為止，且隨後再漿化45 min。過濾所得固體/凝膠，隨後於丙酮(1.08 L)中再漿化，過濾，在過濾器上風乾30 min且乾燥隔夜以得到蓬鬆的白色固體(196.7 g)。
向5 L燒瓶中添加5-苯甲基-2-(6-溴-1H -吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶(135 g，331 mmol)、(4-(苯甲氧基)-2-乙基-5-氟苯基)-三氟硼酸鉀(133 g，397 mmol)及先前步驟之白色固體產物(40.5 g)，接著添加MeTHF (1.23 L)及MeOH (1.75 L)。所得漿液用氮氣脫氣三次。向漿液中添加碳酸銫(431 g，1.323 mol)於水(1.35 L)中之脫氣溶液。將漿液脫氣兩次，添加Pd(amphos)2 Cl2 (11.71 g，16.53 mmol)，再次將漿液脫氣兩次且在67℃下攪拌反應混合物隔夜且冷卻至20℃。分離各層且用MeTHF (550 mL)反萃取。合併有機層且藉由旋轉蒸發濃縮直至固體沈澱為止。添加MeTHF (700 mL)且在65℃下攪拌反應混合物。分離各層且用MeTHF (135 mL)反萃取水相。合併有機相且濃縮至約300 mL，產生黏稠橙色漿液。向漿液中添加MeOH (270 mL)，接著在20℃下在快速攪拌下添加1 M HCl (1.325 L)。攪拌反應混合物5 min並添加水(1 L)，且攪拌所得漿液1 h。過濾固體，用水(150 mL)洗滌，在過濾器上乾燥10 min且在45℃下在氮氣下乾燥16 h以得到呈淡黃色固體狀之標題化合物之2 HCl鹽(221.1 g，351 mmol，92.2%純度)。HPLC方法B滯留時間23.41 min。
製備 6 ： 5 - 乙基 - 2 - 氟 - 4 -( 3 -( 4 , 5 , 6 , 7 - 四氫 - 1H - 咪唑并 [ 4 , 5 - c ] 吡啶 - 2 - 基 )- 1H - 吲唑 - 6 - 基 ) 苯酚 向1 L燒瓶中添加於乙醇(348 mL)中呈漿液型式之5-苯甲基-2-(6-(4-(苯甲氧基)-2-乙基-5-氟苯基)-1H -吲唑-3-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶2 HCl (40 g，63.4 mmol)及含1.25 M HCl之MeOH (101 mL)及水(17.14 mL)。反應混合物用氮氣脫氣5 min且添加10 wt% Pd/C、50 wt% H2 O (4.05 g，1.903 mmol)。密封反應器，用H2 吹掃，加壓至1-2 psi.，升溫至50℃，且攪拌反應混合物隔夜並經由矽藻土過濾。用甲醇(100 mL)洗滌反應器及過濾器。
將過濾溶液與第二批產品在98 mmol規模下組合且濃縮至390 g。在攪拌下緩慢添加EtOAc (2.04 L)，且隨後在攪拌下將溶液冷卻至5℃。過濾固體，用EtOAc (510 mL)洗滌，且在45℃下在氮氣下乾燥隔夜以得到呈灰白色固體狀之標題化合物之2 HCl鹽(58 g，80%產率)。HPLC方法B滯留時間12.83 min。
實例 1 ： 5 - 乙基 - 2 - 氟 - 4 -( 3 -( 5 -( 1 - 甲基哌啶 - 4 - 基 )- 4 , 5 , 6 , 7 - 四氫 - 1H - 咪唑并 [ 4 , 5 - c ] 吡啶 - 2 - 基 )- 1H - 吲唑 - 6 - 基 ) 苯酚水合物 在攪拌下向125 mL燒瓶中添加NMP (19.23 mL)及5-乙基-2-氟-4-(3-(4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚2 HCl (6 g，13.32 mmol)，接著添加NMP (19.23 mL)。添加乙酸(2.52 mL)，且隨後一次性添加1-甲基哌啶-4-酮(3.28 mL，26.6 mmol)，在25℃下攪拌反應混合物30 min且冷卻至15℃。添加三乙醯氧基硼氫化鈉(7.91 g，37.3 mmol)，且在20 min之後將外部夾套設定為20℃。3.5 h之後，總溶液體積為35 mL。用甲醇(5 mL)洗滌反應器。依序將一半溶液(17.5 mL)及一半甲醇洗液(2.5 mL)添加至甲醇(28 mL)、氫氧化銨(17 mL，270 mmol)與水(9 mL)之預混合溶液中，保持溫度低於5℃。10 min之後固體沈澱。攪拌漿液30 min，在30 min內緩慢添加ACN (60 mL)且在0℃下攪拌漿液2 h，過濾並用ACN沖洗。在50℃下乾燥固體12 h以得到呈灰白色固體狀之標題化合物(2.95 g，93.2%產率，(85.2%產率，校正含水量))。HPLC方法C滯留時間12.11 min。
實例 2 ： 5 - 乙基 - 2 - 氟 - 4 -( 3 -( 5 -( 1 - 甲基哌啶 - 4 - 基 )- 4 , 5 , 6 , 7 - 四氫 - 1H - 咪唑并 [ 4 , 5 - c ] 吡啶 - 2 - 基 )- 1H - 吲唑 - 6 - 基 ) 苯酚之結晶水合物 向如實例A中所製備之5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚(10 g，21.07 mmol)於DMSO (19.99 mL)中之溶液中添加乙醇(19.93 mL)。藉由過濾移除未溶解之固體，且將一半DMSO溶液添加至20%水於甲醇(30 mL)中之經攪拌溶液中。10 min之後形成漿液，在RT下攪拌該漿液4 h並過濾。在50℃在氮氣下乾燥所得黃色固體3 h。在45℃下在攪拌下將固體漿化於含20%水之丙酮(110 mL)中35 h，過濾，並用含15%水之丙酮洗滌且乾燥隔夜以得到呈淡黃色固體狀之標題化合物(4.40 g，88%產率)。
實例 3 ： 5 - 乙基 - 2 - 氟 - 4 -( 3 -( 5 -( 1 - 甲基哌啶 - 4 - 基 )- 4 , 5 , 6 , 7 - 四氫 - 1H - 咪唑并 [ 4 , 5 - c ] 吡啶 - 2 - 基 )- 1H - 吲唑 - 6 - 基 ) 苯酚之結晶草酸鹽水合物 在20 mL玻璃瓶中，將化合物1 結晶水合物(248.5 mg)、實例2之產物及草酸無水物(48.0 mg)溶解於1:1四氫呋喃:水(5 mL)中。添加乙腈(5 mL)，生產懸浮液。在RT下攪拌所得反應混合物一天，過濾，用乙腈(2 mL)洗滌，並在環境條件下乾燥隔夜以得到標題化合物。
