KR20210056381A - Jak 억제제로서 디메틸 아미노 아제티딘 아마이드 - Google Patents

Jak 억제제로서 디메틸 아미노 아제티딘 아마이드 Download PDF

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다니엘 디. 롱
카메론 스미스
코빈 톰슨
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세라밴스 바이오파마 알앤디 아이피, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 JAK 키나제 억제제로서 유용한, 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00061

상기 변수들은 본 명세서에 정의되어 있다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 이러한 화합물을 사용하여 호흡기 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

JAK 억제제로서 디메틸 아미노 아제티딘 아마이드
본 발명은 JAK 키나제 억제제로서 유용한 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 이러한 화합물을 사용하여 호흡기 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
천식 (asthma)은 예방법 또는 치료법이 없는 만성 기도 질환이다. 상기 질환은 기도의 염증, 섬유증 (fibrosis), 과민반응 (hyper-responsiveness) 및 개형 (remodeling)을 특징으로 하며, 상기 모두는 기류 (airflow)를 제한한다. 전세계적으로 3억명의 사람들이 천식을 앓는 것으로 추정되며, 천식에 걸린 사람의 수는 2025년까지 1억명 이상 증가할 것으로 추정된다. 미국에서, 천식 환자는 인구의 약 6% 내지 8%이고, 이는 미국에서 가장 흔한 만성 질환 중 하나이다. 대부분의 환자는 류코트리엔 조절제 (leukotriene modifier) 및/또는 지속성 베타 효능제 (long acting beta agonist)와 조합될 수 있는 흡입 (inhaled) 코르티코스테로이드 (corticosteroids)를 사용하여 천식 증상을 제어할 수 있지만, 기존의 요법으로는 제어되지 않는 중증 천식 환자의 서브세트 (subset)가 있다. 중증 지속성 천식 (severe persistent asthma)은 다량의 흡입 코르티코스테로이드로 제어되지 않는 질환으로 정의된다. 중증 천식 환자는 모든 천식 환자의 대략 5%를 차지할 것으로 추정되며, 이들은 고위험의 이환율 (morbidity) 및 사망율 (mortality)을 가지며, 천식 환자들 중에 헬스 케어 자원 활용의 과다한 부분을 차지한다. 이러한 환자를 치료하기 위한 새로운 치료법이 필요하다.
사이토킨 (cytokines)은 케모킨 (chemokines), 인터페론 (interferons), 인터루킨 (interleukins), 림포킨 (lymphokines) 및 종양 괴사 인자 (tumour necrosis factor)를 포함하는 세포간 신호전달 분자 (intercellular signaling molecules)이다. 사이토킨은 정상적인 세포 성장 및 면역조절에 중요하지만, 면역-매개 질환을 유발하고, 악성 세포의 성장에 기여한다. 다수의 사이토킨의 상승된 수준은 천식 염증의 병리학 (pathology)에 연관되어 있다. 예를 들어, 인터루킨 (IL)-5 및 13을 표적으로 하는 항체-기반 요법이 중증 천식 환자의 서브세트에서 임상적 유익을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 천식 염증에 연관된 사이토킨들 중에, 다수가 티로신 키나제의 Janus 패밀리 (Janus family of tyrosine kinases: JAKs)에 의존하는 신호전달 경로를 통해 작용하고, 이는 전사 인자의 STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) 패밀리를 통해 신호를 전달한다. JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 천식 염증에 연관된 사이토킨은 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, 흉선 기질상 림포포이에틴 (thymic stromal lymphopoietin: TSLP), 인터페론-γ (IFNγ) 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)를 포함한다.
상기 JAK 패밀리는 4개의 구성원인, JAK1, JAK2, JAK3 및 티로신 키나제 2 (tyrosine kinase 2: TYK2)를 포함한다. 사이토킨의 JAK-의존성 사이토킨 수용체로의 결합은 수용체의 이량체화 (dimerization)를 유도하여, JAK 키나제 상에 티로신 잔기의 인산화 (phosphorylation)를 초래하여, JAK 활성화에 영향을 준다. 인산화된 JAKs는 다양한 STAT 단백질과 결합 및 인산화하고, 이는 이량체화, 세포 핵 내에 내재화, 유전자 전사를 직접 조절하여, 다른 효과들 중에서 염증 질환과 관련된 하류 효과 (downstream effect)를 유도한다. 상기 JAKs는 대개 사이토킨 수용체와 결합하여 호모다이머 (homodimers) 또는 헤테로다이머 (heterodimers)로 쌍을 이룬다. 특정 사이토킨은 특정 JAK 페어링 (pairing)과 관련이 있다. 상기 JAK 패밀리 중 4개의 구성원들 각각은 천식 염증과 관련된 사이토킨들 중 적어도 하나의 신호전달에 연관되어 있다. 결과적으로, 상기 JAK 패밀리의 모든 구성원에 대한 전체-활성 (pan-activity)을 갖는 화학적 억제제는 중증 천식에 기여하는 광범위한 염증유발 (pro-inflammatory) 경로를 조절할 수 있다.
그러나 이러한 억제제의 광범위한 항-염증 효과는 정상 면역 세포 기능을 억제할 수 있어서, 잠재적으로 감염의 위험을 증가시킬 수 있다. 증가된 감염 위험의 증거는 류마티스 관절염 치료를 위해 경구로 투여되는 JAK 억제제인 토파시티닙 (tofacitinib)에서 관찰되었다. 천식에서, 염증은 기도에 국한되어 있다. 기도의 염증은 천식 이외에 다른 호흡기 질환의 특징이다. 만성 폐쇄성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease: COPD), 낭성 섬유증 (cystic fibrosis: CF), 폐렴 (pneumonitis), 간질성 폐 질환 (interstitial lung diseases) (특발성 폐 섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis) 포함), 급성 폐 손상 (acute lung injury), 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome), 기관지염 (bronchitis), 폐기종 (emphysema) 및 사르코이드증 (sarcoidosis)은 또한 이들의 병태생리학이 JAK-신호전달 사이토킨과 관련이 있는 것으로 여겨지는 기도 질환이다. JAK 억제제를 흡입에 의해 폐에 국소 투여하는 것은 효능이 있는 항-사이토킨 제제를 작용 부위에 직접 전달하여 전신 노출을 제한함으로써, 유해 전신 면역억제 가능성을 제한하여 치료적 유효성이 있을 가능성을 제공한다. 호흡기 질환의 치료를 위해 폐에 국소 투여하기에 적합한 효능이 있는 JAK 억제제에 대한 필요성이 남아있다.
JAK-신호전달 사이토킨은 또한 많은 면역 과정의 핵심인 면역 세포의 서브타입인 T 세포의 활성화에 주요 역할을 한다. 병리학적 T 세포 활성화는 다수의 호흡기 질환의 병인에 있어서 중요하다. 자가반응 T 세포는 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴 (COS라고도 함)에서 역할을 한다. COS와 유사하게, 폐 이식 거부 반응의 병인은 이식된 공여자 폐에 의한 수혜자 T 세포의 비정상적인 T 세포 활성화와 관련이 있다. 폐 이식 거부 반응은 초기에 원발성 이식 기능장애 (Primary Graft Dysfunction: PGD), 기질화 폐렴 (organizing pneumonia: OP), 급성 거부 반응 (acute rejection: AR) 또는 림프구성 세기관지염 (lymphocytic bronchiolitis: LB)으로 발생할 수 있거나, 또는 폐 이식 후 수년 후에 만성 폐 동종이식 기능장애 (Chronic Lung Allograft Dysfunction: CLAD)로 발생할 수 있다. CLAD는 이전에 폐쇄성 세기관지염 (bronchiolitis obliterans: BO)으로 알려졌지만, 현재는 BO, 제한성 CLAD (rCLAD 또는 RAS) 및 호중구성 동종이식 기능장애를 포함한 다양한 병리학적 증상을 가질 수 있는 증후군으로 간주된다. 만성 폐 동종이식 기능장애 (CLAD)는 이식된 폐가 점진적으로 기능을 잃게 되므로 폐 이식 수혜자의 장기 관리에 있어서 주요 과제이다 (Gauthier et al., Curr . Transplant. Rep., 2016, 3(3), 185-191). CLAD는 치료에 잘 반응하지 않으므로, 이러한 병태를 예방 또는 치료할 수 있는 효과적인 화합물이 여전히 필요하다. IFNγ 및 IL-5와 같은 몇몇 JAK-의존성 사이토킨은 CLAD 및 폐 이식 거부 반응에서 상향 조절된다 (Berastegui et al, Clin . Transplant. 2017, 31, e12898). 더욱이, JAK-의존성 IFN 신호전달의 하류인 CXCL9 및 CXCL10과 같은 CXCR3 케모킨의 높은 폐 수준은 폐 이식 환자에서 더 나쁜 결과와 관련이 있다 (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). 전신 JAK 억제는 신장 이식 거부 반응에 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). 그러므로 JAK 억제제는 폐 이식 거부 반응 및 CLAD를 치료 또는 예방하는데 효과적일 가능성이 있다. 폐 이식 거부 반응의 기초로 설명된 유사한 T 세포 활성화 이벤트는 조혈 줄기세포 이식 후에 발생할 수 있는 폐 이식편대 숙주 질환 (lung graft-versus-host disease: GVHD)의 주요 동인으로 간주된다. CLAD와 유사하게, 폐 GVHD는 결과가 극도로 좋지 않은 만성 진행성 병태이며, 현재 승인된 치료법이 없다. 구제 요법 (salvage therapy)으로 전신 JAK 억제제인 룩솔리티닙 (ruxolitinib)을 투여받은 스테로이드-불응성 급성 또는 만성 GVHD 환자 95명을 대상으로 한 후향적 다기관 조사 연구 (retrospective, multicenter survey study)에서, 폐 GVHD 환자를 포함한 대부분의 환자에서 룩솔리티닙에 대한 완전 또는 부분 반응이 입증되었다 (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68).
전신 JAK 억제는 중증 유해 이벤트 및 작은 치료 지수와 관련이 있기 때문에, 폐 이식 거부 반응 또는 폐 GVHD를 예방 및/또는 치료하기 위해 흡입 폐-지향 비-전신 JAK 억제제에 대한 필요성이 남아 있다.
일 양상에서, 본 발명은 JAK 키나제 억제제로서 활성을 갖는 신규한 화합물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00001
상기에서:
n은 0, 1 또는 2이고;
R1은 C1-3 알킬이며;
각 R2는 독립적으로 C1-3 알킬이다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 포유동물에서 호흡기 질환, 구체적으로 천식 및 CLAD를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 양을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 의학적 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 본 발명의 화합물뿐만 아니라 포유동물에서 호흡기 질환을 치료하기 위한 제제 또는 약제의 제조에서 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 JAK 키나제 억제제로서 활성을 갖는 화합물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00002
상기에서:
n은 0, 1 또는 2이고;
R1은 C1-3 알킬이며;
각 R2는 독립적으로 C1-3 알킬이다.
일부 구체예에서, 상기 화합물은 하기 화학식 (II)를 갖는다:
Figure pct00003
.
일부 구체예에서, 상기 화합물은 하기 화학식 (III)을 갖는다:
Figure pct00004
.
일부 구체예에서, R1은 에틸, 프로필 및 이소프로필로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, n은 0이다. 일부 구체예에서, n은 1이다. 일부 구체예에서, n은 1이고, R2는 메틸이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00005
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:
Figure pct00006
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00007
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다:
Figure pct00008
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00009
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 3의 화합물을 제공한다:
Figure pct00010
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00011
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 4의 화합물을 제공한다:
Figure pct00012
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 5의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00013
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 5의 화합물을 제공한다:
Figure pct00014
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 6의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00015
.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 6의 화합물을 제공한다:
Figure pct00016
.
본원에서 화학 구조는 ChemDraw 소프트웨어 (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA)에서 구현된 바와 같이 IUPAC 규약에 따라 명명되었다. 화합물 1은 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논으로 명명된다.
또한, 본 개시내용의 화합물의 단편에 있어서 하기에 예시되는, 테트라히드로이미다조피리딘 모이어티 (moiety)의 이미다조 부분은 토토머 형태 (tautomeric forms)로 존재한다:
Figure pct00017
.
IUPAC 규약에 따르면, 이러한 표현은 이미다졸 부분의 원자의 넘버링이 상이하여 발생한다: (1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-1 H -이미다조[4,5-c]피리딘 (구조 A) 대 (1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3 H -이미다조[4,5-c]피리딘 (구조 B). 구조들이 특정 형태로 개시되거나 또는 명명되었음에도 불구하고, 본 발명은 또한 이의 토토머를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 개시내용의 화합물은 하나 이상의 키랄 중심 (chiral centers)을 함유할 수 있고, 그러므로 이러한 화합물 (및 이의 중간체)은 라세미 (racemic) 혼합물; 순수한 입체이성질체 (즉, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체); 입체이성질체-강화된 혼합물 등으로 존재할 수 있다. 키랄 중심에서 정의된 입체화학 없이 본원에 개시되거나 또는 명명된 키랄 화합물들은, 달리 지시되지 않는 한 상기 정의되지 않은 입체중심에서 임의의 또는 모든 가능한 입체이성질체 변형 (variation)을 포함하는 것으로 의도된다. 특정 입체이성질체의 묘사 (depiction) 또는 명명은 표시된 입체중심이 지정된 입체화학을 갖는 것을 의미하며, 상기 묘사되거나 또는 명명된 화합물의 유용성이 또 다른 입체이성질체의 존재에 의해 제거되지 않는 것을 전제로, 달리 명시되지 않은 한, 소량의 다른 입체이성질체가 또한 존재할 수 있는 것으로 이해된다.
본 개시내용의 화합물은 또한 여러 염기성기 (예: 아미노기)를 함유할 수 있고, 그러므로 이러한 화합물들은 유리 염기, 또는 다양한 염의 형태 예컨대 일-양성자화 (mono-protonated) 염 형태, 이-양성자화 (di-protonated) 염 형태, 삼-양성자화 (tri-protonated) 염 형태 또는 이들의 혼합물로 존재할 수 있다. 이러한 모든 형태들은 달리 명시되지 않는 한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 또한, 화학식 (I), (II) 및 (III)의 동위원소-표지된 (isotopically-labeled) 화합물, 즉, 하나 이상의 원자가 동일한 원자번호를 갖지만 자연 상태에서 우세하게 존재하는 원자량과는 다른 원자량을 갖는 원자로 대체되거나 또는 강화된 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물을 포함한다. 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물 내에 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O 및 18O를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히 관심이 있는 것은 삼중수소 (tritium) 또는 탄소-14가 강화된 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물이며, 이들 화합물은 예를 들면 조직 분포 연구에 사용될 수 있다. 또한, 특히 관심이 있는 것은 특히 대사작용 부위에서 이중수소 (deuterium)가 강화된 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물이며, 이들 화합물은 더 큰 대사 안정성 (metabolic stability)을 가질 것으로 기대된다. 또한, 특히 관심이 있는 것은 11C, 15O 및 13N과 같은 양전자 방출 동위원소 (positron emitting isotope)가 강화된 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물이며, 이들 화합물은 예를 들면 양전자 방출 단층촬영 (Positron Emission Tomography, PET) 연구에 사용될 수 있다.
정의
본 발명의 다양한 양상 및 구체예를 포함하는 본 발명을 기재할 때, 하기 용어는 달리 지시하지 않는 한 하기의 의미를 갖는다.
용어 "알킬 (alkyl)"은 직쇄 또는 분지쇄 또는 이들의 조합일 수 있는 1가 포화된 탄화수소기를 의미한다. 달리 정의하지 않는 한, 이러한 알킬기는 전형적으로 1개 내지 10개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 알킬기는 예로서 메틸 (Me), 에틸 (Et), n-프로필 (n-Pr) 또는 (nPr), 이소프로필 (i-Pr) 또는 (iPr), n-부틸 (n-Bu) 또는 (nBu), sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸 (t-Bu) 또는 (tBu), n-펜틸, n-헥실, 2,2-디메틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 2-에틸부틸, 2,2-디메틸펜틸, 2-프로필펜틸 등을 포함한다.
탄소 원자의 특정 수가 특정 용어에 대해 의도되는 경우, 탄소 원자의 수는 상기 용어 앞에 개시된다. 예를 들면, 용어 "C1-3 알킬"은 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 의미하고, 상기에서 탄소 원자는 직쇄 또는 분지쇄 배열을 포함하는 임의의 화학적으로-허용 가능한 배열이다.
용어 "시클로알킬 (cycloalkyl)"은 모노사이클릭 (monocyclic) 또는 멀티사이클릭 (multicyclic)일 수 있는 1가 포화된 카보사이클릭기를 의미한다. 달리 정의되지 않는 한, 이러한 시클로알킬기는 전형적으로 3개 내지 10개의 탄소 원자를 함유한다. 대표적인 시클로알킬기는 예로서 시클로프로필 (cPr), 시클로부틸 (cBu), 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 아다만틸 등을 포함한다.
용어 "헤테로사이클릴 (heterocyclyl)", "헤테로사이클 (heterocycle)", "헤테로사이클릭 (heterocyclic)" 또는 "헤테로사이클릭 고리 (heterocyclic ring)"는 3개 내지 10개의 총 고리 원자를 갖는 1가 포화된 또는 부분 불포화된 사이클릭 비-방향족기를 의미하고, 상기 고리는 2개 내지 9개의 탄소 고리 원자 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 1개 내지 4개의 고리 헤테로원자 (heteroatoms)를 함유한다. 헤테로사이클릭기는 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 (즉, 융합된 (fused) 또는 브리지된 (bridged))일 수 있다. 대표적인 헤테로사이클릴기는 예로서 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 이미다졸리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴릴, 인돌린-3-일, 2-이미다졸리닐, 테트라히드로피라닐, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-2-일, 퀴뉴클리디닐 (quinuclidinyl), 7-아자노르보르나닐, 노르트로파닐 등을 포함하고, 여기서 부착점은 임의의 이용 가능한 탄소 또는 질소 고리 원자에 있다. 본원에서 헤테로사이클릭기의 부착점을 명백하게 하는 경우, 이러한 기들은 대안으로 비-원자가 (non-valent) 종, 즉 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 이미다졸, 테트라히드로피란 등으로 지칭될 수 있다.
용어 "할로 (halo)"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다.
용어 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 치료 효과를 달성하는데 충분한 양을 의미한다.
용어 "치료하는 (treating)" 또는 "치료 (treatment)"는 환자 (특히, 인간)에서 치료될 의학적 병태, 질환 또는 장애 (예: 호흡기 질환)를 예방, 개선 또는 억제하거나; 또는 의학적 병태, 질환 또는 장애의 증상을 완화시키는 것을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염 (pharmaceutically acceptable salt)"은 환자 또는 포유동물 예컨대 인간에게의 투여가 허용 가능한 염 (예: 해당 용량 용법 (dosage regime)에 대해 허용 가능한 포유동물 안전성을 갖는 염)을 의미한다. 대표적인 약학적으로 허용 가능한 염은 아세트산, 아스코르브산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캄포설폰산, 시트르산, 에탄설폰산, 에디실산 (edisylic acid), 푸마르산, 겐티스산 (gentisic acid), 글루콘산, 글루코론산, 글루탐산, 힙푸르산 (hippuric acid), 히드로브롬산, 염산, 이세티온산 (isethionic acid), 락트산, 락토비온산 (lactobionic acid), 말레산, 말산, 만델산, 메탄설폰산, 무신산 (mucic acid), 나프탈렌설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 나프탈렌-2,6-디설폰산, 니코틴산, 질산, 오로트산 (orotic acid), 파모산 (pamoic acid), 판토텐산, 인산, 숙신산, 황산, 타르타르산, p-톨루엔설폰산 및 자이나포산 (xinafoic acid) 등의 염을 포함한다.
용어 "이의 염 (salt thereof)"은 산의 수소가 양이온 예컨대 금속 양이온 또는 유기 양이온 등으로 대체되는 경우 형성된 화합물을 의미한다. 예를 들면, 상기 양이온은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물의 양성자화된 형태, 즉 하나 이상의 아미노기가 산에 의해 양성자화된 형태일 수 있다. 전형적으로, 상기 염은 약학적으로 허용 가능한 염이고, 환자에게 투여하기 위한 것이 아닌 중간체 화합물의 염은 요구되지 않는다.
일반 합성 절차
본 발명의 화합물 및 이의 중간체는 상업적으로-입수 가능하거나 또는 통상적으로-제조된 개시 물질 및 시약을 사용하여 하기 일반적 방법 및 절차에 따라 제조될 수 있다. 하기 반응식에서 사용된 치환기 및 변수 (예: R1, R2, n 등)는 달리 지시하지 않는 한 본원에 정의된 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 산성 또는 염기성 원자 또는 관능기를 갖는 화합물이 사용될 수 있거나 또는 달리 지시하지 않는 한 염으로 제조될 수 있다 (일부 경우에, 특정 반응에서 염의 사용은 상기 반응을 수행하기 전에 통상적인 절차를 사용하여, 상기 염을 비-염 (non-salt)의 형태 예컨대 유리 염기로의 전환을 필요로 할 것이다).
본 발명의 특정 구체예는 하기 절차에 개시 또는 서술될 수 있지만, 당 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 다른 구체예 또는 양상이 또한 이러한 절차를 사용하거나 또는 당업자에게 알려져 있는 다른 방법, 시약 및 개시 물질을 사용하여 제조될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 구체적으로, 본 발명의 화합물은 다양한 공정 경로에 의해 제조될 수 있고, 여기서 반응물들이 상이한 순서로 조합되어, 최종 생성물을 생성하는 도중에 상이한 중간체를 제공할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 최종 화합물을 제조하는 일반적인 방법은 하기 반응식에 예시되어 있다.
Figure pct00018
화합물 K-18은 환원제의 존재하에 케톤 또는 알데히드와 반응하여 화학식 K-19의 화합물을 제공한다. 그 다음에 화합물 K-19를 치환된 아제티딘과 전형적인 아마이드 결합 형성 조건하에 반응시켜서 화합물 (I)을 제공한다. 전형적으로, 카복실산은 약 1 내지 약 4 당량의 상기 치환된 아제티딘과 과량의 염기의 존재하에 접촉한다. 상기 아마이드 결합 형성 반응은 커플링제 예컨대 N,N,N ',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU) 또는 당분야에 알려진 다른 아마이드 커플링제를 사용할 수 있다. 히드라진을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단할 수 있다. 상기 반응은 전형적으로 실온에서 약 5분 내지 약 24시간 동안 또는 상기 반응이 실질적으로 완료될 때까지 수행된다.
