ES2955717T3 - Amidas heterocíclicas de 5 a 7 elementos como inhibidores de JAK - Google Patents

Amidas heterocíclicas de 5 a 7 elementos como inhibidores de JAK Download PDF

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Cameron Smith
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Abstract

La invención proporciona compuestos de fórmula (I) donde las variables se definen en la especificación, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, que son útiles como inhibidores de la quinasa JAK. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos y métodos para usar dichos compuestos para tratar enfermedades respiratorias. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Amidas heterocíclicas de 5 a 7 elementos como inhibidores de JAK
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La invención se refiere a compuestos que resultan útiles como inhibidores de la quinasa JAK. La invención se refiere, además, a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos y a métodos de utilización de dichos compuestos para el tratamiento de enfermedades respiratorias.
Estado de la técnica
El asma es una enfermedad crónica de las vías respiratorias para la que no hay prevención ni cura. La enfermedad se caracteriza por inflamación, fibrosis, hipersensibilidad y remodelado de las vías respiratorias, la totalidad de los cuales contribuyen a la limitación del flujo de aire. Se estima que 300 millones de personas sufren de asma en todo el mundo y que este número crecerá en más de 100 millones para el 2025. En los Estados Unidos, el asma afecta a aproximadamente 6 % a 8 % de la población, convirtiéndolo en una de las enfermedades crónicas más comunes en el país. Aunque la mayoría de pacientes puede conseguir un control de los síntomas del asma mediante el uso de corticoesteroides inhalados que pueden combinarse con un modificador del leucotrieno y/o un agonista beta de acción prolongada, sigue existiendo un subgrupo de pacientes con asma grave cuya enfermedad no se puede controlar con las terapias convencionales. El asma persistente grave se define como una enfermedad que sigue incontrolada bajo dosis elevadas de corticoesteroides inhalados. Aunque los/las asmáticos/as con la enfermedad grave constituyen aproximadamente el 5 % de todos los afectados por asma, presentan un riesgo alto de morbilidad y mortalidad y son responsables de una parte desproporcionada de uso de recursos sanitarios respecto al resto de asmáticos. Sigue existiendo una necesidad de nuevas terapias para tratar estos pacientes.
Las citoquinas son moléculas de señalización intercelular entre las que se incluyen quimioquinas, interferones, interleuquinas, linfoquinas y factores de necrosis tumoral. Las citoquinas resultan cruciales para el crecimiento celular y la inmunorregulación normales, aunque también están detrás de las enfermedades inmunomediadas y contribuyen al crecimiento de células malignas. Se han relacionado los niveles elevados de muchas citoquinas con la patología inflamatoria del asma. Por ejemplo, se ha demostrado que las terapias basadas en anticuerpos con diana en las interleuquinas (IL)-5 y 13 proporcionan un beneficio clínico en subgrupos de pacientes de asma grave. Entre las citoquinas implicadas en la inflamación del asma, muchas actúan a través de rutas de señalización que dependen de la familia Janus de tirosina quinasas (JAK, por sus siglas en inglés), que señaliza mediante la familia de transductores de señales y activadores de transcripción (STAT, por sus siglas en inglés) de factores de transcripción. Entre las citoquinas implicadas en la inflamación del asma que señalizan a través de la ruta de JAK-STAT se incluyen IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, linfopoyetina estromal tímica (TSLP, por sus siglas en inglés), interferón-γ (IFNγ) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).
La familia JAK comprende cuatro miembros: JAK1, JAK2, JAK3 y la tirosina quinasa 2 (TYK2). La unión de las citoquinas a un receptor de citoquina dependiente de JAK induce la dimerización del receptor, lo que resulta en la fosforilación de los residuos de tirosina en la JA0K quinasa, produciendo la activación de la JAK. Las JAK fosforiladas, a su vez, se unen y fosforilan diversas proteínas STAT, que se dimerizan, se internalizan en el núcleo celular y modulan directamente la transcripción génica, conduciendo, entre otros efectos, a efectos cadena abajo asociados a enfermedad inflamatoria. Las JAK habitualmente se asocian con receptores de citoquina en pares, en forma de homodímeros o heterodímeros. Se asocian citoquinas específicas en emparejamientos de JAK específicos. Cada uno de los cuatro miembros de la familia JAK participa en la señalización de por lo menos una de las citoquinas asociadas a la inflamación del asma. En consecuencia, un inhibidor químico con pan-actividad contra todos los miembros de la familia JAK podría modular un amplio abanico de rutas proinflamatorias que contribuyen al asma grave.
Sin embargo, el amplio efecto antiinflamatorio de dichos inhibidores podría suprimir la función normal de las células inmunitarias, posiblemente conduciendo a un riesgo incrementado de infección. Se han observado pruebas de un riesgo de infección incrementado en el caso del inhibidor de JAK tofacitinib, que se administra por vía oral para el tratamiento de la artritis reumatoide. En el asma, la inflamación se localiza en el tracto respiratorio. La inflamación de las vías respiratorias es característica de otras enfermedades respiratorias además del asma. Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística (FQ), neumonitis, enfermedades pulmonares intersticiales (incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática), lesión pulmonar aguda, síndrome del distrés respiratorio agudo, bronquitis, enfisema y sarcoidosis, y también enfermedades del tracto respiratorio en las que se cree que la fisiopatología está relacionada con citoquinas señalizadoras de JAK. La administración local de un inhibidor de JAK en los pulmones mediante inhalación ofrece el potencial de resultar terapéuticamente eficaz al administrar un potente agente anticitoquina directamente en el sitio de acción, limitando la exposición sistémica y, por lo tanto, limitando el potencial de una inmunosupresión sistémica adversa. Sigue existiendo la necesidad de un inhibidor de JAK potente que resulte adecuado para la administración local en los pulmones para el tratamiento de enfermedades respiratorias.
Las citoquinas de señalización de JAK también desempeñan un papel importante en la activación de los linfocitos T, un subtipo de células inmunitarias que es crucial para muchos procesos inmunitarios. La activación patológica de los linfocitos T es crítica en la etiología de múltiples enfermedades respiratorias. Las células T autorreactivas desempeñan una función en la bronquiolitis obliterante con neumonía organizada (también denominada BONO). De manera similar la BONO, la etiología de los rechazos del trasplante de pulmón se relaciona con una activación aberrante de los linfocitos T del receptor inducida por el pulmón trasplantado del/de la donante. Los rechazos del trasplante pulmonar pueden producirse precozmente, en forma de disfunción primaria del injerto (DPI), neumonía organizada (NO), rechazo agudo (RA), bronquiolitis linfocítica (BL) o pueden producirse años después del trasplante pulmonar, en forma de disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (DCIP). La DCIP se conocía anteriormente como bronquiolitis obliterante (BO), aunque actualmente se considera un síndrome que puede presentar diferentes manifestaciones patológicas, incluyendo la BO, DCIP restrictiva (DCIPr o RAS) y disfunción neutrofílica del alotrasplante. La disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (DCIP) es un reto importante en la gestión a largo plazo de los receptores de trasplante pulmonar, ya que causa que el pulmón trasplantado pierda funcionalidad progresivamente (Gauthier et al., Curr. Transplant. Rep., 2016, 3(3), 185-191). La DCIP responde mal al tratamiento y, por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de compuestos eficaces capaces de prevenir o tratar esta afección. Varias citoquinas dependientes de JAK, tales como IFNγ e IL-5 están reguladas positivamente en la DCIP y el rechazo del trasplante pulmonar (Berastegui et al., Clin. Transplant.2017, 31, e12898). Además, se asocian niveles pulmonares elevados de quimioquinas CXCR3, tales como CXCL9 y CXCL10, que están cadena abajo de la señalización de IFN dependiente de JAK, a resultados peores en pacientes de trasplante pulmonar (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). Se ha demostrado que la inhibición sistémica de JAK resulta eficaz en el rechazo del trasplante renal (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). Por lo tanto, los inhibidores de JAK presentan el potencial de resultar eficaces en el tratamiento o prevención del rechazo del trasplante pulmonar y la DCIP. Varios eventos similares de activación de los linfocitos T descritos como la base para el rechazo del trasplante pulmonar también se consideran el inductor principal de la enfermedad del injerto pulmonar contra el huésped (EICH), que puede ocurrir posteriormente al trasplante de células madre hematopoyéticas. De manera similar a la DCIP, la EICH pulmonar es una afección progresiva crónica con resultados extremadamente malos y actualmente no se dispone de ningún tratamiento aprobado. Un estudio multicéntrico retrospectivo mediante cuestionarios de 95 pacientes con EICH aguda o crónica refractaria a esteroides que habían recibido el inhibidor de JAK sistémico ruxolitinib como terapia de último recurso mostraron una respuesta completa o parcial al ruxolitinib en la mayoría de pacientes, incluyendo aquellos/as con EICH pulmonar (Zeiser et al., Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). Debido a que la inhibición sistémica de JAK se asocia a acontecimientos adversos graves y un índice terapéutico pequeño, sigue existiendo una necesidad de un inhibidor de JAK no sistémico dirigido al pulmón e inhalado para prevenir y/o tratar el rechazo del trasplante pulmonar o la EICH pulmonar.