實例 4 ： 5 - 乙基 - 2 - 氟 - 4 -( 3 -( 5 -( 1 - 甲基哌啶 - 4 - 基 )- 4 , 5 , 6 , 7 - 四氫 - 1H - 咪唑并 [ 4 , 5 - c ] 吡啶 - 2 - 基 )- 1H - 吲唑 - 6 - 基 ) 苯酚之結晶琥珀酸鹽水合物 在4 mL玻璃瓶中，將化合物1 結晶水合物(40 mg)及琥珀酸(10 mg)懸浮於異丙醇(1 mL)中。在RT下攪拌反應混合物懸浮液七天。過濾固體，用異丙醇(0.5 mL)洗滌，並在環境條件下乾燥隔夜以得到結晶琥珀酸鹽溶劑合物。在150℃下在真空烘箱下乾燥分離之琥珀酸鹽溶劑合物固體30 min以得第二固體型式，其在RT下在80%至90%相對濕度平衡一天以得到標題化合物。
實例 5 - 7 ： 本發明之固體型式之特性 藉由粉末X射線繞射(PXRD)、差示掃描熱量測定(DSC)、熱解重量分析(TGA)及動態濕氣吸附(DMS)分析實例3之5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚之草酸鹽結晶水合物及實例4之5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚之琥珀酸鹽結晶水合物的樣品。
實例 5 粉末 X 射線繞射 用Bruker D8-Advance X射線繞射儀，使用Cu-Kα 輻射(λ = 1.54051 Å)，在45 kV之輸出電壓及40 mA之電流下，獲得圖1之粉末X射線繞射圖案。於Bragg-Brentano幾何中操作儀器，其中設定入射、發散度及散射狹縫以使樣品處之強度最大化。對於量測，將少量粉末(5-25 mg)輕緩地按壓於樣品固持器上以形成光滑表面，且經歷X射線暴露。以2θ-2θ模式自2°至40°以2θ掃描樣品，其中步長為0.02°且掃描速度為每步0.30秒。藉由Bruker DiffracSuite量測軟體控制資料獲取且藉由Jade軟體(7.5.1版)分析。用剛玉標準物在±0.02° 2θ角內校準儀器。針對本發明之結晶草酸鹽水合物及結晶琥珀酸鹽水合物觀測到之PXRD 2θ峰值位置及d - 間距分別展示於表1及2中。表 1 ：結晶草酸鹽水合物之 PXRD 資料 表 2 ：結晶琥珀酸鹽水合物之 PXRD 資料
實例 6 ：熱分析 使用具有熱分析(Thermal Analyst)控制器之TA Instruments型號Q-100模組進行差示掃描熱量測定(DSC)。收集資料且使用TA Instruments熱分析軟體分析。將各結晶型式之樣品精確稱量至帶蓋鋁盤中。在5℃下進行5 min等溫平衡階段後，使用10℃/min之線性加熱勻變自0℃加熱樣品至250℃。本發明之結晶草酸鹽水合物及結晶琥珀酸鹽水合物之代表性DSC溫譜圖分別展示於圖2及圖6中。
使用具備高解析度能力之TA Instruments型號Q-50模組進行熱解重量分析(TGA)量測。 使用TA Instruments熱分析控制器收集資料且使用TA Instruments通用分析(Universal Analysis)軟體分析。將稱量之樣品置於鉑盤上且以10℃之加熱速率自環境溫度掃描至300℃。在使用期間用氮氣流吹掃其餘部分及熔爐室。本發明之結晶草酸鹽水合物及結晶琥珀酸鹽水合物之代表性TGA跡線分別展示於圖3及圖7中。
實例 7 ： 動態濕氣吸附評估 使用VTI常壓微量天平SGA-100系統(VTI Corp., Hialeah, FL 33016)進行動態濕氣吸附(DMS)量測。使用稱取之樣品且濕度在開始分析時為最低可能值(接近0% RH)。DMS分析由以下組成：進行初始乾燥步驟(約0% RH) 120 min，接著在5% RH/步驟之掃描速率下在5% RH至90% RH之濕度範圍內，進行吸附及解吸附之兩個循環。在25℃下以等溫方式進行DMS操作。本發明之結晶草酸鹽水合物及結晶琥珀酸鹽水合物之代表性DMS跡線分別展示於圖4及圖8中。
生物檢定 5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚(化合物1 )已表徵於以下生物檢定中。
檢定 1 ： 生物化學 JAK 激酶檢定 將四種LanthaScreen JAK生物化學分析之組(JAK1、2、3及Tyk2)載於常見激酶反應緩衝液(50 mM HEPES，pH 7.5，0.01% Brij-35，10 mM MgCl2 ，及1 mM EGTA)中。重組GST標記之JAK酶及GFP標記之STAT1肽受質獲自Life Technologies。
在白色384孔微量培養盤(Corning)中在環境溫度下，將連續稀釋之化合物與四種JAK酶中之每一者及受質一起預培育1 h。隨後添加總體積為10 μl、具有1% DMSO之ATP以引發激酶反應。JAK1、2、3及Tyk2之最終酶濃度分別為4.2 nM、0.1 nM、1 nM及0.25 nM；所使用之相應Km ATP濃度為25 μM、3 μM、1.6 μM及10 μM；而對於所有四種檢定，受質濃度均為200 nM。在環境溫度下使激酶反應進行1 h，之後添加EDTA (10 mM最終濃度)及Tb抗pSTAT1 (pTyr701)抗體(Life Technologies，2 nM最終濃度)於TR-FRET稀釋緩衝液(Life Technologies)中之10 μl製備劑。在環境溫度下將培養盤培育1 h，之後在EnVision讀取器(Perkin Elmer)上讀取。記錄且使用發射比信號(520 nm/495 nm)，以基於DMSO及背景對照計算抑制百分比值。
對於劑量反應分析，相較於化合物濃度繪製抑制百分比資料，且用Prism軟體(GraphPad Software)自4參數穩固擬合模型測定IC50 值。結果表示為pIC50 (IC50 之負對數)，且隨後使用Cheng-Prusoff等式變換為pKi (解離常數Ki之負對數)。
化合物1 呈現以下酶效能。表 3