약학적 조성물
본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로-허용 가능한 염은 전형적으로 약학적 조성물 또는 제제 (formulation)의 형태로 사용된다. 이러한 약학적 조성물은 환자에게 흡입에 의해 투여하는데 유익할 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 이에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 직장, 비강, 국소 (경피 포함) 및 비경구 투여 방식을 포함하는 임의의 허용 가능한 투여 경로로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물 양상들 중 하나에서, 본 발명은 약학적으로-허용 가능한 담체 또는 부형제 및 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기에 정의된 바와 같이, "화학식 (I), (II) 또는 (III)의 화합물"은 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 의미한다. 선택적으로, 이러한 약학적 조성물은 원한다면 다른 치료제 및/또는 제제화제 (formulating agents)를 함유할 수 있다. 조성물 및 이의 용도를 논의하는 경우, "본 발명의 화합물"은 본원에서 "활성제 (active agent)"로도 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "본 발명의 화합물"은 화학식 (I)에 포함되는 모든 화합물뿐만 아니라 화학식 (I)에서 구체화된 종들 및 이의 약학적으로-허용 가능한 염을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 본 발명의 화합물의 치료적으로 유효한 양을 함유한다. 그러나 당업자는 약학적 조성물이 벌크 (bulk) 조성물과 같이 치료적으로 유효한 양을 초과하여 함유하거나, 또는 치료적으로 유효한 양보다 적게, 즉 치료적으로 유효한 양을 달성하기 위해 다회 투여 목적으로 디자인된 개별 단위 용량 (individual unit dose)을 함유할 수 있다는 것을 알 것이다.
전형적으로, 이러한 약학적 조성물은 약 0.01 내지 약 95 중량% (% by weight)의 활성제; 예를 들어 약 0.05 내지 약 30 중량%; 및 약 0.1 내지 약 10 중량%의 활성제를 함유할 것이다.
임의의 기존의 담체 또는 부형제가 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 특정 담체 또는 부형제, 또는 담체들 또는 부형제들의 조합의 선택은 특정 환자 또는 의학적 병태 또는 질환 상태의 유형을 치료하기 위해 사용되는 투여 방식에 좌우될 것이다. 이와 관련하여, 특정 투여 방식에 적합한 약학적 조성물의 제조는 약제학 분야에 통상의 지식을 가진 자의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물에 사용되는 담체들 또는 부형제들은 상업적으로 입수 가능하다. 추가적인 예시로서, 통상적인 제제화 기술은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); 및 H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999)에 기재되어 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체로서 제공될 수 있는 물질들의 대표적인 예는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 당 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 예컨대 미정질 셀룰로스 및 이의 유도체 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트 분말 (powdered tragacanth); 맥아 (malt); 젤라틴; 탈크; 부형제 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스 (suppository wax); 오일 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화씨유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가 (agar); 완충제 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열성물질-제거수 (pyrogen-free water); 등장성 식염수; 링거액; 에틸 알콜; 인산염 완충 용액; 및 약학적 조성물에 사용되는 무독성 적합성 물질.
약학적 조성물은 전형적으로 상기 활성제를 약학적으로-허용 가능한 담체 및 하나 이상의 선택적 성분들과 철저하게 (thoroughly) 및 친밀하게 (intimately) 혼합 (mixing) 또는 블렌딩 (blending)시켜 제조된다. 그 다음에 수득된 균일하게 블렌딩된 혼합물은 기존의 절차 및 장비를 사용하여, 정제, 캡슐, 환제 (pill) 등으로 성형 또는 로딩될 수 있다.
일 양상에서, 상기 약학적 조성물은 흡입 투여에 적합하다. 흡입 투여를 위한 약학적 조성물은 전형적으로 에어로졸 또는 분말의 형태이다. 이러한 조성물은 일반적으로 흡입 전달 장치 (inhaler delivery devices) 예컨대 건조 분말 흡입기 (dry powder inhaler: DPI), 정량식 흡입기 (metered-dose inhaler: MDI), 네뷸라이저 흡입기 (nebulizer inhaler) 또는 유사한 전달 장치를 사용하여 투여된다.
특정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 건조 분말 흡입기를 사용하여 흡입에 의해 투여된다. 이러한 건조 분말 흡입기는 전형적으로 환자가 호흡하는 동안 환자의 기류 (air-stream)에 분산되는 자유-유동 분말 (free-flowing powder)로서 상기 약학적 조성물을 투여한다. 자유-유동 분말 조성물을 수득하기 위해서, 치료제는 전형적으로 적합한 부형제 예컨대 락토스, 전분, 만니톨, 덱스트로스, 폴리락트산 (polylactic acid: PLA), 폴리락티드-코-글리콜리드 (polylactide-co-glycolide: PLGA) 또는 이들의 조합과 제제화된다. 전형적으로, 상기 치료제는 미분화되고 (micronized), 적합한 담체와 조합되어 흡입에 적합한 조성물을 형성한다.
건조 분말 흡입기에 사용하기 위한 대표적인 약학적 조성물은 락토스 및 본 발명의 화합물을 미분화된 형태 (micronized form)로 포함한다. 이러한 건조 분말 조성물은 예를 들어 건조 분쇄된 (dry milled) 락토스를 치료제와 조합한 다음에 상기 성분들을 건조 블렌딩 (dry blending)하여 제조할 수 있다. 그 다음에 상기 조성물은 전형적으로 건조 분말 전달 장치에서 사용하기 위해 건조 분말 디스펜서 (dry powder dispenser) 또는 흡입 카트리지 (inhalation cartridges) 또는 캡슐 (capsules)로 로딩된다.
치료제를 흡입에 의해 투여하는데 적합한 건조 분말 흡입기 전달 장치는 당분야에 개시되어 있고, 이러한 장치의 예는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 대표적인 건조 분말 흡입기 전달 장치 또는 제품은 Aeolizer (Novartis); Airmax (IVAX); ClickHaler (Innovata Biomed); Diskhaler (GlaxoSmithKline); Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline); Ellipta (GlaxoSmithKline); Easyhaler (Orion Pharma); Eclipse (Aventis); FlowCaps (Hovione); Handihaler (Boehringer Ingelheim); Pulvinal (Chiesi); Rotahaler (GlaxoSmithKline); SkyeHaler/Certihaler (SkyePharma); Twisthaler (Schering-Plough); Turbuhaler (AstraZeneca); Ultrahaler (Aventis); 및 유사물을 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 정량식 흡입기를 사용하여 흡입에 의해 투여된다. 이러한 정량식 흡입기는 전형적으로 압축된 분사제 가스 (propellant gas)를 사용하여 치료제의 측정된 양을 배출한다. 따라서, 정량식 흡입기를 사용하여 투여된 약학적 조성물은 전형적으로 액화된 분사제 중에 치료제의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 히드로플루오로알칸 (hydrofluoroalkanes: HFAs) 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 (HFA 134a) 및 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로-n-프로판, (HFA 227); 및 클로로플루오로카본 예컨대 CCl3F를 포함하는 임의의 적절한 액화된 분사제가 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 분사제는 히드로플루오로알칸이다. 일부 구체예에서, 상기 히드로플루오로알칸 제제는 보조-용매 (co-solvent) 예컨대 에탄올 또는 펜탄, 및/또는 계면활성제 예컨대 소르비탄 트리올레에이트, 올레산, 레시틴 및 글리세린을 함유한다.
정량식 흡입기에 사용하기 위한 대표적인 약학적 조성물은 약 0.01% 내지 약 5 중량%의 본 발명의 화합물; 약 0% 내지 약 20 중량%의 에탄올; 및 약 0% 내지 약 5 중량%의 계면활성제; 나머지는 HFA 분사제를 포함한다. 이러한 조성물은 전형적으로 차가운 (chilled) 또는 가압된 (pressurized) 히드로플루오로알칸을 치료제, 에탄올 (존재하는 경우) 및 계면활성제 (존재하는 경우)를 함유하는 적절한 용기에 부가하여 제조된다. 현탁액을 제조하기 위해서, 치료제는 미분화된 다음에, 분사제와 조합된다. 그 다음에 상기 조성물을 에어로졸 캐니스터 (canister)에 로딩하고, 이는 전형적으로 정량식 흡입기 장치의 일부를 형성한다.
치료제를 흡입에 의해 투여하기에 적합한 정량식 흡입기 장치는 당분야에 개시되어 있고, 이러한 장치의 예는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 대표적인 정량식 흡입기 장치 또는 제품은 AeroBid Inhaler System (Forest Pharmaceuticals); Atrovent Inhalation Aerosol (Boehringer Ingelheim); Flovent (GlaxoSmithKline); Maxair Inhaler (3M); Proventil Inhaler (Schering); Serevent Inhalation Aerosol (GlaxoSmithKline); 및 유사물을 포함한다.
다른 특정 양상에서, 상기 약학적 조성물은 네뷸라이저 흡입기를 사용하여 흡입에 의해 투여된다. 이러한 네뷸라이저 장치는 전형적으로 상기 약학적 조성물을 미스트 (mist)로 분무하여 환자의 기도로 전달하는 고속의 (high velocity) 기류를 생성한다. 따라서, 네뷸라이저 흡입기에서 사용하기 위해 제제화되는 경우, 치료제는 적절한 담체에 용해되어 용액을 형성할 수 있다. 대안으로서, 치료제는 미분화되거나 또는 나노분쇄되고 (nanomilled), 적절한 담체와 조합되어 현탁액을 형성할 수 있다.
네뷸라이저 흡입기에 사용하기 위한 대표적인 약학적 조성물은 약 0.05 μg/mL 내지 약 20　mg/mL의 본 발명의 화합물 및 네뷸라이즈된 제제에 적합한 부형제를 포함하는 용액 또는 현탁액을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 용액은 약 3 내지 약 8의 pH를 갖는다.
치료제를 흡입에 의해 투여하기에 적합한 네뷸라이저 장치는 당분야에 개시되어 있고, 이러한 장치의 예는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 대표적인 네뷸라이저 장치 또는 제품은 Respimat Softmist Inhalaler (Boehringer Ingelheim); the AERx Pulmonary Delivery System (Aradigm Corp.); the PARI LC Plus Reusable Nebulizer (Pari GmbH); 및 유사물을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 약학적 조성물은 대안으로서 경구 투여를 위한 투여 형태 (dosage form)로 제조될 수 있다. 경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 환제, 로젠지 (lozenges), 카쉐 (cachets), 드라제 (dragees), 산제 (powders), 과립제 (granules); 또는 수성 또는 비-수성 액체 중 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 (oil-in-water) 또는 유중수 (water-in-oil) 액체 에멀젼; 또는 엘릭서제 (elixir) 또는 시럽제 등의 형태일 수 있고; 각각은 활성 성분으로서 본 발명의 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다.
고체 투여 형태로 경구 투여를 의도하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 활성제 및 하나 이상의 약학적으로-허용 가능한 담체 예컨대 나트륨 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트를 포함할 것이다. 선택적으로 또는 대안으로서, 이러한 고체 투여 형태는 또한 하기를 포함할 수 있다: 충전제 (filler) 또는 증량제 (extenders), 결합제, 보습제 (humectants), 용액 지연제, 흡수 촉진제, 습윤제, 흡착제, 윤활제, 착색제 및 완충제. 이형제, 습윤제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 산화방지제가 또한 본 발명의 약학적 조성물 중에 존재할 수 있다.
대체 제제로는 또한 제어 방출 제제, 경구 투여를 위한 액체 투여 형태, 경피 패치 및 비경구 제제를 포함할 수 있다. 이러한 대체 제제의 기존의 부형제 및 제조 방법은 예를 들어, 상기 Remington의 참고문헌에 개시되어 있다.
하기의 비-제한적인 예는 본 발명의 대표적인 약학적 조성물을 예시한다.
건조 분말 조성물
미분화된 화학식 (I)의 화합물 (1 g)을 분쇄된 락토스 (25 g)와 블렌딩한다. 그 다음에 상기 블렌딩된 혼합물은 도스 (dose) 당 약 0.1 mg 내지 약 4 mg의 화학식 (I)의 화합물을 제공하기에 충분한 양의 박리가능한 블리스터 팩 (peelable blister pack)의 개별 블리스터 (blisters)에 로딩한다. 상기 블리스터의 내용물을 건조 분말 흡입기를 사용하여 투여한다.
건조 분말 조성물
미분화된 화학식 (I)의 화합물 (1 g)을 분쇄된 락토스 (20　g)와 블렌딩하여 화합물 대 분쇄된 락토스의 중량비가 1:20인 벌크 조성물을 형성한다. 상기 블렌딩된 조성물을 도스 당 약 0.1 mg 내지 약 4 mg의 화학식 (I)의 화합물을 전달할 수 있는 건조 분말 흡입 장치에 패킹한다.
정량식 흡입기 조성물
미분화된 화학식 (I)의 화합물 (10 g)을 탈염수 (demineralized water) (200 mL) 중에 레시틴 (0.2 g)을 용해시켜서 제조된 용액 중에 분산시킨다. 수득된 현탁액을 분무 건조하고, 그 다음에 미분화하여 평균 직경이 약 1.5 μm 미만인 입자를 포함하는 미분화된 조성물을 형성한다. 그 다음에 상기 미분화된 조성물을 정량식 흡입기로 투여하는 경우 도스 당 약 0.1 mg 내지 약 4 mg의 화학식 (I)의 화합물을 제공하기에 충분한 양으로 가압된 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 함유하는 정량식 흡입기 카트리지에 로딩한다.
네뷸라이저 조성물
화학식 (I)의 화합물 (25 mg)을 1.5-2.5 당량의 염산을 함유하는 용액에 용해시키고, 그 다음에 pH를 3.5 내지 5.5로 조정하기 위한 수산화나트륨 및 3 중량%의 글리세롤을 부가한다. 상기 용액을 모든 성분들이 용해될 때까지 잘 교반한다. 상기 용액은 도스 당 약　 0.1 mg 내지 약 4 mg의 화학식 (I)의 화합물을 제공하는 네뷸라이저 장치를 사용하여 투여된다.
유용성
본 발명의 JAK 억제제는 기도의 염증 및 섬유증 질환 치료를 위해 디자인되었다. 구체적으로, 상기 화합물은 전신 노출을 제한하면서, 폐에서 호흡기 질환의 작용 부위에 효능이 있는 항-사이토킨 제제를 직접 전달할 수 있도록 디자인되었다.
본 발명의 화합물은 JAK 패밀리 효소인 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2의 효능이 있는 억제제인 것으로 나타났다. 또한, 상기 화합물 1-6은 염증유발 (pro-inflammatory) 및 섬유화유발 (pro-fibrotic) 사이토킨의 강력한 억제를 나타내었다. JAK 억제제의 광범위한 항-염증 효과는 정상적인 면역 세포 기능을 억제하여 잠재적으로 감염 위험을 증가시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로 본 발명의 화합물은 폐에서 혈장으로의 흡수를 제한하여 면역억제 위험을 최소화하는데 최적화되었다.
하기 실험 섹션에 기재된 바와 같이, 화합물 1-6의 흡수 및 분포는 전임상 분석에서 프로파일링되었다. 화합물 1-6을 마우스 (mice)에서 시험하였고, 투여 후 5시간에서 폐 조직에서 최대 농도 및 혈장으로의 낮은 흡수를 나타내었다. 화합물 1-6은 마우스의 폐 조직에서 염증유발 사이토킨 IL-13의 효과를 억제하는 것으로 나타났다. 특히, 상기 화합물은 폐 조직에서 STAT6의 IL-13-유발 인산화의 억제를 나타내었고, 이는 인 비보에서 국소 폐 JAK 표적 결합의 증거를 제공한다. 이러한 효과는 시험 화합물을 투여하고 4시간 후에 염증유발 사이토킨 IL-13을 투여하는 경우에 관찰되었고, 이는 폐에서 유의한 체류의 추가적 증거로 제공된다.
화합물 1-6은 세포 수준에서 강력한 억제 활성 및 폐 조직에서 유의한 체류 모두를 나타내는 것으로 입증되었다. 본 발명자들에 의한 광범위한 연구로 세포 수준에서 효능이 있는 화합물 또는 폐에서 유의한 체류를 보이는 화합물을 동정할 수 있고, 원하는 특성들 모두를 동시에 나타내는 화합물을 발견하는 것은 훨씬 어렵다는 것이 판명되었다.
JAK 억제제의 항-염증 활성은 천식의 전임상 모델에서 확실하게 입증되었다 (Malaviya et al., Int . Immunopharmacol ., 2010, 10, 829,-836; Matsunaga et al., Biochem . and Biophys . Res. Commun ., 2011, 404, 261-267; Kudlacz et al., Eur. J. Pharmacol, 2008, 582, 154-161). JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 천식 염증과 연관된 사이토킨에는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, 흉선 간질 림포포이에틴 (TSLP), 인터페론-γ (IFNγ) 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 염증성 호흡기 질환, 구체적으로 천식의 치료에 유용할 것으로 기대된다. 폐의 염증 및 섬유증은 천식 이외에, 다른 호흡기 질환 예컨대 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증 (CF), 폐렴, 간질성 폐 질환 (특발성 폐 섬유증 포함), 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄성 세기관지염 및 사르코이드증의 특징이다. 그러므로 본 발명의 화합물은 또한 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 간질성 폐 질환 (특발성 폐 섬유증 포함), 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄성 세기관지염 및 사르코이드증의 치료에 유용할 것으로 기대된다.
화합물 1-6은 이들의 상응하는 플루오로 유사체 (화합물 C-1 내지 C- 6)와 비교할 때, 유사한 JAK 활성을 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 분석 5에서 입증된 바와 같이, 상기는 황산화 대사작용 (sulfation metabolism)을 상당히 적게 발생시키는 이점이 있다. 이는 황산화 대사작용이 폐에서 발생하면 활성 모체 화합물의 노출을 급격히 감소시킬 수 있기 때문에 중요하다.
본 개시내용의 화합물 1-6은 염증과 관련된 사이토킨의 억제를 나타내었다. 그러므로 본 개시내용의 화합물은 하기에 상세히 기재되는 바와 같이, 소정의 특정 호흡기 질환 치료에 유용할 가능성이 있다.
호산구성 기도 염증 (Eosinophilic airway inflammation)은 호산구성 폐 질환으로 통칭되는 질병의 특징적인 특성이다 (Cottin et al., Clin . Chest. Med ., 2016, 37(3), 535-56). 호산구성 질환 (eosinophilic disease)은 IL-4, IL-13 및 IL-5 신호전달과 관련이 있다. 호산구성 폐 질환에는 감염 (특히 기생충 감염), 약물-유발 폐렴 (예: 항생제, 페니토인 또는 l-트립토판과 같은 치료 약물에 의해 유발됨), 진균-유발 폐렴 (예: 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증), 과민성 폐렴 및 다발 혈관염 동반 호산구성 육아종증 (이전에는 Churg-Strauss 증후군으로 알려짐)을 포함한다. 원인 미상의 호산구성 폐 질환에는 특발성 급성 호산구성 폐렴, 특발성 만성 호산구성 폐렴, 과호산구증가 증후군 (hypereosinophilic　syndrome) 및 뢰플러 증후군 (Loeffler syndrome)을 포함한다.
IL-6 유전자의 다형성 (polymorphism)은 IL-6 수준 상승 및 폐동맥 고혈압 (PAH) 발병 위험 증가와 관련이 있다 (Fang et al., J. Am. Soc . Hypertens ., 2017, 11(3), 171-177). PAH에서 IL-6의 역할을 확증하여, IL-6 수용체 사슬 gp130의 억제는 PAH의 래트 (rat) 모델에서 질병을 완화시켰다 (Huang et al., Can. J. Cardiol., 2016, 32(11), 1356.e1-1356.e10).
사이토킨 예컨대 IFNγ, IL-12 및 IL-6은 사르코이드증 및 림프관평활근종증 (lymphangioleiomyomatosis)과 같은 다양한 비-알레르기성 폐 질환과 관련되어 있다 (El-Hashemite et al., Am. J. Respir . Cell. Mol . Biol ., 2005, 33, 227-230, and El-Hashemite et al., Cancer Res., 2004, 64, 3436-3443). 본 발명의 화합물은 또한 IL-6 및 IFNγ 신호전달을 억제하는 것으로 나타났다.
기관지 확장증 및 침윤성 폐 질환은 만성 호중구성 염증과 관련된 질병이다.
