BR112021004052A2 - amidas de dimetil-amino azetidina como inibidores de jak - Google Patents

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BR112021004052A2
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Daniel D. Long
Cameron Smith
Corbin Thompson
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Theravance Biopharma R&D Ip, Llc
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Abstract

A invenção oferece compostos de fórmula (I): (I) em que as variáveis estão definidas na especificação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico que são úteis como inibidores de JAK quinases. A invenção também oferece composições farmacêuticas compreendendo estes compostos, métodos de uso destes compostos para tratar doenças respiratórias e métodos de uso destes compostos para tratar doenças respiratórias.

Description

PATENTE Pauta do Advogado No.: P-342-PCT Número do Cliente: 27038 AMIDAS DE DIMETIL-AMINO AZETIDINA COMO INIBIDORES DE
JAK
HISTÓRICO DA INVENÇÃO Campo da invenção
[001] A invenção é dirigida a compostos úteis como inibidores da JAK quinase. A invenção também é dirigida a composições farmacêuticas que incluem estes compostos e métodos de uso destes compostos para tratar doenças respiratórias.
Estado da técnica
[002] A asma é uma doença crônica das vias respiratórias para a qual não há prevenção ou cura. A doença é caracterizada por inflamação, fibrose, hiper-responsividade e remodelamento das vias respiratórias, que contribuem para a limitação do fluxo de ar. Estima-se que 300 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de asma e que o número de pessoas com asma vai crescer em mais de 100 milhões até 2025. Nos Estados Unidos, a asma aflige cerca de 6% a 8% da população, fazendo dela uma das doenças crônicas mais comuns no país. Embora a maioria dos pacientes atinja o controle dos sintomas de asma com o uso de corticosteroides inalatórios que podem ser combinados com um modificador de leucotrieno e/ou um beta-agonista de longa ação, ainda existe um subconjunto de pacientes com asma grave, cuja doença não é controlada com terapias convencionais. A asma persistente grave é definida como doença que permanece não controlada em doses altas de corticoides inalatórios. Ao mesmo tempo em que os asmáticos graves são estimados em cerca de aproximadamente 5% de todos os doentes de asma, eles apresentam um alto risco de morbidade e mortalidade e são responsáveis por uma parte desproporcional do uso dos serviços de saúde entre os asmáticos. Permanece a necessidade de novas terapias para tratar estes pacientes.
[003] As citocinas são moléculas de sinalização intercelular que incluem quimiocinas, interferons, interleucinas, linfocinas e fator de necrose tumoral. As citocinas são essenciais para o crescimento celular normal e a imunorregulação, mas também guiam doenças imunomediadas e contribuem para o crescimento de células malignas. Níveis elevados de várias citocinas têm sido implicados na patologia da inflamação da asma. Por exemplo, as terapias baseadas em anticorpos direcionadas para interleucinas (IL)-5 e 13 demonstraram oferecer benefícios clínicos em subconjuntos de pacientes asmáticos graves. Entre as citocinas envolvidas na inflamação da asma, muitas agem por meio de vias de sinalização dependente da família Janus de tirosina quinases (JAKs), que sinalizam por meio da família de fatores de transcrição de Transdutor de sinal e Ativador de transcrição (STAT). As citocinas envolvidas na inflamação da asma que sinalizam pela via JAK-STAT incluem IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-l1, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, linfopoietina do estroma tímico (TSLP), gamainterferon (IFNy) e fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF).
[004] A família JAK compreende quatro membros, JAK1, JAK2, JAK3 e tirosina quinase 2 (TYK2). A ligação da citocina a um receptor de citocina dependente de JAK induz a dimerização do receptor, o que resulta na fosforilação de resíduos de tirosina na JAK quinase, ativando a JAK. As JAKs fosforiladas, por sua vez, se ligam e fosforilam várias proteínas STAT que dimerizam, internalizam no núcleo da célula e modulam diretamente a transcrição do gene, levando, entre outros efeitos, aos efeitos posteriores associados à doença inflamatória. As JAKs em geral se associam a receptores de citocina em pares como homodímeros e heterodímeros. As citocinas específicas estão associadas a pareamentos específicos de JAK. Cada um dos quatro membros da família JAK está envolvido na sinalização de pelo menos uma das citocinas associadas à inflamação da asma. Consequentemente, um inibidor químico com atividade global contra todos os membros da família JAK poderia modular uma ampla gama de vias pró-inflamatórias que contribuem para a asma grave.
[005] Entretanto, o amplo efeito anti-inflamatório destes inibidores podem suprimir a função das células imunológicas normais, levando potencialmente ao aumento do risco de infecção. A evidência do aumento do risco de infecção foi observada com o inibidor de JAK tofacitinibe, que é administrado por via oral para o tratamento da artrite reumatoide. Na asma, a inflamação está localizada no trato respiratório. A inflamação das vias respiratórias é característica de outras doenças respiratórias além da asma. A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC), pneumonite, doenças intersticiais pulmonares (incluindo a fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema e sarcoidose também são doenças do trato respiratório nas quais acredita-se que a fisiopatologia está relacionada às citocinas sinalizadoras de JAK. A administração local de um inibidor de JAK para os pulmões por inalação oferece o potencial de ser terapeuticamente eficaz ao fornecer um potente agente anti-citocina diretamente no local de ação, limitando a exposição sistêmica e limitando, portanto, o potencial para imunossupressão sistêmica adversa. Permanece a necessidade de um potente inibidor de JAK adequado para a administração local para os pulmões para tratamento de doença respiratória.
[006] As citocinas de sinalização de JAK desempenham também um papel importante na ativação das células T, um subtipo de células imunológicas que é fundamental para muitos processos imunológicos. A ativação patológica das células T é fundamental na etiologia de várias doenças respiratórias. As células T autorreativas desempenham um papel na bronquiolite obliterante com pneumonia em organização (também chamada COS). Similar à COS, a etiologia das rejeições de transplante pulmonar está associada a uma ativação aberrante das células T do receptor pelo pulmão transplantado do doador. As rejeições de transplante pulmonar podem ocorrer cedo como disfunção primária do enxerto (PGD), pneumonia em organização (PO), rejeição aguda (RA) ou bronquiolite linfocítica (BL) ou podem ocorrer anos após o transplante pulmonar como disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD). A CLAD era anteriormente conhecida como bronquiolite obliterante (BO), mas agora é considerada uma
Síndrome que pode ter diferentes manifestações patológicas, incluindo BO, CLAD restritiva (rCLAD ou RAS) e disfunção neutrofílica do aloenxerto.
A disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD) é um grande desafio para o manejo de longo prazo dos receptores de transplante pulmonar, pois faz com que o pulmão transplantado perca progressivamente sua funcionalidade (Gauthier et al., Curr.
Transplant.
Rep., 2016, 3(3), 185-191). A CLAD é pouco sensível ao tratamento e, portanto, permanece a necessidade de compostos eficazes capazes de prevenir ou tratar esta condição.
Várias citocinas dependentes de JAK, como IFN] e IL-5 são reguladas positivamente na CLAD e na rejeição do transplante de pulmão (Berastegui et al, Clin.
Transplant. 2017, 31, e12898). Além disso, altos níveis de quimiocinas CXCR3 pulmonares como CXCL9 e CXCL10 que estão a jusante da sinalização de IFN dependente de JAK estão relacionados a piores desfechos nos pacientes submetidos a transplante de pulmão (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). A inibição sistêmica de JAK demonstrou ser eficaz na rejeição do transplante renal (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). Portanto, os inibidores de JAK têm o potencial para serem eficazes no tratamento ou prevenção da rejeição do transplante pulmonar e CLAD.
Eventos semelhantes de ativação de células T, como descritos como a base para a rejeição do transplante pulmonar, também são considerados o principal fator da doença do enxerto pulmonar contra o hospedeiro (GVHD), que pode ocorrer após os transplantes de células-tronco hematopoéticas.
Similar à CLAD, a GVHD pulmonar é uma condição progressiva com desfechos extremamente ruins e não existe tratamento atualmente aprovado. Um estudo de pesquisa multicêntrico retrospectivo de 95 pacientes com GVHD aguda ou crônica refratária à esteroide que receberam o inibidor sistêmico de JAK ruxolitinibe como terapia de resgate demonstrou resposta completa ou parcial para ruxolitinibe na maioria dos pacientes, incluindo aqueles com GVHD pulmonar (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). Como a inibição sistêmica do JAK está associada a eventos adversos graves e um pequeno índice terapêutico, permanece a necessidade de um inibidor não sistêmico de JAK, direcionado ao pulmão para evitar e/ou tratar a rejeição do transplante pulmonar ou GVHD pulmonar.
RESUMO DA INVENÇÃO
[007] Em uma modalidade, a invenção oferece novos compostos com atividade como inibidores da JAK quinase. Portanto, a invenção oferece um composto de fórmula (1): HO. O O j (R?» CE, un N Ng V
H (1) em que: n é 0, 1 ou 2; R!' ser Ci 3zalquil e cada R? ser independentemente de C,i-zalquil; ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[008] À invenção também oferece uma composição farmacêutica que compreende um composto da invenção e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[009] A invenção também oferece um método para o tratamento de doenças respiratórias inflamatórias, em especial, asma e CLAD, em um mamífero, o método compreendendo a administração ao mamífero de um composto ou uma composição farmacêutica da invenção.
[0010] A invenção também oferece um composto da invenção como aqui descrito para uso na terapia médica, assim como o uso de um composto da invenção na fabricação de uma formulação ou medicamento para tratar doenças respiratórias em um mamífero.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0011] Em uma modalidade, a invenção oferece compostos com atividade como um inibidor da JAK quinase. Portanto, a invenção oferece um composto de fórmula (1): HO.
O O j (R» CE, un N Ng V
H (1) em que: n é 0, 1 ou 2; R!' ser Ci 3zalquil e cada R? ser independentemente de C;-3zalquil; ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
Em algumas modalidades, o composto tem a fórmula (II):
HO.
O o O (Rh
N | NO ENKO ON Ng À
NO (11) . Em algumas modalidades, o composto tem a fórmula (III): Ho. o : o 2 N R' E | NX HN ON Ng V
NH (111) .
[0012] Em algumas modalidades, R' é selecionado a partir do grupo composto por etil, propil e isopropil. Em algumas modalidades, n é O. Em algumas modalidades, n n é 1. Em algumas modalidades, n é 1 e Rº é metil.
[0013] En outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 1: Ho.
CÇ o
N
O E O HNK à N À NON Tr 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0014] En outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 1: Ho.
CÇ o
N O DT NON
HNK N N À NON rr i 1
[0015] Em outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 2 HO. O 3
N O o Ox / N À DN | HN-N À 2 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0016] Em outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 2 HO. O 3
N O Da O / N À TN | HN-N R 2
[0017] Em outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 3 HO. O 3
N
QUA d N À DN | HN-N À 3 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0018] Em outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 3 HO. O 3
N O Da My / N À HNÁ ON a -N Ns : 3
[0019] Em outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 4 HO. CÇ 3
N O » My
NON À // meo NO 4 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0020] Em outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 4 HO. O 3
N O N Ky
VN N À // mo NO 4
[0021] En outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 5 HO. O 3
N O N On
VN ON À // HN-N ON A ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0022] En outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 5 HO. O 3
N O N On
NON À // HN-N ON AL 5
[0023] En outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 6 HO.
O 3
N O » My
VN N À // HN-N ON AL 6 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0024] Em outra modalidade, a invenção oferece um composto de fórmula 6 HO.
O 3
N O N Ly
VN ON À // HN-N ON LL 6
[0025] As estruturas químicas são nomeadas neste documento de acordo com as convenções da IUPAC como implementado no programa ChemDraw (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA). Composto 1 é designado como (S) - (3- (dimetilamino)azetidin-l1- 11) (2- (6- (2-etil-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5- isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il)metanona.
[0026] Além disso, a porção imidazo do grupo tetrahidroimidazopiridina existe em formas tautoméricas, ilustradas abaixo para um fragmento dos compostos da divulgação
H DT WA | HNNO Hd HN=N ON
A B
[0027] De acordo com a convenção da IUPAC, estas representações dão origens a diferentes numerações dos átomos da porção imidazol. (1H-indazol-3-il)-4,5,6,7- tetrahidro-lH-imidazo[4,5-c]piridina (estrutura A) versus (1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5- cl]lpiridina (estrutura B). Deve-se compreender que, embora as estruturas sejam apresentadas ou nomeadas, em uma forma específica, a invenção também inclui seu tautômero.
[0028] Os compostos da divulgação podem conter um ou mais centros quirais; portanto, tais compostos (e seus intermediários) podem existir como misturas racêmicas, estereoisômeros puros (por ex., enantiômeros ou diastereômeros), misturas enriquecidas com estereoisômeros e semelhantes. Os compostos quirais mostrados ou nomeados neste documento sem uma estereoquímica definida em um centro quiral destinam-se a incluir qualquer uma ou todas as possíveis variações de estereoisômero no estereocentro indefinido, salvo indicação em contrário. A representação ou nomeação de um determinado estereoisômero significa o estereocentro indicado tem a estereoquímica designada, com a compreensão de que pequenas quantidades de outros estereoisômeros também “podem estar presentes, salvo indicação em contrário, desde que a utilidade do composto descrito ou chamado não seja eliminada pela presença de outro estereoisômero.
[0029] Os compostos da divulgação também podem comter vários grupos básicos (p.ex., grupos amino); portanto, estes compostos podem existir como a base livre ou em várias formas de sal, como uma forma de sal monoprotonado, diprotonado,
triprotonado, ou suas misturas. Todas estas formas estão incluídas no escopo desta invenção, salvo indicação em contrário.
[0030] A presente invenção inclui também compostos da fórmula (1), (II) e (III) marcados com isótopos, ou seja, compostos da fórmula (1), (II) e (III), em que um ou mais átomos foram substituídos ou enriquecidos com um átomo com o mesmo número atômico, mas com massa atômica diferente da que predomina na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados em um composto de fórmula (1), (II) e (III incluem, mas não estão limitados a 2H, 3H, “UC, 4ºC, 4C, *?N, 15N, 150, 410, 1º0,. De especial interesse são os compostos da fórmula (1), (II) e (III), enriquecidos com trítio, Ou carbono-l14, que podem ser usados, por exemplo, em estudos de distribuição tecidual. De especial interesse são também compostos de fórmula (1), (II) e (III), enriquecidos com deutério, especialmente em um sítio do metabolismo, cujos compostos tenham maior estabilidade metabólica. Além disso, de especial interesse são compostos de fórmula (1), (II) e (III), enriquecidos com um isótopo emissor de pósitrons, como, por exemplo, "'C, “O e **N, cujos compostos podem ser utilizados, por exemplo, em estudos de Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET).
Definições
[0031] Ao descrever esta invenção, incluindo seus diversos aspectos e formas, os seguintes termos têm o seguinte significado, salvo indicação em contrário.
[0032] O termo "alquil" significa um grupo de hidrocarbonetos monovalentes saturados que pode ser linear ou ramificado ou suas combinações. Salvo definição em contrário, estes grupos alquil normalmente contêm de 1 a 10 átomos de carbono. Os grupos alquil representativos incluem, por exemplo, metil (Me), etil (Et), n-propil (n-Pr) ou (nPr), isopropil (i-Pr) ou (iPr), n-butil (n-Bu) ou (nBu), sec- butil, isobutil, terc-butil (t-Bu) ou (tBu), n-pentil, n- hexil, 2,2-dimetilpropil, 2-metilbutil, 3-metilbutil, 2- etilbutil, 2,2-dimetilpentil, 2-propilpentil, e semelhantes.
[0033] Quando um determinado número de átomos de carbono é destinado para um termo determinado, o número de átomos de carbono é mostrado antes do termo. Por exemplo, o termo "C1- ; alquil” significa um grupo alquil com 1 a 3 átomos de carbono, caracterizado pelos átomos de carbono estarem em qualquer configuração quimicamente aceitável, incluindo configurações lineares ou ramificadas.
[0034] O termo "cicloalquil" significa um grupo carbocíclico monovalente saturado que pode ser monocíclico ou multicíclico. Salvo definição em contrário, estes grupos cicloalquil normalmente têm de 3 a 10 átomos de carbono. Os grupos representantes de cicloalquil incluem, por exemplo, ciclopropil (cPr), ciclobutil (cBu), ciclopentil, ciclohexil, cicloheptil, ciclooctil, adamantil e semelhantes.
[0035] O termo "heterociclil", "heterociclo", "heterocíclico" ou "anel heterocíclico" significa um grupo cíclico não aromático monovalente saturado ou parcialmente insaturado, com 3 a 10 átomos de anel totais, caracterizado pelo anel conter de 2 a 9 átomos de carbono e de 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Os grupos heterocíclicos podem ser monocíclicos ou multicíclicos (ou seja, unidos ou ligados por pontes). Os grupos “representativos de heterocíclicos incluem, por exemplo, pirrolidinil, piperidinil, piperazinil, imidazolidinil, morfolinil, tiomorfolil, indolin-3-il, 2-imidazolinil, tetrahidropiranil, 1,2,3,4- tetrahidroisoquinolin-2-il, quinuclidinil, 7 azanorbornanil, nortropanil, e semelhantes, caracterizado pelo ponto de fixação estar em qualquer átomo de carbono ou nitrogênio disponível no anel. Quando o contexto torna o ponto de fixação do grupo heterocíclico evidente, estes grupos podem, alternativamente, ser referidos como uma espécie não valente, isto é, pirrolidina, piperidina, piperazina, imidazol, tetrahidropirano etc.
[0036] O termo "halo" significa flúor, cloro, bromo ou iodo.
[0037] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade suficiente para realizar o tratamento quando administrada a um paciente que necessita de tratamento.
[0038] O termo “para tratar” ou “tratamento” significa atenuar ou suprimir a doença ou distúrbio médico a ser tratado (p.ex., uma doença respiratória) um paciente (em especial, um humano) ou aliviar os sintomas da condição, doença ou distúrbio médico.
[0039] O termo "sal aceitável do ponto de vista farmacêutico" significa um sal que é aceitável para a administração a um paciente ou a um mamífero, como um humano (por exemplo, sais com segurança aceitável em mamíferos para um determinado regime de dosagem). Os sais representativos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico incluem sais de ácido acético, ascórbico, benzenossulfônico, benzóico, canforsulfônico, cítrico, etanossulfônico, edisílico, fumárico, gentísico, glicônico, glicurônico, glutâmico, hipúrico, bromídrico, clorídrico, isetionônico, lático, lactobiônico, maléico, málico, mandélico, metanossulfônico, múcico, naftalenossulfônico, naftaleno-1l,5-dissulfônico, naftaleno-2,6-dissulfônico, nicotínico, nítrico, orótico, pamóico, pantotênico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenossulfônico e xinafoico e semelhantes.
[0040] O termo "seu sal” significa um composto formado quando o hidrogênio de um ácido é substituído por um cátion, como um cátion de metal ou um cátion orgânico e semelhantes. Por exemplo, o cátion pode ser uma forma protonada de um composto da fórmula (1), (II) e (III), ou seja, uma forma na qual um ou mais grupos amino foram protonados por um ácido. Normalmente, o sal é um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, embora isto não seja necessário para sais de compostos intermediários que não são destinados para administração a um paciente.
Procedimentos gerais de síntese
[0041] Os compostos deste invenção e seus intermediários podem ser preparados de acordo com os seguintes métodos e procedimentos gerais, utilizando materiais de partida e reagentes disponíveis comercialmente ou preparados na rotina. Os substituintes e variáveis (por exemplo, R!, Rº?, n, etc.) usados nos esquemas a seguir têm o mesmo significado como os definidos neste documento, salvo indicação em contrário. Além disso, compostos com um átomo ácido ou básico ou grupo funcional podem ser usados ou produzidos como um sal, salvo indicação em contrário (em alguns casos, o uso de um sal em uma reação especial vai exigir a conversão do sal para a forma não sal, por exemplo, uma base livre, usando procedimentos de rotina antes de realizar a reação).
[0042] Embora uma determinada modalidade desta invenção possa ser mostrada ou descrita nos procedimentos a seguir, aqueles que são versados na técnica vão reconhecer que outras modalidades desta invenção também podem ser preparadas com tais procedimentos, ou usando outros métodos, reagentes e materiais conhecidos por aqueles que são versados na técnica. Em especial, será percebido que os compostos da invenção podem ser preparados por várias vias de processo em que os reagentes são combinados em diferentes ordens para fornecer diferentes intermediários a caminho para a produção dos produtos finais.
[0043] Un método geral de preparação dos compostos finais da invenção é ilustrado no Esquema a seguir.
SB % à NA FB o SR ço nO A CN DIES — Bane o O RAIOS CE Mm Ad mo SR xs wss 0
[0044] O composto K-18 reage com uma cetona ou um aldeído na presença de um agente redutor para fornecer o composto de fórmula K-19. O composto K-19 reage em seguida com uma azetidina substituída sob condições de formação de ligação de amida típica para obter o composto (1) Tipicamente, o ácido carboxílico entra em contato com cerca de 1 a 4 equivalentes da azetidina substituída na presença de um excesso de base. A reação de formação da ligação amida pode utilizar agentes de acoplamento, como hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)urônio (HATU) ou outros agentes amida de acoplamento conhecidos na técnica. A hidrazina pode ser adicionada para clivar subprodutos indesejáveis. A reação é tipicamente conduzida em temperatura ambiente por cerca de 5 minutos e 24 horas ou até que a reação esteja consideravelmente concluída.
Composições farmacêuticas
[0045] Os compostos da invenção e seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico são normalmente usados na forma de uma composição ou formulação farmacêutica. Estas composições farmacêuticas podem ser vantajosamente administrada a um paciente por inalação. Além disso, as composições “farmacêuticas podem ser administradas por qualquer via de administração aceitável, incluindo, mas não se limitando a modos de administração oral, tópico (incluindo transdérmico), retal, nasal, inalação, e parenteral.
[0046] Consequentemente, em um de seus aspectos de composição, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica compreendendo um carreador ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico e um composto da fórmula (1), (II) e (III), na qual, como definido acima, "composto da fórmula (1), (II) e (IILI)" significa um composto da fórmula (1), (II) e (III) ou seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico. Opcionalmente, estas composições farmacêuticas podem conter outros agentes de terapêuticos e/ou formulação se desejado. Quando falamos de composições e seus usos, "o composto da invenção" também pode ser aqui referido como o "agente ativo". Como usado neste documento, o termo "composto da invenção" destina-se a incluir todos os compostos abrangidos pela fórmula (1), assim como as espécies contidas na fórmula (I) e seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.
[0047] As composições farmacêuticas da invenção contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto desta invenção. Aqueles que são versados na técnica vão reconhecer, porém, que uma composição farmacêutica pode conter mais de uma quantidade terapeuticamente eficaz, ou seja, composições a granel ou menos de uma quantidade terapeuticamente eficaz, ou seja, doses unitárias individuais projetadas para a administração múltipla para atingir uma quantidade terapeuticamente eficaz.
[0048] Normalmente, estas composições farmacêuticas conterão cerca de 0,01 a 95%, em peso, do agente ativo, incluindo, por exemplo, a partir de cerca de 0,05 a 30%, em peso, do agente ativo e a partir de cerca de 0,1% a cerca de 10% em peso do agente ativo.
[0049] Qualquer carreador ou excipiente convencionais pode ser usado nas composições farmacêuticas da invenção. A escolha de um determinado carreador ou excipiente, Ou combinações de carreadores ou excipientes, dependerá do modo de administração a ser usado para tratar um paciente em especial ou tipo de condição médica ou estado de doença. Neste contexto, a preparo de uma composição farmacêutica adequada para um determinado modo de administração está bem dentro do escopo daqueles que são versados na técnica farmacêutica. Além disso, os carreadores ou excipientes usados nas composições farmacêuticas desta invenção estão comercialmente disponíveis. Por meio de outra ilustração, as técnicas de formulação convencionais estão descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Mariland (2000); e H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).