檢定 2 ： 細胞 JAK 效能檢定 ： 抑制 IL - 13 藉由量測BEAS-2B人類肺上皮細胞(ATCC)中之介白素-13 (IL-13，R&D Systems)誘導之STAT6磷酸化，來進行AlphaScreen JAKI細胞效能檢定。將抗STAT6抗體(Cell Signaling Technologies)結合至AlphaScreen受體珠粒(Perkin Elmer)，同時使用EZ-Link Sulfo-NHS-生物素(Thermo Scientific)對抗pSTAT6 (pTyr641)抗體(Cell Signaling Technologies)進行生物素標記。
在37℃下在5% CO2 含濕氣培育箱中，在補充有10% FBS(Hyclone)、100 U/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素(Life Technologies)及2 mM GlutaMAX (Life Technologies)之50% DMEM/50% F-12培養基(Life Technologies)中，使BEAS-2B細胞生長。在檢定第1天，在具有25 μL培養基之白色聚D離胺酸塗佈之384孔培養盤(Corning)中，以7,500個細胞/孔的密度接種細胞，且在培育箱中使其黏附隔夜。在檢定第2天，將培養基移除，且用含有測試化合物之劑量反應之12 μL分析緩衝液(漢克氏平衡鹽溶液(Hank's Balanced Salt Solution)/HBSS，25 mM HEPES及1 mg/ml牛血清白蛋白/BSA)替換。將化合物連續稀釋於DMSO中，且隨後在培養基中再稀釋1000倍，以使最終DMSO濃度達至0.1%。在37℃下將細胞與測試化合物一起培育1 h，且隨後添加12 μL預溫熱之IL-13 (80 ng/mL於分析緩衝液中)以用於刺激。在37℃下培育30 min後，移除分析緩衝液(含有化合物及IL-13)，及10 μL細胞溶解緩衝液(25 mM HEPES、0.1% SDS、1% NP-40、5 mM MgCl2 、1.3 mM EDTA、1 mM EGTA，且補充有Complete Ultra mini蛋白酶抑制劑及來自Roche Diagnostics之PhosSTOP)。在環境溫度下震盪培養盤30 min，之後添加偵測試劑。首先添加生物素抗pSTAT6及抗STAT6結合之受體珠粒之混合物且在環境溫度下培育2 h，接著添加抗生蛋白鏈菌素結合之供體珠粒(Perkin Elmer)。培育最少2 h後，在EnVision盤式讀取器上讀取分析培養盤。記錄且利用AlphaScreen螢光信號，以基於DMSO及背景對照計算抑制百分比值。
對於劑量反應分析，相較於化合物濃度繪製抑制百分比資料，且用Prism軟體自4參數穩固擬合模型測定IC50 值。結果亦可表示為IC50 值之負對數，pIC50 。化合物1 在此檢定中呈現8.2之pIC50 值。
檢定 3 ： 細胞 JAK 效能檢定 ： 抑制人類 PBMC 中 IL - 2 / 抗 CD3 刺激之 IFNγ 在自人類全血分離之人類周邊血液單核細胞(PBMC) (Stanford Blood Center)中量測測試化合物抑制介白素-2 (IL-2)/抗CD3刺激之干擾素γ (IFNγ)之效能。由於IL-2經由JAK傳導信號，因此此檢定提供JAK細胞效能之量測。
(1)使用Ficoll梯度自健康供體之人類全血分離人類周邊血液單核細胞(PBMC)。在37℃，5% CO2 含濕氣培育箱中在補充有10%熱滅活胎牛血清(FBS，Life Technologies)、2 mM Glutamax (Life Technologies)、25 mM HEPES (Life Technologies)及1X Pen/Strep (Life Technologies)的RPMI (Life Technologies)中培養細胞。細胞以200,000個細胞/孔接種於培養基(50 μL)中且培養1 h。將化合物連續稀釋於DMSO中，且隨後在培養基中再稀釋500倍(達到2×最終分析濃度)。將測試化合物(100 μL/孔)添加至細胞中，且在37℃，5% CO2 下培育1 h，接著在預溫熱之分析培養基(50 μL)中添加IL-2 (R&D Systems；最終濃度100 ng/mL)及抗CD3 (BD Biosciences；最終濃度1 μg/mL)持續24 h。
(2)細胞介素刺激之後，細胞在500 g下離心5 min且移除上澄液且在-80℃下冷凍。為了測定測試化合物回應於IL-2/抗CD3之抑制效能，經由ELISA (R&D Systems)量測上澄液IFNγ濃度。藉由分析IFNγ濃度對比化合物濃度之抑制曲線來測定IC50 值。資料表示為pIC50 (負十進制對數IC50 )值。化合物1 在此檢定中呈現約7.3之pIC50 值。
檢定 4 ： 細胞 JAK 效能檢定 ： 抑制 CD4 + T 細胞中 IL - 2 刺激之 pSTAT5 使用流式細胞量測術在自人類全血分離 (Stanford Blood Center)之人類周邊血液單核細胞(PBMC)中之CD4陽性(CD4+) T細胞中量測測試化合物抑制介白素-2 (IL-2)/抗CD3刺激之STAT5磷酸化的效能。由於IL-2經由JAK傳導信號，因此此檢定提供JAK細胞效能之量測。
使用藻紅素(PE)結合之抗CD4抗體(Clone RPA-T4，BD Biosciences)鑑別CD4+ T細胞，同時使用Alexa Fluor 647結合之抗pSTAT5抗體(pY694，Clone 47，BD Biosciences)偵測STAT5磷酸化。
(1)遵循檢定3段落(1)之方法，不同之處在於用抗CD3刺激細胞介素30 min而非24 h。