병리학적 T 세포 활성화는 다수의 호흡기 질환의 병인에 있어서 중요하다. 자가반응 T 세포는 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴 (COS라고도 함)에서 역할을 한다. COS와 유사하게, 폐 이식 거부 반응의 병인은 이식된 공여자 폐에 의한 수혜자 T 세포의 비정상적인 T 세포 활성화와 관련이 있다. 폐 이식 거부 반응은 초기에 원발성 이식 기능장애 (PGD), 기질화 폐렴 (OP), 급성 거부 반응 (AR) 또는 림프구성 세기관지염 (LB)으로 발생할 수 있거나, 또는 폐 이식 후 수년 후에 만성 폐 동종이식 기능장애 (CLAD)로 발생할 수 있다. CLAD는 이전에 폐쇄성 세기관지염 (BO)으로 알려졌지만, 현재는 BO, 제한성 CLAD (rCLAD 또는 RAS) 및 호중구성 동종이식 기능장애를 포함한 다양한 병리학적 증상을 가질 수 있는 증후군으로 간주된다. 만성 폐 동종이식 기능장애 (CLAD)는 이식된 폐가 점진적으로 기능을 잃게 되므로 폐 이식 수혜자의 장기 관리에 있어서 주요 과제이다 (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185-191). CLAD는 치료에 잘 반응하지 않으므로, 이러한 병태를 예방 또는 치료할 수 있는 효과적인 화합물이 여전히 필요하다. IFNγ 및 IL-5와 같은 몇몇 JAK-의존성 사이토킨은 CLAD 및 폐 이식 거부 반응에서 상향 조절된다 (Berastegui et al, Clin . Transplant. 2017, 31, e12898). 더욱이, JAK-의존성 IFN 신호전달의 하류인 CXCL9 및 CXCL10과 같은 CXCR3 케모킨의 높은 폐 수준은 폐 이식 환자에서 더 나쁜 결과와 관련이 있다 (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). 전신 JAK 억제는 신장 이식 거부 반응에 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). 그러므로 JAK 억제제는 폐 이식 거부 반응 및 CLAD를 치료 또는 예방하는데 효과적일 가능성이 있다. 폐 이식 거부 반응의 기초로 설명된 유사한 T 세포 활성화 이벤트는 조혈 줄기세포 이식 후에 발생할 수 있는 폐 이식편대 숙주 질환 (GVHD)의 주요 동인으로 간주된다. CLAD와 유사하게, 폐 GVHD는 결과가 극도로 좋지 않은 만성 진행성 병태이며, 현재 승인된 치료법이 없다. 구제 요법으로 전신 JAK 억제제인 룩솔리티닙을 투여받은 스테로이드-불응성 급성 또는 만성 GVHD 환자 95명을 대상으로 한 후향적 다기관 조사 연구에서, 폐 GVHD 환자를 포함한 대부분의 환자에서 룩솔리티닙에 대한 완전 또는 부분 반응이 입증되었다 (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). 전신 JAK 억제는 중증 유해 이벤트 및 작은 치료 지수와 관련이 있기 때문에, 폐 이식 거부 반응 또는 폐 GVHD를 예방 및/또는 치료하기 위해 흡입 폐-지향 비-전신 JAK 억제제에 대한 필요성이 남아 있다. 본 발명의 화합물은 이러한 요구를 충족시키는데 필요한 특성을 갖는다. 최근에는 면역-체크포인트 억제제 사용이 증가하면서 또 다른 T 세포 매개 폐 질환인, 면역-체크포인트 억제제 유발 폐렴이 나타났다. 이러한 T 세포 자극제로 치료를 받는 암 환자에서, 치명적인 폐렴이 발생할 수 있다.
혼합 림프구 반응 분석 (mixed lymphocyte reaction assay)은 이식 거부 반응을 모방하는 인 비트로 분석이다. 화합물 1은 IFNγ 분비를 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
그러므로 일 양상에서, 본 발명은 포유동물 (예: 인간)에서 호흡기 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 약학적으로-허용 가능한 담체 및 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로-유효한 양을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증 (CF), 폐렴, 간질성 폐 질환 (특발성 폐 섬유증 포함), 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄성 세기관지염 또는 사르코이드증이다. 다른 양상에서, 상기 호흡기 질환은 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환이다.
일 양상에서, 상기 호흡기 질환은 폐 감염, 호산구성 질환, 기생충 감염, 폐동맥 고혈압, 사르코이드증, 림프관평활근종증, 기관지확장증, 침윤성 폐 질환, 약물-유발 폐렴, 진균-유발 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 과민성 폐렴, 다발 혈관염 동반 호산구성 육아종증, 특발성 급성 호산구성 폐렴, 특발성 만성 호산구성 폐렴, 과호산구증가 증후군, 뢰플러 증후군, 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴, 급성 및 만성 폐 이식 거부 반응 (PGD, OP, LB, AR 및 CLAD, BO, 제한적 CLAD 및 호중구성 동종이식 기능장애 포함), 폐 이식편대 숙주 질환, 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴, 폐동맥 고혈압, 기관지 확장증 또는 면역-체크포인트-억제제 유발 폐렴이 있다.
본 발명은 또한 포유동물에서 천식을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 약학적으로-허용 가능한 담체 및 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로-유효한 양을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
천식 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 화합물은 전형적으로 1일 1회, 또는 1일 수회 투여량으로 투여될 것이고, 다른 투여 형태도 사용될 수 있다. 도스 당 투여되는 활성제의 양 또는 1일 당 투여되는 전체 양은 전형적으로, 치료될 병태, 선택된 투여 경로, 투여된 실제 화합물 및 이의 관련 활성, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자 증상의 중증도 등을 포함하는 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이다.
본 개시내용은 또한 포유동물에서 호흡기 질환 (이에 한정되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 질환을 포함함)을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 약학적으로-허용 가능한 담체 및 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로-유효한 양을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
호흡기 질환 (이에 한정되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 질환을 포함함) 치료에 사용되는 경우, 본 개시내용의 화합물은 전형적으로 1일 1회, 또는 1일 수회 투여량으로 투여될 것이고, 다른 투여 형태도 사용될 수 있다. 도스 당 투여되는 활성제의 양 또는 1일 당 투여되는 전체 양은 전형적으로, 치료될 병태, 선택된 투여 경로, 투여된 실제 화합물 및 이의 관련 활성, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자 증상의 중증도 등을 포함하는 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이다.
JAK 억제제로서, 본 개시내용의 화합물은 또한 다양한 다른 질병에 유용할 수 있다. 본 개시내용의 화합물은 염증성 장 질환, 궤양성 대장염 (직장구불창자염 (proctosigmoiditis), 전대장염 (pancolitis), 궤양성 직장염 (ulcerative proctitis) 및 좌측 대장염 (left-sided colitis)), 크론병, 콜라겐성 대장염, 림프구성 대장염, 베체트병 (Behcet's disease), 복강병 (celiac disease), 면역 체크포인트 억제제 유발 대장염, 돌창자염 (ileitis), 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis), 이식편대 숙주 질환-관련 대장염 및 감염성 대장염을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아닌 다양한 위장관 염증 적응증에 유용할 수 있다. 궤양성 대장염 (Reimund et al., J. Clin . Immunology, 1996, 16, 144-150), 크론병 (Woywodt et al., Eur . J. Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), 콜라겐성 대장염 (Kumawat et al., Mol . Immunology, 2013, 55, 355-364), 림프구성 대장염 (Kumawat et al., 2013), 호산구성 식도염 (Weinbrand-Goichberg et al., Immunol . Res., 2013, 56, 249-260), 이식편대 숙주 질환-관련 대장염 (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 3268-3276), 감염성 대장염 (Stallmach et al., Int . J. Colorectal Dis ., 2004, 19, 308-315), 베체트병 (Zhou et al., Autoimmun. Rev., 2012, 11, 699-704), 복강병 (de Nitto et al., World J. Gastroenterol., 2009, 15, 4609-4614), 면역 체크포인트 억제제 유발 대장염 (예: CTLA-4 억제제-유발 대장염; (Yano et al., J. Translation. Med ., 2014, 12, 191), PD-1- 또는 PD-L1-억제제-유발 대장염), 및 돌창자염 (Yamamoto et al., Dig. Liver Dis ., 2008, 40, 253-259)은 소정의 염증유발 사이토킨 수준의 증가를 특징으로 한다. 다수의 염증유발 사이토킨이 JAK 활성화를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 출원에 기재된 화합물은 염증을 완화시키고, 증상 완화를 제공할 수 있다. 구체적으로, 본 개시내용의 화합물은 궤양성 대장염의 완화를 유도 및 유지, 및 크론병, 면역 체크포인트 억제제 유발 대장염 및 이식편대 숙주 질환에서 위장관 유해 효과의 치료에 유용할 수 있다. 그러므로 일 양상에서, 본 개시내용은 포유동물 (예: 인간)에서 위장관 염증 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 약학적으로-허용 가능한 담체 및 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
아토피성 피부염 및 다른 염증성 피부 질환은 JAK-STAT 경로에 의존하는 염증유발 사이토킨 증가와 관련이 있다. 그러므로, 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 아토피성 피부염, 원형 탈모증, 백반증, 건선, 피부 근육염, 피부 T 세포 림프종 (Netchiporouk et al., Cell Cycle 2014; 13, 3331-3335) 및 서브타입 (세자리 증후군 (Sezary syndrome), 균상식육종, 파제드병모양그물증, 육아종 이완 피부, 림프종모양구진증, 만성 태선양 비강진, 급성 두창상 태선양 비강진, CD30+ 피부 T-세포 림프종, 속발성 피부 CD30+ 대세포 림프종, 비-균상식육종 CD30- 피부 큰 T-세포 림프종, 다형성 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 피하 T-세포 림프종, 혈관중심 림프종, 아구성 NK-세포 림프종), 결절성 양진, 편평태선, 원발성 국소 피부 아밀로이드증, 수포성 유사천포창, 이식편대 숙주 질환의 피부 징후, 유사천포창, 원판상 루푸스, 고리육아종, 만성단순태선, 외음부/음낭/항문 주위 소양증, 경화태선, 대상포진 후 신경통 가려움증, 모낭성 편평태선 및 독발성 모낭염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 피부 염증성 또는 소양성 병태에 유익할 수 있다. 특히, 아토피성 피부염 (Bao et al., JAK -STAT, 2013, 2, e24137), 원형 탈모증 (Xing et al., Nat. Med. 2014, 20, 1043-1049), 백반증 (Craiglow et al, JAMA Dermatol. 2015, 151, 1110-1112), 결절성 양진 (Sonkoly et al., J. Allergy Clin . Immunol . 2006, 117, 411-417), 편평태선 (Welz-Kubiak et al., J. Immunol . Res. 2015, ID:854747), 원발성 국소 피부 아밀로이드증 (Tanaka et al., Br. J. Dermatol. 2009, 161, 1217-1224), 수포성 유사천포창 (Feliciani et al., Int . J. Immunopathol . Pharmacol. 1999, 12, 55-61) 및 이식편대 숙주 질환의 피부 징후 (Okiyama et al., J. Invest. Dermatol . 2014, 134, 992-1000)는 JAK 활성화를 통해 신호를 전달하는 소정의 사이토킨의 상승을 특징으로 한다. 따라서, 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 이러한 사이토킨에 의해 유발된 관련된 피부 염증 또는 소양증을 완화시킬 수 있다. 특히, 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 아토피성 피부염 및 다른 염증성 피부 질환 치료에 유용할 것으로 기대될 수 있다. 그러므로 일 양상에서, 본 개시내용은 포유동물 (예: 인간)에서 염증성 피부 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 상기 포유동물의 피부에 적용하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 상기 염증성 피부 질환은 아토피성 피부염이다.
많은 안질환이 JAK-STAT 경로에 의존하는 염증유발 사이토킨의 상승과 관련이 있는 것으로 나타났다. 그러므로 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 포도막염, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 안구 건조증, 노화-관련 황반 변성 및 아토피성 각결막염을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 안질환 치료에 유용할 수 있다. 특히 포도막염 (Horai and Caspi, J. Interferon Cytokine Res., 2011, 31, 733-744), 당뇨병성 망막병증 (Abcouwer, J. Clin. Cell. Immunol ., 2013, Suppl 1, 1-12), 당뇨병성 황반 부종 (Sohn et al., American Journal of Opthamology, 2011, 152, 686-694), 안구 건조증 (Stevenson et al, Arch. Ophthalmol ., 2012, 130, 90-100) 및 노화-관련 황반 변성 (Knickelbein et al, Int . Ophthalmol . Clin ., 2015, 55(3), 63-78)은 JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 소정의 염증유발 사이토킨의 상승을 특징으로 한다. 따라서, 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 관련된 안구 염증을 완화시키고, 질병 진행을 역전시키거나 또는 증상 완화를 제공할 수 있다. 그러므로 일 양상에서, 본 개시내용은 포유동물에서 안질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 상기 포유동물의 안구에 투여하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 상기 안질환은 포도막염, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 안구 건조증, 노화-관련 황반 변성 또는 아토피성 각결막염이다. 일 양상에서, 상기 방법은 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유리체내 주사에 의해 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 안질환에 유용한 하나 이상의 화합물과 조합하여 사용될 수 있다.
본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 다른 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암과 같은 다른 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 이식 거부 반응, 안구 건조증, 건선성 관절염, 당뇨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 운동 신경 질환, 골수이형성 증후군, 통증, 근육 감소증, 악액질, 패혈성 쇼크, 전신성 홍반 루푸스, 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 강직성 척추염, 골수섬유증, B-세포 림프종, 간세포 암종, 호지킨병, 유방암, 다발성 골수종, 흑색종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소 투명 세포 암종, 난소 종양, 췌장 종양, 진성 적혈구증가증, 쇼그렌 증후군, 연조직 육종, 육종, 비장 비대증, T-세포 림프종 및 지중해 빈혈증 (thalassemia major) 중 하나 이상을 치료하는데 유용할 수 있다.
병용 요법
본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 질환 치료를 위해 동일한 기전 또는 상이한 기전에 의해 작용하는 하나 이상의 약제와 조합하여 사용될 수 있다. 상이한 약제는 별도의 조성물로 또는 동일한 조성물로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 병용 요법에 유용한 약제 부류는 베타 2 아드레날린 수용체 효능제, 무스카린 수용체 길항제, 글루코코르티코이드 효능제, G-단백질 결합된 수용체-44 길항제, 류코트리엔 D4 길항제, 무스카린 M3 수용체 길항제, 히스타민 H1 수용체 길항제, 면역글로불린 E 길항제, PDE 4 억제제, IL-4 길항제, 무스카린 M1 수용체 길항제, 히스타민 수용체 길항제, IL-13 길항제, IL-5 길항제, 5-리폭시게나제 억제제, 베타 아드레날린 수용체 효능제, CCR3 케모킨 길항제, CFTR 자극제, 면역글로불린 조절제, 인터루킨 33 리간드 억제제, PDE 3 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제 델타 억제제, 트롬복산 A2 길항제, 엘라스타제 억제제, Kit 티로신 키나제 억제제, 류코트리엔 E4 길항제, 류코트리엔 길항제, PGD2 길항제, TNF 알파 리간드 억제제, TNF 결합제, 보체 캐스케이드 억제제, 에오탁신 리간드 억제제, 글루타티온 환원효소 억제제, 히스타민 H4 수용체 길항제, IL-6 길항제, IL2 유전자 자극제, 면역글로불린 감마 Fc 수용체 IIB 조절제, 인터페론 감마 리간드, 인터루킨 13 리간드 억제제, 인터루킨 17 리간드 억제제, L-셀렉틴 길항제, 백혈구 엘라스타제 억제제, 류코트리엔 C4 길항제, 류코트리엔 C4 신타제 억제제, 막 구리 아민 산화효소 억제제, 메탈로프로테아제-12 억제제, 메탈로프로테아제-9 억제제, 진드기 알레르겐 조절제, 무스카린 수용체 조절제, 니코틴 아세틸콜린 수용체 효능제, 핵 인자 카파 B 억제제, p-셀렉틴 길항제, PDE 5 억제제, PDGF 수용체 길항제, 포스포이노시티드-3 키나제 감마 억제제, TLR-7 효능제, TNF 길항제, Abl 티로신 키나제 억제제, 아세틸콜린 수용체 길항제, 산성 포유동물 키티나제 억제제, ACTH 수용체 효능제, 액틴 중합화 조절제, 아데노신 A1 수용체 길항제, 아데닐레이트 사이클라제 자극제, 아드레날린 수용체 길항제, 부신피질 영양 호르몬 리간드 (adrenocorticotrophic hormone ligand), 알코올 탈수소효소 5 억제제, 알파 1 안티트립신 자극제, 알파 1 프로테나제 억제제, 안드로겐 수용체 조절제, 안지오텐신 전환 효소 2 자극제, ANP 효능제, Bcr 단백질 억제제, 베타 1 아드레날린 수용체 길항제, 베타 2 아드레날린 수용체 길항제, 베타 2 아드레날린 수용체 조절제, 베타 아밀로이드 조절제, BMP10 유전자 억제제, BMP15 유전자 억제제, 칼슘 채널 억제제, 카텝신 G 억제제, CCL26 유전자 억제제, CCR3 케모킨 조절제, CCR4 케모킨 길항제, 세포 부착 분자 억제제, 샤페로닌 자극제 (chaperonin stimulator), 키티나제 억제제, 콜라겐 I 길항제, 보체 C3 억제제, CSF-1 길항제, CXCR2 케모킨 길항제, 사이토킨 수용체 공통 베타 사슬 조절제, 세포 독성 T-림프구 단백질-4 자극제, 데옥시리보뉴클레아제 I 자극제, 데옥시리보뉴클레아제 자극제, 디펩티딜 펩티다제 I 억제제, DNA 기라제 억제제, DP 프로스타노이드 수용체 조절제, E-셀렉틴 길항제, EGFR 패밀리 티로신 키나제 수용체 억제제, 엘라스틴 조절제, 엔도텔린 ET-A 길항제, 엔도텔린 ET-B 길항제, 에폭시드 히드롤라제 억제제, FGF3 수용체 길항제, Fyn 티로신 키나제 억제제, GATA 3 전사 인자 억제제, 글루코실세라미다제 조절제, 글루타메이트 수용체 조절제, GM-CSF 리간드 억제제, 구아닐 레이트 사이클라제 자극제, H+ K+ ATPase 억제제, 헤모글로빈 조절제, 헤파린 효능제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 히스톤 데아세틸라제-2 자극제, HMG CoA 환원 효소 억제제, I-카파 B 키나제 베타 억제제, ICAM1 유전자 억제제, IL-17 길항제, IL-17 수용체 조절제, IL-23 길항제, IL-4 수용체 조절제, 면역글로불린 G 조절제, 면역글로불린 G1 효능제, 면역글로불린 G1 조절제, 면역글로불린 엡실론 Fc 수용체 IA 길항제, 면역글로불린 감마 Fc 수용체 IIB 길항제, 면역글로불린 카파 조절제, 인슐린 증감제, 인터페론 베타 리간드, 인터루킨 1 유사 수용체 길항제, 인터루킨 18 리간드 억제제, 인터루킨 수용체 17A 길항제, 인터루킨-1 베타 리간드 억제제, 인터루킨-5 리간드 억제제, 인터루킨-6 리간드 억제제, KCNA 전압-게이트 칼륨 채널-3 억제제, Kit 리간드 억제제, 라미닌-5 효능제, 류코트리엔 CysLT1 수용체 길항제, 류코트리엔 CysLT2 수용체 길항제, LOXL2 유전자 억제제, Lyn 티로신 키나제 억제제, MARCKS 단백질 억제제, MDR 관련 단백질 4 억제제, 메탈로프로테아제-2 조절제, 메탈로프로테아제-9 조절제, 미네랄로코르티코이드 수용체 길항제, 무스카린 M2 수용체 길항제, 무스카린 M4 수용체 길항제, 무스카린 M5 수용체 길항제, 나트륨이뇨 펩티드 수용체 A 효능제, 자연 살해 세포 수용체 조절제, 니코틴 ACh 수용체 알파 7 서브유닛 자극제, NK 세포 수용체 조절제, 핵 인자 카파 B 조절제, 오피오이드 성장 인자 수용체 효능제, P-당단백질 억제제, P2X3 퓨린 수용체 길항제, p38 MAP 키나제 억제제, 펩티다제 1 조절제, 포스포리파제 A2 억제제, 포스포리파제 C 억제제, 플라스미노겐 활성인자 억제제 1 억제제, 혈소판 활성화 인자 수용체 길항제, PPAR 감마 효능제, 프로스타사이클린 효능제, 단백질 티로신 키나제 억제제, SH2 도메인 이노시톨 포스파타제 1 자극제, 신호 전달 억제제, 나트륨 채널 억제제, STAT-3 조절제, 줄기세포 항원-1 억제제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 조절제, T 세포 표면 당단백질 CD28 억제제, T-세포 표면 당단백질 CD8 억제제, TGF 베타 효능제, TGF 베타 길항제, 트롬복산 신테타제 억제제, 흉선 기질 림프 단백질 리간드 억제제, 티모신 효능제, 티모신 베타 4 리간드, TLR-8 효능제, TLR-9 효능제, TLR9 유전자 자극제, 토포이소머라제 IV 억제제, 트로포닌 I 속 골격근 자극제 (Troponin I fast skeletal muscle stimulator), 트로포닌 T 속 골격근 자극제, 타입 I IL-1 수용체 길항제, 타입 II TNF 수용체 조절제, 이온 채널 조절제, 우테로글로빈 자극제 및 VIP 효능제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 JAK 억제제 화합물과 조합하여 사용될 수 있는 특정 약제는 로십터 아세테이트, 우메클리디늄 브로마이드, 세쿠키누맙, 메텐케팔린 아세테이트, 트리데칵티드 아세테이트, 플루티카손 프로피오네이트, 알파-시클로덱스트린-안정화된 설포라판, 테제펠루맙, 모메타손 푸로에이트, BI-1467335, 두필루맙, 아클리디늄, 포르모테롤, AZD-1419, HI-1640V, 리비판셀, CMP-001, 만니톨, ANB-020, 오말리주맙, 트레갈리주맙, 미티작스, 벤랄리주맙, 골리무맙, 로플루밀라스트, 이마티닙, REGN-3500, 마시티닙, 아프레밀라스트, RPL-554, 악팀뮨, 아달리무맙, 루파타딘, 파로그렐릴, MK-1029, 베클로메타손 디프로피오네이트, 포르모테롤 푸마레이트, 모가물리주맙, 세라트로다스트, UCB-4144, 네미랄리십, CK-2127107, 페비피프란트, 다니릭신, 보센탄, 아바타셉트, EC-18, 두벨리십, 도시파르스타트, 시프로플록사신, 살부타몰 HFA, 에르도스테인, PrEP-001, 네도크로밀, CDX-0158, 살부타몰, 에노보사름, R-TPR-022, 렌질루맙, 플루티카손 푸로에이트, 빌란테롤 트리페나테이트, 플루티카손 프로피오네이트, 살메테롤, PT-007, PRS-060, 레메스템셀-L, 시트룰린, RPC-4046, 산화질소, DS-102, 게릴림주맙, 악타이르, 플루티카손 푸로에이트, 우메클리디늄, 빌란테롤, AG-NPP709, 가무넥스, 인플릭시맙, 암피온, 아큐마피모드, 카나키누맙, INS-1007, CYP-001, 시루쿠맙, 플루티카손 프로피오네이트, 메폴리주맙, 피타바스타틴, 솔리트로마이신, 에타네르셉트, 이바카프토르, 아나킨라, MPC-300-IV, 글리코피로늄 브로마이드, 아클리디늄 브로마이드, FP-025, 리산키주맙, 글리코피로늄, 포르모테롤 푸마레이트, 아디포셀, YPL-001, 티오트로피움 브로마이드, 글리코피로늄 브로마이드, 인다카테롤 말레에이트, 안데칼릭시맙, 올로다테롤, 에소메프라졸, 집먼지진드기 백신, 메쑥 꽃가루 알레르겐 백신 (mugwort pollen allergen vaccine), 바모롤론, 게파픽산트, 레베페나신, 게피티닙, 레조인 (ReJoin), 티펠루카스트, 베도라드린, SCM-CGH, SHP-652, RNS-60, 브로달루맙, BIO-11006, 우메클리디늄 브로마이드, 빌란테롤 트리페나테이트, 이프라트로피움 브로마이드, 트랄로키누맙, PUR-1800, VX-561, VX-371, 올로파타딘, 툴로부테롤, 포르모테롤 푸마레이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 레슬리주맙, 살메테롤 지나포에이트, 플루티카손 프로피오네이트, 베클로메타손 디프로피오네이트, 포르모테롤 푸마레이트, 티오트로피움 브로마이드, 리겔리주맙, RUTI, 베르틸리무맙, 오말리주맙, 글리코피로늄 브로마이드, SENS-111, 베클로메타손 디프로피오네이트, CHF-5992, LT-4001, 인다카테롤, 글리코피로늄 브로마이드, 모메타손 푸로에이트, 펙소페나딘, 글리코피로늄 브로마이드, 아지트로마이신, AZD-7594, 포르모테롤, CHF-6001, 바테펜테롤, OATD-01, 올로다테롤, CJM-112, 로시글리타존, 살메테롤, 세티피프란트, 흡입 인터페론 베타, AZD-8871, 플레카나티드, 플루티카손, 살메테롤, 에이코사펜타에노산 모노글리세라이드, 레브리키주맙, RG-6149, QBKPN, 모메타손, 인다카테롤, AZD-9898, 나트륨 피루베이트, 질루톤 (zileuton), CG-201, 이미다페나신, CNTO-6785, CLBS-03, 모메타손, RGN-137, 프로카테롤, 포르모테롤, CCI-15106, POL-6014, 인다카테롤, 베클로메타손, MV-130, GC-1112, 알레고백 데포 (Allergovac depot), MEDI-3506, QBW-251, ZPL-389, 우데나필, GSK-3772847, 레보세티리진, AXP-1275, ADC-3680, 티마피프란트, 아베디테롤, AZD-7594, 이프라트로피움 브로마이드, 살부타몰 설페이트, 타데키니그 알파, ACT-774312, 도르나제 알파 (dornase alfa), 일로프로스트, 바테펜테롤, 플루티카손 푸로에이트, 알리카포르센, 시클레소나이드, 에메라마이드, 아르포르모테롤, SB-010, 오자그렐, BTT-1023, 덱트레쿠맙, 레발부테롤, 프란루카스트, 히알루론산, GSK-2292767, 포르모테롤 (Formoterol), NOV-14, 루시낙탄트, 살부타몰, 프레드니솔론, 에바스틴, 덱사메타손 시페실레이트, GSK-2586881, BI-443651, GSK-2256294, VR-179, VR-096, hdm-ASIT+, 부데소나이드, GSK-2245035, VTX-1463, 에메다스틴, 덱스프라미펙솔, 레발부테롤, N-6022, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, PIN-201104, OPK-0018, TEV-48107, 수플라타스트, BI-1060469, 게밀루카스트, 인터페론 감마, 달라자타이드, 빌라스틴, 플루티카손 프로피오네이트, 살메테롤 지나포에이트, RP-3128, 벤시클로퀴디움 브로마이드, 레슬리주맙, PBF-680, CRTH2 길항제, 프란루카스트, 살메테롤 지나포에이트, 플루티카손 프로피오네이트, 티오트로피움 브로마이드 일수화물, 마실루카스트, RG-7990, 독소필린, 아베디테롤, 글리코피로늄 브로마이드, TEV-46017, ASM-024, 플루티카손 프로피오네이트, 글리코피로늄 브로마이드, 살메테롤 지나포에이트, 살부타몰, TA-270, 플루니솔라이드, 나트륨 크로모글리케이트, Epsi-gam, ZPL-521, 살부타몰, 아빕타딜, TRN-157, 자피르루카스트, 스템퓨셀 (Stempeucel), 페미롤라스트 나트륨, 나돌롤, 플루티카손 프로피오네이트 + 살메테롤 지나포에이트, RV-1729, 살부타몰 설페이트, 이산화탄소 + 퍼플루오로옥틸 브로마이드, APL-1, 덱트레쿠맙 + VAK-694, 리신 아세틸살리실레이트, 질루톤, TR-4, 인간 동종이형 아디포스-유래 중간엽 줄기세포 전구체 요법 (human allogenic adipose-derived mesenchymal progenitor cell therapy), MEDI-9314, PL-3994, HMP-301, TD-5471, NKTT-120, 페미롤라스트, 베클로메타손 디프로피오네이트, 트란틴테롤, 일나트륨 알파 루미놀, IMD-1041, AM-211, TBS-5, ARRY-502, 세라트로다스트, 재조합 미디스마제 (recombinant midismase), ASM-8, 데플라자코르트, 밤부테롤, RBx-10017609, 이프라트로피움 + 페노테롤, 플루티카손 + 포르모테롤, 에피나스틴, WIN-901X, VALERGEN-DS, 올리고G-COPD-5/20, 툴로부테롤, 옥시스 투르부할러 (oxis Turbuhaler), DSP-3025, ASM-024, 미졸라스틴, 부데소나이드 + 살메테롤, LH-011, AXP-E, 히스타민 인간 면역글로불린, YHD-001, 테오필린, 암브록솔 + 에르도스테인, 라마트로반, 몬텔루카스트, 프란루카스트, AG-1321001, 툴로부테롤, 이프라트로피움 + 살부타몰, 트라닐라스트, 메틸프레드니솔론 술렙타네이트, 콜포르신 다로페이트, 레피리나스트 및 독소필린을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본원에서는 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 치료제는 상기에 명시된 약제 부류 및 상기에 기재된 특정 약제의 목록으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 폐로 전달하기에 적합하다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 흡입 또는 네뷸라이저 투여에 적합하다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 건조 분말 또는 액체 조성물이다.