[0050] Exemplos representativos de materiais que podem servir como carreadores aceitáveis do ponto e vista farmacêutico incluem, mas não estão limitados aos seguintes: açúcares, como lactose, glicose e sacarose; amidos, como O amido de milho e fécula; celulose, como celulose microcristalina, e seus derivados, como a carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, como a manteiga de cacau e ceras de supositórios; óleos, como óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicois, como propilenoglicol; poliois, como a glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres, como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes, como o hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água apirogênica; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções tamponadas com fosfato e outras substâncias não-tóxicas compatíveis empregadas em composições farmacêuticas.
[0051] As composições farmacêuticas são geralmente preparadas ao agitar ou misturar completa e eficientemente o agente ativo com um carreador e um ou mais ingredientes opcionais aceitos do ponto de vista farmacêutico. A mistura agitada uniformemente resultante pode em seguida ser moldada ou carregada em comprimidos, cápsulas, comprimidos e usando procedimentos e equipamentos convencionais.
[0052] Em uma modalidade, a composição farmacêutica é adequada para administração por inalação. As composições farmacêuticas adequada para administração por inalação são tipicamente na forma de aerossol ou pó. Estas composições são geralmente administradas usando dispositivos de liberação por inalação, como um inalador de pó seco (DPI), um inalador dosimetrado (IDM), um inalador nebulizador ou um dispositivo de liberação semelhante.
[0053] En uma modalidade especial, a composição farmacêutica é administrada por inalação através de um inalador de pó seco. Estes inaladores de pó seco normalmente administram a composição farmacêutica como um pó de fluxo livre que é dispersado na corrente de ar do paciente durante a inspiração. Para obter uma composição em pó de fluxo livre, o agente terapêutico geralmente é formulado com um excipiente adequado como lactose, amido, manitol, dextrose, ácido polilático (PLA), poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) ou suas combinações. Tipicamente, o agente terapêutico é micronizado e combinado com um carreador adequado para formar uma composição adequada para inalação.
[0054] Uma composição farmacêutica representativa para uso em um inalador de pó seco compreende lactose e um composto da invenção na forma micronizada. Esta composição de pó seco pode ser preparada, por exemplo, combinando lactose seca e triturada com o agente terapêutico e em seguida misturar os componentes a seco. A composição é normalmente carregada em um dispensador de pó seco ou em cartuchos ou cápsulas de inalação para uso em um dispositivo de liberação de pó seco.
[0055] Os dispositivos de distribuição dos inaladores de pó seco adequados para administrar os agentes terapêuticos são descritos na técnica e exemplos destes dispositivos estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, os dispositivos ou produtos de liberação inalador de pó seco incluem Aeolizer (Novartis); Airmax (IVAX); ClickHaler (Innovata Biomed); Diskhaler (GlaxoSmithKline); Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline); Ellipta (GlaxoSmithKline); Easyhaler (Orion Pharma); Eclipse (Aventis); Flowcaps (Hovione); Handihaler (Boehringer Ingelheim); Pulvinal (Chiesi); Rotahaler (GlaxoSmithKline); SkyeHaler/Certihaler (SKkyePharma); Twisthaler (Schering-Plough); Turbuhaler (Astrazeneca); Ultrahaler (Aventis); e semelhantes.
[0056] En uma modalidade especial, a composição farmacêutica é administrada por inalação através de um inalador dosimetrado. Tais inaladores dosimetrados descarregam uma quantidade medida de um agente terapêutico usando um gás propulsor comprimido. Consequentemente, as composições farmacêuticas administradas usando um inalador dosimetrado tipicamente compreendem uma solução ou suspensão do agente terapêutico em um propelente liquefeito. Qualquer propelente liquefeito adequado pode ser empregado inclusive hidrofluoroalcanos (HFAsS), como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) e 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano, (HFA 227);
e clorofluorocarbonos, como CCl;F. Em uma modalidade especial, o propelente são hidrofluoroalcanos. Em algumas modalidades, a formulação de hidrofluoroalcano contém um cossolvente, como etanol ou pentano e/ou um surfactante, como trioleato de sorbinato, ácido oleico, lecitina e glicerina.
[0057] Uma composição farmacêutica representativa para uso em um inalador dosimetrado compreende a partir de cerca de 0,01% a cerca de 5% em peso de um composto da invenção; a partir de cerca de 0% a cerca de 20% em peso de etanol e a partir de cerca de 0% a cerca de 5% por peso de surfactante, com o remanescente sendo um propelente HFA. Tais composições são normalmente preparadas pela adição de hidrofluoroalcano refrigerado ou pressurizado a um recipiente apropriado contendo o agente terapêutico, etanol (se presente) e o surfactante (se presente). Para preparar uma suspensão, O agente terapêutico é micronizado e em seguida combinado com o propelente. A composição é em seguida carregada em um recipiente aerossol, que normalmente faz parte de um dispositivo inalador dosimetrado.
[0058] Os dispositivos inaladores dosimetrados adequados para administrar os agentes terapêuticos são descritos na técnica e exemplos destes dispositivos estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, os dispositivos ou produtos inaladores dosimetrados representantes incluem AeroBid Inhaler System (Forest Pharmaceuticals); Atrovent Inhalation Aerosol (Boehringer Ingelheim); Flovent (GlaxoSmithKline); Maxair Inhaler (3M); Proventil Inhaler
(Schering); Serevent Inhalation Aerosol (GlaxoSmithKline) e semelhantes.
[0059] En uma modalidade especial, a composição farmacêutica é administrada por inalação através de um inalador nebulizador. Estes dispositivos nebulizadores geralmente produzem uma corrente de ar de alta velocidade que faz com que a composição farmacêutica pulverize como uma névoa, transportada para o trato respiratório do paciente. Consequentemente, quando formulado para uso em um inalador nebulizador, o agente terapêutico pode ser dissolvido em um carreador adequado para formar uma solução. Por outro lado, o agente terapêutico pode ser micronizado ou nanotriturado e combinado com um carreador adequado para formar uma suspensão.
[0060] Uma composição farmacêutica representativa para uso em um inalador nebulizador compreende uma solução ou suspensão compreendendo a partir de cerca de 0,05 ug/ml a cerca de 20 mg/ml de um composto da invenção e excipientes compatíveis com as formulações nebulizadas. Em uma modalidade, a solução tem um pH de cerca de 3 a cerca de 8.
[0061] Os dispositivos nebulizadores adequados para administrar os agentes terapêuticos são descritos na técnica e exemplos destes dispositivos estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, dispositivos ou produtos nebulizadores representantes incluem o Respimat Softmist Inhalaler (Boehringer Ingelheim); the AERXx Pulmonary Delivery System (Aradigm Corp.); the PARI LC Plus Reusable Nebulizer (Pari GmbH); e semelhantes.
[0062] Ainda em outra modalidade, as composições farmacêuticas da invenção podem, alternativamente, ser preparadas em uma forma de dosagem destinada para a administração por via oral. As composições farmacêuticas adequadas para administração por via oral podem estar na forma de cápsulas, comprimidos, pastilhas, pílulas, drágeas, pós, grânulos, ou como uma solução ou suspensão em um líquido aquoso ou não-aquoso, como uma emulsão líquida óleo em água ou água em óleo ou como um elixir ou xarope e semelhantes, cada uma contendo uma quantidade pré-determinada de um composto desta invenção como um ingrediente ativo.
[0063] Quando destinadas à administração por via oral em uma forma farmacêutica sólida, as composições farmacêuticas da invenção geralmente compreenderão o agente ativo e um ou mais carreadores aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, como citrato de sódio ou fosfato dicálcico. Opcional ou alternativamente, estas formas farmacêuticas sólidas também podem compreender preenchedores ou extensores, aglutinantes, umectantes, agentes retardadores de solução, aceleradores de absorção, agentes umectantes, absorventes, lubrificantes, corantes e agentes tamponantes. Os agentes de liberação, umectantes, de revestimento, adoçantes, edulcorantes e aromatizantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição de composições farmacêuticas da invenção.
[0064] As formulações alternativas podem também incluir formulações de liberação controlada, formas farmacêuticas líquidas para administração oral, adesivos transdérmicos e formulações parenterais. Os excipientes convencionais e os métodos de preparação destas formulações alternativas são descritas, por exemplo, na referência por Remington, citado acima.
[0065] Os seguintes exemplos não-limitantes ilustram composições farmacêuticas representantes desta invenção.
Composição do pó seco
[0066] Um composto micronizado de fórmula (1) (19) é misturado com lactose triturada (259). Esta mistura combinada é em seguida carregada em blisters individuais de uma embalagem de blister de fácil abertura, em quantidade suficiente para fornecer entre cerca de 0,1 mg a 4 mg do composto de fórmula (1) por dose. O conteúdo dos blisters é administrado usando um inalador de pó seco.
Composição do pó seco
[0067] Um composto micronizado de fórmula (1) (19) é misturado com lactose triturada (20 g) para formar uma composição em granel, tendo uma relação de peso do composto para a lactose triturada de 1:20. A composição combinada é acondicionada em um dispositivo de inalação de pó seco capaz de liberar entre cerca de 0,1 mg à cerca de 4 mg do composto de fórmula (1) por dose.
Composição do inalador dosimetrado
[0068] Um composto micronizado de fórmula (1) (10 g) é disperso em uma solução preparada por dissolução de lecitina (0,29) em água desmineralizada (200 ml). A suspensão resultante é seca por pulverização e micronizada para formar uma composição micronizada compreendendo partículas com um diâmetro médio inferior a cerca de 1,5 um. A composição micronizada é em seguida carregada em cartuchos de inalador dosimetrado contendo 1,1,1,2-tetrafluoroetano pressurizado em uma quantidade suficiente para fornecer cerca de 0,1 mg a cerca de 4 mg do composto de fórmula (I) por dose quando administrado por inalador dosimetrado.
Composição do nebulizador
[0069] Um composto de fórmula (1) (25 mg) é dissolvido em uma solução contendo 1,5 a 2,5 equivalentes de ácido clorídrico, seguido por adição de hidróxido de sódio para ajustar o pH para 3,5 a 5,5 e 3% em peso de glicerol. A solução é bem agitada até que todos os componentes estejam dissolvidos. A solução é administrada com um dispositivo nebulizador que oferece cerca de 0,1 mg a cerca de 4 mg do composto de fórmula (1) por dose.
Utilidade
[0070] Os inibidores de JAK da invenção foram concebidos para o tratamento da doença inflamatória e fibrótica do trato respiratório. Em especial, os compostos foram concebidos para permitir a administração de um potente agente anti- citocina diretamente no local de ação de doença respiratória no pulmão, enquanto limita a exposição sistêmica.
[0071] Foi demonstrado que os compostos da invenção são potentes inibidores da família de enzimas JAK: JAKl, JAK2, JAK3 e TYK2. Além disso, o composto 1-6 demonstrou inibição potente das citocinas pró-inflamatórias e pró-fibróticas. Foi reconhecido que o amplo efeito antiinflamatório de inibidores de JAK podem suprimir a função das células imunológicas normais, levando potencialmente ao aumento do risco de infecção. Estes compostos foram portanto otimizados para limitar a absorção a partir do pulmão para o plasma, minimizando assim o risco de imunossupressão.
[0072] Como descrito na seção experimental abaixo, os perfis de absorção e distribuição dos compostos 1-6 foram traçados nos ensaios pré-clínicos. Os compostos 1-6 foram testados em camundongos e mostraram alta concentração 5 horas após a administração no tecido pulmonar e baixa absorção no plasma. Foi demonstrado que os compostos 1-6 inibem um efeito da citocina pró-inflamatória IL-13 no tecido pulmonar de camundongo. Especificamente, os compostos demonstraram inibição da fosforilação de STAT6 induzida por IL-13 no tecido pulmonar que oferece evidência de envolvimento local do alvo JAK pulmonar in vivo. Este efeito foi observado quando a citocina pró-inflamatória IL-13 é administrada 4 horas após a administração do composto do teste, fornecendo evidências adicionais de retenção significativa no pulmão.
[0073] Foi demonstrado que os compostos 1-6 exibem potente atividade inibidora a nível celular e retenção significativa no tecido pulmonar. A extensiva investigação pelos presentes inventores determinou que, embora seja possível identificar compostos que são potentes a nível celular ou compostos que apresentam retenção significativa no pulmão, é muito mais difícil descobrir compostos que apresentam ambas as características desejáveis ao mesmo tempo.
[0074] À atividade antiinflamatória dos inibidores de JAK foi demonstrada amplamente em modelos pré-clínicos de asma (Malaviya et al., Int. Immunopharmacol., 2010, 10, 829,- 836; Matsunaga et al., Biochem. and Biophys. Res. Commun.,
2011, 404, 261-267; Kudlacz et al., Eur. J. Pharmacol, 2008, 582, 154-161). As citocinas envolvidas na inflamação da asma que sinalizam pela via JAK-STAT incluem IL-2, IL-3, IL-A4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-l1, IL-13, IL-23, IL-3l1, IL-27, linfopoietina do estroma tímico (TSLP), gamainterferon (IFNy) e fator estimulante de colônias de granulócitos- macrófagos (GM-CSF). Assim, espera-se que os compostos da invenção sejam úteis para o tratamento de distúrbios respiratórios “inflamatórios, em especial, a asma. A inflamação e fibrose do pulmão é característica de outras doenças respiratórias além da asma, como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC), pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome de desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante e sarcoidose. Espera-se, portanto, que os presentes compostos sejam úteis para o tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome de desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante e sarcoidose.
[0075] Quando “comparados com seus análogos fluoro correspondentes (compostos C-1 a C-6), foi demonstrado que os compostos 1-6 têm atividade JAK semelhante. No entanto, eles têm a vantagem de dar originem a um metabolismo de sulfatação significantemente menor, como demonstrado no Ensaio 5. Isso é significativo, pois o metabolismo de sulfatação ocorre nos pulmões, o que pode levar a uma rápida redução da exposição ao composto original ativo.
[0076] Os compostos 1-6 da divulgação demonstraram inibição das citocinas associadas a inflamação. Portanto, é provável que os compostos da divulgação sejam úteis para o tratamento de determinadas doenças respiratórias específicas, como detalhado abaixo.
[0077] À inflamação eosinofílica das vias respiratórias é uma característica de doenças coletivamente denominadas doenças pulmonares eosinofílicas (Cottin et al., Clin. Chest. Med., 2016, 37(3), 535-56). As doenças eosinofílicas estão associadas à sinalização de IL-4, IL-13 e IL-5. As doenças pulmonares eosinofílicas incluem infecções (especialmente infecções helmínticas), pneumonite induzida por fármacos (induzidas por exemplo, por fármacos como antibióticos, fenitoína ou l-triptofano), pneumonite induzida por fungos (p.ex., aspergilose broncopulmonar alérgica), pneumonite por hipersensibilidade e granulomatose eosinofílica com poliangeíte (anteriormente conhecida como síndrome de Churg-Strauss). As doenças pulmonares eosinofílicas de etiologia desconhecida incluem pneumonia eosinofílica idiopática aguda, pneumonia eosinofílica idiopática crônica, síndrome hipereosinofílica e síndrome de Lóffler.
[0078] Um polimorfismo no gene da IL-6 está associado a elevados níveis de IL-6 e a um risco aumentado de desenvolvimento de hipertensão arterial pulmonar (HAP) (Fang et al., J. Am. Soc. Hypertens., 2017, 11(3), 171-177). Corroborando o papel da IL-6 na HAP, a inibição da cadeia do receptor de IL-6 gpl30 melhorou a doença em um modelo de rato de HAP (Huang et al., Can. J. Cardiol., 2016, 32(11),
1356.e1-1356.e10).
[0079] As citocinas como IFNy, IL-l12 e IL-6 estão envolvidas em uma variedade de doenças pulmonares não- alérgicas como sarcoidose e linfangioleiomiomatose (El- Hashemite et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 2005, 33, 227-230, and El-Hashemite et al., Cancer Res., 2004, 64, 3436-3443). Também foi demonstrado que os compostos da invenção inibem a sinalização de IL-6 e IFNy.
[0080] À bronquiectasia e doenças pulmonares infiltrativas são doenças associadas à inflamação neutrofílica crônica.
[0081] A ativação patológica das células T é fundamental na etiologia de várias doenças respiratórias. As células T autorreativas desempenham um papel na bronquiolite obliterante com pneumonia em organização (também chamada COS). Similar a COS, a etiologia das rejeições de transplante pulmonar está associada a uma ativação aberrante da ativação das células T dos receptores pelo pulmão transplantado do doador. As rejeições de transplante pulmonar podem ocorrer cedo como disfunção primária do enxerto (PGD), pneumonia em organização (PO), rejeição aguda (RA) ou bronquiolite linfocítica (BL) ou podem ocorrer anos após o transplante pulmonar como disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD). A CLAD era anteriormente conhecida como bronquiolite obliterante (BO), mas agora é considerada uma síndrome que pode ter diferentes manifestações patológicas, incluindo BO, CLAD restritiva (rCLAD ou RAS) e disfunção neutrofílica do aloenxerto.
A disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD) é um grande desafio para o manejo a longo prazo dos receptores de transplante pulmonar, pois faz com que o pulmão transplantado perca sua funcionalidade progressivamente (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185- 191). A CLAD é pouco sensível ao tratamento e, portanto, permanece a necessidade de compostos eficazes capazes de prevenir ou tratar esta condição.
Várias citocinas dependentes de JAK, como IFN] e IL-5 são reguladas positivamente na CLAD e na rejeição do transplante de pulmão (Berastegui et al, Clin.
Transplant. 2017, 31, e12898). Além disso, altos níveis de quimiocinas CXCR3 pulmonares como CXCL9 e CXCL10 que estão a jusante da sinalização de IFN dependente de JAK estão relacionados a piores desfechos nos pacientes submetidos a transplante de pulmão (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). A inibição sistêmica de JAK demonstrou ser eficaz na rejeição do transplante renal (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). Portanto, os inibidores de JAK têm o potencial para serem eficazes no tratamento ou prevenção da rejeição do transplante pulmonar e CLAD.
Eventos semelhantes de ativação de células T, como descritos como a base para a rejeição do transplante pulmonar, também são considerados o principal fator da doença do enxerto pulmonar contra o hospedeiro (GVHD), que pode ocorrer após os transplantes de células-tronco hematopoéticas.
Similar à CLAD, a GVHD pulmonar é uma condição progressiva com desfechos extremamente ruins e não existe tratamento atualmente aprovado.
Um estudo de pesquisa multicêntrico retrospectivo de 95 pacientes com GVHD aguda ou crônica refratária à esteroide que receberam o inibidor sistêmico de JAK ruxolitinibe como terapia de resgate demonstrou resposta completa ou parcial para ruxolitinibe na maioria dos pacientes, incluindo aqueles com GVHD pulmonar (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). Como a inibição sistêmica do JAK está associada a eventos adversos graves e um pequeno índice terapêutico, permanece a necessidade de um inibidor não sistêmico de JAK, direcionado ao pulmão para evitar e/ou tratar a rejeição do transplante pulmonar ou GVHD pulmonar. os compostos da invenção têm as características necessárias para atender a esta necessidade. Mais recentemente, a pneumonite induzida por inibidor do checkpoint imunológico , outra doença pulmonar mediada por célula T, emergiu com o uso crescente de inibidores de checkpoint imunológico. Os pacientes com câncer tratados com esses agentes estimulantes de células T podem desenvolver pneumonite fatal.
[0082] O ensaio da reação linfocítica mista é um ensaio in vitro que mimetiza a rejeição do transplante. Foi demonstrado que o composto 1 inibe efetivamente a secreção de IFNy.
[0083] Em uma modalidade, portanto, a invenção oferece um método para tratar uma doença inflamatória gastrointestinal em um mamífero (p.ex., humano), o método compreendendo a administração ao mamífero de um uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo um excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico e um composto da invenção ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0084] Em uma modalidade, a doença respiratória é asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC), pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante e sarcoidose. Em outra modalidade, a doença respiratória é asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica.
[0085] En uma modalidade, a doença pulmonar é uma infecção pulmonar, uma doença eosinofílica, uma infecção helmíntica, hipertensão arterial pulmonar, sarcoidose, linfangioleiomiomatose, bronquiectasia, uma doença pulmonar infiltrativa, pneumonite induzida por drogas, pneumonite induzida por fungos, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonite por hipersensibilidade, granulomatose eosinofílica com poliangeite, pneumonia eosinofílica aguda idiopática, pneumonia eosinofílica crônica idiopática, síndrome hipereosinofílica, síndrome de Lóffler, bronquiolite obliterante com pneumonia organizativa, rejeições aguda e crônica de pulmão (incluindo PGD, OP, LB, AR e CLAD, BO, CLAD restritiva e disfunção neutrofílica do enxerto), doença do enxerto contra o hospedeiro, bronquiolite obliterante, pneumonia organizativa, hipertensão arterial pulmonar, bronquiectasia ou pneumonite induzida por inibidor do ponto de verificação imunológico.
[0086] A invenção oferece ainda um método para tratar asma em um mamífero, o método compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico e um composto da invenção ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0087] Quando usados para o tratamento de asma, os compostos da invenção serão tipicamente administrados em dose única diária ou em doses múltiplas por dia, embora outras formas de administração possam ser usadas. A quantidade de agente ativo administrado por dose ou a quantidade total administrada por dia será determinada por um médico, considerando as circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto em questão administrado e a sua atividade relacionada, a idade, o peso, a resposta de cada paciente, a gravidade dos sintomas do paciente e semelhantes.
[0088] A divulgação ainda oferece um método para tratar uma doença respiratória (incluindo, mas não se limitandoà doença aqui descrita) em um mamífero, o método compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um composto da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico e um composto da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0089] Quando “usados para oO tratamento da asma (incluindo, mas não se limitando à doença descrita nesta divulgação), os compostos da divulgação serão administrados em dose única diária ou em doses múltiplas por dia, embora outras formas de administração possam ser usadas. A quantidade de agente ativo administrado por dose ou a quantidade total administrada por dia será determinada por um médico, considerando as circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto em questão administrado e a sua atividade relacionada, a idade, o peso, a resposta de cada paciente, a gravidade dos sintomas do paciente e semelhantes.
[0090] Como inibidores de JAK, os compostos da divulgação também podem ser úteis para uma variedade de outras doenças. Os compostos da divulgação podem ser úteis para várias indicações inflamatórias gastrintestinais que incluem, mas não estão limitados a, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa (proctosigmoidite, pancolite, proctite ulcerativa e colite do lado esquerdo), doença de Crohn, colite colagenosa, colite linfocítica, doença de Behçet, doença celíaca, colite induzida por inibidor do checkpoint imunológico, ileíte, esofagite eosinofílica, colite relacionada à doença enxerto contra hospedeiro e colite infecciosa. Colite ulcerativa (Reimund et al., vv. Clin. Immunology, 1996, 16, 144-150), doença de Crohn (Woywodt et al., Eur. J. Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), colite colagenosa (Kumawat et al., Mol. Immunology, 2013, 55, 355-364), colite linfocítica (Kumawat et al., 2013), esofagite eosinofílica (Weinbrand-Goichberg et al., Immunol. Res., 2013, 56, 249-260), colite relacionada à doença enxerto contra hospedeiro (Coghill et al., Blood 2001, 117, 3268-3276), colite relacionada à doença enxerto contra hospedeiro (Stallmach et al., Int. J. Colorectal Dis., 2004, 19, 308-315), doença de Behçet (Zhou et al., Autoimmun. Rev., 2012, 11, 699-704), doença celíaca (de Nitto et al., World J. Gastroenterol., 2009, 15, 4609-4614), colite induzida por inibidor de checkpoint imunológico (p. ex., colite induzida por inibidor de CTLA-4; (Yano et al., JU. Translation. Med., 2014, 12, 191), colite induzida por inibidor de PD-l1- ou PD-Ll1) e ileíte (Yamamoto et al., Dig. Liver Dis., 2008, 40, 253-259) são caracterizadas pela elevação dos níveis de certas citocinas pró-inflamatórias. Como muitas citocinas pró-inflamatórias sinalizam através da ativação de JAK, os compostos descritos nessa aplicação podem ser capazes de aliviar a inflamação e fornecer alívio para seus sintomas. Em especial, os compostos da divulgação podem ser úteis para a indução e manutenção da remissão da colite ulcerativa, para o tratamento da doença de Crohn, colite induzida por inibidor de checkpoint imunológico, e os efeitos adversos gastrintestinais da doença enxerto contra o hospedeiro. Em uma modalidade, portanto, a divulgação oferece um método para tratar uma doença inflamatória gastrointestinal em um mamífero (p. ex., humano), o método compreendendo a administração ao mamífero de um composto da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo um excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico e um composto da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[0091] À dermatite atópica e outras doenças inflamatórias da pele estão associadas com a elevação das citocinas pró-inflamatórias que dependem da via JAK-STAT.