Las solicitudes de patente internacional n.º WO 2017/077288 y n.º WO 2017/077283 describe derivados 4,5,6,7-tetrahidroimidazopiridina y 1,4,5,6,7,8-hexahidroimidazoazepina como inhibidores de quinasa Janus. La solicitud de patente internacional n.º WO 2018/165395 describe derivados 4,5,6,7-tetrahidroimidazopiridina como inhibidores de quinasa Janus.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención proporciona nuevos compuestos que presentan actividad como inhibidores de quinasa JAK.
De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000003_0001
en la que:
A es un anillo heterociclilo monocíclico de 6 a 7 elementos que contiene dos átomos de nitrógeno, en el que A está conectada al grupo carbonilo en (I) mediante un átomo de nitrógeno; A está sustituida con 1 a 3 grupos R2 y, opcionalmente, dos grupos R2 forman un anillo puenteado con -(CH2) con A, o
A es pirrolidinilo, en el que el pirrolidinilo está conectado al grupo carbonilo en (I) mediante un átomo de nitrógeno y en el que el pirrolidinilo está sustituido con NR3R4;
R1 es alquilo C1-3,
cada R2 es, independientemente, alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH,
R3 es alquilo C1-3,
y R4 es alquilo C1-3,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La invención proporciona, además, una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona, además, un compuesto de la invención tal como se indica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de enfermedad respiratoria, en particular, asma o DCIP, en un mamífero, en el que el método comprende administrar en el mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, o de una composición farmacéutica de la invención.
La invención proporciona, además, un compuesto de la invención tal como se indica en la presente memoria para la utilización en terapia médica, así como la utilización de un compuesto de la invención en la preparación de una formulación o medicamento para el tratamiento de enfermedades respiratorias en un mamífero.
Descripción detallada de la invención
En una realización, la invención proporciona nuevos compuestos que presentan actividad como inhibidores de quinasa JAK. De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000004_0001
en la que:
A es un anillo heterociclilo monocíclico de 6 a 7 elementos que contiene dos átomos de nitrógeno, en el que A está conectada al grupo carbonilo en (I) mediante un átomo de nitrógeno; A está sustituida con 1 a 3 grupos R2 y, opcionalmente, dos grupos R2 forman un anillo puenteado con -(CH2) con A, o
A es pirrolidinilo, en el que el pirrolidinilo está conectado al grupo carbonilo en (I) mediante un átomo de nitrógeno y en el que el pirrolidinilo está sustituido con NR3R4;
R1 es alquilo C1-3,
cada R2 es, independientemente, alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH,
R3 es alquilo C1-3,
y R4 es alquilo C1-3,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el compuesto (I) presenta la fórmula (I'):
Figure imgf000004_0002
En algunas realizaciones, R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo, propilo e isopropilo.
En algunas realizaciones, A se selecciona del grupo que consiste en piperazinilo, 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptanilo y 1,4-diazacicloheptanilo, cada uno de los cuales está sustituido con 1 o 2 grupos R2, en el que cada R2 es, independientemente, alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH o A es pirrolidinilo sustituido con NR3R4, en el que R3 es alquilo C1-3 y R4 es alquilo C1-3.
En algunas realizaciones, A se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000005_0001
en la que R2 es alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH, R3 es alquilo C1-3 y R4 es alquilo C1-3. En otra realización, la invención proporciona un compuesto de fórmula:
Figure imgf000005_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, la invención proporciona un compuesto de fórmula:
Figure imgf000005_0003
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, la invención proporciona un compuesto de fórmula:
Figure imgf000005_0004
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, la invención proporciona un compuesto de fórmula:
Figure imgf000005_0005
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, la invención proporciona un compuesto de fórmula:
Figure imgf000006_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, la invención proporciona un compuesto de fórmula:
Figure imgf000006_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra realización, la exposición proporciona un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000006_0003
en la que:
R1 es alquilo C1-3,
A1 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000006_0004
en el que R2 es alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula (II) presenta la fórmula (II'):
Figure imgf000006_0005
En algunas realizaciones, R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo y propilo.
En algunas realizaciones, A1 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000007_0001
En algunas realizaciones, A1 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000007_0002
y R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo y propilo.
En otra realización, la exposición proporciona un compuesto de fórmula (III):
Figure imgf000007_0003
en la que:
R1 es alquilo C1-3,
A2 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000007_0004
en la que R2 es, independientemente, alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH, R3 es alquilo C1-3 y R4 es alquilo C1-3,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula (III) presenta la fórmula (III'):
Figure imgf000007_0005
En algunas realizaciones, R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo, isopropilo y propilo.
En algunas realizaciones, A2 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000008_0001
En algunas realizaciones, R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo, isopropilo y propilo, y A2 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000008_0002
En otra realización, la exposición proporciona un compuesto de fórmula (IV):
Figure imgf000008_0003
en la que:
R1 es alquilo C1-3,
A3 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000008_0004
en la que R2 es, independientemente, alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH, R3 es alquilo C1-3 y R4 es alquilo C1-3,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula (IV) presenta la fórmula (IV'):
Figure imgf000008_0005
En algunas realizaciones, R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo, isopropilo y propilo.
En algunas realizaciones, A3 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000008_0006
En algunas realizaciones, R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo, isopropilo y propilo, y A3 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0001
Además, la parte imidazo de la fracción tetrahidroimidazopiridina existe en formas tautoméricas, ilustradas posteriormente para un fragmento de los compuestos de la exposición.
Figure imgf000009_0002
Según la convención de la IUPAC, dichas representaciones dan lugar a una numeración diferente de los átomos de la parte imidazol: (1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (estructura A) vs. (1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina (estructura B). Se entenderá que, aunque se muestran las estructuras, o se denominan, en una forma particular, la invención también incluye el tautómero de las mismas.
Los compuestos de la exposición pueden contener uno o más centros quirales y, por lo tanto, dichos compuestos (e intermediarios de los mismos) pueden existir en forma de mezclas racémicas, estereoisómeros puros (es decir, enantiómeros o diastereómeros), mezclas enriquecidas en esteroisómeros y similares. Los compuestos quirales mostrados o denominados en la presente memoria sin una estereoquímica definida en un centro quiral pretenden incluir todos y cada una de las posibles variaciones de estereoisómero en el estereocentro no definido, a menos que se indique de otro modo. La representación o denominación de un estereoisómero particular significa que el estereocentro indicado presenta la estereoquímica designada en el entendido que también pueden encontrarse presentes cantidades menores de otros estereoisómeros, a menos que se indique lo contrario, con la condición de que la utilidad del compuesto representado o denominado no resulte eliminada por la presencia de otro estereoisómero.
Los compuestos de la exposición pueden contener, además, varios grupos básicos (p. ej., grupos amino) y, por lo tanto, dichos compuestos pueden existir en forma de base libre o en diversas formas salinas, tales como una forma de sal monoprotonada, una forma de sal diprotonada, una forma de sal triprotonada, o mezclas de las mismas. La totalidad de dichas formas está comprendida dentro del alcance de la presente invención, a menos que se indique lo contrario.
La presente invención incluye, además, compuestos marcados isotópicamente de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) y (IV'), es decir, compuestos de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) y (IV') en donde uno o más átomos han sido sustituidos o enriquecidos con un átomo que presenta el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica que predominan naturalmente. Entre los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en un compuesto de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) y (IV') se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O y 18O. Resultan de particular interés los compuestos de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) y (IV') enriquecidos en tritio o carbono-14, los cuales pueden utilizarse, por ejemplo, en estudios de distribución en los tejidos. También resultan de particular interés los compuestos de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) y (IV') enriquecidos en deuterio, especialmente en un sitio del metabolismo en el que se espera que los compuestos presenten una mayor estabilidad metabólica. Adicionalmente resultan de particular interés los compuestos de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) y (IV') enriquecidos en un isótopo emisor de positrones, tal como 11C, 15O y 13N, los cuales pueden utilizarse en, por ejemplo, estudios de tomografía de emisión de positrones.
Definiciones
Al describir la presente invención, incluyendo sus diversos aspectos y realizaciones, los términos siguientes presentan los significados siguientes, a menos que se indique lo contrario.