추가로, 일 방법 양상에서, 본 개시내용은 포유동물에게 본 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 하나 이상의 다른 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
병용 요법에서 사용될 때, 상기 제제는 단일의 약학적 조성물로 제제화될 수 있거나, 또는 상기 제제는 동시에 또는 개별 시점에서 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 투여되는 개별 조성물로 제공될 수 있다. 이러한 조성물은 개별로 포장될 수 있거나 또는 키트로서 함께 포장될 수 있다. 상기 키트 내에 2개 이상의 치료제를 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 투여할 수 있다.
실시예
하기 합성 및 생물학적 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며, 어느 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 하기 실시예에서, 다음의 약어들은 달리 지시하지 않는 한 하기 의미를 갖는다. 하기에 정의되지 않은 약어는 이의 일반적으로 허용되는 의미를 갖는다.
ACN = 아세토니트릴
DCM = 디클로로메탄
DIPEA = N,N-디이소프로필에틸아민
DMF = N,N-디메틸포름아마이드
EtOAc = 에틸 아세테이트
h = 시간 (hour(s))
HATU = N,N,N ',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트
IPA = 이소프로필 알코올
IPAc = 이소프로필아세테이트
MeOH = 메탄올
min = 분 (minute(s))
Pd(PPh3)4 = 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)
RT = 실온
TFA = 트리플루오로아세트산
THF = 테트라히드로푸란
비스(피나콜레이토)디보론 = 4,4,5,5,4',4',5',5'-옥타메틸-[2,2']비[[1,3,2]디옥사보롤라닐]
시약 및 용매는 상업 공급자 (Aldrich, Fluka, Sigma 등)로부터 구입하여, 추가 정제 없이 사용하였다. 반응 혼합물의 진행은 박층 크로마토그래피 (TLC), 분석용 고성능 액체 크로마토그래피 (분석용 HPLC) 및 질량 분광분석법에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물은 각각의 반응에서 구체적으로 기재된 바와 같이 워크업 (work up)되었고; 통상 이들은 추출 및 다른 정제 방법 예컨대 온도- 및 용매-의존성 결정화, 및 침전에 의해 정제되었다. 또한, 반응 혼합물은 전형적으로 C18 또는 BDS 컬럼 패킹 및 기존의 용리제를 사용하여, 컬럼 크로마토그래피 또는 분취용 HPLC에 의해 일상적으로 정제되었다. 전형적인 분취용 HPLC 조건은 하기에 기재되어 있다.
반응 생성물의 특성 분석은 질량 및 1H-NMR 분광법에 의해 일상적으로 수행되었다. NMR 분석을 위해, 샘플을 중수소화 용매 (예: CD3OD, CDCl3 또는 d 6-DMSO)에 용해시키고, 표준 관찰 조건하에 Varian Gemini 2000 기기 (400 MHz)로 1H-NMR 스펙트럼을 수득하였다. 화합물의 질량 분광계 확인은 자동 정제 시스템에 결합된 Applied Biosystems (Foster City, CA) 모델 API 150 EX 기기 또는 Waters (Milford, MA) 3100 기기로 전자분무 이온화 방법 (ESMS)에 의해 수행되었다.
분취용 HPLC 조건
컬럼: C18, 5　μm. 21.2 x 150 mm 또는 C18, 5 μm 21 x 250 또는 C14, 5 μm 21 x 150 mm
컬럼 온도: 실온
유속: 20.0 mL/분
이동상: A = 물 + 0.05% TFA
B = ACN + 0.05% TFA,
주입 부피: (100-1500 μL)
검출기 파장: 214 nm
조 화합물 (crude compounds)을 1:1의 물:아세트산에 약 50 mg/mL로 용해시켰다. 2.1 x 50 mm C18 컬럼을 사용하여 4분 분석용 스케일 테스트 실행을 수행한 후에, 상기 분석용 스케일 테스트 실행의 %B 체류에 기반한 구배로 100 μL 주입을 사용하여 15분 또는 20분 분취용 스케일 실행을 수행하였다. 정확한 구배는 샘플 의존적이었다. 최적의 분리를 위해 21 x 250 mm C18 컬럼 및/또는 21 x 150 mm C14 컬럼으로 밀착된 불순물이 있는 샘플을 체크하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획물을 질량 분광분석법으로 확인하였다.
제조예 1: 4 -( 벤질옥시 )-2- 에틸페닐 ) 트리플루오로 - λ 4 -보란, 칼륨염 I-5
Figure pct00019
(a) 1-(벤질옥시)-3-에틸벤젠 (I-2)
ACN (250 mL, 10 vol) 중 3-에틸페놀 (I-1) (25.0 g, 204.0 mmol)의 교반된 용액에 탄산 칼륨 (42.0 g, 306 mmol)을 실온에서 부가하였다. 수득된 반응 물질을 실온에서 15분에 걸쳐 교반한 다음에, 벤질 브로마이드 (24.0 mL, 204 mmol)를 적가 방식으로 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 수득된 반응 물질을 물 (1.0 L)에 부은 다음에, 화합물을 EtOAc (2 x 2L)로 추출하였다. 조합한 유기물을 냉수, 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켰다. 그 다음에 조 생성물을 헥산 중 2% EtOAc 용리제를 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (I- 2)을 연황색 유성 화합물 (35.0 g, 81%)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.46-7.44 (m, 2H), 7.39 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.34-7.31 (m, 1H), 7.21 (t, J = 7.6 Hz), 6.86-6.80 (m, 3H), 5.07 (s, 2H), 2.64 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.24 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
(b) 4-(벤질옥시)-1-브로모-2-에틸벤젠 (I-3)
ACN (525 mL, 15 vol) 중 1-(벤질옥시)-3-에틸벤젠 (I-2) (35.0 g, 164 mmol)의 빙냉한 교반된 용액에 N-브로모숙신이미드 (32.0 g 181 mmol)를 15분에 걸쳐 조금씩 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 다음 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 수득된 반응 물질을 빙냉수 (1.50 L)에 부은 다음에, 화합물을 EtOAc (2 x 1L)로 추출하였다. 조합한 유기물을 물로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켜서 조 생성물을 수득하였다. n-헥산 (250 mL)을 조 물질에 부가하여, 슬러리를 수득한 다음에, 소결 깔때기를 통해 여과하였다. 모액을 감압하에 증발시켜서 원하는 생성물 I-3을 연황색 유성 화합물 (42.0 g, 87%)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.52-7.29 (m, 7H), 6.88 (s, 1H), 6.68 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 2.69 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(c) 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (I-4)
4-(벤질옥시)-1-브로모-2-에틸벤젠 (I-3) (42.0 g, 144 mmol), 비스(피나콜레이토)디보론 (44.0 g, 173 mmol) 및 디옥산 (440 mL) 중 아세트산 칼륨 (28 g, 288 mmol)의 교반된 용액을 15분 동안 N2 (g)를 퍼징하여 탈기시킨 다음에, PdCl2(dppf).DCM 복합체 (11.0 g, 15 mmol)를 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 다음 16시간 동안 80℃까지 가열하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 상기 반응 물질을 셀라이트 층 (celite bed)을 통해 여과하고, 모액을 감압하에 증발시켜서 조 생성물을 수득하였다. 조 잔류물을 헥산 중 1% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (I- 4)을 연황색 유성 화합물 (32.0 g, 66%)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.45-7.36 (m, 5H), 6.84-6.78 (m, 2H), 5.08 (s, 2H), 2.91 (q, J = 7.6 Hz), 1.33 (s, 12H), 1.19 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
(d) (4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)트리플루오로-λ4-보란, 칼륨염 (I-5)
아세톤:메탄올 (200 mL, 1:1 비율, 10 vol) 중 화합물 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (I-4) (20 g, 59.0 mmol)의 교반된 용액에 불화수소 칼륨의 3M 용액 (23.0 g, 295 mmol, 98.0 mL의 물에 용해됨)을 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 수득된 반응 물질을 감압하에 증발시켰다. 이와 같이 수득된 고형물을 물 (100 mL)에 용해시키고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 수득된 반응 물질을 소결 깔때기를 통해 여과하고, n-헥산으로 세척하고, 감압하에 건조하여 원하는 생성물 (I- 5)을 백색 고형물 (14.0 g, 74%)로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.43 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.30 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.0 Hz), 6.58 (s, 1H), 6.53 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 2.65 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.07 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
제조예 2: 6 - 벤질 5-( tert -부틸) ( S )-3- 벤질 -3,4,6,7- 테트라히드로 -5H-이미 다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-11)
Figure pct00020
(a) (S)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, 염산염 (I-7)
물 (40 L, 8 vol.) 중 L-히스티딘 (I-6) (5.0 kg, 32.14 mol)의 빙냉한 교반된 현탁액에 진한 염산 (3.93 L, 33.75 mol)을 부가한 다음에, 포름알데히드 (5.50 L, 67.5 mol, 37% 수용액)를 적가 방식으로 부가하였다. 수득된 용액을 동일한 온도에서 30분 동안 교반한 다음에, 80℃에서 8시간 동안 가열하였다. LCMS로 반응 진행을 모니터링하였다. 물을 감압하에 제거하여 조 생성물을 수득하고, 수득된 조생성물을 톨루엔 (20 L)에서 2시간 동안 교반하였다. 유기물을 감압하에 제거하여 과량의 물을 제거하고, 화합물을 공비적으로 (azeotropically) 건조시켰다. 그 다음에 수득된 물질을 디에틸 에테르 (20 L)에 넣고, 2시간 동안 교반하였다. 그 다음에 고체 물질을 여과하고, 공기 건조하여 원하는 생성물 (I- 7)을 회백색 고형물 (6.50 Kg, 85%)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.69 (s, 1H), 4.56 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.20 (dd, J = 5.5, 5.2 Hz, 1H), 3.42 (dd, J = 5.0, 17.0 Hz, 1H), 3.11 (dd, J = 10.2, 16.8 Hz, 1H).
(b) (S)-3,5-비스(tert-부톡시카보닐)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (I-8)
1,4-디옥산 (48 L, 8 vol) 및 물 (48 L, 8 vol) 중 (S)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 2염산염 (I-7) (6.10 Kg, 25.40 mmol)의 빙냉한 교반된 용액에 트리에틸아민 (12.36 L, 89 mol)을 적가한 다음에, 디-tert-부틸 디카보네이트 (18.07 L, 78.74 mol, 5L의 1,4-디옥산에 용해됨)를 30분에 걸쳐서 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 실온에서 다음 16시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 및 LCMS 모니터링), 황색 반응 혼합물을 물 (10 L)로 희석하고, 디에틸 에테르 (2 x 10 L) 및 EtOAc (2 x 7.50 L)로 연속적으로 세척하였다. 유기상을 버렸다. 수층을 냉각시키고, 6N HCl 용액을 사용하여 pH ~ 3이 되도록 하였다; 수성상을 EtOAc (3 x 10 L)로 추출하였다. 조합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 감압하에 농축하였다. 유성 잔류물을 30% EtOAc:헥산으로부터 결정화하여 원하는 생성물 (I- 8)을 회백색 고형물 (5.1 Kg, 55%)로 수득하였다. C17H25N3O6에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 368.18 실측치 368.21.
(c) 6-벤질 3,5-디-tert-부틸 (S)-6,7-디히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-3,5,6(4H)-트리카복실레이트 (I-9)
DCM (51 L, 10 vol) 중 (S)-3,5-비스(tert-부톡시카보닐)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (I-8) (5.1Kg, 13.88 mol)의 빙냉한 용액에 포화된 수성 중탄산나트륨 (41.0 L, 8 vol), 테트라-부틸 암모늄 요오다이드 (5.13 Kg, 13.88 mol) 및 벤질 브로마이드 (2.47 L, 20.82 mol)를 순차적으로 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 실온에서 다음 16시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 및 LCMS 모니터링), 2상 용액 (biphasic solution)으로 분리되었다. 수성층을 DCM (3 x 10 L)으로 추출하였다. 조합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이는 헥산 중 40% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M)을 통해 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (I- 9)을 점성 오일 (4.50 Kg, 72%)로 수득하였다. C24H31N3O6에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 458.22, 실측치 458.60.
(d) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-10)
IPA (45 L, 10 vol) 중 6-벤질 3,5-디-tert-부틸 (S)-6,7-디히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-3,5,6(4H)-트리카복실레이트 (I-9) (4.50 Kg, 9.84 mol)의 빙냉한 용액에 수산화암모늄 (36 L, 8 vol)을 적가하였다. 수득된 반응 혼합물을 실온에서 다음 16시간 동안 추가로 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 및 LCMS 모니터링), 수득된 혼합물을 물 (25 L)로 희석한 다음에 EtOAc (3 x 20L)로 추출하였다. 조합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이를 DCM 중 2% MeOH 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M)을 통한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (I- 10)을 진한 점성 오일 (2.70 Kg, 77%)로 수득하였다. C19H23N3O4에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 358.17, 실측치 358.33.
(e) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-11)
DCM (32.4 L, 12 vol) 중 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-10) (2.70 kg, 7.55 mol)의 빙냉한 용액에 수성 1N 수산화나트륨 (24.3 L, 9 vol)을 부가한 다음에 테트라-부틸 암모늄 요오다이드 (2.80 Kg, 7.55 mol) 및 벤질 브로마이드 (0.99 L, 8.31 mol)를 순차적으로 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 실온에서 다음 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 및 LCMS 모니터링), 2상 용액으로 분리되었다. 수성층을 DCM (3 x 10 L)으로 추출하였다. 조합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이를 헥산 중 40% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (I- 11)을 점성 오일 (1.70 Kg, 63%)로 수득하였다. C26H29N3O4에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 448.22 실측치 448.20.
제조예 3: 6 - 벤질 5-( tert -부틸) ( S )-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-16)
Figure pct00021
(a) 4-브로모-2-플루오로벤조일 클로라이드 (I-13)
DCM (12.5 L, 15 vol) 중 4-브로모-2-플루오로벤조산 (I-12) (1.25 Kg, 5.71 mol)의 빙냉한 교반된 용액에 옥살릴 클로라이드 (0.98 L, 11.42 mol)를 적가 방식으로 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 동일한 온도에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 DMF (150 mL)를 상기 반응 혼합물에 적가 방식으로 부가하였다. 수득된 반응 물질을 실온으로 가온하고 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링에 의해), 과량의 옥살릴 클로라이드를 질소 대기하에 감압하에 제거하여 조 생성물 (I-13) (1.08 Kg, 80%)을 수득하였고, 이를 다음 단계에서 추가 정제 없이 사용하였다.
(b) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(4-브로모-2-플루오로벤조일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-14)
ACN (13.6 L, 8 vol) 중 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-11) (1.70 Kg, 3.80 mol)의 교반된 용액에 트리에틸아민 (2.11 L, 15.2 mol)을 부가한 다음에, 4-브로모-2-플루오로벤조일 클로라이드 (I-13) (1.08 Kg, 3.4 L ACN 중에 4.56 mol, 2 vol)를 실온에서 부가하였다. 부가 완료 후에, 수득된 반응 혼합물의 색상이 밝은 황색에서 갈색으로 변했다. 수득된 반응 혼합물을 동일한 온도에서 30분 동안 교반하고, 반응 진행을 TLC로 모니터링하였다. 수득된 반응 혼합물을 빙냉수 (10 L)로 퀀칭한 다음에, EtOAc (3 x 5 L)로 추출하고, 조합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하였다. 유기물들을 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이를 헥산 중 20% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (I-14) (1.74 Kg, 71%)을 수득하였다. C33H31BrFN3O5에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 648.14, 실측치 648.20.
(c) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(6-브로모-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-15)
THF (26.0 L, 15 vol) 중 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(4-브로모-2-플루오로벤조일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-14) (1.74 Kg, 2.68 mol)의 교반된 용액에 히드라진 수화물 (0.705 L, 13.4 mol)을 실온에서 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 가열하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 수득된 반응 물질을 빙냉수 (10 L)에 부은 다음에 화합물을 EtOAc (3 x 10L)로 추출하였다. 조합한 유기물들을 브라인으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켜 조 생성물을 수득하였고, 이를 헥산 중 20% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (I- 15)을 회백색 고형물 (1.12 Kg, 65%)로 수득하였다. C33H32BrN5O4에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 642.16, 실측치 642.21.