Portanto, os compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico sejam benéficos em várias condições inflamatórias e prurídicas da pele que incluem, mas não estão limitados a dermatite atópica, alopecia aerata, vitiligo, dermatomiosite, linfoma de célula T cutâneo (Netchiporouk et al., Cell Cycle 2014; 13, 3331-3335) e subtipos (síndrome de Sezary, micose fungoide, reticulose pagetoide, pele frouxa granulomatosa, papulose linfomatosa, pitiríase liquenoide crônica, pitiríase liquenoide varioliforme aguda, linfoma cutâneo de células T CD30+, linfoma cutâneo secundário de células grandes CD30+, fungoides não-micóticos, linfoma cutâneo de células T grandes CD30-, linfoma pleomórfico de células T, linfoma de Lennert, linfoma subcutâneo de células T, linfoma angiocêntrico, linfoma blástico de células NK), prurigo nodular, líquen plano, amiloidose cutânea primária localizada, penfigoide bolhoso, manifestações cutâneas de doença do enxerto contra hospedeiro, penfigoide, lúpus discoide, granuloma anular, líquen simples crônico, prurido vulvar/escrotal/perianal, líquen escleroso, coceira de nevralgia pós-herpética, líquen planopilar e foliculite decalvante.
Em especial, a dermatite atópica (Bao et al., JAK-STAT, 2013, 2, e24137), alopecia areada (Xing et al., Nat.
Med. 2014, 20, 1043-1049), vitiligo (Craiglow et al, JAMA Dermatol. 2015, 151, 1110-1112), prurigo nodular (Sonkoly et al., J Allergy Clin.
Immunol. 2006, 117, 411- 417), líquen plano (Welz-Kubiak et al., J Immunol.
Res. 2015, ID:854747), amiloidose cutânea primária localizada (Tanaka et al., Br. .J Dermatol. 2009, 161, 1217-1224), penfigoide bolhoso (Feliciani et al., Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 1999, 12, 55-61) e manifestações cutâneas da doença enxerto contra hospedeiro (Okiyama et al., J. Invest. Dermatol. 2014, 134, 992-1000) são caracterizados pela elevação de certas citocinas que sinalizam via ativação JAK. Consequentemente, os compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser capazes de aliviar o prurido associado à inflamação cutânea ou disparado por essas citocinas. Em especial, espera-se que compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico sejam úteis para o tratamento da dermatite atópica e outras doenças inflamatórias da pele. Em uma modalidade, portanto, a divulgação oferece um método de tratamento de uma doença de pele inflamatória em um mamífero (p. ex., humano), oO método compreendendo a aplicação de uma composição farmacêutica compreendendo um composto da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um carreador farmacêutico na pele de mamíferos. Em uma modalidade, a doença inflamatória de pele é a dermatite atópica.
[0092] Foi demonstrado que muitas doenças oculares estão associadas à elevação de citocinas pró-inflamatórias que dependem da via JAK-STAT. Os compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, portanto, podem ser úteis para o tratamento de várias doenças oculares que incluem, mas não estão limitados a uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade e ceratoconjuntivite atópica. Em especial, uveíte (Horai and Caspi, J. Interferon
Cytokine Res., 2011, 31, 733-744), retinopatia diabética (Abcouwer, J.
Clin.
Cell.
Immunol., 2013, Suppl 1, 1-12) edema macular diabético (Sohn et al., American Journal of Opthamology, 2011, 152, 686-694), doença do olho seco (Stevenson et al, Arch.
Ophthalmol., 2012, 130, 90-100) e degeneração macular relacionada à idade (Knickelbein et al, Int.
Ophthalmol.
Clin., 2015, 55(3), 63-78) são caracterizadas pela elevação de algumas citocinas pró- inflamatórias que sinalizam a via JAK-STAT.
Consequentemente, os compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser capazes de aliviar a inflamação ocular associada e reverter a progressão da doença ou melhorar os sintomas.
Em uma modalidade, portanto, a divulgação oferece um método de tratamento de uma doença ocular em um mamífero, o método compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo um composto da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um carreador farmacêutico no olho do mamífero.
Em uma modalidade, a doença ocular é uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular associada à idade e ceratoconjuntivite atópica.
Em uma modalidade, o método compreende administrar o composto da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico por injeção intravítrea.
Os compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser usados em combinação com um ou mais compostos úteis para doenças oculares.
[0093] Os compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis para o tratamento de outras doenças como doenças inflamatórias, doenças autoimunes ou cânceres. Os compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser úteis para o tratamento de um ou mais de artrite, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, rejeição de transplante, xeroftalmia, artrite psoriática, diabetes, diabetes dependente de insulina, doença do neurônio motor, síndrome mielodisplásica, dor, sarcopenia, caquexia, choque séptico, lúpus eritematoso sistêmico, leucemia, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogênica aguda, espondilite anquilosante, mielofibrose, linfoma de células B, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer de mama, mieloma múltiplo, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer de célula não pequena do pulmão, câncer de células claras do ovário, tumor ovariano, tumor de pâncreas, policitemia vera, síndrome de Sjoegrens, sarcoma de partes moles, sarcoma, esplenomegalia, linfoma de células T e talassemia maior.
Terapia combinada
[0094] Os compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser usados combinados com um ou mais agentes que agem pelo mesmo mecanismo ou por mecanismos diferentes para tratar uma doença. Os diferentes agentes podem ser administrados em sequência ou simultaneamente, em composições separadas ou na mesma composição. As classes úteis de agentes para terapia combinada incluem, mas não estão limitados a, um agonista adrenoceptor beta 2, um antagonista do receptor muscarínico, um agonista de glicocorticoide, um antagonista do receptor 44 da proteína G acoplada, um antagonista de leucotrieno DA4, um antagonista do receptor muscarínico M3, um antagonista do receptor Hl da histamina, um antagonista da imunoglobulina E, um inibidor de PDE 4, um antagonista de IL-4, um antagonista do receptor muscarínico Ml, um antagonista do receptor de histamina, um antagonista de 1IL-13, um antagonista de IL-5, um inibidor da 5-lipoxigenase, um agonista beta-adrenoceptor, um antagonista da quimiocina CCR3, um estimulador de CFTR, um modulador de imunoglobulina, um inibidor de ligante de interleucina 33, um inibidor de PDE 3, um inibidor de fosfoinositídeo-3 quinase delta, um antagonista de tromboxano A2, um inibidor da elastase, um inibidor Kit da tirosina quinase, um antagonista de leucotrieno E4, um antagonista do leucotrieno, um inibidor do ligante TNF-alfa, um agente de ligação de TNF, um inibidor do complemento da cascata, um inibidor do ligante eotaxina, um inibidor de glutationa redutase, um antagonista do receptor H4 da histamina, um antagonista de IL-6, um estimulador do gene IL2, um modulador do receptor de imunoglobulina gama Fc IIB, um ligante da gamainterferon, um inibidor do ligante da interleucina 13, um inibidor do ligante da interleucina 17 inibidor, um antagonista da L- selectina, um inibidor da elastase leucocitária, um antagonista de leucotrieno C4, um inibidor de leucotrienos C4 sintase, um inibidor a base de cobre da amino oxidase de membrana, um inibidor de metaloprotease-l12, inibidor de metaloprotease-9, um modulador de alérgenos de ácaros, um modulador de receptor muscarínico, um agonista do receptor nicotínico da acetilcolina, um inibidor do fator nuclear kappa B, um antagonista da P-selectina, um inibidor de PDE 5, um antagonista do receptor PDGF, um Inibidor fosfoinositídeo-3 quinase gama, um agonista de TLR-7, antagonista de TNF, um inibidor de tirosina quinase Abl, um antagonista de receptor de acetilcolina, um inibidor de quitinase ácida de mamífero, um agonista do receptor de ACTH, um modulador de polimerização de actina, um antagonista de receptor de adenosina Al, um estimulador de adenilato ciclase, um antagonista adrenoceptor, um ligante do hormônio adrenocorticotrófico, um inibidor da álcool desidrogenase 5, um estimulador de antitripsina alfa 1, um inibidor de proteinase alfa 1, um modulador do receptor de andrógeno, um estimulador da enzima conversora da angiotensina 2, um agonista de ANP, um inibidor da proteína Bcr, um antagonista adrenoceptor beta 1, antagonista adrenoceptor beta 2, um modulador adrenoceptor beta 2, um modulador de beta- amilóide, um inibidor do gene BMP10, um inibidor do gene BMP15, um inibidor do canal de cálcio, um inibidor da catepsina G, um inibidor do gene CCL26, um modulador da quimiocina CCR3, um antagonista da quimiocina CCR4, um inibidor da molécula de adesão celular, de um estimulador chaperonina, um inibidor de quitinase, um antagonista de colágeno I, um inibidor de complemento C3, um antagonista CSF-1, um antagonista da quimiocina CXCR2, um modulador de cadeia beta comum do receptor de citocina, um estimulador da proteína-4 do linfócito T citotóxico, um estimulador de desoxirribonuclease I, um estimulador de desoxirribonuclease, um inibidor da dipeptidil peptidase 1, um inibidor de DNA girase, um modulador do receptor de prostanoide DP, um antagonista da E-Selectina, um inibidor do receptor da tirosina quinase da família EGFR, um modulador de elastina, um antagonista da endotelina ET-A, um antagonista da endotelina ET-B, um inibidor de epóxido hidrolase, um antagonista do receptor FGF3, um inibidor de tirosina quinase Fyn, um inibidor do fator de transcrição GATA 3, um modulador de Glucosilceramidase, um modulador do receptor de glutamato, um inibidor do ligante de GM-CS, um inibidor da guanilato ciclase, um estimulador de H+ K+ ATPase inibidor, um modulador de hemoglobina, um agonista de heparina, um inibidor de histona desacetilase, um estimulador da histona deacetilase-2, um inibidor da HMG CoA redutase, um inibidor de I-kappa B beta quinase, um inibidor do gene ICAMI, um antagonista de IL-l17, um modulador do receptor de IL-17, um antagonista de IL-23, um modulador do receptor de IL-4, um modulador da imunoglobulina Gl, um antagonista do receptor IA da imunoglobulina épsilon Fc, um antagonista do receptor Fc gama Imunoglobulina IGA antagonista, um modulador da imunoglobulina kappa, um sensibilizador de insulina, um ligante betainterferon, um antagonista semelhante do receptor da interleucina 1, inibidor do ligante da Interleucina 18, um inibidor do receptor da interleucina 17A, um inibidor de ligante da interleucina-l beta, um inibidor de ligante interleucina-5, um inibidor de ligante da interleucina-6, inibidor do canal 3 KCNA dependente de voltagem, um Inibidor de ligante kit, um agonista da laminina-5, um antagonista de receptor de leucotrieno CysLT1, um antagonista de receptor de leucotrieno CysLT2, um inibidor do gene LOXL2, um inibidor de Lyn tirosina quinase, um inibidor da proteína MARCKS, um inibidor da proteína associada 4 MDR, um modulador da metaloprotease-2, um modulador da metaloprotease-9, um antagonista do receptor de mineralocorticoide, um antagonista do receptor muscarínico M2, um antagonista do receptor muscarínico M4, um antagonista do receptor muscarínico M5, um agonista do receptor do peptídeo natriurético, um modulador do receptor de células natural killer, um estimulador da alfa subunidade 7 ACh do receptor nicotínico, um modulador do receptor das células NK, um modulador do fator nuclear kappa B, um agonista opióide do receptor de fator de crescimento, um inibidor da glicoproteína-P, um antagonista de P2X3 purinoceptor, um inibidor da p38 MAP quinase, um modulador da Peptidase 1, um inibidor da fosfolipase A2, um inibidor da enzima fosfolipase C, um inibidor do ativador de plasminogênio 1, um antagonista do receptor do fator ativador de plaquetas, um agonista de PPAR gama, um agonista de prostaciclina, um inibidor da proteína tirosina quinase, um estimulador do domínio SH2 1 fosfatase de inositol, um inibidor de transdução de sinal, um inibidor do canal de sódio, um modulador de STAT-3, um inibidor do antígeno de células-tronco-l1, um modulador de superóxido dismutase, um inibidor da glicoproteína de superfície de célula T CD28, um inibidor de CD8 glicoproteína de superfície de células T, um inibidor de TGF beta-agonista, antagonista de TGF beta, um inibidor de tromboxana sintetase, um inibidor de linfoproteína do estroma tímico, um inibidor do ligante timosina, um agonista beta 4 timosina, um agonista de TLR-8, um agonista de TLR-9, um estimulador de gene TLR9, um inibidor da Topoisomerase IV, um estimulador da troponina I fast do músculo esquelético, um estimulador da troponina T fast estimulador muscular esquelética, um antagonista do receptor I IL-l1, um modulador do receptor tipo II de TNF, um modulador de canal iônico, um estimulador de uteroglobina, e um agonista de VIP.
[0095] Agentes — específicos que podem ser usados combinados com os compostos inibidores de JAK presentes incluem, mas não estão limitados a acetato de rosiptor, brometo de umeclidínio, secukinumabe, acetato de metencefalina, acetato de tridecactídeo, propionato de fluticasona, sulforafana alfa-ciclodextrina-estabilizada, tezepelumabe, furoato de mometasona, BI-1467335, dupilumabe, aclidínio, formoterol, AZD-1419, HI-1640V, rivipansel, CMP- 001, manitol, ANB-020, omalizumabe, tregalizumabe, Mitizax, benralizumabe, golimumabe, roflumilaste, imatinibe, REGN- 3500, masitinibe, apremilaste, RPL-554, Actimmune, adalimumabe, rupatadine, parogrelil, MK-1029, dipropionato de beclometasona, fumarato de formoterol, mogamulizumabe, seratrodaste, UCB-4144, nemiralisibe, CK-2127107, fevipiprante, danirixina, bosentana, abatacepte, EC-18, duvelisibe, dociparstato, ciprofloxacino, salbutamol HFA, erdosteina, PrEP-00l1, nedocromil, CDX-0158, salbutamol, enobosarma, R-TPR-022, lenzilumabe, furoato de fluticasona, trifenatato de vilanterol, propionato de fluticasona, salmeterol, PT-007, PRS-060, remestemcel-L, citrulina, RPC- 4046, óxido nítrico, DS-102, gerilimzumabe, Actair, furoato de fluticasona, umeclidínio, vilanterol, AG-NPP709, Gamunex, infliximabe, Ampion, acumapimode, canakinumabe, INS-1007, CYP-001, sirukumabe, propionato de fluticasona, mepolizumabe, pitavastatina, solithromicina, etanercepte, ivacaftor, anakinra, MPC-300-IV, brometo de glicopirrônio, brometo de aclidínio, FP-025, risankizumabe, glicopirrônio, fumarato de formoterol, Adipocell, YPL-001, brometo de tiotrópio, brometo de glicopirrônio, maleato de indacaterol, andecaliximabe, olodaterol, esomeprazol, vacina anti-poeira de ácaro, vacina do alérgeno do pólen da artemísia, vamorolona, gefapixanto, revefenacina, gefitinibe, ReJoin, tipelucaste, bedoradrina, SCM-CGH, SHP-652, RNS-60, brodalumabe, BIO-11006, brometo de umeclidínio, trifenatato de vilanterol, brometo de ipratrópio, tralokinumabe, PUR- 1800, VX-561, VX-371, olopatadina, tulobuterol, fumarato de formoterol, triancinolona acetonida, reslizumabe, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, dipropionato de beclometasona, fumarato de formoterol, brometo de tiotrópio, ligelizumabe, RUTI, bertilimumabe, omalizumabe, brometo de glicopirrônio, SENS-111, dipropionato de beclometasona, CHF- 5992, LT-4001, indacaterol, brometo de glicopirrônio, furoato de mometasona, fexofenadina, brometo de glicopirrônio, azitromicina, AZD-7594, formoterol, CHF-6001, batefenterol, OATD-01, olodaterol, CJIM-112, rosiglitazona, salmeterol, setipiprante, betainterferon inalada, AZD-8871, plecanatida, fluticasona, salmeterol, monoglicérides do ácido eicosapentaenóico, lebrikizumabe, RG-6149, QBKPN, Mometasona, indacaterol, AZD-9898, piruvato de sódio, zileutona, cG-201, imidafenacina, CNTO-6785, CLBS-03,
mometasona, RGN-137, procaterol, formoterol, CCI-15106, POL- 6014, indacaterol, beclometasona, MV-130, GC-1112, Allergovac depot , MEDI-3506, QBW-251, ZPL-389, udenafila, GSK-3772847, levocetirizin, AXP-1275, ADC-3680, timapiprante, abediterol, AZD-7594, brometo de ipratrópio, sulfato de salbutamol, tadekinig alfa, ACT-774312, dornase alfa, iloproste, batefenterol, furoato de fluticasona, alicaforseno, ciclesonida, emeramida, arformoterol, SB-010, Ozagrel, BTT-1023, Dectrekumab, levalbuterol, pranlucaste, ácido hialurônico, GSK-2292767, Formoterol, NOV-14, Lucinactante, salbutamol, prednisolona, ebastina, cipecilato de dexametasona, GSK-2586881, BI-443651, GSK-2256294, VR- 179, VR-096, hdm-ASIT+, budesonida, GSK-2245035, VTX-1463, Emedastina, dexpramipexol, levalbuterol, N-6022, fosfato sódico de dexametasona, PIN-201104, OPK-0018, TEV-48107, suplataste, BI-1060469, Gemilucaste, gamainterferon, dalazatida, bilastina, propionato de fluticasona, xinafoato de salmeterol, RP-3128, brometo de bencicloquidio, reslizumabe, PBF-680, antagonista de CRTH2, Pranlucaste, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, brometo monoidrato de tiotrópio, masilucaste, RG-7990, Doxofilina, abediterol, brometo de glicopirrônio, TEV-46017, ASM-024, propionato de fluticasonay brometo de glicopirrônio, xinafoato de salmeterol, salbutamol, TA-270, Flunisolida, cromoglicato de sódio, Epsi-gam, ZPL-521, salbutamol, aviptadila, TRN-157, Zafirlucaste, Stempeucel, pemirolasto sódico, nadolol, propionato de fluticasona + xinafoato de salmeterol, RV-1729, sulfato de salbutamol, dióxido de carbono + brometo de perfluoro-octila, APL-l, dectrekumabe
+ VAK-694, acetilsalicilato de lisina, zileuton, TR-4, terapia de células progenitoras mesenquimais derivadas de tecido adiposo alogênico humano, MEDI-9314, PL-3994, HMP- 301, TD-5471, NKTT-120, pemirolaste, dipropionato de beclometasona, trantinterol, alfaluminol monossódico, IMD- 1041, AM-211, TBS-5, ARRY-502, seratrodaste, midismase recombinante, ASM-8, deflazacorte, bambuterol, RBx-10017609 ipratrópio + fenoterol, fluticasona + formoterol, epinastina, WIN-901X, VALERGEN-DS,OligoG-COPD-5/20, tulobuterol, oxis Turbuhaler, DSP-3025, ASM-024, mizolastina, budesonida + salmeterol, LH-011, AXP-E, imunoglobulina humana histamina, YHD-001, teofilina, ambroxol + erdosteína, ramatrobana, montelucaste, pranlucaste, AG-1321001, tulobuterol, ipratrópio + salbutamol, tranilaste, suleptanato de metilprednisolona, daropato de colforsina, repirinaste e doxofilina.
[0096] Também é fornecida, neste documento, uma composição farmacêutica compreendendo um composto da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um ou mais agentes terapêuticos. O agente terapêutico pode ser selecionado a partir da classe de agentes especificados acima e a partir da lista de agentes específicos descrita acima. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para liberação para os pulmões. Em uma modalidade, a composição farmacêutica da invenção é adequada para administração por inalação ou por nebulização. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um pó seco ou uma composição líquida.
[0097] Além disso, em uma modalidade do método, a divulgação oferece um método para tratar uma doença Ou desordem em um mamífero compreendendo a administração ao mamífero de um composto da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um ou mais agentes terapêuticos.
[0098] Quando usado em combinação terapêutica, OoS agentes poderão ser formulados em uma única composição farmacêutica, como divulgado anteriormente, ou os agentes podem ser fornecidos em diferentes composições que são administradas simultaneamente ou em tempos distintos, pela mesma via ou por diferentes vias de administração. Tais composições podem ser acondicionadas separadamente ou podem ser acondicionadas como um kit. Os dois ou mais agentes terapêuticos no kit podem ser administrados pela mesma via de administração ou por diferentes vias de administração.
EXEMPLOS
[0099] Os exemplos sintéticos e biológicos a seguir são fornecidos para ilustrar a invenção e não devem ser interpretados de forma alguma como limitação do escopo da invenção. Nos exemplos abaixo, as seguintes abreviaturas têm os seguintes significados, salvo indicação em contrário. Abreviaturas não definidas abaixo têm seus significados geralmente aceitos.
ACN = acetonitrila DCM = diclorometano DIPEA = N,N-di-isopropietilamina DMF = N, N-dimetilformamida EtOAc = acetato de etila h = hora(s) HATU= hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-O- (7-azabenzotriazol-1-il)urônio IPA = álcool isopropílico IPAc = acetato de isopropila MeOH = metanol min = minuto(s) Pd(PPh3), = tetraquis (trifenilfosfina)paládio(0 TA= temperatura ambiente TFA = ácido trifluoroacético THF = tetrahidrofurano bis (pinacolato)diboro = 4,4,5,5,4',4',5',5'- octametil-[2,2']bi[[1,3,2]dioxaborolanil]
[00100] Os reagentes e solventes foram adquiridos de fornecedores comerciais (Aldrich, Fluka, Sigma, etc.), e usados sem purificação adicional. O progresso da mistura da reação foi monitorado por cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia líquida de alta eficiência analítica (CLAE/HPLC analítica) e espectrometria de massa. As misturas da reação foram trabalhadas como descrito especificamente em cada reação; geralmente, foram purificadas por métodos de extração e outros de purificação, como cristalização dependente de temperatura e solvente e precipitação. Além disso, as misturas da reação foram sistematicamente purificadas por cromatografia em coluna ou HPLC/CLAE preparativa, geralmente usando empacotamento C18 ou BDS de coluna e eluentes convencionais. As condições típicas de HPLC/CLAE preparativa estão descritas abaixo.