El término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo saturado monovalente que puede ser lineal o ramificado, o una combinación de los mismos. A menos que se defina lo contrario, dichos grupos alquilo habitualmente contienen entre 1 y 10 átomos de carbono. Entre los grupos alquilo representativos se incluyen, a título de ejemplo, metilo (Me), etilo (Et), n-propilo (n-Pr) o (nPr), isopropilo (i-Pr) o (iPr), n-butilo (n-Bu) o (nBu), sec-butilo, isobutilo, terc-butilo (t-Bu) o (tBu), n-pentilo, n-hexilo, 2,2-dimetilpropilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2-etilbutilo, 2,2-dimetilpentilo, 2-propilpentilo y similares.
En el caso de que un número específico de átomos de carbono está destinado a un término particular, se muestra el número de átomos de carbono precediendo al término. Por ejemplo, el término "alquilo C1-3" se refiere a un grupo alquilo con 1 a 3 átomos de carbono, en el que los átomos de carbono se encuentran en cualquier configuración químicamente aceptable, incluyendo configuraciones lineales o ramificadas.
El término "cicloalquilo" se refiere a un grupo carbocíclico saturado monovalente que puede ser monocíclico o multíciclico. A menos que se defina lo contrario, dichos grupos cicloalquilo habitualmente contienen entre 3 y 10 átomos de carbono. Entre los grupos cicloalquilo representativos se incluyen, a título de ejemplo, ciclopropilo (cPr), ciclobutilo (cBu), ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, adamantilo y similares.
El término "cpropilo" significa ciclopropilo.
El término "heterociclilo", "heterociclo", "heterocíclico" o "anillo heterocíclico" significa un grupo no aromático cíclico saturado o parcialmente insaturado monovalente, con 3 a 10 átomos anulares en total, en el que el anillo contiene entre 2 y 9 átomos anulares de carbono y entre 1 y 4 heteroátomos anulares seleccionados de entre nitrógeno, oxígeno y azufre. Los grupos heterocíclicos pueden ser monocíclicos o multicíclicos (es decir, fusionados o puenteados). Entre los grupos heterociclilo representativos se incluyen, a título de ejemplo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, imidazolidinilo, morfolinilo, tiomorfolilo, indolín-3-ilo, 2-imidazolinilo, tetrahidropiranilo, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolín-2-ilo, quinuclidinilo, 7-azanorbornanilo, nortropanilo y similares, en los que el punto de unión se encuentra en cualquier átomo anular de carbono o nitrógeno disponible. En donde el contexto hace que el punto de unión del grupo heterocíclico resulte evidente, dichos grupos alternativamente pueden denominarse especies no valentes, es decir, pirrolidina, piperidina, piperazina, imidazol, tetrahidropirano, etc.
El término "halo" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para llevar a cabo el tratamiento al administrarla en un paciente que requiere tratamiento.
El término "tratar" o "tratamiento" significa prevenir, mejorar o suprimir la afección médica, enfermedad o trastorno bajo tratamiento (p. ej., una enfermedad respiratoria) en un paciente (particularmente un ser humano), o aliviar los síntomas de la afección médica, enfermedad o trastorno.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que resulta aceptable para la administración en un/a paciente o en un mamífero, tal como un ser humano (p. ej., sales que presentan seguridad de mamífero para un régimen posológico dado). Entre las sales farmacéuticamente aceptables representativas se incluyen sales de ácido acético, ascórbico, bencenosulfónico, benzoico, canforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, edisílico, fumárico, gentísico, glucónico, glucurónico, glutámico, hipúrico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, naftalenosulfónico, naftaleno-1,5-disulfónico, naftaleno-2,6-disulfónico, nicotínico, nítrico, orótico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenosulfónico y xinafoico, y similares.
La expresión "sal de los mismos" se refiere a un compuesto formado en el caso de que el hidrógeno de un ácido se sustituya por un catión, tal como un catión metálico o un catión orgánico, y similar. Por ejemplo, el catión puede ser una forma protonada de un compuesto de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) o (IV'), es decir, una forma en que uno o más grupos amino han sido protonados por un ácido. Habitualmente, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable, aunque ello no resulta necesario para sales de compuestos intermediarios que no están destinados a la administración en un/a paciente.
Procedimientos sintéticos generales.
Los compuestos de la presente invención, e intermediarios de los mismos, pueden prepararse según los métodos y procedimientos generales siguientes utilizando materiales de partida y reactivos disponibles comercialmente o preparados rutinariamente. Los sustituyentes y variables (p. ej., A, R1, R2, R3, etc.) utilizados en los esquemas siguientes presentan los mismos significados que los definidos en otros sitios de la presente memoria, a menos que se indique lo contrario. Además, pueden utilizarse compuestos que presentan un átomo o grupo funcional ácido o básico, o pueden producirse en forma de una sal, a menos que se indique lo contrario (en algunos casos, el uso de una sal en una reacción particular requerirá la conversión de la sal en una forma no salina, p. ej., una base libre, utilizando procedimientos rutinarios antes de llevar a cabo la reacción).
Aunque puede mostrarse o describirse una realización particular de la presente invención en los procedimientos siguientes, el experto en la materia reconocerá que también pueden prepararse otras realizaciones o aspectos de la presente invención utilizando dichos procedimientos o mediante la utilización de otros métodos, reactivos y materiales de partida conocidos por el experto en la materia. En particular, se apreciará que los compuestos de la invención pueden prepararse mediante una diversidad de rutas de procedimiento en las que se combinan los reactivos en diferentes órdenes para proporcionar intermediarios diferentes en el camino de producción de los productos finales.
En el Esquema a continuación se ilustra un método general de preparación de compuestos finales de la invención.
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Se hizo reaccionar el compuesto K-18 con una cetona o aldehído en presencia de un agente reductor, proporcionando el compuesto de fórmula K-19. A continuación, se hizo reaccionar el compuesto K-19 con amina A bajo condiciones normales de formación de enlace amida, proporcionando el compuesto (I). Habitualmente, se pone en contacto ácido carboxílico con aproximadamente 1 a aproximadamente 4 equivalentes de amina A en presencia de un exceso de base. La reacción de formación de enlace amida puede utilizar agentes de acoplamiento, tales como hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronio (HATU, por sus siglas en inglés) u otros agentes de acoplamiento de amida conocidos de la técnica. Puede añadirse hidrazina para escindir productos secundarios no deseados. La reacción se lleva a cabo normalmente a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas, o hasta que la reacción se haya completado sustancialmente.
Composiciones farmacéuticas.
Los compuestos de la invención y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se utilizan normalmente en la forma de una composición o formulación farmacéutica. Dichas composiciones farmacéuticas. pueden administrarse ventajosamente en el paciente mediante inhalación. Además, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante cualquier vía de administración aceptable, incluyendo, aunque sin limitación, los modos de administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo transdérmica) y parenteral.
De acuerdo con lo anterior, en uno de sus aspectos de composición, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y un compuesto de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) o (IV'), en el que, tal como se ha definido anteriormente, "compuesto de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) o (IV')" se refiere a un compuesto de fórmula (I), (I'), (II), (II'), (III), (III'), (IV) o (IV') o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Opcionalmente, dichas composiciones farmacéuticas pueden contener otros agentes terapéuticos y/o de formulación, si se desea. Al comentar las composiciones y usos de las mismas, el "compuesto de la invención" también puede denominarse en la presente memoria como "agente activo". Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "compuesto de la invención" pretende incluir todos los compuestos comprendidos en la fórmula (I), así como las especies realizadas en la fórmula (I) y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas.
Las composiciones farmacéuticas de la invención normalmente contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención. Sin embargo, el experto en la materia reconocerá que una composición farmacéutica puede contener más de una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, composiciones en masa, o menos de una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, dosis unitarias individuales diseñadas para la administración múltiple a fin de conseguir una cantidad terapéuticamente eficaz.
Habitualmente, dichas composiciones farmacéuticas contendrán entre aproximadamente 0,01 % y aproximadamente 95 % en peso del agente activo, incluyendo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,05 % y aproximadamente 30 % en peso, y entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 10 % en peso del agente activo.
Puede utilizarse cualquier portador o excipiente convencional en las composiciones farmacéuticas. de la invención. La elección de un portador o excipiente particular, o combinaciones de portadores o excipientes, dependerán del modo de administración que se utilice para tratar un paciente particular o tipo de afección médica o estado de enfermedad. A este respecto, la preparación de una composición farmacéutica adecuada para un modo particular de administración se encuentra perfectamente comprendida dentro del alcance de los conocimientos del/de la experto/a en las técnicas farmacéuticas. Además, los portadores o excipientes utilizados en las composiciones farmacéuticas. de la presente invención se encuentran disponibles comercialmente. A título de ilustrativo adicional, las técnicas de formulación convencionales se describen en Remington: The Science y Practice of Pharmacy, 20a edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000) y H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms y Drug Delivery Systems, 7a edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).