(d) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-16)
비스(피나콜레이토)디보론 (250 g, 984 mmol)을 프로판-2-올 (1882 mL, 2.46E+04 mmol)과 함께, 불소 화학을 사용하여 사전에 에칭된 (previously etched) 5L의 가지 3개 달린 단일벽 플라스크에 충전하고, 상기 혼합물을 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 용해는 흡열성이었다 (-4℃). 불소 화학을 사용하여 사전에 에칭된 4L의 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에서, 불화칼륨 불화수소염 (potassium fluoride hydrofluoride) (538 g, 6891 mmol)을 물 (2.306 L, 1.28E+05 mmol)에 용해시켜서 3M 용액을 형성하였다. 용해는 흡열성이었다 (-12℃). 그 다음에 상기 용액을 여과하여 상기 불화칼륨 불화수소염으로부터 소량의 불용성 물질을 제거하였다. 용액들 모두가 완전히 용해되면, 상기 삼각 플라스크의 내용물을 단일벽 플라스크에 15분에 걸쳐 조금씩 충전하였다. 중간 정도의 발열이 관찰되었다 (+10℃). 상기 용액은 부가하는 동안 진하고 반투명의 반-불투명한 (translucent semi-opaque) 회색 슬러리가 되었고, 내용물이 잘 혼합되도록 교반을 증가시켰다. 상기 혼합물을 1.5시간 동안 교반한 다음에 조립 유리 용융된 깔때기 (coarse glass fritted funnel) (4L, 사전에 에칭됨)를 통해 여과하였다. 여과를 완료하는데 30-45분이 소요되었다. 투명한 2상 여과물을 버렸다. 백색 고형물을 필터에서 10분 동안 건조시켰다 (케이크의 균열이 관찰됨). 고형물을 다시 깨끗한 5L의 가지 3개 달린 단일벽 플라스크로 옮기고, 물 (1.33 L, 7.38E+04mmol)로 재슬러리화하였다. 상기 슬러리를 2시간 동안 교반한 후에 투명의 균질한 하이드로겔 (hydrogel)을 형성하였다. 상기 용액을 또 다른 1시간 동안 교반한 후에 고형물/겔을 4L의 조립 유리 깔때기 (사전에 에칭됨)를 사용하여 여과하였다. 고형물을 필터에서 30분 동안 건조시켰다. 고형물을 다시 깨끗한 5L의 가지 3개 달린 단일벽 플라스크로 옮기고, 아세톤 (1.084 L, 1.48E+04 mmol)에 재슬러리화하였다. 백색/회색 슬러리를 1시간 동안 교반한 다음에 4L의 조립 유리 깔때기 (사전에 에칭됨)에서 여과하였다. 여과를 완료하는데 20분이 소요되었고, 그 다음에 깔때기에서 또 다른 1시간 동안 건조하였다. 이때, 상기 고형물은 균일한 건조를 보장하기 위해 가끔 교반하였다. 필터에서 건조 후에 밝은 백색 분말이 남았다. 고형물을 저속 질소 블리드 (nitrogen bleed)로 진공하에 55℃에서 20시간 동안 건조하여 플러피한 (fluffy) 백색 고형물을 수득하였다 (200.3 g이 수집됨).
2-메틸 테트라히드로푸란 (100 mL, 10 vol) 중 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(6-브로모-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-15) (10.0 g, 16.0 mmol)의 교반된 용액에 (4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)트리플루오로-λ4-보란, 칼륨염 (I-5) (8.0 g, 20 mmol) 및 상기에서 수득된 플러피한 백색 고형물 (0.20 g)을 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 질소 기체로 30분 동안 탈기시켰다. 상기 용액에 준비된 탄산세슘 수용액 (20.0g, 물 60 mL 중 62.0 mmol, 6 vol)을 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 15분 동안 추가로 탈기한 다음에, 비스(디-tert-부틸(4-디메틸아미노페닐)포스핀)디클로로팔라듐(II) (0.66 g, 0.93 mmol)을 부가하고, 상기 반응 혼합물을 진공하에 비우고, 질소로 플러싱하였다. 수득된 반응 혼합물을 110℃에서 20시간 동안 가열하였다. 반응 완료 후에 (TLC 및 LCMS 모니터링), 수득된 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 셀라이트 층을 통해 여과한 다음에, EtOAc (3 x 0.5 L)로 추가로 세척하였다. 조합한 유기물들을 1N 수산화나트륨 용액 (3 x 0.5 L)으로 세척하였다. 그 다음에 조합한 유기물들을 브라인으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켜서 조 생성물을 수득하였고, 이를 헥산 중 20% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물 (I-16) (N-벤질 위치이성질체의 혼합물로서)을 연황색 고형물 (8.0 g, 66%)로 수득하였다. C48H47N5O5에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 774.36 실측치 774.59.
제조예 4: ( S )-2-(6-(2-에틸-4- 히드록시페닐 )-1H- 인다졸 -3-일)-4,5,6,7- 테 트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, 염산염 (I-18)
Figure pct00022
(a) 벤질 (S)-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실레이트, 염산염 (I-17)
6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-16) (1.0 g, 1.292 mmol)를 디옥산 (8 mL) 및 물 (1.5 mL)에 용해시킨 다음에, 디옥산 중 염화수소 용액, 4M (7 mL, 28.0 mmol)을 부가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 그 다음에 반응 혼합물을 동결하고, 동결건조하고, 조 생성물 (I- 17)을 다음 반응에서 직접 사용하였다 (정량적 수율이 가정됨). C43H39N5O3에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 674.31 실측치 674.3.
(b) (S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, 염산염 (I-18)
벤질 (S)-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실레이트, 염산염 (I-17) (0.918 g, 1.292 mmol)을 2-프로판올 (15 mL)에 용해시키고, 50℃에서 염화수소 수용액, 5M (0.258 mL, 1.292 mmol) 및 물 (0.25 mL), 그 다음에 탄소상 팔라듐, 10% wt., 50% 물 (0.138 g, 0.065 mmol)을 부가하였다. 그 다음에 반응 플라스크를 질소로 퍼지하고, 수소 벌룬 (hydrogen balloon)을 부착하고, 필요에 따라 수소 벌룬을 보충하면서 반응 혼합물을 50℃에서 4일 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 그 다음에 모든 고형물을 여과로 제거하고, 수득된 용액을 농축하였다. 잔류물을 1:1의 ACN/물에 용해시키고, 동결시키고, 동결건조시켰다. 수득된 분말 (I-18)을 추가 정제 없이 사용하였다 (정량적 수율이 가정됨). C22H21N5O3에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 404.17 실측치 404.2.
제조예 5: ( S )-2-(6-(2-에틸-4- 히드록시페닐 )-1H- 인다졸 -3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (I-19)
Figure pct00023
(S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, HCl (I-18) (0.25 g, 0.568 mmol)을 DMF (2.5 mL) 및 아세톤 (2.5 mL)에 현탁시킨 다음에, 아세트산 (0.098 mL, 1.705 mmol) 및 나트륨 시아노보로하이드라이드 (0.179 g, 2.84 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 반응 혼합물을 농축한 다음에, 조 생성물을 역상 크로마토그래피 (5-70% ACN/물 구배, 50 g C18aq 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (149 mg, 47% 수율)을 제공하였다. C25H27N5O3에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 446.21 실측치 446.3.
실시예 1: ( S )-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00024
(S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (I-19) (50 mg, 0.089 mmol), 3-(디메틸아미노)아제티딘 2염산염 (23.20 mg, 0.134 mmol) 및 DIPEA (0.078 mL, 0.447 mmol)를 DMF (1.5 mL) 중에 용해시킨 다음에, HATU (51.0 mg, 0.134 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (0.014 mL, 0.447 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단하고, 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (5-70% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (25 mg, 37% 수율)을 제공하였다. C30H37N7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 528.30, 실측치 528.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.09 (s, 1H), 9.40 (s, 1H), 8.27 (d, J = 8.31, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.04 (m, 2H), 6.71 (d, J = 2.54, 1H), 6.64 (dd, J = 2.53, 8.26, 1H), 4.26 (m, 1H), 4.06 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.64 (m, 2H), 3.03 (m, 2H), 2.74 (m, 2H), 2.47 (q, J = 7.56, 2H), 2.07 (d, J = 3.69, 6H), 1.07 (m, 6H), 1.00 (t, J = 7.50, 3H).
제조예 6: ( S )-5-에틸-2-(6-(2-에틸-4- 히드록시페닐 )-1H- 인다졸 -3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
Figure pct00025
(S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, HCl (0.100 g, 0.227 mmol) (I-18) 및 아세트알데히드 (0.019 mL, 0.341 mmol)를 메탄올 (3.0 mL)에 용해시킨 다음에, 나트륨 시아노보로하이드라이드 (0.057 g, 0.909 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 나트륨 보로하이드라이드 (9 mg, 0.227 mmol)를 부가하여 남아있는 아세트알데히드를 퀀칭한 다음에, 반응 혼합물을 농축하였다. 그 다음에 조 생성물을 역상 크로마토그래피 (5-70% ACN/물 구배, 40 g C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (62 mg, 50% 수율)을 제공하였다. C24H25N5O3에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 432.20 실측치 432.1.
실시예 2: ( S )-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(5-에틸-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00026
(S)-5-에틸-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (30 mg, 0.055 mmol), 3-(디메틸아미노)아제티딘 2염산염 (14.28 mg, 0.082 mmol) 및 DIPEA (0.048 mL, 0.275 mmol)를 DMF (1.50 mL)에 용해시키고, 그 다음에 HATU (31.4 mg, 0.082 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (5.18 μl, 0.165 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에, 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (5-60% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (25 mg, 63% 수율)을 제공하였다. C29H35N7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 514.29 실측치 514.2.
실시예 3: ( S )-(3-(디메틸아미노)-3-메틸아제티딘-1-일)(5-에틸-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00027
(S)-5-에틸-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (30 mg, 0.055 mmol), N,N,3-트리메틸아제티딘-3-아민 염산염 (12.43 mg, 0.082 mmol) 및 DIPEA (0.048 mL, 0.275 mmol)를 DMF (1.50 mL) 중에 용해시킨 다음에, HATU (31.4 mg, 0.082 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (5.18 μl, 0.165 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에, 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (5-60% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (25 mg, 62% 수율)을 제공하였다. C30H37N7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 528.30 실측치 528.2.
실시예 4: ( S )-(3-(디메틸아미노)-3-메틸아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00028
(S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (40 mg, 0.090 mmol) (I-19) N,N,3-트리메틸아제티딘-3-아민 염산염 (20.29 mg, 0.135 mmol) 및 DIPEA (0.047 mL, 0.269 mmol)를 DMF (1.50 mL) 중에 용해시킨 다음에, HATU (51.2 mg, 0.135 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (8.45 μl, 0.269 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에, 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (5-60% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (26 mg, 38% 수율)을 제공하였다. C31H39N7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 542.32 실측치 542.2.
제조예 7: ( S )-2-(6-(2-에틸-4- 히드록시페닐 )-1H- 인다졸 -3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (I-20)
Figure pct00029
(S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, HCl (I-18) (0.160 g, 0.364 mmol) 및 프로피온알데히드 (0.039 mL, 0.546 mmol)를 메탄올 (3.0 mL) 중에 용해시킨 다음에, 나트륨 시아노보로하이드라이드 (0.069 g, 1.091 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 역상 크로마토그래피 (5-70% ACN/물 구배, 50g C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (78 mg, 38% 수율)을 제공하였다. C25H27N5O3에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 446.21 실측치 446.3.
실시예 5: ( S )-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00030
(S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (30 mg, 0.054 mmol), (I-20) 3-(디메틸아미노)아제티딘 2염산염 (13.92 mg, 0.080 mmol) 및 DIPEA (0.047 mL, 0.268 mmol)를 DMF (1.50 mL) 중에 용해시킨 다음에, HATU (30.6 mg, 0.080 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (5.05 μl, 0.161 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에, 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (5-60% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (26 mg, 63% 수율)을 제공하였다. C30H37N7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 528.30 실측치 528.2.
실시예 6: ( S )-(3-(디메틸아미노)-3-메틸아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00031
(S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (30 mg, 0.054 mmol), (I-20) N,N,3-트리메틸아제티딘-3-아민 염산염 (12.12 mg, 0.080 mmol) 및 DIPEA (0.047 mL, 0.268 mmol)을 DMF (1.50 mL)에 용해시킨 다음에, HATU (30.6 mg, 0.080 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (5.05 μl, 0.161 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에, 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (5-60% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (18 mg, 44% 수율)을 제공하였다. C31H39N7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 542.32 실측치 542.2.
제조예 8: 2 -(4-( 벤질옥시 )-2-에틸-5- 플루오로페닐 )-4,4,5,5- 테트라메틸 -1,3,2-디옥사보롤란
Figure pct00032
(a) 1-(벤질옥시)-4-브로모-5-에틸-2-플루오로벤젠
ACN (250 mL) 중 4-브로모-5-에틸-2-플루오로페놀 (20 g, 910.32 mmol)의 용액에 K2CO3 (31.55 g, 228.3 mmol)를 부가한 다음에 벤질 브로마이드 (13.10 mL, 109.58 mmol)를 적가하였다. 수득된 반응 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 수성층을 EtOAc로 추출하고 (3회), 조합하고, 브라인으로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4에서 건조시키고, 감압하에 증발시켜 표제 중간체를 연황색 유성 액체 (25 g, 89% 수율)로 수득하였다. 1H NMR (400　MHz, 클로로포름-d) δ 7.48 - 7.30 (m, 5H), 7.27 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 2.66 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(b) 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란
디옥산 (100 mL) 중 이전 단계의 생성물 (12.5 g, 40.45 mmol)의 용액에 비스(피나콜레이토)디보론 (15.40 g, 60.67 mmol) 및 KOAc (11.9 g, 121.35 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 질소로 15분 동안 퍼징한 다음에, 디클로로메탄과 착화된 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐 (II) (1.65 g, 2.023 mmol)을 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 교반하고, 110℃에서 3시간 동안 가열하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 잔류물을 EtOAc로 세척하였다. 여과물을 과량의 EtOAc (200 mL)로 희석하고, 물 (100 mL) 그 다음에 브라인 (100 mL)으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 진공에서 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이를 3-5% EtOAc:헥산으로 용출시킨 (100-200) 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물을 회백색 고형물 (9.50 g, 66% 수율)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.54 - 7.27 (m, 6H), 6.81 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.16 (s, 2H), 2.84 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.32 (s, 12H), 1.14 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
제조예 9: 6 -(4-( 벤질옥시 )-2-에틸-5- 플루오로페닐 )-1-( 테트라히드로 -2 H -피란-2-일)-3-(트리메틸스타닐)-1 H -인다졸
Figure pct00033
(a) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸
DMF:H2O (480:120 mL) 중 6-브로모-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸 (50 g, 178.57 mmol) 및 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (76.3 g, 214.29 mmol)의 용액에 K3PO4 (94.64 g, 446.86 mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 질소로 15분 동안 탈기시킨 다음에, Pd(PPh3)2Cl2 촉매 (6.26 g, 8.93 mmol)를 부가하고, 혼합물을 다시 질소로 5분 동안 탈기시키고, 교반한 다음에, 100-110 ℃에서 5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 잔류물을 EtOAc로 세척하였다. 여과물을 EtOAc로 희석하고, 냉수 및 브라인으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 진공에서 농축하여 조 생성물을 제공하고, 이를 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 중간체를 백색 고형물로 수득하였다 (65 g, 86% 수율). C27H27FN2O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 431.21 실측치 431.46. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 8.06 - 7.98 (m, 2H), 7.70 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.51 - 7.32 (m, 5H), 7.08 (dd, J = 809.6, 8.3 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.76 - 5.64 (m, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.04 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 3.72 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 2.52 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 2.22 - 2.02 (m, 3H), 1.80 - 1.71 (m, 3H), 1.06 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(b) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1H-인다졸
메탄올 (700 mL) 중 이전 단계의 생성물 (65 g, 151.16 mmol)의 용액에 진한 HCl (120 mL)을 부가하고, 수득된 용액을 60-65℃에서 3시간 동안 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, 포화 NaHCO3 수용액 및 물로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하여 표제 중간체를 백색 고형물 (52 g, 99% (조질))로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 8.13 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.59 - 7.30 (m, 6H), 7.10 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 2.53 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.05 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(c) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-3-요오도-1H-인다졸
DMF (400 mL) 중 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1H-인다졸 (56 g, 161.18 mmol)의 용액에 KOH (36.2 g, 647.39 mmol)를 부가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. DMF (100 mL) 중 요오드 (82.2 g, 323.69 mmol) 용액을 0℃에서 천천히 부가하고, 실온에서 30분 동안 교반하고, 물 (3 x 150 mL)로 희석하고, EtOAc (3 x 200mL)로 추출하였다. 유기층을 포화된 메타중아황산나트륨 (sodium metabisulfite) 수용액 (3 x 200 mL) 및 물 (400 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4에서 건조시키고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이를 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 중간체를 갈색 반고형물 (64 g, 84% 수율)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 10.49 (s, 1H), 7.57 - 7.32 (m, 7H), 7.16 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.04 - 6.91 (m, 2H), 5.20 (s, 2H), 2.51 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.04 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(d) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-3-요오도-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸
DCM (700 mL) 중 이전 단계의 생성물 (60 g, 127.12 mmol)의 빙냉한 용액에 p-톨루엔설폰산 (4.84 g, 25.423 mmol) 그 다음에 3,4-디히드로-2H-피란 (17.43 mL, 190.68 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, DCM으로 희석하고, 포화 NaHCO3 수용액 및 브라인으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4에서 건조시키고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 제공하고, 이를 플래시 크로마토그래피 (실리카겔)로 정제하여 표제 중간체를 회백색 고형물 (64 g, 91% 수율)로 수득하였다. C27H26FIN2O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 557.10 실측치 557.30. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.56 - 7.31 (m, 7H), 7.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.68 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.08 - 3.99 (m, 1H), 3.77 - 3.64 (m, 1H), 2.50 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.23 - 1.97 (m, 3H), 1.81 - 1.68 (m, 3H), 1.06 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
(e) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-3-(트리메틸스타닐)-1H-인다졸
톨루엔 (150 mL) 중 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-3-요오도-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸 (20 g, 35.97 mmol)의 용액에 헥사메틸디틴 (9.2 mL, 43.17 mmol)을 부가하였다. 반응 혼합물을 질소로 20분 동안 탈기시킨 다음에 테트라키스 (2.0 g, 1.80 mmol)를 부가한 다음에, 100℃에서 2시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 셀라이트를 통해 여과하고, 잔류물을 EtOAc로 세척하였다. 여과물을 농축하고, 2-5% EtOAc:헥산으로 용출시킨 컬럼 크로마토그래피 (중성 알루미나에서)로 정제하여 표제 화합물 (17.50 g, 82% 수율)을 수득하였다. C30H35FN2O2Sn에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 595.17, 593.17 실측치 595.49, 593.55. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.57 - 7.29 (m, 6H), 7.13 - 7.00 (m, 2H), 6.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.81 - 5.68 (m, 1H), 5.21 (s, 2H), 4.13 - 4.00 (m, 1H), 3.81 - 3.66 (m, 1H), 2.54 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 2.23 - 2.00 (m, 2H), 1.87 - 1.59 (m, 4H), 1.08 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.47 (s, 9H).
제조예 10: 5 -( tert -부틸) 6- 메틸 ( S )-2- 요오도 -3-((2- 트리메틸실릴 ) 에톡시 )메틸)-3,4,6,7-테트라히드로-5 H -이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
Figure pct00034
(a) (S)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
물 (420 mL) 중 L-히스티딘 (50 g, 322.24 mmol)의 교반된 현탁액에 진한 HCl (29 mL)을 0℃에서 적가한 다음에 포름알데히드 (55 mL, 676.72 mmol)를 0℃에서 한 번에 부가하였다. 수득된 반응 혼합물을 30분 동안 교반한 다음에 75℃에서 6시간 동안 가열하고 농축하였다. 수득된 조 물질을 디에틸 에테르와 2시간 동안 교반하고, 여과하고, IPA:THF (100:300 mL)로 세척하여 표제 중간체의 HCl 염을 회백색 고형물 (75 g 99% 수율 (조질))로 제공하였다. C7H9N3O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 168.07 실측치 168.17.
(b) 메틸 (S)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실레이트
메탄올 (1500 mL) 중 이전 단계의 생성물 (75.0 g, 312.5 mmol)의 교반된 용액에 SOCl2 (45.6 mL, 625 mmol)를 0℃에서 적가하고, 실온에서 16시간 동안 교반한 다음에 1시간 동안 가열 환류 (70℃)하였다. 용매를 증류로 제거하고, 조 생성물을 메탄올, 그 다음에 디에틸 에테르로 연마 (triturate)하여 표제 중간체의 조 HCl 염을 회백색 고형물 (조질 80g)로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.05 (s, 1H), 4.71 (dd, J = 9.4, 5.2 Hz, 1H), 4.36 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.44 - 3.21 (m, 2H).
(c) 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
메탄올 (1000 mL) 중 이전 단계의 생성물 (80.0 g, 314.96 mmol)의 교반된 용액에 DIPEA (282 mL, 1574 mmol) 그 다음에 디-tert-부틸 디카보네이트 (172 mL, 787.48 mmol)를 0℃에서 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음에 액체 NH3 (150 mL, 수중 25%)를 부가하고, 반응 혼합물을 다시 실온에서 16시간 동안 교반하고, 메탄올을 증류로 제거하고, 잔류물을 DCM (3 x 200 mL)에서 추출하였다. 조합한 유기 추출물들을 무수 Na2SO4에서 건조시키고, 농축하고, 5% MeOH:DCM으로 용출시킨, 플래시 크로마토그래피 (100-200 메쉬 실리카겔)로 정제하여 표제 중간체 (41 g, 46% 수율)를 제공하였다. C13H19N3O4에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 282.14 실측치 282.21. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.85 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 5.18 (dd, J = 49.3, 5.1 Hz, 1H), 4.51 (t, J = 14.2 Hz, 1H), 4.09 (dd, J = 43.9, 16.1 Hz, 1H), 3.59 (s, 3H), 3.08 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 2.94 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 1.45 (s, 9H).