[00101] A caracterização dos produtos da reação foi feita sistematicamente usando espectrometria de massa e RMN de '!'H-. Para análise por RMN, as amostras foram dissolvidas em solventes deuterados (como CD;3OD, CDCl3 ou d;-DMSO), e foram adquiridos os espectros de RMN de !H com o instrumento Varian Gemini 2000 (400 MHz) sob condições de observação padrões. A identificação por espectrometria de massa dos compostos foi feita por um método de ionização por eletrospray (ESMS) com um instrumento da Applied Biosystems, (Foster City CA), modelo API 150 EX, ou um instrumento 3100 da Waters (Milford, MA), acoplados a sistemas de autopurificação.
Condições da HPLC preparativa
[00102] Coluna: C18, 5 um. 21,2 x 150 mm ou C18, 5 um 21 x 250 ou cl4, 5 um 21x150 mm Temperatura da coluna: Temperatura ambiente Vazão do fluxo: 20,0 ml/min Fases móveis: A =Água + 0,05% TFA B = ACN + 0,05% TFA, Volume de injeção: (100-1500 ul) Comprimento de onda do detector: 214 nm
[00103] Os compostos brutos foram dissolvidos em 1:1 de água:ácido acético em cerca de 50 mg/ml. Um teste de 4 minutos de escala analítica foi realizado usando uma coluna C18 2,1 x 50 mm, seguida de um teste de escala preparativa de 15 ou 20 minutos usando injeção de 100 ul com o gradiente baseado na % de retenção de B do teste da escala analítica. Dos gradientes precisos dependiam da amostra. As amostras com impurezas com tempos de retenção próximos foram verificadas com uma coluna C18 21 x 250 mm e/ou coluna C1l4 21 x 150 mm para melhor separação. As frações com o produto desejado foram identificadas por análise de espectrometria de massa.
Preparo 1: Sal potássico I-5 de 4-(benziloxi)-2- etilfenil)trifluoro-A'-borano Ho. OO "OO — ——- o º H 2 1-3 BnO. BnO. ———> —
ES 4 5 (a) 1- (benziloxi)-3-etilbenzeno (1-2)
[00104] Foi adicionado carbonato de potássio (42,0 g, 306 mmol) a uma solução agitada de 3-etilfenol (1-1) (25,0 g, 204,0 mmol) em ACN (250 ml, 10 vol) em temperatura ambiente. A massa de reação resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 15 minutos, seguida pela adição de brometo de benzila (24,0 ml, 204 mmol) gota a gota. A mistura de reação resultante foi agitada durante 6 horas em temperatura ambiente. Após o término da reação (monitoramento por TLC), a massa de reação resultante foi vertida em água (1,0 1) seguida pela extração do composto com EtOAc (2 x 2 1). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água fria, solução de salmoura, secas sobre sulfato de sódio, filtradas e evaporadas sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica
(100-200 M) usando eluentes de EtOAc 2% em hexano para obter o produto desejado (1-2) como um composto oleoso amarelo claro (35,0 g, 81%). RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio-d) à 7,46-7,44 (m, 2H), 7,39 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,34-7,31 (mM, 1H), 7,21 (t, J = 7,6 Hz), 6,86-6,80 (my, 3H), 5,07 (s, 2H), 2,64 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,24 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
(b) 4- (benziloxi)-l-bromo-2-etilbenzeno (1-3)
[00105] Foi adicionada N-bromosuccinimida (32,0 g 181 mmol) a uma solução agitada e gelada de 1-(benziloxi)- 3-etilbenzeno (1-2) (35,0 g, 164 mmol) em ACN (525 ml, 15 vol) em porções por um período de 15 minutos. A mistura resultante da reação foi agitada durante 1 hora em temperatura ambiente. Após o término da reação (monitoramento por TLC), a massa resultante da reação foi vertida em água gelada (1,50 1) seguida pela extração do composto com EtOAc (2 x 1 1). As fases orgânicas foram lavadas com água e secas sobre sulfato de sódio, filtradas e evaporadas sob pressão reduzida para obter o produto bruto. Foi adicionado n-hexano (250 ml) ao material bruto, resultando uma pasta, seguida pela filtração por um funil sinterizado. O licor-mãe foi evaporado sob pressão reduzida para obter o produto desejado, I1I-3, como composto oleoso amarelo claro (42,0 g, 87%). RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio- d) õ 7,52-7,29 (m, 7H), 6,88 (s, 1H), 6,68 (dy, J = 6,0 Hz, 1H), 5,04 (s, 2H), 2,69 (q, IJ = 7,6 Hz, 2H), 1,20 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
(c) 2- (4- (benziloxi) -2-etilfenil)-4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-dioxaborolano (I -4)
[00106] Uma solução agitada de 4- (benziloxi)-1l1-bromo-2- etilbenzeno (1-3) (42,0 g, 144 mmol), bis(pinacolato) diboro (44,0 g, 173 mmol) e acetato de potássio (28 g, 288 mmol) em dioxano (440 ml) foi desgaseificada por purga de N2 (g) durante 15 minutos seguido pela adição do complexo PdCl7;(dppf) .DCM (11,09, 15 mmol). A mistura de reação resultante foi aquecida até 80 ºC pelas próximas 16 horas. Após o término da reação (monitoramento por TLC), a massa da reação foi filtrada por leito de celite e o licor-mãe foi evaporado sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (100-200 M) usando eluentes de EtOAc 1% em hexano para obter o produto desejado (I-4) como um composto oleoso amarelo claro (32,0 g, 66%). RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio-d) 5 7,74 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,45- 7,36 (my, 5H), 6,84-6,78 (m, 2H), 5,08 (s, 2H), 2,91 (q, J= 7,6 Hz), 1,33 (s, 12H), 1,19 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
(d) Sal potássico de (4- (benziloxi)-2- etilfenil)trifluoro-A'-borano (1-5)
[00107] A uma solução agitada do composto 2-(4- (benziloxi)-2-etilfenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolano (1-4) (20 g, 59,0 mmol), em acetona:metanol (200 ml, proporção 1:1, 10 vol), foi adicionada uma solução 3M de bifluoreto de potássio (23,0 g, 295 mmol, dissolvido em 98,0 ml de água). A mistura resultante da reação foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas. Após o término da reação (monitoramento por TLC), a massa resultante da reação foi evaporada sob pressão reduzida. O sólido assim obtido foi absorvido em água (100ml) e agitado em temperatura ambiente durante 30 minutos. A massa de reação resultante foi filtrada através de um funil sinterizado, lavada com n-hexano e seca sob pressão reduzida para fornecer o produto desejado (1-5) como um sólido branco (14,0 g, 74%). RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio-d) 5 7,43 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,37 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,30 (t, 3 = 7,1 Hz, 1H), 7,22 (df, IJ = 8,0 Hz), 6,58 (s, 1H), 6,53 (dy, J = 7,9 Hz, 1H), 5,00 (s, 2H), 2,65 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 1,07 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
Preparo 2: 5- (terc-butil) (S) -3-benzil-3,4,6,7- tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila (I-11) o o o o A — OS ONT SO n H Bot Boc 6 nv rs 1 o o o EX o EX NS Bo a NºBoc ro E (a) Sal de cloridrato do ácido (S)-4,5,6,7-tetrahidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico (1-7)
[00108] Foi adicionado a uma suspensão agitada e gelada de L-histidina (1-6) (5,0 kg, 32,l4mol) em água (40 1, 8 vol.) ácido clorídrico concentrado (3,93 1, 33,75 mol), seguido pela adição de formaldeído (5,50 1, 67,5 mol, solução aq. a 37%) gota a gota. A solução resultante foi agitada durante 30 minutos na mesma temperatura e em seguida aquecida a 80 ºC durante 8 horas. O progresso da reação foi monitorado por LCMS. A água foi removida sob pressão reduzida para obter o produto bruto e o bruto resultante foi agitado durante 2 horas em tolueno (20 1). As fases orgânicas foram removidas sob pressão reduzida para remover o excesso de água e o composto foi seco azeotropicamente. O material resultante foi coletado em éter dietílico (20 1) e agitado durante 2 horas. O material sólido foi em seguida filtrado e seco no ar para obter o produto desejado (I-7) como um sólido esbranquiçado (6,50 Kg, 85%). RMN de 'H (400 MHz, D20) 5 8,69 (s, 1H), 4,56 (df, J = 15,4 Hz, 1H), 4,42 (dy, J = 15,5 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 5,5, 5,2 Hz, 1H), 3,42 (dd, IJ = 5,0, 17,0 Hz, 1H), 3,11 (dd, J = 10,2, 16,8 Hz, 1H).
(b) Ácido (S) -3, 5-bis (terc-butoxicarbonil)-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico (1-8)
[00109] A uma solução gelada agitada de dicloridrato de ácido (8) -4, 5,6, T-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6- carboxílico (I-7) (6,10 kg, 25,40 mol) em 1,4-dioxano (48 1, 8 vol) e água (48 1, 8 vol) foi adicionada trietilamina (12,36 1, 89 mol) gota a gota, seguida pela adição de dicarbonato de di-terc-butila (18,07 1, 78,74 mol, dissolvidos em 5 1 de 1,4-dioxano) durante um período de 30 minutos. A mistura de reação resultante foi agitada em temperatura ambiente pelas 16 horas seguintes. Após o término da reação (monitoramento por TLC e LCMS), a mistura de reação amarelada foi diluída com água (10 1) e lavada sucessivamente com éter dietílico (2 x 10 1) e EtOAc (2 x 7,50 1). A fase orgânica foi descartada. A camada aquosa foi resfriada e o pH foi ajustado para -3 com solução de HCl 6N; a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 10 1). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com solução de salmoura, secas sobre sulfato de sódio e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi cristalizado a partir de 30% EtOAc:hexanos para obter o produto desejado (1-8) como um sólido esbranquiçado (5,1 Kg, 55%). (m/z): [M+H]+ calculado para 368,18 de Ci7HasN30sk foi encontrado 368,21.
(c) 3, 5-di-terc-butil (S) -6, T-diidro-3H-imidazo[4,5- c]lpiridina-3,5,6(4H) -tricarboxilato de 6-benzila (1-9)
[00110] A uma solução gelada de ácido (S)-3,5-bis(terc- butoxicarbonil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5- c]lpiridina-6-carboxílico (1-8) (5,1 Kg, 13,88 mol) em DCM (51 1, 10 vol) foi adicionado, em sequência, solução saturada de bicarbonato de sódio (41,0 1, 8 vol), iodeto de tetra- butilamônio (5,13 Kg, 13,88 mol) e brometo de benzila (2,47 1, 20,82 mol). A mistura resultante da reação foi agitada em temperatura ambiente durante as 16 horas seguintes. Após o término da reação (monitoramento por TLC e LCMS), a solução bifásica foi separada. A camada aquosa foi extraída com DCM (3 x 10 1). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de salmoura, secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna através de gel de sílica (100-200M) ao usar os eluentes 40% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (1-9) como óleo viscoso (4,50 kg, 72%). (m/z): [M+H]+ calculado para 458,22 de CoaH3N30s foi encontrado 458,60.
(d) 5- (terc-butil) (S)-3,4,6,7-tetrahidro-5H- imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila (I- 10)
[00111] Foi adicionado a uma solução gelada de 3,5-di- terc-butil (S) -6, T-diidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-
3,5,6(4H) -tricarboxilato de 6-benzila (1-9) (4,50 kg, 9,84 mol) em IPA (45 1, 10 vol) hidróxido de amônio (36 1, 8 vol.) gota a gota. A mistura resultante da reação foi adicionalmente agitada em temperatura ambiente durante as 16 horas seguintes. Após o término da reação (monitoramento por TLC e LCMS), a mistura resultante foi diluída com água (25 1) seguida pela extração com EtOAc (3 x 20 1). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de salmoura, secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna através de gel de sílica (100-200M) ao usar os eluentes 2% MeOH em DCM para obter o produto desejado (I-10) como óleo viscoso espesso (2,70 kg, 77%). (m/z): [M+H]+ calculado para 358,17 de Ci9H2o3N30a4 foi encontrado 358,33.
(e) 5- (terc-butil) (S) -3-benzil-3,4,6,7-tetrahidro-5H- imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila (I- 11)
[00112] A uma solução gelada de 5-(terc-butil) (S)- 3,4,6,T-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6- dicarboxilato de 6-benzila (I-10) (2,70 kg, 7,55 mol) em DCM (32,4 1, 12 vol) foi adicionado hidróxido de sódio 1N aquoso (24,3 1, 9 vol.) seguido pela adição sequencial de iodeto de tetrabubilamônio (2,80 kg, 7,55 mol) e brometo de benzila (0,99 1, 8,31 mol). A mistura resultante da reação foi agitada em temperatura ambiente durante as 2 horas seguintes. Após o término da reação (monitoramento por TLC e LCMS), a solução bifásica foi separada. A camada aquosa foi extraída com DCM (3 x 10 1). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução de salmoura, secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna através de gel de sílica (100-200M) ao usar os eluentes 40% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-11) como um óleo viscoso (1,70 kg, 63%). (m/z): [M+H]+ calculado para 448,22 de CosH2o9N304 foi encontrado 448,20.
Preparo 3: 5- (terc-butil) (S) -3-benzil-2-(6-(4- (benziloxI) -2-etilfenil)-lH-indazol-3-il)-3,4,6,7- tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila (I1-16) ro ro EX Neco é OE e AA EE SE — Br Br 2 na E Bno. BNO, AOS E aê "o N > “Boc ns 6 (a) Cloreto de 4-bromo-2-fluorobenzila (I1-13)
[00113] Foi adicionado a uma solução gelada de ácido 4- bromo-2-fluorobenzoico (I1I-12) (1,25 kg, 5,71 mol) em DCM (12,5 , 15 vol) cloreto de oxalila (0,98 1, 11,42 mol) gota a gota. A mistura resultante da reação foi agitada durante minutos em temperatura ambiente. Foi adicionado DMF (150 ml) gota a gota à mistura de reação. A massa resultante da reação foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 2 horas. Após o término da reação (monitoramento por TLC), o excesso de cloreto de oxalila foi removido sob pressão reduzida em uma atmosfera de nitrogênio para obter o produto bruto (I1I-13) (1,08 kg, 80%), que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.
(b) 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-2- (4-bromo-2- fluorobenzoil)-3,4,6,T7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5- c]lpiridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila (I-14)
[00114] A uma solução agitada de 5-(terc-butil) (S)-3- benzil-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6- dicarboxilato de 6-benzila (I-11) (1,70 kg, 3,80 mol) em ACN (13,6 1, 8 vol) foi adicionada trietilamona (2,11 1, 15,2 mol), seguida pela adição de cloreto de 4-bromo-2- fluorobenzoila (1-13) (1,08 kg, 4,56 mol em ACN 3,4 1, 2 vol) em temperatura ambiente. Após o término da adição, a mistura resultante da reação mudou da cor marrom para amarelo claro. A mistura resultante da reação foi agitada em temperatura ambiente durante 30 min e o progresso da reação foi monitorado por TLC. A mistura resultante da reação foi resfriada com água gelada (10 1), seguida pela extração com EtoAc (3 x 51) e as fases orgânicas foram lavadas com solução de salmoura. As fases orgânicas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna através de gel de sílica (100-200M) ao usar os eluentes 20% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-14) (1,74 kg, 71%). %). (m/z): [M+H]+ calculado para 648,14 de C33H31BrEN3O0s foi encontrado 648,20.
(Cc) 5- (terc-butil) (S) -3-benzil-2- (6-bromo-lH-indazol- 3-11)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6- dicarboxilato de 6-benzila (I-15)
[00115] A uma solução agitada de 5-(terc-butil) (S)-3- benzil-2- (4-bromo-2-fluorobenzoil)-3,4,6,7-tetrahidro-5H- imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila (I- 14) (1,74 kg, 2,68 mol) em THF (26,0 1, 15 vol) foi adicionada hidrato de hidrazina (0,705 1, 13,4 mol) em temperatura ambiente. A mistura resultante da reação foi aquecida a 60 ºC durante 3 horas. Após o término da reação (monitoramento por TLC), a massa resultante da reação foi vertida em água gelada (10 1) seguida pela extração do composto com EtOAc (3 x 10 1). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura e secas sobre sulfato de sódio, filtradas e evaporadas sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna através de gel de sílica (100-200M) ao usar os eluentes 20% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-15) como um sólido esbranquiçado (1,12 kg, 65%). (m/z): [M+H]+ calculado para 642,16 de C33H32BrNsO, foi encontrado 642,21.
(d) 5- (terc-butil) (S) -3-benzil-2-(6-(4- (benziloxi)-2- etilfenil)-lH-indazol-3-i1)-3,4,6,7-tetrahidro-5H- imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila (I- 16)
[00116] Bis (pinacolato)diboro (250 g, 984 mmol) foi carregado em um frasco fundo redondo com 3 bocas de 5 1 previamente causticado usando química de flúor, juntamente com propan-2-ol (1882 ml, 2,46E+04 mmol), e a mistura foi agitada até dissolução completa. A dissolução foi endotérmica (-4ºC). Em um frasco Erlenmeyer de 41, previamente causticado usando química de flúor, foi dissolvido bifluoreto de potássio (538 g, 6891 mmol) em água
(2,306 1, 1,28E+05 mmol) para formar uma solução 3M.
A dissolução foi endotérmica (-12ºC). A solução foi filtrada em seguida para remover uma pequena quantidade de material insolúvel do bifluoreto de potássio.
Assim que ambas soluções foram totalmente dissolvidas, o conteúdo do frasco Erlenmeyerfoi carregado em um frasco simples, em porções, durante 15 minutos.
Foi observada uma moderação exotermia (+10 ºC). A solução se tornou uma pasta cinza, espessa, semi- opaca e translúcido durante a adição e a agitação foi aumentada para manter o conteúdo bem misturado.
A mistura foi agitada durante 1,5 horas e em seguida filtrada através de um funil esmerilhado de vidro grosso (4 l, previamente causticado). A filtração levou de 30 a 45 minutos para ser concluída.
Foi descartado o filtrado bifásico claro.
Os sólidos brancos foram secos durante 10 minutos no filtro (foi observada a quebra da massa). Os sólidos foram transferidos para um frasco fundo redondo com 3 bocas de 1, limpo, e a pasta foi produzida novamente com água (1,33 1, 7,38E+04 mmol). A pasta foi agitada durante 2 horas; depois disso, foi formado um hidrogel homogêneo.
A solução foi agitada por mais 1 hora, na qual os sólidos/gel foram filtrados usando um funil de vidro grosso de 4 1 (previamente causticado). Os sólidos secaram no filtro durante 30 minutos.
Os sólidos foram transferidos de volta para um frasco fundo redondo com 3 bocas de 5 1 limpoe a pasta foi refeita em acetona (1,084 1, 1,48E+04 mmol). A pasta branca/cinza foi agitada durante 1 hora e em seguida filtrada através de um funil de vidro grosso de 4 1 (previamente causticado). A filtração levou 20 minutos para terminar e em seguida foi seca no funil por mais l1 hora. Durante esse período, os sólidos foram agitados ocasionalmente para garantir secagem homogênea. Permaneceu um pó branco fino após a secagem no filtro. Os sólidos foram secos durante 20 horas a 55 “C sob vácuo com uma leve liberação de nitrogênio para obter um sólido branco macio (foram coletados 200,3 g).
[00117] A uma mistura agitada de 5-(terc-butil) (S)-3- benzil-2-(6-bromo-lH-indazol-3-i1)-3,4,6,7-tetrahidro-5H- imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila (I- 15) (10,0 g, 16,0 mmol) em 2-metil tetrahidrofurano (100 ml, vol) foi adicionado o sal potássico de (4- (benziloxi)-2- etilfenil)trifluoro-A'-borano (1-5) (8,0 g, 20 mmol) e o pó branco macio obtido na etapa acima (0,20 g). A mistura resultante da reação foi desgaseificada com gás nitrogênio durante 30 minutos. A esta solução foi adicionada uma solução aquosa preparada de carbonato de césio (20,0 g, 62,0 mmol em 60 ml de água, 6 vol). A mistura resultante da reação foi mais desgaseificada durante 15 minutos seguida pela adição de bis (di-terc-butil (4- dimetilaminofenil)fosfina)dicloropaládio(I11I) (0,66 g, 0,93 mmol) e a mistura de reação foi evacuada sob vácuo e enxaguada com nitrogênio. A mistura resultante da reação foi aquecida a 110 ºC durante 20 horas. Após o término da reação (monitoramento por TLC e LCMS), a mistura resultante da reação foi resfriada em temperatura ambiente e filtrada por um leito de celite e em seguida lavada com EtOAC (3 x 0,5 1). A fases orgânicas combinadas foram lavadas com solução de hidróxido de sódio 1N (3 x 0,5 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura e secas sobre sulfato de sódio, filtradas e evaporadas sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna através de gel de sílica (100-200M) ao usar os eluentes 20% EtOAc em hexano para obter o produto desejado (I-16) (como mistura de regioisômeros de N-benzil) como um sólido amarelo claro (8,0 g, 66%). (m/z): [M+H]+ calculado para 774,36 de CasHa7N5Os foi encontrado 774,59.
Preparo 4: Ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-l1lH- indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina- 6-carboxílico, cloridrato (I1-18) sro sro, SE (a) (S) -3-benzil-2-(6- (4- (benziloxi)-2-etilfenil)-lH- indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina- 6-dicarboxilato de benzila, cloridrato (I1I-17)
[00118] Foi dissolvido 5-(terc-butil) (S)-3-benzil-2- (6- (4- (benziloxi)-2-etilfenil)-lH-indazol-3-il1)-3,4,6,7- tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila (I1I-16) (1,0 g, 1,292 mmol) em dioxano (8 ml) e água (1,5 ml); em seguida, foi adicionada solução de ácido clorídrico 4M em dioxano (7 ml, 28,0 mmol) e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 3 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). A mistura de reação foi congelada e liofilizada e o produto bruto (I1-17) foi usado diretamente na reação seguinte (foi considerado o rendimento quantitativo). (m/z): [M+H]+ calculado para 674,31 de Ca3H3a9N503 foi encontrado 674,3.
(b) Ácido (S) -2- (6- (2-etil-4-hidroxifenil)-lH- indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina- 6-carboxílico, cloridrato (I1-18)
[00119] Foi dissolvido (S) -3-benzil-2-(6- (4- (benziloxi)-2-etilfenil)-lH-indazol-3-i11)-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxilato de benzila, cloridrato (I1-17) (0,918 g, 1,292 mmol) em 2- propanol (15 ml), solução de cloreto de hidrogênio, 5M em água (0,258 ml, 1,292 mmol) e água (0,25 ml) a 50 ºC; em seguida, foi adicionado paládio, 10% p em carbono, 50% de água (0,138 g, 0,065 mmol). O frasco de reação foi em seguida purgado com nitrogênio; foi fixado um frasco de hidrogênio e a mistura de reação foi agitada a 50 ºC durante 4 dias com o frasco de hidrogênio sendo reabastecido conforme necessário (progresso da reação monitorado por LCMS). Todos os sólidos foram removidos por filtração e a solução resultante foi concentrada. O resíduo foi dissolvido em 1:1 de ACN/água, congelado e liofilizado. O pó resultante (I1-18) foi usado sem purificação adicional (foi considerado o rendimento quantitativo). (m/z): [M+H]+ calculado para 404,17 de CooHoiN5O03 foi encontrado 404,2.
Preparo 5: Ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-lH- indazol-3-il) -5-isopropil —-4,5,6,7-tetrahidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico (1I-19)
HO.
J O o > OO HN- N N
SD 119
[00120] Foi suspendido ácido (8) -2- (6- (2-etil-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, HCl (I-18) (0,25 g, 0,568 mmol) em DMF (2,5 ml) e acetona (2,5 ml); em seguida, ácido acético (0,098 ml, 1,705 mmol) e cianoborohidreto de sódio (0,179 gq, 2,84 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). A mistura de reação foi concentrada; em seguida, o produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (5-70% gradiente de ACN/água, 50 g coluna Cl8agq) para fornecer o sal de TFA do título composto (149 mg, 47% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 446,21 de CosHoNs5O03z foi encontrado 446,3.
