KR20220149585A - Jak 억제제 화합물의 결정성 수화물 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 화학식 1의 화합물의 결정성 수화물을 제공한다:
Figure pct00032
.
또한 본원에서는 이러한 결정성 수화물을 포함하는 약학적 조성물, 호흡기 질환을 치료하기 위해 이러한 결정성 수화물을 사용하는 방법, 및 이와 같은 결정성 수화물을 제조하는데 유용한 공정을 제공한다.

Description

JAK 억제제 화합물의 결정성 수화물
본원에서는 호흡기 및 기타 질환 치료에 유용한 JAK 억제제 화합물의 결정형 수화물를 제공한다. 또한 본원에서는 이러한 결정형을 포함하는 약학적 조성물, 예를 들어 호흡기 질환을 치료하기 위해 상기 결정형을 사용하는 방법, 및 이러한 결정형을 제조하는데 유용한 공정을 제공한다.
시토킨은 케모킨, 인터페론, 인터루킨, 림포킨 (lymphokines) 및 종양 괴사 인자를 포함하는 세포간 신호전달 분자이다. 시토킨은 정상적인 세포 증식 및 면역 조절에 중요할 뿐만 아니라 면역-매개 질환을 유발하고, 악성 세포 증식에 기여한다. 다수의 시토킨 수준의 증가는 많은 질환 또는 병태, 구체적으로 염증을 특징으로 하는 질환의 병리에 관련되어 있다. 질환에 관련된 다수의 시토킨은 티로신 키나제의 Janus 패밀리 (Janus family of tyrosine kinase: JAK)에 의존하는 신호전달 경로를 통해 작용하고, 이는 전사 인자의 전사의 신호 변환인자 및 활성인자 (Signal Transducer and Activator of Transcription: STAT) 패밀리를 통해 신호를 전달한다.
상기 JAK 패밀리는 JAK1, JAK2, JAK3 및 티로신 키나제 2 (TYK2)의 4개의 멤버를 포함한다. 시토킨의 JAK-의존성 시토킨 수용체로의 결합은 수용체 이합체화(dimerization)를 유도하고, 이는 JAK 키나제에서 티로신 잔기의 인산화를 초래하여 JAK 활성화에 영향을 준다. 인산화된 JAK는, 이합체화되고 세포 핵 내에 내재되어 유전자 전사를 직접 조절하는 다양한 STAT 단백질에 결합하고 인산화하여, 여러 효과 중에 염증 질환과 관련된 다운스트림 효과를 유도한다. 상기 JAK는 통상 시토킨 수용체와 쌍으로 동종이합체 또는 이종이합체로 회합한다. 특정 시토킨은 특정 JAK 페어링(pairings)과 관련이 있다. JAK 패밀리 중 4개의 멤버 각각은 염증과 관련된 시토킨 중 적어도 하나의 신호전달에 관련되어 있다.
천식은 예방법이나 치료법이 없는 만성 기도 질환이다. 상기 질환은 기도의 염증, 섬유증, 과민증 (hyperresponsiveness) 및 개조 (remodeling)를 특징으로 하고, 이들 모두는 공기 흐름을 제한하는데 기여한다. 전 세계적으로 대략 3억 명의 사람들이 천식으로 고통받고 있고, 천식 환자의 수는 2025년까지 1억명 이상 증가할 것으로 추정된다. 대부분의 환자는 류코트리엔 조절제 및/또는 지속 작용 베타 작용제와 조합될 수 있는 흡입형 코르티코스테로이드를 사용하여 천식 증상을 제어할 수 있지만, 천식 질환이 기존의 요법으로 제어되지 않는 중증 천식 환자 집단이 남아있다. JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 천식 염증에 관련된 시토킨으로는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, 흉선 기질상 림포포이에틴 (thymic stromal lymphopoietin: TSLP), 인터페론-γ (IFNγ), 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF)를 포함한다. 기도 염증은 천식 이외의 다른 호흡기 질환의 특징이다. 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease:COPD), 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis: CF), 폐렴, 간질성 폐질환 (특발성 폐섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis) 포함), 급성 폐손상 (acute lung injury), 급성 호흡곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome), 기관지염 (bronchitis), 폐기종 (emphysema) 및 폐쇄세기관지염 (bronchiolitis obliterans)은 또한 병리생리학이 JAK-신호전달 시토킨과 관련이 있다고 여겨지는 기도 질환이다.
JAK-신호전달 시토킨은 또한 많은 면역 과정에 중요한 면역 세포의 서브-타입인 T 세포의 활성화에서 주요 역할을 한다. 병리학적 T 세포 활성화는 다수의 호흡기 질환의 병인에서 중요하다. 자가반응성 T 세포는 폐쇄세기관지염 기질화 폐렴 (bronchiolitis obliterans organizing pneumonia, COS라고도 칭함)에서 역할을 한다. COS와 유사하게, 폐 이식 거부반응의 병인은 이식된 공여자 폐에 의한 수여자 T 세포의 이상 (aberrant) T 세포 활성화와 연관되어 있다. 폐 이식 거부반응은 초기에는 원발성 이식 기능장애 (PGD), 기질화 폐렴 (OP), 급성 거부반응 (AR) 또는 림프구성 세기관지염 (LB)으로 발생할 수 있거나 또는 이들은 폐 이식하고 몇 년 후에는 만성 폐 동종이식 기능장애 (CLAD)로 발생할 수 있다. CLAD는 이전에는 폐쇄세기관지염 (BO)으로 알려져 있었지만, 현재는 BO, 제한적 CLAD (rCLAD 또는 RAS) 및 호중구성 동종이식 기능장애를 포함하는 상이한 병리학적 증상을 갖는 증후군으로 여겨진다. 만성 폐 동종이식 기능장애(CLAD)는 이식된 폐가 점차적으로 기능을 상실하게 하기 때문에 폐 이식 수여자의 장기적 관리에 있어서 주요 과제이다 (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185-191). CLAD는 치료에 잘 반응하지 않으므로, 따라서 이러한 병태를 예방 또는 치료할 수 있는 효과적인 화합물이 여전히 필요하다. 몇 가지 JAK-의존성 시토킨, 예컨대 IFNγ 및 IL-5는 CLAD 및 폐 이식 거부반응에서 상향-조절된다 (Berastegui et al, Clin Transplant. 2017, 31, e12898). 더욱이, JAK-의존성 IFN 신호전달의 다운스트림에 있는 CXCL9 및 CXCL10과 같은 CXCR3 케모킨의 높은 폐 수준은 폐 이식 환자에서 불량한 예후와 관련이 있다 (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). 전신 JAK 억제는 신장 이식 거부반응에서 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). 그러므로, JAK 억제제는 폐 이식 거부반응 및 CLAD를 예방 또는 지연하는데 효과적일 가능성이 있다. 폐 이식 거부반응의 근거로서 기재한 유사한 T 세포 활성화 사건은 또한 조혈 줄기 세포 이식 후 발생할 수 있는 폐 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)의 주요 동인으로 여겨진다. CLAD와 유사하게, 폐 GVHD는 만성 진행성 병태로, 예후가 극도로 좋지 않고, 현재 승인된 치료법은 없다. 구제 요법 (salvage therapy)으로 전신 JAK 억제제 룩솔리티닙 (ruxolitinib)을 투여받은 스테로이드-불응성 급성 또는 만성 GVHD 환자 95명에 대한 후향적, 다기관 조사 연구에서 폐 GVHD 환자를 포함하는 대부분의 환자에서 룩솔리티닙에 대해 완전 또는 부분 관해를 나타내었다 (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68).
2019년 9월 3일에 출원된 공동 양도된(commonly assigend) 미국 출원 일련번호 제16/559,077호는 JAK 억제제로서 유용한 몇몇의 디메틸 아미노 아제티딘 아미드 화합물을 개시한다. 특히, (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (화합물 1):
Figure pct00001
이 천식 및 폐 이식 거부반응을 포함하는 염증성 호흡기 질환을 치료, 예방 및/또는 지연하는데 적절한 강력한 비-전신-JAK 억제제(non-systemic pan-JAK inhibitor)로서 특히 개시된다.
상기 화합물을 치료제로서 효과적으로 사용하기 위해, 결정형 고체-상태 형태를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 상당히 높은 온도에서 열적으로 안정한 물리적 형태를 가짐으로써, 그 물질의 처리과정 및 저장을 용이하게 하는 것이 매우 바람직할 수 있다. 결정성 고체는 일반적으로 제품의 순도및 안정성을 증진시키는데 비결정형보다 바람직하다. 그러나, 유기 화합물의 결정형의 형성은 매우 예측하기 어렵다. 유기 화합물의 형태가 결정성이 될지를 예측할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법은 존재하지 않는다. 더욱이, 결정형이 약학적 활성제로서 사용하기에 바람직한 물리적 특성을 갖는 지를 예측할 수 있는 방법도 존재하지 않는다.
따라서, 화합물 1의 결정형에 대한 필요성이 존재한다.
본원에서는 화학식 1의 화합물의 결정성 수화물을 제공한다:
Figure pct00002
본원에서는 또한 본 개시의 결정성 수화물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본원에서는 본 개시의 결정성 수화물을 제조하는 방법뿐만 아니라, JAK 억제제를 사용하여 치료될 수 있는 질병, 특히 호흡기 질병 및 폐 이식 거부반응의 치료, 예방, 지연, 및/또는 개선 방법을 제공한다.
또한, 본원에서는 JAK 억제제를 사용하여 치료될 수 있는 질환, 특히 호흡기 질환 및 폐 이식 거부반응의 치료, 예방, 지연, 및/또는 완화를 위한 의학적 요법 및 제제 또는 의약의 제조에 있어서의 상기 결정형 수화물의 용도를 제공한다.
본 발명의 다양한 양상을 첨부된 도면을 참고로 도시한다.
도 1은 화합물 1의 결정성 수화물의 분말 x-선 회절 (PXRD) 패턴을 나타낸다.
도 2는 화합물 1의 결정성 수화물의 시차 주사 열량 분석법 (DSC) 열분석도를 나타낸다.
도 3은 화합물 1의 결정성 수화물의 열 중량 분석 (TGA) 플롯을 나타낸다.
도 4는 약 25 ℃의 온도에서 관찰된 화합물 1의 결정성 수화물의 동적 수분 흡착 (dynamic moisture sorption: DMS) 등온선을 나타낸다.
정의
본 발명의 다양한 양상 및 구체예를 포함하는 본 명세서를 서술할 때, 하기 용어는 달리 지시하지 않는 한 하기의 의미를 갖는다.
용어 "약"은 명시된 값의 ± 5 퍼센트를 의미한다.
용어 "수화물 (hydrate)"은 물 분자와 본 발명의 화합물의 분자에 의해 형성되는, 전형적으로는 결정형의 복합체 또는 응집물을 의미하며, 상기 물 분자 대 화합물 분자의 비율은 1:1, 1:1 미만 또는 1:1 초과일 수 있다.
용어 "실질적으로(substantially)"가 예를 들어 X-선 회절 패턴, DSC 트레이스, 또는 TGA 트레이스를 지칭하는 경우, 본원에 기술된 것과 반드시 동일하지는 않지만 당 분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 때 실험적 오차 또는 편차 범위에 들어가는 패턴 또는 트레이스를 포함한다.
용어 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 치료에 영향을 주는 충분한 양을 의미한다.
용어 "치료하는 (treating)" 또는 "치료 (treatment)"는 환자 (특히 인간)에서 치료되는 의학적 병태, 질환 또는 장애 (예: 호흡기 질환)를 개선 또는 억제; 또는 상기 의학적 병태, 질환 또는 장애의 증상을 완화시키는 것을 의미한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수 형태 "a", "an", "one" 및 "the"는 문맥에서 분명하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함할 수 있다는 것을 알아야 한다.
명명 규칙
화합물 1은 ChemDraw 소프트웨어 (PerkinElmer, Inc., Cambridge,MA) 에서 구현되는 바와 같이 IUPAC 규칙에 따라 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논으로 명명되었다.
또한, 화합물 1의 구조에서 테트라히드로이미다조피리딘 모이어티의 이미다조 부분은 실시예 1의 화합물의 단편에 대해 하기에 도시된 바와 같이 토토머 형태로 존재한다:
Figure pct00003
IUPAC 규칙에 따라, 이러한 표현은 이미다졸 부분의 원자에 번호를 다르게 부여할 수 있다: (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-1 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (구조 A) 대 (S)-(3-디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (구조 B). 특정 형태의 구조들을 나타내거나 또는 명명하더라도, 본 발명은 또한 그의 토토머를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
화합물 1 의 결정형
본원에서는 화학식 1의 화합물의 결정성 수화물(결정형 I)을 제공한다:
Figure pct00004
일 구체예에서, 상기 결정성 수화물은 68±0.20, 10.43±0.20, 10.94±0.20, 및 13.08±0.20의 2θ 값에서의 회절 피크를 포함하는 분말 X-선 회절 (PXRD) 패턴을 특징으로 한다. 상기 결정성 수화물은 8.49±0.20의 2θ 값에서 하나의 추가 회절 피크를 갖는 PXRD 패턴을 추가적 특징으로 할 수 있다. 상기 결정성 수화물은 11.55±0.20, 12.20±0.20, 17.06±0.20, 및 26.29±0.20으로부터 선택되는 2θ 값에서 2 이상의 추가 회절 피크를 갖는 PXRD 패턴을 추가적 특징으로 할 수 있다. 상기 결정성 수화물은 1.55±0.20, 12.20±0.20, 17.06±0.20, 및 26.29±0.20의 2θ 값에서 추가 회절 피크를 갖는 PXRD 패턴을 추가적 특징으로 할 수 있다.
상기 결정성 수화물은 5.68±0.20, 8.49±0.20, 10.43±0.20, 10.94±0.20, 11.55±0.20, 12.20±0.20, 13.08±0.20, 15.94±0.20, 16.24±0.20, 17.06±0.20, 17.60±0.20, 18.41±0.20, 18.82±0.20, 18.96±0.20, 21.90±0.20, 22.08±0.20, 22.27±0.20, 24.55±0.20, 및 26.29±0.20으로부터 선택되는 2θ 값에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 회절 피크를 갖는 PXRD 패턴을 특징으로 할 수 있다.
분말 X-선 회절 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, PXRD 스펙트럼의 피크 위치는 실험 세부사항, 예컨대 시료 제조 및 기기 기하학의 세부사항에 대해, 상대 피크 높이보다 상대적으로 덜 민감하다. 그러므로, 일 구체예에서, 상기 결정성 수화물은 상기 피크 위치가 도 1에 도시된 것과 실질적으로 일치하는 분말 x-선 회절 패턴을 특징으로 한다.
또 다른 구체예에서, 상기 결정성 수화물은 고온에 노출될 때 그의 거동 (behavior)을 특징으로 한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 분당 10℃의 가열 속도로 기록된 시차 주사 열량 분석법 (DSC) 트레이스는 약 55.1℃에서 개시 및 약 139.4℃에서 피크를 갖는 탈수 흡열 (dehydration endotherm), 및 약 198.6℃ 에서 개시 및 약 212.4℃에서 피크를 갖는 용융물 전이(melt transition)로 확인되는 흡열 열 흐름 (endothermic heat flow)에서 피크를 나타낸다. 일 구체예에서, 상기 결정형 수화물(결정형 I)는 212.4±3　℃에서 최대 흡열 열 흐름을 나타내는 분당 10℃의 가열 속도로 기록된 시차 주사 열량 분석법 트레이스를 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 최대 흡열 열 흐름은 212.4±2　℃에서 나타난다. 또 다른 구체예에서, 최대 흡열 열 흐름은 212.4±1 ℃에서 나타난다.
일 구체예에서, 상기 결정성 수화물은 1수화물이다.
도 3의 열 중량 분석 (TGA) 트레이스는 100.0 ℃ 까지 3.4%의 중량 손실을 나타낸다. 상기 화합물은 약 27℃의 개시 온도에서 탈수한다. 분해와 관련된 중량 손실은 약 248.2 ℃의 개시 온도에서 관찰될 수 있다.
본 발명의 결정성 수화물은 가역적인 흡착/탈착 프로파일을 갖는 것으로 나타난다. 상기 고체는 적당히 흡습성(hygroscopic)이다. 상기 결정성 수화물은 도 4에 도시된 바와 같이 실온에서 상대 습도 약 0 % 내지 약 90 % 범위에 노출될 때 약 5.3 %의 총 수분 흡수를 나타내었다.
결정형 I은 하기 수치의 단일 결정 X-선 결정학(single crystal X-ray crystallography)에 의해 결정되는 단위 셀(unit cell)을 특징으로 한다: a = 20.8736(5) Å; b = 9.15021(19) Å; c = 15.7412(3) Å; a = 90°; b =98.4786(18)°; 및 g = 90°. 100(2)　K 온도에서 분석되는 결정형 I의 단일 결정은 하기 수치를 갖는 단사정계(monoclinic crystal system)를 특징으로 한다: a = 20.8736(5) Å; b = 9.15021(19) Å; c = 15.7412(3) Å; a = 90°; b =98.4786(18)°; g = 90°; 셀 부피 (V) 2973.67(11) Å3, 및 스페이스 그룹(space group) C2.
결정형 I은 실시예 10에 나타난 바와 같은 온도 및 상대 습도의 가속된 조건 하에서 우수한 안정성을 나타내었다.
합성 방법
화합물 1은 하기 실시예에 기재된 방법을 사용하거나 또는 본 출원의 배경기술에 기재된 공동 양도된 미국출원에 기재된 방법을 사용하여 용이하게 입수가능한 개시 물질로부터 제조될 수 있다.
결정형 I은 하기 단계에 의해 제조될 수 있다:
(a) (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논을 55℃ ±10℃에서 알코올 용매에 용해시켜 용액을 제공하는 단계;
(b) (a)단계의 용액을 10℃ ±10℃ 로 냉각시켜 현탁제를 생성하는 단계;
(c) 비활성 기체 조건 하, (b)단계의 현탁제로부터 고체를 분리하는 단계;
(d) (c)단계에서 수득한 고체를 60℃ ±15℃에서 건조시키는 단계; 및
(e) (d)단계에서 수득한 고체를 주위 습도 및 온도 조건에 두어 결정성 수화물을 제공하는 단계.
일부 구체예에서, 알코올 용매는 메탄올이다. 일부 구체예에서, 알코올 용매는 에탄올이다.
일부 구체예에서, 단계 (b)에서 현탁제 생성을 개시하기 위해 결정형 I의 시드(seed)를 부가하였다.
약학적 조성물
본 개시의 결정성 수화물 고체 형태는 약학적 조성물 또는 제제의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 유리하게는 흡입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 경구, 국소 (경피 포함), 직장, 비강 및 비경구 투여 방식을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 허용가능한 임의의 투여 경로로 투여될 수 있다.
따라서, 본원의 일 구체예에서 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 및 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 선택적으로, 이러한 약학적 조성물은 바람직하다면 다른 치료제 및/또는 제제화제를 함유할 수 있다. 조성물 및 그의 용도에 대해 논의하는 경우, 본 발명의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)은 본원에서 "활성제 (active agent)"로도 언급될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)의 치료적으로 유효한 양을 함유한다. 그러나 당 분야의 통상의 기술자는 약학적 조성물이 치료적으로 유효한 양을 초과하여 함유하거나, 즉 벌크 (bulk) 조성물, 또는 치료적으로 유효한 양보다 적게, 즉 치료적으로 유효한 양의 달성을 위해 다회 투여 목적으로 설계된 개별 유닛 용량으로 함유할 수 있다는 것을 알 것이다.
전형적으로, 이러한 약학적 조성물은 약 0.01 내지 약 95 중량%의 활성제; 예를 들어, 약 0.05 내지 약 30 중량%; 및 약 0.1 중량% 내지 약 10 중량%의 활성제를 함유할 것이다.
임의의 종래의 담체 또는 부형제가 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다. 특정 담체 또는 부형제, 또는 담체나 부형제의 조합의 선택은 특정 환자 또는 의학적 병태 또는 질환 상태의 유형을 치료하기 위해 사용되는 투여 방식에 의해 결정될 것이다. 이와 관련하여, 특정한 투여 방식에 적절한 약학적 조성물의 제조는 약제학 분야의 통상의 기술의 범위 내에 속한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물에 사용되는 담체 또는 부형제는 상업적으로 입수가능하다. 추가적 예시로서, 기존의 제제화 기법은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); 및 H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999)에 기재되어있다.
약학적으로 허용가능한 담체로 제공될 수 있는 물질의 대표적인 예로는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 예컨대 미정질 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트 분말 (powdered tragacanth); 맥아 (malt); 젤라틴; 탈크; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스 (suppository waxes); 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화씨유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가 (agar); 완충제, 예컨대 마그네슘 수산화물 및 알루미늄 수산화물; 알긴산; 발열성물질-제거수 (pyrogen-free water); 등장성 식염수; 링거액; 에틸 알코올; 포스페이트 완충 용액; 및 약학적 조성물에 사용되는 기타 무독성 적합성 물질.
약학적 조성물은 전형적으로 활성제를 약학적으로 허용 가능한 담체 및 하나 이상의 선택적 성분들과 철저하게 (thoroughly) 및 친밀하게 (intimately) 혼합 (mixing) 또는 블렌딩 (blending)시켜 제조된다. 이후 생성된 균일하게 블렌딩된 혼합물은 종래의 방법 및 장비를 사용하여, 정제, 캡슐, 환제 (pill) 등으로 성형 또는 로드 (load)될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 흡입 투여에 적절하다. 흡입 투여를 위한 약학적 조성물은 전형적으로 에어로졸 또는 분말의 형태이다. 이러한 조성물은 일반적으로 건조 분말 흡입기 (dry powder inhaler: DPI), 정량식 흡입기 (metered-dose inhaler: MDI), 네뷸라이저 흡입기 (nebulizer inhaler) 또는 유사한 전달 장치와 같은 흡입기 전달 장치를 사용하여 투여된다.
특정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 건조 분말 흡입기를 사용하여 흡입에 의해 투여된다. 이러한 건조 분말 흡입기는 전형적으로 약학적 조성물을 흡기 (inspiration) 중에 환자의 기류(air-stream)에 분산된 자유-유동 분말로서 투여한다. 자유-유동 분말 조성물을 수득하기 위해, 치료제는 전형적으로 적절한 부형제 예컨대 락토스, 전분, 만니톨, 덱스트로스, 폴리락트산 (polylactic acid: PLA), 폴리락티드-코-글리콜리드 (polylactide-co-glycolide: PLGA) 또는 이들의 조합과 함께 제제화된다. 전형적으로, 상기 치료제는 미분화되고, 적절한 담체와 조합되어 흡입에 적절한 조성물을 형성한다.
건조 분말 흡입기에 사용되는 대표적인 약학적 조성물은 락토스 및 화합물 1의 결정성 수화물의 미분화된 형태를 포함한다. 이러한 건조 분말 조성물은 예를 들어 건조 분쇄된 락토스를 치료제와 조합하고, 이후 상기 성분들을 건식 블렌딩함으로써 제조될 수 있다. 그 다음에 상기 조성물은 전형적으로 건조 분말 디스펜서, 또는 건조 분말 전달 장치에 사용하기 위한 흡입 카트리지 또는 캡슐로 로딩된다.
치료제를 흡입에 의해 투여하기에 적절한 건조 분말 흡입기 전달 장치는 당 분야에 개시되어 있고, 이러한 장치의 예는 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 대표적인 건조 분말 흡입기 전달 장치 또는 제품으로는 Aeolizer (Novartis); Airmax (IVAX); ClickHaler (Innovata Biomed); Diskhaler (GlaxoSmithKline); Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline); Ellipta (GlaxoSmithKline); Easyhaler (Orion Pharma); Eclipse (Aventis); FlowCaps (Hovione); Handihaler (Boehringer Ingelheim); Pulvinal (Chiesi); Rotahaler (GlaxoSmithKline); SkyeHaler/Certihaler (SkyePharma); Twisthaler (Schering-Plough); Turbuhaler (AstraZeneca); Ultrahaler (Aventis) 등이 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 정량식 흡입기를 사용하여 흡입에 의해 투여된다. 이러한 정량식 흡입기는 전형적으로 압축된 분사제 기체(propellant gas)를 사용하여 측정된 양의 치료제를 배출한다. 따라서, 정량식 흡입기를 사용하여 투여된 약학적 조성물은 전형적으로 액화된 분사제 내에 치료제의 현탁제를 포함한다. 히드로플루오로알칸 (HFAs), 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 (HFA 134a) 및 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로-n-프로판, (HFA 227); 및 클로로플루오로카본, 예컨대 CCl3F를 포함하는 임의의 적절한 액화된 분사제가 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 분사제는 히드로플루오로알칸이다. 일부 구체예에서, 상기 히드로플루오로알칸 제제는 보조-용매 (co-solvent), 예컨대 에탄올 또는 펜탄, 및/또는 계면활성제, 예컨대 소르비탄 트리올레에이트, 올레산, 레시틴 및 글리세린을 함유한다.