(2)細胞介素刺激之後，將細胞用預溫熱之固定溶液(200 μL；BD Biosciences)在37℃，5% CO2 下固定10 min，用DPBS緩衝液(1 mL，Life Technologies)洗滌兩次，且在4℃下再懸浮於冰冷的Perm Buffer III (1000 μL，BD Biosciences)中30 min。細胞用含2% FBS之DPBS (FACS緩衝液)洗滌兩次，且隨後在室溫下在暗處再懸浮於含有抗CD4 PE (1:50稀釋)及抗CD3抗CD3 Alexa Fluor 647 (1:5稀釋)之FACS緩衝液(100 μL)中60 min。培育之後，細胞在FACS緩衝液中洗滌兩次，隨後使用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)分析。為了測定測試化合物回應於IL-2/抗CD3之抑制效能，在CD4+ T細胞中量測pSTAT5之中位螢光強度(MFI)。藉由分析MFI對比化合物濃度之抑制曲線測定IC50 值。資料表示為pIC50 (負十進制對數IC50 )值。化合物1 在此檢定中呈現約7.7之pIC50 值。
檢定 5 ： 細胞 JAK 效能檢定 ： 抑制 CD3 + T 細胞中 IL - 4 刺激之 pSTAT6 使用流式細胞量測術在自人類全血(Stanford Blood Center)分離之人類周邊血液單核細胞(PBMC)中之CD3陽性(CD3+) T細胞中量測測試化合物抑制介白素-4 (IL-4)刺激之STAT6磷酸化的效能。由於IL-4經由JAK傳導信號，因此此檢定提供JAK細胞效能之量測。
使用藻紅素(PE)結合之抗CD3抗體(Clone UCHT1，BD Biosciences)鑑別CD3+ T細胞，同時使用Alexa Fluor 647結合之抗pSTAT6抗體(pY641，Clone 18/P，BD Biosciences)偵測STAT6磷酸化。
如檢定3及4中自健康供體之人類全血分離人類周邊血液單核細胞(PBMC)。將細胞以250,000個細胞/孔接種於培養基(200 μL)中，培養1 h，且隨後再懸浮於含有各種濃度之測試化合物的分析培養基(50 μL) (補充有0.1%牛血清白蛋白(Sigma)、2 mM Glutamax、25 mM HEPES及1X Penstrep之RPMI)中。將化合物連續稀釋於DMSO中，且隨後在分析培養基中再稀釋500倍(達至2×最終分析濃度)。在37℃，5% CO2 下將測試化合物(50 μL)與細胞一起培育1 h，接著在預溫熱之分析培養基中添加IL-4 (50 μL) (R&D Systems；最終濃度20 ng/mL)持續30 min。細胞介素刺激之後，將細胞用預溫熱之固定溶液(100 μL) (BD Biosciences)在37℃，5% CO2 下固定10分鐘，用FACS緩衝液(1 mL) (含2% FBS之DPBS)洗滌兩次，且在4℃下再懸浮於冰冷的Perm Buffer III (1000 μL) (BD Biosciences)中30 min。細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，且隨後在室溫下在暗處再懸浮於含有抗CD3 PE (1:50稀釋)及抗pSTAT6 Alexa Fluor 647 (1:5稀釋)之FACS緩衝液(100 μL)中60 min。培育之後，細胞在FACS緩衝液中洗滌兩次，隨後使用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)分析。
為了測定測試化合物回應於IL-4之抑制效能，在CD3+ T細胞中量測pSTAT6之中位螢光強度(MFI)。藉由分析MFI對比化合物濃度之抑制曲線測定IC50 值。資料表示為pIC50 (負十進制對數IC50 )。化合物1 在此檢定中呈現8.1之pIC50 值。
檢定 6 ： 細胞 JAK 效能檢定 ： 抑制 CD3 + T 細胞中 IL - 6 刺激之 pSTAT3 使用類似於檢定5之方法來測定測試化合物抑制介白素-6 (IL-6)刺激之STAT3磷酸化的效能。使用Alexa Fluor 647結合之抗pSTAT3抗體(pY705，Clone 4/P，BD Biosciences)偵測STAT3磷酸化。
化合物1 在此檢定中呈現7.4之pIC50 值。
檢定 7 ： 細胞 JAK 效能檢定 ： 抑制 IFNγ 誘導之 pSTAT1 使用流式細胞量測術在源自人類全血(Stanford Blood Center)之CD14陽性(CD14+)單核球中量測測試化合物抑制干擾素γ (IFNγ)刺激之STAT1磷酸化的效能。由於IFNγ經由JAK傳導信號，因此此檢定提供JAK細胞效能之量測。
使用異硫氰酸螢光素(FITC)結合之抗CD14抗體(Clone RM052，Beckman Coulter)鑑別單核球，且使用Alexa Fluor 647結合之抗pSTAT1抗體(pY701，Clone 4a，BD Biosciences)偵測STAT1磷酸化。
使用Ficoll梯度自健康供體之人類全血分離人類周邊血液單核細胞(PBMC)。在37℃，5% CO2 含濕氣培育箱中在補充有10%胎牛血清(FBS，Life Technologies)、2 mM Glutamax (Life Technologies)、25 mM HEPES (Life Technologies)及1X Pen/Strep (Life Technologies)之RPMI (Life Technologies)中培養細胞。將細胞以250,000個細胞/孔接種於培養基(200 μL)中，培養2 h，且隨後再懸浮於含有各種濃度之測試化合物的分析培養基(50 μL) (補充有0.1%牛血清白蛋白(Sigma)、2 mM Glutamax、25 mM HEPES及1X Penstrep之RPMI)中。將化合物連續稀釋於DMSO中，且隨後在培養基中再稀釋1000倍，以使最終DMSO濃度達至0.1%。在37℃，5% CO2 下將測試化合物稀釋液與細胞一起培育1 h，接著在培養基(50 µL)中添加預溫熱之IFNγ (R&D Systems)持續30 min，最終濃度為0.6 ng/mL。細胞介素刺激之後，在37℃，5% CO2 下將細胞用預溫熱之固定溶液(100 µL) (BD Biosciences)固定10分鐘，用FACS緩衝液(1 mL) (含1%BSA之PBS)洗滌兩次，再懸浮於1:10抗CD14 FITC:FACS緩衝液(100 µL)中，且在4℃下培育15 min。將細胞洗滌一次，且隨後在4℃下再懸浮於冰冷的Perm Buffer III (BD Biosciences) (100 µL)中30 min。細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，且隨後在RT下在暗處再懸浮於1:10抗pSTAT1 Alexa氟647:FACS緩衝液(100 µL)中30 min，在FACS緩衝液中洗滌兩次，且使用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)分析。