Exemplo 1: (S) - (3- (dimetilamino) azetidin-1-11) (2- (6- (2-etil-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-yl)-5-isopropil- 4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona HO.
O o To tor / NON À meo NO 1
[00121] Foram dissolvidos ácido (8) -2- (6- (2-etil-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-
tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, HCl (1-19) (50 mg, 0,089 mmol), cloridrato de 3- (Dimetilamino)azetidina (23,20 mg, 0,134 mmol) e DIPEA (0,078 ml, 0,447 mmol) em DMF (1,5 ml); em seguida, HATU (51,0 mg, 0,134 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 3 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicionada hidrazina (0,014 ml, 0,447 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis e a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (5-70% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (25 mg, 37% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 528,30 de C309H37;N;O2z foi encontrado 528,3. RMN de 'H (400 MHz, DMSO-d6) 5 13,09 (s, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,27 (d, J = 8,31, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,04 (m, 2H), 6,71 (df, J = 2,54, 1H), 6,64 (dd, J = 2,53, 8,26, 1H), 4,26 (m, 1H), 4,06 (m, 2H), 3,82 (m, 2H), 3,64 (m, 2H), 3,03 (m, 2H), 2,74 (m, 2H), 2,47 (q, JIJ = 7,56, 2H), 2,07 (d, J = 3,69, 6H), 1,07 (m, 6H), 1,00 (t, J = 7,50, 3H).
Preparo 6: Ácido (S) -5-etil —2-(6- (2-etil-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico HO.
o OQ oH Pa nt ENO ON a
[00122] Foram dissolvidos ácido (S) -2- (6- (2-etil-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, HCl (0,100 g, 0,227 mmol) (I-18) e acetaldeído (0,019 ml, 0,341 mmol) em metanol (3,0 ml); em seguida, cianoborohidreto de sódio (0,057 g, 0,909 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicionado borohidreto de sódio (9 mg, 0,227 mmol) para retirar qualquer acetaldeído remanescente; em seguida, a mistura de reação foi concentrada. O produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (5-70% gradiente de ACN/água, 40 q coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (62 mg, 50% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 432,20 de CoaHosN503 foi encontrado 432,1.
Exemplo 2: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-l-il) (5-etil- 2-(6- (2-etil-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona Ho.
O o Pot A EN ON 9 2
[00123] Foram dissolvidos ácido (S) -5-etil-2-(6-(2- etil-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, TFA (30 mg, 0,055 mmol), cloridrato de 3- (Dimetilamino)azetidina (14,28 mg, 0,082 mmol) e DIPEA (0,048 ml, 0,275 mmol) em DMF (1,50 ml); em seguida, HATU (31,4 mg, 0,082 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (5,18 pl, 0,165 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (5-60% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (25 mg, 63% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 514,29 de C>9H35N;O2r foi encontrado 514,2.
Exemplo 3: (S) - (3- (dimetilamino) -3-metilazetidin-l1- il) (5-etil-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)- 4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona HO. O o To vt A HNK ON 9 3
[00124] Foram dissolvidos ácido (S) -5-etil-2-(6-(2- etil-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, TFA (30 mg, 0,055 mmol), cloridrato de N,N,3-trimetilazetidin-3-amina (12,43 mg, 0,082 mmol) e DIPEA (0,048 ml, 0,275 mmol) em DMF (1,50 ml); em seguida, HATU (31,4 mg, 0,082 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (5,18 pl, 0,165 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (5-60% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (25 mg, 62% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 528,30 de C309H3;N;O02 foi encontrado 528,2. Exemplo 4: (S) - (3- (dimetilamino) -3-metilazetidin-l1- il) (2- (6- (2-etil-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-yl)-5- isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il)metanona HO. O o Pont A
VN N À mo NO 4
[00125] Foram dissolvidos ácido (S) -2- (6- (2-etil-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, (40 mg, 0,090 mmol) (1-19), cloridrato de N,N,3- trimetilazetidin-3-amina (20,29 mg, 0,135 mmol) e DIPEA (0,047 ml, 0,269 mmol) em DMF (1,50 ml); em seguida, HATU (51,2 mg, 0,135 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (8,45 pl, 0,269 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (5-60% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (26 mg,
38% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 542,32 de C31H39N702 foi encontrado 542,2.
Preparo 7: Ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-lH- indazol-3-il) -5-propil -4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5- c]piridina-6-carboxílico (1-20) HO.
O o Part ”
CNN
BN ON AL 1-20
[00126] Foram dissolvidos ácido (8) -2- (6- (2-etil-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, HCl (1-18) (0,160 g, 0,364 mmol) e propionaldeído (0,039 ml, 0,546 mmol) foram dissolvidos em metanol: (3,0 ml); em seguida, cianoborohidreto de sódio (0,069 g, 1,091 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). A mistura de reação foi concentrada e o produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (5- 70% gradiente de ACN/água, 50 g coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (78 mg, 38% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 446,21 de CosHoNs5O03z foi encontrado 446,3.
Exemplo 5: (S) - (3- (dimetilamino) azetidin-1-il) (2- (6- (2-etil-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-yl)-5-propil-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
HO. O o Ponto:
VN ON À EN ON a
[00127] Foram dissolvidos ácido (8) -2- (6- (2-etil-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, TFA (30 mg, 0,054 mmol) (1-20), cloridrato de 3- (dimetilamino)azetidina (13,92 mg, 0,080 mmol) e DIPEA (0,047 ml, 0,268 mmol) em DMF (1,50 ml); em seguida, HATU (30,6 mg, 0,080 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (5,05 pl, 0,161 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (5-60% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (26 mg, 63% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 528,30 de C309H3;N;O02 foi encontrado 528,2.
Exemplo 6: (S) - (3- (dimetilamino) -3-metilazetidin-1- il) (2- (6- (2-etil-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-yl)-5-propil- 4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona HO. O o Todo
VN ON À
EN ON AL 6
[00128] Foram dissolvidos ácido (S) -2- (6- (2-etil-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, TFA (30 mg, 0,054 mmol) (1I-20), cloridrato de N,N,3-trimetilazetidin-3- amina (12,12 mg, 0,080 mmol) e DIPEA (0,047 ml, 0,268 mmol) em DMF (1,50 ml); em seguida, HATU (30,6 mg, 0,080 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (5,05 pl, 0,161 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (5-60% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (18 mg, 44% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 542,32 de C31H39N;O02r foi encontrado 542,2.
Preparo 8: 2- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)- 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano
F F F HO. BnO. BnO. — —=— Oo. > ss Px o (a) 1- (benziloxi)-4-bromo-5-etil-2-fluorobenzeno
[00129] A uma solução de 4-bromo-5-etil-2-fluorofenol (20 g, 910,32 mmol) em ACN (250 ml) foi adicionado K2CO;3 (31,55 q, 228,3 mmol) seguido por brometo de benzila (13,10 ml, 109,58 mmol), gota a gota. A mistura da reação resultante foi agitada a 80 ºC durante 2 h. A camada aquosa foi extraída com EtOAc (três vezes), combinada e lavada com salmoura. A camada orgânica foi seca sobre Na7;SO, e evaporada sob pressão reduzida para alcançar o título intermediário como um líquido oleoso amarelo claro (25 g, 89% de rendimento). RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio-d) 5 7,48 - 7,30 (my, 5H), 7,27 (dy, J = 10,5 Hz, 1H), 6,87 (dy, J = 8,7 Hz, 1H), 5,12 (s, 2H), 2,66 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 1,16 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
(b) 2- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolano
[00130] A uma solução do produto da etapa anterior (12,5 g, 40,45 mmol) em dioxano (100 ml) foi adicionado (bis)pinacolato diboro (15,40 g, 60,67 mmol) e KOAc (11,9 g, 121,35 mmol). A mistura de reação foi purgada com nitrogênio durante 15 min seguida pela adição de [1,1'- bis (difenilfosfino) ferroceno]dicloropaládio(I11I), complexo com diclorometano (1,65 g, 2,023 mmol). A mistura resultante da reação foi agitada e aquecida a 110 ºC durante 3 horas, filtrada através de Celite e o resíduo, lavado com EtOAc. O filtrado foi diluído com excesso de EtOAc (200 ml) e lavado com água (100 ml) seguido de salmoura (100 ml), seco sobre sulfato de sódio e concentrado em vácuo para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (1000-200), eluído com 3-5% de EtOAc: Hexano para obter o produto desejado como um sólido quase branco (9,50 g, 66% de rendimento). RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio- d) 5 7,54 -— 7,27 (m, 6H), 6,81 (df, J = 7,9 Hz, 1H), 5,16 (s,2H), 2,84 (q, J= 7,5 Hz, 2H), 1,32 (s, 12H), 1,14 (t, O = 7,5 Hz, 3H).
Preparo 9: 6-(4-(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-3-(trimetilestanil)-lH-indazol A 2 NY F ' o BnoO. x aro 1 BnO. THP O O Ds. Q DA > AN
ANN THP
F Bno À Bno x aro O - Pa Ta A: = = NS se HN-N ANN THP THP' (a) 6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-lH-indazol
[00131] Foi adicionado uma solução de 6-bromo-1- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-lH-indazol (50 g, 178,57 mmol) e 2- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-dioxaborolano (76,3 g, 214,29 mmol) em DMF : HO (480:120 ml) K3;PO, (94,64 g, 446,86 mmol). A mistura de reação foi desgaseificada com nitrogênio durante 15 min e em seguida, foi adicionado o catalisador Pd(PPh3)xCl>, (6,26 g, 8,93 mmol) e a mistura foi novamente desgaseificada com nitrogênio durante 5 min e aquecida a 100 a 110 ºC durante horas. A mistura de reação foi filtrada através de Celite e o resíduo foi lavado com EtOAc. O filtrado foi diluído com EtOAc, lavado com água fria e salmoura, seco sobre sulfato de sódio e concentrado em vácuo para fornecer produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna de flash para obter o intermediário de título como um sólido branco (65 g, 86% de rendimento). (m/z): [M+H]* calculado para 431,21 de
C27H27FN202 foi encontrado 431,46. RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio-d) 5 8,06 - 7,98 (m, 2H), 7,70 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,51 - 7,32 (my, 5H), 7,08 (dd, J = 809,6, 8,3 Hz, 1H), 7,03 (df, J= 11,9 Hz, 1H), 6,95 (dy, J = 8,5 Hz, 1H), 5,76 - 5,64 (my, 1H), 5,20 (s, 2H), 4,04 (dy, J = 10,1 Hz, 1H), 3,72 (t, J = 9,7 Hz, 1H), 2,52 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 2,22 - 2,02 (m, 3H), 1,80 - 1,71 (m, 3H), 1,06 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
(b) 6-(4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-lH-indazol
[00132] A uma solução do produto da etapa anterior (65 g, 151,16 mmol) em metanol (700 ml) foi adicionado HCl conc. (120 ml) e a solução resultante foi aquecida a 60 a 65 ºC durante 3 horas, resfriada em TA e concentrada sob vácuo. O resíduo foi dissolvido em EtOAc e lavado com solução saturada de NaHCO; e água. A fase orgânica foi seca sobre Na2SOs anidro e concentrada sob vácuo para alcançar o título intermediário como um sólido branco (52 g, 99% (bruto)). RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio-d) 5 8,13 (s, 1H), 7,77 (df, J = 8,3 Hz, 1H), 7,59 - 7,30 (m, 6H), 7,10 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,01 (df, J = 11,8 Hz, 1H), 6,96 (dy, J = 8,4 Hz, 1H), 5,21 (s, 2H), 2,53 (q, J=7,5 Hz, 2H), 1,05 (t, J= 7,5 Hz, 3H).
(Cc) 6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3-iodo-1H- indazol
[00133] A uma solução de 6-(4-(benziloxi)-2-etil-5- fluorofenil)-lH-indazol (56 g, 161,18 mmol) em DMF (400 ml) foi adicionado KOH (36,2 g, 647,39 mmol) e a mistura foi agitada durante 5 minutos. A solução de iodo (82,2 9, 323,69 mmol) em DMF (100 ml) foi adicionada lentamente a O ºC e agitada em TA durante 30 minutos, diluída com água (3 x 150 ml) e extraída com EtoOAc (3 x 200 ml). A fase orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de metabissulfito de sódio (3 x 200 ml) e água (400 ml), seca em Na7;SO, anidro e concentrada sobre pressão reduzida para obter o produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna de flash para obter o título intermediário como um semissólido acastanhado (649, 84% de rendimento). RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio-d) 10,49 (s, 1H), 7,57 - 7,32 (my, 7H), 7,16 (dy, J = 8,3 Hz, 1H), 7,04 - 6,91 (m, 2H), 5,20 (s, 2H), 2,51 (q, J = 7,4 Hz, 2H), 1,04 (t, J= 7,5 Hz, 3H).
(d) 6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3-iodo-l1- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-lH-indazol
[00134] A uma solução gelada do produto da etapa anterior (60 g, 127,12 mmol) em DCM (700 ml) foi adicionado ácido p-toluenossulfônico (4,84 g, 25,423 mmol) seguido por 3,4-diidro-2H-pirano (17,43 ml, 190,68 mmol) gota a gota. A mistura da reação foi agitada em TA durante a noite, diluída com DCM e lavada com solução aquosa saturada de NaHCO; e salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na;SO0, anidro e concentrada sob pressão reduzida para fornecer o produto bruto que foi purificado por cromatografia flash (gel de sílica) para obter o título intermediário como um sólido esbranquiçado (64 g, 91% de rendimento). (m/z): [M+H]* calculado para 557,10 de C>;H2;FIN270, foi encontrado 557,30. RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio-d) 5 7,56 - 7,31 (m, 7H), 7,14 (df, J = 8,3 Hz, 1H), 7,01 (df, J = 11,8 Hz, 1H), 6,95 (dy, J = 8,5 Hz, 1H), 5,68 (dy, J = 9,3 Hz, 1H), 5,20 (s, 2H), 4,08 - 3,99 (m, 1H), 3,77 - 3,64 (m, 1H), 2,50 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 2,23 - 1,97 (m, 3H), 1,81 - 1,68 (m, 3H), 1,06 (t, J=7,4 Hz, 3H).
(e) 6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-3-(trimetilestanil)-lH-indazol
[00135] A uma solução de 6-(4-(benziloxi)-2-etil-5- fluorofenil)-3-iodo-l- (tetrahidro-2H-piran-2-1il)-lH-indazol (20 gq, 35,97 mmol) em tolueno (150 ml) foi adicionado hexametilditina (9,2 ml, 43,17 mmol). A mistura de reação foi desgaseificada com nitrogênio durante 20 min, seguida por adição de tetrakis (2,0 g, 1,80 mmol) e em seguida, agitada a 100 ºC durante 2 horas, resfriada em TA, filtrada através de Celite e o resíduo lavado com EtOAc. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna (em alumina neutra), eluído com 2-5%. EtOAc:hexano para obter o título composto (17,50 g, 82% de rendimento). (m/z): [M+H]* calculado para 595,17 de C30H35EN20, 593,17 foi encontrado 595,49, 593,55. RMN de 'H (400 MHz, clorofórmio-d) 5 7,68 (dy, J = 8,0 Hz, 1H), 7,57 - 7,29 (my, 6H), 7,13 - 7,00 (m, 2H), 6,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,81 - 5,68 (m, 1H), 5,21 (s, 2H), 4,13 - 4,00 (m, 1H), 3,81 - 3,66 (m, 1H), 2,54 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 2,23 - 2,00 (m, 2H), 1,87 - 1,59 (m, 4H), 1,08 (t, J= 7,5 Hz, 3H), 0,47 (s, 9H).
Preparo 10: (S) -2-iodo-3- ((2-trimetilsilil)etoxi) metil)- 3,4,6,7-tetrahidro -5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6- dicarboxilato de 5- (terc-butila), 6-metila o 9 9
DP o o o
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(a) Ácido (S) -4, 5,6, T-tetrahidro-3H-imidazo[4,5- c]lpiridina-6-carboxílico
[00136] A uma suspensão agitada de L-histidina (50 g, 322,24 mmol) em água (420 ml) foi adicionado HCl conc. (29 ml) gota a gota a O ºC, seguido por formaldeído (55 ml, 676,72 mmol) em uma porção a O ºC. A mistura resultante da reação foi agitada durante 30 minutos e, em seguida, aquecida a 75 ºC durante 6 horas e concentrada. O produto bruto resultante foi agitado durante 2 horas com éter dietílico, filtrado e lavado com IPA:THF (100:300 ml) para fornecer o sal cloridrato do título intermediário como sólido esbranquiçado (75 gq, 99% de rendimento (bruto) ). (m/z): [M+H]* calculado para 168,07 de C;H9N307 foi encontrado 168,17.
(b) (8) -4, 5,6, T-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina- 6-carboxilato de metila
[00137] A uma solução agitada do produto da etapa anterior (75,0 g, 312,5 mmol) em metanol (1500 ml) foi adicionado SOCl, (45,6 ml, 625 mmol) gota a gota a 0 ºC e agitada em TA durante 16 horas e em seguida aquecida sob refluxo (70 ºC) durante 1 hora. O solvente foi removido por destilação; o produto bruto foi triturado com metanol seguido pelo éter dietílico para fornecer o sal cloridrato do título intermediário como um sólido esbranquiçado (80 g bruto). RMN de 'H (400 MHz, DMSO-ds;) 3 9,05 (s, 1H), 4,71 (dd, J = 9,4, 5,2 Hz, 1H), 4,36 (dy, J = 15,5 Hz, 18), 4,30 (dy, J = 15,6 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,44 - 3,21 (m, 2H).
(Cc) 6-metil (S) -3,4,6,T-tetrahidro-5H-imidazo[4,5- c]lpiridina-5,6-dicarboxilato de 5- (terc-butila)
[00138] A uma solução agitada do produto da etapa anterior (80,0 g, 314,96 mmol) em metanol (1000 ml) foi adicionado DIPEA (282 ml, 1574 mmol) seguido por dicarbonato de di-terc-butila (172 ml, 787,48 mmol) a O ºC. A mistura de reação foi agitada em TA durante 16 horas e em seguida, NH; líquido (150 ml, 25% em água) foi adicionado e a mistura da reação foi agitada novamente durante 16 horas em TA; o metanol foi removido por destilação e o resíduo foi extraído em DCM (3 x 200 ml). Os extratos orgânicos combinado foram secados sobre NasSO0, anidro, concentrados e purificados por cromatografia flash (malha de gel de sílica 100-200), eluído com 5% MeOH:DCM para obter o título intermediário (41 g, 46% de rendimento). (m/z): [M+H]* calculado para 282,14 de C13H19N304 foi encontrado 282,21. RMN de 'H (400 MHz, DMSO-dk;) 11,85 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 5,18 (dd, JIJ = 49,3, 5,1 Hz, 1H), 4,51 (t, J= 14,2 Hz, 1H), 4,09 (dd, J = 43,9, 16,1 Hz, 1H), 3,59 (s, 3H), 3,08 (dy, J = 15,5 Hz, 1H), 2,94 (dy, J = 15,1 Hz, 1H), 1,45 (s, 9H).
(d) (S) -2-iodo-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5- c]lpiridina-5,6-dicarboxilato de 5- (terc-butila), 6-metila
[00139] A uma solução do produto da etapa anterior (41,0 gq, 145,9 mmol) em THF (500 ml) foi adicionado N- iodossuccinimida (66,0 g, 291,8mmol) a O ºC e a solução resultante foi agitada em TA durante 4 horas, diluída com água e extraída com acetato de etila. A porção orgânica foi lavada com solução de tiossulfato de sódio a 10% (3 x 200 ml). A fase orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para fornecer o título composto 60 g (bruto), que foi usado na próxima etapa sem purificação. (m/z): [M+H]* calculado para 408,3l de Ci3HigIN;O0, foi encontrado 408,03. RMN de 'H (400 MHz, DMSO-d;) 5 12,48 (s, 1H), 5,34 - 4,97 (m, 1H), 4,67 - 4,35 (my, 1H), 4,12 - 3,95 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,14 - 2,82 (m, 2H), 1,44 (s, 9H).
(e) (S) -2-iodo-3-((2-trimetilsilil)etoxi) metil)- 3,4,6,T7T-tetrahidro -5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6- dicarboxilato de 5- (terc-butila), 6-metila
[00140] A uma solução agitada de (S)-2-iodo-3,4,6,7- tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 5- (terc-butila) 6-metila (40 g, 0,098 mol) em DMF (150 ml) foi adicionado DIPEA (35,1 ml, 0,19 mol) a O ºC. A mistura de reação foi agitada por 10 minutos; em seguida, foi adicionado cloreto de 2- (trimetilsilil)-etoximetila (19,1 ml, 0,10 mol) gota a gota a O ºC. A mistura de reação resultante foi agitada durante 3 h em TA. Após 4 horas, foi adicionada água resfriada e a mistura de reação foi extraída com EtOAc (2 x 200 ml). A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro, concentrada e purificada por cromatografia em coluna de flash, eluída com hexano:EtOAc 20-35% para obter o título do produto como um líquido viscoso amarelo claro (27 gq). (m/z): [M+H]* calculado para 538,12 de C19H32IN305sSi foi encontrado 538,42. RMN de 'H (400 MHz, DMSO- ds.) 5 5,33 - 5,04 (my, 3H), 4,79 - 4,56 (my, 1H), 4,54 - 4,14 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,47 (t, J= 7,8 Hz, 2H), 3,31 - 3,16 (m, 1H), 2,97 (t, J = 18,9 Hz, 1H), 1,44 (s, 9H), 0,92 - 0,74 (m, 2H), -0,03 (s, 9H).
Preparo 11: Ácido (6S)-5-(terc-butoxicarbonil)-2-(6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-l1-(tetrahidro-2H-piran-2- il) -l1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)- 4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico
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F F Bno. Bno - o O 2 — O N oH 7 'oBn “TI o Nº ANN ON “Boc 14º deu so TÁP SE (A) (68) -2- (6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-l1- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-l1H-indazol-3-il)-3-((2- (trimetilsilil) etoxi) metil)-3,4,6,7-tetrahidro-5H- imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 5-(terc-butila) 6-metila
[00141] A uma solução agitada de (S)-2-iodo-3-((2- trimetilsilil)etoxi) metil)- 3,4,6,7-tetrahidro -5H- imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 5- (terc- butila), 6-metila (17,0 g, 31,65 mmol) em tolueno (500 ml) foi adicionada 6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-l1- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-3-(trimetilestanill)-lH-indazol (20 gq, 34,82 mmol). A mistura de reação foi purgada com argônio durante 15 minutos, foram adicionados Pd(PPh3). (3,6 g, 3,16 mmol) e iodeto de cobre (1,20 g, 6,33 mmol) e a mistura de reação foi agitada a 120 ºC durante 16 horas. A mistura de reação foi filtrada através de Celite, o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (coluna Redisep 80 g, eluído com DCM durante 10 minutos e, em seguida, em 15-20% de EtOAc em hexano para obter o título intermediário como um sólido amarelo (15,109, 58% de rendimento). (m/z): [M+H]* calculado para 840,41 de CasHsgENsO;Si foi encontrado 840,54. RMN de 'H (400 MHz, Clorofórmio-d) 5 8,43 (s, 1H), 7,54 - 7,33 (my, 6H), 7,20 (s, 1H), 7,05 (dy, J = 11,4 Hz, 1H), 6,95 (dy, J=8,5 Hz, 1H), 6,09 - 5,69 (m, 3H), 5,59 - 5,36 (m, 1H), 5,20 (s, 2H), 4,97 - 4,80 (m, 1H), 4,12 - 3,90 (m, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,57 - 3,47 (m, 2H), 3,40 (d, 1H), 3,21 - 3,05 (my, 1H), 2,74 - 2,34 (m, 4H), 2,25 - 2,07 (m, 2H), 1,94 - 1,65 (m, 4H), 1,54 (s, 9H), 1,12 - 0,99 (m, 3H), 0,91 - 0,75 (m, 2H), -0,12 (s, 9H).