정량식 흡입기 사용을 위한 대표적인 약학적 조성물은 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I) 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%; 에탄올 약 0 중량% 내지 약 20 중량%; 및 계면활성제 약 0 중량% 내지 약 5 중량%; 나머지는 HFA 분사제를 포함한다. 이러한 조성물은 전형적으로 치료제, 에탄올 (존재하는 경우) 및 계면활성제 (존재하는 경우)를 함유하는 적절한 용기에 냉각되거나 또는 압축된 히드로플루오로알칸을 부가하여 제조된다. 현탁제를 제조하기 위해, 치료제를 미분화하고, 이후 분사제와 합한다. 이후 상기 조성물을 에어로졸 캐니스터 (aerosol canister)에 로딩하며, 이는 전형적으로 정량식 흡입기 장치의 일부를 형성한다.
치료제를 흡입에 의해 투여하기에 적절한 정량식 흡입기 전달 장치는 당해 기술 분야에 개시되어 있고, 이러한 장치의 예는 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 대표적인 정량식 흡입기 장치 또는 제품은 AeroBid Inhaler System (Forest Pharmaceuticals); Atrovent Inhalation Aerosol (Boehringer Ingelheim); Flovent (GlaxoSmithKline); Maxair Inhaler (3M); Proventil Inhaler (Schering); Serevent Inhalation Aerosol (GlaxoSmithKline) 등이 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 네뷸라이저 흡입기를 사용하여 흡입에 의해 투여된다. 이러한 네뷸라이저 장치는 전형적으로 고속 공기 스트림을 생성하여 약학적 조성물이 미스트로 분무되도록 하며, 상기 미스트는 환자 기도로 운반된다. 따라서, 네뷸라이저 흡입기에서 사용하기 위해 제제화되는 경우, 치료제를 미분화하거나 또는 나노분쇄하고 적절한 담체와 조합하여 현탁제제를 형성할 수 있다.
네뷸라이저 흡입기에 사용되는 대표적인 약학적 조성물은 약 0.05 μg/mL 내지 약 20mg/mL의 본 발명의 결정성 수화물 및 네뷸라이저 제제에 적절한 부형제를 포함하는 현탁제제를 포함한다. 일 구체예에서, 그 액제의 pH는 약 3 내지 약 8이다.
치료제를 흡입에 의해 투여하기에 적절한 네뷸라이저 장치는 당 분야에 개시되어 있고, 이러한 장치의 예는 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 대표적인 네뷸라이저 장치 또는 제품으로는 Respimat Softmist Inhaler (Boehringer Ingelheim); AERx Pulmonary Delivery System (Aradigm Corp.); PARI LC Plus Reusable Nebulizer (Pari GmbH) 등을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 대안으로서 경구 투여를 위한 제형으로 제조될 수 있다. 경구 투여에 적절한 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 환제, 로젠지 (lozenge), 카세제 (cachet), 드라제 (dragee), 산제 (powder), 과립제 (granule); 또는 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁제제; 또는 수중유 (oil-in-water) 또는 유중수 (water-in-oil) 액체 에멀젼; 또는 엘릭실제 (elixir) 또는 시럽제 등의 형태일 수 있고; 각각은 활성 성분으로서 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)의 미리 결정된 양을 함유한다.
고체 제형으로 경구 투여를 의도하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 활성제 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트를 포함할 것이다. 선택적으로 또는 대안으로서, 이러한 고체 제형은 또한 하기를 포함할 수 있다: 충전제 (filler) 또는 증량제 (extender), 결합제, 보습제 (humectants), 용액 지연제, 흡수 촉진제, 습윤제, 흡수제, 윤활제, 착색제 및 완충제. 이형제, 습윤제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 산화방지제 또한 본 발명의 약학적 조성물 중에 존재할 수 있다.
결정형 I은 또한 안구 주사를 위해 멸균 수성 현탁제로서 제제화될 수 있다. 이러한 수성 제제에 포함될 수 있는 유용한 부형제는 폴리소르베이트 80, 카르복시메틸셀룰로스, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트, 히스티딘, α-α-트레할로스 2수화물, 수크로스, 폴리소르베이트 20, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 및 소듐 포스페이트를 포함한다. 벤질 알코올은 보존제로서 제공될 수 있고, 염화나트륨은는 강장도 (tonicity)를 조정하기 위해 포함될 수 있다. 또한, 염산 및/또는 수산화나트륨이 pH 조정을 위해 상기 용액에 부가될 수 있다. 안구 주사를 위한 수성 제제는 보존제 없이 (preservative-free) 제조될 수 있다.
대체 제제로는 또한 제어된 방출 제제, 경피 패치 및 비경구 제제를 포함할 수 있다. 이러한 대체 제제의 기존의 부형제 및 제조 방법은 예를 들어 상기 Remington참고문헌에 기재되어 있다.
하기 비제한적인 실시예는 본 개시의 대표적인 약학적 조성물을 예시한다.
건조 분말 조성물
미분화된 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)(1 g)을 분쇄된 락토스 (25 g)와 블렌딩한다. 이후 상기 블렌딩된 혼합물을 투여 (dose)당 화학식 I의 화합물을 약 0.1 mg 내지 약 4 mg으로 제공하기에 충분한 양으로 박리형 블리스터 팩(peelable blister pack)의 개별 블리스터로 로딩한다. 상기 블리스터의 내용물은 건조 분말 흡입기를 사용하여 투여된다.
건조 분말 조성물
미분화된 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I) (1 g)을 분쇄된 락토스 (20　g)와 블렌딩하여 화합물 대 분쇄된 락토스의 중량비가 1:20인 벌크 조성물을 형성한다. 상기 블렌딩된 조성물은 투여 당 화학식 1의 화합물을 약 0.1 mg 내지 약 4 mg으로 전달할 수 있는 건조 분말 흡입 장치로 패킹한다.
정량식 흡입기 조성물
미분화된 화합물 1의 결정성 수화물, 결정형 I (10 g)을 탈염수 (200 mL)에 레시틴 (0.2 g)을 용해시켜서 제조된 용액 중에 분산시킨다. 생성된 현탁제를 분무 건조하고 이후 미분화하여 약 1.5 μm 미만의 평균 직경을 갖는 입자를 포함하는 미분화된 조성물을 형성한다. 이후 상기 미분화된 조성물을 정량식 흡입기로 투여할 때, 투여 당 화합물 1을 약 0.1 mg 내지 약 4 mg으로 제공하기에 충분한 양으로 가압된 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 함유하는 정량식 흡입기 카트리지에 로딩한다.
네뷸라이저 조성물
본 개시의 결정성 수화물, 결정형 I (25 mg)을 1.5-2.5 당량의 염산을 함유하는 용액에 현탁시키고, 이후 pH를 3.5 내지 5.5로 조정하기 위한 수산화나트륨 및 3 중량%의 글리세롤을 부가한다. 그 현탁제제는, 투여 당 화합물 1을 약 0.1 mg 내지 약 4 mg으로 제공하는 네뷸라이저 장치를 사용하여 투여한다.
안구 주사용 수성 제제
각 mL의 멸균 수성 현탁제제는 mL당 5 mg 내지 50 mg의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I), 강장도를 위한 염화나트륨, 보존제로서 0.99 % (w/v) 벤질 알코올, 0.75 % 카르복시메틸셀룰로스 소듐 및 0.04 % 폴리소르베이트를 포함한다. 수산화나트륨 또는 염산이 pH를 5 내지 7.5로 조정하기 위해 포함될 수 있다.
안구 주사용 수성 제제
무-보존제 멸균 수성 현탁제는 10 mM 소듐 포스페이트, 40 mM 염화나트륨, 0.03 % 폴리소르베이트 20, 및 5　% 수크로스 중에 5 mg/mL 내지 50 mg/mL의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)을 포함한다.
유용성
화합물 1은 기도의 염증성 및 섬유증 질환의 치료를 위해 설계되었다. 특히, 상기 화합물은 강력한 항-시토킨 활성제를 전신 노출을 제한하면서 폐 내의 호흡기 질환의 작용 위치에 직접적으로 전달하도록 설계되었다.
화합물 1은 JAK 패밀리 효소인 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌다. 또한, 화합물 1은 염증유발 (pro-inflammatory) 및 섬유화유발(pro-fibrotic) 시토킨의 강력한 억제를 나타내었다. JAK 억제제의 광범위한 항-염증 효과가 정상적인 면역 세포 기능을 억제하여 잠재적으로 감염 위험을 증가시킬 수 있음이 인식되어 왔다. 본 화합물은 폐에서 혈장으로의 흡수를 제한하여 면역억제 위험을 최소화하도록 최적화되었다.
하기 실험 섹션에서 기술되는 바와 같이, 화합물 1의 흡수 및 분포는 전임상 분석에서 프로파일링되었다. 화합물 1은 마우스에서 테스트되었고, 투여 5시간 후에 폐 조직 내에서의 높은 농도 및 혈장으로의 낮은 흡수를 나타냈다. 화합물 1은 마우스의 폐 조직에서 염증유발 시토킨 IL-13의 효과를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 상기 화합물은 폐 조직에서 STAT6의 IL-13-유도 인산화의 억제를 나타내고, 이는 인 비보 (in vivo) 국소 폐 JAK 표적 관여의 증거를 제공한다. 이러한 효과는 염증유발 시토킨 IL-13이 시험 화합물 투여 4시간 후에 투여되는 경우에 관찰되었고, 이는 폐에서 유의한 체류의 추가적 증거를 제공한다.
화합물 1은 세포 수준에서 강력한 억제 활성 및 폐에서 유의한 체류 모두를 나타낸다. 본 발명자들의 광범위한 연구는 세포 수준에서 강력한 화합물 또는 폐에서 유의한 체류를 나타내는 화합물을 확인하는 것은 가능하지만, 두 가지 바람직한 특성을 동시에 나타내는 화합물을 발견하는 것은 훨씬 더 어렵다는 것을 입증하였다.
JAK 억제제의 항-염증 활성은 천식의 전임상 모델에서 강력하게 입증되었다 (Malaviya et al., Int. Immunopharmacol., 2010, 10, 829-836; Matsunaga et al., Biochem. and Biophys. Res. Commun., 2011, 404, 261-267; Kudlacz et al., Eur. J. Pharmacol, 2008, 582, 154-161). JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 천식 염증에 관련된 시토킨으로는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, 흉선 기질상 림포포이에틴 (thymic stromal lymphopoietin: TSLP), 인터페론-γ (IFNγ), 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함한다. 따라서, 화합물 1, 및 이의 결정성 수화물, 결정형 I은 염증성 호흡기 장애, 특히 천식 치료에 유용할 것으로 기대된다. 천식은 저Th2 및 고Th2 서브타입으로 분류된다 (Simpson et al, Respirology, 2006, 11, 54-61). IL-4, IL-13, IL-5, 및 TSLP 가 고Th2 천식과 관련되어 있는 반면, IL-23/IL-12, IL-6, IL-27, 및 IFN-감마가 저Th2 천식과 관련되어 있다. 전신 JAK 억제 프로파일에 기초하여, 화합물 1은 고Th2 천식 및 저Th2 천식 모두의 매개 물질을 강력하게 억제한다. 따라서 화합물 1의 결정형 I은 고Th2 천식 및 저Th2 천식 모두의 치료에 유용할 것으로 기대된다.
폐의 염증 및 섬유증은 천식뿐만 아니라 다른 호흡기 질환, 예를 들어 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 낭포성 섬유증 (CF), 폐렴, 간질성 폐질환 (특발성 폐섬유증 포함), 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄세기관지염 및 사르코이드증(sarcoidosis)의 특징이다. 따라서, 화합물 1, 및 이의 결정성 수화물, 결정형 I은 또한 만성 폐쇄성 폐질환, 낭포성 섬유증, 폐렴, 간질성 폐질환 (특발성 폐섬유증 포함), 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 폐쇄세기관지염 및 사르코이드증의 치료에 또한 유용할 것으로 기대된다.
이의 상응하는 플루오로 유사체(화합물 C-1)와 비교할 때, 화합물 1은 유사한 JAK 활성을 갖는 것으로 나타났다. 그러나 분석 섹션(assay section)에서 입증된 바와 같이, 이는 현저히 더 낮은 황산화 대사를 유발한다는 장점이 있다. 이는 황산화 대사가 폐에서 일어나면 활성 모 화합물의 노출의 급격한 감소를 초래할 수 있기 때문에 유의미하다.
화합물 1은 염증과 관련된 시토킨의 억제를 나타낸다. 따라서, 결정형 I은 하기 상세히 설명된 바와 같이, 특정 호흡기 질환 치료에 유용할 것이다.
호산구성 기도 염증은 총체적으로 호산구성 폐질환이라고 하는 질병의 특징적 특징이다 (Cottin et al., Clin. Chest. Med., 2016, 37(3), 535-56). 호산구성 질환은 IL-4, IL-13 및 IL-5 신호전달과 관련이 있다. 호산구성　폐질환은 감염 (구체적으로 연충 감염), 약물-유발성 폐렴 (예를 들어 치료 약물 예컨대 항생제, 페니토인 (phenytoin) 또는　l-트립토판에 의해 유발), 진균-유발성 폐렴 (예: 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증), 과민성 폐렴 및 다발혈관염을 동반한 호산구성　육아종증 (이전에 척-스트라우스 증후군 (Churg-Strauss syndrome)으로 알려져 있음)을 포함한다. 알려져 있지 않은 병인의 호산구성　폐질환으로는 특발성 급성　호산구성　폐렴, 특발성 만성　호산구성　폐렴, 과호산구성　증후군 및 뢰플러 증후군(L
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ffler syndrome)을 포함한다.
IL-6 유전자의 다형 (polymorphism)은 IL-6의 수준 증가 및 폐 동맥 고혈압 (PAH)의 발생 위험 증가와 관련이 있다 (Fang et al., J Am Soc. Hypertens., 2017, 11(3), 171-177). PAH에서 IL-6의 역할을 입증하여, IL-6 수용체 사슬 gp130의 억제로 PAH의 래트(rat) 모델에서 상기 질환을 개선하였다 (Huang et al., Can J Cardiol., 2016, 32(11), 1356.e1-1356.e10).
시토킨 예컨대 IFNγ, IL-12 및 IL-6은 광범위한 비-알레르기성 폐 질환 예컨대 사르코이드증 및 림프관평활근종증과 관련이 있다 (El-Hashemite et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2005, 33, 227-230, and El-Hashemite et al., Cancer Res., 2004, 64, 3436-3443). 본 개시의 화합물은 또한 IL-6 및 IFNγ 신호전달을 억제하는 것으로 나타났다.
기관지확장증 및 침윤성 폐질환은 만성 호중구성 염증과 관련이 있는 질환이다.
병리학적 T 세포 활성화는 다수의 호흡기 질환의 병인에서 중요하다. 자가반응성 T 세포는 폐쇄세기관지염 기질화 폐렴 (또한 COS라고 함)에서 역할을 한다. COS와 유사하게, 폐 이식 거부반응의 병인은 이식된 공여자 폐에 의한 수여자 T 세포의 이상 (aberrant) T 세포 활성화와 연관되어 있다. 폐 이식 거부반응은 초기에는 원발성 이식 기능장애 (PGD), 기질화 폐렴 (OP), 급성 거부반응 (AR) 또는 림프구성 세기관지염 (LB)으로 발생할 수 있거나 또는 이들은 폐 이식하고 몇 년 후에는 만성 폐 동종이식 기능장애 (CLAD)로 발생할 수 있다. CLAD는 이전에 폐쇄세기관지염 (BO)으로 알려져 있었지만, 현재는 BO, 제한적 CLAD (rCLAD 또는 RAS) 및 호중구성 동종이식 기능장애를 포함하는 상이한 병리학적 증상을 갖는 증후군으로 여겨진다. 만성 폐 동종이식 기능장애(CLAD)는 이식된 폐가 점차적으로 기능을 상실하게 하기 때문에 폐 이식 수여자의 장기적 관리에 있어서 주요 과제이다 (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185-191). CLAD는 치료에 잘 반응하지 않으므로, 따라서 이러한 병태를 예방 또는 치료할 수 있는 효과적인 화합물이 여전히 필요하다. 몇 가지 JAK-의존성 시토킨, 예컨대 IFNγ 및 IL-5는 CLAD 및 폐 이식 거부반응에서 상향-조절된다 (Berastegui et al, Clin Transplant. 2017, 31, e12898). 더욱이, JAK-의존성 IFN 신호전달의 다운스트림에 있는 CXCL9 및 CXCL10과 같은 CXCR3 케모킨의 높은 폐 수준은 폐 이식 환자에서 불량한 예후와 관련이 있다 (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). 전신 JAK 억제는 신장 이식 거부반응에서 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). 그러므로, JAK 억제제는 폐 이식 거부반응 및 CLAD를 예방 또는 지연하는데 효과적일 가능성이 있다. 폐 이식 거부반응에 기초하여 개시된 유사한 T 세포 활성화 사례는 또한 조혈 줄기 세포 이식 후 발생할 수 있는 폐 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)의 주요 동인으로 여겨진다. CLAD와 유사하게, 폐 GVHD는 결과가 극도로 좋지 않은 만성 진행성 병태이며, 현재 승인된 치료법이 없다. 구제 요법 (salvage therapy)으로 전신 JAK 억제제 룩솔리티닙 (ruxolitinib)을 투여받은 스테로이드-불응성 급성 또는 만성 GVHD 환자 95명에 대한 후향적, 다기관 조사 연구에서 폐 GVHD 환자를 포함하는 대부분의 환자에서 룩솔리티닙에 대해 완전 또는 일부 관해를 나타내었다 (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). 전신 JAK 억제는 심각한 부작용 및 작은 치료지수와 관련이 있으므로, 폐 이식 거부반응 또는 폐 GVHD를 예방하거나 지연시키기 위한 흡입되는 폐-직접적(lung-directed), 비전신 JAK 억제제에 대한 필요성이 남아있다. 화합물 1은 이러한 필요를 충족시키는데 요구되는 특성을 갖는다. 최근에는 면역-관문 억제제 사용이 증가하면서 또 다른 T 세포 매개 폐 질환인, 면역-관문 억제제 유발성 폐렴이 나타났다. 이러한 T 세포 자극제로 치료를 받은 암 환자에서, 치명적인 폐렴이 발생할 수 있다.
혼합 림프구 반응 분석은 이식 거부반응을 모방하는 인-비트로(in-vitro) 분석이다. 화합물 1은 IFNγ 분비를 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
그러므로, 일 구체예에서, 본 개시는 포유동물 (예: 인간)에서 호흡기 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)또는 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로-유효한 양을 포유동물 (또는 인간)에게 투여하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 낭포성 섬유증, 폐렴, 특발성 폐섬유증, 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 사르코이드증, 호산구성 질환, 폐 감염, 연충 감염, 폐 동맥 고혈압, 림프관평활근종증, 기관지확장증, 침윤성 폐질환, 약물-유발성 폐렴, 진균 유발성 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 과민성 폐렴, 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증, 특발성 급성 호산구성 폐렴, 특발성 만성 호산구성 폐렴, 과호산구성 증후군, 뢰플러 증후군, 폐쇄세기관지 기질화 폐렴, 폐 이식편대숙주병, 및 면역-관문-억제제 유발성 폐렴으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 호흡기 질환은 천식이다. 일부 구체예에서, 상기 천식은 중등도(moderate) 내지 중증(severe) 천식이다. 일부 구체예에서, 상기 천식은 경증(mild) 내지 증등도 천식이다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 흡입을 통해 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 천식은 고Th2 천식이다. 일부 구체예에서, 상기 천식은 저Th2 천식이다.
일 구체예에서, 본 개시는 포유동물 (예: 인간)에서 폐 이식 거부반응을 예방 또는 지연시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)또는 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로-유효한 양을 포유동물 (또는 인간)에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 폐 이식 거부반응은 원발성 이식 기능장애, 기질화 폐렴, 급성 거부반응, 림프구성 세기관지염, 및 만성 폐 동종이식 기능장애로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 폐 이식 거부반응은 급성 폐 이식 거부반응이다. 일부 구체예에서, 상기 폐 이식 거부반응은 만성 폐 동종이식 기능장애이다. 일부 구체예에서, 상기 폐 이식 거부반응은 폐쇄세기관지염, 제한적 만성 폐 동종이식 기능장애, 및 호중구성 동종이식 기능장애로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 흡입을 통해 투여된다.
또한 본원에서는 JAK 억제제를 사용하여 치료될 수 있는 질환, 특히 호흡기 질환 및 폐 이식 거부반응을 치료, 예방, 지연 또는 개선시키기 위한 의학적 요법 및 제제 또는 의약의 제조에 있어서의 결정형 I의 용도를 제공한다.
본 개시는 또한 포유동물에서 천식을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)또는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로-유효한 양을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다.
천식 치료에 사용할 때, 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)은 전형적으로 단회 1일 용량 또는 1일 당 다회 용량으로 투여될 것이고, 다른 투여 형태도 사용될 수 있다. 투여 당 활성제의 투여량 또는 1일 당 총 투여량은 전형적으로 치료되는 병태, 선택된 투여 경로, 투여된 실제 화합물 및 이의 상대 활성, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자 증상의 중증도 등을 포함하는 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이다.
본 개시는 또한 포유동물에서 호흡기 질환 (본원에서 기술된 질환을 포함하나 이에 제한되는 것은 아님)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)또는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물의 치료적으로-유효한 양을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다.
호흡기 질환 치료에 사용할 때 (본원에서 기술된 질환을 포함하나 이에 제한되는 것은 아님), 상기 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)은 전형적으로 1일 1회 투여 또는 1일 다중 투여로 투여될 것이고, 다른 형태의 투여도 사용될 수 있다. 투여 당 활성제의 투여량 또는 1일 당 총 투여량은 전형적으로 치료되는 병태, 선택된 투여 경로, 투여된 실제 화합물 및 이의 상대 활성, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자 증상의 중증도 등을 포함하는 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이다.
인간 코로나바이러스는 흔한 호흡기 병원체이며 일반적으로 경증 상부 호흡기 질환을 유발한다. 중증급성호흡기증후군 관련- 코로나바이러스(SARS-CoV-1)와 중동호흡기증후군-관련 코로나바이러스(MERS-CoV)라는 두가지 고병원성 바이러스가 각각 10% 및 35% 초과의 사망률을 초래하는 중증 호흡기 증후군을 유발하였다 (Assiri et al., N Engl J Med., 2013, 369, 407-1). 최근에 출현한 코로나바이러스 질병 2019 (COVID-19) 및 후속 판데믹은 세계적인 의료 비상사태를 발생시키고 있다. SARS-CoV-1 및 MERS-CoV와 유사하게, 환자의 서브세트(약 16%)는 급성 폐 손상(ALI)으로 나타나는 중증 호흡기 질환이 발생할 수 있으며, 이는 ICU 입원(약 5%), 호흡 부전(약 6.1 %) 및 사망을 초래한다(Wang et al., JAMA, 2020, 323, 11, 1061-1069; Guan et al., N Engl J Med., 2020, 382, 1708-1720; Huang et al., The Lancet, 2020. 395(10223), 497-506; Chen et al., The Lancet, 2020, 395(10223), 507-13). COVID-19 환자의 서브그룹은 급성 폐손상 및 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 유발하는 과염증성 "시토킨 폭풍"을 갖는 것으로 나타난다. 상기 시토킨 폭풍은 또한 전신 순환계로 흘러들어 패혈증 및 궁극적으로 다발성 장기부전 증후군을 일으킬 수 있다. COVID-19에서 나타나는 조절되지 않은 시토킨 신호전달은 인터페론(IFN), 인터루킨(IL) 및 케모킨의 증가된 발현을 특징으로 하고, 이는 ALI 및 관련된 사망을 초래한다. 이러한 과염증성 반응은 폐-선택적 전신-Janus 키나제 (JAK) 억제제에 의해 조절 및 치료될 수 있을 것이다. IL-6에 대한 단일클론항체(토실리주맙 및 사릴루맙)는 COVID-19유래 ALI를 갖는 환자의 치료에 효과적인 것으로 보인다 (Xu X, Han M, Li T, Sun W, Wang D, Fu B, et al. Effective Treatment of Severe COVID-19 Patients with Tocilizumab, 2020, PNAS, https://doi.org/10.1073/pnas.2005615117). COVID-19의 in-vivo 모델은 아직 발표되지 않았지만, 마우스-적응형 2003 SARS-CoV-1 및 2012 MERS-CoV 균주로의 감염, 및 인간 SARS-CoV-1에 감염된 인간 SARS-CoV-1 수용체 hACE2를 발현하는 형질전환 마우스는 IFNγ, IL-6 및 IL-12와 같은 JAK-의존성 시토킨과 케모킨 (C-C 모티프) 리간드 10 (CCL10), CCL2 및 CCL7와 같은 다운스트림 케모킨의 상승을 나타낸다(McCray et al., J Virol., 2007, 81(2), 813-21; Gretebeck et al., Curr Opin Virol. 2015, 13, 123-9.; Day et al., Virology. 2009, 395(2), 210-22. JAK 억제제는 또한 지질다당류- 또는 간시클로비르(ganciclovir)- 유발성 ALI의 마우스 모델에서 유익한 것으로 나타났다 (Severgnini et al., Am J Respir Crit Care Med., 2005, 171(8), 858-67; Jin et al., Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol., 2018, 314(5), L882-92). 마지막으로, 임상 시험 결과에 기초하여, JAK 억제제 바리시티닙은 산소 보충, 침습적 기계적 환기(invasive mechanical ventilation), 또는 체외막산소공급을 필요로 하는 환자의 COVID-19의 치료를 위해 렘데시비르와의 병용으로 긴급 사용 승인 (EUA)을 받았다 (https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-drug-combination-treatment-covid-19#:~:text=Today%2C%20the%20U.S.%20Food%20and,or%20older%20requiring%20supplemental%20oxygen%2C). 입원한 COVID-19 환자를 대상으로 한 임상시험에서, 바리시티닙과 렘데시비르 병용요법이 렘데시비르와 함께 위약을 투여받은 환자에 비해 치료 시작 후 29일 이내로 회복 시간을 단축시키는 것으로 나타났다.