Entre los ejemplos representativos de materiales que pueden servir de portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, azúcares, tales como lactosa, glucosa y sucrosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa, tal como celulosa microcristalina y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras supositorias; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones tampón de fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas utilizadas en composiciones farmacéuticas.
Se preparan habitualmente composiciones farmacéuticas mediante la mezcla a fondo e íntima o la combinación del agente activo con un portador farmacéuticamente aceptable, y uno o más ingredientes opcionales. La mezcla uniformemente mezclada resultante a continuación puede conformarse o cargarse en comprimidos, cápsulas, píldoras y similares, utilizando procedimientos y equipos convencionales.
En un aspecto, la composición farmacéutica resulta adecuada para la administración inhalada. Las composiciones farmacéuticas para la administración inhalada normalmente están en la forma de un aerosol o unos polvos. Dichas composiciones se administran generalmente utilizando dispositivos inhaladores de administración, tales como un inhalador de polvos secos (IPS), un inhalador de dosis medidas (IDM), un inhalador-nebulizador o un dispositivo de administración similar.
En una realización particular, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación utilizando un inhalador de polvos secos. Dichos inhaladores de polvos secos normalmente administran la composición farmacéutica en forma de unos polvos de flujo libre que se dispersan en el flujo de aire de un/a paciente durante la inspiración. Con el fin de conseguir una composición de polvos de flujo libre, el agente terapéutico normalmente se formula con un excipiente adecuado, tal como lactosa, almidón, manitol, dextrosa, ácido poliláctico (PLA), poliláctido-co-glicólido (PLGA) o combinaciones de los mismos. Habitualmente, el agente terapéutico se microniza y se combina con un portador adecuado para formar una composición adecuada para la inhalación.
Una composición farmacéutica representativa para la utilización en un inhalador de polvos secos comprende lactosa y un compuesto de la invención en forma micronizada. Dicha composición de polvos secos puede prepararse, por ejemplo, mediante combinación de lactosa molida seca con el agente terapéutico y mezclando en seco seguidamente los componentes. A continuación, la composición se carga habitualmente en un dispensador de polvos secos o en cartuchos o cápsulas para inhalación para la utilización con un dispositivo de administración de polvos secos.
Los dispositivos inhaladores de administración de polvos secos adecuados para administrar agentes terapéuticos mediante inhalación se describen en la técnica y se encuentran disponibles comercialmente ejemplos de dichos dispositivos. Por ejemplo, entre los dispositivos o productos inhaladores de administración de polvos secos representativos se incluyen Aeolizer (Novartis); Airmax (IVAX); ClickHaler (Innovata Biomed); Diskhaler (GlaxoSmithKline); Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline); Ellipta (GlaxoSmithKline); Easyhaler (Orion Pharma); Eclipse (Aventis); FlowCaps (Hovione); Handihaler (Boehringer Ingelheim); Pulvinal (Chiesi); Rotahaler (GlaxoSmithKline); SkyeHaler/Certihaler (SkyePharma); Twisthaler (Schering-Plough); Turbuhaler (AstraZeneca); Ultrahaler (Aventis); y similares.
En otra realización particular, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación utilizando un inhalador de dosis medidas. Dichos inhaladores de dosis medida normalmente descargan una cantidad medida de un agente terapéutico utilizando un gas propelente comprimido. De acuerdo con lo anterior, las composiciones farmacéuticas administradas utilizando un inhalador de dosis medidas habitualmente comprenden una solución o suspensión del agente terapéutico en un propelente licuado. Puede utilizarse cualquier propelente licuado adecuado, incluyendo hidrofluoroalcanos (HFA), tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134a) y 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propano (HFA 227) y clorofluorocarburos, tales como CCl3F. En una realización particular, el propelente es un hidrofluoroalcano. En algunas realizaciones, la formulación de hidrofluoroalcano contiene un cosolvente, tal como etanol o pentano, y/o un surfactante, tal como trioletato de sorbitán, ácido oleico, lecitina y glicerina.
Una composición farmacéutica representativa para la utilización en un inhalador de dosis medida comprende entre aproximadamente 0,01 % y aproximadamente 5 % en peso de un compuesto de la invención; entre aproximadamente 0 % y aproximadamente 20 % en peso de etanol, y entre aproximadamente 0 % y aproximadamente 5 % en peso de surfactante, en el que el resto es un propelente de HFA. Dichas composiciones se preparan habitualmente mediante la adición de hidrofluoroalcano frío o presurizado en un recipiente adecuado que contiene el agente terapéutico, etanol (en caso de estar presente) y el surfactante (en caso de estar presente). Para preparar una suspensión, el agente terapéutico se microniza y después se combina con el propelente. A continuación, la composición se carga en un cartucho de aerosol, que normalmente forma una parte de un dispositivo inhalador de dosis medida.
Los dispositivos inhaladores de dosis medida para la administración de agentes terapéuticos mediante inhalación se describen en la técnica y los ejemplos de dichos dispositivos se encuentran disponibles comercialmente. Por ejemplo, entre los dispositivos inhaladores o productos de dosis medida representativos se incluyen AeroBid Inhaler System (Forest Pharmaceuticals); Atrovent Inhalation Aerosol (Boehringer Ingelheim); Flovent (GlaxoSmithKline); Maxair Inhaler (3M); Proventil Inhaler (Schering); Serevent Inhalation Aerosol (GlaxoSmithKline); y similares.
En otro aspecto particular, la composición farmacéutica se administra mediante inhalación utilizando un inhaladornebulizador. Dichos dispositivos nebulizadores habitualmente producen una corriente de aire a alta velocidad que causa que la composición farmacéutica se pulverice en forma de una niebla que resulta arrastrada hasta el interior del tracto respiratorio del/de la paciente. De acuerdo con lo anterior, al formularlo para el uso en un inhalador-nebulizador, el agente terapéutico puede disolverse en un portador adecuado para formar una solución. Alternativamente, el agente terapéutico puede micronizarse o nanomolerse y combinarse con un portador adecuado para formar una suspensión. Una composición farmacéutica representativa para la utilización en un inhalador-nebulizador comprende una solución o suspensión que comprende entre aproximadamente 0,05 µg/ml y aproximadamente 20 mg/ml de un compuesto de la invención y excipientes compatibles con las formulaciones nebulizadas. En una realización, la solución presenta un pH de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 8.
Los dispositivos nebulizadores para la administración de agentes terapéuticos mediante inhalación se describen en la técnica y los ejemplos de dichos dispositivos se encuentran disponibles comercialmente. Por ejemplo, entre los dispositivos nebulizadores o productos representativos se incluyen el inhalador Respimat Softmist (Boehringer Ingelheim); el sistema de administración pulmonar AERx (Aradigm Corp.); el nebulizador reutilizable PARI LC Plus (Pari GmbH) y similares.
En todavía otro aspecto, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse alternativamente en una forma de administración destinada a la administración oral. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral pueden encontrarse en la forma de cápsulas, comprimidos, píldoras, pastillas, cápsulas, grageas, polvos y gránulos; o en forma de una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o en forma de una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite; o en forma de un elixir o jarabe, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como ingrediente activo.
En el caso de que esté destinada a la administración oral en una forma de administración sólida, la composición farmacéutica de la invención normalmente comprende el agente activo y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato sódico o fosfato dicálcico. Opcional o alternativamente, dichas formas de administración sólidas pueden comprender, además, agentes de carga o extensores, ligantes, humectantes, agentes retardantes de solución, aceleradores de absorción, agentes humectantes, absorbentes, lubricantes, agentes colorantes y agentes tamponadores. También pueden encontrarse presentes en las composiciones farmacéuticas. de la invención, agentes de liberación, agentes humectantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes.
Entre las formulaciones alternativas se pueden incluir, además, formulaciones de liberación controlada, formas de administración líquidas para la administración oral, parches transdérmicos y formulaciones parenterales. Los excipientes y métodos convencionales de preparación de dichas formulaciones alternativas se describen en, por ejemplo, la referencia de Remington, supra.
Los ejemplos no limitativos a continuación ilustran composiciones farmacéuticas representantes de la presente invención.
Composición de polvos secos.
Un compuesto micronizado de fórmula (I) (1 g) se combina con lactosa molida (25 g). A continuación, la mezcla combinada se carga en blísteres individuales de un paquete blíster pelable en una cantidad suficiente para proporcionar entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 4 mg del compuesto de fórmula I en cada dosis. El contenido de los blísteres se administra mediante la utilización de un inhalador de polvos secos.
Composición de polvos secos.