(b) (68) -2- (6- (4- (benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-l1- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-l1H-indazol-3-il)-3-((2- (trimetilsilil) etoxi) metil)-3,4,6,7-tetrahidro-5H- imidazo[4,5-c]piridina-5,6-dicarboxilato de 6-benzila 5- (terc-butila)
[00142] A um frasco de fundo redondo foi adicionado o produto da etapa anterior (15,0 g, 17,85 mmol) em tolueno (400 ml), álcool benzílico (46,3 ml) e Ti(OEt). (7,15 ml, 35,70 mmol) e a mistura de reação foi refluída vigorosamente (140 ºC) durante 48 horas com água e extraída com o DCM. A suspensão foi filtrada, o filtrado foi seco sobre NazSO.s, concentrado sob pressão reduzida e purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (coluna Redisep 80, 0-5% EtOAc em hexanos) durante 20 minutos para remover O excesso de álcool benzílico; em seguida, eluída com 10-15%
EtOAc em hexano) para fornecer o título intermediário. A RMN H' está em conformidade com a estrutura. (m/z): [M+H]* calculado para 916,44 de Cs2H.2FN5O;Si foi encontrado 916,86.
(C) Ácido (6S)-5-(terc-butoxicarbonil)-2-(6-(2-etil-5- fluoro-4-hidroxifenil)-l-(tetrahidro-2H-piran-2-1il)-1H- indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico
[00143] A uma solução agitada do produto da etapa anterior (21,0 g, 22,92 mmol) em 1:1 IPA:THF (400 ml)) foi adicionado Pd(OH); (5,0 g). A mistura de reação foi agitada em TA durante 16 horas sob um frasco de hidrogênio, filtrada através de Celite, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em coluna de gel de sílica (coluna 80 Redisep, eluída com 25-40% EtOAc em hexano) para fornecer o título composto (6,1 g, 8,29 mmol) como um sólido esbranquiçado). (m/z): [M+H]* calculado para 736,35 de C3gHsoFN5O;Si foi encontrado 736,5. A RMN H está em conformidade com a estrutura. (m/z): [M+H]* calculado para 736,35 de C3gHsoFNsO;Si foi encontrado 736,5. RMN de 'H (400 MHz, DMSO-ds;) 5 12,94 (s, 1H), 9,86 (s, 1H), 8,34 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,20 (dy, J = 8,7 Hz, 1H), 7,03 (dy, J = 11,8 Hz, 1H), 6,93 (dy, J = 9,1 Hz, 1H), 6,11 — 5,77 (m, 3H), 5,33 - 5,06 (m, 1H), 4,87 - 4,56 (my, 1H), 4,52 - 4,14 (m, 1H), 3,97 - 3,69 (m, 2H), 3,53 - 3,40 (m, 2H), 3,23 — 3,11 (my, 1H), 3,11 - 2,93 (my, 1H), 2,47 - 2,44 (m, 2H), 2,13 - 1,96 (m, 2H), 1,68 (dy, J = 70,9 Hz, 4H), 1,48 (s, 9H), 1,02 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 0,86 - 0,68 (m, 2H), -0,17 (s, 9H).
Preparo 12: Ácido (S) -2- (6- (2-etil-5-fluoro-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico
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[00144] À uma solução agitada de ácido (6S)-5-(terc- butoxicarbonil)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-l- (tetrahidro-2H-piran-2-il)-l1H-indazol-3-il)-3-((2- (trimetlsilil)etoxi)-metil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico (5,7 g, 7,75 mmol) em 5:1 dioxano:água (60 ml) foi adicionado HCl conc. (20 ml) gota a gota a O ºC. A mistura de reação foi aquecida e agitada a 90 ºC durante 16 horas e destilada sob vácuo para fornecer o resíduo bruto, que foi triturado em sequência com éter dietílico e acetonitrila para fornecer o sal HCl do composto do título (3,6 g, 95% de rendimento) como um sólido marrom-claro. (m/z): [M+H]* calculado para 422,16 de Ca2HooFN503 foi encontrado 422,24. RMN de 'H (400 MHz, D20/DMSO-d;) 5 8,22 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,19 (dy, J = 8,1 Hz, 1 H), 6,99 (dy, J = 11,9 Hz, 1 H), 6,91 (d, J=9,0 Hz, 1H), 4,56 - 4,51 (my, 1H), 4,36 (dy, J= 15,5 Hz, 1H), 4,30 (dy, J = 15,5 Hz, 1H), 3,35 - 3,25 (my, 18), 3,15 - 3,05 (my, 1H), 2,4 - 2,55 (my, 2H), 0,97 (t, J= 7,5 Hz, 38).
Preparo 13: Ácido (S) -2- (6- (2-etil-5-fluoro-4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico
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[00145] A uma solução de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5- fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-11)-4,5,6,7-tetrahidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico, HCl (400 mg, 0,874 mmol), acetona (0,192 ml, 2,62 mmol), e ácido acético (0,150 ml, 2,62 mmol) em DMF (7 ml), foi adicionado cianoborohidreto de sódio (274 mg, 4,37 mmol) e a mistura de reação foi agitada em TA durante a noite. Foi adicionado borohidreto de sódio (33 mg, 0,874 mmol), a solução foi concentrada e purificada por HPLC preparativa para fornecer o sal TFA do título composto (115 mg, 23% de rendimento). (m/z): [M+H]* calculado para 464,20 de CosHosENsO;z foi encontrado 464,5.
Exemplo 7: (S) - (3- (dimetilamino) azetidin-1-il) (2- (6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-1il)-5- isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il)metanona C-1
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[00146] A uma solução de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5- fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-isopropil- 4,5,6,7T-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico, TFA (179 mg, 0,310 mmol), N,N-dimetilazetidin-3-amina, 2 HCl (107 mg, 0,465 mmol) e DIPEA (0,162 ml, 0,930 mmol) em DMF (4 ml) foi adicionado cianoborohidreto de sódio (177 mg, 0,465 mmol) e a mistura de reação foi agitada em TA durante a noite. Foi adicionada hidrazina (5 eq), a mistura da reação foi concentrada e purificada por HPLC preparativa para fornecer o sal de TFA do título composto (63 mg, 26% de rendimento). (m/z): [M+H]* calculado para 546,29 de C30H36FN702 foi encontrado 546,7. RMN de 'H (400 MHz, DMSO-dk;) 9,90 (s, 1H), 8,29 (dd, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,07 (d, 1H), 7,01 (d, 1H), 6,89 (d, 1H), 4,35 - 4,18 (m, 1H), 4,11 - 3,94 (m, 1H), 3,94 - 3,73 (m, 3H), 3,70 - 3,57 (m, 2H), 3,06 - 2,94 (m, 2H), 2,87 - 2,66 (m, 2H), 2,48 - 2,40 (m, 2H), 2,13 —- 2,00 (m, 6H), 1,07 (t, 3H), 1,03 - 0,93 (m, 6H).
Exemplo 8: (S) - (3- (dimetilamino) -3-metilazetidin-1- il) (2- (6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-yl)- 5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il)metanona
F HO. O o Pagto
CNN À mo NOS c-4
[00147] Foram dissolvidos ácido (8) -2- (6- (2-etil-5- fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-isopropil- 4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-
dicarboxílico, TFA (30 ma, 0,052 mmol), N,N,3- trimetilazetidin-3-amina, 2HCl (29,2 mg, 0,156 mmol) e DIPEA (0,045 ml, 0,260 mmol) em DMF (1,0 ml); em seguida, HATU (29,6 mg, 0,078 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 20 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (4,90 pl, 0,156 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (2-70% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (13 mg, 33% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 560,31 de C31H3gFN702 foi encontrado 560,2.
Preparo 14: Ácido (S)-5-etil -2-(6-(2-etil-5-fluoro - 4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il1)-4,5,6,7-tetrahidro-3H- imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico
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HO O o d N ANN a
[00148] Foram dissolvidos ácido (S) -2- (6- (2-etil-5- fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, HCl (450 mg, 0,983 mmol) e acetaldeído (0,083 ml, 1,474 mmol) em DMF (7 ml); em seguida, cianoborohidreto de sódio (247 mg, 3,93 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicionado borohidreto de sódio
(112 mg, 2,95 mmol) para retirar qualquer acetaldeído remanescente; em seguida, a mistura de reação foi concentrada. o produto bruto foi purificado por cromatografia de fase reversa (5-65% gradiente de ACN/água, 100 g coluna Cl8agq) para fornecer o sal de TFA do título composto (165 mg, 30% de rendimento). (m/z): [M+H] + calculado para 450,19 de CoaH24EN5O3z foi encontrado 450,2.
Exemplo 9: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-l-il) (5-etil- 2-(6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)- 4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona
F “O o - a A EN Na | c-2
[00149] Foram combinados ácido (S)-5-etil-2-(6-(2-etil- 5-fluoro -4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,053 mmol) e HATU (30,4 mg, 0,080 mmol) em DMF (1,0 ml). Foram adicionados N,N-dimetilazetidin-3-amina (16 mg, 0,160 mmol) e DIPEA (0,037 ml, 0,213 mmol) foram adicionados à solução e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 6 horas (progresso da reação foi monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (4,92 ul, 0,160 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (10-70% gradiente de ACN/água, coluna Zorbax Bonus-RP) para fornecer o sal de TFA do título composto (27 mg, 67% de rendimento). (m/z): [M+H] + calculado para 532,28 de CagsH34FN702 foi encontrado 532,2.
Exemplo 10: (S) - (3- (dimetilamino) -3-metilazetidin-l1- il) (5-etil-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-l1lH- indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin- 6-il)metanona
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[00150] Foram combinados ácido (S)-5-etil-2-(6-(2-etil- 5-fluoro -4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,053 mmol) e HATU (30,4 mg, 0,080 mmol) em DMF (1,0 ml). Foram adicionados N,N,3-trimetilazetidin-3-amina (18 mg, 0,160 mmol) e DIPEA (0,037 ml, 0,213 mmol) à solução e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 6 horas (progresso da reação foi monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (4,92 pl, 0,160 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (10-70% gradiente de ACN/água, coluna Zorbax Bonus-RP) para fornecer o sal de TFA do título composto (28 mg, 68% de rendimento). (m/z) [M+H]+ calculado para 546,29 de C30H3kEN;O, foi encontrado 546,2.
Preparo 15: Ácido (S) -2- (6- (2-etil-5-fluoro -4- hidroxifenil)-lH-indazol-3-il) -5-propil-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílico
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[00151] Foram dissolvidos ácido (8) -2- (6- (2-etil-5- fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-11)-4,5,6,7-tetrahidro- 3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, HCl (300 mg, 0,655 mmol) e propionaldeído (0,071 ml, 0,983 mmol) em DMF (7 ml); em seguida, cianoborohidreto de sódio (124 mg, 1,966 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 72 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicionado borohidreto de sódio (26 mg, 0,655 mmol) para retirar qualquer aldeído remanescente; em seguida, a mistura de reação foi concentrada. O produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (2-70% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (117 mg, 31% de rendimento). (m/z): [M+H] + calculado para 464,21 de CosHo6gFN5O3 foi encontrado 464,2.
Exemplo 11: (S)-(3-(dimetilamino)azetidin-1-il) (2-(6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-propil- 4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6-il)metanona Ho. À O o Pa ct A / No ON À
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[00152] Foram dissolvidos ácido (8) -2- (6- (2-etil-5- fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7- tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, TFA (33 mg, 0,057 mmol), N,N-dimetilazetidin-3-amina, 2HCl (29,7 mg, 0,171 mmol) e DIPEA (0,060 ml, 0,343 mmol) em DMF (2,0 ml); em seguida, HATU (28,2 mg, 0,074 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 18 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (8,97 pl, 0,286 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (2-70% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (27 mg, 61% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 546,29 de C30H3kEN;O, foi encontrado 546,5.
Exemplo 12: (S) - (3- (dimetilamino) -3-metilazetidin-l1- il) (2- (6- (2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)- 5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-6- il)metanona
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[00153] Foram dissolvidos ácido (8) -2- (6- (2-etil-5- fluoro-4-hidroxifenil)-lH-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-
tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina-6-dicarboxílico, TFA (30 mg, 0,052 mmol), N,N,3-trimetilazetidin-3-amina, 2HCl (29,2 mg, 0,156 mmol) e DIPEA (0,045 ml, 0,260 mmol) em DMF (1,0 ml); em seguida, HATU (29,6 mg, 0,078 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 20 horas (progresso da reação monitorado por LCMS). Foi adicioanda hidrazina (8,89 pl, 0,260 mmol) para clivar os subprodutos indesejáveis; em seguida, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de reação foi concentrada e, em seguida, o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa (2-70% gradiente de ACN/água, coluna C18) para fornecer o sal de TFA do título composto (15 mg, 37% de rendimento). (m/z): [M+H]+ calculado para 560,31 de C31H3gFEN;O0, foi encontrado 560,5.
Ensaios biológicos
[00154] Os compostos da invenção foram caracterizados em um ou mais dos seguintes ensaios biológicos.
Ensaio 1: Ensaios bioquímicos da JAK quinase
[00155] UN painel de quatro ensaios bioquímicos LanthaScreen JAK (JAKl, 2, 3 e Tyk2) foi realizado em um tampão de reação comum para quinase (50 mM de HEPES, pH 7,5, 0,01% Brij-35, 10 mM de MgCl,; e 1 mM de EGTA). As enzimas JAK marcadas com GST recombinante e o substrato de peptídio STAT1 marcado com GFP foram adquiridos da Life Technologies.
[00156] Os compostos com diluição em série foram pré- incubados com cada uma das quatro enzimas JAK e o substrato em microplacas brancas com 384 poços (Corning) em temperatura ambiente durante lh. Foi adicionado ATP posteriormente para iniciar as reações de quinase em 10 1ul de volume total, com 1% de DMSO. As concentrações enzimáticas finais para JAK1, 2, 3 e Tyk2 são 4,2 nM, 0,l nM, 1 nM, e 0,25 nM, respectivamente; as concentrações correspondente de Km ATP usadas são 25 uM, 3 uM, 1,6 UM, e 10 UM, enquanto a concentração de substrato é de 200 nM para todos os quatro ensaios. As reações da quinase continuaram por 1 hora em temperatura ambiente antes de ser adicionada uma preparação de 10 uL de EDTA (10mMM de concentração final) e anticorpo Tb-anti-pSTAT1 (pTyr701) (Life Technologies, 2 nM concentração final) em tampão de diluição TR-FRET (Life Technologies) . As placas foram incubadas em temperatura ambiente por 1 hora antes de serem lidas no leitor EnVision (Perkin Elmer). Os sinais de taxa de emissão (520 nm/495 nm) foram registrados e usados para calcular a porcentagem de valores de inibição com base no DMSO e nos controles de fundo.
[00157] Para a análise de dose-resposta, dados de inibição percentual foram aplicados em um gráfico versus as concentrações dos compostos, e os valores de ICs, foram determinados a partir de um modelo de encaixe robusto de 4 parâmetros com o software Prism (GraphPad Software). Os resultados foram expressos como pICso (logaritmo negativo de ICso) e, posteriormente, convertidos para pK; (logaritmo negativo da constante de dissociação, Ki) usando a equação de Cheng-Prusoff.
[00158] Os compostos em teste com um valor de K; menor ou pK; maior nos quatro ensaios de JAK mostram maior inibição da atividade de JAK.
Ensaio 2: Inibição de pSTAT5 estimulada por IL-2 em células T Tall-1
[00159] A potência dos compostos de teste para inibição da fosforilação de STATS estimulada pela interleucina-2 (IL- 2) foi medida na linhagem celular de células T Tall-1 humanas (DSMZ) usando AlphaLisa. Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK1/3, este ensaio oferece uma medida de potência celular de JAK1I/3.
[00160] O STATS fosforilado foi medido através do kit AlphaLISA SureFire Ultra pSTATS (Tyr694/699) (PerkinElmer).
[00161] As células T humanas da linhagem celular Tall- 1 foram cultivadas a 37 ºC, em incubadora umidificada a 5% de CO, em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 15% de Soro Fetal Bovino TInativado pelo Calor (SFB, Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e 1X Pen/Strep (Life Technologies). Os compostos foram diluídos em série em DMSO e distribuídos acusticamente em poços vazios. Os meios de ensaio (DMEM sem fenol vermelho (Life Technologies) suplementado com FBS a 10% (ATCC)) foram distribuídos (4 uL/poço) e as placas foram agitadas a 900 rpm durante 10 minutos. As células foram semeadas como 45.000 células/poço nos meios de ensaio (4 pL/poço) e incubadas a 37 ºC, 5% de CO2 durante 1 hora, seguida pela adição de IL-2 (R&D Systems; concentração final 300 ng/ml) em meios de ensaio pré- aquecidos (4 ul) durante 30 minutos. Após a estimulação com citocinas, as células foram lisadas com 6 ul de 3x tampão de lise AlphaLisa (PerkinElmer) contendo 1x PhosStop e comprimidos Complete (Roche). O lisado foi agitado a 900 rpm durante 10 minutos em temperatura ambiente (TA). O STAT5 fosforilado foi medido através do kit pSTATS AlphaLisa (PerkinElmer) . A mistura de pérolas aceptoras recém- preparadas foi distribuída no lisado (5 pL) sob luz verde filtrada <100 lux. As placas foram agitadas a 900 rpm durante 2 minutos, giradas levemente e incubadas durante 2 horas em TA no escuro. As pérolas doadoras foram distribuídas (5 uL) sob luz verde filtrada <100 lux. As placas foram agitadas a 900 rpm durante 2 minutos, giradas levemente e incubadas durante a noite em TA no escuro. A luminescência foi medida com excitação a 689 nm e emissão a 570 nm usando um leitor de placas EnVision (PerkinElmer) sob luz verde filtrada <100 lux.
[00162] Para determinar a potência inibitória dos compostos de teste em resposta a IL-2, a intensidade de emissão mediana das células ligadas a pSTATS foi medida em uma linhagem celular T humana. Os valores de ICs foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da intensidade do sinal versus concentração do composto. Os dados foram expressos em valores de pICso (logaritmo decádico negativo ICso) (médiatdesvio padrão).
Resultados do ensaio in vitro Tabela 1 J JI Ta Número do | AKI AK2 J T |11-1 exemplo P P |AK3 pKi |yk2 pK: pI K: K: Cc50 cs 1 0,2 0,5 0,2 1 mo tda CL c-1 0,4 0,8 0,1 15 8 ea de la CO 2 0,3 0,7 0,3 12 7 eo e da a c-2 0,2 0,9 5 4 7 a ed le CL 3 0,4 0,6 0,2 il 6 so a da o c-3 0,3 0,9 17 4 7 a ed LL 0,0 0,8 il 7 eo da LL c-4 0,1 0,9 5 4 6 o da CO 0,5 0,6 0,3 o 7 so a dia e c-5 0,1 0,8 0,0 4 7 el te LO 0,3 0,5 o 6 seo da ch c-6 0,3 0,7 0,0 3 6 Ensaio 3: Modelo Murino (camundongo) de indução de pPSTAT6 induzida por IL-13 em tecido pulmonar
[00163] A IL-13 é uma citocina importante subjacente à fisiopatologia da asma (Kudlacz et al. Eur. JJ. Pharmacol, 2008, 582,154-161). A IL-13 se liga aos receptores de superfície celular ativando os membros da família de Janus de quinases (JAK) que em seguida fosforilam STAT6 e subsequentemente ativa as vias de transcrição. No modelo descrito, uma dose de IL-13 foi administrada localmente nos pulmões do camundongo para induzir a fosforilação de STATG6 (pSTAT6) que é em seguida medida como o ponto final (resultado).
[00164] Foram usados camundongos adultos Balb/c da Harlan no ensaio. No dia do estudo, os animais foram levemente anestesiados com isoflurano e receberam administração de veículo ou composto do teste (1 mg/ml, 50 uL de volume total ao longo de várias respirações) via aspiração oral. Os animais foram colocados em decúbito lateral pós- dose e monitorados quanto à plena recuperação da anestesia antes de serem devolvidos às gaiolas. Quatro horas mais tarde, os animais foram novamente anestesiados brevemente e inoculados com o veículo ou IL-13 (0,03g dose total liberada, 50 uL volume total) através de aspiração oral antes de serem monitorados durante a recuperação da anestesia e devolvidos às gaiolas. Uma hora após a administração de veículo ou IL-13, foram coletados o sangue total e pulmões para a detecção de pSTAT6 nos homogenados do pulmão, usando um kit de ensaio Perkin Elmer AlphaLISAO SureFire6 Ultra" HV p-STAT6 (Tyr641) e para análise da concentração total do fármaco no pulmão e no plasma. As amostras de sangue foram centrifugadas (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos, a aproximadamente 12.000 rpm, a 4 ºC, para coletar o plasma. Os pulmões foram enxaguados em DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco), secos, congelados instantaneamente, pesados e homogeneizados em uma diluição de 1:3 de ácido fórmico a 0,1% em água para HPLC. Os níveis de plasma e do pulmão do composto do teste foram determinados por análise LC-MS em comparação aos padrões analíticos construídos em uma curva padrão na matriz do teste. Foi determinada uma proporção pulmão para plasma como a proporção da concentração de pulmão em ng/g para a concentração de plasma em ng/ml em 5 horas.
[00165] A atividade no modelo é evidenciada por uma diminuição no nível de pSTAT6 presente nos pulmões dos animais tratados em 5 horas em comparação aos animais de controle inoculados com IL-l13, tratados com veículo. A diferença entre os animais de controle que foram inoculados com IL-13, tratados com veículo e os animais de controle que foram inoculados e tratados com veículo ditaram 0% e 100% de efeito inibitório, respectivamente, em qualquer experimento. Os compostos testados no ensaio exibiram inibição da fosforilação de STAT6 5 horas depois após a inoculação com IL-13 como documentado a seguir.
Tabela 2: Inibição de pSTAT6 e exposição plasma/pulmão observadas Concen Concen Prop tração no | tração no | orção Inib Comp | pulmão plasma pulmão ição de osto (ng/g) em 5| (ng/ml) em 5 |para pSTAT6 em h h plasma a 5/5 h h ces es 423 75 1 1979 6,2
Concen Concen Prop tração no | tração no | orção Inib Comp | pulmão plasma pulmão ição de osto (ng/g) em 5| (ng/ml) em 5 |para pSTAT6 em h h plasma a 5/5 h h 77501 23+t6 339 72 2 652 5130+2 24+6 216 73 3 205 15000+ 55+21 271 72 3349 6940+4 25+9 281 55 248 7465+3 23+2,5 330 084
[00166] À observação da concentração de composto significativa no pulmão de camundongo confirmou que a inibição observada da indução de pSTAT6 induzida por IL-13 era um resultado da atividade do composto do teste. A proporção pulmão para plasma em 5 horas mostrou que o composto 1 exibiu significativamente mais exposição no pulmão do que exposição no plasma nos camundongos. Ensaio 4: Inibição da liberação de TARC evocada por TSLP nas células mononucleares periféricas do sangue humano
[00167] A linfopoietina estromal tímica (TSLP) e o timo e a quimiocina regulada por ativação (TARC) são superexpressos nas vias respiratórias asmáticas e se correlacionam com a gravidade da doença. Nos pulmões, a TSLP pode ser liberada pelas células epiteliais brônquicas em resposta a alérgenos e infecções virais. A TSLP sinaliza por meio de um heterodímero IL-7Ra/TSLPR encontrado em uma ampla gama de tecidos e tipos de células, incluindo células epiteliais, células endoteliais, neutrófilos, macrófagos e mastócitos. A ligação da TSLP ao seu receptor induz uma mudança conformacional que ativa JAK1l e JAK2 para fosforilar vários fatores de transcrição, incluindo STAT3 e STAT5. Nas células imunológicas, isto desencadeia uma cascata de eventos intracelulares que resultam em proliferação celular, anti-apoptose, migração de células dendríticas e produção de citocinas Th2 e quimiocinas. Em células mononucleares periféricas do sangue (PBMC), a TLSP tem um efeito pró- inflamatório ao ativar as células dendríticas mieloides para atrair e estimular as células T pela TARC quimioatraente.