(d) 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-2-요오도-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
THF (500 mL) 중 이전 단계의 생성물 (41.0 g, 145.9 mmol)의 용액에 N-요오도숙신이미드 (66.0 g, 291.8 mmol)를 0℃에서 부가하고, 수득된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 부분을 10% 티오황산나트륨 용액 (3 x 200 mL)으로 세척하였다. 조합한 유기층들을 무수 황산나트륨에서 건조시키고, 농축하여 표제 화합물 60g (조질)을 제공하였고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. C13H18IN3O4에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 408.03 실측치 408.31. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.48 (s, 1H), 5.34 - 4.97 (m, 1H), 4.67 - 4.35 (m, 1H), 4.12 - 3.95 (m, 1H), 3.60 (s, 3H), 3.14 - 2.82 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
(e) 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-2-요오도-3-((2-트리메틸실릴)에톡시)메틸)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
DMF (150 mL) 중 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-2-요오도-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (40 g, 0.098 mol)의 교반된 용액에 DIPEA (35.1 mL, 0.19 mol)를 0℃에서 부가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음에 2-(트리메틸실릴)-에톡시메틸 클로라이드 (19.1 mL, 0.10 mol)를 0℃에서 적가하였다. 수득된 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 4시간 후에, 차가운 물을 부가하고, 반응 혼합물을 EtOAc (2 x 200 mL)로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨에서 건조시키고, 농축하고, 20-35% EtOAc:헥산으로 용출시킨, 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물을 연황색의 점성 액체 (27 g)로 수득하였다. C19H32IN3O5Si에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 538.12 실측치 538.42. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 5.33 - 5.04 (m, 3H), 4.79 - 4.56 (m, 1H), 4.54 - 4.14 (m, 1H), 3.60 (s, 3H), 3.47 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.31 - 3.16 (m, 1H), 2.97 (t, J = 18.9 Hz, 1H), 1.44 (s, 9H), 0.92 - 0.74 (m, 2H), -0.03 (s, 9H).
제조예 11: (6 S )-5-( tert -부톡시카보닐)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1-(테트라히드로-2 H -피란-2-일)-1 H -인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-4,5,6,7-테트라히드로-3 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
Figure pct00035
(a) 5-(tert-부틸) 6-메틸 (6S)-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
톨루엔 (500 mL) 중 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-2-요오도-3-((2-트리메틸실릴)에톡시)메틸)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (17.0 g, 31.65 mmol)의 교반된 용액에 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-3-(트리메틸스타닐)-1H-인다졸 (20 g, 34.82 mmol)을 부가하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 15분 동안 퍼징하고, Pd(PPh3)4 (3.6 g, 3.16 mmol) 및 요오드화구리 (1.20 g, 6.33 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 120℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여과물을 감압하에 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Redisep 80 g 컬럼, 10분 동안 DCM으로 용출시킨 다음에 헥산 중 15-20% EtOAc로 용출)로 정제하여 표제 중간체를 황색 고형물 (15.10 g, 58% 수율)로 수득하였다. C46H58FN5O7Si에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 840.41 실측치 840.54. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 8.43 (s, 1H), 7.54 - 7.33 (m, 6H), 7.20 (s, 1H), 7.05 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.09 - 5.69 (m, 3H), 5.59 - 5.36 (m, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.97 - 4.80 (m, 1H), 4.12 - 3.90 (m, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.57 - 3.47 (m, 2H), 3.40 (d, 1H), 3.21 - 3.05 (m, 1H), 2.74 - 2.34 (m, 4H), 2.25 - 2.07 (m, 2H), 1.94 - 1.65 (m, 4H), 1.54 (s, 9H), 1.12 - 0.99 (m, 3H), 0.91 - 0.75 (m, 2H), -0.12 (s, 9H).
(b) 6-벤질 5-(tert-부틸) (6S)-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
둥근 바닥 플라스크에 톨루엔 (400 mL) 중 이전 단계의 생성물 (15.0 g, 17.85 mmol), 벤질 알코올 (46.3 mL) 및 Ti(OEt)4 (7.15 mL, 35.70 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 48시간 동안 격렬하게 환류시키고 (140℃), 물로 희석하고, DCM으로 추출하였다. 현탁액을 여과하고, 여과물을 Na2SO4에서 건조시키고, 감압하에 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Redisep 80 g 컬럼, 헥산 중 0-5% EtOAc)로 20분 동안 정제하여 과량의 벤질 알코올을 제거한 다음에, 헥산 중 10-15% EtOAc로 용출시켜서 표제 중간체를 제공하였다. 1H NMR은 구조가 일치한다. C52H62FN5O7Si에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 916.44 실측치 916.86.
(c) (6S)-5-(tert-부톡시카보닐)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
1:1의 IPA:THF (400 mL) 중 이전 단계의 생성물 (21.0 g, 22.92 mmol)의 교반된 용액에 Pd(OH)2 (5.0 g)를 부가하였다. 반응 혼합물을 수소 벌룬하에 실온에서 16시간 동안 교반하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 감압하에 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Redisep 80 g 컬럼, 헥산 중 25-40% EtOAc로 용출됨)로 정제하여 표제 화합물 (6.1 g, 8.29 mmol)을 회백색 고형물로 제공하였다. C38H50FN5O7Si에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 736.35 실측치 736.5. 1H NMR은 구조가 일치한다. C38H50FN5O7Si에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 736.35 실측치 736.5. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.94 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 8.34 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.20 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.11 - 5.77 (m, 3H), 5.33 - 5.06 (m, 1H), 4.87 - 4.56 (m, 1H), 4.52 - 4.14 (m, 1H), 3.97 - 3.69 (m, 2H), 3.53 - 3.40 (m, 2H), 3.23 - 3.11 (m, 1H), 3.11 - 2.93 (m, 1H), 2.47 - 2.44 (m, 2H), 2.13 - 1.96 (m, 2H), 1.68 (d, J = 70.9 Hz, 4H), 1.48 (s, 9H), 1.02 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.86 - 0.68 (m, 2H), -0.17 (s, 9H).
제조예 12: ( S )-2-(6-(2-에틸-5- 플루오로 -4- 히드록시페닐 )-1 H - 인다졸 -3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
Figure pct00036
5:1의 디옥산:물 (60 mL) 중 (6S)-5-(tert-부톡시카보닐)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)-메틸)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (5.7 g, 7.75 mmol)의 교반된 용액에 진한 HCl (20 mL)을 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 가온하고, 90℃에서 16시간 동안 교반하고, 진공하에서 증류하여 조 잔류물을 제공하였고, 이를 차가운 디에틸 에테르 및 아세토니트릴로 순차적으로 연마하여 표제 화합물의 HCl 염 (3.6 g, 95% 수율)을 연갈색 고형물로 제공하였다. C22H20FN5O3에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 422.16 실측치 422.24. 1H NMR (400 MHz, D2O/DMSO-d 6) δ 8.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.19 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 6.99 (d, J = 11.9 Hz, 1 H), 6.91 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.56 - 4.51 (m, 1H), 4.36 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 3.35 - 3.25 (m, 1H), 3.15 - 3.05 (m, 1H), 2.4 - 2.55 (m, 2H), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
제조예 13: ( S )-2-(6-(2-에틸-5- 플루오로 -4- 히드록시페닐 )-1 H - 인다졸 -3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
Figure pct00037
DMF (7 mL) 중 (S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, HCl (400 mg, 0.874 mmol), 아세톤 (0.192 mL, 2.62 mmol) 및 아세트산 (0.150 mL, 2.62 mmol)의 용액에 나트륨 시아노보로하이드라이드 (274 mg, 4.37 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 나트륨 보로하이드라이드 (33 mg, 0.874 mmol)를 부가하고, 용액을 농축하고, 분취용 HPLC로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (115 mg, 23% 수율)을 제공하였다. C25H26FN5O3에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 464.20 실측치 464.5.
실시예 7: ( S )-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1 H -인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 C-1
Figure pct00038
DMF (4 mL) 중 (S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (179 mg, 0.310 mmol), N,N-디메틸아제티딘-3-아민, 2 HCl (107 mg, 0.465 mmol) 및 DIPEA (0.162 mL, 0.930 mmol)의 용액에 HATU (177 mg, 0.465 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 히드라진 (5 당량)을 부가하고, 반응 혼합물을 농축하고, 분취용 HPLC로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (63 mg, 26% 수율)을 제공하였다. C30H36FN7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 546.29 실측치 546.7. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.90 (s, 1H), 8.29 (dd, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.07 (d, 1H), 7.01 (d, 1H), 6.89 (d, 1H), 4.35 - 4.18 (m, 1H), 4.11 - 3.94 (m, 1H), 3.94 - 3.73 (m, 3H), 3.70 - 3.57 (m, 2H), 3.06 - 2.94 (m, 2H), 2.87 - 2.66 (m, 2H), 2.48 - 2.40 (m, 2H), 2.13 - 2.00 (m, 6H), 1.07 (t, 3H), 1.03 - 0.93 (m, 6H).
실시예 8: ( S )-(3-(디메틸아미노)-3- 메틸아제티딘 -1-일) (2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00039
(S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (30 mg, 0.052 mmol), N,N,3-트리메틸아제티딘-3-아민, 2HCl (29.2 mg, 0.156 mmol) 및 DIPEA (0.045 mL, 0.260 mmol)를 DMF (1.0 mL)에 용해시킨 다음에 HATU (29.6 mg, 0.078 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (4.90 μl, 0.156 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에, 상기 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (2-70% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (13 mg, 33% 수율)을 제공하였다. C31H38FN7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 560.31 실측치 560.2.
제조예 14: ( S )-5-에틸-2-(6-(2-에틸-5- 플루오로 -4- 히드록시페닐 )-1H- 인다졸 -3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
Figure pct00040
(S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, HCl (450 mg, 0.983 mmol) 및 아세트알데히드 (0.083 mL, 1.474 mmol)를 DMF (7 mL)에 용해시킨 다음에, 나트륨 시아노보로하이드라이드 (247 mg, 3.93 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 나트륨 보로하이드라이드 (112 mg, 2.95 mmol)를 부가하여 남아있는 아세트알데히드를 퀀칭한 다음에 반응 혼합물을 농축하였다. 그 다음에 조 생성물을 역상 크로마토그래피 (5-65% ACN/물 구배, 100 g C18aq 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (165 mg, 30% 수율)을 제공하였다. C24H24FN5O3에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 450.19 실측치 450.2.
실시예 9: ( S )-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(5-에틸-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00041
(S)-5-에틸-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (30 mg, 0.053 mmol) 및 HATU (30.4 mg, 0.080 mmol)를 DMF (1.0 mL)에서 조합하였다. 상기 용액에 N,N-디메틸아제티딘-3-아민 (16 mg, 0.160 mmol) 및 DIPEA (0.037 mL, 0.213 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (4.92 μl, 0.160 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에, 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (10-70% ACN/물 구배, Zorbax Bonus-RP 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (27 mg, 67% 수율)을 제공하였다. C29H34FN7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 532.28 실측치 532.2.
실시예 10: ( S )-(3-(디메틸아미노)-3-메틸아제티딘-1-일)(5-에틸-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00042
(S)-5-에틸-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (30 mg, 0.053 mmol) 및 HATU (30.4 mg, 0.080 mmol)를 DMF (1.0 mL)에서 조합하였다. 상기 용액에 N,N,3-트리메틸아제티딘-3-아민 (18 mg, 0.160 mmol) 및 DIPEA (0.037 mL, 0.213 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (4.92 μl, 0.160 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (10-70% ACN/물 구배, Zorbax Bonus-RP 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (28 mg, 68% 수율)을 제공하였다. C30H36FN7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 546.29 실측치 546.2.
제조예 15: ( S )-2-(6-(2-에틸-5- 플루오로 -4- 히드록시페닐 )-1H- 인다졸 -3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
Figure pct00043
(S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, HCl (300 mg, 0.655 mmol) 및 프로피온알데히드 (0.071 mL, 0.983 mmol)를 DMF (7 mL)에 용해시킨 다음에, 나트륨 시아노보로하이드라이드 (124 mg, 1.966 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 나트륨 보로하이드라이드 (26 mg, 0.655 mmol)를 부가하여 남아있는 알데히드를 퀀칭한 다음에, 반응 혼합물을 농축하였다. 그 다음에 조 생성물을 분취용 HPLC (2-70% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (117 mg, 31% 수율)을 제공하였다. C25H26FN5O3에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 464.21 실측치 464.2.
실시예 11: ( S )-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00044
(S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (33 mg, 0.057 mmol), N,N-디메틸아제티딘-3-아민, 2HCl (29.7 mg, 0.171 mmol) 및 DIPEA (0.060 mL, 0.343 mmol)를 DMF (2.0 mL)에 용해시킨 다음에, HATU (28.2 mg, 0.074 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (8.97 μl, 0.286 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에 상기 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (2-70% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (27 mg, 61% 수율)을 제공하였다. C30H36FN7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 546.29 실측치 546.5.
실시예 12: ( S )-(3-(디메틸아미노)-3-메틸아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00045
(S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (30 mg, 0.052 mmol), N,N,3-트리메틸아제티딘-3-아민, 2HCl (29.2 mg, 0.156 mmol) 및 DIPEA (0.045 mL, 0.260 mmol)를 DMF (1.0 mL)에 용해시킨 다음에, HATU (29.6 mg, 0.078 mmol)를 부가하고, 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (8.89 μl, 0.260 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단한 다음에, 상기 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (2-70% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (15 mg, 37% 수율)을 제공하였다. C31H38FN7O2에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 560.31 실측치 560.5.
생물학적 분석
본 발명의 화합물은 하기 하나 이상의 생물학적 분석에서 특성 규명되었다.
분석 1: 생화학적 JAK 키나제 분석
4개의 LanthaScreen JAK 생화학적 분석 패널 (JAK1, 2, 3 및 Tyk2)을 통상의 키나제 반응 버퍼 (50 mM HEPES, pH 7.5, 0.01% Brij-35, 10 mM MgCl2 및 1 mM EGTA)에서 수행하였다. 재조합 GST-태그된 JAK 효소 및 GFP-태그된 STAT1 펩티드 기질은 Life Technologies로부터 입수하였다.
계열 희석된 화합물을 4개의 JAK 효소 각각 및 기질과 함께 화이트 384-웰 마이크로플레이트 (Corning)에서 주위 온도에서 1시간 동안 사전-인큐베이션하였다. 이어서 ATP를 부가하여 1% DMSO로 총 부피 10 μl에서 키나제 반응을 개시하였다. JAK1, 2, 3 및 Tyk2에 대한 최종 효소 농도는 각각 4.2 nM, 0.1 nM, 1 nM 및 0.25 nM이고; 사용된 상응하는 Km ATP 농도는 25 μM, 3 μM, 1.6 μM 및 10 μM 이며; 4개 분석 모두에 대해 기질 농도는 200 nM이다. 키나제 반응을 주위 온도에서 1시간 동안 진행시킨 후에, TR-FRET 희석 버퍼 (Life Technologies)에 EDTA (10mM 최종 농도) 및 Tb-항-pSTAT1 (pTyr701) 항체 (Life Technologies, 2 nM 최종 농도)의 10 μL 제제를 부가하였다. 상기 플레이트를 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에, EnVision 리더 (Perkin Elmer)에서 판독하였다. 방출 비율 신호 (520nm/495nm)를 기록하고 이를 활용하여 DMSO 및 배경 대조군에 기반하여 억제 퍼센트 값을 계산하였다.
용량-반응 분석을 위해, 억제 퍼센트 데이터를 화합물 농도에 대해 플로팅하고, IC50 값을 Prism 소프트웨어 (GraphPad Software)를 사용하여 4-파라미터 로버스트 적합 모델 (4-parameter robust fit model)로부터 결정하였다. 결과는 pIC50 (IC50의 음의 로그)으로 표시한 후에, Cheng-Prusoff 방정식을 사용하여 pKi (해리 상수, Ki의 음의 로그)로 변환시켰다.
4개의 JAK 분석에서 더 낮은 Ki 값 또는 더 높은 pKi 값을 갖는 시험 화합물은 JAK 활성의 더 큰 억제를 나타낸다.
분석 2: Tall-1 T 세포에서 IL-2 자극된 pSTAT5의 억제
인터루킨-2 (IL-2) 자극된 STAT5 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 효능을 AlphaLisa를 사용하여 Tall-1 인간 T 세포주 (DSMZ)에서 측정하였다. IL-2는 JAK1/3을 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK1/3 세포 효능의 척도를 제공한다.
인산화된 STAT5를 AlphaLISA SureFire Ultra pSTAT5 (Tyr694/699) 키트 (PerkinElmer)를 통해 측정하였다.
Tall-1 세포주로부터의 인간 T 세포를 15% 열불활성화된 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2mM 글루타맥스 (Glutamax) (Life Technologies), 25mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)가 보충된 RPMI (Life Technologies)에서 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 배양하였다. 화합물을 DMSO에서 계열 희석하고, 빈 웰에 음향적으로 (acoustically) 분배하였다. 분석 배지 (10% FBS (ATCC)가 보충된 페놀 레드-프리 DMEM (Life Technologies))를 분배하고 (4 μL/웰), 플레이트를 900rpm으로 10분 동안 진탕하였다. 세포를 분석 배지 (4 μL/웰)에 45,000 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, IL-2 (R&D Systems; 최종 농도 300 ng/mL)를 예열된 분석 배지 (4 μL)에 30분 동안 부가하였다. 사이토킨 자극 후에, 1x PhosStop 및 Complete 정제 (Roche)를 함유하는 6 ul의 3x AlphaLisa 용해 버퍼 (PerkinElmer)로 세포를 용해시켰다. 상기 용해물을 실온 (RT)에서 900 rpm으로 10분 동안 진탕하였다. pSTAT5 AlphaLisa 키트 (PerkinElmer)를 통해 인산화된 STAT5를 측정하였다. 새롭게 제조된 수용체 비드 혼합물을 녹색 필터된 <100 룩스 광 하에서 용해물 (5 μL)에 분배하였다. 플레이트를 900 rpm으로 2분 동안 진탕하고, 간단히 침강시키고, 실온의 어두운 곳에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 공여체 비드를 녹색 필터된 <100 룩스 광 하에서 분배하였다 (5 μL). 플레이트를 900 rpm으로 2분 동안 진탕하고, 간단히 침강시키고, 실온의 어두운 곳에서 밤새 인큐베이션하였다. 녹색 필터된 <100 룩스 광 하에서 EnVision 플레이트 리더 (PerkinElmer)를 사용하여 689 nm에서 여기 및 570 nm에서 방출로 발광 (luminescence)을 측정하였다.
IL-2에 반응하여 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해, pSTAT5에 결합된 비드의 평균 방출 세기를 인간 T 세포주에서 측정하였다. 신호 세기 대 화합물 농도의 억제 곡선의 분석으로부터 IC50 값을 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값 (평균 ± 표준 편차)으로 표시하였다.
인 비트로 분석 결과
Figure pct00046
분석 3: 폐 조직에서 IL-13 유발 pSTAT6 유도의 뮤린 (마우스) 모델
IL-13은 천식의 병태생리학을 기초로 하는 중요한 사이토킨이다 (Kudlacz et al. Eur . J. Pharmacol, 2008, 582,154-161). IL-13은 Janus 패밀리 키나제 (JAK)의 구성원을 활성화시키는 세포 표면 수용체에 결합하고, 그 다음에 STAT6을 인산화시키고, 후속하여 추가의 전사 경로를 활성화시킨다. 기재된 모델에서, IL-13의 용량을 마우스의 폐로 국소로 전달하여 STAT6의 인산화 (pSTAT6)를 유도하고, 그 다음에 엔드포인트 (endpoint)로서 측정하였다.
Harlan의 성체 Balb/c 마우스를 본 분석에서 사용하였다. 연구 당일에, 동물들을 이소플루란 (isoflurane)으로 가볍게 마취시키고, 비히클 (vehicle) 또는 시험 화합물 (1 mg/mL, 수회 호흡에 걸쳐 50 μL 전체 부피)을 경구 흡인을 통해 투여하였다. 동물들은 투여 후에 측면 횡와위 (lateral recumbency)로 놓고, 마취로부터 완전히 회복되는 동안 모니터링하고 이후 이들을 홈 케이지로 되돌려 보냈다. 4시간 후에, 동물들을 다시 한번 간단히 마취시키고, 비히클 또는 IL-13 (전달된 전체 용량 0.03 μg, 50 μL 전체 부피)으로 경구 흡인을 통해 챌린지하고 (challenged), 마취로부터 회복되는 동안 모니터링하고, 이후 이들을 홈 케이지로 되돌려 보냈다. 비히클 또는 IL-13을 투여하고 1시간 후에, Perkin Elmer AlphaLISA® SureFire® Ultra™ HV p-STAT6 (Tyr641) 분석 키트를 사용한 폐 균질 물에서 pSTAT6 검출, 및 폐 및 혈장 모두에서 총 약물 농도 분석 모두를 위해 전혈과 폐를 수집하였다. 혈액 샘플을 4℃에서 약 12,000 rpm으로 4분 동안 원심 분리하여 (Eppendorf centrifuge, 5804R) 혈장을 수집하였다. 폐를 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 헹구고, 패드 건조하고, 순간 동결하고, 칭량하고, HPLC 물 중 0.1% 포름산에서 1:3으로 희석하여 균질화하였다. 시험 화합물의 혈장 및 폐 수준은 시험 매트릭스에서 표준 곡선으로 구성된 분석 표준에 대해 LC-MS 분석에 의해 결정하였다. 폐 대 혈장 비율은 5시간에서 ng/g 단위의 폐 농도 대 ng/mL 단위의 혈장 농도의 비율로서 결정하였다.
상기 모델에서 활성은, 비히클로 처리되고 IL-13으로 챌린지된 대조군 동물과 비교하여, 5시간에서 처리된 동물의 폐에 존재하는 pSTAT6 수준의 감소로 입증되었다. 비히클-처리되고 IL-13으로 챌린지된 대조군 동물과, 비히클-처리되고 비히클로 챌린지된 대조군 동물 간의 차이는 임의의 주어진 실험에서 각각 0% 및 100%의 억제 효과로 나타내었다. 상기 분석에서 시험된 화합물은 하기에 기록된 바와 같이 IL-13으로 챌린지하고 5시간 후에 STAT6 인산화의 억제를 나타내었다.