따라서, 폐-선택적 흡입형 전신-JAK 억제제인 화합물 1은 COVID-19와 관련된 시토킨 폭풍을 약화시키는 데 독특하게(uniquely) 적절할 수 있다. 폐로 전달하고 전신 면역 억제를 피함으로써, 사망률을 악화시키는 추가 감염도 피할 수 있다. 이는 환기적 도움(ventilatory support)이 필요한 환자에게 특히 해당된다. COVID-19을 갖는 개체의 주요 사망 원인은 동반 질환 및 중복 감염인 것으로 나타나는바, 흡입되는 약물은 환자를 이러한 위험에 취약하게 하는 면역 억제를 피하는 방법일 수 있다.
따라서, 본 개시는 코로나바이러스, 예컨대 SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, 및 MERS-CoV 에 감염된 포유동물 (또는 환자) 또는 그의 증상을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)또는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물을 포유동물 (또는 환자)에게 투여하는 것을 포함한다. 본 개시는 또한 포유동물 (또는 환자)에서 코로나바이러스(예컨대 SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, 및 MERS-CoV) 감염에 의한 ALI 및/또는 ARDS를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I) 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물을 포유동물 (또는 환자)에게 투여하는 것을 포함한다.
JAK 억제제의 작용기전은 비강 염증성 질환의 치료와 관련이 있다 (Therapeutic Effects of Intranasal Tofacitinib on Chronic Rhinosinusitis with Nasal Polyps in Mice, Joo et al., The Laryngoscope, 2020, https://doi.org/10.1002/lary.29129). 또한 IL-4 및 IL-13 신호전달 경로를 차단함으로써 작용하는 두필루맙은 비용종을 동반하는 만성 비부비동염 치료를 위해 승인되었다.
따라서, 본원은 또한 포유동물 (예컨대 인간)에서 비강 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)또는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물을 포유동물 (또는 인간)에게 투여하는 방법을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 비강 염증성 질환은 비용종을 동반하거나 동반하지 않는 만성 비부비동염, 비용종, 비용종을 동반하는 부비강염, 및 비염 (비알레르기성, 알레르기성, 재발성 (perenial) 및 혈관운동성(vasomotor) 비염)으로 이루어지는 군에서 선택된다.
JAK 억제제로서, 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)은 또한 다양한 다른 질환에 유용할 수 있다. 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)은 이에 한정되는 것은 아니지만, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염 (직장구불창자염 (proctosigmoiditis), 전대장염 (pancolitis), 궤양성 직장염 (ulcerative proctitis) 및 좌측 대장염 (left-sided colitis)), 크론병, 콜라겐성 대장염, 림프구성 대장염, 베체트병 (Behcet's disease), 셀리악병 (celiac disease), 면역 관문 억제제 유발성 대장염, 돌창자염 (ileitis), 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis), 이식편대 숙주 질환-관련 대장염 및 감염성 대장염을 포함하는 다양한 염증성 위장 적응증에 유용할 수 있다. 궤양성 대장염 (Reimund et al., J. Clin. Immunology, 1996, 16, 144-150), 크론병 (disease (Woywodt et al., Eur. J. Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), 콜라겐성 대장염 (Kumawat et al., Mol. Immunology, 2013, 55, 355-364), lymphocytic colitis (Kumawat et al., 2013), 호산구성 식도염 (Weinbrand-Goichberg et al., Immunol. Res., 2013, 56, 249-260), 이식편대 숙주 질환-관련 대장염 (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 3268-3276), 감염성 대장염 (Stallmach et al., Int. J. Colorectal Dis., 2004, 19, 308-315), 베체트병 (Zhou et al., Autoimmun. Rev., 2012, 11, 699-704), 셀리악병 (de Nitto et al., World J. Gastroenterol., 2009, 15, 4609-4614), 면역 관문 억제제 유발성 대장염 (예컨대, CTLA-4 억제제 유발성 대장염; (Yano et al., J. Translation. Med., 2014, 12, 191), 및 돌창자염 (Yamamoto et al., Dig. Liver Dis., 2008, 40, 253-259) 은 특정 염증유발성 시토킨 수준의 증가를 특징으로 한다. 다수의 염증유발성 시토킨이 JAK 활성화를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 출원서에 개시된 화합물은 염증을 완화하고 증상의 경감을 제공할 수 있다. 특히, 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)은 궤양성 대장염의 차도 유도 및 유지, 및 크론병, 면역 관문 억제제 유발성 대장염 및 이식편대 숙주 질환에서의 위장 유해 효과 치료에 유용할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 본 개시는 포유동물 (예컨대 인간)에서 염증성 위장 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)또는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
아토피성 피부염 및 기타 염증성 피부 질환은 JAK-STAT 경로에 의존하는 염증유발성 시토킨의 증가와 관련이 있다. 따라서, 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)은 아토피성 피부염, 원형탈모증 (alopecia areata), 백반증 (vitiligo), 피부 T 세포 림프종 (cutaneous T cell lymphoma) (Netchiporouk et al., Cell Cycle 2014; 13, 3331-3335) 및 서브타입 (Sezary 증후군, 균상 식육종 (mycosis fungoides), 파제트병모양 그물증 (pagetoid reticulosis), 육아종성 이완 피부 (granulomatous slack skin), 림프종양 구진증 (lymphomatoid papulosis), 만성 태선양 비강진 (pityriasis lichenoides chronica), 급성 태선모양 잔비늘증 (pityriasis lichenoides et varioliformis acuta), CD30+ 피부 T-세포 림프종, 속발성 피부 CD30+ 거대세포 림프종, 비-균상 식육종 CD30- 피부 거대 T-세포 림프종, 다형성 T-세포 림프종 (pleomorphic T-cell lymphoma), Lennert 림프종, 피하 T-세포 림프종, 혈관중심성 림프종 (angiocentric lymphoma), 모구성 NK-세포 림프종 (blastic NK-cell lymphoma)), 결절성 양진 (prurigo nodularis), 편평태선 (lichen planus), 원발성 국소 피부 아밀로이드증 (primary localized cutaneous amyloidosis), 수포성 유사천포창 (bullous pemphigoid), 이식편대 숙주 질환의 피부 증상 (skin manifestations of graft versus host disease), 유사천포창 (pemphigoid), 원반모양 루푸스 (discoid lupus), 고리육아종 (granuloma annulare), 만성 단순 태선 (lichen simplex chronicus), 외음부/음낭/항문주위 소양증, 경화 태선 (lichen sclerosus), 대상포진후 신경통 가려움증 (post herpetic neuralgia itch), 모공 편평태선 (lichen planopilaris), 및 탈모모낭염 (foliculitis decalvans)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아닌 다수의 피부 염증성 또는 소양성 병태에서 유익할 수 있다. 특히, 아토피성 피부염 (Bao et al., JAK-STAT, 2013, 2, e24137), 원형탈모증 (Xing et al., Nat. Med. 2014, 20, 1043-1049), 백반증 (Craiglow et al, JAMA Dermatol. 2015, 151, 1110-1112), 결절성 양진 (Sonkoly et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2006, 117, 411-417), 편평태선 (Welz-Kubiak et al., J. Immunol. Res. 2015, ID:854747), 원발성 국소 피부 아밀로이드증 (Tanaka et al., Br. J. Dermatol. 2009, 161, 1217-1224), 수포성 유사천포창 (Feliciani et al., Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 1999, 12, 55-61), 및 이식편대 숙주 질환의 피부 증상 (Okiyama et al., J. Invest. Dermatol. 2014, 134, 992-1000)은 JAK 활성화를 통해 신호를 전달하는 특정 시토킨 증가를 특징으로 한다. 따라서, 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)은 이들 시토킨에 의해 유발된 관련된 피부 염증 또는 소양증을 완화시킬 수 있다. 구체적으로, 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)은 아토피성 피부염 및 기타 염증성 피부 질환 치료에 유용할 것으로 기대된다. 일 구체예에서, 따라서, 본 개시는 포유동물 (예컨대 인간)에서 염증성 피부 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적 담체를 포유동물의 피부에 적용하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 염증성 피부 질환은 아토피성 피부염이다.
많은 안 질환이 JAK-STAT 경로에 의존하는 염증유발성 시토킨의 증가와 관련이 있는 것으로 나타났다. 따라서, 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)은 포도막염 (uveitis), 당뇨 망막병증 (diabetic retinopathy), 당뇨 황반 부종 (diabetic macular edema), 안구 건조 질환 (dry eye disease), 연령-관련 황반 변성 (age-related macular degeneration) 및 아토피성 각막결막염 (atopic keratoconjunctivitis)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아닌 다수의 안 질환 치료에 유용할 수 있다. 구체적으로, (Horai and Caspi, J. Interferon Cytokine Res., 2011, 31, 733-744), 당뇨 망막병증 (Abcouwer, J. Clin. Cell. Immunol., 2013, Suppl 1, 1-12), 당뇨 황반 부종 (Sohn et al., American Journal of Ophthalmology, 2011, 152, 686-694), 안구 건조 질환 (Stevenson et al, Arch. Ophthalmol., 2012, 130, 90-100), 및 연령-관련 황반 변성 (Knickelbein et al, Int. Ophthalmol. Clin., 2015, 55(3), 63-78) 은 JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 특정 염증-유발상 시토킨 증가를 특징으로 한다. 망막 정맥 폐쇄 (RVO)는 매우 만연한 시각 장애 질환이다. 망막 혈류의 폐쇄는 망막 혈관구조 손상, 출혈 및 조직 허혈을 초래할 수 있다. RVO에 대한 원인이 다인자성임에도 불구하고, 혈관 및 염증 매개인자 모두가 중요한 것으로 밝혀졌다 (Deobhakta et al, International Journal of Inflammation, 2013, article ID 438412). IL-6 및 IL-13과 같은 JAK-STAT 경로를 통해 신호를 전달하는 시토킨뿐만 아니라 JAK-STAT 경로 신호전달에 의해 생성이 일부 유도되는 MCP-1과 같은 다른 시토킨이 RVO 환자의 안구 조직에서 증가된 수준으로 검출되었다 (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911). 따라서, 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)은 관련된 안구 염증을 완화하고 질환 진행을 역전시키거나 또는 이 질병의 증상 경감을 제공할 수 있다. 많은 RVO 환자는 광응고 (photocoagulation)에 의해 치료되지만, 이는 본질적으로 파괴적 요법 (destructive therapy)이다. 항-VEGF제가 또한 사용되지만, 이는 일부 환자에서만 유효하다. 눈에서 염증 수준을 감소시키는 스테로이드 약제 (트리암시놀론 아세토나이드(Triamcinolone acetonide) 및 덱사메타손 (dexamethasone) 이식물)가 또한 특정 RVO 형태의 환자에서 유익한 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 또한 백내장 및 안압 증가/녹내장을 유발하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)은 관련된 안구 염증을 완화하고 질환 진행을 역전시키거나 또는 증상 경감을 제공할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 본 개시는 포유동물에서 안 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포유동물의 안구에 투여하는 것을 포함한다. 상기 안구 질환은 포도막염, 당뇨 망막병증, 당뇨 황반 부종, 안구 건조 질환, 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄 또는 아토피성 각막결막염이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)을 유리체내 주사를 통해 투여하는 것을 포함한다. 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)은 또한 안 질환에 유용한 하나 이상의 화합물과 병용하여 사용될 수 있다.
화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)은 또한 다른 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암과 같은 다른 질환 치료에 유용할 수 있다. 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)은 하나 이상의 관절염, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 이식 거부반응, 안구건조증 (xerophthalmia), 건선 관절염, 당뇨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 운동 신경세포 질환, 골수형성이상 증후군, 통증, 근감소증 (sarcopenia), 악액질 (cachexia), 패혈성 쇼크 (septic shock), 전신 홍반 루푸스, 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 강직성 척추염, 골수섬유증, B-세포 림프종, 간세포 암종, 호지킨 질환 (Hodgkins disease), 유방암, 다발성 골수종, 흑색종, 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 비-소-세포 폐암, 난소 투명 세포 암종 (ovarian clear cell carcinoma), 난소 종양, 췌장 종양, 진성 적혈구증가증 (polycythemia vera), 쇼그렌 증후군 (Sjoegrens syndrome), 연조직 육종 (soft tissue sarcoma), 육종, 비종 (splenomegaly), T-세포 림프종 및 중증성 지중해빈혈 (thalassemia major) 치료에 유용할 수 있다.
병용 요법
본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)은 질환을 치료하기 위해 동일한 기전 또는 상이한 기전으로 작용하는 하나 이상의 활성제와 병용하여 사용될 수 있다. 상이한 활성제들이 개별의 조성물로 순차적으로 또는 동시에, 또는 동일한 조성물로 투여될 수 있다. 병용 요법에 유용한 활성제의 부류로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 베타 2 아드레날린수용체(adrenoceptor) 작용제, 무스카린 수용체 길항제, 글루코코르티코이드 작용제, G-단백질 커플링된 수용체-44 길항제, 류코트리엔 D4 길항제, 무스카린 M3 수용체 길항제, 히스타민 H1 수용체 길항제, 면역글로불린 E 길항제, PDE 4 억제제, IL-4 길항제, 무스카린 M1 수용체 길항제, 히스타민 수용체 길항제, IL-13 길항제, IL-5 길항제, 5-리폭시게나제(5-Lipoxygenase) 억제제, 베타 아드레날린수용체 작용제, CCR3 케모킨 길항제, CFTR 자극제, 면역글로불린 조절제, 인터루킨 33 리간드 억제제, PDE 3 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제 델타 억제제, 트롬복산 A2 길항제, 엘라스타제(elastase) 억제제, 키트 티로신 키나제 억제제, 류코트리엔 E4 길항제, 류코트리엔 길항제, PGD2 길항제, TNF 알파 리간드 억제제, TNF 결합제, 보체 캐스케이드 (complement cascade) 억제제, 에오탁신(eotaxin) 리간드 억제제, 글루타티온 환원효소 억제제, 히스타민 H4 수용체 길항제, IL-6 길항제, IL2 유전자 자극제, 면역글로불린 감마 Fc 수용체 IIB 조절제, 인터페론 감마 리간드, 인터루킨 13 리간드 억제제, 인터루킨 17 리간드 억제제, L-셀렉틴 길항제, 백혈구 엘라스타제 억제제, 류코트리엔 C4 길항제, 류코트리엔 C4 합성효소 억제제, 막 구리 아민 옥시다제 억제제, 메탈로프로테아제-12 억제제, 메탈로프로테아제-9 억제제, 진드기(mite) 알레르겐 조절제, 무스카린 수용체 조절제, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 작용제, 핵 인자 카파 B (nuclear factor kappa B) 억제제, p-셀렉틴 길항제, PDE 5 억제제, PDGF 수용체 길항제, 포스포이노시티드-3 키나제 감마 억제제, TLR-7 작용제, TNF 길항제, Abl 티로신 키나제 억제제, 아세틸콜린 수용체 길항제, 산성 포유동물 키티나제(acidic mammalian chitinase) 억제제, ACTH 수용체 작용제, 액틴 중합 조절제, 아데노신 A1 수용체 길항제, 아데닐레이트 고리화효소 자극제, 아드레날린수용체 길항제, 부신 피질 자극 호르몬(adrenocorticotrophic hormone) 리간드, 알코올 탈수소효소 5 억제제, 알파 1 항트립신 자극제, 알파 1 프로테이나제(proteinase) 억제제, 안드로겐 수용체 조절제, 안지오텐신 전환 효소 2 자극제, ANP 작용제, Bcr 단백질 억제제, 베타 1 아드레날린수용체 길항제, 베타 2 아드레날린수용체 길항제, 베타 2 아드레날린수용체 조절제, 베타 아밀로이드 조절제, BMP10 유전자 억제제, BMP15 유전자 억제제, 칼슘 채널 억제제, 카텝신 G 억제제, CCL26 유전자 억제제, CCR3 케모킨 조절제, CCR4 케모킨 길항제, 세포 부착 분자 억제제, 샤페로닌 자극제, 키티나제 억제제, 콜라겐 I 길항제, 보체 C3 억제제, CSF-1 길항제, CXCR2 케모킨 길항제, 시토킨 수용체 공통 베타 체인(cytokine receptor common beta chain) 조절제, 세포독성 T-림프구 단백질-4 자극제, 디옥시리보뉴클레아제 I 자극제, 디옥시리보뉴클레아제 자극제, 디펩티딜 펩티다제I 억제제, DNA 자이라제(gyrase) 억제제, DP 프로스타노이드 수용체 조절제, E-셀렉틴 길항제, EGFR 패밀리 티로신 키나제 수용체 억제제, 엘라스틴 조절제, 엔도텔린 ET-A 길항제, 엔도텔린 ET-B 길항제, 에폭사이드 가수분해효소 억제제, FGF3 수용체 길항제, Fyn 티로신 키나제 억제제, GATA 3 전사인자 억제제, 글루코실세라미다제(Glucosylceramidase) 조절제, 글루타메이트 수용체 조절제, GM-CSF 리간드 억제제, 구아닐레이트 고리화효소 자극제, H+ K+ ATPase 억제제, 헤모글로빈 조절제, 헤파린 작용제, 히스톤 디아세틸라제 억제제, 히스톤 디아세틸라제-2 자극제, HMG CoA 환원효소 억제제, I-카파 B 키나제 베타 억제제, ICAM1 유전자 억제제, IL-17 길항제, IL-17 수용체 조절제, IL-23 길항제, IL-4 수용체 조절제, 면역글로불린 G 조절제, 면역글로불린 G1 작용제, 면역글로불린 G1 조절제, 면역글로불린 엡실론 Fc 수용체 IA 길항제, 면역글로불린 감마 Fc 수용체 IIB 길항제, 면역글로불린 카파 조절제, 인슐린 감작제(Insulin sensitizer), 인터페론 베타 리간드, 인터루킨 1 유사 수용체 길항제, 인터루킨 18 리간드 억제제, 인터루킨 수용체 17A 길항제, 인터루킨-1 베타 리간드 억제제, 인터루킨-5 리간드 억제제, 인터루킨-6 리간드 억제제, KCNA 전압-게이트 포타슘 채널-3 억제제, 키트 리간드 억제제, 라미닌-5 작용제, 류코트리엔 CysLT1 수용체 길항제, 류코트리엔 CysLT2 수용체 길항제, LOXL2 유전자 억제제, Lyn 티로신 키나제 억제제, MARCKS 단백질 억제제, MDR 관련 단백질 4 억제제, 메탈로프로테아제-2 조절제, 메탈로프로테아제-9 조절제, 무기질코르티코이드 수용체 길항제, 무스카린 M2 수용체 길항제, 무스카린 M4 수용체 길항제, 무스카린 M5 수용체 길항제, 나트륨이뇨(Natriuretic) 펩티드 수용체 A 작용제, 자연 살해 세포(Natural killer cell) 수용체 조절제, 니코틴성 ACh 수용체 알파 7 서브유닛 자극제, NK 세포 수용체 조절제, 핵 인자 카파 B 조절제, 오피오이드(opioid) 성장인자 수용체 작용제, P-당단백질 억제제, P2X3 퓨린성수용체(purinoceptor) 길항제, p38 MAP 키나제 억제제, 펩티다제 1 조절제, 포스포리파아제 A2 억제제, 포스포리파아제 C 억제제, 플라스미노겐 활성인자(plasminogen activator) 억제제 1 억제제, 혈소판 활성 인자(platelet activating factor) 수용체 길항제, PPAR 감마 작용제, 프로스타시클린(prostacyclin) 작용제, 단백질 티로신 키나제 억제제, SH2 영역 이노시톨 포스파타제 1 자극제, 신호 전달 억제제, 소듐 채널 억제제, STAT-3 조절제, 줄기 세포 항원-1 억제제, 슈퍼옥시드 디스무타제(superoxide dismutase) 조절제, T-세포 표면 당단백질 CD28 억제제, T-세포 표면 당단백질 CD8 억제제, TGF 베타 작용제, TGF 베타 길항제, 트롬복산 합성효소 억제제, 흉선 기질상 림프단백질(thymic stromal lymphoprotein) 리간드 억제제, 티모신 작용제, 티모신 베타 4 리간드, TLR-8 작용제, TLR-9 작용제, TLR9 유전자 자극제, 토포아이소머라제(Topoisomerase) IV 억제제, 트로포닌 I 빠른 골격근 자극제, 트로포닌 T 빠른 골격근 자극제, 타입 I IL-1 수용체 길항제, 타입 II TNF 수용체 조절제, 이온 채널 조절제, 유테로글로빈 (uteroglobin) 자극제, 및 VIP 작용제를 포함한다.