Se combina un compuesto micronizado de fórmula (I) (1 g) con lactosa molida (20 g) para formar una composición en masa que presenta una proporción en peso de compuesto a lactosa molida de 1:20. La composición combinada se empaqueta en un dispositivo de inhalación de polvos secos capaz de administrar entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 4 mg del compuesto de fórmula I en cada dosis.
Composición de inhalador de dosis medida.
Se dispersó un compuesto micronizado de fórmula (I) (10 g) en una solución preparada mediante disolución de lecitina (0,2 g) en agua desmineralizada (200 ml). La suspensión resultante se secó mediante pulverización y después se micronizó para formar una composición micronizada que comprendía partículas con un diámetro medio inferior a aproximadamente 1,5 µm. A continuación, se cargó la composición micronizada en cartuchos de inhalador de dosis medida que contenían 1,1,1,2-tetrafluoroetano presurizado en una cantidad suficiente para proporcionar entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 4 mg del compuesto de fórmula I por dosis al administrarlo mediante el inhalador de dosis medida.
Composición para nebulizador.
Se disolvió un compuesto de fórmula (I) (25 mg) en una solución que contenía 1,5 a 2,5 equivalentes de ácido clorhídrico, seguido de la adición de hidróxido sódico para ajustar el pH a un valor entre 3,5 y 5,5 y 3 % en peso de glicerol. La solución se sometió a agitación hasta que todos los componentes estuviesen disueltos. La solución se administró mediante la utilización de un dispositivo nebulizador que proporciona entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 4 mg del compuesto de fórmula (I) en cada dosis.
Utilidad.
Los inhibidores de JAK de la invención se han diseñado para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y fibróticas del tracto respiratorio. En particular, los compuestos se han diseñado para permitir la administración de un potente agente anticitoquina directamente en el sitio de acción de la enfermedad respiratoria en el pulmón, limitando simultáneamente la exposición sistémica.
Se ha mostrado que los compuestos de la invención son inhibidores potentes de la familia JAK de enzimas: JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Además, los compuestos han demostrado una potente inhibición de las citoquinas proinflamatorias y profibróticas. Se ha reconocido que el amplio efecto antiinflamatorio de los inhibidores de JAK podría suprimir la función normal de las células inmunitarias, posiblemente conduciendo a un riesgo incrementado de infección. Por lo tanto, los presentes compuestos se han optimizado para limitar la absorción por el pulmón hacia el plasma, minimizando de esta manera el riesgo de inmunosupresión.
Tal como se explica en la sección experimental, posteriormente, la absorción y distribución de los compuestos habituales se ha perfilado en ensayos preclínicos. Se sometieron a ensayo los compuestos 1 a 6 en ratones y mostraron a las 5 horas de la administración, una concentración elevada en el tejido pulmonar y una baja absorción hasta el plasma. Se ha mostrado que los compuestos de la invención inhiben el efecto de la citoquina proinflamatoria IL-13 en tejido pulmonar de ratón. Específicamente, los compuestos han demostrado inhibir la fosforilación inducida por IL-13 de STAT6 en tejido pulmonar, lo que proporciona pruebas del acoplamiento in vivo con la diana JAK localmente en el pulmón. Se ha observado dicho efecto al administrar la citoquina proinflamatoria IL-13 cuatro horas después de la administración del compuesto de ensayo, proporcionando pruebas adicionales de retención significativa en el pulmón.
Se ha demostrado que los compuestos sometidos a ensayo muestran tanto una potente actividad inhibidora al nivel celular como una retención significativa en el tejido pulmonar. Una amplia investigación por los presentes inventores ha determinado que, aunque resulta posible identificar compuestos que son potentes al nivel celular o compuestos que muestran una retención significativa en el pulmón, resulta mucho más difícil encontrar compuestos que muestren ambas características deseables simultáneamente.
La actividad antiinflamatoria de los inhibidores de JAK se ha demostrado robustamente en modelos preclínicos de asma (Malaviya et al., Int. Immunopharmacol., 2010, 10, 829,-836; Matsunaga et al., Biochem. y Biophys. Res. Commun., 2011, 404, 261-267; Kudlacz et al., Eur. J. Pharmacol., 2008, 582, 154-161). Entre las citoquinas implicadas en la inflamación asmática que señalizan a través de la ruta JAK-STAT se incluyen IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, linfopoyetina estromal tímica (TSLP, por sus siglas en inglés), interferón-γ (IFNγ) y factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF). De acuerdo con lo anterior, se espera que los compuestos de la invención resulten útiles para el tratamiento de los trastornos respiratorios inflamatorios, en particular, el asma. La inflamación y fibrosis del pulmón es característica de otras enfermedades respiratorias además del asma, tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis quística ((FQ), la neumonitis, las enfermedades pulmonares intersticiales (incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática), la lesión pulmonar aguda, el síndrome del distrés respiratorio agudo, la bronquitis, el enfisema, la bronquiolitis obliterante y la sarcoidosis. Por lo tanto, los presentes compuestos también se espera que resulten útiles para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la fibrosis quística, la neumonitis, las enfermedades pulmonares intersticiales (incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática), la lesión pulmonar aguda, el síndrome del distrés respiratorio agudo, la bronquitis, el enfisema, la bronquiolitis obliterante y la sarcoidosis.
En comparación con los análogos fluoro correspondientes (compuestos C-1, C-2, C-3, C-4, C-5 y C-6), se ha mostrado que los compuestos 1 a 6 presentan una actividad de JAK similar. Sin embargo, presentan la ventaja de dar lugar a un metabolismo de sulfatación significativamente inferior, tal como se demuestra en el Ensayo 5. Lo anterior resulta significativo, ya que el metabolismo de sulfatación ocurre en los pulmones, lo que podría conducir a una rápida reducción de la exposición al compuesto parental activo.
Los compuestos de la exposición han demostrado inhibir las citoquinas asociadas a la inflamación. Por lo tanto, los compuestos de la exposición es probable que resulten útiles para el tratamiento de determinadas enfermedades respiratorias específicas, tal como se detalla posteriormente.
La inflamación eosinofílica de las vías respiratorias es un elemento característico de las enfermedades denominadas colectivamente enfermedades pulmonares eosinofílicas (Cottin et al., Clin. Chest. Med., 2016, 37(3), 535-56). Las enfermedades eosinofílicas se han asociado a la señalización de IL-4, IL-13 e IL-5. Entre las enfermedades pulmonares eosinofílicas se incluyen infecciones (especialmente infecciones helmínticas), neumonitis inducida farmacológicamente (inducida, por ejemplo, por fármacos terapéuticos, tales como antibióticos, fenitoína o I-triptófano), neumonitis inducida por hongos (p. ej., aspergilosis broncopulmonar alérgica), neumonitis por hipersensibilidad y granulomatosis eosinofílica con poliangitis (anteriormente conocida como síndrome de Churg-Strauss). Entre las enfermedades pulmonares eosinofílicas de etiología desconocida se incluyen la neumonía eosinofílica aguda idiopática, la neumonía eosinofílica crónica idiopática, el síndrome hipereosinofílico y el síndrome de Löffler.
Se ha asociado un polimorfismo en el gen IL-6 a niveles elevados de IL-6 y a un riesgo incrementado de desarrollar hipertensión arterial pulmonar (HAP) (Fang et al., J. Am. Soc. Hypertens., 2017, 11(3), 171-177). En confirmación del papel de IL-6 en la HAP, la inhibición de la cadena gp130 del receptor de IL-6 mejoró la enfermedad en un modelo de rata de HAP (Huang et al., Can. J. Cardiol., 2016, 32(11), 1356.e1-1356.e10).
Se han implicado algunas citoquinas, tales como IFNγ, IL-12 e IL-6 en un abanico de enfermedades pulmonares no alérgicas, tales como la sarcoidosis y la linfangioleiomiomatosis (El-Hashemite et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 2005, 33, 227-230, y El-Hashemite et al., Cancer Res., 2004, 64, 3436-3443). También se ha mostrado que los compuestos de la invención inhiben la señalización de IFNγ.
La bronquiectasia y las enfermedades pulmonares infiltrativas son enfermedades asociadas a la inflamación neutrofílica crónica.