[00168] Neste ensaio, foi demonstrado que a estimulação da TSLP induz a liberação de TARC das PBMCs e que esta resposta é atenuada de forma dependente da dose no tratamento com o composto. As potências dos compostos de teste foram medidas para inibição da liberação de TARC.
[00169] Alíquotas de PBMC (previamente isoladas do sangue total e congeladas em alíquotas a -80 ºC) de 3 a 5 doadores foram descongeladas a 37 ºC e adicionadas gota a gota a 40 ml de meio RPMI completo pré-aquecido, filtrado estéril e em tubos Falcon de 50ml. As células foram peletizadas e ressuspendidas em meios completos a 2,24x105 células/ml. As células foram semeadas em 85 ul (190.000 células) por poço em uma microplaca de fundo plano de 96 poços, tratada com cultura de tecidos. As células ficaram em repouso durante 1 hora a 37 ºC com CO, a 5%.
[00170] Os compostos foram recebidos como soluções de lote a 10 mM em DMSO. Foram feitas diluições em série 3,7 vezes para obter 9 concentrações do composto do teste em DMSO a concentração final de teste de 300X do ensaio. As diluições intermediárias 150 vezes foram feitas em meios completos para gerar composto na concentração final de teste de 2X do ensaio com DMSO a 0,2%. Após o período de repouso de 1 hora, 95 ul de composto 2X foram adicionados a cada poço de PBMC, para uma faixa de concentração de ensaio final de 33,33 uM a 0,95 UM. Foram adicionados 95 ul de DMSO a 0,2% em meios completos aos poços de controle não tratados. As células ficaram em repouso durante 1 hora a 37 ºC com CO, a 5% antes da estimulação.
[00171] À proteína TSLP humana recombinante foi reconstituída a 10 ug/ml em DPBS estéril com BSA a 0,1% e armazenada em alíquotas a -20 ºC. Imediatamente antes do uso, uma alíquota foi descongelada e preparada a 20X da concentração final do ensaio em meios completos. Foram adicionados 10 ul de 20X TSLP em cada poço de PBMC, para uma concentração final do ensaio de 10 ng/ml. Foram adicionados ul de meio completo aos poços de controle não estimulados. As células foram estimuladas na presença do composto durante 48 horas a 37 ºC com CO; a 5%.
[00172] Após a estimulação, os sobrenadantes da cultura de células foram coletados e os níveis de TARC foram detectados usando ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
usando o kit para ELISA Human CCL17/TARC Quantikine (R&D Systems fDDNO0O0), de acordo com as instruções do fabricante.
[00173] Para a análise de resposta à dose, o log [composto do teste (M)] foi traçado em relação aos valores percentuais de resposta para cada doador e os valores de ICso foram determinados usando uma análise de regressão não linear com o software GraphPad Prism, usando o algoritmo de resposta à dose sigmoidal de 4 parâmetros com inclinação variável. Os dados são expressos como pIC”º médio (logaritmo decádico negativo ICso.), valores calculados a partir de pICso, valores de doadores individuais e arredondados para uma casa decimal. Os valores de potência para a inibição por compostos originais e seu análogos desfluoro modificados estão resumidos na Tabela 3.
Tabela 3: Valores de potência (pICso)) de compostos de teste para inibição da liberação de TARC evocada por TSLP em células mononucleares periféricas do sangue humano Ensaio 5: Metabolismo de S9 no pulmão
[00174] A estabilidade metabólica in vitro dos compostos 1 e C-1 foram avaliados na fração de S9 no pulmão humano (composto 1 UM; proteína S9 1 mg/ml). As amostras de tempo 0, 15, 30 e 60 minutos foram analisadas em relação ao composto original por LC-MS/MS de alta resolução. As frações de S9 de pulmão humano (lote 1410245) foram adquiridas da
XenoTech LLC (Lenexa, KS). NADPH (Sigma Aldrich, N1630) e 5- fosfossulfato de 3-fosfoadenosina (PAPS) (Sigma Aldrich, Al651) foram adquiridos da Sigma Aldrich (St.
Louis, MO). A acetonitrila e a água foram obtidas na VWR (Radnor, PA) e eram de grau HPLC ou superior.
O raloxifeno e o ácido fórmico foram adquiridos na Sigma Aldrich (St.
Louis, MO). As incubações de S9 no pulmão foram realizadas em banho-maria a 37 ºC em uma placa de polipropileno com 96 poços.
As soluções de S9 no pulmão consistiam em fosfato de potássio 100 mM tamponado para pH 7,4 (BD Biosciences, Woburn, MA), suplementado com NADPH 1 mM (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO), cloreto de magnésio 3 mM (Sigma Aldrich, M1028) e na presença de cofator PAPS 100 uM (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO), com concentrações finais de proteína de incubação de 1 mg/ml.
Os lotes de DMSO 10 mM de raloxifeno (n=1) e do composto (n=1) foram diluídos em tampão e adicionados às incubações para render concentrações de substrato de 1 uM (0,001% DMSO v/v). Os volumes de incubação consistiam em 400 pl e os pontos no tempo foram medidos em 0, 15, 30 e 60 minutos por meio da remoção de uma alíquota de 70 pl e diluição em 140 pl de acetonitrila (ácido fórmico 0%). Todas as amostras foram centrifugadas a 2250g durante 10 minutos a 5 ºC.
O sobrenadante (50 pL) foi retirado das amostras centrifugadas e diluído em 100 nuL de água para HPLC contendo padrão interno.
As amostras foram executadas em um amostrador Dionex Ultimate 3000 Auto e analisadas usando um espectrômetro de massa de alta resolução Thermo Q-Exactive (Thermo, Waltham, MA) no modo Full Scan em conjunto com uma coluna Atlantis T3 3 pM - 2,1 x 50 mm (Waters Inc., 186003717). A fase móvel A consistia em água + ácido fórmico a 0,2% e a fase móvel B consistia em acetonitrila + ácido fórmico a 0,2%. A integração de pico foi feita usando o software Gubbs GMSU (Gubbs Inc., Alpharetta, GA). Para cada amostra, as razões da área de pico foram calculadas dividindo a área do pico do analito pela área de pico do padrão interno. Para cada incubação, as razões da área do pico dos analitos em cada t0O foram ajustadas para 100%, e as razões da área do pico das alíquotas a partir de amostras de 60 minutos foram convertidas em porcentagem remanescente em relação ao t0O correspondente. A determinação da formação do metabólito de sulfato foi feita qualitativamente pela observação do pico de eluição precoce no canal de íon original que, com base em dados internos históricos, correspondia ao metabólito O- sulfato de cada composto original. Os resultados do ensaio estão resumidos na Tabela 4 (n=2 réplicas). Tabela 4: Estabilidade metabólica da fração S9 no pulmão humano Compost o Compost Depuraçã Aparecimen remanescente o o (pL/min/mg) to do sulfato em 60 min (%) es o sm |
ENT ea | ao [e | sm | so do a sm | a o [mo | so | es sr [a mo | os das o | mo | os da o | mo | Les dos a mo
[00175] Quando “comparados com seus análogos fluoro correspondentes (compostos C-1 a C-6), os compostos 1-6 deram origem a metabolismo de sulfatação significativamente inferior.
[00176] BD Biosciences) é usado para detectar a fosforilação de STAT3.
Ensaio 6: Farmacocinética no plasma e pulmão em camundongos
[00177] As concentrações de plasma e de pulmão dos compostos testados e suas proporções foram determinadas da seguinte maneira. Foram usados camundongos BALB/c do Charles River Laboratories no ensaio. Os compostos testados foram individualmente formulados em 20% de propilenoglicol em tampão de citrato com pH 4 em uma concentração de 0,2 mg/ml e 50 ul da solução administrada foi introduzida por aspiração na traquéia de um camundongo. Em vários momentos (normalmente 0,167, 2, 6, 24 h) pós-administração, foram retiradas amostras de sangue através de punção cardíaca e pulmões intactos foram retirados dos camundongos. As amostras de sangue foram centrifugadas (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos, a aproximadamente 12.000 rpm, a 4 “ºC, para coletar o plasma. Os pulmões foram secos, pesados e homogeneizados em uma diluição de 1:3 em água estéril. As concentrações de plasma e de pulmão do composto do teste foram determinadas por análise LC-MS contra padrões analíticos construídos em uma curva padrão na matriz do teste. Foi determinada uma razão pulmão para plasma como a proporção da ASC do pulmão em pg h/ml para a ASC do plasma em ug h/ml, na qual a ASC está convencionalmente definida como a área sob a curva do composto do teste versus tempo.
Tabela 5: Exposição do plasmas e tecido pulmonar após uma única administração por aspiração dos compostos em teste ASC (o- Tecido 24) do | pulmonar Razão ASC Composto |plasma ASC (09-24) de tecido (pg (pg pulmonar :plasma hr/mL) hr/g) Ensaio 7: Ensaio de sobrevida de eosinófilos mediada por IL-5
[00178] A potência dos compostos do teste para sobrevida de eosinófilos mediada por IL-5 pode ser medida em eosinófilos humano isolados do sangue humano (AllCells). Como a IL-5 sinaliza por meio da JAK, este ensaio oferece uma medida de potência celular de JAK.
[00179] Os eosinófilos humanos são isolados do sangue humano fresco (AllCells) de doadores saudáveis. O sangue é misturado com dextrano a 4,5% (Sigma-Aldrich) em uma solução de cloreto a 0,9% (Sigma-Aldrich). As células vermelhas do sangue ficaram em repouso durante 35 minutos para sedimentar.
A camada superior rica em leucócitos é removida e sobreposta em Ficoll-Paque (GE Healthcare) e centrifugada a 600g durante minutos. O plasma e as camadas de células mononucleares são removidos antes que a camada de granulócitos seja lisada com água para remover qualquer contaminação de glóbulos vermelhos. Os eosinófilos são posteriormente purificados usando kit de isolamento de eosinófilos humanos (Miltenyi Biotec). Uma fração dos eosinófilos purificados é incubada com FITC anti-CDl6 (Miltenyi Biotec) durante 10 minutos a 4 ºC no escuro. A pureza é analisada usando um citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences).
[00180] As células são cultivadas a 37 ºC, em incubadora umidificada a 5% de CO, em RPMI 1640 (Life Technologies), suplementadas com 10% de Soro Fetal Bovino Inativado pelo Calor (SFB, Life Technologies), 2mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e 1X Pen/Strep (Life Technologies). As células são semeadas em
10.000 células/poço nos meios (50 uL). A placa é centrifugada a 300g durante 5 minutos e o sobrenadante, removido. Os compostos são diluídos em série em DMSO e, em seguida, diluídos 500 vezes para uma concentração final de ensaio de 2x nos meios. Os compostos do teste (50 pl/poço) são adicionados às células e incubados a 37 ºC, 5% de CO, durante 1 hora, seguida pela adição de I1IL-5 (RED Systems; concentrações finais de 1 ng/ml e 10 pg/ml) em meios de ensaio pré-aquecido (50 uL) durante 72 horas.
[00181] Após a estimulação com citocinas, as células são centrifugadas a 300g durante 5 minutos e lavadas duas vezes com DPBS frio (Life Technologies). Para acessar a viabilidade e a apoptose, as células são incubadas com iodeto de propídeo (Thermo Fisher Scientific) e APC Annexin V (BD Biosciences) e analisadas usando um citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences). Os valores de ICs, são determinados a partir da análise das curvas de viabilidade celular percentual versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pICso (ICso logaritmo decádico negativo).
Ensaio 8: Inibição de quimiocinas CXCL9 e CXCL10 induzida por IFNy e IL-27 em culturas de vias respiratórias 3D em humanos
[00182] Foram obtidas culturas de tecidos EpiAirway de Mattek (AIR-100). As culturas foram provenientes de doadores asmáticos. Em uma inserção de cultura de células, as células epiteliais de Dbrônquios/traqueias foram cultivadas e diferenciadas em um suporte de membrana porosa, permitindo uma interface ar-líquido com meio de cultura aquecido abaixo das células e uma atmosfera gasosa de teste acima. Os tecidos foram cultivados em meios de manutenção (Mattek, AIR-100-MM) em uma incubadora umidificada a 37 ºC, 5% de CO». Foram testados quatro doadores. No dia 0, as culturas de tecidos foram tratadas com compostos em teste na interface líquida a 10 uM, 1 pM e/ou 0,1 JM. Os compostos foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) para uma concentração final de 0,1%. Foi usado DMSO a 0,1% como um controle do veículo. Os compostos em teste foram incubados com as culturas durante 1 hora a 37 ºC, 5% de CO, seguido pela adição de meios pré- aquecidos contendo IFNy (R&D Systems) ou IL-27 (R&D Systems), em uma concentração final de 100 ng/ml. As culturas de tecidos foram mantidas durante 8 dias. Os meios foram substituídos a cada 2 dias com meios frescos contendo os compostos e IFNy ou IL-27. No Dia 8, as culturas de tecido e sobrenadantes foram coletados para análise. As amostras de sobrenadante foram analisadas para CXCL10 (IP-10) e CXCL9 (MIG) utilizando análise luminex (EMD Millipore). Os dados são expressos em % de inibição +/- desvio padrão (tSTDV). A percentagem de inibição foi determinada pela potência inibitória do composto contra a secreção de CXCL10 ou CXCL9 induzida por IFNy ou IL-27 em comparação às células tratadas com veículo. Os dados são a média de 4 doadores. O composto 1 foi capaz de inibir a secreção de CXCL10 induzida por IFNy em 100% +1,0 (a 10 pM), 76% +13 (a 1 pM) e 18% +22 (a 0,1 pUM) em comparação ao controle de veículo. O composto 1 foi capaz de inibir a secreção de CXCL9 induzida por IFNy em 100% +0,1 (a 10 uM), 93% +t6,9 (a 1 pM) e 16% +t41 (a 0,1 pM) em comparação ao controle de veículo. O composto 1 foi capaz de inibir a secreção de CXCL10 induzida por IL-27 em 100% +0,0 (a 1,0 uM), 98% +10 (a 1 pM) e 25% +26 (a 0,1 pM) em comparação ao controle de veículo. O composto 1 foi capaz de inibir a secreção de CXCL9 induzida por IL-27 em 100% +0,0 (a 10 UM), 97% +2,0 (a 1 pM) e 52% +18 (a 0,1 pM) em comparação ao controle de veículo.
Ensaio 9: Ensaio da potência celular da JAK: Inibição de IL-2/anti-CD3 estimulada por IFNy em PBMCs humanos
[00183] A potência dos compostos de teste para inibição da interleucina-2 (IL-2) /anti-CD3 estimulada pelo gama interferon (IFNy) pode ser medida em células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) isoladas do sangue humano total (Stanford Blood Center). Como a IL-2 sinaliza por meio da
JAK, este ensaio oferece uma medida de potência celular de JAK.
(1) As células mononucleares periféricas do sangue (PBMC) são isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis usando um gradiente Ficoll. As células são cultivadas a 37 ºC, em incubadora umidificada a 5% de CO; em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 10% de soro fetal bovino inativado por calor (SFB, Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e 1X Pen/Strep (Life Technologies). As células são semeadas em 200.000 células/poço nos meios (50 uL) e cultivadas durante lh. Os compostos são diluídos em série em DMSO e, em seguida, diluídos 500 vezes (para uma concentração final de ensaio de 2x) nos meios. Os compostos do teste (100 pl/poço) são adicionados às células e incubados a 37 ºC, 5% de CO, durante 1 hora, seguida pela adição de IL-2 (RED Systems; concentração final de 100 ng/ml) e anti-CD3 (BD Biosciences; concentração final de 1 ug/ml) em meios de ensaio pré-aquecidos (50 uL) durante 24 horas (2) Após a estimulação com citocina, as células são centrifugadas a 500g durante 5 min e o sobrenadante, removido e congelado a -80 ºC. Para determinar a potência inibitória do composto do teste em resposta à IL-2/anti-Cd3, são medidas as concentrações de IFNy sobrenadante via ELISA (R&D Systems). Os valores de ICs, são determinados a partir da análise das curvas de concentração de IFNy versus a concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pICso (ICso logaritmo decádico negativo).
Ensaio 10: Ensaio da potência celular da JAK: Inibição de pSTAT5 estimulada por IL-2 em células T CD4+
[00184] A potência dos compostos de teste para inibição da fosforilação de STATS estimulada pela interleucina-2 (IL- 2) /anti-CD3 pode ser medida em células T CD4-positivos (CD4+), células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) isoladas do sangue humano total (Stanford Blood Center) usando a citometria de fluxo. Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK, este ensaio oferece uma medida de potência celular de JAK.
[00185] As células T CD4+ são identificadas usando um anticorpo anti-CD4 conjugado com ficoeritrobilina (PE) (Clone RPA-T4, BD Biosciences), enquanto é usado um anticorpo anti-pSTAT5S conjugado Alexa Fluor 647 (pY694, Clone 47, BD Biosciences) para detectar a fosforilação de STATS.
(1) O protocolo do parágrafo 9 do ensaio (1) é seguido, exceto que a estimulação de citocinas com anti-CD3 é realizada durante 30 min ao invés de 24 horas.
(2) Após a estimulação com citocinas, as células são fixadas com solução de fixação pré aquecida (200 pl; BD Biosciences) durante 10 min a 37 ºC, 5% de CO», lavadas duas vezes com tampão DPBS (1 ml, Life Technologies), e ressuspendidas em tampão III Perm gelado (1000 pl, BD Biosciences) durante 30 min a 4 ºC. As células são lavadas duas vezes com 2% de SFB DPBS (tampão FACS) e, em seguida, ressuspendidas em tampão FACS (100 nl) contendo anti-CD4 PE (diluição 1:50) e anti-CD3 anti-CD3Alexa Fluor 647 (diluição 1:5) durante 60 min em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, as células são lavadas duas vezes com tampão
FACS antes de serem analisadas usando o citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences). Para determinar a potência inibitória dos compostos do teste em resposta a IL-2/anti- CD3, é medida a intensidade fluorescente mediana (MFI) de pSTAT5 em células T CD4+. Os valores de ICs, são determinados a partir da análise das curvas de inibição da IFM versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pICso (ICso logaritmo decádico negativo).
Ensaio 11: Ensaio da potência celular da JAK: Inibição de pSTAT6 estimulada por IL-4 em células T CD3+
[00186] A potência dos compostos de teste para inibição da fosforilação de STAT6 estimulada pela interleucina-4 (IL- 4) pode ser medida em células T CD3-positivas (CD3+), células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) isoladas do sangue humano total (Stanford Blood Center) utilizando a citometria de fluxo. Como a IL-4 sinaliza por meio da JAK, este ensaio oferece uma medida de potência celular de JAK.
[00187] As células T CD3+ são identificadas utilizando um anticorpo anti-CD3 conjugado com ficoeritrobilina (PE) (Clone UCHT1, BD Biosciences), enquanto foi usado um anticorpo anti-pSTAT6 conjugado Alexa Fluor 647 (pY641, Clone 18/P, BD Biosciences) para detectar a fosforilação de STAT6.
[00188] As células mononucleares periféricas do sangue (PBMC) são isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis como nos Ensaios 9 e 10. As células são semeadas em 250.000 células/poço nos meios (200 ul), cultivadas por lhe, em seguida, ressuspendidas em meios de ensaio (50 ul) (RPMI suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino
(Sigma), 2 mM Glutamax, 25 mM HEPES e 1X Penstrep) contendo diferentes concentrações dos compostos do teste. os compostos são diluídos em série em DMSO e, em seguida, diluídos 500 vezes (para uma concentração final de ensaio de 2x) nos meios. Os compostos de teste (50 puL) são incubados com as células a 37 ºC, 5% de CO, por 1 h, seguido pela adição de 50 pl de IL-4 (R&D Systems; concentração final ng/ml) em meio para ensaio pré-aquecido durante 30 min. Após estimulação das citocinas, as células são fixadas com solução de fixação pré-aquecida (100 ul) (BD Biosciences) por 10 min a 37 ºC, 5% de CO,, lavadas duas vezes com tampão FACS (1 ml) (2% FBS de DPBS) e ressuspendidas em 1000 pl de tampão Perm III gelado (BD Biosciences) durante 30 min a 4 ºC. As células são lavadas duas vezes com tampão FACS e, em seguida, colocadas em suspensão de tampão FACS (100 pl) contendo anti-CD3 PE (diluição 1:50) e anti-pSTAT6 Alexa Fluor 647 (diluição 1:5) durante 60 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, as células são lavadas duas vezes com tampão FACS antes de serem analisadas usando o citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences).
[00189] Para determinar a potência inibitória do composto do teste em resposta a IL-4, é medida a intensidade fluorescente mediana (MFI) de pSTAT6 em células T CD3+. Os valores de ICs são determinados a partir da análise das curvas de inibição da IFM versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos como pICso (ICso logaritmo decádico negativo).
Ensaio 12: Ensaio da potência celular da JAK: Inibição de pSTAT3 estimulada por IL-6 em células T CD3+
[00190] Um protocolo análogo ao Ensaio 11 pode ser usado para determinar a potência do composto do teste para inibição de fosforilação de STAT3 estimulada por interleucina 6 (IL- 6). É usado um anticorpo anti-STAT3 Alexa Fluor 647 conjugado (pY705, Clone 4/P, BD Biosciences) para detectar a fosforilação de STAT3.
Ensaio 13: Modelo de Murino de inflamação eosinofílica do pulmão induzida por Alternaria alternata
[00191] A eosinofilia das vias respiratórias é uma marca da asma humana. Alternaria alternata é um aeroalérgeno fúngico que pode agravar a asma em humanos e induz inflamação eosinofílica em pulmões de camundongos (Havaux et al. Clin Exp Immunol. 2005 Feb;139(2):179-88). Nos camundongos, foi demonstrado que a Alternaria ativa indiretamente as células linfoides inatas tipo 2 residentes do tecido no pulmão, que respondem (p.ex., IL-2 e IL-7) e liberam citocinas dependentes de JAK (p.ex, IL-5 e IL-13) e coordenam a inflamação eosinofílica (Bartemes et al. J Immunol. 2012 Feb 1;188(3) :1503-13).
[00192] Podem ser usados camundongos C57 de 7 a 9 semanas de vida de Taconic no estudo. No dia do estudo, os animais são levemente anestesiados com isoflurano e receberam administração de veículo ou composto do teste (0,03-1,0 mg/ml, 50 ul do volume total ao longo de várias respirações) via aspiração orofaríngea. Os animais são colocados em decúbito lateral pós-dose e monitorados para a plena recuperação da anestesia antes de serem devolvidos às gaiolas. Uma hora depois, os animais são novamente anestesiados levemente e inoculados com veículo ou extrato de Alternaria (200 ug de dose total liberada, 50 ul de volume total) através de aspiração orofaríngea, antes de serem monitorados durante a recuperação da anestesia e devolvidos às gaiolas. Quarenta e oito horas após a administração de Alternaria, é coletado fluido da lavagem broncoalveolar (BALF) e os eosinófilos são contados no BALF utilizando o Advia 120 Hematology System (Siemens). A atividade no modelo é evidenciada por uma diminuição no nível de eosinófilos presentes na BALF dos animais tratados em 48 horas em comparação aos animaisde controles inoculados com Alternaria, tratados com veículos. Os dados são expressos como porcentagem de inibição da resposta dos eosinófilos da BALF inoculados com Alternaria, tratados com veículo. Para calcular a percentagem de inibição, o número de eosinófilos de BALF para cada condição foi convertido em percentagem da média de eosinófilos de BALF tratados com veículo, inoculado com Alternaria e subtraídos de 100%.