본 발명의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)과 병용하여 사용될 수 있는 특정 활성제는 이에 한정되는 것은 아니지만, 로십토 아세테이트 (rosiptor acetate), 우메클리디늄 브로마이드(umeclidinium bromide), 세쿠키누맙 (secukinumab), 메텐케팔린 아세테이트(metenkefalin acetate), 트리데카타이드 아세테이트(tridecactide acetate), 플루티카손 프로피오네이트 (fluticasone propionate), 알파-시클로덱스트린-안정화 술포라판(alpha-cyclodextrin-stabilized sulforaphane), 테제펠루맙 (tezepelumab), 모메타손 푸로에이트 (mometasone furoate), BI-1467335, 두필루맙 (dupilumab), 아클리디늄(aclidinium), 포모테롤(formoterol), AZD-1419, HI-1640V, 리비판셀(rivipansel), CMP-001, 만니톨, ANB-020, 오말리주맙 (omalizumab), 트레갈리주맙 (tregalizumab), 미티작스 (Mitizax), 벤랄라주맙 (benralizumab), 골리무맙 (golimumab), 로플루밀라스트 (roflumilast), 이마티닙 (imatinib), REGN-3500, 마시티닙 (masitinib), 아프레밀라스트 (apremilast), RPL-554, 악팀문 (Actimmune), 아달리무맙 (adalimumab), 루파타딘 (rupatadine), 파로그렐릴 (parogrelil), MK-1029, 베클로메타손 디프로피오네이트 (beclometasone dipropionate), 포르모테롤 푸마레이트 (formoterol fumarate), 모가물리주맙 (mogamulizumab), 세라트로다스트 (seratrodast), UCB-4144, 네미랄리십 (nemiralisib), CK-2127107, 페비피프란트 (fevipiprant), 다니릭신 (danirixin), 보센탄 (bosentan), 아바타셉트 (abatacept), EC-18, 두벨리십 (duvelisib), 도시파르스타트 (dociparstat), 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 살부타몰 HFA (salbutamol HFA), 에르도스테인 (erdosteine), PrEP-001, 네도크로밀 (nedocromil), CDX-0158, 살부타몰 (salbutamol), 에노보사름 (enobosarm), R-TPR-022, 렌질루맙 (lenzilumab), 플루티카손 푸로에이트 (fluticasone furoate), 빌란테롤 트리페나테이트 (vilanterol trifenatate), 플루티카손 프로피오네이트 (fluticasone propionate), 살메테롤 (salmeterol), PT-007, PRS-060, 레메스템셀 (remestemcel)-L, 시트룰린 (citrulline), RPC-4046, 니트릭 옥시드 (nitric oxide), DS-102, 게릴림주맙 (gerilimzumab), 악테르 (Actair), 플루티카손 푸로에이트 (fluticasone furoate), 우메클리디늄 (umeclidinium), 빌란테롤 (vilanterol), AG-NPP709, 가무넥스 (Gamunex), 인플릭시맙 (infliximab), 암피온 (Ampion), 아큐마피모드 (acumapimod), 카나키누맙 (canakinumab), INS-1007, CYP-001, 시루쿠맙 (sirukumab), 플루티카손 프로피오네이트, 메폴리주맙 (mepolizumab), 피타바스타틴 (pitavastatin), 솔리트로마이신 (solithromycin), 에타네르셉트 (etanercept), 이바카프토 (ivacaftor), 아나킨라 (anakinra), MPC-300-IV, 글리코피로늄 브로마이드 (glycopyrronium bromide), 아클리디늄 브로마이드 (aclidinium bromide), FP-025, 리산키주맙 (risankizumab), 글리코피로늄 (glycopyrronium), 포르모테롤 푸마레이트 (formoterol fumarate), 아디포셀 (Adipocell), YPL-001, 티오트로피움 브로마이드 (tiotropium bromide), 글리코피로늄 브로마이드 (glycopyrronium bromide), 인다카테롤 말레에이트 (indacaterol maleate), 안데칼릭시맙 (andecaliximab), 올로다테롤 (olodaterol), 에소메프라졸 (esomeprazole), 집먼지 진드기 백신 (dust mite vaccine), 머그워트 폴렌 알레르겐 백신 (mugwort pollen allergen vaccine), 바모롤론 (vamorolone), 게파픽산트 (gefapixant), 레베페나신 (revefenacin), 게피티닙 (gefitinib), 레조인 (ReJoin), 티펠루카스트 (tipelukast), 베도라드린 (bedoradrine), SCM-CGH, SHP-652, RNS-60, 브로달루맙 (brodalumab), BIO-11006, 우메클리디늄 브로마이드 , 빌란테롤 트리페나테이트 (vilanterol trifenatate), 이프라트로피움 브로마이드 (ipratropium bromide), 트랄로키누맙 (tralokinumab), PUR-1800, VX-561, VX-371, 올로파타딘 (olopatadine), 툴로부테롤 (tulobuterol), 포르모테롤 푸마레이트 (formoterol fumarate), 트리암시놀론 아세토니드 (triamcinolone acetonide), 레슬리주맙 (reslizumab), 살메테롤 크시나포에이트 (salmeterol xinafoate), 플루티카손 프로피오네이트 (fluticasone propionate), 베클로메타손 디프로피오네이트, 포르모테롤 푸마레이트, 티오트로피움 브로마이드, 리겔리주맙, RUTI, 베르틸리무맙, 오말리주맙, 글리코피로늄 브로마이드, SENS-111, 베클로메타손 디프로피오네이트, CHF-5992, LT-4001, 인다카테롤 (indacaterol), 글리코피로늄 브로마이드, 모메타손 푸로에이트, 펙소페나딘 (fexofenadine), 글리코피로늄 브로마이드, 아지트로마이신, AZD-7594, 포르모테롤, CHF-6001, 바테펜테롤, OATD-01, 올로다테롤, CJM-112, 로시글리타존 (rosiglitazone), 살메테롤 (salmeterol), 세티피프란트 (setipiprant), 흡입된 인터페론 베타, AZD-8871, 플레카나티드 (plecanatide), 플루티카손, 살메테롤, 에이코사펜타에노산 모노글리세리드, 레브리키주맙 (lebrikizumab), RG-6149, QBKPN, 모메타손, 인다카테롤 (indacaterol), AZD-9898, 소듐 피루베이트, 질루톤 (zileuton), CG-201, 이미다페나신 (imidafenacin), CNTO-6785, CLBS-03, 모메타손, RGN-137, 프로카테롤 (procaterol), 포르모테롤, CCI-15106, POL-6014, 인다카테롤 (indacaterol), 베클로메타손, MV-130, GC-1112, 알레르고바크 데포트 (Allergovac depot), MEDI-3506, QBW-251, ZPL-389, 우데나필 (udenafil), GSK-3772847, 레보세티리진 (levocetirizine), AXP-1275, ADC-3680, 티마피프란트 (timapiprant), 아베디테롤 (abediterol), AZD-7594, 이프라트로피움 브로마이드 (ipratropium bromide), 살부타몰 술페이트 (salbutamol sulfate), 타데키니그 알파 (tadekinig alfa), ACT-774312, 도르나제 알파 (dornase alfa), 일로프로스트 (iloprost), 바테펜테롤, 플루티카손 푸로에이트, 알리카포르센 (alicaforsen), 시클레소니드 (ciclesonide), 에메라미드 (emeramide), 아르포르모테롤 (arformoterol), SB-010, 오자그렐 (Ozagrel), BTT-1023, 데크트레쿠맙 (Dectrekumab), 레발부테롤 (levalbuterol), 프란루카스트 (pranlukast), 히알루론산, GSK-2292767, 포르모테롤, NOV-14, 루시나크탄트, 살부타몰, 프레드니솔론, 에바스틴, 덱사메타손 시페실레이트, GSK-2586881, BI-443651, GSK-2256294, VR-179, VR-096, hdm-ASIT+, 부데소니드, GSK-2245035, VTX-1463, 에메다스틴 (Emedastine), 덱스프라미펙솔 (dexpramipexole), 레발부테롤 (levalbuterol), N-6022, 덱사메타손 소듐 포스페이트, PIN-201104, OPK-0018, TEV-48107, 수플라타스트 (suplatast), BI-1060469, 게밀루카스트 (Gemilukast), 인터페론 감마, 달라자티드 (dalazatide), 빌라스틴 (bilastine), 플루티카손 프로피오네이트, 살메테롤 크시나포에이트, RP-3128, 벤시클로퀴디움 브로마이드 (bencycloquidium bromide), 레슬리주맙 (reslizumab), PBF-680, CRTH2 길항제, 프란루카스트 (Pranlukast), 살메테롤 크시나포에이트, 플루티카손 프로피오네이트, 티오트로피움 브로마이드 모노히드레이트, 마실루카스트 (masilukast), RG-7990, 독소필린 (Doxofylline), 아베디테롤 (abediterol), 글리코피로늄 브로마이드 (glycopyrronium bromide), TEV-46017, ASM-024, 플루티카손 프로피오네이트, 글리코피로늄 브로마이드, 살메테롤 크시나포에이트, 살부타몰, TA-270, 플루니솔리드 (Flunisolide), 소듐 크로모글리케이트 (sodium chromoglycate), Epsi-gam, ZPL-521, 살부타몰, 아빕타딜 (aviptadil), TRN-157, 자피르루카스트 (Zafirlukast), 스템포셀 (Stempeucel), 페미롤라스트 소듐 (pemirolast sodium), 나돌롤 (Nadolol), 플루티카손 프로피오네이트 + 살메테롤 크시나포에이트, RV-1729, 살부타몰 술페이트, 카본 디옥시드 + 퍼플루오로옥틸 브로마이드, APL-1, 데크트레쿠맙 (dectrekumab) + VAK-694, 리신 아세틸살리실레이트, 질루톤, TR-4, 인간 알로겐 아디포스-유래 간엽 전구 세포 요법 (human allogenic adipose-derived mesenchymal progenitor cell therapy), MEDI-9314, PL-3994, HMP-301, TD-5471, NKTT-120, 페미롤라스트 (pemirolast), 베클로메타손 디프로피오네이트, 트란틴테롤 (trantinterol), 모노소듐 알파 루미놀, IMD-1041, AM-211, TBS-5, ARRY-502, 세라트로다스트 (seratrodast), 레콤비난트 미디스마제 (recombinant midismase), ASM-8, 데플라자코르트 (deflazacort), 밤부테롤 (bambuterol), RBx-10017609, 이프라트로피움 (ipratropium) + 페노테롤 (fenoterol), 플루티카손 + 포르모테롤, 에피나스틴 (epinastine), WIN-901X, VALERGEN-DS, 올리고G-COPD-5/20, 툴로부테롤 (tulobuterol), 옥시스 투르부할러 (oxis Turbuhaler), DSP-3025, ASM-024, 미졸라스틴 (mizolastine), 부데소니드 (budesonide) + 살메테롤, LH-011, AXP-E, 히스타민 인간 면역글로불린, YHD-001, 테오필린 (theophylline), 암브록솔 (ambroxol) + 에르도스테인 (erdosteine), 라마트로반 (ramatroban), 몬텔루카스트 (montelukast), 프란루카스트 (pranlukast), AG-1321001, 툴로부테롤 (tulobuterol), 이프라트로피움 (ipratropium) + 살부타몰, 트라닐라스트 (tranilast), 메틸프레드니솔론 술렙타네이트 (methylprednisolone suleptanate), 콜포르신 다로페이트 (colforsin daropate), 레피리나스트 (repirinast) 및 독소필린 (doxofylline)을 포함한다.
본원은 또한 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)및 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 치료제는 상기 명시된 활성제의 부류 및 상기 명시된 특정 활성제의 목록으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 폐 전달에 적절하다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 흡입 또는 네뷸라이저 투여에 적절하다. 일부 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 건조 분말, 또는 액상 현탁제(liquid suspension)이다.
또한, 일 방법 구체예에서, 본 개시는 포유동물에 본 개시의 화합물 1의 결정성 수화물 (결정형 I)및 하나 이상의 다른 치료제를 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
병용 요법으로 사용하는 경우, 상기 활성제는 단일 약학적 조성물로 제제화될 수 있거나, 또는 상기 활성제는 동시에 또는 개별 시점에서, 동일한 또는 상이한 투여 경로로 투여되는 개별 조성물로 제공될 수 있다. 이러한 조성물은 개별로 포장될 수 있거나 또는 키트로서 함께 포장될 수 있다. 상기 키트 내에 2개 이상의 치료제를 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 투여할 수 있다.
실시예
하기 합성 및 생물학적 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며, 어느 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 하기 실시예에서, 다음의 약어들은 달리 지시하지 않는 한 하기 의미를 갖는다. 하기에 정의되지 않은 약어는 이들의 일반적으로 허용되는 의미를 갖는다.
ACN = 아세토니트릴
calcd = 계산된
DCM = 디클로로메탄
DIPEA = N,N-디이소프로필에틸아민
DMF = N,N-디메틸포름아미드
EtOAc = 에틸 아세테이트
h = 시간 (hour(s))
HATU = N,N,N',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄
헥사플루오로포스페이트
IPA = 이소프로필 알코올
IPAc = 이소프로필아세테이트
KOAc = 포타슘 아세테이트
MeOH = 메탄올
min = 분
PdCl2 (dppf) = 디클로로(1,1'-비스(디페닐포스피노)-페로센)디팔라듐(II
Pd(PPh3)4 = 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)
RT = 실온
TEA = 트리에틸아민
TFA = 트리플루오로아세트산
THF = 테트라히드로푸란
비스(피나콜레이토)디보론 = 4,4,5,5,4',4',5',5'-옥타메틸-
[2,2']비[[1,3,2]디옥사보롤란일]
시약 및 용매는 상업적 공급처 (Aldrich, Fluka, Sigma 등)로부터 구입하고, 추가의 정제 없이 사용하였다. 반응 혼합물의 진행은 박막 크로마토그래피 (thin layer chromatography: TLC), 분석용 고성능 액체 크로마토그래피 (analytical high performance liquid chromatography: anal. HPLC) 및 질량 분광 분석계로 모니터하였다. 반응 혼합물은 각 반응에서 구체적으로 기재된 바와 같이 워크업되었다; 보통 상기 반응 혼합물은 추출 및 다른 정제 방법, 예컨대 온도- 및 용매-의존성 결정화, 및 침전에 의해 정제되었다. 추가로, 반응 혼합물은, 전형적으로 C18 또는 BDS 컬럼 팩킹 (column packings) 및 기존의 용출액을 이용하여, 컬럼 크로마토그래피 또는 분취용 HPLC (preparative HPLC)에 의해 통상적으로 정제되었다. 전형적인 분취용 HPLC 조건은 하기에 기재되어 있다.
반응 생성물의 특성 규명은 통상적으로 질량 및 1H-NMR 분광법에 의해 수행되었다. NMR 분석을 위해, 시료를 중수소화 용매 (예컨대 CD3OD, CDCl3 또는 d6-DMSO)에 용해시키고, 1H-NMR 스펙트럼은 표준 관찰 조건하에 Varian Gemini 2000기기 (400 MHz)로 수득하였다. 화합물의 질량 분광분석적 확인은, 자동정제 시스템 (autopurification systems)과 결합된, Applied Biosystems (Foster City, CA) 모델 API 150 EX 기기 또는 Waters (Milford, MA) 3100 기기로 전기분무 이온화 방법 (electrospray ionization method: ESMS)에 의해 수행되었다.
분취용 HPLC 조건
컬럼: C18, 5 μm 21.2 x 150 mm 또는 C18, 5 μm 21 x 250
또는 C14, 5 μm 21 x 150 mm
컬럼 온도: 실온
유속: 20.0 mL/min
이동상: A = 물 + 0.05 % TFA
　 B = ACN + 0.05 % TFA,
주입 부피: (100-1500 μL)
검출기 파장: 214 nm
조 화합물(crude compounds)을 1:1의 물:아세트산 중에 약 50 mg/mL로 용해시켰다. 4분 분석용 스케일 테스트 실행 (analytical scale test run)을 2.1 x 50 mm C18 컬럼을 사용하여 수행하고, 그 다음에 15 또는 20분 분취용 스케일 실행 (preparative scale run)은 분석용 스케일 테스트 실행의 % B 보유 (retention)에 기반한 구배로 100μL 주입을 사용하여 수행하였다. 정확한 구배는 시료 의존성이었다. 근접한 실행 불순물을 갖는 시료는 최선의 분리를 위해 21 x 250 mm C18 컬럼 및/또는 21 x 150 mm C14 컬럼으로 확인하였다. 목적 생성물을 포함하는 분획물은 질량 분광 분석으로 동정하였다.
분석용 HPLC 조건
방법 A
컬럼: Agilent Zorbax Bonus-RP C18, 150 x 4.60 nm, 3.5　마이크론
컬럼 온도: 40℃
유속: 1.5 mL/분
주입 부피: 5 μL
시료 제조: 1:1의 ACN:1 M HCl 중에 용해
이동상: A = 물:TFA (99.95:0.05)
B = ACN:TFA (99.95:0.05)
검출기 파장: 254 nm 및 214 nm
구배: 26분 전체 (시간 (분)/ % B): 0/5, 18/90, 22/90,
22.5/90, 26/5
방법 B
컬럼: Agilent Poroshell 120 Bonus-RP, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm
컬럼 온도: 30℃
유속: 1.5 mL/분
주입 부피: 10 μL
이동상: A = ACN:물:TFA (2:98:0.1)
B = ACN:물:TFA (90:10:0.1)
시료 제조: 이동상 B 중에 용해
검출기 파장: 254 nm 및 214 nm
구배: 60분 전체 (시간 (분)/ % B): 0/0, 50/100, 55/100,
55.1/0, 60/0
방법 C
컬럼: Agilent Poroshell 120 Bonus-RP, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm
컬럼 온도: 30℃
유속: 1.5 mL/분
주입 부피: 10 μL
이동상: A = ACN:물:TFA (2:98:0.1)
B = ACN:물:TFA (90:10:0.1)
시료 제조: 이동상 B (0.15 mL) 중에 용해시키고, 이후 이동상 A (0.85 mL) 로 희석시킴
검출기 파장: 245 nm
구배: 46분 전체 (시간 (분)/ % B): 0/0, 25/50,
35/100,40/100, 40.1/0, 46/0
제조예 1: (4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)트리플루오로-λ 4 -보란, 칼륨염 I-5
Figure pct00006
(a) 1-(벤질옥시)-3-에틸벤젠 (I-2)
ACN (250 mL, 10 vol) 중 3-에틸페놀 (I-1) (25.0 g, 204.0 mmol)의 교반된 용액에 탄산칼륨 (42.0 g, 306 mmol)을 실온에서 부가하였다. 생성된 반응 물질을 실온에서 15분 동안 교반한 다음에, 벤질 브로마이드 (24.0 mL, 204 mmol) 를 적가 방식으로 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 생성된 반응 물질을 물 (1.0 L)에 부은 다음에, 화합물을 EtOAc (2 x 2L)로 추출하였다. 합한 유기물을 냉수, 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켰다. 이후 조 생성물을 헥산 중 2% EtOAc 용리제를 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 (I-2)을 연황색 유성 화합물 (35.0 g, 81%)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, chloroform-d) δ 7.46-7.44 (m, 2H), 7.39 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.34-7.31 (m, 1H), 7.21 (t, J = 7.6 Hz), 6.86-6.80 (m, 3H), 5.07 (s, 2H), 2.64 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.24 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
(b) 4-(벤질옥시)-1-브로모-2-에틸벤젠 (I-3)
ACN (525 mL, 15 vol) 중 1-(벤질옥시)-3-에틸벤젠 (I-2) (35.0 g, 164 mmol)의 빙냉한 교반된 용액에 N-브로모숙신이미드 (32.0 g 181 mmol)를 15분에 걸쳐 조금씩 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 생성된 반응 물질을 빙냉수 (1.50 L)에 부은 다음에, 화합물을 EtOAc (2 x 1L)로 추출하였다. 합한 유기물을 물로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켜서 조 생성물을 수득하였다. n-헥산 (250 mL)을 조 물질에 부가하여, 슬러리를 생성한 다음에, 소결 깔때기를 통해 여과하였다. 모액을 감압하에 증발시켜서 목적 생성물 I-3을 연황색 유성 화합물 (42.0 g, 87%)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, chloroform-d) δ 7.52-7.29 (m, 7H), 6.88 (s, 1H), 6.68 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 2.69 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.20 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(c) 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (I-4)
디옥산 (440 mL) 중 4-(벤질옥시)-1-브로모-2-에틸벤젠 (I-3) (42.0 g, 144 mmol), 비스(피나콜레이토) 디보론 (44.0 g, 173 mmol) 및 아세트산 칼륨 (28 g, 288 mmol)의 교반된 용액을 15분 동안 N2 (g)를 퍼징하여 탈기시킨 다음에, PdCl2(dppf) DCM 복합체 (11.0 g, 15 mmol)를 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 다음 16시간 동안 80℃까지 가열하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 상기 반응 물질을 셀라이트 층 (celite bed)을 통해 여과하고, 모액을 감압하에 증발시켜서 조 생성물을 수득하였다. 조 잔류물을 헥산 중 1% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 (I-4)을 연황색 유성 화합물 (32.0 g, 66%)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, chloroform-d) δ 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.45-7.36 (m, 5H), 6.84-6.78 (m, 2H), 5.08 (s, 2H), 2.91 (q, J = 7.6 Hz), 1.33 (s, 12H), 1.19 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
(d) (4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)트리플루오로-λ4-보란, 칼륨염 (I-5)
아세톤:메탄올 (200 mL, 1:1 비율, 10 vol) 중 화합물 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (I-4) (20 g, 59.0 mmol)의 교반된 용액에 불화수소 칼륨(potassium hydrogen fluoride)의 3M 용액 (23.0 g, 295 mmol, 98.0 mL의 물에 용해됨)을 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 수득된 반응 물질을 감압하에 증발시켰다. 이와 같이 수득된 고체를 물 (100 mL)에 용해시키고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 생성된 반응 물질을 소결 깔때기를 통해 여과하고, n-헥산으로 세척하고, 감압하에 건조하여 목적 생성물 (I-5)을 백색 고체(14.0 g, 74%)로 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, chloroform-d) δ 7.43 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.37 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.30 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.0 Hz), 6.58 (s, 1H), 6.53 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 2.65 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.07 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
제조예 2: 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-11)
Figure pct00007
(a) (S)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, 염산염 (I-7)
물 (40 L, 8 vol.) 중 L-히스티딘 (I-6) (5.0 kg, 32.14 mol)의 빙냉한 교반된 현탁제에 진한 염산 (3.93 L, 33.75 mol)을 부가한 다음에, 포름알데히드 (5.50 L, 67.5 mol, 37% 수용액)를 적가 방식으로 부가하였다. 생성된 용액을 동일한 온도에서 30분 동안 교반한 다음에, 80℃에서 8시간 동안 가열하였다. LCMS로 반응 진행을 모니터링하였다. 물을 감압하에 제거하여 조 생성물을 수득하고, 생성된 조 생성물을 톨루엔 (20 L)에서 2시간 동안 교반하였다. 유기물을 감압 하에 제거하여 과량의 물을 제거하고, 화합물을 공비적으로 (azeotropically) 건조시켰다. 이후 생성된 물질을 디에틸 에테르 (20 L)에 넣고, 2시간 동안 교반하였다. 그 다음에 고체 물질을 여과하고, 공기 건조하여 목적 생성물 (I-7)을 회백색 고체 (6.50 Kg, 85%)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 8.69 (s, 1H), 4.56 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.20 (dd, J = 5.5, 5.2 Hz, 1H), 3.42 (dd, J = 5.0, 17.0 Hz, 1H), 3.11 (dd, J = 10.2, 16.8 Hz, 1H).
(b) (S)-3,5-비스(tert-부톡시카보닐)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (I-8)
1,4-디옥산 (48 L, 8 vol) 및 물 (48 L, 8 vol) 중 (S)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 2-염산염 (I-7) (6.10 Kg, 25.40 mmol)의 빙냉한 교반된 용액에 트리에틸아민 (12.36 L, 89 mol)을 적가한 다음에, 디-tert-부틸 디카보네이트 (18.07 L, 78.74 mol, 5L의 1,4-디옥산에 용해됨)를 30분에 걸쳐서 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 다음 16시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC & LCMS 모니터링), 황색 반응 혼합물을 물 (10L)로 희석하고, 디에틸 에테르 (2 x 10 L) 및 EtOAc (2 x 7.50 L)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상(organic phase)을 버렸다. 수성 층을 냉각시키고, 6N HCl 용액을 사용하여 pH ~ 3이 되도록 하였다; 수성 상을 EtOAc (3 x 10 L)로 추출하였다. 합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 감압하에 농축하였다. 유성 잔류물을 30% EtOAc:헥산으로부터 결정화하여 목적 생성물 (I-8)을 회백색 고체 (5.1 Kg, 55%)로 수득하였다. C17H25N3O6에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 368.18 실측치 368.21.
(c) 6-벤질 3,5-디-tert-부틸 (S)-6,7-디히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-3,5,6(4H)-트리카복실레이트 (I-9)
DCM (51 L, 10 vol) 중 (S)-3,5-비스(tert-부톡시카보닐)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (I-8) (5.1Kg, 13.88mol)의 빙냉한 용액에 포화된 수성 중탄산나트륨 (41.0 L, 8 vol), 테트라-부틸 암모늄 요오다이드 (5.13 Kg, 13.88 mol) 및 벤질 브로마이드 (2.47 L, 20.82 mol)를 순차적으로 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 다음 16시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC & LCMS 모니터링), 2상 용액은 분리되었다. 수성층을 DCM (3 x 10 L)으로 추출하였다. 합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이는 헥산 중 40% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M)을 통해 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 (I-9)을 점성 오일 (4.50 Kg, 72%)로서 수득하였다. C24H31N3O6에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 458.22, 실측치 458.60.
(d) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-10)
IPA (45 L, 10 vol) 중 6-벤질 3,5-디-tert-부틸 (S)-6,7-디히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-3,5,6(4H)-트리카복실레이트 (I-9) (4.50 Kg, 9.84 mol)의 빙냉한 용액에 수산화암모늄 (36 L, 8 vol)을 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 다음 16시간 동안 추가로 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC & LCMS 모니터링), 생성된 혼합물을 물 (25 L)로 희석한 다음에 EtOAc (3 x 20L)로 추출하였다. 합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이를 DCM 중 2% MeOH 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M)을 통한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 (I-10)을 진한 점성 오일 (2.70 Kg, 77%)로서 수득하였다. C19H23N3O4에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 358.17, 실측치 358.33.
(e) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-11)
DCM (32.4 L, 12 vol) 중 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-10) (2.70 kg, 7.55 mol)의 빙냉한 용액에 수성 1N 수산화나트륨 (24.3 L, 9 vol)을 부가한 다음에 테트라-부틸 암모늄 요오다이드 (2.80 Kg, 7.55 mol) 및 벤질 브로마이드 (0.99 L, 8.31 mol)를 순차적으로 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 다음 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC & LCMS 모니터링), 2상 용액은 분리되었다. 수성 층을 DCM (3 x 10 L)으로 추출하였다. 합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이를 헥산 중 40% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 (I-11)을 점성 오일 (1.70 Kg, 63%)로 수득하였다. C26H29N3O4에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 448.22 실측치 448.20.
제조예 3: 6-벤질 5-( tert -부틸) (S)-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-16)
Figure pct00008
(a) 4-브로모-2-플루오로벤조일 클로라이드 (I-13)
DCM (12.5 L, 15 vol) 중 4-브로모-2-플루오로벤조산 (I-12) (1.25 Kg, 5.71 mol)의 빙냉한 교반된 용액에 옥살릴 클로라이드 (0.98 L, 11.42 mol)를 적가 방식으로 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 동일한 온도에서 10분 동안 교반하였다. 이후 DMF (150 mL)를 상기 반응 혼합물에 적가 방식으로 부가하였다. 생성된 반응 물질을 실온으로 가온하고 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링에 의해), 과량의 옥살릴 클로라이드를 질소 대기하에 감압하에 제거하여 조 생성물 (I-13) (1.08 Kg, 80%)을 수득하였고, 이를 다음 단계에서 추가 정제 없이 사용하였다.