為了測定測試化合物之抑制效能，在CD14+單核球中量測pSTAT1之中位螢光強度(MFI)。藉由分析MFI對比化合物濃度之抑制曲線測定IC50 值。資料表示為pIC50 (負十進制對數IC50 )值。化合物1 在此檢定中呈現約7.5之pIC50 值。
檢定 8 ： 小鼠之血漿及肺中之藥物動力學 以以下方式測定測試化合物之血漿及肺臟水準及其比率。在檢定中使用來自Charles River Laboratories之BALB/c小鼠。測試化合物以0.2 mg/mL之濃度單獨地調配於含20%丙二醇之pH 4檸檬酸鹽緩衝液中，且藉由經口抽吸將50 μL之給藥溶液引入小鼠氣管中。在給藥後之多個時間點(典型地0.167、2、6、24小時)，經由心臟穿刺移出血液樣品，且自小鼠切除完整肺臟。在4℃下以約12,000 rpm使血液樣品離心(Eppendorf centrifuge，5804R) 4分鐘以收集血漿。肺臟經填塞乾燥、稱取且以1:3之稀釋液於無菌水中均質化。藉由LC-MS分析，對照在測試基質中構建成標準曲線之分析型標準品，來測定測試化合物之血漿及肺臟水準。肺與血漿比率測定為肺AUC (以µg hr/g為單位)與血漿AUC (以µg hr/mL為單位)之比率，其中AUC習知地定義為測試化合物濃度對比時間之曲線下面積。
在小鼠中，化合物1 在肺臟中之暴露量比在血漿中之暴露量高約55倍。
檢定 9 ： 肺組織中 IL - 13 誘導之 pSTAT6 誘導的鼠類 ( 小鼠 ) 模型 Il-13為哮喘之病理生理學潛在的重要細胞介素(Kudlacz等人Eur . J . Pharmacol ,2008 ,582 ,154-161)。IL-13與細胞表面受體結合，使激酶之傑納斯家族(JAK)之成員活化，其隨後使STAT6磷酸化且隨後進一步活化轉錄路徑。在所描述之模型中，將一定劑量之IL-13局部遞送至小鼠肺臟中以誘導STAT6之磷酸化(pSTAT6)，隨後作為終點來量測。
在分析中使用來自Harlan之成年balb/c小鼠。在研究當天，輕輕地用異氟醚麻醉動物且經由經口抽吸投與媒劑或測試化合物(0.5 mg/mL，50 μl總體積，經由若干次呼吸)。在給藥後，將動物側臥放置且在返回其飼養籠之前監測自麻醉之完整恢復。四小時後，再次簡單麻醉動物且在監測自麻醉恢復及返回至其飼養籠之前經由經口抽吸用媒劑或IL-13 (0.03 μg總遞送劑量，50 μL總體積)進行刺激。在媒劑或IL-13投與之後一小時，收集肺臟以用於使用抗pSTAT6 ELISA之兩個pSTAT6檢測(兔單抗捕獲/包被抗體；小鼠單抗檢測/報導抗體：抗pSTAT6-pY641；二級抗體：抗小鼠IgG-HRP)且如上文檢定12中所描述分析總藥物濃度。
相比於經媒劑處理、IL-13刺激之對照動物，在5小時時經處理動物之肺臟中存在之pSTAT6水準降低證明該模型中之活性。經媒劑處理、IL-13刺激之對照動物與經媒劑處理、媒劑刺激之對照動物之間的差異在任何給定實驗中分別指示0%及100%抑制性作用。化合物1 在IL-13刺激後4小時呈現對STAT6磷酸化約60%之抑制。
檢定 10 ： 交鏈孢屬赤星病菌 ( Alternaria alternata ) 誘發之肺臟嗜酸性炎症的鼠類模型 呼吸道嗜酸性球增多症為人類哮喘之標誌。交鏈孢屬赤星病菌為可加重人類哮喘且在小鼠肺臟中誘發嗜酸性球性炎症之真菌氣源性致敏原(Havaux等人Clin Exp Immunol . 2005 , 139(2):179-88)。在小鼠中已證明，交鏈孢屬間接活化肺臟中之組織駐留2型先天性淋巴細胞，其對JAK依賴性細胞介素(例如IL-2及IL-7)作出回應且釋放JAK依賴性細胞介素(例如IL-5及IL-13)且調和嗜酸性球性炎症(Bartemes等人J Immunol . 2012 , 188(3):1503-13)。
在該研究中使用來自Taconic之七至九週齡雄性C57小鼠。在研究當天，輕輕地用異氟醚麻醉動物且經由口咽抽吸投與媒劑或測試化合物(0.1-1.0 mg/mL，50 μl總體積，經由若干次呼吸)。在給藥後，將動物側臥放置且在返回其飼養籠之前監測自麻醉之完整恢復。一小時後，再次簡單麻醉動物且在監測自麻醉恢復及返回至其飼養籠之前經由口咽抽吸用媒劑或交鏈孢屬萃取物 (200 μg總遞送萃取物，50 μL總體積)進行刺激。在交鏈孢屬投與四十八小時之後，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)且使用Advia 120 Hematology系統(Siemens)對BALF中之嗜酸性球進行計數。
藉由相比於經媒劑處理、交鏈孢屬刺激之對照動物，四十八小時時經處理動物之BALF中存在之嗜酸性球水準降低證明該模型中之活性。資料表示為經媒劑處理、交鏈孢屬刺激之BALF嗜酸性球回應之抑制百分比。為了計算抑制百分比，將各條件之BALF嗜酸性球的數目轉化成平均經媒劑處理、交鏈孢屬刺激之BALF嗜酸性球之百分比且減去一百百分比。化合物1 在交鏈孢屬刺激後四十八小時呈現對BALF嗜酸性球數約88%的抑制。
檢定 11 ： 肺臟模型之 LPS / G - CSF / IL - 6 / IFNγ 混合物誘導之呼吸道嗜中性球性炎症的鼠類模型 呼吸道嗜中性球增多症為一系列人類呼吸道疾病之標誌。使用誘發呼吸道嗜中性球增多症之LPS /G-CSF/IL-6/IFNγ混合物在嗜中性球性呼吸道炎症之模型中測試化合物1 。
在該研究中使用來自Jackson Laboratory之七至九週齡雄性Balb/C (野生型)小鼠。在研究當天，輕輕地用異氟醚麻醉動物且經由口咽抽吸投與媒劑或測試化合物(1.0 mg/mL，50 μl總體積，經由若干次呼吸)。在給藥後，將動物側臥放置且在返回其飼養籠之前監測自麻醉之完整恢復。一小時後，再次簡單麻醉動物且經由口咽抽吸(OA)用媒劑或LPS；0.01 mg/kg /G-CSF；5 μg/IL-6；5 μg/IFNγ；5 μg (100 μL總體積)進行刺激。投與LPS/G-CSF/IL-6/IFNγ混合物後二十四小時，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)並對嗜中性球計數。