Figure pct00047
마우스 폐에서 유의한 화합물 농도의 관찰로, 관찰된 IL-13 유발 pSTAT6 유도 억제는 시험 화합물의 활성의 결과이었음을 확인하였다. 5시간에서 폐 대 혈장 비율은 화합물 1이 마우스의 혈장에 노출된 것보다 폐에서 유의하게 더 많이 노출되었음을 보여 주었다.
분석 4: 인간 말초혈액 단핵 세포에서 TSLP -유발 TARC 방출의 억제
TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) 및 TARC (thymus and activation-regulated chemokine)는 천식 환자의 기도에서 과발현되고, 질병 중증도와 관련이 있다. 폐에서, TSLP는 알레르겐 및 바이러스 감염에 반응하여 기관지 상피 세포에 의해 방출될 수 있다. TSLP는 상피 세포, 내피 세포, 호중구, 마크로파지 및 비만 세포를 포함한 광범위한 조직 및 세포 타입에서 발견되는 IL-7Rα/TSLPR 헤테로다이머를 통해 신호를 전달한다. TSLP의 이의 수용체에의 결합은 JAK1 및 JAK2를 활성화하여, STAT3 및 STAT5를 포함한 다양한 전사 인자를 인산화시키는 구조적 변화를 유도한다. 면역 세포에서, 이는 세포 증식, 항-아폽토시스, 수지상 세포 이동, Th2 사이토킨 및 케모킨의 생성을 초래하는 일련의 세포내 이벤트를 유발한다. PBMC (peripheral blood mononuclear cells)에서, TSLP는 화학유인제 TARC에 의해 매개되는 과정인, 골수성 수지상 세포를 활성화하여 T 세포를 유인 및 자극함으로써 염증유발 효과를 갖는다.
본 분석에서, TSLP 자극은 PBMC로부터 TARC 방출을 유도하고, 이러한 반응은 화합물로 치료할 때 용량-의존적 방식으로 약화됨을 보여 주었다. TARC 방출 억제에 대해 시험 화합물의 효능을 측정하였다.
3 내지 5명의 공여자로부터의 PBMC 알리코트 (사전에 전혈로부터 단리하고, 알리코트로 -80℃에서 동결)를 37℃에서 해동하고, 50 mL Falcon 튜브에 있는 40 mL의 예열된 멸균-여과된, 완전 RPMI 배지에 적가하였다. 세포를 펠렛화하고, 완전 배지에 2.24 x 106 세포/mL로 재현탁하였다. 조직 배양 처리된 96-웰 평면 바닥 마이크로플레이트에서 웰 (well)당 85 μL (190,000개 세포)로 세포를 시딩하였다. 세포를 5% CO2로 37℃에서 1시간 동안 휴지시켰다.
DMSO 중 10 mM 스톡 용액으로 화합물을 수득하였다. 3.7-배 연속 희석을 수행하여 DMSO 중에 시험 화합물의 9개의 농도를 300X의 최종 분석 시험 농도로 생성하였다. 완전 배지에서 150-배 중간 희석을 수행하여 0.2% DMSO로 2X의 최종 분석 시험 농도로 화합물을 생성하였다. 1시간의 휴지 기간 후에, 33.33 μM 내지 0.95 μM의 최종 분석 농도 범위에 대해, PBMC의 각 웰에 95 μL의 2X 화합물을 부가하였다. 완전 배지 중에 95 μL의 0.2% DMSO를 미처리 대조군 웰에 부가하였다. 세포를 자극하기 전에 5% CO2로 37℃에서 1시간 동안 화합물로 사전-처리하였다.
재조합 인간 TSLP 단백질을 0.1% BSA를 가진 멸균 DPBS 중에 10 μg/mL로 재구성하고, 알리코트로 -20℃에서 저장하였다. 사용 직전에, 알리코트를 해동하고, 완전 배지에서 20X의 최종 분석 농도로 제조하였다. 10 ng/mL의 최종 분석 농도를 위해, 10 μL의 20X TSLP를 PBMC의 각 웰에 부가하였다. 10 μL의 완전 배지를 비자극된 대조군 웰에 부가하였다. 세포를 화합물의 존재하에 37℃에서 5% CO2로 48시간 동안 자극하였다.
자극 후에, 세포 배양 상등액을 수확하고, TARC 수준을 제조자의 지침에 따라 인간 CCL17/TARC Quantikine ELISA 키트 (R&D Systems #DDN00)를 사용하여, 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)으로 검출하였다.
용량 반응 분석을 위해, 로그 [시험 화합물 (M)]을 각 공여자에 대한 반응값 퍼센트에 대해 플로팅하였고, IC50 값은 가변 경사를 가진 4-파라미터 시그모이드 용량-반응 알고리즘 (4-parameter sigmoidal dose-response algorithm)을 사용하는 GraphPad Prism 소프트웨어로 비선형 회귀 분석을 사용하여 결정하였다. 데이터는 개별 공여자의 pIC50 값으로부터 계산된 평균 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하고, 소수점 첫째 자리로 반올림하였다. 원래 화합물 및 이의 des-fluoro 변형된 유사체에 의한 억제 효능 값은 하기 표 3에 요약되어 있다.
Figure pct00048
분석 5: 폐 S9 대사작용
화합물 1 및 C-1의 인 비트로 대사작용 안정성을 인간 폐 S9 분획물 (1 μM 화합물; 1 mg/mL S9 단백질)에서 평가하였다. 시간 0, 15, 30 및 60분의 샘플을 고해상도 LC-MS/MS로 모체 화합물에 대해 분석하였다. 인간 유래의 폐 S9 분획물 (lot 1410245)은 XenoTech LLC (Lenexa, KS)로부터 구입하였다. NADPH (Sigma Aldrich, N1630) 및 3-포스포아데노신 5-포스포설페이트 (PAPS) (Sigma Aldrich, A1651)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 아세토니트릴 및 물은 VWR (Radnor, PA)로부터 입수하였고, HPLC 등급 이상이었다. 랄록시펜 (Raloxifene) 및 포름산은 Sigma Aldrich (St.　Louis, MO)로부터 구입하였다. 폐 S9 인큐베이션은 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 37℃의 수조에서 수행하였다. 폐 S9 용액은 1 mM NADPH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 3 mM 염화마그네슘 (Sigma Aldrich, M1028)이 보충되고, 100 μM PAPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 보조인자가 존재하는, pH 7.4로 완충된 100 mM 인산칼륨 (BD Biosciences, Woburn, MA)으로 구성되고, 최종 인큐베이션 단백질 농도는 1 mg/mL이다. 랄록시펜 (n = 1) 및 화합물 (n = 1)의 10 mM DMSO 스톡을 버퍼에서 희석하고, 상기 인큐베이션으로 스파이크하여 (spiked) 1 μM 기질 농도 (0.001% DMSO v/v)를 수득하였다. 인큐베이션 부피는 400 μL로 구성되었고, 0, 15, 30 및 60분의 시점에서 70 μL의 알리코트를 꺼내어 140 μL의 아세토니트릴 (0% 포름산)로 희석하였다. 모든 샘플을 5℃에서 2250 g로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 샘플로부터 상등액 (50 μL)을 취하고, 내부 표준을 함유하는 100 μL HPLC 물로 희석하였다. 상기 샘플을 Dionex Ultimate 3000 자동 샘플러에서 수행하고, Atlantis T3 컬럼 3μM - 2.1 x 50 mm (Waters Inc., 186003717)와 결합된, 전체 스캔 모드에서 Thermo Q-Exactive 고분해능 질량 분광분석기 (Thermo, Waltham, MA)를 사용하여 분석하였다. 이동상 A는 물 + 0.2% 포름산으로 구성되었고, 이동상 B는 아세토니트릴 + 0.2% 포름산으로 구성되었다. Gubbs GMSU 소프트웨어 (Gubbs Inc., Alpharetta, GA)를 사용하여 피크 적분 (peak integration)을 수행하였다. 각 샘플에 대해, 분석물 피크 면적을 내부 표준 피크 면적으로 나누어 피크 면적 비율 (peak area ratios)을 계산하였다. 각 인큐베이션의 경우, 각 t0에서 분석물의 피크 면적 비율을 100%로 설정하고, 60분의 샘플로부터 피크 면적 비율을 해당 t0에 대한 나머지 퍼센트로 변환하였다. 설페이트 대사산물 형성의 결정은 과거 내부 데이터를 기반으로, 각 모체 화합물의 O-설페이트 대사산물에 해당하는 모체 이온 채널에서 초기-용출 피크를 관찰하여 정성적으로 이루어졌다. 분석 결과는 하기 표 4에 요약되어 있다 (n = 2 반복).
Figure pct00049
화합물 1-6은 이의 상응하는 플루오로 유사체 (화합물 C-1 내지 C- 6)와 비교할 때, 유의하게 적은 황산화 대사작용을 유도하였다.
BD Biosciences)는 STAT3 인산화를 검출하는데 사용된다.
분석 6: 마우스의 혈장 및 폐에서 약동학
시험 화합물의 혈장 및 폐 농도 및 이의 비율은 하기 방식으로 결정하였다. Charles River Laboratories의 BALB/c 마우스를 본 분석에 사용하였다. 시험 화합물을 0.2 mg/mL의 농도로 pH 4 시트레이트 버퍼 중 20% 프로필렌 글리콜에서 개별적으로 제제화하고, 50 μL의 투여 용액을 마우스의 기관에 경구 흡인에 의해 도입하였다. 투여 후 다양한 시점 (전형적으로 0.167, 2, 6, 24시간)에서, 혈액 샘플을 심장 천자를 통해 꺼내고, 온전한 폐를 마우스로부터 절제하였다. 혈액 샘플을 4℃에서 약 12,000 rpm으로 4분 동안 원심 분리하여 (Eppendorf centrifuge, 5804R) 혈장을 수집하였다. 폐를 패드 건조하고, 칭량하고, 멸균수에서 1:3으로 희석하여 균질화하였다. 시험 화합물의 혈장 및 폐 농도는 시험 매트릭스에서 표준 곡선으로 구성된 분석 표준에 대해 LC-MS 분석에 의해 결정하였다. 폐-대-혈장 비율은 μg hr/g 단위의 폐 AUC 대 μg hr/mL 단위의 혈장 AUC의 비율로 결정되었고, 여기서 AUC는 일반적으로 시험 화합물 농도 대 시간 곡선하 면적으로 정의된다.
Figure pct00050
분석 7: IL-5 매개된 호산구 생존 분석
IL-5 매개된 호산구 생존에 대한 시험 화합물의 효능은 인간 전혈 (AllCells)로부터 단리된 인간 호산구에서 측정될 수 있다. IL-5는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다.
인간 호산구는 건강한 공여자의 신선한 인간 전혈 (AllCells)로부터 단리된다. 혈액을 0.9% 염화나트륨 용액 (Sigma-Aldrich) 중 4.5% 덱스트란 (Sigma-Aldrich)과 혼합한다. 적혈구는 35분 동안 침강되도록 두었다. 백혈구 풍부 상층을 꺼내고, Ficoll-Paque (GE Healthcare) 상에 층을 이루고, 600 g으로 30분 동안 원심분리한다. 혈장 및 단핵 세포 층은 과립구 층을 물로 용해시키기 전에 꺼내어 임의의 오염된 적혈구를 제거하였다. 호산구는 인간 호산구 단리 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 추가로 정제하였다. 정제된 호산구의 분획물을 항-CD16 FITC (Miltenyi Biotec)와 함께 4℃의 어두운 곳에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 순도는 LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서, 10% 열불활성화 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2mM 글루타맥스 (Life Technologies), 25mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI 1640 (Life Technologies)에서 세포를 배양하였다. 세포를 배지 (50 μL) 중에 10,000 세포/웰로 시딩하였다. 상기 플레이트를 300 g으로 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 꺼냈다. 화합물은 DMSO에서 연속적으로 희석한 다음에, 배지에서 500배 더 희석하여 2x의 최종 분석 농도로 하였다. 시험 화합물 (50 μL/웰)을 세포에 부가하고, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음에, 예열된 분석 배지 (50 μL)에 IL-5 (R&D Systems; 최종 농도 1 ng/mL 및 10 pg/mL)를 72시간 동안 부가하였다.
사이토킨 자극 후에, 세포를 300 g으로 5분 동안 원심분리하고, 냉 DPBS (Life Technologies)로 2회 세척하였다. 생존력 및 아폽토시스를 평가하기 위해, 세포를 프로피디움 요오다이드 (Thermo Fisher Scientific) 및 APC Annexin V (BD Biosciences)와 인큐베이션하고, LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. IC50 값은 세포 생존율 퍼센트 대 화합물 농도의 생존율 곡선 분석으로부터 결정된다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다.
분석 8: 인간 3D 기도 배양물에서 IFNγ 및 IL-27 유발 케모킨 CXCL9 및 CXCL10의 억제
EpiAirway 조직 배양물을 Mattek (AIR-100)으로부터 입수하였다. 배양물은 천식 환자 공여자로부터 유래되었다. 세포 배양 인서트에서, 인간 유래 기관/기관지 상피 세포를 다공성 막 지지체에서 성장 및 분화시켜서, 세포 아래에 가온된 배양 배지와 위에 기체 시험 대기와의 공기-액체 계면을 형성하였다. 조직은 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 유지 배지 (Mattek, AIR-100-MM)에서 배양하였다. 4명의 공여자를 시험하였다. 0일차에, 조직 배양물을 10 μM, 1 μM 및/또는 0.1 μM로 액체 계면에서 시험 화합물로 처리하였다. 화합물을 디메틸 설폭시드 (DMSO, Sigma)에서 최종 농도 0.1%로 희석하였다. 0.1%의 DMSO를 비히클 대조군으로 사용하였다. 시험 화합물을 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 배양물과 인큐베이션한 다음에, 100 ng/ml의 최종 농도로 IFNγ (R&D Systems) 또는 IL-27 (R&D Systems)을 함유하는 예열된 배지를 부가하였다. 조직 배양물을 8일 동안 유지하였다. 배지는 화합물과 IFNγ 또는 IL-27을 함유하는 새로운 배지로 2일마다 교체하였다. 8일차에, 조직 배양물 및 상등액을 분석을 위해 수집하였다. 루미넥스 분석 (EMD Millipore)을 사용하여 CXCL10 (IP-10) 및 CXCL9 (MIG)에 대해 상등액 샘플을 분석하였다. 데이터는 % 억제 +/- 표준 편차 (± STDV)로 표시하였다. 억제 퍼센트는 비히클로 처리된 세포와 비교하여, IFNγ 또는 IL-27 유발 CXCL10 또는 CXCL9 분비에 대한 화합물 억제 효능에 의해 결정하였다. 데이터는 4명의 공여자의 평균이다. 화합물 1은 비히클 대조군과 비교할 때 IFNγ 유발 CXCL10 분비를 100% ± 1.0 (10 μM에서), 76% ± 13 (1 μM에서) 및 18% ± 22 (0.1 μM에서)만큼 억제할 수 있었다. 화합물 1은 비히클과 비교할 때 IFNγ 유발 CXCL9 분비를 100% ± 0.1 (10 μM에서), 93% ± 6.9 (1 μM에서) 및 16% ± 41 (0.1 μM에서)만큼 억제할 수 있었다. 화합물 1은 비히클 대조군과 비교할 때 IL-27 유발 CXCL10 분비를 100% ± 0.0 (10 μM에서), 98% ± 1.0 (1 μM에서) 및 25% ± 26 (0.1 μM에서)만큼 억제할 수 있었다. 화합물 1은 비히클 대조군과 비교할 때 IL-27 유발 CXCL9 분비를 100% ± 0.0 (10 μM에서), 97% ± 2.0 (1 μM에서) 및 52% ± 18 (0.1 μM에서)만큼 억제할 수 있었다.
분석 9: 세포 JAK 효능 분석: 인간 PBMC에서 IL-2/항-CD3 자극된 IFNγ의 억제
인터루킨-2 (IL-2)/항-CD3 자극된 인터페론 감마 (IFNγ) 억제에 대한 시험 화합물의 효능을 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 단리된 인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 측정할 수 있다. IL-2는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다.
(1) 인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)는 ficoll 구배를 사용하여 건강한 공여자의 인간 전혈로부터 단리하였다. 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 10% 열불활성화된 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2 mM 글루타맥스 (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI (Life Technologies)에서 세포를 배양하였다. 세포를 배지 (50 μL) 중에 200,000 세포/웰로 시딩하고, 1시간 동안 배양하였다. 화합물을 DMSO에서 연속하여 희석하고, 그 다음에 배지에서 500-배 (2x 최종 분석 농도까지)로 더 희석하였다. 시험 화합물 (100　μL/웰)을 세포에 부가하고, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 예열된 분석 배지 (50　μL)에 IL-2 (R&D Systems; 최종 농도 100 ng/mL) 및 항-CD3 (BD Biosciences; 최종 농도 1 μg/mL)을 24시간 동안 부가하였다.
(2) 사이토킨 자극 후에, 세포를 500 g으로 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 꺼내고, -80℃로 동결시켰다. IL-2/항-CD3에 반응하는 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해, 상등액 중 IFNγ 농도를 ELISA (R&D Systems)를 통해 측정하였다. IC50 값은 IFNγ 농도 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다.
분석 10: 세포 JAK 효능 분석: CD4+ T 세포에서 IL-2 자극된 pSTAT5의 억제
인터루킨-2 (IL-2)/항-CD3 자극된 STAT5 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 효능은 유세포 분석기를 사용하여 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 단리된 인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 중에 CD4-포지티브 (CD4+) T 세포에서 측정될 수 있다. IL-2는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다.
CD4+ T 세포는 피코에리트로빌린 (phycoerythrobilin: PE) 접합된 항-CD4 항체 (Clone RPA-T4, BD Biosciences)를 사용하여 동정하고, Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT5 항체 (pY694, Clone 47, BD Biosciences)를 사용하여 STAT5 인산화를 검출하였다.
(1) 상기 분석 9의 단락 (1)의 프로토콜에 따르고, 단 항-CD3에 의한 사이토킨 자극은 24시간이 아닌 30분 동안 수행하였다.
(2) 사이토킨 자극 후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 예열된 고정 용액 (200 μL; BD Biosciences)으로 10분 동안 고정시키고, DPBS 버퍼 (1 mL, Life Technologies)로 2회 세척하고, 4℃에서 30분 동안 빙냉한 Perm 버퍼 III (1000 μL, BD Biosciences)에 재현탁하였다. 세포를 DPBS 중 2% FBS (FACS 버퍼)로 2회 세척하고, 그 다음에 60분 동안 실온의 어두운 곳에서 항-CD4 PE (1:50 희석) 및 항-CD3 항-CD3 Alexa Fluor 647 (1:5 희석)을 함유하는 FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 FACS 버퍼에서 2회 세척하고, 그 후에 LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. IL-2/항-CD3에 반응하는 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, pSTAT5의 중간값 형광 세기 (MFI)를 CD4+ T 세포에서 측정하였다. IC50 값은 MFI 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다.
분석 11: 세포 JAK 효능 분석: CD3+ T 세포에서 IL-4 자극된 pSTAT6의 억제
인터루킨-4 (IL-4) 자극된 STAT6 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 효능은 유세포 분석기를 사용하여 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 단리된 인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 중에 CD3-포지티브 (CD3+) T 세포에서 측정될 수 있다. IL-4는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다.
CD3+ T 세포는 피코에리트로빌린 (PE) 접합된 항-CD3 항체 (Clone UCHT1, BD Biosciences)를 사용하여 동정하고, Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT6 항체 (pY641, Clone 18/P, BD Biosciences)를 사용하여 STAT6 인산화를 검출하였다.
인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)는 상기 분석 9 및 10에서와 같이 건강한 공여자의 인간 전혈로부터 단리하였다. 세포를 배지 (200 μL) 중에 250,000 세포/웰로 시딩하고, 1시간 동안 배양한 다음에, 다양한 농도의 시험 화합물을 함유하는 분석 배지 (50 μL) (0.1% 우혈청 알부민 (Sigma), 2mM 글루타맥스, 25mM HEPES 및 1X Penstrep이 보충된 RPMI)에 재현탁하였다. 화합물을 DMSO에서 연속하여 희석하고, 그 다음에 분석 배지에서 500-배로 (2x 최종 분석 농도까지) 더 희석하였다. 시험 화합물 (50　μL)을 세포와 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 예열된 분석 배지에 IL-4 (50　μL) (R&D Systems; 최종 농도 20 ng/mL)를 30분 동안 부가하였다. 사이토킨 자극 후에, 세포를 예열된 고정 용액 (100 μL) (BD Biosciences)으로 10분 동안 37℃, 5% CO2에서 고정시키고, FACS 버퍼 (1 mL) (DPBS 중 2% FBS)로 2회 세척하고, 4℃에서 30분 동안 빙냉한 Perm 버퍼 III (1000 μL) (BD Biosciences)에 재현탁하였다. 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척하고, 그 다음에 60분 동안 실온의 어두운 곳에서 항-CD3 PE (1:50 희석) 및 항-pSTAT6 Alexa Fluor 647 (1:5 희석)을 함유하는 FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 FACS 버퍼에서 2회 세척하고, 그 후에 LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
IL-4에 반응하는 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, pSTAT6의 중간값 형광 세기 (MFI)를 CD3+ T 세포에서 측정하였다. IC50 값은 MFI 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다.
분석 12: 세포 JAK 효능 분석: CD3+ T 세포에서 IL-6 자극된 pSTAT3의 억제
분석 11과 유사한 프로토콜을 사용하여 인터루킨-6 (IL-6) 자극된 STAT3 인산화의 억제에 대한 시험 화합물의 효능을 결정할 수 있다. Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT3 항체 (pY705, Clone 4/P, BD Biosciences)를 사용하여 STAT3 인산화를 검출하였다.