(b) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(4-브로모-2-플루오로벤조일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-14)
ACN (13.6 L, 8 vol) 중 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-11) (1.70 Kg, 3.80 mol)의 교반된 용액에 트리에틸아민 (2.11 L, 15.2 mol)을 부가한 다음에, 4-브로모-2-플루오로벤조일 클로라이드 (I-13) (1.08 Kg, 3.4 L ACN 중에 4.56 mol, 2 vol)를 실온에서 부가하였다. 부가 완료 후에, 생성된 반응 혼합물의 색상이 연황색에서 갈색으로 변했다. 생성된 반응 혼합물을 동일한 온도에서 30분 동안 교반하고, 반응 진행을 TLC로 모니터링하였다. 생성된 반응 혼합물을 빙냉수 (10L)로 퀀칭한 다음에, EtOAc (3 x 5 L)로 추출하고, 합한 유기물들을 브라인 용액으로 세척하였다. 유기물들을 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여 조 생성물을 수득하였고, 이를 헥산 중 20% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 (I-14) (1.74 Kg, 71%)을 수득하였다. C33H31BrFN3O5에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 648.14, 실측치 648.20.
(c) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(6-브로모-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-15)
THF (26.0 L, 15 vol) 중 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(4-브
로모-2-플루오로벤조일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-14) (1.74 Kg, 2.68 mol)의 교반된 용액에 히드라진 수화물 (0.705 L, 13.4 mol)을 실온에서 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 가열하였다. 반응 완료 후에 (TLC 모니터링), 생성된 반응 물질을 빙냉수 (10 L)에 부은 다음에 화합물을 EtOAc (3 x 10L)로 추출하였다. 합한 유기물들을 브라인으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켜 조 생성물을 수득하였고, 이를 헥산 중 20% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 (I-15)을 회백색 고체 (1.12 Kg, 65%)로 수득하였다. C33H32BrN5O4 에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 642.16, 실측치 642.21.
(d) 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-16)
비스(피나콜레이토)디보론 (250 g, 984 mmol)을 프로판-2-올 (1882mL, 2.46E+04 mmol)과 함께, 불소 화학 (fluoride chemistry)을 사용하여 사전에 에칭된 (previously etched) 5L의 가지 3개 달린 단일벽 플라스크에 충전하고, 상기 혼합물을 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 용해는 흡열성이었다 (-4℃). 불소 화학을 사용하여 사전에 에칭된 4L의 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask)에서, 불화칼륨 불화수소염(potassium fluoride hydrofluoride)(538 g, 6891 mmol)을 물 (2.306 L, 1.28E+05 mmol)에 용해시켜서 3M 용액을 형성하였다. 용해는 흡열성이었다 (-12℃). 그 다음에 상기 용액을 여과하여 상기 불화칼륨 불화수소염으로부터 소량의 불용성 물질을 제거하였다. 용액들 모두가 완전히 용해되면, 상기 삼각 플라스크의 내용물을 단일벽 플라스크에 15분에 걸쳐 조금씩 충전하였다. 중간 정도의 발열이 관찰되었다 (+10℃). 상기 용액은 부가하는 동안 진하고 반투명의 반-불투명한 (translucent semi-opaque) 회색 슬러리가 되었고, 내용물이 잘 혼합되도록 교반을 증가시켰다. 상기 혼합물을 1.5시간 동안 교반한 다음에 조립 유리 프릿 깔때기 (coarse glass fritted funnel) (4L, 사전에 에칭됨)를 통해 여과하였다. 여과를 완료하는데 30-45분이 소요되었다. 투명한 2상 여액을 버렸다. 백색 고체를 필터에서 10분 동안 건조시켰다 (케이크의 균열이 관찰됨). 상기 고체를 다시 깨끗한 5L의 가지 3개 달린 단일벽 플라스크로 옮기고, 물 (1.33 L, 7.38E+04 mmol)로 재슬러리화하였다. 상기 슬러리를 2시간 동안 교반한 후에 투명의 균질한 하이드로겔 (hydrogel)을 형성하였다. 상기 용액을 또 다른 1시간동안 교반한 후에 고체/겔을 4L의 조립 유리 깔때기 (사전에 에칭됨)를 사용하여 여과하였다. 상기 고체를을 필터에서 30분 동안 건조시켰다. 상기 고체를 다시 깨끗한 5L의 가지 3개 달린 단일벽 플라스크로 옮기고, 아세톤 (1.084 L, 1.48E+04 mmol)에 재슬러리화하였다. 백색/회색 슬러리를 1시간 동안 교반한 다음에 4L의 조립 유리 깔때기 (사전에 에칭됨)에서 여과하였다. 여과를 완료하는데 20분이 소요되었고, 그 다음에 깔때기에서 또 다른 1시간 동안 건조하였다. 이때, 상기 고체는 균일한 건조를 보장하기 위해 가끔 휘저었다(agitated). 건조 후 필터에 밝은 백색 분말이 남았다. 상기 고체를 저속 질소 블리드 (nitrogen bleed)로 진공하에 55℃에서 20시간 동안 건조하여 푹신한 (fluffy) 백색 고체를 수득하였다 (200.3 g이 수집됨).
2-메틸 테트라히드로푸란 (100 mL, 10 vol) 중 6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(6-브로모-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-15) (10.0 g, 16.0 mmol)의 교반된 용액에 (4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)트리플루오로-λ4-보란, 칼륨염 (I-5) (8.0 g, 20 mmol) 및 상기에서 수득된 푹신한 백색 고체 (0.20 g)를 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 질소 기체로 30분 동안 탈기시켰다. 상기 용액에 준비된 탄산세슘 수용액 (20.0g, 물 60 mL 중 62.0 mmol, 6 vol)을 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 15분 동안 추가로 탈기한 다음에, 비스(디-tert-부틸(4-디메틸아미노페닐)포스핀)디클로로팔라듐(II) (0.66 g, 0.93 mmol)을 부가하고, 상기 반응 혼합물을 진공 하에 진공처리하고(evacuated), 질소로 플러싱(flushing)하였다. 생성된 반응 혼합물을 110℃에서 20시간 동안 가열하였다. 반응 완료 후에 (TLC & LCMS 모니터링), 생성된 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 셀라이트 층을 통해 여과한 다음에, EtOAc (3 x 0.5 L)로 추가로 세척하였다. 합한 유기물들을 1N 수산화나트륨 용액 (3 x 0.5 L)으로 세척하였다. 그 다음에 합한 유기물들을 브라인으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켜서 조 생성물을 수득하였고, 이를 헥산 중 20% EtOAc 용리액을 사용하여 실리카겔 (100-200M) 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 (I-16) (N-벤질 위치이성질체의 혼합물로서)을 연황색 고체 (8.0 g, 66%)로 수득하였다. C48H47N5O5 에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 774.36 실측치 774.59.
제조예 4: (S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, 염산염 (I-18)
Figure pct00009
(a) 벤질 (S)-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실레이트, 염산염 (I-17)
6-벤질 5-(tert-부틸) (S)-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트 (I-16) (1.0 g, 1.292 mmol)를 디옥산 (8 mL) 및 물 (1.5 mL)에 용해시킨 다음에, 디옥산 중 4M 염화수소 용액 (7 mL, 28.0 mmol)을 부가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 그 다음에 상기 반응 혼합물을 동결하고, 동결건조하고, 조 생성물 (I-17)을 다음 반응에서 바로 사용하였다 (정량적 수율이 가정됨). C43H39N5O3 에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 674.31 실측치 674.3.
(b) (S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, 염산염 (I-18)
벤질 (S)-3-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실레이트, 염산염 (I-17) (0.918 g, 1.292 mmol)을 50℃에서 2-프로판올 (15 mL), 5M 염화수소 수용액 (0.258 mL, 1.292 mmol) 및 물 (0.25 mL)에 용해시키고, 그 다음에 탄소상 팔라듐, 10% wt., 50% 물 (0.138 g, 0.065 mmol)을 부가하였다. 그 다음에 반응 플라스크를 질소로 퍼지하고, 수소 벌룬 (hydrogen balloon)을 부착하고, 필요에 따라 수소 벌룬을 보충하면서 반응 혼합물을 50℃에서 4일 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 그 다음에 모든 고체를 여과로 제거하고, 생성된 용액을 농축하였다. 잔류물을 1:1의 ACN/물에 용해시키고, 동결시키고, 동결건조시켰다. 생성된 분말 (I-18)을 추가 정제 없이 사용하였다 (정량적 수율이 가정됨). C22H21N5O3 에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 404.17 실측치 404.2.
제조예 5: (S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (I-19)
Figure pct00010
(S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, HCl (I-18) (0.25 g, 0.568 mmol)을 DMF (2.5 mL) 및 아세톤 (2.5 mL)에 현탁시킨 다음에, 아세트산 (0.098 mL, 1.705 mmol) 및 소듐 시아노보로하이드라이드 (0.179 g, 2.84 mmol)를 부가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 상기 반응 혼합물을 농축한 다음에, 조 생성물을 역상 크로마토그래피 (5-70% ACN/물 구배, 50 g C18aq 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (149 mg, 47% 수율)을 제공하였다. C25H27N5O3 에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 446.21 실측치 446.3.
실시예 1: (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논
Figure pct00011
(S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (I-19) (50 mg, 0.089 mmol), 3-(디메틸아미노)아제티딘 2염산염 (23.20 mg, 0.134 mmol) 및 DIPEA (0.078 mL, 0.447 mmol)를 DMF (1.5 mL) 중에 용해시킨 다음에, HATU (51.0 mg, 0.134 mmol)를 부가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다 (반응 진행은 LCMS로 모니터링함). 히드라진 (0.014 mL, 0.447 mmol)을 부가하여 원하지 않는 부산물을 절단하고, 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 분취용 HPLC (5-70% ACN/물 구배, C18 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (25 mg, 37% 수율)을 제공하였다. C30H37N7O2 에 대한 (m/z): [M+H]+ 계산치 528.30, 실측치 528.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.09 (s, 1H), 9.40 (s, 1H), 8.27 (d, J = 8.31, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.04 (m, 2H), 6.71 (d, J = 2.54, 1H), 6.64 (dd, J = 2.53, 8.26, 1H), 4.26 (m, 1H), 4.06 (m, 2H), 3.82 (m, 2H), 3.64 (m, 2H), 3.03 (m, 2H), 2.74 (m, 2H), 2.47 (q, J = 7.56, 2H), 2.07 (d, J = 3.69, 6H), 1.07 (m, 6H), 1.00 (t, J = 7.50, 3H).
제조예 6: 벤질 ( S )-1-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1 H -인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-1 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실레이트 (I-21)
Figure pct00012
단계 1
I-16 (550 g, 0.71 몰)을 가지 3개 달린 건조된 둥근바닥 플라스크에 부가하였다. 상기 화합물을 실온(24-25℃)에서 DCM (4125 mL)에 용해시켜 투명한 옅은 황색 용액을 제공하였다. 상기 용액을 다음 30분 동안 0℃로 냉각시켰다 (얼음 염 혼합물) (외부 온도는 -5℃였다). 그 다음에 드로핑 깔때기를 통해 TFA (1375 mL)를 45분에 걸쳐 천천히 부가하였다. 상기 반응을 동일 온도 (0℃)에서 10분동안 교반하였다. 상기 반응 물질을 30℃까지 가온하고 동일 온도에서 1.5 시간동안 교반하였다. 반응을 TLC 뿐만 아니라 LCMS를 통해서도 모니터링했다. 반응 완료 후에, 상기 반응 혼합물은 감압 하에 40℃에서 증발시켜 조 물질을 연갈색 진한 점성물로서 얻었다. 2.5L의 헵탄을 각 시간에 부가하고 건조할 때까지 증발시킴으로써 헵탄 스트리핑 (Heptane stripping)을 수행하였다. 이후 혼합물을 높은 진공 하에 건조하였다. 목적 생성물 I-20을 진한 점성 액체로서 수득하였다 (641 g, 100% 수율, LCMS= 94.35% 순도).
단계 2
가지 3개 달린 건조된 둥근바닥 플라스크에, 분자체(molecular sieves) 4A°(641g, w/w)를 충전한 다음, 실온(25℃)에서 비활성 기체 하에 8 부피(8 volumes)의 아세톤(5.13L)을 한번에 부가하였다. 하얀색 현탁제가 관찰되었다. 단계 1에서 수득한 물질 (641 g, 0.71 mol, 7.690 L (12 볼륨)의 아세톤에 용해됨)을 플라스크 내에 점성 물질(gummy mass)의 생성을 피하기 위해 천천히 10분에 걸쳐 플라스크에 부가하였다). 연황색이 반응물질에서 관찰되었다. CH3COOH (15.4 mL, 0.266 mol) 을 25℃에서 적가하였고 생성된 반응 물질을 동일한 온도에서 30분동안 교반하였다. 짙은 황색 현탁제가 관찰되었다. 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 (297 g, 1.4 mol)를 25℃에서 30 분에 걸쳐 조금씩 부가하였다. 온도가 25℃ 에서 31℃까지 올랐고 반응 물질 색이 짙은 황색에서 연황색으로 변했다. 생성된 반응 혼합물을 30℃에서 다음 30분 동안 교반하였다. 반응 진행을 LCMS 및 TLC로 모니터링하였다. 반응 완료 후에, 반응 혼합물을 10℃로 냉각시키고 추가 20분 동안 교반하였다. 반응 물질을 이후 셀라이트 층을 통해 여과하여 분자체 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드를 제거하였다. 여과를 위해 사용한 셀라이트 층을 2-Me-THF 10 볼륨(6.41 L)으로 세척하고 2-Me-THF을 분리하였다. 상기 수득된 아세톤 모액을 감압 하에 건조할 때까지 증발시키고 진한 점성 액체를 얻었다. 수득한 점성 액체를 셀라이트 층 세척에 사용하였던 2-Me-THF (6.41 L)에 용해시켰다. 유기 층(2-Me-THF)에, 10% NaHCO3 수용액 (~5.5 L)을 부가하여 pH를 약 7.02로 하였다. 이 때, 약간의 기체 발생이 관찰되었고 이는 5분 이내에 중단되었다. 2상 층 및 유기 층은 분리되었다. 유기 층은 추가로 물(2.0 L로 2회)로 세척하였다. 유기 층은 Na2SO4에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 95.73% HPLC 순도의 벤질 (S)-1-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실레이트 (I-21) 을 연황색 포말성 고체(foamy solid) (500g)로 수득하였다. 동일한 스케일의 11 배치가 수행되었고 수득한 물질들을 합하였다. 헵탄 (5 볼륨) 중의 화합물의 슬러리가 제조되었고 실온에서 2시간동안 교반하였다. 화합물을 여과시키고 헵탄 (2 볼륨)으로 세척하였다. 습윤 케이크를 외부 온도를 가하지 않고 24시간 동안 진공 트레이 건조기 내에서 건조시켜 화합물 I-21 5.40kg 을 수득하였다.
제조예 7 : (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히
드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (1)
Figure pct00013
단계 1:
벤질 (S)-1-벤질-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실레이트 (1,350 g, 1886 mmol) 및 테트라히드로푸란 (2025 mL)을 가지 3개 달린 건조된 둥근바닥 플라스크에 충전시키고 25℃에서 교반하여 균일한 투명한 황색/오렌지색 용액을 수득했다. 25℃에서 상기 용액에 프로판-2-올 (11,475 mL) 및 6M 염화수소(aq) (1257 mL)을 부가하고 교반하여 균일 용액을 얻었다. 자유로이 교반된 황색 슬러리를 30분 동안 탈기시키기 위해 질소 버블을 사용하였다. 10 wt % Pd/C, 50 wt % H2O (202.5 g, 95 mmol)를 반응기에 부가하였다. 질소 기체를 차단한 후0 반응 용액을 H2 버블링으로 퍼징(purge)하고 내부 온도를 65℃로 가온하였다. HPLC는 반응이 210분 후에 완료됨을 나타내었다. 반응 혼합물을 10 그람 셀라이트 패드를 통해 여과하여 많은 양의 촉매를 제거하였다. 투명한 황색 용액이 수집되었다. SiliaMetS 티올 (101.25 g, 953 mmol) (흰색 고체)을 여액에 충전시키고 혼합물을 50 ℃에서 1시간 걸쳐 교반하여 나머지 Pd를 소거하였다. 1시간 후에, SiliaMetS 티올을 0.2 마이크론 필터를 통해 여과시키고 연황색 균일 용액을 얻었다. 여액을 이후 3X (vol)로 농축하고 50℃로 유지하였다. 50℃ 농축 용액에 3 당량의 12M HCl (471 ml, 5657 mmol))을 부가하였다. 50℃ 에서 5분에 걸쳐 교반한 후, 시드 2.025그람을 부가하고 50℃ 로 1시간에 걸쳐 유지하였다. 슬러리가 상당히 진해졌다(thicken). 아세토니트릴 (20250 mL) 15X (vol)를 120분에 걸쳐 천천히 부가하였다. 배치를 2시간에 걸쳐 50℃ 로 유지한 이후 20℃로 3시간에 걸쳐 냉각시킨 후 교반 하에 밤새 유지하였다. 슬러리는 이후 여과되었고 케이크를 ACN으로 5회 린스하고 높은 진공 하 50℃에서 밤새 건조하였다.
일단 오프 로딩되면, 케이크는 (S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라하이드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, 2HCl(850g, 1640mmol, 87% 수율)의 옅은 오렌지색 고체를 제공하였다.
화합물 I-21 1.115kg에 대해 유사한 계획을 수행하여 화합물 I-22를 추가로 700g 얻었다. 수득한 두개의 로트(lots)를 합하였다.
단계 2:
N,N-디메틸아제티딘-3-아민, 2HCl (432 g, 2497 mmol) 및 N,N-디메틸아세트아미드 (3750 ml, 4.00E+04 mmol)를 20℃에서 자켓형 반응기에 충전시켰다. DIPEA (2699 ml, 1.55E+04 mmol) 을 20℃에서 약 5분에 걸쳐 부가하였다. 혼합물을 15분동안 20℃에서 교반하여 탁한(hazy) 용액을 얻었고 이를 200rpm으로 휘저으면서 10-15℃ 로 냉각하였다. 온도를 20℃ 아래로 유지하면서 (S)-2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, 2.2HCl (1250g, 2378 mmol)을 배치에 부가하였다.
발열 반응이 부가 동안에 관찰되었다 (약 7℃ 정도의 발열이 관찰되었다). 슬러리를 수득하였고 이를 약 15분동안 15-25℃에서 휘저었다. 15분 후에, 연한 슬러리가 여전히 관찰되었다. 내부 온도 17℃로, 350 rpm 에서 20 ± 5℃ 로 혼합하면서 HATU (994 g, 2615 mmol)를 약 5분에 걸쳐 부가하였다. 부가 동안 온도가 22℃까지 올랐다. HATU 부가 후에 연한 슬러리가 수득되었다. 반응 완료 도달까지, 즉 2시간동안 배치를 20-25℃ 로 유지시키고 215 rpm에서 교반하면서 휘저었다. 완료된 반응에, 배치의 온도를 30℃ 아래로 유지하며 미리 섞어놓은 냉각시킨 1 볼륨 물 (1.25L)로 희석한 1M aq. HCl (4993 ml, 4993 mmol) (5℃) 용액을 충전시켰다.
이소프로필 아세테이트 5 볼륨(6,250 mL)을 배치에 충전하고 혼합물을 15분동안 휘저었다. 휘젓기를 중단하였다. 수성 산 층을 분리하고 반응기에 옮겼다. 유기 층을 버렸다. 수성 층의 pH를 4-5.0이 되도록 하였다. 이소프로필 아세테이트 5 볼륨(6,250 mL)을 배치에 부가하고 휘젓기를 15분동안 20℃에서 수행하였다. 혼합물을 20℃로 유지하였다. 수성 산 층을 분리하고 반응기에 옮겼다. 유기 층을 버렸다. 이소프로필 아세테이트 5 볼륨(6,250 mL)을 배치에 부가하고 15분동안 20℃에서 휘젓고 20℃로 유지하였다. 수성 산 층을 분리하고 반응기에 옮겼다. 유기 층을 버렸다. 수성 산 층을 밤새 20℃에서 보관하였다. 물 30 볼륨 (37.5kg)을 반응기에 충전하였다. 중탄산나트륨 (1238 g, 1.47E+04 mmol)을 부가하고 혼합물을 완전히 용해될 때까지 휘저었다. 휘젓기를 중단하고, 용액을 밤새 20℃로 유지하였다. 2-메틸테트라히드로푸란 10 볼륨(12,500 mL)을 수성 용액에 교반하면서 부가하였다. 발열 반응이 관찰되었다. 내부 온도를 20 + 5℃로 조정하였다. 수성 산 층을 약 10분에 걸쳐 반응기에 부가하였다. 1℃의 약한(mild) 발열이 관찰되었다. 혼합물을 20℃에서 약 15분동안 휘젓고 이후 20℃로 유지하였다. 바닥 수성 층을 제거하고 반응기에 부가하였다. 유기 층을 제거하고 2-메틸테트라히드로푸란 5 볼륨 (6,250mL)을 충전시킴으로써 추출하고 약 15분동안 20℃에서 혼합하였다. 상기 합한 수성 층을 배쓰 온도가 50℃인 rotovap을 사용하여 3 볼륨 (3.75L)로 농축시켰다. 2-메틸테트라히드로푸란 10 볼륨 (12,500 mL)을 부가하고 상기 혼합물을 배쓰 온도가 50℃인 rotovap을 사용하여 3 볼륨 (3.75L)로 농축시켰다. 아세토니트릴(2.00E+04 mL)을 25L 자켓형 반응기에 부가하고 215rpm에서 혼합하면서 이의 내부 온도를 0-5℃로 조정하였다. 농축된 배치 (약 3.75L)를 냉각한 아세토니트릴 에 0-5℃에서 약 1시간에 걸쳐 부가하였다. 상기 혼합물을 215rpm으로 혼합하면서 밤새 0℃에서 숙성시켰다. 이를 여과시키고 케이크를 4 볼륨의 미리-냉각시킨 아세토니트릴 (5,000 mL)로 0℃에서 세척하였다. 케이크를 필터에서 N2 기체 압력 하에 2시간에 걸쳐 건조하였다. 습윤 케이크를 강한 진공 하 (약간의 N2 퍼징과 함께) 50℃에서 밤새 건조시켜 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (1150 g, 2179 mmol, 92 % 수율) 을 비결정성 고체로서 수득하였다. 물질의 두번째 배치를 동일한 방식으로 제조하여 1036g의 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논을 비결정성 고체 (PXRD에 의해 확인)로서 제공하였고 두개의 배치를 합하였다.
실시예 2: ( S )-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1 H -인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논의 결정성 수화물 (결정형 I)
(S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (95 g, 180 mmol)을 30℃에서 1M HCl (aq) (950 mL) 및 이소프로필 아세테이트 (950 ml) 에 녹였다. 그 배치를 30℃ 에서 30분동안 유지시킨 다음 층을 분리하였다. 이를 3회 반복하였으며 항상 바닥 수성 층을 유지하고 이소프로필 아세테이트 층을 버렸다. 4번째 수성 층의 이소프로필 아세테이트 추출 후에, 2-메틸테트라히드로푸란 (950 ml, 9419 mmol)을 부가하고 이후 충분한 10% 중탄산나트륨으로 pH를 7.5로 하였다. 혼합물을 30분에 걸쳐 교반하고 층을 분리하였다. 수성 층을 2-메틸테트라히드로푸란 (250mL)으로 추출하였다. 2-메틸테트라히드로푸란 층을 합하였다. 용액으로부터 생성물을 침전시키기 위해 2-메틸테트라히드로푸란으로부터 아세토니트릴로의 용매 교체(solvent swap)를 수행하였다. 여과 및 건조 후에, 케이크는 89 그람의 조 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논을 제공하였다. 이 고체 (89 그람)을 445mL의 메탄올 내로 가져갔다. 완전히 용해할 때까지 교반 후에, 배치를 0.2μm 필터를 통해 여과하였다. 여액을 이후 내부 온도 55℃까지 가열하고 이 온도에서 60분에 걸쳐 교반하면서 유지하였다. 약간의 침전물이 형성되기 시작하면서 약간 탁한 용액이 되었다. 그 다음 온도를 최종 내부 온도가 15℃가 될 때까지 0.2℃/분 속도로 선형으로 (linearly) 냉각시키고 이후 15℃ 로 8시간에 걸쳐 유지하였다. 이 때에, 배치가 상당히 진해졌으며, 슬러리를 강한 진공을 사용하여 질소 블랭킷 하에 여과하였다. 습윤 케이크를 오프-로딩한 후 온도가 65℃로 설정된 진공 오븐 내에서 강한 진공(28mm Hg) 하에 18 시간에 걸쳐 건조하였다. 건조 케이크를 이후 오프-로딩하고 주위 습도 및 온도와 평형을 이루도록 하여 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 수화물 결정형 I (75 g, 140 mmol, 78 % 수율)의 최종 백색 내지 회백색 결정성 케이크를 제공하였다.