在用化合物1 進行OA治療後，呼吸道嗜中性球在統計學上顯著降低(與經媒劑治療之小鼠相比84%)，證實阻斷JAK-依賴性信號傳導對嗜中性呼吸道炎症有效。
檢定 12 ： 家兔眼睛中之眼部藥物動力學 此檢定之目標為測定化合物1 在家兔眼部組織中之藥物動力學。
溶液調配物 將本發明化合物5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H -吲唑-6-基)苯酚(1 )溶解於10% 2-羥基丙基-β-環糊精中以獲得4 mg/mL之目標濃度，或溶解於純化水中以獲得1 mg/mL之目標濃度。將測試化合物溶液之雙側玻璃體內注射液(50 µL/眼)分別以兩個劑量組(針對環糊精及水媒劑調配物分別為200 µg/眼及50 µg/眼)投與紐西蘭白兔分別。在注射後預定時間點(30分鐘、4小時、1天、3天、7天、14天)在以下眼部組織中量測測試化合物濃度：玻璃體、房水(aqueous)、視網膜/脈絡膜及虹膜-睫狀體。在各時間點給藥兩隻家兔(四隻眼睛)。在玻璃體組織中，化合物1 呈現濃度之二相降低，表徵為半衰期為約12小時之濃度初始降低及終半衰期為約3.6天之最終降低。亦發現化合物快速分佈於視網膜及脈絡膜區域中且展示如玻璃體組織中之類似藥物動力學概況。
懸浮液調配物 藉由使實例2之結晶化合物1 與0.5%羥丙基甲基纖維素(HPMC E5) + 0.02% Tween 80組合以獲得10 mg/mL之目標濃度來製備懸浮液調配物。向紐西蘭白兔(500 µg/眼)投與測試化合物之懸浮液之雙側玻璃體內注射液(50 µL/眼)。在注射後30分鐘、2週、4週、6週及8週在如懸浮液調配物檢定中之眼部組織中量測測試化合物濃度。化合物展示玻璃體中之藥物濃度自30分鐘至6週線性降低，其中清除速率為約3 µg/mL/天。該行為與媒劑中化合物1 之溶解度及溶液調配物之眼部藥物動力學行為一致。量測血漿中之藥物濃度且發現其比玻璃體組織中之濃度低至少3個數量級。
檢定 13 ： 藥效動力學檢定 ： 抑制大鼠中 IL6 誘導之 pSTAT3 在大鼠視網膜/脈絡膜勻漿中量測單次玻璃體內投與測試化合物抑制IL-6誘導之pSTAT3的能力。
藉由使實例2之結晶化合物1 與0.5%羥丙基甲基纖維素(HPMC E5 LV)、0.02% Tween 80及含0.9%氯化鈉之純化水組合以獲得3 mg/mL及10 mg/mL之目標濃度來製備懸浮液調配物。
雌性路易士(Lewis)大鼠用懸浮液調配物或用藥物媒劑玻璃體內(IVT)給藥(5 µL/眼)。三天後，玻璃體內投與IL-6 (Peprotech；0.1 mg/mL；5 µL/眼)或媒劑以誘導pSTAT3。用IL-6第二次IVT注射一小時後剝離眼部組織。使視網膜/脈絡膜組織均質化且使用ELISA (Cell Signaling Technology)來量測pSTAT3水準。相較於媒劑/媒劑組及媒劑/IL-6組計算IL-6誘導之pSTAT3之抑制百分比。大於100%之抑制反映pSTAT3水準降低至低於媒劑/媒劑組中所觀測到的彼等水準。
在IL-6刺激之前進行3天預處理之情況下，藉由懸浮液調配物投與之15 µg劑量及50 µg劑量之本發明化合物在視網膜/脈絡膜組織中將IL-6誘導之pSTAT3分別抑制33%及109%。
檢定 14 ： 藥效動力學檢定 ： 抑制家兔中 IFNγ 誘導之 IP - 10 在家兔玻璃體及視網膜/脈絡膜組織中量測單次玻璃體內投與測試化合物抑制干擾素γ (IFNγ)誘導之IP-10蛋白質水準的能力。
如檢定12中製備實例2之化合物1 之濃度為1 mg/mL及4 mg/mL的溶液調配物。藉由使實例2之結晶化合物1與0.5%羥丙基甲基纖維素(HPMC E5)、0.02% Tween 80及含9 mg/mL氯化鈉之純化水組合以獲得20 mg/mL之目標濃度來製備懸浮液調配物。
將雄性紐西蘭白兔(Liveon Biolabs，India)用於研究。使動物在到達研究機構(Jubilant Biosys Ltd.，India)後適應環境。以50 µL/眼之總劑量體積為每隻家兔提供總共兩次玻璃體內(IVT)注射。第一次IVT注射(45 µL/眼)在規定時間點(亦即，針對溶液調配物為24小時，或針對懸浮液調配物為1週)遞送測試化合物或媒劑。第二次IVT注射(5 µL/眼)遞送用於誘導IP-10之IFNγ (1 µg/眼；儲備溶液1 mg/mL；Kingfisher Biotech)或媒劑。簡言之，在注射當天，藉由肌肉內注射氯胺酮(35 mg/kg)及甲苯噻嗪(5 mg/kg)麻醉家兔。一旦深入麻醉，則用無菌鹽水沖洗各眼，且使用具有31號規格的針之0.5 mL胰島素注射器(50個單位= 0.5 mL)在雙眼之鼻側上藉由Braunstein固定卡尺(2 3/4”)標記距直肌3.5 mm及距角膜緣4 mm之位置進行IVT注射。
用IFNγ進行第二次IVT注射後24小時收集組織。收集玻璃體液(VH)及視網膜/脈絡膜組織(R/C)並均質化，且使用家兔CXCL10 (IP-10) ELISA套組(Kingfisher Biotech)來量測IP-10蛋白質水準。相較於媒劑/媒劑組及媒劑/IFNγ組，計算IFNγ誘導之IP-10之抑制百分比。
當以溶液型式給藥時，在IFNγ刺激之前進行24小時預處理之情況下，45 µg化合物1 在玻璃體液及視網膜/脈絡膜組織中將IFNγ誘導之IP-10分別抑制70%及86%，而180 µg化合物在玻璃體液及視網膜/脈絡膜組織中將IFNγ誘導之IP-10分別抑制91%及100%。
在IFNγ刺激之前進行1週預處理之情況下，化合物1 之結晶懸浮液調配物在玻璃體液及視網膜/脈絡膜組織兩者中皆將IFNγ誘導之IP-10抑制100%。