분석 13: 폐의 알터나리아 알터나타 ( Alternaria alternata )-유발된 호산구성 염증의 뮤린 모델
기도 호산구증가증 (eosinophilia)은 인간 천식의 특징이다. 알터나리아 알 터나타는 인간에서 천식을 악화시키고, 마우스의 폐에서 호산구성 염증을 유발할 수 있는 진균 공기알레르겐 (fungal aeroallergen)이다 (Havaux et al. Clin Exp Immunol. 2005 Feb;139(2):179-88). 마우스에서, 알터나리아는 폐에서 조직 정주 (tissue resident) 타입 2 선천성 림프구 세포 (innate lymphoid cells)를 간접적으로 활성화시키고, 이는 (예: IL-2 및 IL-7)에 반응하고, JAK-의존성 사이토킨 (예: IL-5 및 IL-13)을 분비하며, 호산구성 염증을 조정하는 것이 입증되었다 (Bartemes et al. J Immunol. 2012 Feb 1;188(3):1503-13).
Taconic의 7주령 내지 9주령의 수컷 C57 마우스를 본 연구에 사용할 수 있다. 연구 당일에, 동물들을 이소플루란으로 가볍게 마취시키고, 비히클 또는 시험 화합물 (0.03 - 1.0 mg/mL, 수회의 호흡에 걸쳐 50 μL 전체 부피)을 구인두 (oropharyngeal) 흡인을 통해 투여하였다. 동물들을 투여 후에 측면 횡와위로 놓고, 마취로부터 완전히 회복되는 동안 모니터링하고 이후 이들을 홈 케이지로 되돌려 보냈다. 1시간 후에, 동물들을 다시 한번 간단히 마취시키고, 비히클 또는 알터나리아 추출물 (전달된 전체 추출물 200 μg, 50 μL 전체 부피)로 구인두 흡인을 통해 챌린지시킨 후에 마취로부터 회복되는 동안 모니터링하였고, 이후 이들을 홈 케이지로 되돌려 보냈다. 알터나리아를 투여하고 48시간 후에, 기관지폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid: BALF)을 수집하고, 호산구를 BALF에서 Advia 120 Hematology System (Siemens)을 사용하여 계수하였다. 상기 모델에서 활성은 비히클로 처리되고 알터나리아로 챌린지된 대조군 동물과 비교하여, 48시간에서 처리된 동물의 BALF에 존재하는 호산구 수준의 감소로 입증되었다. 데이터는 비히클로 처리되고 알터나리아로 챌린지된 BALF 호산구 반응의 억제 퍼센트로 표시하였다. 억제 퍼센트를 산출하기 위해, 각 조건에 대해 BALF 호산구 수는 평균 비히클로 처리되고 알터나리아로 챌린지된 BALF 호산구의 퍼센트로 변환되고, 이를 100 퍼센트로부터 차감하였다.
분석 14: 세포 JAK 효능 분석: IFNγ -유발 pSTAT1의 억제
인터페론 감마 (IFNγ) 자극된 STAT1 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 효능은 유세포 분석기를 사용하여 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 유래된 CD14-포지티브 (CD14+) 단핵구에서 측정하였다. IFNγ는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다.
단핵구는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate: FITC) 접합된 항-CD14 항체 (Clone RM052, Beckman Coulter)를 사용하여 동정하였고, Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT1 항체 (pY701, Clone 4a, BD Biosciences)를 사용하여 STAT1 인산화를 검출하였다.
인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)는 ficoll 구배를 사용하여 건강한 공여자의 인간 전혈로부터 단리하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서, 10% 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2 mM 글루타맥스 (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI (Life Technologies)에서 배양하였다. 세포를 배지 (200 μL)에서 250,000 세포/웰로 시딩하고, 2시간 동안 배양하고, 다양한 농도의 시험 화합물을 함유하는 분석 배지 (50 μL) (0.1% 우혈청 알부민 (Sigma), 2 mM 글루타맥스, 25 mM HEPES 및 1X Penstrep이 보충된 RPMI)에 재현탁하였다. 상기 화합물을 DMSO에서 연속하여 희석하고, 그 다음에 배지에서 1000-배 더 희석하여 최종 DMSO 농도를 0.1%로 하였다. 시험 화합물 희석물을 세포와 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 배지 (50 μL)에 예열된 IFNγ (R&D Systems)를 최종 농도 0.6　ng/mL로 30분 동안 부가하였다. 사이토킨 자극 후에, 세포를 예열된 고정 용액 (100 μL) (BD　Biosciences)으로 10분 동안 37℃, 5% CO2에서 고정시키고, FACS 버퍼 (1　mL) (PBS 중 1% BSA)로 2회 세척하고, 1:10의 항-CD14 FITC:FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하고, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 한번 세척하고, 그 다음에 4℃에서 30분 동안 빙냉한 Perm 버퍼 III (BD Biosciences) (100 μL)에 재현탁하였다. 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척하고, 그 다음에 30분 동안 실온의 어두운 곳에서 1:10의 항-pSTAT1 Alexa Fluor 647:FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하고, FACS 버퍼에서 2회 세척하고, MACSQuant 유세포 분석기 (Miltenyi)를 사용하여 분석하였다.
시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, pSTAT1의 중간값 형광 세기 (MFI)를 CD14+ 단핵구에서 측정하였다. IC50 값은 MFI 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 7.5로 나타났다.
분석 15: 세포 JAK 효능 분석: GM- CSF -유발 pSTAT5의 억제
과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 자극된 STAT5 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 효능은 유세포 분석기를 사용하여 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 유래된 CD14-포지티브 (CD14+) 단핵구에서 측정하였다. GM-CSF는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다.
단핵구는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 접합된 항-CD14 항체 (Clone RM052, Beckman Coulter)를 사용하여 동정하고, Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT5 항체 (pY694, BD Biosciences)를 사용하여 STAT5 인산화를 검출하였다.
인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)는 ficoll 구배를 사용하여 건강한 공여자의 인간 전혈로부터 단리하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서, 10% 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2 mM 글루타맥스 (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI (Life Technologies)에서 배양하였다. 세포를 배지 (200 μL)에 250,000 세포/웰로 시딩하고, 2시간 동안 배양하고, 다양한 농도의 시험 화합물을 함유하는 분석 배지 (50 μL) (0.1% 우혈청 알부민 (Sigma), 2 mM 글루타맥스, 25 mM HEPES 및 1X Penstrep이 보충된 RPMI)에 재현탁하였다. 상기 화합물을 DMSO에서 연속하여 희석하고, 그 다음에 배지에서 1000-배 더 희석하여 최종 DMSO 농도를 0.1%로 하였다. 시험 화합물 희석물을 세포와 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 배지 (50 μL)에 예열된 GM-CSF (R&D Systems)를 최종 농도 0.3　ng/mL로 15분 동안 부가하였다. 사이토킨 자극 후에, 세포를 예열된 고정 용액 (100 μL) (BD　Biosciences)으로 37℃, 5% CO2에서 10분 동안 고정시키고, FACS 버퍼 (1　mL) (PBS 중 1% BSA)로 2회 세척하고, 1:10의 항-CD14 FITC:FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하고, 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 한번 세척하고, 그 다음에 4℃에서 30분 동안 빙냉한 Perm 버퍼 III (BD Biosciences) (100 μL)에 재현탁하였다. 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척하고, 그 다음에 30분 동안 실온의 어두운 곳에서 1:10의 항-pSTAT1 Alexa Fluor 647:FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하고, FACS 버퍼에서 2회 세척하고, MACSQuant 유세포 분석기 (Miltenyi)를 사용하여 분석하였다.
시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, pSTAT5의 중간값 형광 세기 (MFI)를 CD14+ 단핵구에서 측정하였다. IC50 값은 MFI 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 6.9로 나타났다.
분석 16: 세포 JAK 효능 분석: IL-12-유발 pSTAT4의 억제
인터루킨-12 (IL-12) 자극된 STAT4 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 효능은 유세포 분석기를 사용하여 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 유래된 CD3-포지티브 (CD3+) T 세포에서 측정하였다. IL-12는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 척도를 제공한다.
CD3+ T 세포는 피코에리트린 (phycoerythrin: PE) 접합된 항-CD3 항체 (Clone UCHT1, BD Biosciences)를 사용하여 동정하고, Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT4 항체 (clone 38/p-Stat4, BD Biosciences)를 사용하여 STAT4 인산화를 검출하였다.
인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)는 ficoll 구배를 사용하여 건강한 공여자의 인간 전혈로부터 단리하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서, 10% 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2 mM 글루타맥스 (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies), 1X Pen/Strep (Life Technologies), 플레이트 결합된 정제된 항-CD3 항체 (5μg/ml, clone UCHT1, BD Biosciences) 및 가용성 항-CD28 항체 (1μg/ml, clone CD28.2, BD Biosciences)가 보충된 RPMI (Life Technologies)에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 수집하고, 배지로 세척한 다음에, 인터루킨-2 (IL-2, 10ng/ml, R&D Systems)를 함유하는 배지에 재현탁하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 수집하고, RPMI로 세척하고, 배지 (200 μL) 중에 250,000 세포/웰로 시딩하고, 2시간 동안 배양한 다음에, 다양한 농도의 시험 화합물을 함유하는 분석 배지 (50 μL) (0.1% 우혈청 알부민 (Sigma), 2 mM 글루타맥스, 25 mM HEPES 및 1X Penstrep이 보충된 RPMI)에 재현탁하였다. 화합물을 DMSO에서 연속하여 희석하고, 그 다음에 배지에서 1000-배 더 희석하여 최종 DMSO 농도를 0.1%로 하였다. 시험 화합물 희석물을 세포와 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 배지 (50 μL)에 예열된 IL-12 (R&D Systems)를 최종 농도 10　ng/mL로 30분 동안 부가하였다. 사이토킨 자극 후에, 세포를 예열된 고정 용액 (100 μL) (BD　Biosciences)으로 37℃, 5% CO2에서 10분 동안 고정시키고, FACS 버퍼 (1　mL) (PBS 중 1% BSA)로 2회 세척하고, 4℃에서 30분 동안 빙냉한 Perm 버퍼 III (1000 μL) (BD Biosciences)에 재현탁하였다. 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음에, 실온의 어두운 곳에서 45분 동안 항-CD3 PE (1:50의 희석) 및 항-pSTAT4 Alexa Fluor 647 (1:10의 희석)을 함유하는 FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 FACS 버퍼에서 2회 세척한 다음에, MACSQuant 유세포 분석기 (Miltenyi)를 사용하여 분석하였다. 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, pSTAT4의 중간값 형광 세기 (MFI)를 CD3+ T 세포에서 측정하였다. IC50 값은 MFI 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하였다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 6.0으로 나타났다.
분석 17: 혼합된 림프구 반응 분석에서 IFNγ 분비의 억제
혼합된 림프구 반응 분석 (mixed lymphocyte reaction assay)은 이식 거부 반응을 모방하는 인 비트로 분석이다. 한 공여자로부터의 T 세포를 다른 공여자로부터의 동종이형 수지상 세포와 배양하였다. 이 반응은 IFNγ 분비와 같은 세포 면역 반응을 유도한다.
CD14+ 단핵구는 ficoll 구배 및 자기 분리 (magnetic seperation) (CD14 마이크로비드, Miltenyi)를 사용하여 공여자 A의 인간 전혈 (Stanford blood center)로부터 단리하였다. 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서, 10% 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2mM 글루타맥스 (Life Technologies), 1X Pen/Strep (Life Technologies), 인터루킨-4 (IL-4, 50 ng/ml, R&D Systems) 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF, 50ng/ml, R&D Systems)가 보충된 RPMI (Life Technologies)에서 세포를 6일 동안 배양하여 단핵구를 수지상 세포로 분화시켰다. 수지상 세포를 수확하고, 배지로 세척한 다음에, 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 24시간 동안, 대장균 (Escherichia coli) 유래의 리포폴리사카라이드 (LPS, 100ng/ml, Sigma)를 함유하는 배지에서 세포를 배양함으로써 활성화시켰다. 세포를 수확하고, 배지로 세척하고, 배지에 400,000 세포/ml로 재현탁하고, 10,000 세포/웰/25 μl로 플레이팅하였다. CD4+ T 세포를 ficoll 구배 및 자기 분리 (CD4+ T 세포 단리 키트, Miltenyi)를 사용하여 공여자 B의 인간 전혈 (Stanford blood center)로부터 새로 단리하였다. T 세포를 10% 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2mM 글루타맥스 (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI (Life Technologies)에서 4,000,000 세포/ml로 재현탁하였다. CD4+ T 세포는 100,000 세포/웰/25μl로 수지상 세포와 혼합하였다. 세포를 시험 화합물 (20 μM, 2 μM 및/또는 0.2 μM에서 50 μl)로 최종 농도 10 μM, 1 μM 및/또는 0.1 μM로 처리하였다. 화합물을 디메틸 설폭시드 (DMSO, Sigma)에서 최종 농도 0.1%로 희석하였다. 0.1%의 DMSO를 비히클 대조군으로 사용하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 5일 동안 유지하였다. 5일차에, 상등액을 수집하고, 효소 결합된 면역흡착 분석 (ELISA)을 사용하여 인터페론 감마 (INFγ)를 측정하였다. 억제 퍼센트는 비히클 처리된 세포와 비교하여 IFNγ 분비에 대한 화합물 억제 효능에 의해 결정하였다. 데이터는 4명의 공여자의 평균이다. 화합물 1은 비히클 대조군과 비교하여, IFNγ 분비를 99% ± 0.4 (10 μM에서), 76% ± 10 (μM에서) 및 43% ± 12 (0.1 μM에서)만큼 억제할 수 있었다.
분석 18: 천식 공여자로부터 유래된 인간 3D 기도 배양물에서 자발적인 페리오스틴 및 IL-6 분비의 억제
EpiAirway 조직 배양물은 Mattek (AIR-100)으로부터 입수하였다. 세포는 Th2 매개 천식 (호산구성)과 관련된 모세포 단백질 (matricellular protein)인 페리오스틴 (periostin), 및 Th2 및 비-Th2 관련 천식 모두에서 역할을 하는 염증성 사이토킨인 인터루킨-6 (IL-6)을 자발적으로 분비하는 천식 공여자로부터 유래되었다. 세포 배양 인서트에서, 인간 유래 기관/기관지 상피 세포를 다공성 막 지지체에서 성장 및 분화시켜서, 세포 아래에 가온된 배양 배지와 위에 기체 시험 대기와의 공기-액체 계면을 형성하였다. 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 유지 배지 (Mattek, AIR-100-MM)에서 조직을 배양하였다. 4명의 공여자를 시험하였다. 0일차에, 조직 배양물은 10 μM, 1 μM 및/또는 0.1 μM로 액체 계면에서 시험 화합물로 처리하였다. 화합물을 디메틸 설폭시드 (DMSO, Sigma)에서 최종 농도 0.1%로 희석하였다. 0.1%의 DMSO를 비히클 대조군으로 사용하였다. 조직 배양물을 8일 동안 유지하였다. 배지는 화합물을 함유하는 새로운 배지로 2일마다 교체하였다. 8일차에, 상등액을 분석을 위해 수집하였다. 루미넥스 분석 (EMD Millipore)을 사용하여 페리오스틴 및 인터루킨-6 (IL-6)에 대해 상등액 샘플을 분석하였다. 데이터는 % 억제 +/- 표준 편차 (± STDV)로 표시하였다. 억제 퍼센트는 비히클 처리된 세포와 비교하여, 페리오스틴 및 IL-6의 자발적 분비에 대한 화합물 억제 효능에 의해 결정하였다. 데이터는 3명 또는 4명의 공여자의 평균이다. 화합물 1은 비히클 대조군과 비교할 때 자발적 페리오스틴 분비를 62% ±25 (10 μM에서) 및 40% ±28 (1 μM에서)만큼 억제할 수 있었다. 화합물 1은 비히클과 비교할 때 IL-6 분비를 91% ±9.0 (10 μM에서), 70% ±33 (1 μM에서) 및 10% ±40 (0.1 μM에서)만큼 억제할 수 있었다.
결정 구조
2.28 Å의 해상도에서 인간 JAK1에 결합된 화합물 C-1의 공-결정 구조 (co-crystal structure)를 수득하였다. 리간드는 ATP 결합 부위에서 결합하는 것으로 관찰되었다. 공여체 원자와 수용체 원자 사이의 거리가 3.5Å 이하인 것에 기반하여 7개의 특정 수소 결합 상호작용이 확인되었다. 특히, C-1 화합물의 엑소사이클릭 아마이드 (exocyclic amide)의 카보닐과 JAK1의 Arg879 측쇄 간에 수소 결합 상호작용이 확인되었다. 유사한 상호작용이 본 발명의 화합물에 대해 기대될 수 있다. 이전 모델링 연구에서, 이러한 상호작용은 다른 티로신 키나제에 비해 JAK1에 대한 선택성을 제공하는 방법으로 제시되었고, 다른 밀접하게 관련된 키나제 (예: TRKA, VEGFR, ABL1)는 동등한 위치에서 아르기닌 잔기를 갖지 않았기 때문이다. 결정 구조에서 수소 결합 상호작용의 관찰된 결과와 엑소사이클릭 아마이드를 갖지 않는 시리즈와 비교하여 향상된 키놈 선택성 (kinome selectivity)이 본 디자인 가설을 입증하였다.
본 발명은 이의 특정 양상 또는 구체예를 참조하여 기재되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있거나 균등물로 대체될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 또한, 적용 가능한 특허 법령 및 규정에 의해 허용되는 한, 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 문헌이 본원에서 개별적으로 통합된 것처럼 동일한 정도로 그 전문이 본원에 참조로 통합된다.

Claims (39)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00051

    상기에서:
    n은 0, 1 또는 2이고;
    R1은 C1-3 알킬이며;
    각 R2는 독립적으로 C1-3 알킬이다.
  2. 청구항 1에 있어서, 하기 화학식 (II)을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00052
    .
  3. 청구항 1에 있어서, 하기 화학식 (III)을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00053
    .
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1은 에틸, 프로필 및 이소프로필로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 n은 0인 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염.
  6. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 n은 1인 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염.
  7. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 n은 1이고, R2는 메틸인 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염.
  8. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00054
    .
  9. 하기 화학식 1의 화합물:
    Figure pct00055
    .
  10. 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00056
    .
  11. 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00057
    .
  12. 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00058
    .
  13. 하기 화학식 5의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00059
    .
  14. 하기 화학식 6의 화합물 또는 이의 약학적으로-허용 가능한 염:
    Figure pct00060
    .
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  16. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 호흡기 질환 치료에 사용하기 위한 화합물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄성 세기관지염, 사르코이드증, 호산구성 질환 (eosinophilic disease), 기생충 감염, 폐동맥 고혈압, 림프관평활근종증 (lymphangioleiomyomatosis), 기관지확장증, 침윤성 폐 질환, 약물-유발 폐렴, 진균-유발 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (allergic bronchopulmonary aspergillosis), 과민성 폐렴, 다발 혈관염 동반 호산구성 육아종증 (eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 특발성 급성 호산구성 폐렴, 특발성 만성 호산구성 폐렴, 과호산구증가 증후군 (hypereosinophilic syndrome), 뢰플러 증후군 (Loeffler syndrome), 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴 (bronchiolitis obliterans organizing pneumonia), 폐 이식편대 숙주 질환 (lung graft-versus-host disease) 및 면역-체크포인트-억제제 유발 폐렴으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환인 화합물.
  19. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 폐 이식 거부 반응 (lung transplant rejection)의 치료에 사용하기 위한 화합물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 원발성 이식 기능장애 (primary graft dysfunction), 기질화 폐렴 (organizing pneumonia), 급성 거부 반응, 림프구성 세기관지염 및 만성 폐 동종이식 기능장애 (chronic lung allograft dysfunction)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 급성 폐 이식 거부 반응인 화합물.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 만성 폐 동종이식 기능장애인 화합물.
  23. 청구항 19에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 폐쇄성 세기관지염, 제한성 만성 폐 동종이식 기능장애 및 호중구성 동종이식 기능장애로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  24. 포유동물에서 호흡기 질환 치료용 약제를 제조하기 위한, 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄성 세기관지염, 사르코이드증, 호산구성 질환, 기생충 감염, 폐동맥 고혈압, 림프관평활근종증, 기관지확장증, 침윤성 폐 질환, 약물-유발 폐렴, 진균-유발 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 과민성 폐렴, 다발 혈관염 동반 호산구성 육아종증, 특발성 급성 호산구성 폐렴, 특발성 만성 호산구성 폐렴, 과호산구증가 증후군, 뢰플러 증후군, 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴, 폐 이식편대 숙주 질환 및 면역-체크포인트-억제제 유발 폐렴으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용도.
  26. 청구항 24에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환인 용도.
  27. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 폐 이식 거부 반응 치료용 약제를 제조하기 위한 용도.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 원발성 이식 기능장애, 기질화 폐렴, 급성 거부 반응, 림프구성 세기관지염 및 만성 폐 동종이식 기능장애로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용도.
  29. 청구항 27에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 급성 폐 이식 거부 반응인 용도.
  30. 청구항 27에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 만성 폐 동종이식 기능장애인 용도.
  31. 청구항 27에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 폐쇄성 세기관지염, 제한성 만성 폐 동종이식 기능장애 및 호중구성 동종이식 기능장애로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용도.
  32. 포유동물에서 호흡기 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄성 세기관지염, 사르코이드증, 호산구성 질환, 기생충 감염, 폐동맥 고혈압, 림프관평활근종증, 기관지확장증, 침윤성 폐 질환, 약물-유발 폐렴, 진균-유발 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 과민성 폐렴, 다발 혈관염 동반 호산구성 육아종증, 특발성 급성 호산구성 폐렴, 특발성 만성 호산구성 폐렴, 과호산구증가 증후군, 뢰플러 증후군, 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴, 폐 이식편대 숙주 질환 및 면역-체크포인트-억제제 유발 폐렴으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  34. 청구항 32에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환인 방법.
  35. 포유동물에서 폐 이식 거부 반응을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로-허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 원발성 이식 기능장애, 기질화 폐렴, 급성 거부 반응, 림프구성 세기관지염 및 만성 폐 동종이식 기능장애로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  37. 청구항 35에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 급성 폐 이식 거부 반응인 방법.
  38. 청구항 35에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 만성 폐 동종이식 기능장애인 방법.
  39. 청구항 35에 있어서, 상기 폐 이식 거부 반응은 폐쇄성 세기관지염, 제한성 만성 폐 동종이식 기능장애 및 호중구성 동종이식 기능장애로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
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