실시예 3 : (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (화합물 1)의 결정성 수화물, 결정형 I
20L 자켓형 반응기에 상기 제조예 7에서 수득한 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (화합물 1, 2186 g, 4143 mmol)을 부가하고 이후 메탄올(10930 mL)을 처리하였다. 수득한 슬러리를 교반하고 55℃ 로 가열하여 투명한 균일 용액을 제공하였다. 상기 용액을 55℃에서 30분간 유지시키고 시딩하였다 (이전 실시예에서 수득한 물질 2.186g과 함께). 상기 용액을 55℃에서 추가 1시간 동안 유지하였다. 결정화 및 진해짐(thickening)이 발생했다. 상기 혼합물을 이후 10℃ 로 450 분에 걸쳐 냉각시켰다. 배치를 내부적으로 10℃에서 12시간에 걸쳐 유지한 다음 여과하였다. 습윤 케이크를 5℃에서 미리 냉각된 메탄올(2186mL)로 세척하였다. 상기 케이크를 질소 퍼지 및 55℃로 설정된 가열된 재킷을 사용하여 진공 하에 필터 건조기에서 건조시켰다. 상기 케이크를 19시간에 걸쳐 이러한 건조 조건 하에 유지하였다. 이후 케이크를 오프-로딩하고 건조 트레이에 펼치고 30시간에 걸쳐 주위 RH 조건과 평형을 이루도록 하여 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (1411.6 g, 2587 mmol, 62.4 % 수율)의 결정성 수화물, 결정형 I을 회백색 내지 옅은 황색 고체로서 제공하였다.
실시예 4 : (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (화합물 1)의 결정성 수화물, 결정형 I
실시예 2에 나타난 바와 유사한 방법으로 수득한 조 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (화합물 1) 250 g에 메탄올 (1.250 mL) 을 부가하고, 수득한 슬러리를 30 분 동안 55℃ 로 가열하여 균일 용액을 제공하였다. 상기 용액을 0.2μm 필터를 통해 여과하였다. 상기 여액을 55℃ 에서 3시간 동안 교반하였고 결정화가 시작되었다. 생성된 연한 슬러리의 온도를 약 250분동안 5℃로 조정하였다. 진해진 슬러리를 5℃에서 밤새 교반하였다. 이후 압력 필터를 사용하여 고체를 분리하였다. 필터 케이크를 5℃에서 미리 냉각된 메탄올(250mL)로 세척한 다음, 55℃에서 높은 진공 하에 밤새 건조시켜 180g의 결정성 물질을 제공하였다. 수득된 결정성 물질 180g에 메탄올(900mL)을 부가하였다. 교반된 슬러리의 온도를 약 30분 동안 55℃로 조정하였다. 상기 슬러리를 55℃에서 약 3시간 동안 교반하였다. 이후 상기 슬러리의 온도를 약 200분 동안 5-15℃로 조정하였다. 상기 슬러리를 5-15℃에서 약 2시간 더 교반하였다. 비활성 조건 하에 압력 필터를 사용하여 고체를 분리하였다. 필터 케이크를 5-15℃로 미리 냉각된 메탄올(300mL)로 세척한 다음, 높은 진공 하에 55-65℃에서 약 12시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 건조된 케이크를 주위 온도, 압력 및 상대 습도 하에 약 12시간 동안 유지하여 165.7g의 (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논의 결정성 1수화물(결정형 I)을 97.7%의 HPLA 데이터 기반 순도를 갖는 회백색 내지 연황색 고체로서 제공하였다.
실시예 5: (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (화합물 1)의 결정성 수화물, 결정형 I
(S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논을 상기 제조예 7의 단계 2에 나타난 바와 유사하게 제조하여 수득하였다. 수득된 고체(0.100g, 0.183mmol)를 50℃에서 5시간에 걸쳐 에탄올(0.5ml, 0.183mmol)에 용해시켰으며, 이때 슬러리가 형성되었다. 상기 슬러리를 비활성 조건 하에 해당 온도에서 여과하고 진공 하에 60℃에서 12시간 동안 오븐에서 건조시킨 후 주위 실온 및 압력 하에 12시간 동안 평형화시켜 결정형 I(0.06g)을 제공하였다.
실시예 6-10: 결정형의 특성
(S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 (화합물 1)의 결정성 수화물, 결정형 I의 샘플을 분말 X-선 회절 (PXRD), 시차 주사 열량 분석법 (DSC), 열 중량 분석 (TGA), 동적 수분 흡착 (DMS), 및 단일 결정 X-선 회절을 통해 분석하였다.
실시예 6 분말 X-선 회절
도 1의 분말 X-선 회절 패턴을, 출력 전압이 45kV이고 전류가 40mA인 Cu-Kα 방사선(λ = 1.54051 Å)을 사용하는 Lynxeye 1D 검출기가 장착된 Bruker D8-Advance X-선 회절계를 이용하여 얻었다. 상기 기기는 샘플에서 강도를 최대화하도록 설정된 입사, 발산 및 산란 슬릿의 Bragg-Brentano 구조(geometry)에서 실행되었다. 측정을 위해 소량의 분말(5-25 mg)을 샘플 홀더에 부드럽게 눌러 매끄러운 표면을 형성하고 X선에 노출시켰다. 상기 샘플을 총 1시간의 스캔 시간 동안 0.02°의 단계 크기(step size) 및 단계당 2초의 스캔 속도로 2θ-2θ 모드에서 2°내지 35°의 2θ로 스캔하였다. 데이터 수집은 Bruker DiffracSuite 측정 소프트웨어로 제어하고 Jade 소프트웨어(버전 7.7)로 분석했다. 관찰된 PXRD 2θ 피크 위치 및 d-간격은 화합물 1의 결정성 수화물, 결정형 I에 대한 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00014
실시예 7: 열적 분석
시차 주사 열량 분석법 (DSC)을 TA Instruments Model Discovery DSC를 사용하여 수행했다. TRIOS 소프트웨어로 데이터를 수집하고 TA Instruments Universal Analysis 소프트웨어를 사용하여 분석했다. 결정형의 샘플을 TZero 밀폐 핀홀 뚜껑으로 덮인 알루미늄 팬에 정확하게 칭량했다. 상기 샘플을 처음에 -20℃로 냉각시킨 후, 10　℃/분의 선형 가열 램프를 사용하여 -20℃ 에서 250 ℃까지 가열하였다. 결정형 I의 대표적인 DSC 열분석도를 도 2에 나타냈다.
열중량 분석(TGA) 측정은 고분해능(high resolution) 기능이 장착된 TA Instruments Model Discovery TGA 모듈을 사용하여 수행되었다. 데이터를 TA Instruments TRIOS 소프트웨어를 사용하여 수집하고 TA Instruments Universal Analysis 소프트웨어를 사용하여 분석했다. 칭량된 샘플을 백금 팬에 놓고 주위 온도에서 260℃까지 분당 10℃의 가열 속도로 스캔했다. 사용하는 동안 밸런스 및 퍼니스 챔버를 질소 흐름으로 퍼징하였다. 결정형 I의 대표적인 TGA 트레이스를 도 3에 나타냈다. 27℃ 내지 100℃에서 약 3.4%의 중량 손실이 관찰되었으며 이는 1수화물 형태의 탈수에 해당한다.
실시예 8: 동적 수분 흡착 평가
동적 수분 흡착 (DMS) 측정은 VTI 대기 마이크로저울, SGA-100 시스템 (VTI Corp., Hialeah, FL 33016)을 사용하여 수행하였다. 칭량된 샘플을 사용하였고, 습도는 분석 시작시에 가능한 최저 값 (0% RH에 근접)이었다. 상기 DMS 분석은 16시간 동안 초기 건조 단계 (~0% RH), 이후 5% RH 내지 90% RH의 습도 범위에 걸친 5% RH/단계의 스캔 속도의 흡착과 탈착의 두 사이클로 구성되었다. 상기 DMS 실행은 25 ℃에서 등온적으로 수행되었다. 결정형 I의 대표적인 DMS 트레이스를 도 4에 나타냈다.
실시예 9: 단일 결정 X-선 회절
0.28 x 0.11 x 0.02 mm 크기의 화합물 1의 결정성 수화물(결정형 I)의 결정을 유리 섬유에 두었다.
Oxford Cryosystems Cobra 냉각 장치를 구비한 Rigaku Atlas CCD 회절계 상에서 데이터를 수집하였다. 데이터는 Cu Kα 방사선을 사용하여 수집하였고 Bruker AXS SHELXTLsuite 결정 소프트웨어를 사용하여 구조를 분석하고 정련하였다. 탄소에 부착된 수소 원자가 기하학적으로 배치되었고, 승차 등방성 변위 파라미터 (riding isotropic displacement parameter)로 정련(refinement)할 수 있었다. 헤테로원자에 부착된 수소 원자는 차이 Fourier 맵 (difference Fourier map)에 위치하였고, 등방성 변위 파라미터로 자유롭게 정련할 수 있었다. 결정계(crystal system) 및 스페이스 그룹과 함께 단위 셀 파라미터를 하기 표 2에 나타내었다. 데이터는 결정형 I이 1수화물임을 보여준다.
Figure pct00015
실시예 10: 안정성 연구
25 ℃ 및 60% 상대 습도(RH)의 가속 조건과 40 ℃ 및 75% 상대 습도(RH)의 가속 조건에서 보관된 결정형 I의 샘플은 화합물 1 함량 및 불순도 프로파일에 대해 HPLC로 분석하였으며, 그 결과는 표 3 및 4에 나타난 바와 같다.
RRT = 상대 머무름 시간 (화합물 1에 관한)
LOQ = 정량 한계 (0.05% a/a), LOQ 이상에서의 피크만 보고됨
Figure pct00016
Figure pct00017
결정형 I은 이러한 조건 하에서 우수한 안정성을 나타내었다.
제조예 8: 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란
Figure pct00018
(a) 1-(벤질옥시)-4-브로모-5-에틸-2-플루오로벤젠
ACN (250 mL) 중 4-브로모-5-에틸-2-플루오로페놀 (20 g, 910.32 mmol) 용액에 K2CO3 (31.55 g, 228.3 mmol)을 부가하고 이후 벤질 브로마이드 (13.10 mL, 109.58 mmol)을 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 수성 층을 EtOAc로 추출하고 (3회), 브라인과 합하고 브라인으로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고 감압 하에 증발시켜 표제 중간체를 연황색 유성 액체(25 g, 89 % 수율)로 제공하였다. 1H NMR (400　MHz, Chloroform-d) δ 7.48 - 7.30 (m, 5H), 7.27 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 2.66 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(b) 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란
디옥산 (100　mL) 중의 이전 단계의 생성물 (12.5 g, 40.45 mmol) 용액에 비스(피나콜레이토)디보론 (15.40 g, 60.67 mmol) 및 KOAc (11.9 g, 121.35　mmol)를 부가하였다. 반응 혼합물을 15분 동안 질소로 퍼징한 후, 디클로로메탄과 함께 착물인 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) (1.65g, 2.023mmol)을 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 교반하고 110℃에서 3시간 동안 가열하고 셀라이트를 통해 여과하고 잔류물을 EtOAc로 세척하였다. 여액을 과량의 EtOAc(200mL)로 희석하고, 물(100mL)에 이어 브라인(100mL)으로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 진공에서 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 3-5% EtOAc:헥산으로 용리하는 (100-200) 실리카 겔 상 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물을 회백색 고체로 제공하였다(9.50g, 66% 수율). 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.54 - 7.27 (m, 6H), 6.81 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.16 (s, 2H), 2.84 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.32 (s, 12H), 1.14 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
제조예 9: 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2 H -피란-2-일)-3-(트리메틸스탄일)-1 H -인다졸
Figure pct00019
(a) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸
DMF:H2O (480:120 mL) 중의 6-브로모-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸 (50 g, 178.57　mmol) 및 2-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란 (76.3 g, 214.29 mmol) 용액에 K3PO4 (94.64 g, 446.86 mmol)을 부가하였다. 반응 혼합물을 질소로 15분 동안 탈기한 다음, Pd(PPh3)2Cl2 촉매(6.26g, 8.93mmol)를 부가하고 혼합물을 다시 질소로 5분 동안 교반하여 탈기하고 100-110℃ 에서 5시간 동안 가열했다. 상기 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 잔류물을 EtOAc로 세척하였다. 여액을 EtOAc로 희석하고, 냉수 및 브라인으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공에서 농축하여 조 생성물을 수득하고, 이를 플래시 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 중간체를 백색 고체로서 제공하였다 (65 g, 86 % 수율). C27H27FN2O2에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 431.21 실측치 431.46. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.06 - 7.98 (m, 2H), 7.70 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.51 - 7.32 (m, 5H), 7.08 (dd, J = 809.6, 8.3 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.76 - 5.64 (m, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.04 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 3.72 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 2.52 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 2.22 - 2.02 (m, 3H), 1.80 - 1.71 (m, 3H), 1.06 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(b) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1H-인다졸
메탄올(700mL) 중의 이전 단계의 생성물(65g, 151.16mmol)의 용액에 진한 HCl(120mL)을 부가하고 생성된 용액을 60-65℃ 에서 3시간 동안 가열하고, 실온으로 냉각하고, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc에 용해시키고 포화 NaHCO3 수용액 및 물로 세척하였다. 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 진공에서 농축시켜 표제 중간체를 백색 고체로서 제공하였다(52g, 99%(조)). 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.13 (s, 1H), 7.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.59 - 7.30 (m, 6H), 7.10 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 2.53 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.05 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(c) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-3-요오도-1H-인다졸
DMF (400 mL) 중의 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1H-인다졸 (56 g, 161.18　mmol) 용액에 KOH (36.2 g, 647.39 mmol)을 부가하고 혼합물을 5분동안 교반하였다. DMF (100 mL) 중의 요오드 (iodine) (82.2 g, 323.69 mmol) 용액을 0℃에서 천천히 부가하고 실온에서 30분 동안 교반하고 물(3 x 150mL)로 희석하고 EtOAc(3 x 200mL)로 추출하였다. 유기층을 포화 소듐 메타비술파이트(sodium metabisulfite) 수용액(3 x 200 mL) 및 물(400 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 로 건조하고 감압 하에 농축하여 조 생성물을 얻었고, 이를 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 중간체를 갈색 반고체(64g, 84% 수율)로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 10.49 (s, 1H), 7.57 - 7.32 (m, 7H), 7.16 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.04 - 6.91 (m, 2H), 5.20 (s, 2H), 2.51 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 1.04 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
(d) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-3-요오도-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸
DCM(700mL) 중 이전 단계의 생성물(60g, 127.12mmol)의 빙냉 용액에 p-톨루엔술폰산(4.84g, 25.423mmol)을 부가하고 이어 3,4-디하이드로-2H-피란(17.43mL, 190.68mmol)을 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, DCM으로 희석하고, 포화 NaHCO3 수용액 및 브라인으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 로 건조하고 감압 하에 농축하여 조 생성물을 수득하고 이를 플래시 크로마토그래피(실리카 겔)로 정제하여 표제 중간체를 회백색 고체로서 제공하였다(64g, 91% 수율). C27H26FIN2O2 에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 557.10 실측치 557.30. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.56 - 7.31 (m, 7H), 7.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.68 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.08 - 3.99 (m, 1H), 3.77 - 3.64 (m, 1H), 2.50 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.23 - 1.97 (m, 3H), 1.81 - 1.68 (m, 3H), 1.06 (t, J = 7.4 Hz, 3H).
(e) 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-3-(트리메틸스탄일)-1H-인다졸
톨루엔 (150 mL) 중의6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-3-요오도-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸 (20 g, 35.97 mmol) 용액에 헥사메틸디틴(hexamethylditin) (9.2 mL, 43.17 mmol)을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소로 20분 동안 탈기시킨 후 테트라키스 (2.0g, 1.80mmol)를 부가한 다음, 100℃에서 2시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시키고, 셀라이트를 통해 여과하고, 잔류물을 EtOAc로 세척하였다. 여액을 농축하고 2 내지 5%. EtOAc:헥산으로 용리하는 컬럼 크로마토그래피(중성 알루미나 상)로 정제하여 표제 화합물을 제공하였다(17.50g, 82% 수율). C30H35FN2O2Sn에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 595.17, 593.17 실측치 595.49, 593.55. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.57 - 7.29 (m, 6H), 7.13 - 7.00 (m, 2H), 6.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.81 - 5.68 (m, 1H), 5.21 (s, 2H), 4.13 - 4.00 (m, 1H), 3.81 - 3.66 (m, 1H), 2.54 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 2.23 - 2.00 (m, 2H), 1.87 - 1.59 (m, 4H), 1.08 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.47 (s, 9H).
제조예 10: 5-( tert -부틸) 6-메틸 ( S )-2-요오도-3-((2-트리메틸실릴)에톡시) 메틸)- 3,4,6,7-테트라히드로 -5 H -이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
Figure pct00020
(a) (S)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
물(420mL) 중의 L-히스티딘(50g, 322.24mmol)의 교반된 현탁제에 진한 HCl(29 mL)을 0 ℃에서 적가한 다음 포름알데히드(55 mL, 676.72 mmol)를 0℃에서 한 번에 가했다. 생성된 반응 혼합물을 30분 동안 교반한 다음, 75℃에서 6시간 동안 가열하고 농축하였다. 생성된 조 물질을 디에틸 에테르와 함께 2시간 동안 교반하고, 여과하고 IPA:THF(100:300 mL)로 세척하여 표제 중간체의 HCl 염을 회백색 고체로서 제공하였다(75 g 99% 수율(조)). C7H9N3O2 에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 168.07 측정치 168.17.
(b) 메틸 (S)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실레이트
메탄올(1500mL) 중의 이전 단계의 생성물(75.0g, 312.5mmol)의 교반된 용액에 SOCl2(45.6mL, 625mmol)를 0℃에서 적가하고 실온에서 16시간 동안 교반한 다음 1시간 동안 환류(70℃)까지 가열하였다. 용매를 증류에 의해 제거하고 조 생성물을 메탄올에 이어 디에틸 에테르로 연화(triturate)시켜 표제 중간체의 조 HCl 염을 회백색 고체(조 80 g)로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.05 (s, 1H), 4.71 (dd, J = 9.4, 5.2 Hz, 1H), 4.36 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.44 - 3.21 (m, 2H).
(c) 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
메탄올(1000mL) 중의 이전 단계의 생성물(80.0g, 314.96mmol)의 교반된 용액에 DIPEA(282mL, 1574mmol)에 이어 디-tert-부틸 디카보네이트(172mL, 787.48mmol)를 0 ℃에서 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음, 액체 NH3(물 중 150mL, 25%)를 부가하고 반응 혼합물을 실온에서 다시 16시간 동안 교반하고, 메탄올을 증류에 의해 제거하고 잔류물을 DCM 내에서 추출하였다 (3 x 200mL). 합한 유기 추출물을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 5% MeOH:DCM으로 용리하는 플래쉬 크로마토그래피(100-200 메쉬 실리카겔)로 정제하여 표제 중간체(41g, 46% 수율)를 제공하였다. C13H19N3O4에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 282.14 실측치 282.21. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.85 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 5.18 (dd, J = 49.3, 5.1 Hz, 1H), 4.51 (t, J = 14.2 Hz, 1H), 4.09 (dd, J = 43.9, 16.1 Hz, 1H), 3.59 (s, 3H), 3.08 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 2.94 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 1.45 (s, 9H).
(d) 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-2-요오도-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
THF(500mL) 중의 이전 단계의 생성물(41.0g, 145.9mmol)의 용액에 N-요오도숙신이미드 (66.0g, 291.8mmol)를 0℃에서 부가하고 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 부분을 10% 티오황산나트륨 용액(3 x 200mL)으로 세척하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 농축하여 표제 화합물 60g(조)을 얻었고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. C13H18IN3O4에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 408.03 실측치 408.31. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.48 (s, 1H), 5.34 - 4.97 (m, 1H), 4.67 - 4.35 (m, 1H), 4.12 - 3.95 (m, 1H), 3.60 (s, 3H), 3.14 - 2.82 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).
(e) 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-2-요오도-3-((2-트리메틸실릴)에톡시) 메틸)- 3,4,6,7-테트라히드로 -5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
DMF(150mL) 중의 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-2-요오도-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카르복실레이트(40g, 0.098mol)의 교반 용액에 0 ℃에서 DIPEA (35.1mL, 0.19mol)을 부가하였다. 그 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 2-(트리메틸실릴)-에톡시메틸 클로라이드(19.1mL, 0.10mol)를 0℃에서 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 4시간 후 냉각수를 부가하고 반응 혼합물을 EtOAc(2 x 200mL)로 추출하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시키고, 20-35% EtOAc:헥산으로 용리하는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물을 옅은 황색 점성 액체(27g)로서 제공하였다. C19H32IN3O5Si에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 538.12 실측치 538.42. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 5.33 - 5.04 (m, 3H), 4.79 - 4.56 (m, 1H), 4.54 - 4.14 (m, 1H), 3.60 (s, 3H), 3.47 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.31 - 3.16 (m, 1H), 2.97 (t, J = 18.9 Hz, 1H), 1.44 (s, 9H), 0.92 - 0.74 (m, 2H), -0.03 (s, 9H).
제조예 11: (6S)-5-(tert-부톡시카보닐)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
Figure pct00021
(a) 5-(tert-부틸) 6-메틸 (6S)-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴) 에톡시) 메틸)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
톨루엔 (500 mL) 중의 5-(tert-부틸) 6-메틸 (S)-2-요오도-3-((2-트리메틸실릴)에톡시)메틸)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카르복실레이트 (17.0 g, 31.65 mmol)용액에 6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-3-(트리메틸스탄일)-1H-인다졸(20g, 34.82mmol)을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 15분 동안 아르곤으로 퍼지하고, Pd(PPh3)4 (3.6g, 3.16mmol) 및 요오드화구리(1.20g, 6.33mmol)를 부가하고 그 반응 혼합물을 120℃에서 16시간 동안 교반하였다. 그 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여액을 감압 하에 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Redisep 80g 컬럼, 10분 동안 DCM으로 용리한 이후 헥산 중의 15-20% EtOAc로 용리된)를 통해 정제하여 표제 중간체를 황색 고체로서 제공하였다(15.10g, 58% 수율). C46H58FN5O7Si에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 840.41 실측치 840.54. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.43 (s, 1H), 7.54 - 7.33 (m, 6H), 7.20 (s, 1H), 7.05 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.09 - 5.69 (m, 3H), 5.59 - 5.36 (m, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.97 - 4.80 (m, 1H), 4.12 - 3.90 (m, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.57 - 3.47 (m, 2H), 3.40 (d, 1H), 3.21 - 3.05 (m, 1H), 2.74 - 2.34 (m, 4H), 2.25 - 2.07 (m, 2H), 1.94 - 1.65 (m, 4H), 1.54 (s, 9H), 1.12 - 0.99 (m, 3H), 0.91 - 0.75 (m, 2H), -0.12 (s, 9H).
(b) 6-벤질 5-(tert-부틸) (6S)-2-(6-(4-(벤질옥시)-2-에틸-5-플루오로페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴) 에톡시) 메틸)-3,4,6,7-테트라히드로-5H-이미다조[4,5-c]피리딘-5,6-디카복실레이트
둥근 바닥 플라스크에 톨루엔(400mL), 벤질 알코올(46.3mL) 및 Ti(OEt)4(7.15mL, 35.70mmol) 중 이전 단계의 생성물(15.0g, 17.85mmol)을 부가하고 반응 혼합물을 48시간 동안 격렬하게 환류(140℃)하고 물로 희석하고 DCM으로 추출했다. 현탁제를 여과하고, 여액을 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에 농축하고, 20분 동안 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Redisep 80g 컬럼, 헥산 중 0-5% EtOAc)로 정제하여 과량의 벤질 알코올을 제거한 다음, 헥산 중 10- 15% EtOAc로 용리하여 표제 중간체를 제공하였다. 구조와 일치하는 1H NMR. C52H62FN5O7Si에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 916.44 실측치 916.86.