La activación patológica de los linfocitos T es crítica en la etiología de múltiples enfermedades respiratorias. Las células T autorreactivas desempeñan una función en la bronquiolitis obliterante con neumonía organizada (también denominada BONO). De manera similar a la BONO, la etiología de los rechazos del trasplante de pulmón se relaciona con una activación aberrante de los linfocitos T del receptor inducida por el pulmón trasplantado del/de la donante. Los rechazos del trasplante pulmonar pueden producirse precozmente, en forma de disfunción primaria del injerto (DPI), neumonía organizada (NO), rechazo agudo (RA), bronquiolitis linfocítica (BL) o pueden producirse años después del trasplante pulmonar, en forma de disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (DCIP). La DCIP se conocía anteriormente como bronquiolitis obliterante (BO), aunque actualmente se considera un síndrome que puede presentar diferentes manifestaciones patológicas, incluyendo la BO, DCIP restrictiva (DCIPr o RAS) y disfunción neutrofílica del alotrasplante. La disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (DCIP) es un reto importante en la gestión a largo plazo de los receptores de trasplante pulmonar, ya que causa que el pulmón trasplantado pierda funcionalidad progresivamente (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185-191). La DCIP responde mal al tratamiento y, por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de compuestos eficaces capaces de prevenir o tratar esta afección. Varias citoquinas dependientes de JAK, tales como IFNγ e IL-5 están reguladas positivamente en la DCIP y el rechazo del trasplante pulmonar (Berastegui et al., Clin. Transplant.2017, 31, e12898). Además, se asocian niveles pulmonares elevados de quimioquinas CXCR3, tales como CXCL9 y CXCL10, que están cadena abajo de la señalización de IFN dependiente de JAK, a resultados peores en pacientes de trasplante pulmonar (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). Se ha demostrado que la inhibición sistémica de JAK resulta eficaz en el rechazo del trasplante renal (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). Por lo tanto, los inhibidores de JAK presentan el potencial de resultar eficaces en el tratamiento o prevención del rechazo del trasplante pulmonar y la DCIP. Varios eventos similares de activación de los linfocitos T descritos como la base para el rechazo del trasplante pulmonar también se consideran el inductor principal de la enfermedad del injerto pulmonar contra el huésped (EICH), que puede ocurrir posteriormente al trasplante de células madre hematopoyéticas. De manera similar a la DCIP, la EICH pulmonar es una afección progresiva crónica con resultados extremadamente malos y actualmente no se dispone de ningún tratamiento aprobado. Un estudio multicéntrico retrospectivo mediante cuestionarios de 95 pacientes con EICH aguda o crónica refractaria a esteroides que habían recibido el inhibidor de JAK sistémico ruxolitinib como terapia de último recurso mostraron una respuesta completa o parcial al ruxolitinib en la mayoría de pacientes, incluyendo aquellos/as con EICH pulmonar (Zeiser et al., Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). Debido a que la inhibición sistémica de JAK se asocia a acontecimientos adversos graves y un índice terapéutico pequeño, sigue existiendo una necesidad de un inhibidor de JAK no sistémico dirigido al pulmón e inhalado para prevenir y/o tratar el rechazo del trasplante pulmonar o la EICH pulmonar. Los compuestos de la exposición presentan las características requeridas para satisfacer dicha necesidad. Más recientemente, la neumonitis inducida por inhibidor de punto de control inmunitario, otra enfermedad pulmonar mediada por linfocitos T, ha surgido con el mayor uso de los inhibidores de punto de control inmunitario. En los pacientes de cáncer tratados con estos agentes estimulantes de linfocitos T, puede desarrollarse neumonitis mortal.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un compuesto de la invención tal como se indica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad respiratoria en un mamífero (p. ej., un ser humano), en el que el método comprende administrar en el mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o de una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto, la enfermedad respiratoria es asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, neumonitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística (FQ), neumonitis, enfermedades pulmonares intersticiales (incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática), lesión pulmonar aguda, síndrome del distrés respiratorio agudo, bronquitis, enfisema, bronquiolitis obliterante o sarcoidosis. En otro aspecto, la enfermedad respiratoria es asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
En un aspecto, la enfermedad respiratoria es una infección pulmonar, una enfermedad eosinofílica, una infección helmíntica, hipertensión arterial pulmonar, sarcoidosis, linfangioleiomiomatosis, broncoectasia, una enfermedad pulmonar infiltrante, neumonitis inducida farmacológicamente, neumonitis inducida por hongo, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, granulomatosis eosinofílica con poliangiitis, neumonía eosinofílica aguda idiopática, neumonía eosinofílica crónica idiopática, síndrome hipereosinofílico, síndrome de Löffler, bronquiolitis obliterante con neumonía organizada, rechazos de trasplante pulmonar agudos y crónicos (incluyendo disfunción primaria del injerto (DPI), neumonía organizada (NO), bronquiolitis linfocítica (BL), rechazo agudo (RA) y DCIP, DCIP restrictiva y disfunción neutrofílica del aloinjerto), bronquiolitis obliterante con neumonía organizada por enfermedad del injerto pulmonar contra el huésped, hipertensión arterial pulmonar, broncoectasia o neumonitis inducida por inhibidor de punto de control inmunitario.
La invención proporciona, además, un compuesto de la invención tal como se indica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento del asma en un mamífero, en el que el método comprende administrar en el mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o de una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Al utilizarlos para tratar el asma, los compuestos de la exposición habitualmente se administran en una sola dosis diaria o en múltiples dosis cada día, aunque pueden utilizarse otras formas de administración. La cantidad de agente activo administrada por dosis o la cantidad total administrada al día normalmente serán determinadas por un/a médico/a, a la luz de las circunstancias pertinentes, incluyendo la afección que debe tratarse, la vía de administración seleccionada, el compuesto final administrado y su actividad relativa, la edad, el peso y la respuesta del/de la paciente individual, la gravedad de los síntomas del/de la paciente, y similares.
La invención proporciona, además, un compuesto de la invención tal como se indica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad respiratoria (incluyendo, aunque sin limitación, la enfermedad indicada en la presente memoria) en un mamífero, en el que el método comprende administrar en el mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o de una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Al utilizarlos para tratar una enfermedad respiratoria (incluyendo, aunque sin limitación, la enfermedad indicada en la presente memoria), los compuestos de la exposición habitualmente se administran en una sola dosis diaria o en múltiples dosis cada día, aunque pueden utilizarse otras formas de administración. La cantidad de agente activo administrada por dosis o la cantidad total administrada al día normalmente serán determinadas por un/a médico/a, a la luz de las circunstancias pertinentes, incluyendo la afección que debe tratarse, la vía de administración seleccionada, el compuesto final administrado y su actividad relativa, la edad, el peso y la respuesta del/de la paciente individual, la gravedad de los síntomas del/de la paciente, y similares.