檢定 15 ： 抑制人類 3D 呼吸道培養物中 IFNγ 及 IL - 27 誘導之趨化因子 CXCL9 及 CXCL10 EpiAirway組織培養物獲自Mattek (AIR-100)。培養物來源於哮喘供體。在細胞培養插入物中，人類來源之氣管/支氣管上皮細胞在多孔膜載體上生長及分化，使得氣液界面具有細胞下方的溫熱培養基及上述氣態測試氛圍。在維持培養基(Mattek，AIR-100-MM)中在37℃，5% CO2 含濕氣培育箱中培養組織。測試四個供體。在第0天，組織培養物用10 μM、1 μM及/或0.1 μM測試化合物處理。化合物在二甲亞碸(DMSO，Sigma)中稀釋至最終濃度0.1%。0.1% DMSO用作媒劑對照。在37℃，5% CO2 下將測試化合物與培養物一起培育1小時，接著添加含有IFNγ (R&D Systems)或IL-27 (R&D Systems)之預溫熱培養基，最終濃度為100 ng/ml。組織培養物保留8天。培養基每2天用含有化合物及IFNγ或IL-27之新鮮培養基替換。在第8天，收集組織培養物及上澄液用於分析。使用流式螢光檢測術(luminex)分析(EMD Millipore)檢定上澄液樣品之CXCL10 (IP-10)及CXCL9 (MIG)。資料表示為抑制% +/-標準差(±STDV)。與經媒劑處理之細胞相比，抑制百分比由化合物針對IFNγ或IL-27誘導之CXCL10或CXCL9分泌的抑制效能來測定。資料為來自3或4個供體之平均值。與媒劑對照組相比，化合物1 能夠將IFNγ誘導之CXCL10分泌抑制99% ± 2.0 (在10 µM下)、71% ± 19 (在1 µM下)及17% ± 12 (在0.1 µM下)。與媒劑相比，化合物1 能夠將IFNγ誘導之CXCL9分泌抑制100% ± 0.3 (在10 µM下)、99% ± 0.9 (在1 µM下)及74% ± 17 (在0.1 µM下)。與媒劑對照組相比，化合物1 能夠將IL-27誘導之CXCL10分泌抑制108% ± 11 (在10 µM下)、98% ±10 (在1 µM下)以及73% ± 8.5 (在0.1 µM下)。與媒劑對照相比，化合物1 能夠將IL-27誘導之CXCL9分泌抑制100% ± 0 (在10 µM下)、95% ± 3.7 (在1 µM下)以及75% ± 3.5 (在0.1 μM下)。
檢定 16 ： IL - 5 介導之嗜酸性球存活率檢定 在自人類全血(AllCells)分離之人類嗜酸性球中量測測試化合物對IL-5介導之嗜酸性球存活率的效能。由於IL-5經由JAK傳導信號，因此此檢定提供JAK細胞效能之量測。
自健康供體之新鮮人類全血(AllCells)分離人類嗜酸性球。將血液與4.5%聚葡萄糖(Sigma-Aldrich)混合於0.9%氯化鈉溶液(Sigma-Aldrich)中。將紅血球沈降35分鐘。移除富含白血球之上層且在Ficoll-Paque (GE Healthcare)上分層且在600 g下離心30分鐘。在用水溶解顆粒球層之前移除血漿及單核細胞層，以移除任何污染之紅血球。使用人類嗜酸性球分離套組(Miltenyi Biotec)進一步純化嗜酸性球。在4℃下在暗處將一部分純化之嗜酸性球與抗CD16 FITC (Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘。使用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)分析純度。
在37℃，5% CO2 含濕氣培育箱中在補充有10%熱滅活胎牛血清(FBS，Life Technologies)、2 mM Glutamax (Life Technologies)、25 mM HEPES (Life Technologies)及1X Pen/Strep (Life Technologies)的RPMI 1640 (Life Technologies)中培養細胞。將細胞以10,000個細胞/孔接種於培養基(50 μL)中。培養盤在300 g下離心5分鐘且移除上澄液。將化合物連續稀釋於DMSO中，且隨後在培養基中再稀釋500倍達至2×最終分析濃度。將測試化合物(50 μL/孔)添加至細胞中，且在37℃，5% CO2 下培育1小時，接著在預溫熱之分析培養基(50 μL)中添加IL-5 (R&D Systems；最終濃度1 ng/mL及10 pg/ml)持續72小時。
細胞介素刺激之後，細胞在300 g下離心5 min，且用冷DPBS (Life Technologies)洗滌兩次。為了達到存活及細胞凋亡，將細胞與碘化丙啶(Thermo Fisher Scientific)及APC Annexin V (BD Biosciences)一起培育且使用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)進行分析。藉由分析細胞存活率%對比化合物濃度之存活率曲線來測定IC50 值。資料表示為pIC50 (負十進制對數IC50 )值。化合物1 之pIC50 值在10 pg/ml IL-5存在下為7.9±0.5且在1 ng/ml IL-5存在下pIC50 值為6.5±0.2。
雖然本發明已參考其特定態樣或實施例進行描述，但一般熟習此項技術者應瞭解，可進行各種變化或可代入等效物，而不偏離本發明之真實精神及範疇。 另外，在由適用之專利狀況及規定允許之程度上，本文中所引用之所有公開案、專利及專利申請案以全文引用之方式併入本文中，該引用之程度如同將各文件單獨地以引用之方式併入本文中一般。
本發明之各種態樣藉由參考附圖說明。 圖1展示5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H - 吲唑-6-基)苯酚之草酸鹽結晶水合物(以下稱作『草酸鹽水合物』)之粉末x射線繞射(PXRD)圖案。 圖2展示本發明之草酸鹽水合物之差示掃描熱量測定(DSC)溫譜圖。 圖3展示本發明之草酸鹽水合物之熱解重量分析(TGA)曲線圖。 圖4展示在約25℃之溫度下觀測到的本發明之草酸鹽水合物之動態濕氣吸附(DMS)等溫線。 圖5展示5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H -咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H - 吲唑-6-基)苯酚之結晶琥珀酸鹽水合物(以下稱作『琥珀酸鹽水合物』)之粉末x射線繞射(PXRD)圖案。 圖6展示本發明之琥珀酸鹽水合物之差示掃描熱量測定(DSC)溫譜圖。 圖7展示本發明之琥珀酸鹽水合物之熱解重量分析(TGA)曲線圖。 圖8展示在約25℃之溫度下觀測到的本發明之琥珀酸鹽水合物之動態濕氣吸附(DMS)等溫線。