(c) (6S)-5-(tert-부톡시카보닐)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
1:1 IPA:THF(400mL)) 중 이전 단계의 생성물(21.0g, 22.92mmol)의 교반된 용액에 Pd(OH)2(5.0g)을 부가하였다. 그 반응 혼합물을 수소 벌룬(hydrogen balloon) 하에 실온에서 16시간 동안 교반하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 감압 하에 농축하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Redisep 80g 컬럼, 헥산 중 25-40% EtOAc로 용리됨)로 정제하여 회백색 고체로서 표제 화합물(6.1g, 8.29mmol)을 제공하였다. C38H50FN5O7Si에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 736.35 실측치736.5. 구조와 일치하는 1H NMR. C38H50FN5O7Si에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 736.35 실측치736.5. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.94 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 8.34 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.20 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.11 - 5.77 (m, 3H), 5.33 - 5.06 (m, 1H), 4.87 - 4.56 (m, 1H), 4.52 - 4.14 (m, 1H), 3.97 - 3.69 (m, 2H), 3.53 - 3.40 (m, 2H), 3.23 - 3.11 (m, 1H), 3.11 - 2.93 (m, 1H), 2.47 - 2.44 (m, 2H), 2.13 - 1.96 (m, 2H), 1.68 (d, J = 70.9 Hz, 4H), 1.48 (s, 9H), 1.02 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.86 - 0.68 (m, 2H), -0.17 (s, 9H).
제조예 12: (S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
Figure pct00022
5:1 디옥산:물 (60 mL) 중 (6S)-5-(tert-부톡시카보닐)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1-(테트라히드로-2H-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일)-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)-메틸)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산 (5.7 g, 7.75 mmol)의 교반된 용액에 진한 HCL (20 mL)을 0℃에서 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 90 ℃에서 16시간동안 가온하고, 교반하고, 진공 하에 증류하여 조 잔류물을 제공하였으며, 이를 냉각된 디에틸 에테르 및 아세토니트릴로 순차적으로 연화시켜 표제 화합물의 HCl 염을 연갈색 고체로서 제공하였다(3.6g. 95% 수율). C22H20FN5O3 에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 422.16 실측치 422.24. 1H NMR (400 MHz, D2O/DMSO-d 6) δ 8.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.19 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 6.99 (d, J = 11.9 Hz, 1 H), 6.91 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.56 - 4.51 (m, 1H), 4.36 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 3.35 - 3.25 (m, 1H), 3.15 - 3.05 (m, 1H), 2.4 - 2.55 (m, 2H), 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
제조예 13: ( S )-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1 H -인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산
Figure pct00023
DMF (7 mL) 중 (S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, HCl (400 mg, 0.874　mmol), 아세톤 (0.192 mL, 2.62 mmol), 및 아세트산 (0.150 mL, 2.62　mmol) 용액에 소듐 시아노보로하이드라이드 (274 mg, 4.37 mmol)을 부가하고 상기 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 소듐 보로하이드라이드 (33mg, 0.874mmol)을 부가하고, 용액을 농축하고, 분취용 HPLC로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염(115mg, 23% 수율)을 제공하였다. C25H26FN5O3에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 464.20 실측치 464.5.
실시예 11: ( S )-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1 H -인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3 H -이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논 C-1
Figure pct00024
DMF (4 mL) 중 (S)-2-(6-(2-에틸-5-플루오로-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-카복실산, TFA (179 mg, 0.310　mmol), N,N-디메틸아제티딘-3-아민, 2 HCl (107 mg, 0.465 mmol), 및 DIPEA (0.162　mL 0.930 mmol)의 교반된 용액에 HATU (177 mg, 0.465 mmol)를 부가하고 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 히드라진 (5 eq)을 부가하고, 반응 혼합물을 농축시키고 분취용 HPLC로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염을 제공하였다 (63　mg, 26 % 수율). C30H36FN7O2에 대한 (m/z):　[M+H]+ 계산치 546.29 실측치 546.7. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.90 (s, 1H), 8.29 (dd, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.07 (d, 1H), 7.01 (d, 1H), 6.89 (d, 1H), 4.35 - 4.18 (m, 1H), 4.11 - 3.94 (m, 1H), 3.94 - 3.73 (m, 3H), 3.70 - 3.57 (m, 2H), 3.06 - 2.94 (m, 2H), 2.87 - 2.66 (m, 2H), 2.48 - 2.40 (m, 2H), 2.13 - 2.00 (m, 6H), 1.07 (t, 3H), 1.03 - 0.93 (m, 6H).
생물학적 분석
화합물 1은 하기 생물학적 분석에서 특성이 규명되었다.
분석법 1: 생화학적 JAK 키나제 분석
4개의 LanthaScreen JAK 생화학적 분석 (JAK1, 2, 3 및 Tyk2)의 패널을 통상의 키나제 반응 버퍼 (50 mM HEPES, pH 7.5, 0.01% Brij-35, 10 mM MgCl2 및 1 mM EGTA)에서 수행하였다. 재조합 GST-태그된 JAK 효소 및 GFP-태그된 STAT1 펩티드 기질은 Life Technologies로부터 입수하였다.
계열 희석된 화합물을 4개의 JAK 효소 각각 및 기질과 화이트 384-웰 마이크로플레이트 (Corning)에서 주위 온도로 1시간 동안 사전-인큐베이션하였다. 그 다음에 ATP를 부가하여, 1% DMSO와 함께 10 μL의 총 부피로 키나제 반응을 개시하였다. JAK1, 2, 3 및 Tyk2에 대한 최종 효소 농도는 각각 4.2 nM, 0.1 nM, 1 nM 및 0.25 nM이고; 사용된 해당하는 Km ATP 농도는 25 μM, 3 μM, 1.6 μM 및 10 μM이며; 상기 기질 농도는 4개의 분석 모두에 대해서 200 nM이었다. TR-FRET 희석 버퍼 (Life Technologies) 중 EDTA (10mM 최종 농도) 및 Tb-항-pSTAT1 (pTyr701) 항체 (Life Technologies, 2 nM 최종 농도)의 10 μL 제제를 부가하기 전에 키나제 반응을 1시간 동안 주위 온도에서 진행시켰다. EnVision 리더 (Perkin Elmer)에서 판독하기 전에 플레이트를 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 방출 비율 신호 (520nm/495nm)를 기록하고, 이를 사용하여 DMSO 및 배경 대조군에 기반한 억제 백분율 값을 계산하였다.
용량-반응 분석 (dose-response analysis)을 위해, 억제 백분율 데이터를 화합물 농도에 대해 플롯팅하고, IC50 값은 Prism 소프트웨어 (GraphPad Software)를 구비한 4-parameter robust fit 모델로부터 결정하였다. 결과는 pIC50 (IC50의 음의 로그)으로 나타내고, 후속하여 Cheng-Prusoff 식을 사용하여 pKi (해리 상수 Ki의 음의 로그)로 변환시켰다.
4개의 JAK 분석에서 더 낮은 Ki 값 또는 더 높은 pKi 값을 갖는 시험 화합물은 더 큰 JAK 활성 억제를 나타낸다.
분석법 2: Tall-1 T 세포에서 IL-2 자극된 pSTAT5의 억제
인터루킨-2 (IL-2) 자극된 STAT5 인산화 억제에 대한 시험 화합물의 효능을 AlphaLisa를 사용하여 Tall-1 인간 T 세포주 (DSMZ)에서 측정하였다. IL-2가 JAK1/3을 통해 신호를 전달하기 때문에, 이 분석은 JAK1/3 세포 효능의 측정을 제공한다.
인산화된 STAT5는 AlphaLISA SureFire Ultra pSTAT5 (Tyr694/699) 키트 (PerkinElmer)를 통해 측정하였다. 15% 열 불활성화된 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2mM Glutamax (Life Technologies), 25mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI (Life Technologies) 중에 Tall-1 세포주 유래의 인간 T 세포를 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 배양하였다. 화합물을 DMSO 중에서 계열 희석시키고, 빈 웰에 청각적으로 (acoustically) 분배하였다. 분석 배지 (10% FBS (ATCC)가 보충된 페놀 레드-프리 DMEM (phenol red-free DMEM) (Life Technologies))를 분배하고 (4 μL/웰), 플레이트를 900rpm에서 10분 동안 진탕하였다. 분석 배지 (4 μL/웰) 중에 세포를 45,000 세포/웰로 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 예열된 분석 배지 (4　μL)에 IL-2 (R&D Systems; 최종 농도 300 ng/mL)를 30분 동안 부가하였다. 시토킨 자극 후에, 1xPhosStop 및 Complete 정제 (Roche)를 함유하는 3x AlphaLisa 용해 버퍼 (PerkinElmer) 6ul로 세포를 용해시켰다. 상기 용해물을 900rpm으로 10분 동안 실온(RT)에서 진탕하였다. 인산화된 STAT5를 pSTAT5 AlphaLisa 키트 (PerkinElmer)를 통해 측정하였다. 새롭게 제조된 수용체 비드 혼합물을 녹색 필터된 <100 lux 광 하에 용해물 (5μL) 상에 분배하였다. 플레이트를 900rpm에서 2분 동안 진탕하고, 간단하게 스핀다운시키고, 어두운 곳에서 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 공여체 비드를 녹색 필터된 <100 lux 광 하에 분배하였다 (5μL). 플레이트를 900rpm에서 2분 동안 진탕하고, 간단하게 스핀다운시키고, 어두운 곳에서 RT에서 밤새 인큐베이션하였다. 녹색 필터된 <100 lux 광 하에 EnVision 플레이트 리더 (PerkinElmer)를 사용하여 689 nm에서 여기 (excitation) 및 570 nm에서 방출(emission)로 발광을 측정하였다.
IL-2에 반응하는 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해, pSTAT5에 결합하는 비드의 평균 방출 강도를 인간 T 세포주에서 측정하였다. 화합물 농도에 대한 신호 강도의 억제 곡선 분석으로부터 IC50 값을 결정하였다. 데이터는 pIC50 값 (IC50의 음의 십진 로그값) (평균 ± 표준 편차)으로 표시하였다.
인 비트로 분석 결과
Figure pct00025
분석법 3: 폐 조직에서 IL-13 유발 pSTAT6 유도의 뮤린 (마우스) 모델
IL-13은 천식의 병태생리학에 기초가 되는 중요한 시토킨이다 (Kudlacz et al. Eur. J. Pharmacol, 2008, 582,154-161). IL-13은 Janus 패밀리 키나제 (JAK)의 구성원을 활성화하는 세포 표면 수용체에 결합하고, 그 다음에 STAT6을 인산화하고, 그 후에 추가의 전사 경로를 활성화한다. 기재된 모델에서, IL-13의 용량을 마우스 폐에 국소로 전달하여 STAT6의 인산화를 유도하고 (pSTAT6), 그런 다음 이를 종말점 (endpoint)으로서 측정하였다.
Harlan의 성체 balb/c 마우스를 본 분석에 사용하였다. 연구 당일에, 동물을 이소플루란으로 가볍게 마취시키고, 비히클 또는 시험 화합물 (1 mg/mL, 몇 번의 호흡을 통해 총 부피 50 μL)을 구강 흡인(aspiration)을 통해 투여하였다. 동물들을 투여 후에 측면 횡와위 (lateral recumbency)로 놓고, 이들의 홈 케이지로 복귀시키기 전에 마취로부터의 완전한 회복을 모니터하였다. 4시간 후에, 동물을 다시 한번 간단히 마취시키고, 비히클 또는 IL-13 (전달된 총 용량 0.03 μg, 총 부피 50 μL)을 구강 흡인으로 챌린지한 후, 마취로부터의 회복을 모니터하고, 그 후 이들의 홈 케이지로 복귀시켰다. 비히클 또는 IL-13을 투여하고 1시간 후에, Perkin Elmer AlphaLISA® SureFire® Ultra™ HV p-STAT6 (Tyr641) 분석 키트를 사용하여 폐 균질액 내 pSTAT6의 검출 및 폐 및 혈장 내의 총 약물 농도 분석을 위해 전혈 및 폐를 수집하였다. 혈액 샘플을 4℃에서 대략 12,000 rpm으로 4분 동안 원심분리하여 (Eppendorf centrifuge, 5804R) 혈장을 수집하였다. 폐를 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 헹구고, 패드 건조하고, 순간 동결하고, 칭량하고, HPLC 물 중 0.1% 포름산에서 1:3으로 희석하여 균질화하였다. 시험 화합물의 혈장 및 폐 수준은 시험 매트릭스에서 표준 곡선으로 구성된 분석 표준에 대해 LC-MS 분석에 의해 결정하였다. 폐 대 혈장 비율은 5시간에서 ng/g 단위의 폐 농도 대 ng/mL 단위의 혈장 농도의 비율로서 결정하였다.
상기 모델에서의 활성은 처리된 동물의, 비히클로 처리되고 IL-13으로 챌린지된 대조군 동물과 비교 시, 폐에 존재하는 pSTAT6의 5시간에서의 수준의 감소로 입증되었다. 비히클로 처리되고 IL-13으로 챌린지된 대조군 동물과, 비히클로 처리되고 비히클로 챌린지된 대조군 동물 간의 차이는 임의의 주어진 실험에서 각각 0% 및 100%의 억제 효과로 나타내었다. 화합물 1은 하기에 기록된 바와 같이 IL-13으로 챌린지하고 5시간 후에 STAT6 인산화의 억제를 나타내었다.
Figure pct00026
마우스 폐에서의 화합물의 유의한 농도의 관찰은 관찰된 IL-13 유발 pSTAT6 유도 억제는 시험 화합물의 활성의 결과이었음을 확인하였다. 5시간에서 폐 대 혈장 비율은 화합물 1이 마우스의 혈장에 노출된 것보다 폐에서 유의하게 더 많이 노출되었음을 보여주었다.
분석법 4: 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 TSLP-유발 TARC 방출의 억제
흉선 기질상 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLP) 및 흉선 및 활성화-조절 케모킨(thymus and activation-regulated chemokine, TARC)는 천식 환자의 기도에서 과발현되고, 질병 중증도와 관련이 있다. 폐에서, TSLP는 알레르겐 및 바이러스 감염에 반응하여 기관지상피 세포에 의해 방출될 수 있다. TSLP는 상피 세포, 내피 세포, 호중구, 대식세포 및 비만 세포를 포함한 광범위한 조직 및 세포 타입에서 발견되는 IL-7Rα/TSLPR 이종이합체를 통해 신호를 전달한다. TSLP의 이의 수용체에의 결합은 JAK1 및 JAK2를 활성화하여, STAT3 및 STAT5를 포함한 다양한 전사 인자를 인산화시키는 구조적 변화를 유도한다. 면역 세포에서, 이는 세포 증식, 항-아폽토시스, 수지상 세포 이동, 및 Th2 시토킨 및 케모킨의 생성을 초래하는 일련의 세포내 이벤트를 유발한다. 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)에서, TSLP는 화학유인제 TARC에 의해 매개되는 과정인, 골수성 수지상 세포를 활성화하여 T 세포를 유인 및 자극함으로써 염증유발 효과를 갖는다.
본 분석에서, TSLP 자극은 PBMC로부터 TARC 방출을 유도하고, 이러한 반응은 화합물로 치료할 때 용량-의존적 방식으로 약화됨을 보여주었다. TARC 방출 억제에 대해 시험 화합물의 효능을 측정하였다.
3 내지 5명의 공여자로부터의 PBMC 알리코트 (사전에 전혈로부터 분리하고, 알리코트로 -80℃에서 동결)를 37℃에서 해동하고, 50 mL Falcon 튜브에 있는 40 mL의 예열된 멸균-여과된, 완전 RPMI 배지에 적가하였다. 세포를 펠렛화하고, 완전 배지에 2.24Х106 세포/mL로 재현탁하였다. 조직 배양 처리된 96-웰 평면 바닥 마이크로플레이트에서 웰 (well)당 85 μL (190,000개 세포)로 세포를 시딩하였다. 세포를 5% CO2로 37℃에서 1시간 동안 방치하였다.
DMSO 중 10 mM 스톡 용액으로 화합물을 수득하였다. 3.7-배 계열 희석을 수행하여 DMSO 중에 시험 화합물의 9개의 농도를 300X의 최종 분석 시험 농도로 생성하였다. 완전 배지에서 150-배 중간 희석을 수행하여 0.2% DMSO로 2X의 최종 분석 시험 농도로 화합물을 생성하였다. 1시간의 방치 기간 후에, 33.33 μM 내지 0.95 μM의 최종 분석 농도 범위를 위해, PBMC의 각 웰에 95 μL의 2X 화합물을 부가하였다. 완전 배지 중 95 μL의 0.2% DMSO를 미처리 대조군 웰에 부가하였다. 세포를 자극하기 전에 5% CO2와 함께 37℃에서 1시간 동안 화합물로 사전-처리하였다.
재조합 인간 TSLP 단백질을 0.1% BSA를 가진 멸균 DPBS 중에 10 μg/mL로 재구성하고, 알리코트로 -20℃에서 보관하였다. 사용 직전에, 알리코트를 해동하고, 완전 배지에서 20X의 최종 분석 농도로 제조하였다. 10 ng/mL의 최종 분석 농도를 위해, 10 μL의 20X TSLP를 PBMC의 각 웰에 부가하였다. 10 μL의 완전 배지를 비자극된 대조군 웰에 부가하였다. 세포를 화합물의 존재하에 37℃에서 48시간 동안 5% CO2와 함께 자극하였다.
자극 후에, 세포 배양 상등액을 수확하고, TARC 수준을 제조자의 지침에 따라 인간 CCL17/TARC Quantikine ELISA 키트 (R&D Systems #DDN00)를 사용하여, 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)으로 검출하였다.
용량 반응 분석을 위해, log[시험 화합물 (M)]을 각 공여자에 대한 반응값 백분율에 대해 플롯팅하였고, IC50 값은 가변 경사를 가진 4-파라미터 시그모이드 용량-반응 알고리즘 (4-parameter sigmoidal dose-response algorithm)을 사용하는 GraphPad Prism 소프트웨어로 비선형 회귀 분석을 사용하여 결정하였다. 데이터는 개별 공여자의 pIC50 값으로부터 계산된 평균 pIC50 (음의 십진 로그 IC50) 값으로 표시하고, 소수점 첫째 자리로 반올림하였다. 원래 화합물 및 그들의 des-플루오로 변형 유사체에 의한 억제 효능 값을 하기 표 7에 요약하였다.
Figure pct00027
분석법 5: 폐 S9 대사
화합물 1 및 C-1의 in vitro 대사 안정성을 인간 폐 S9 분획(1 μM 화합물, 1 mg/mL S9 단백질)에서 평가하였다. 시간 0, 15, 30 및 60분 샘플을 고분해능 LC-MS/MS로 모 화합물에 대해 분석했다. 인간의 폐 S9 분획(로트 1410245)은 XenoTech LLC(Lenexa, KS)에서 구입하였다. NADPH(Sigma Aldrich, N1630) 및 3-phosphoadenosine 5-phosphosulfate(PAPS)(Sigma Aldrich, A1651)는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 아세토니트릴과 물은 VWR(Radnor, PA)에서 얻었고 HPLC 등급 이상이었다. 랄록시펜(raloxifene)과 포름산은 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. S9 인큐베이션은 96-웰 폴리프로필렌 플레이트의 37℃ 수조에서 수행되었다. 폐 S9 용액은 1mM NADPH(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 3mM 염화마그네슘(Sigma Aldrich, M1028)이 보충된 pH 7.4로 완충된 100mM 인산칼륨(BD Biosciences, Woburn, MA)으로 구성되었고 100μM PAPS(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 보조인자가 존재하며, 최종 인큐베이션 단백질 농도는 1mg/mL이다. 랄록시펜(n=1) 및 화합물(n=1)의 10mM DMSO 스톡을 버퍼에 희석하고 인큐베이션에 넣어 1μM 기질 농도(0.001% DMSO v/v)를 생성했다. 인큐베이션 부피는 400μL로 구성되었고 시점은 0, 15, 30 및 60분에 70μL 알리코트를 제거하고 140μL 아세토니트릴(0% 포름산)으로 희석하여 측정했다. 모든 샘플을 5℃에서 10분 동안 2250g에서 원심분리했다. 원심분리된 샘플에서 상등액(50μL)을 취하여 내부 표준(internal standard)을 함유하는 100μL HPLC 물에 희석했다. 샘플은 Dionex Ultimate 3000 자동 샘플러에서 실행되었으며 Atlantis T3 column 3μM - 2.1 x 50 mm (Waters Inc., 186003717)과 함께 Thermo Q-Exactive 고분해능 질량 분광계 (Thermo, Waltham, MA)을 Full Scan mode로 사용하여 분석하였다. 이동상 A는 물 + 0.2% 포름산으로 구성되었고 이동상 B는 아세토니트릴 + 0.2% 포름산으로 구성되었다. 피크 통합(Peak integration)은 Gubbs GMSU 소프트웨어(Gubbs Inc., Alpharetta, GA)를 사용하여 수행되었다. 각 샘플에 대해 피크 면적 비율은 분석물 피크 면적을 내부 표준 피크 면적으로 나누어 계산했다. 각 인큐베이션에 대해 각 t0에서 분석물의 피크 면적 비율을 100%로 설정하고 60-분 샘플의 피크 면적 비율을 해당 t0에 대한 나머지 백분율로 변환했다. 황산염 대사 산물 형성의 결정은 과거 내부 데이터를 기반으로 각 모(parent) 화합물의 O-황산염 대사 산물에 해당하는 모 이온 채널의 조기-용리(early-eluting) 피크를 관찰하여 정성적으로 이루어졌다. 상기 분석에 대한 결과를 하기 표 8에 요약하였다 (n=2 반복).
Figure pct00028
상응하는 플루오로 유사체(화합물 C-1)와 비교할 때, 화합물 1은 상당히 더 적은 황산화 대사를 일으켰다.
분석법 6: 마우스의 혈장 및 폐에서 약동학
시험 화합물의 혈장 및 폐 농도 및 그의 비율은 하기 방식으로 결정되었다. Charles River Laboratories의 BALB/c 마우스를 본 분석에 사용하였다. 시험 화합물은 농도 0.2 mg/mL로 pH 4 시트레이트 버퍼 중 20% 프로필렌 글리콜에서 개별적으로 제제화하고, 50 μL의 투여 용액을 마우스의 기도로 구강 흡인에 의해 도입하였다. 투여후 다양한 시점 (전형적으로 0.167, 2, 6, 24시간)에서, 혈액 샘플을 심장 천자를 통해 꺼내고, 온전한 폐를 마우스로부터 절제하였다. 혈액 시료를 4℃에서 대략 12,000 rpm으로 4분 동안 원심분리하여 (Eppendorf centrifuge, 5804R) 혈장을 수집하였다. 폐를 패드 건조하고, 칭량하고, 멸균수 중에 1:3 으로 희석하여 균질화하였다. 시험 화합물의 혈장 및 폐 농도는 시험 매트릭스의 표준 곡선으로 구축된 분석용 표준에 대해 LC-MS 분석으로 결정하였다. 폐-대-혈장 비율은 μg hr/g의 폐 AUC 대 μg hr/g의 혈장 AUC의 비율로서 결정하고, 여기서 AUC는 통상적으로 시험 화합물 농도 대 시간의 곡선 아래 면적으로 정의된다.
Figure pct00029
분석법 7: 인간 3D 기도 배양물 중 IFNγ 및 IL-27 유도된 케모킨 CXCL9 및 CXCL10의 억제
EpiAirway 조직 배양물을 Mattek (AIR-100)으로부터 입수하였다. 배양물은 천식 공여체로부터 유래되었다. 세포 배양 인서트에서, 인간 유래 기관/기관지 상피 세포를 증식시키고, 다공성 멤브레인 서포트에서 분화시켜서 세포 아래로는 가온된 배양 배지 및 위로는 기체성 시험 대기를 갖는 공기-액체 계면을 허용하였다. 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 유지 배지 (Mattek, AIR-100-MM) 중에 조직을 배양하였다. 4개의 공여체를 시험하였다. 0일 차에, 조직 배양물을 10μM, 1μM 및/또는 0.1μM의 시험 화합물로 액체 계면에서 처리하였다. 화합물 1을 디메틸 술폭시드 (DMSO, Sigma)에서 희석하여 최종 농도 0.1%로 하였다. 0.1%의 DMSO를 비히클 대조군으로 사용하였다. 화합물 1을 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 배양물과 인큐베이션하고, 최종 농도 100ng/ml로 IFNγ (R&D Systems) 또는 IL-27 (R&D Systems)를 함유하는 사전-가온된 배지를 부가하였다. 조직 배양물을 8일 동안 유지하였다. 배지는 화합물 1 및 IFNγ 또는 IL-27을 함유하는 신선한 배지로 2일마다 교체하였다. 8일 차에, 분석을 위해 조직 배양물 및 상등액을 수집하였다. CXCL10 (IP-10) 및 CXCL9 (MIG)에 대해 luminex 분석 (EMD Millipore)을 사용하여 상등액 시료를 분석하였다. 데이터는 % 억제 +/- 표준 편차 (±STDV)로 나타내었다. 억제 백분율은 비히클 처리된 세포와 비교하여 IFNγ 또는 IL-27 유도된 CXCL10 또는 CXCL9 분비에 대한 화합물의 억제효능 통해 결정하였다. 데이터는 4개의 공여체로부터의 평균이다. 화합물 1은 IFNγ 유도된 CXCL10 분비를 비히클 대조군과 비교할 때 100% ±1.0 (10μM에서), 76% ±13 (1μM에서) 및 18% ±22 (0.1μM에서) 만큼 억제할 수 있다. 화합물 1은 IFNγ 유도된 CXCL9 분비를 비히클과 비교할 때 100% ±0.1 (10μM에서), 93% ±6.9 (1μM에서) 및 16% ±41 (0.1μM에서) 만큼 억제할 수 있다. 화합물 1은 IL-27 유도된 CXCL10 분비를 비히클 대조군과 비교할 때 100% ±0.0 (10μM에서), 98% ±1.0 (1μM에서) 및 25% ±26 (0.1μM에서) 만큼 억제할 수 있다. 화합물 1은 IL-27 유도된 CXCL9 분비를 비히클 대조군과 비교할 때 100% ±0.0 (10μM에서), 97% ±2.0 (1μM에서) 및 52% ±18 (0.1μM에서) 만큼 억제할 수 있다.