Como inhibidores de JAK, los compuestos de la exposición también pueden resultar útiles para una diversidad de otras enfermedades. Los compuestos de la exposición pueden resultar útiles para una diversidad de indicaciones inflamatorias gastrointestinales entre las que se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa (proctosigmoiditis, pancolitis, proctitis ulcerosa y colitis del lado izquierdo), enfermedad de Crohn, colitis colagenosa, colitis linfocítica, enfermedad de Behcet, enfermedad celíaca, colitis inducida por inhibidor de punto de control inmunitario, ileítis, esofagitis eosinofílica, colitis relacionada con enfermedad del injerto contra el huésped, y colitis infecciosa. La colitis ulcerosa (Reimund et al., J. Clin. Immunology, 1996, 16, 144-150), la enfermedad de Crohn (Woywodt et al., Eur. J. Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), la colitis colagenosa (Kumawat et al., Mol. Immunology, 2013, 55, 355-364), la colitis linfocítica (Kumawat et al., 2013), la esofagitis eosinofílica (Weinbrand-Goichberg et al., Immunol. Res., 2013, 56, 249-260), la colitis relacionada con la enfermedad del injerto contra el huésped (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 3268-3276), la colitis infecciosa (Stallmach et al., Int. J. Colorectal Dis., 2004, 19, 308-315), la enfermedad de Behcet (Zhou et al., Autoimmun. Rev., 2012, 11, 699-704), la celiaquía (de Nitto et al., World J. Gastroenterol., 2009, 15, 4609-4614), la colitis inducida por inhibidor de punto de control inmunitario (p. ej., colitis inducida por inhibidor de CTLA-4 (Yano et al., J. Translation Med., 2014, 12, 191), o la colitis inducida por inhibidor de PD-1- o PD-L1) y la ileítis (Yamamoto et al., Dig. Liver Dis., 2008, 40, 253-259) se caracterizan por la elevación de los niveles de determinadas citoquinas proinflamatorias. Debido a que muchas citoquinas proinflamatorias señalizan mediante la activación de JAK, los compuestos indicados en la presente solicitud podrían ser capaces de aliviar la inflamación y proporcionar un alivio de los síntomas. En particular, los compuestos de la exposición podrían resultar útiles para la inducción y mantenimiento de la remisión de la colitis ulcerosa y para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, la colitis inducida por inhibidor de punto de control inmunitario y los efectos gastrointestinales adversos en la enfermedad del injerto contra el huésped. No es parte de la invención un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria gastrointestinal en un mamífero (p. ej., un ser humano), en el que el método comprende administrar en el mamífero un compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La dermatitis atópica y otras enfermedades inflamatorias de la piel se han asociado a una elevación de las citoquinas proinflamatorias que se basan en la ruta de JAK-STAT. Por lo tanto, los compuestos de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, podrían resultar beneficiosos en varias afecciones inflamatorias dérmicas o pruríticas, entre las que se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, dermatitis atópica, alopecia areata, vitíligo, soriasis, dermatomiositis, linfoma de células T cutáneo (Netchiporouk et al., Cell Cycle, 2014; 13, 3331-3335) y subtipos (síndrome de Sézary, micosis fungoide, reticulosis pagetoide, piel fláccida granulomatosa, papulosis linfomatoide, pitiriasis liquenoide y varioliforme aguda, linfoma cutáneo de células T CD30+, linfoma de células grandes CD30+ cutáneo secundario, linfoma cutáneo de células T grandes no micosis fungoide, linfoma de células T pleomórficas, linfoma de Lennert, linfoma subcutáneo de células T, linfoma angiocéntrico, linfoma de células NK blásticas, prurigo nodular, liquen plano, amiloidosis cutánea localizada primaria, penfigoide bulloso, manifestaciones cutáneas de la enfermedad del injerto contra el huésped, penfigoide, lupus discoide, granuloma anular, liquen simple crónico, prurito vulvar/escrotal/perianal, liquen escleroso, picor por neuralgia postherpética, liquen plano pilar y foliculitis decalvante. En particular, la dermatitis atópica (Bao et al., JAK-STAT, 2013, 2, e24137), la alopecia areata (Xing et al., Nat. Med. 2014, 20, 1043-1049), el vitíligo (Craiglow et al, JAMA Dermatol. 2015, 151, 1110-1112), el prurigo nodular (Sonkoly et al., J. Allergy Clin. Immunol.2006, 117, 411-417), el liquen plano (Welz-Kubiak et al., J. Immunol. Res.2015, ID:854747), la amiloidosis cutánea localizada primaria (Tanaka et al., Br. J. Dermatol.2009, 161, 1217-1224), el penfigoide bulloso (Feliciani et al., Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 1999, 12, 55-61) y las manifestaciones dérmicas de la enfermedad del injerto contra el huésped (Okiyama et al., J. Invest. Dermatol.2014, 134, 992-1000) se caracterizan por la elevación de determinadas citoquinas que señalizan mediante la activación de JAK. De acuerdo con lo anterior, los compuestos de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, podrían aliviar la inflamación dérmica asociada o prurito inducido por estas citoquinas. En particular, los compuestos de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, podría preverse que resulte útil para el tratamiento de la dermatitis atópica y otras enfermedades cutáneas inflamatorias. No es parte de la invención un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria de la piel en un mamífero (p. ej., un ser humano), en el que el método comprende aplicar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un portador farmacéutico en la piel del mamífero. En un aspecto, la enfermedad cutánea inflamatoria es la dermatitis atópica.
Se ha demostrado que muchas enfermedades oculares están asociadas a elevaciones de las citoquinas proinflamatorias que se basan en la ruta de JAK-STAT. Por lo tanto, los compuestos de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, podrían resultar útiles para el tratamiento de varias enfermedades oculares, entre las que se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, uveítis, retinopatía diabética, edema macular diabético, enfermedad del ojo seco, degeneración macular relacionada con la edad y queratoconjuntivitis atópica. En particular, la uveítis (Horai y Caspi, J. Interferon Cytokine Res., 2011, 31, 733-744), la retinopatía diabética (Abcouwer, J. Clin. Cell. Immunol., 2013, Supl.1, 1-12), el edema macular diabético (Sohn et al., American Journal of Opthamology, 2011, 152, 686-694), la enfermedad del ojo seco (Stevenson et al, Arch. Ophthalmol., 2012, 130, 90-100) y la degeneración macular relacionada con la edad (Knickelbein et al, Int. Ophthalmol. Clin., 2015, 55(3), 63-78) se caracterizan por la elevación de determinadas citoquinas proinflamatorias que señalizan mediante la ruta de JAK-STAT. De acuerdo con lo anterior, los compuestos de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, podrían aliviar la inflamación ocular asociada y revertir la progresión de la enfermedad, o proporcionar un alivio de los síntomas. No es parte de la invención un método de tratamiento de una enfermedad ocular en un mamífero, en el que el método comprende aplicar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un portador farmacéutico en el ojo del mamífero. En un aspecto, la enfermedad ocular es uveítis, retinopatía diabética, edema macular diabético, enfermedad del ojo seco, degeneración macular relacionada con la edad o queratoconjuntivitis atópica. En un aspecto, el método comprende administrar el compuesto de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, mediante inyección intravítrea. También pueden utilizarse compuestos de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en combinación con uno o más compuestos útiles para enfermedades oculares.
Los compuestos de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, también pueden resultar útiles para tratar otras enfermedades, tales como otras enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias o cánceres. Los compuestos de la exposición, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, pueden resultar útiles para tratar uno o más de entre artritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, rechazo del trasplante, xeroftalmia, artritis soriásica, diabetes, diabetes dependiente de insulina, enfermedad de las neuronas motoras, síndrome mielodisplásico, dolor, sarcopenia, caquexia, choque séptico, lupus eritematoso sistémico, leucemia, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, espondilitis anquilosante, mielofibrosis, linfoma de células B, carcinoma hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, cáncer de mama, mieloma múltiple, melanoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer pulmonar no microcítico, carcinoma de células claras ováricas, tumor ovárico, tumor pancreático, policitemia vera, síndrome de Sjögren, sarcoma de tejido blando, sarcoma, esplenomegalia, linfoma de células T y talasemia mayor.
Terapia de combinación.