Claims (21)

  1. 一種5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H-吲唑-6-基)苯酚之結晶草酸鹽水合鹽，其表徵為在以下2θ值處包含繞射峰值的粉末X射線繞射圖案：6.77±0.20、12.13±0.20、13.54±0.20、17.23±0.20及18.00±0.20。
  2. 如請求項1之結晶草酸鹽水合鹽，其中該粉末X射線繞射圖案進一步表徵為在選自以下之2θ值處具有兩個或更多個額外繞射峰值：11.56±0.20、14.29±0.20、19.51±0.20、21.38±0.20及23.63±0.20。
  3. 如請求項1之結晶草酸鹽水合鹽，其中該結晶草酸鹽水合鹽進一步表徵為粉末X射線繞射圖案，其中峰值位置實質上與圖1中所示之圖案的峰值位置一致。
  4. 如請求項1之結晶草酸鹽水合鹽，其中該結晶草酸鹽水合鹽進一步表徵為在每分鐘10℃之加熱速率下記錄的差示掃描熱量測定跡線，該差示掃描熱量測定跡線展示在266℃與276℃之間的溫度下吸熱流之最大值。
  5. 如請求項1之結晶草酸鹽水合鹽，其中該結晶草酸鹽水合鹽進一步表徵為實質上與圖2中所示之差示掃描熱量測定跡線一致的差示掃描熱量測定跡線。
  6. 一種5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H-吲唑-6-基)苯酚之結晶琥珀酸鹽水合鹽，其表徵為在以下2θ值處包含繞射峰值的粉末X射線繞射圖案：4.81±0.20、9.66±0.20、14.93±0.20及16.78±0.20。
  7. 如請求項6之結晶琥珀酸鹽水合鹽，其中該粉末X射線繞射圖案進一步表徵為在選自以下之2θ值處具有兩個或更多個額外繞射峰值：10.46±0.20、16.21±0.20、17.45±0.20、22.87±0.20及24.77±0.20。
  8. 如請求項6之結晶琥珀酸鹽水合鹽，其中該結晶琥珀酸鹽水合鹽進一步表徵為粉末X射線繞射圖案，其中峰值位置實質上與圖5中所示之圖案的峰值位置一致。
  9. 如請求項6之結晶琥珀酸鹽水合鹽，其中該結晶琥珀酸鹽水合鹽進一步表徵為在每分鐘10℃之加熱速率下記錄的差示掃描熱量測定跡線，該差示掃描熱量測定跡線展示在180℃與190℃之間的溫度下吸熱流之最大值。
  10. 如請求項6之結晶琥珀酸鹽水合鹽，其中該結晶琥珀酸鹽水合鹽進一步表徵為實質上與圖6中所示之差示掃描熱量測定跡線一致的差示掃描熱量測定跡線。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之結晶草酸鹽水合 鹽或如請求項6至10中任一項之結晶琥珀酸鹽水合鹽及醫藥學上可接受之載劑。
  12. 一種製備如請求項1之5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H-吲唑-6-基)苯酚之結晶草酸鹽水合鹽的方法，該方法包含：(a)在室溫下將5-乙基-2-氟-4-(3-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-4,5,6,7-四氫-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基)-1H-吲唑-6-基)苯酚：草酸之1：1混合物溶解於四氫呋喃：水之1：1混合物中，(b)添加四氫呋喃：水：乙腈之1：1：2混合物以產生懸浮液，(c)攪拌該懸浮液約一天，及(d)將該結晶草酸鹽水合鹽與該懸浮液分離。
  13. 一種醫藥組合物之用途，其係用於製備用於治療哺乳動物之與呼吸道疾病相關的炎症之藥劑，其中該醫藥組合物包含如請求項1至5中任一項之結晶草酸鹽水合鹽或如請求項6至10中任一項之結晶琥珀酸鹽水合鹽及醫藥學上可接受之載劑，其中該呼吸道疾病係哮喘、囊腫性纖維化症(CF)、肺炎、特發性肺纖維化、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、支氣管炎、氣腫、阻塞性細支氣管炎、慢性阻塞性肺病、肺部感染、蠕蟲感染、肺部動脈高血壓、類肉瘤病、肺淋巴血管平滑肌增生症、支氣管擴張症、浸潤性肺病、藥物誘發之肺炎、真菌誘發之肺炎、過敏性支氣管肺麴菌病、過敏性肺炎、嗜酸性肉芽腫伴多血管炎、特發性急性嗜酸性肺炎、特發性慢性嗜酸性肺炎、嗜伊紅白血球增多症候群、呂弗勒症候群 (Löffler syndrome)、阻塞性細支氣管炎伴機化性肺炎或免疫檢查點抑制劑誘發之肺炎。
  14. 如請求項13之用途，其中該呼吸道疾病為哮喘、囊腫性纖維化症、肺炎、特發性肺纖維化、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、支氣管炎或氣腫。
  15. 如請求項13之用途，其中該呼吸道疾病為阻塞性細支氣管炎。
  16. 如請求項13之用途，其中該呼吸道疾病為哮喘或慢性阻塞性肺病。
  17. 如請求項16之用途，其中該呼吸道疾病為哮喘。
  18. 如請求項13之用途，其中該醫藥組合物藉由吸入投與。
  19. 如請求項13之用途，其中該呼吸道疾病為肺部感染、蠕蟲感染、肺部動脈高血壓、類肉瘤病、肺淋巴血管平滑肌增生症、支氣管擴張症或浸潤性肺病。
  20. 如請求項13之用途，其中該呼吸道疾病為藥物誘發之肺炎、真菌誘發之肺炎、過敏性支氣管肺麴菌病、過敏性肺炎、嗜酸性肉芽腫伴多血管炎、特發性急性嗜酸性肺炎、特發性慢性嗜酸性肺炎、嗜伊紅白血球增多症候群、呂弗勒症候群(Löffler syndrome)、阻塞性細支氣管炎伴機化性 肺炎及免疫檢查點抑制劑誘發之肺炎。
  21. 一種醫藥組合物之用途，其係用於製備用於治療哺乳動物之與眼部疾病相關的炎症之藥劑，其中該醫藥組合物包含如請求項1至5中任一項之結晶草酸鹽水合鹽或如請求項6至10中任一項之結晶琥珀酸鹽水合鹽及醫藥學上可接受之載劑。
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