분석법 8: 세포 JAK 효능 분석: IFNγ-유도된 pSTAT1의 억제
인터페론 감마 (IFNγ) 자극된 STAT1 인산화 억제에 대한 화합물 1의 효능은 유세포 측정기를 사용하여 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 유래된 CD14-포지티브 (CD14+) 단핵구 (monocytes)에서 측정하였다. IFNγ는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 측정을 제공한다.
단핵구는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate: FITC) 접합된 항-CD14 항체 (Clone RM052, Beckman Coulter)를 사용하여 동정하였고, Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT1 항체 (pY701, Clone 4a, BD Biosciences)는 STAT1 인산화를 검출하는데 사용하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 ficoll 구배를 사용하여 건강한 공여체의 인간 전혈로부터 분리되었다. 37 ℃, 5 % CO2 가습 인큐베이터에서, 10 % 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2 mM Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI (Life Technologies) 중에서 세포를 배양하였다. 세포를 배지 (200 μL) 중에 250,000 세포/웰로 시딩하고, 2시간동안 배양하고, 다양한 농도의 시험 화합물을 함유하는 분석 배지 (50 μL) (0.1 % 우혈청 알부민 (Sigma), 2 mM lutamax, 25 mM HEPES 및 1X Penstrep이 보충된 RPMI)에 재현탁하였다. 상기 화합물을 DMSO에서 계열 희석하고, 그 다음에 배지에서 1000-배 더 희석하여 최종 DMSO 농도를 0.1 %로 하였다. 시험 화합물 희석물을 세포와 37 ℃, 5 % CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 사전-가온된 배지 (50μL) 중 IFNγ (R&D Systems)를 최종 농도 0.6　ng/mL로 30분 동안 부가하였다. 시토킨 자극 후에, 세포를 사전-가온된 고정 용액 (100 μL) (BD　Biosciences)으로 10분 동안 37 ℃, 5 % CO2에서 고정시키고, FACS 버퍼 (1mL) (PBS 중 1% BSA)로 2회 세척하고, 1:10의 항-CD14 FITC:FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하고, 4 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 한번 세척하고, 그 다음에 빙냉한 Perm 버퍼 III (BD Biosciences) (100 μL)에 4 ℃에서 30분 동안 재현탁하였다. 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척하고, 그 다음에 30분 동안 실온의 어두운 곳에서 1:10의 항-pSTAT1 Alexa Fluor 647:FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하고, FACS 버퍼에서 2회 세척하고, MACSQuant 유세포 측정기 (Miltenyi)를 사용하여 분석하였다.
시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, pSTAT1의 중간 형광세기 (median fluorescent intensity, MFI)를 CD14+ 단핵구에서 측정하였다. IC50 값은 MFI 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십의 로그 IC50) 값으로 나타내었다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 약 7.5를 나타내었다.
분석법 9: 세포 JAK 효능 분석: GM-CSF-유도된 pSTAT5의 억제
과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 자극된 STAT5 인산화 억제에 대한 화합물 1의 효능은 유세포 측정기를 사용하여 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 유래된 CD14-포지티브 (CD14+) 단핵구 (monocytes)에서 측정하였다. GM-CSF는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 측정을 제공한다.
단핵구는 fluorescein isothiocyanate (fluorescein isothiocyanate: FITC) 접합된 항-CD14 항체 (Clone RM052, Beckman Coulter)를 사용하여 동정하였고, Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT5 항체 (pY694, BD Biosciences)는 STAT5 인산화를 검출하는데 사용하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 ficoll 구배를 사용하여 건강한 공여체의 인간 전혈로부터 분리되었다. 37 ℃, 5 % CO2 가습 인큐베이터에서, 10 % 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2 mM Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI (Life Technologies) 중에서 세포를 배양하였다. 세포를 배지 (200 μL) 중에 250,000 세포/웰로 시딩하고, 2시간 동안 배양하고, 다양한 농도의 시험 화합물을 함유하는 분석 배지 (50 μL) (0.1 % 우혈청 알부민 (Sigma), 2 mM Glutamax, 25 mM HEPES 및 1X Penstrep이 보충된 RPMI)에 재현탁하였다. 상기 화합물을 DMSO에서 계열 희석하고, 그 다음에 배지에서 1000-배 더 희석하여 최종 DMSO 농도를 0.1 %로 하였다. 시험 화합물 희석물을 세포와 37 ℃, 5 % CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 사전-가온된 배지 (50μL) 중 GM-CSF (R&D Systems)를 최종 농도 0.3　ng/mL로 15분 동안 부가하였다. 시토킨 자극 후에, 세포를 사전-가온된 고정 용액 (100 μL) (BD　Biosciences)으로 10분 동안 37 ℃, 5 % CO2에서 고정시키고, FACS 버퍼 (1mL) (PBS 중 1% BSA)로 2회 세척하고, 1:10의 항-CD14 FITC:FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하고, 4 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 한번 세척하고, 그 다음에 빙냉한 Perm 버퍼 III (BD Biosciences) (100 μL)에 4 ℃에서 30분 동안 재현탁하였다. 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척하고, 그 다음에 30분 동안 실온의 어두운 곳에서 1:10의 항-pSTAT1 Alexa Fluor 647:FACS 버퍼 (100 μL)에 재현탁하고, FACS 버퍼에서 2회 세척하고, MACSQuant 유세포 측정기 (Miltenyi)를 사용하여 분석하였다.
시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, pSTAT5의 중간 형광세기 (median fluorescent intensity, MFI)를 CD14+ 단핵구에서 측정하였다. IC50 값은 MFI 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십의 로그 IC50) 값으로 나타내었다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 약 6.9를 나타내었다.
분석법 10: 세포 JAK 효능 분석: IL-12--유도된 pSTAT4의 억제
인터루킨-12 (IL-12) 자극된 STAT4 인산화 억제에 대한 화합물 1의 효능은 유세포 측정기를 사용하여 인간 전혈 (Stanford Blood Center)로부터 유래된 CD3-포지티브 (CD3+) T 세포에서 측정하였다. IL-12 는 JAK를 통해 신호를 전달하기 때문에, 본 분석은 JAK 세포 효능의 측정을 제공한다.
CD3+ T 세포는 phycoerythrin (PE) 접합된 항-CD3 항체 (clone UCHT1, BD Biosciences)를 사용하여 동정하였고, Alexa Fluor 647 접합된 항-pSTAT4 항체 (clone 38/p-Stat4, BD Biosciences)는 STAT4 인산화를 검출하는데 사용하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 ficoll 구배를 사용하여 건강한 공여체의 인간 전혈로부터 분리되었다. 37 ℃, 5 % CO2 가습 인큐베이터에서, 10 % 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2 mM Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies), 1X Pen/Strep (Life Technologies), 플레이트 결합된 정제된 항-CD3 항체 (5μg/ml, clone UCHT1, BD Biosciences) 및 용해성 항-CD28 항체 (1μg/ml, clone CD28.2, BD Biosciences)가 보충된 RPMI (Life Technologies) 중에서 세포를 배양하였다. 세포를 수확하고, 배지로 세척한 다음 인터루킨-2 (IL-2, 10ng/ml, R&D Systems)를 함유하는 배지에서 재현탁하였다. 세포를 3일동안 37℃, 5 % CO2의 가습 인큐베이터에서 배양하였다. 세포를 수확하고, RPMI로 세척하고, 배지 (200 μL) 중에 250,000 세포/웰로 시딩하고, 2시간 동안 배양하고, 다양한 농도의 시험 화합물을 함유하는 분석 배지 (50 μL) (0.1 % 우혈청 알부민 (Sigma), 2 mM Glutamax, 25 mM HEPES 및 1X Penstrep이 보충된 RPMI)에 재현탁하였다. 상기 화합물을 DMSO에서 계열 희석하고, 그 다음에 배지에서 1000-배 더 희석하여 최종 DMSO 농도를 0.1 %로 하였다. 시험 화합물 희석물을 세포와 37 ℃, 5 % CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 그 다음에 사전-가온된 배지 (50μL) 중 IL-12 (R&D Systems)를 최종 농도 10ng/mL로 30분 동안 부가하였다. 시토킨 자극 후에, 세포를 사전-가온된 고정 용액 (100 μL) (BD　Biosciences)으로 10분 동안 37 ℃, 5 % CO2에서 고정시키고, FACS 버퍼 (1mL) (PBS 중 1% BSA)로 2회 세척하고, 빙냉한 Perm 버퍼 III (1000 μL) (BD Biosciences) 에서 4 ℃에서 30분 동안 재현탁하였다. 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척하고, 그 다음에 45분 동안 실온의 어두운 곳에서 항-CD3 PE (1:50 희석) 및 항-pSTAT4 Alexa Fluor 647 (1:10 희석) 을 함유하는 FACS 버퍼 (100 μL) 에 재현탁하였다. 인큐베이션 후, 세포를 MACSQuant 유세포 측정기 (Miltenyi)를 사용하여 분석하기 전에 FACS 버퍼에서 2회 세척하였다. 시험 화합물의 억제 효능을 결정하기 위해서, pSTAT4의 중간 형광세기 (MFI)를 CD3+ T 세포에서 측정하였다. IC50 값은 MFI 대 화합물 농도의 억제 곡선 분석으로부터 결정하였다. 데이터는 pIC50 (음의 십의 로그 IC50) 값으로 나타내었다. 화합물 1은 본 분석에서 pIC50 값이 약 6.0를 나타내었다.
분석법 11: 혼합 립프구 반응 분석 내 IFNγ 분비 억제
혼합 림프구 반응 분석은 이식 거부반응을 모방하는 인-비트로(in-vitro) 분석이다. 한 공여체 유래 T 세포를 다른 공여체 유래 동종 수지상 세포와 배양한다. 이러한 반응은 IFNγ 분비와 같은 세포 면역 반응을 유도한다.
CD14+ 단핵구는 ficoll 구배 및 자기 분리(CD14 마이크로비드, Miltenyi)를 사용하여 공여체 A의 인간 전혈(Stanford blood center)에서 단리되었다. 단핵구는 세포를 10% 우태아 혈청(FBS, Life Technologies), 2mM Glutamax(Life Technologies), 1X Pen/Strep(Life Technologies), 인터루킨-4 (IL-4, 50ng/ml, R&D Systems), 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF, 50ng/ml, R&D Systems)가 보충된 RPMI(Life Technologies)에서 6일동안 37 ℃, 5 % CO2 가습 인큐베이터에서 배양하여 수지상 세포로 분화되었다. 수지상 세포를 수확하고 배지로 세척한 다음 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 대장균의 지질다당류(LPS, 100ng/ml, Sigma)를 함유하는 배지에서 세포를 배양하여 활성화했다. 세포를 수확하고, 배지로 세척하고, 400,000 세포/ml로 배지 중에서 재현탁하고 10,000 세포/well/25μl로 도말하였다. CD4+ T세포는 ficoll 구배 및 자기 분리(CD4+ T세포 분리 키트, Miltenyi)를 사용하여 공여체 B의 인간 전혈(Stanford blood center)에서 새롭게 단리되었다. 10 % 우태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 2 mM Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) 및 1X Pen/Strep (Life Technologies)이 보충된 RPMI (Life Technologies) 중에서 T 세포를 4,000,000 세포/ml로 재현탁하였다. CD4+ T 세포를 수지상 세포와 100,000 세포/웰/25㎕로 혼합하였다. 세포를 시험 화합물(20μM, 2μM 및/또는 0.2μM에서 50μl)로 처리하여 최종 농도가 10μM, 1μM 및/또는 0.1μM이 되도록 하였다. 화합물 1을 디메틸 술폭시드 (DMSO, Sigma)에서 희석하여 최종 농도 0.1%로 하였다. 0.1%의 DMSO를 비히클 대조군으로 사용하였다. 세포를 5일동안 37℃, 5 % CO2의 가습 인큐베이터에서 유지하였다. 5일째에 상등액을 수집하고 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 인터페론 감마(INFγ)에 대해 측정했다. 억제 백분율은 비히클 처리된 세포와 비교한 IFNγ 분비에 대한 화합물의 억제 효능을 통해 결정하였다. 데이터는 4개의 공여체로부터의 평균이다. 화합물 1은 비히클 대조군과 비교하여 IFNγ 분비를 99% ±0.4 (10μM에서), 76% ±10 (μM에서) 및 43% ±12 (0.1μM에서) 만큼 억제할 수 있었다.
분석법 12: 천식 공여체로부터 유래한 인간 3D 기도 배양물에서 자발적 페리오스틴(periostin) 및 IL-6 분비 억제
EpiAirway 조직 배양물을 Mattek (AIR-100)으로부터 입수하였다. 세포는 Th2 매개 천식(호산구성)과 관련된 세포기질 단백질(matricellular protein)인 페리오스틴과 Th2 및 비-Th2 관련 천식 모두에서 역할을 하는 염증성 사이토카인인 인터루킨-6(IL-6)을 자발적으로 분비하는 천식 공여체로부터 유래되었다. 세포 배양 인서트에서, 인간 유래 기관/기관지 상피 세포를 증식시키고, 다공성 멤브레인 서포트에서 분화시켜서 세포 아래로는 가온된 배양 배지 및 위로는 기체성 시험 대기를 갖는 공기-액체 계면을 허용하였다. 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 유지 배지 (Mattek, AIR-100-MM) 중에 조직을 배양하였다. 4개의 공여체를 시험하였다. 0일 차에, 조직 배양물을 10μM, 1μM 및/또는 0.1μM의 시험 화합물로 액체 계면에서 처리하였다. 화합물 1을 디메틸 술폭시드 (DMSO, Sigma)에서 희석하여 최종 농도 0.1%로 하였다. 0.1%의 DMSO를 비히클 대조군으로 사용하였다. 조직 배양물을 8일 동안 유지하였다. 배지는 화합물 1을 함유하는 신선한 배지로 2일 마다 교체하였다. 8일째에 분석을 위해 상등액을 수집했다. 페리오스틴 및 인터루킨-6 (IL-6)에 대해 luminex 분석 (EMD Millipore)을 사용하여 상등액 시료를 분석하였다. 데이터는 % 억제 +/- 표준 편차 (±STDV)로 나타내었다. 억제 백분율은 비히클 처리된 세포와 비교한 자발적인 페리오스틴 및 IL-6 분비에 대한 화합물의 억제 효능을 통해 결정하였다. 데이터는 3 또는 4개의 공여체로부터의 평균이다. 화합물 1은 비히클 대조군에 비해 자발적 페리오스틴 분비를 62% ±25 (10μM에서) 및40% ±28 (1μM에서) 만큼 억제할 수 있었다. 화합물 1은 비히클에 비해 자발적 IL-6 분비를 91% ±9.0 (10μM에서), 70% ±33 (1μM에서) 및 10% ±40 (0.1μM에서)만큼 억제할 수 있었다.
결정 구조
2.28Å의 분해능에서 인간 JAK1에 결합된 화합물 C-1의 공결정 구조를 얻었다. 리간드는 ATP 결합 부위에 결합하는 것으로 관찰되었다. 7개의 특정 수소 결합 상호작용은 공여(donor) 원자와 수용(acceptor) 원자 사이의 3.5 Å 이하의 거리를 기준으로 확인되었다. 특히, C-1의 화합물의 환외(exocyclic) 아미드의 카르보닐과 JAK1의 Arg879 측쇄 사이에 수소 결합 상호작용이 확인되었다. 초기 모델링 연구에서, 이러한 상호작용은, 다른 티로신 키나제보다 JAK1에 선택성을 제공하는 방법으로서 제안되었으며, 이는 다른 밀접하게 관련된 키나제(예: TRKA, VEGFR, ABL1)가 동등한 위치에 아르기닌 잔기를 보유하지 않기 때문이다. 결정 구조에서 수소 결합 상호작용 및 환외 아미드를 보유하지 않은 시리즈와 비교하여 개선된 키놈(kinome) 선택성에 대한 관찰된 결과는 이러한 설계 가설을 검증한다.
본 개시가 그의 특정 양상 또는 구체예를 참조하여 기술되었지만, 본 개시의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있거나 균등물이 대체될 수 있다는 것이 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 또한, 적용 가능한 특허 법령 및 규정에서 허용하는 범위 내에서, 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각 문서가 개별적으로 본원에 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 전체가 참조로 통합된다.

Claims (44)

  1. 하기 화학식 1의 화합물의 결정성 수화물로서:
    Figure pct00030

    상기 결정성 수화물은 분말 X-선 회절 패턴이 5.68±0.20, 10.43±0.20, 10.94±0.20, 및 13.08±0.20의 2θ 값에서 회절 피크를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 결정성 수화물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 분말 X-선 회절 패턴은 8.49±0.20의 2θ 값에서 하나의 추가 회절 피크를 갖는 것을 추가적 특징으로 하는 것인, 결정성 수화물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 분말 X-선 회절 패턴은 11.55±0.20, 12.20±0.20, 17.06±0.20, 및 26.29±0.20로부터 선택되는 2θ 값에서 2 이상의 추가 회절 피크를 갖는 것을 추가적 특징으로 하는 것인, 결정성 수화물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 분말 X-선 회절 패턴은 11.55±0.20, 12.20±0.20, 17.06±0.20, 및 26.29±0.20의 2θ 값에서 추가 회절 피크를 갖는 것을 추가적 특징으로 하는 것인, 결정성 수화물.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정성 수화물은 피크 위치가 도 1에 도시된 패턴의 피크 위치와 실질적으로 일치하는 분말 X-선 회절 패턴을 특징으로 하는 것인, 결정성 수화물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정성 수화물은 분당 10　℃의 가열 속도에서 기록되는 시차 주사 열량 분석법 트레이스(differential scanning calorimetry trace)가 212.4±3　℃의 온도에서 최대 흡열 열 흐름(endothermic heat flow)을 나타내는 것을 특징으로 하는 것인, 결정성 수화물.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정성 수화물은 시차 주사 열량 분석법 트레이스가 도 2에 도시된 것과 실질적으로 일치하는 것을 특징으로 하는 것인, 결정성 수화물.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정성 수화물은 1수화물인 것인 결정성 수화물.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 결정성 수화물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  10. 하기 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 결정성 수화물을 제조하는 방법:
    (a) (S)-(3-(디메틸아미노)아제티딘-1-일)(2-(6-(2-에틸-4-히드록시페닐)-1H-인다졸-3-일)-5-이소프로필-4,5,6,7-테트라히드로-3H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일)메타논을 알코올 용매에 55℃ ±10℃에서 용해시켜 용액을 제공하는 단계;
    (b) (a)단계에서 수득한 용액을 10℃ ±10℃ 로 냉각시켜 현탁제를 생성하는 단계;
    (c) 비활성 기체 조건 하, (b)단계의 현탁제로부터 고체를 분리하는 단계;
    (d) (c)단계에서 수득한 고체를 60℃ ±15℃에서 건조시키는 단계; 및
    (e) (d)단계에서 수득한 고체를 주위 습도 및 온도 조건에 두어 결정성 수화물을 제공하는 단계.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 알코올 용매는 메탄올 또는 에탄올인 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 호흡기 질환을 치료하기 위한 것인 결정성 수화물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 낭포성 섬유증, 폐렴, 특발성 폐섬유증, 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 사르코이드증(sarcoidosis), 호산구성 질환, 연충 감염, 폐 동맥 고혈압, 림프관평활근종증, 기관지확장증, 침윤성 폐질환, 약물-유발성 폐렴, 진균 유발성 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 과민성 폐렴, 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증, 특발성 급성 호산구성 폐렴, 특발성 만성 호산구성 폐렴, 과호산구성 증후군, 뢰플러 증후군(L
    Figure pct00031
    ffler syndrome), 폐쇄세기관지 기질화 폐렴, 폐 이식편-대-숙주 질환, 및 면역-관문-억제제 유발성 폐렴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 결정성 수화물.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식인 것인 결정성 수화물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 천식은 중등도(moderate) 내지 중증(severe) 천식인 것인 결정성 수화물.
  16. 청구항 12에 있어서, 상기 결정성 수화물은 약학적 조성물 내에서 흡입 투여되는 것인 결정성 수화물.
  17. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 폐 이식 거부반응을 예방 또는 지연시키기 위한 것인 결정성 수화물.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 원발성 이식 기능장애 (primary graft dysfunction), 기질화 폐렴, 급성 거부반응, 림프구성 세기관지염, 및 만성 폐 동종이식 기능장애로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 결정성 수화물.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 급성 폐 이식 거부반응인 것인 결정성 수화물.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 만성 폐 동종이식 기능장애인 것인 결정성 수화물.
  21. 청구항 17에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 폐쇄세기관지염, 제한적 만성 폐 동종이식 기능장애, 및 호중구성 동종이식 기능장애로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 결정성 수화물.
  22. 청구항 17에 있어서, 상기 결정성 수화물은 약학적 조성물 내에서 흡입 투여되는 것인 결정성 수화물.
  23. 포유동물에서의 호흡기 질환 치료용 의약 제조에 있어서, 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 결정성 수화물의 용도.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 낭포성 섬유증, 폐렴, 특발성 폐섬유증, 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 사르코이드증(sarcoidosis), 호산구성 질환, 연충 감염, 폐 동맥 고혈압, 림프관평활근종증, 기관지확장증, 침윤성 폐질환, 약물-유발성 폐렴, 진균 유발성 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 과민성 폐렴, 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증, 특발성 급성 호산구성 폐렴, 특발성 만성 호산구성 폐렴, 과호산구성 증후군, 뢰플러 증후군, 폐쇄세기관지 기질화 폐렴, 폐 이식편-대-숙주 질환, 및 면역-관문-억제제 유발성 폐렴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  25. 청구항 23에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식인 것인 용도.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 천식은 중등도 내지 중증 천식인 것인 용도.
  27. 청구항 23에 있어서, 상기 의약은 흡입 투여되는 것인 용도.
  28. 포유동물에서의 폐 이식 거부반응 예방 또는 지연용 의약 제조에 있어서, 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 결정성 수화물의 용도.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 원발성 이식 기능장애, 기질화 폐렴, 급성 거부반응, 림프구성 세기관지염, 및 만성 폐 동종이식 기능장애로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 급성 폐 이식 거부반응인 것인 용도.
  31. 청구항 28에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 만성 폐 동종이식 기능장애인 것인 용도.
  32. 청구항 28에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 폐쇄세기관지염, 제한적 만성 폐 동종이식 기능장애, 및 호중구성 동종이식 기능장애로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  33. 청구항 28에 있어서, 상기 의약은 흡입 투여되는 것인 용도.
  34. 포유동물에서 호흡기 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 결정성 수화물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 낭포성 섬유증, 폐렴, 특발성 폐섬유증, 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군, 기관지염, 폐기종, 사르코이드증, 호산구성 질환, 연충 감염, 폐 동맥 고혈압, 림프관평활근종증, 기관지확장증, 침윤성 폐질환, 약물-유발성 폐렴, 진균 유발성 폐렴, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 과민성 폐렴, 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증, 특발성 급성 호산구성 폐렴, 특발성 만성 호산구성 폐렴, 과호산구성 증후군, 뢰플러 증후군, 폐쇄세기관지 기질화 폐렴, 폐 이식편-대-숙주 질환, 및 면역-관문-억제제 유발성 폐렴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 청구항 34에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식인 것인 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 천식은 중등도 내지 중증 천식인 것인 방법.
  38. 청구항 34에 있어서, 상기 약학적 조성물은 흡입 투여되는 것인 방법.
  39. 포유동물에서 폐 이식 거부반응을 예방 또는 지연하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 결정성 수화물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 원발성 이식 기능장애, 기질화 폐렴, 급성 거부반응, 림프구성 세기관지염, 및 만성 폐 동종이식 기능장애로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 청구항 39에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 급성 폐 이식 거부반응인 것인 방법.
  42. 청구항 39에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 만성 폐 동종이식 기능장애인 것인 방법.
  43. 청구항 39에 있어서, 상기 폐 이식 거부반응은 폐쇄세기관지염, 제한적 만성 폐 동종이식 기능장애, 및 호중구성 동종이식 기능장애로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 청구항 39에 있어서, 상기 약학적 조성물은 흡입 투여되는 것인 방법.



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