Ensaio 14: Ensaio da potência celular da JAK: Inibição de IFN-y induzida por pSTAT1
[00193] A potência dos compostos do teste para inibição da fosforilação de STAT1l estimulada pela gamainterferon (IFNy) foi medida em monócitos CDl4-positivos (CDl4+) derivados do sangue total (Stanford Blood Center) utilizando a citometria de fluxo. Como IFNy sinaliza por meio da JAK, este ensaio oferece uma medida a potência celular de JAK.
[00194] Os monócitos foram identificados usando um anticorpo anti-CDl4 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Clone RMO52, Beckman Coulter) e um anticorpo anti-pSTAT1l conjugado Alexa Fluor 647 (pY701,
Clone 4a, BD Biosciences) foi usado para detectar a fosforilação de STAT1.
[00195] As células mononucleares periféricas do sangue (PBMC) foram isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis usando um gradiente Ficoll. As células são cultivadas a 37 ºC, incubadora umidificada a 5 % de CO; em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS, Life Technologies), 2mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e 1X Pen/Strep (Life Technologies). As células são semeadas em uma taxa de 250.000 células/poço em meios (200 nl), cultivadas por 2 h e ressuspendidas em meios de ensaio (50 pl) (RPMI suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino (Sigma), 2 mM Glutamax, 25 mM HEPES e 1X Penstrep) contendo diferentes concentrações do composto do teste. O composto foi diluído em série em DMSO e, em seguida, diluído 1000 vezes nos meios para chegar à concentração final de 0,1% em DMSO. As diluições do compostos de teste foram incubadas com as células a 37 ºC, 5 % de CO, durante 1 h, seguido pela adição de IFNy pré-aquecido (R&D Systems) nos meios (50 pl) a uma concentração final de 0,6 ng/ml durante minutos. Após a estimulação de citocinas, as células foram fixadas com solução de fixação pré-aquecida (100 pl) (BD Biosciences) durante 10 min a 37 ºC, 5 % de CO», lavadas duas vezes com tampão de FACS (1 ml) (1% de BSA em PBS), ressuspendidas em 1:10 de anti-CDI4FITC: tampão FACS (100 pl), e incubadas a 4 ºC durante 15 min. As células foram lavadas uma vez e, em seguida, ressuspendidas em tampão Perm III gelado (BD Biosciences) (100 nl) durante 30 min a 4 ºC.
As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspendidas em 1:10 de Alexa Fluor 647 anti-pSTAT1:tampão FACS (100 nl) durante 30 min em TA no escuro, lavadas duas vezes com tampão FACS e analisadas através de um citômetro de fluxo MACSQuant (Miltenyi).
[00196] Para determinar a potência inibitória do composto do teste, a intensidade fluorescente mediana (MFI) de pSTAT1 foi medida em monócitos CDl4+. Os valores de ICso foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da MFI versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pICso (ICso logaritmo decádico negativo). O composto 1 exibiu um valor de pICsº de cerca de 7,5 nesse ensaio.
Ensaio 15: Ensaio da potência celular da JAK: Inibição depSTAT5 induzida por GM-CSF
[00197] A potência dos compostos do teste para inibição da fosforilação de STATS estimulada pelo fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) foi medida em monócitos CDl4-positivos (CDl4+) derivados do sangue total (Stanford Blood Center) utilizando a citometria de fluxo. Como GM-CSF sinaliza por meio da JAK, este ensaio oferece uma medida de potência celular de JAK.
[00198] Os monócitos foram identificados usando um anticorpo anti-CDl4 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Clone RMO52, Beckman Coulter) e um anticorpo anti-pSTAT5S conjugado Alexa Fluor 647 (pY694, BD Biosciences) foi usado para detectar a fosforilação de STAT5.
[00199] As células mononucleares periféricas do sangue (PBMC) foram isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis usando um gradiente Ficoll.
As células são cultivadas a 37 ºC, incubadora umidificada a 5 % de CO; em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS, Life Technologies), 2mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e 1X Pen/Strep (Life Technologies). As células foram semeadas em uma taxa de 250.000 células/poço em meios (200 nl)
cultivadas por 2 horas e ressuspendidas em meios de ensaio (50 nl) (RPMI suplementados com 0,1% de albumina de soro bovino (Sigma), 2 mM Glutamax, 25 mM HEPES e 1X Penstrep) contendo diferentes concentrações dos compostos do teste.
O composto foi diluído em série em DMSO e, em seguida, diluído 1000 vezes nos meios para chegar à concentração final de 0,1% em DMSO.
As diluições do compostos de teste foram incubadas com as células a 37 ºC, 5 % de CO, durante 1 h, seguido pela adição de GM-CSF pré-aquecido (R&D Systems) nos meios (50 pl) a uma concentração final de 0,3 ng/ml durante minutos.
Após a estimulação de citocinas, as células foram fixadas com solução de fixação pré-aquecida (100 pl) (BD Biosciences) durante 10 min a 37 ºC, 5 % de CO», lavadas duas vezes com tampão de FACS (1 ml) (1% de BSA em PBS), ressuspendidas em 1:10 de anti-CDI4FITC: tampão FACS (100 pl), e incubadas a 4 ºC durante 15 min.
As células foram lavadas uma vez e, em seguida, ressuspendidas em tampão Perm III gelado (BD Biosciences) (100 pl) durante 30 min a 4 ºC.
As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspendidas em 1:10 de Alexa Fluor 647 anti-pSTAT1:tampão FACS (100 nl) durante 30 min em TA no escuro, lavadas duas vezes com tampão FACS e analisadas através de um citômetro de fluxo MACSQuant (Miltenyi).
[00200] Para determinar a potência inibitória do composto do teste, a intensidade fluorescente mediana (MFI) de pSTAT5S foi medida em monócitos CDl4+. Os valores de ICso foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da MFI versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pICso (ICso logaritmo decádico negativo). O composto 1 exibiu um valor de pICs, de cerca de 6,9 nesse ensaio.
Ensaio 16: Ensaio da potência celular da JAK: Inibição depSTAT4 induzida por IL-12
[00201] A potência dos compostos de teste para inibição da fosforilação de STAT4 estimulada pela interleucina-12 (IL-12) foi medida em células T CD3-positivos (CD3+), derivadas do sangue humano total (Stanford Blood Center) utilizando a citometria de fluxo. Como a IL-12 sinaliza por meio da JAK, este ensaio oferece uma medida de potência celular de JAK.
[00202] Células T CD3+ foram identificadas utilizando um anticorpo anti-CD3 conjugado com ficoeritrina (PE) (Clone UCHT1, BD Biosciences) e foi usado um anticorpo anti-pSTAT4 conjugado Alexa Fluor 647 (clone 38/p-Stat4, BD Biosciences para detectar a fosforilação de STATA4.
[00203] As células mononucleares periféricas do sangue (PBMC) foram isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis usando um gradiente Ficoll. As células foram cultivadas em RPMI (Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Life Technologies), 2 mM Glutamax
(Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies), 1X Pen / Strep (Life Technologies), anticorpo anti-CD3 purificado ligado à placa (5 pg/ml, clone UCHTl, BD Biosciences) e anticorpo anti-CD28 solúvel (1 pg/ml, clone CD28.2, BD Biosciences) durante 3 dias a 37 ºC em incubadora umidificada com 5% de CO;. As células foram coletadas, lavadas com meio e, em seguida, ressuspendidas em meio contendo interleucina- 2 (IL-2, 10 ng/ml, R&D Systems). As células foram cultivadas durante 3 dias a 37 ºC em uma incubadora umidificada a 5% de CO». As células foram coletadas, lavadas com RPMI e semeadas em uma taxa de 250.000 células/poço em meios (200 ul), cultivadas por 2 horas e ressuspendidas em meios de ensaio (50 pl) (RPMI suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino (Sigma), 2 mM Glutamax, 25 mM HEPES e 1X Penstrep) contendo diferentes concentrações dos compostos do teste.
O composto foi diluído em série em DMSO e, em seguida, diluído 1000 vezes nos meios para chegar à concentração final de 0,1% em DMSO.
As diluições dos compostos de teste foram incubadas com as células a 37 ºC, 5% de CO, por 1 h, seguido pela adição de IL-12 (R&D Systems) em meio (50 pl) em uma concentração de 10 ng/ml durante 30 min.
Após estimulação das citocinas, as células foram fixadas com solução de fixação pré-aquecida (100 pl) (BD Biosciences) durante 10 min a 37 ºC, 5% de CO», lavadas duas vezes com tampão FACS (1 ml) (1% BSA de PBS) e ressuspendidas em tampão Perm III gelado (1000 ul) (BD Biosciences) durante 30 min a 4 ºC.
As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e, em seguida, ressuspendidas em tampão FACS (100 pl) contendo anti-CD3 PE (diluição 1:50) e anti-pSTAT4 Alexa Fluor 647
(diluição 1:10) durante 45 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS antes de serem analisadas usando um citômetro de fluxo MACSQuant (Miltenyi). Para determinar a potência inibitória do composto do teste, a intensidade fluorescente mediana (MFI) de pSTAT4 foi medida em células CD3+. Os valores de ICs foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da MFI versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pICso (ICso logaritmo decádico negativo). O composto 1 exibiu um valor de pICsº de cerca de 6,0 nesse ensaio.
Ensaio 17: Inibição da secreção de IFNy em um ensaio de reação de linfócitos mistos
[00204] O ensaio da reação linfocítica mista é um ensaio in vitro que mimetiza a rejeição do transplante. As células T de um doador são cultivadas com células dendríticas alogênicas de outro doador. Esta reação induz uma resposta imunológica celular, como a secreção de IFNy.
[00205] Os monócitos CD1I4 foram isolados de sangue total humano (centro de sangue de Stanford) do doador A usando um gradiente de Ficoll e separação magnética (microesferas CDl4, Miltenyi). Os monócitos foram diferenciados em células dendríticas por cultura de células em RPMI (Life Technologies), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Life Technologies), 2 mM Glutamax (Life Technologies), 1X Pen/Strep (Life Technologies), interleucina-4 (IL-4, 50 ng/ml, R&D Systems) e fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF, 50 ng/ml, R&D Systems) durante 6 dias a 37 ºC em uma incubadora umidificada com 5%
de CO;. As células dendríticas foram coletadas, lavadas com meio e, em seguida, ativadas por cultura de células em meio contendo —“lipopolissacarídeo de Escherichia coli (LPS, 100 ng/ml, Sigma) durante 24 horas a 37 ºC, em uma incubadora umidificada com 5% de CO». As células foram coletadas, lavadas com meio, ressuspendidas a 400.000 células/ml em meios e semeadas a 10.000 células/poço/25 pl.
As células T CD4+ foram recém-isoladas de sangue total humano (centro de sangue de Stanford) do doador B usando um gradiente de Ficoll e separação magnética (kit de isolamento de célula T CD4+, Miltenyi). As células T foram ressuspendidas para 4.000.000 células/ml em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS, Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e 1X Pen/Strep (Life Technologies). As células T CD4+ foram misturadas às células dendríticas a 100.000 células/poço/25 pl.
As células foram tratadas com os compostos do teste (50 pl a 20 1uM, 2 1uM e/ou 0,2 puM) até uma concentração final de 10 puM, 1 puM e/ou 0,1 JM.
Os compostos foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) para uma concentração final de 0,1%. Foi usado DMSO a 0,1% como um controle do veículo.
As células foram mantidas durante 5 dias a 37 ºC, em uma incubadora umidificada a 5% de CO;. No dia 5, os sobrenadantes foram coletados e foi feita a medida para gama-interferon (INFy) usando o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A percentagem de inibição foi determinada pela potência inibitória do composto contra IFNy em comparação com as células tratadas com veículo.
Os dados são a média de 4 doadores.
O composto 1 foi capaz de inibir a secreção de IFNy em 99% +0,4 (a 10 puM), 76% +10 (a 1 pM) e 43% +12 (a 0,1 UM) em comparação com o controle de veículo.
Ensaio 18: Inibição de periostina espontânea e secreção de IL-6 em culturas das vias respiratórias 3D humanas derivadas de doadores asmáticos
[00206] Foram obtidas culturas de tecidos EpiAirway de Mattek (AIR-100). As células foram derivadas de doadores asmáticos que secretam periostina espontaneamente, uma proteína da matriz celular associada à asma mediada por Th2 (eosinofílica) e interleucina-6 (IL-6), uma citocina inflamatória que desempenha papel na asma relacionada e não relacionada a Th2. Em uma inserção de cultura de células, as células epiteliais de brônquios/traqueias foram cultivadas e diferenciadas em um suporte de membrana porosa, permitindo uma interface ar-líquido com meio de cultura aquecido abaixo das células e uma atmosfera gasosa de teste acima. Os tecidos foram cultivados em meios de manutenção (Mattek, AIR-100-MM) em uma incubadora umidificada a 37 ºC, 5% de CO». Foram testados quatro doadores. No dia 0, as culturas de tecidos foram tratadas com compostos em teste na interface líquida a 10 uM, 1 pM e/ou 0,1 JM. Os compostos foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) para uma concentração final de 0,1%. Foi usado DMSO a 0,1% como um controle do veículo. As culturas de tecidos foram mantidas durante 8 dias. Os meios foram substituídos a cada 2 dias por meios frescos contendo os compostos. No Dia 8, os sobrenadantes foram coletados para análise. As amostras de sobrenadante foram analisadas para periostina e interleucina-6 (IL-6) usando a análise luminex (EMD Millipore). Os dados são expressos em
% de inibição +/- desvio padrão (tSTDV). A porcentagem de inibição foi determinada pela potência inibitória do composto contra a secreção espontânea de periostina e IL-6 em comparação com as células tratadas com veículo. Os dados são a média de 3 ou 4 doadores. O composto 1 foi capaz de inibir a secreção de espontânea de periostina em 62% +25 (a UM) e 40% +28 (a 1 puM) em comparação ao controle de veículo. O composto 1 foi capaz de inibir a secreção espontânea de IL-6 em 91% +9,0 (a 10 uM), 70% +33 (a 1 pUM) e 10% +40 (a 0,1 pM) em comparação ao controle de veículo.
Estrutura cristalina
[00207] Foi obtida uma estrutura cocristalina co composto 1 ligado à JAK1I humana em uma resolução de 2,28 À. Foi observada a ligação do ligante ao sítio de ligação do ATP. Foram identificadas sete pontes específicas de hidrogênio com base em uma distância de 3.5 À ou menos entre os átomos doador e receptor. De especial importância, foi identificada uma ponte de hidrogênio entre o carbonil da amida exocíclica do composto de C-l1 e a cadeia lateral de Arg879 de JAKl. Pode-se esperar uma interação semelhante para os compostos da invenção. Em estudos de modelagem anteriores, esta interação foi proposta como uma forma de oferecer a seletividade para JAKlI sobre outras tirosinas quinases, pois quinases de outra forma intimamente relacionadas (p.ex., TRKA, VEGFR, ABL1) não possuíam um resíduo de arginina no local equivalente. Os resultados observados da ponte de hidrogênio na estrutura cristalina e seletividade de quinoma melhorada em comparação à série que não tem a amida exocíclica validam a hipótese deste design.
[00208] Enquanto esta invenção tem sido descrita com referência aos aspectos específicos ou suas modalidades, será compreendido por aqueles que são versados na técnica que diversas alterações podem ser feitas ou equivalentes podem ser substituídos, sem se afastar do verdadeiro espírito e do escopo da invenção.
Além disso, na medida do permitido pelos estatutos e dos regulamentos aplicáveis sobre patentes, todas as publicações, patentes e pedidos citados neste documento são incorporados a título de referência em sua totalidade, da mesma forma como se cada documento tiver sido incorporado individualmente a título de referência neste documento.

Claims (39)

O QUE SE REIVINDICA É:
1. Um composto caracterizado pela fórmula (1) HO. O o O (Rh
N | NO HENKO ON Ng À
NO (1) caracterizado por: n ser 0, 1 ou 2; R' ser Ci-3zalquil e cada R? ser independentemente de Ci-3alquil; ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
2. O composto da Reivindicação 1, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, caracterizado por ter a fórmula (IL): HO. O o O (Rh
N | E EN à Ng À
NO (11) .
3. O composto da Reivindicação 1, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, caracterizado por ter a fórmula (III): HO. Ç ; o 2 N R' 6 | NX ENKO ON Ng À
NO (111) .
4, O composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico,
caracterizado por R!' ser selecionado do grupo composto por etil, propil e isopropil.
5. O composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 4, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, caracterizado por n ser O.
6. O composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 4, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, caracterizado por n ser 1.
7. O composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 4, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, caracterizado por n ser 1 e Rº ser etil.
8. O composto caracterizado pela fórmula 1: HO. Q |
N Cl O
HNK N N À NON rr 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
9. O composto caracterizado pela fórmula 1: HO. Ú OQ :
N é | NO
HNK N N À NON T i 1
10. O composto caracterizado pela fórmula 2: Ho. O 3
N O K o“ d N À DN | HN-N H 2 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
11. O composto caracterizado pela fórmula 3: Ho. O 3
N
QUE d N À DN | HN-N À 3 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
12. O composto caracterizado pela fórmula 4: Ho. CÇ 3
N O » Ly
VN ON À // ANN ON r 4 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
13. O composto caracterizado pela fórmula 5: Ho. O 3
N O » OW
NON À // HN-N N RW ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
14. O composto caracterizado pela fórmula 6: HO. O 3
NOM
Q É
NON À // HN-N ON AL 6 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
15. Uma composição farmacêutica caracterizada por um composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 14 e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico.
16. Um composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 14 caracterizado pelo uso no tratamento de uma doença respiratória em um mamífero.
17. O composto da Reivindicação 16, caracterizado pela doença respiratória ser selecionada do grupo composto por asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, pneumonite, fibrose pulmonar idiopática, lesão pulmonar aguda, síndrome da desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante, uma doença eosinofílica, uma infecção helmíntica, hipertensão arterial pulmonar, linfangioleiomiomatose, bronquiectasia, uma doença pulmonar infiltrativa, pneumonite induzida por drogas, pneumonite induzida por fungos, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonite por hipersensibilidade, granulomatose eosinofílica com poliangeite, pneumonia eosinofílica aguda idiopática, pneumonia eosinofílica crônica idiopática, síndrome hipereosinofílica, síndrome de Lôffler, bronquiolite obliterante com pneumonia organizativa, doença enxerto contra hospedeiro ou pneumonite induzida por inibidor do checkpoint imunológico.
18. O composto da Reivindicação 16 caracterizado pela doença respiratória ser asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica.
19. O composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 14 caracterizado pelo uso no tratamento de rejeição de transplante de pulmão em um mamífero.
20. O composto da Reivindicação 19, caracterizado pela rejeição de transplante de pulmão ser selecionada do grupo composto por disfunção primária do enxerto, pneumonia em organização, rejeição aguda, bronquiolite linfocítica e disfunção crônica restritiva do enxerto pulmonar.
21. O composto da Reivindicação 19, caracterizado pela rejeição do transplante de pulmão ser rejeição aguda do transplante de pulmão.
22. O composto da Reivindicação 19, caracterizado pela rejeição do transplante de pulmão ser disfunção crônica pulmonar do enxerto.
23. O composto da Reivindicação 19, caracterizado pela rejeição de transplante de pulmão ser selecionada do grupo composto por bronquiolite obliterante, disfunção crônica pulmonar do enxerto restritiva e disfunção neutrofílica do enxerto.
24. Uso de um composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 14 caracterizado pela produção de um medicamento para o tratamento de uma doença respiratória em um mamífero.
25. Uso da Reivindicação 24, caracterizado pela doença respiratória ser selecionada do grupo composto por asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, pneumonite, fibrose pulmonar idiopática, lesão pulmonar aguda, síndrome da desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante, uma doença eosinofílica, uma infecção helmíntica, hipertensão arterial pulmonar, linfangioleiomiomatose, bronquiectasia, uma doença pulmonar infiltrativa, pneumonite induzida por drogas,
pneumonite induzida por fungos, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonite por hipersensibilidade, granulomatose eosinofílica com poliangeite, pneumonia eosinofílica aguda idiopática, pneumonia eosinofílica crônica idiopática, síndrome hipereosinofílica, síndrome de Lóffler, bronquiolite obliterante com pneumonia organizativa, doença enxerto contra hospedeiro ou pneumonite induzida por inibidor do checkpoint imunológico.
26. O uso da Reivindicação 24, caracterizado pela doença respiratória ser asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica.
27. Uso de um composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 14 caracterizado pela produção de um medicamento para o tratamento de rejeição de transplante de pulmão em um mamífero.
28. O uso da Reivindicação 27, caracterizado pela rejeição de transplante de pulmão ser selecionada do grupo composto por disfunção primária do enxerto, pneumonia em organização, rejeição aguda, bronquiolite linfocítica e disfunção crônica do enxerto pulmonar.
29. O uso da Reivindicação 27, caracterizado pela rejeição do transplante de pulmão ser rejeição aguda do transplante de pulmão.
30. O uso da Reivindicação 27, caracterizado pela rejeição do transplante de pulmão ser disfunção crônica pulmonar do enxerto.
31. O uso da Reivindicação 27, caracterizado pela rejeição de transplante de pulmão ser selecionada do grupo composto por bronquiolite obliterante, disfunção crônica pulmonar do enxerto restritiva e disfunção neutrofílica do enxerto.
32. Um método de tratamento de uma doença respiratória em um mamífero, caracterizado pelo método compreender a administração ao mamífero de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 14 e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico.
33. O método da Reivindicação 32, caracterizado pela doença respiratória ser selecionada do grupo composto por asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, pneumonite, fibrose pulmonar idiopática, lesão pulmonar aguda, síndrome da desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante, uma doença eosinofílica, uma infecção helmíntica, hipertensão arterial pulmonar, linfangioleiomiomatose, bronquiectasia, uma doença pulmonar infiltrativa, pneumonite induzida por drogas, pneumonite induzida por fungos, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonite por hipersensibilidade, granulomatose eosinofílica com poliangeite, pneumonia eosinofílica aguda idiopática, pneumonia eosinofílica crônica idiopática, síndrome hipereosinofílica, síndrome de Lôffler, bronquiolite obliterante com pneumonia organizativa, doença enxerto contra hospedeiro ou pneumonite induzida por inibidor do checkpoint imunológico.
34. O método da Reivindicação 32, caracterizado pela doença respiratória ser asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica.
35. Um método de tratamento de rejeição de transplante de pulmão em um mamífero, caracterizado pelo método compreender a administração ao mamífero de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 14 e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico.
36. O método da Reivindicação 35, caracterizado pela rejeição de transplante de pulmão ser selecionada do grupo composto por disfunção primária do enxerto, pneumonia em organização, rejeição aguda, bronquiolite linfocítica e disfunção crônica restritiva do enxerto pulmonar.
37. O método da Reivindicação 35, caracterizado pela rejeição do transplante de pulmão ser rejeição aguda do transplante de pulmão.
38. O método da Reivindicação 35, caracterizado pela rejeição do transplante de pulmão ser disfunção crônica pulmonar do enxerto.
39. O método da Reivindicação 35, caracterizado pela rejeição de transplante de pulmão ser selecionada do grupo composto por bronquiolite obliterante, disfunção crônica pulmonar do enxerto restritiva e disfunção neutrofílica do enxerto.
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