Los compuestos de la exposición o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos pueden utilizarse en combinación con uno o más agentes que actúen mediante el mismo mecanismo o mediante diferentes mecanismos para tratar una enfermedad. Los diferentes agentes pueden administrarse secuencial o simultáneamente, en composiciones diferentes o en la misma composición. Entre las clases útiles de agentes para la terapia de combinación se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un agonista de adrenoceptor beta-2, un antagonista de receptor muscarínico, un agonista de glucocorticoide, un antagonista de receptor 44 acoplado con proteína G, un antagonista de inmunoglobulina E, un inhibidor de PDE-4, un antagonista de IL-4, un antagonista de receptor muscarínico M1, un antagonista de receptor de histamina, un antagonista de IL-13, un antagonista de IL-5, un inhibidor de 5-lipooxigenasa, un agonista de adrenoceptor beta, un antagonista de quimioquina CCR3, un estimulante de CFTR, un modulador de inmunoglobulina, un inhibidor de ligando de interleuquina 33, un inhibidor de PDE-3, un inhibidor de fosfoinositida-3 quinasa delta, un antagonista de tromboxano A2, un inhibidor de elastasa, un inhibidor de tirosina quinasa Kit, un antagonista de leucotrieno E4, un antagonista de leucotrieno, un antagonista de PGD2, un inhibidor de ligando de TNF-alfa, un agente ligante de TNF, un inhibidor de cascada del complemento, un inhibidor de ligando de eotaxina, un inhibidor de glutatión reductasa, un antagonista de receptor de histamina H4, un antagonista de IL-6, un estimulante de gen de IL2, un modulador de receptor IIB de Fc de inmunoglobulina gamma, un ligando de interferón gamma, un inhibidor de ligando de interleuquina 13, un inhibidor de ligando de interleuquina 17, un antagonista de L-selectina, un inhibidor de elastasa de leucocito, un antagonista de leucotrieno C4, un inhibidor de leucotrieno C4 sintasa, un inhibidor membranal de cobre amina oxidasa, un inhibidor de metaloproteasa 12, un inhibidor de metaloproteasa 9, un modulador de alérgeno de ácaro, un modulador de receptor muscarínico, un agonista de receptor nicotínico de acetilcolina, un inhibidor de factor nuclear kappa B, un antagonista de selectina P, un inhibidor de PDE-5, un antagonista de receptor de PDGF, un inhibidor de fosfoinositida-3 quinasa gamma, un agonista de TLR-7, un antagonista de TNF, un inhibidor de Abl tirosina quinasa, un antagonista de receptor de acetilcolina, un inhibidor de quitinasa de mamífero ácida, un agonista de receptor de ACTH, un modulador de polimerización de la actina, un antagonista de receptor A1 de adenosina, un estimulante de adenilato ciclasa, un antagonista de adrenoceptor, un ligando de hormona adrenocorticotrópica, un inhibidor de alcohol-deshidrogenasa 5, un estimulador de antitripsina alfa-1, un inhibidor de proteinasa alfa-1, un modulador de receptor de andrógeno, un estimulador de enzima conversor de la angiotensina II, un modulador de adrenoceptor beta-2, un modulador de amiloide beta, un inhibidor de gen BMP10, un inhibidor de gen BMP15, un inhibidor de canales de calcio, un inhibidor de catepsina G, un inhibidor de gen de CCL26, un modulador de quimioquina CCR3, un antagonista de quimioquina CCR4, un inhibidor de molécula de adhesión celular, un estimulante de chaperonina, un inhibidor de quitinasa, un antagonista de colágeno I, un inhibidor de complemento C3, un antagonista de CSF-1, un antagonista de quimioquina CXCR2, un modulador de cadena beta común de receptor de citoquina, un estimulante de proteína 4 de linfocito T citotóxico, un estimulador de desoxirribonucleasa I, un estimulador de desoxirribonucleasa, un inhibidor de dipeptidilpeptidasa I, un inhibidor de ADN girasa, un modulador de receptor prostanoide DP, un antagonista de selectina E, un inhibidor de receptor de tirosina quinasa de la familia de EGFR, un modulador de elastina, un antagonista de endotelina ET-A, un antagonista de endotelina ET-B, un inhibidor de epóxido hidrolasa, un antagonista de receptor de FGF3, un inhibidor de tirosina quinasa Fyn, un inhibidor de factor de transcripción GATA3, un modulador de glucosilceramidasa, un modulador de receptor de glutamato, un inhibidor de ligando de GM-CSF, un estimulante de guanilato ciclasa, un inhibidor de ATPasa H+K+, un modulador de hemoglobina, un agonista de heparina, un inhibidor de histona desacetilasa, un estimulador de histona desacetilasa-2, un inhibidor de HMG CoA reductasa, un inhibidor de I-kappa B quinasa beta, un inhibidor de gen ICAM1, un antagonista de IL-17, un modulador de receptor de IL-17, un antagonista de IL-23, un modulador de receptor de IL-4, un modulador de inmunoglobulina G, un agonista de inmunoglobulina G1, un modulador de inmunoglobulina G, un antagonista de receptor IA de Fc de inmunoglobulina epsilón, un antagonista de receptor IIB de Fc de inmunoglobulina gamma, un modulador de inmunoglobulina kappa, un sensibilizador de insulina, un ligando de interferón beta, un antagonista de receptor similar a interleuquina 1, un inhibidor de ligando de interleuquina 18, un antagonista de receptor 17A de interleuquina, un inhibidor de ligando de interleuquina-1 beta, un inhibidor de ligando de interleuquina-5, un inhibidor de ligando de interleuquina-6, un inhibidor de canal-3 de potasio activado por voltaje KCNA, un inhibidor de ligando Kit, un agonista de laminina-5, un antagonista de receptor de leucotrieno CysLT1, un antagonista de receptor de leucotrieno CysLT2, un inhibidor de gen LOXL2, un inhibidor de tirosina quinasa Lyn, un inhibidor de proteína MARCKS, un inhibidor de proteína 4 asociada a MDR, un modulador de metaloproteasa-2, un modulador de metaloproteasa-9, un antagonista de receptor mineralocorticoide, un antagonista de receptor muscarínico M2, un antagonista de receptor muscarínico M4, un antagonista de receptor muscarínico M5, un agonista de receptor A de péptido natriurético, un modulador de receptor de células asesinas naturales, un estimulador de subunidad alfa-7 de receptor nicotínico ACH, un modulador de receptor de células NK, un modulador de factor nuclear kappa B, un agonista de receptor de factor de crecimiento opioide, un inhibidor de glucoproteína P, un antagonista de purinoceptor P2X3, un inhibidor de MAP quinasa p38, un modulador de peptidasa 1, un inhibidor de fosfolipasa A, un inhibidor de fosfolipasa C, un inhibidor 1 de activador del plasminógeno, un antagonista de receptor de factor activador de plaquetas, un agonista de PPAR gamma, un agonista de prostaciclina, un inhibidor de proteína tirosina quinasa, un estimulador de dominio SH2 de inositol fosfatasa 1, un inhibidor de transducción de señales, un inhibidor de canales de sodio, un modulador de STAT-3, un inhibidor de antígeno-1 de células madre, un modulador de superóxido dismutasa, un inhibidor de glucoproteína CD28 de superficie de células T, un inhibidor de glucoproteína CD8 de superficie de células T, un agonista de TGF-beta, un antagonista de TGF-beta, un inhibidor de tromboxano sintetasa, un inhibidor de ligando de linfoproteína estromal tímica, un agonista de timosina, un ligando de timosina beta-4, un agonista de TLR-8, un agonista de TLR-9, un estimulante de gen TLR9, un inhibidor de topoisomerasa IV, un estimulador de músculo esquelético rápido troponina I, un estimulador de troponina T de músculo esquelético rápido, un antagonista de receptor de IL-1 de tipo I, un modulador de receptor de TNF de tipo II, un modulador de canales iónicos, un estimulador de uteroglobina y un agonista de VIP.
Entre los agentes específicos que pueden utilizarse en combinación con los presentes compuestos inhibidores de JAK se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, acetato de rosiptor, bromuro de umeclidinio, secukinumab, acetato de metenkefalina, acetato de tridecáctide, propionato de fluticasona, sulforafano estabilizado por ciclodextrina alfa, tezepelumab, furoato de mometasona, BI-1467335, dupilumab, aclidinium, formoterol, AZD-1419, HI-1640V, rivipansel, CMP-001, manitol, ANB-020, omalizumab, tregalizumab, Mitizax, benralizumab, golimumab, roflumilast, imatinib, REGN-3500, masitinib, apremilast, RPL-554, Actimmune, adalimumab, rupatadina, parogrelil, MK-1029, dipropionato de beclometasona, formoterol fumarato, mogamulizumab, seratrodast, UCB-4144, nemiralisib, CK-2127107, fevipiprant, danirixina, bosentán, abatacept, EC-18, duvelisib, dociparstat, ciprofloxacino, salbutamol HFA, erdosteína, PrEP-001, nedocromilo, CDX-0158, salbutamol, enobosarm, R-TPR-022, lenzilumab, furoato de fluticasona, trifenatato de vilanterol, propionato de fluticasona, salmeterol, PT-007, PRS-060, remestemcel-L, citrulina, RPC-4046, óxido nítrico, DS-102, gerilimzumab, Actair, furoato de fluticasona, umeclidinio, vilanterol, AG-NPP709, Gamunex, infliximab, Ampion, acumapimod, canakinumab, INS-1007, CYP-001, sirukumab, propionato de fluticasona, mepolizumab, pitavastatina, solitromicina, etanercept, ivacaftor, anakinra, MPC-300-IV, bromuro de glucopirronio, bromuro de aclidinio, FP-025, risankizumab, glucopirronio, fumarato de formoterol, Adipocell, YPL-001, bromuro de tiotropio, bromuro de glucopirronio, maleato de indacaterol, andecaliximab, olodaterol, esomeprazol, vacuna contra los ácaros del polvo, Vacuna contra el alérgeno del polen de la artemisa, vamorolona, gefapixant, revefenacina, gefitinib, ReJoin, tipelukast, bedoradrina, SCM-CGH, SHP-652, RNS-60, brodalumab, BIO-11006, bromuro de umeclidinio, trifenatato de vilanterol, bromuro de ipratropio, tralokinumab, PUR-1800, VX-561, VX-371, olopatadina, tulobuterol, fumarato de formoterol, acetónido de triamcinolona, reslizumab, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, dipropionato de beclometasona, fumarato de formoterol, bromuro de tiotropio, ligelizumab, RUTI, bertilimumab, omalizumab, bromuro de glucopirronio, SENS-111, dipropionato de beclometasona, CHF-5992, LT-4001, indacaterol, bromuro de glucopirronio, furoato de mometasona, fexofenadina, bromuro de glucopirronio, azitromicina, AZD-7594, formoterol, CHF-6001, batefenterol, OATD-01, olodaterol, CJM-112, rosiglitazona, salmeterol, setipiprant, interferónbeta inhalado, AZD-8871, plecanátide, fluticasona, salmeterol, monoglicéridos de ácido eicosapentaenoico, lebrikizumab, RG-6149, QBKPN, mometasona, indacaterol, AZD-9898, piruvato sódico, zileuton, CG-201, imidafenacina, CNTO-6785, CLBS-03, mometasona, RGN-137, procaterol, formoterol, CCI-15106, POL-6014, indacaterol, beclometasona, MV-130, GC-1112, Allergovac depot, MEDI-3506, QBW-251, ZPL-389, udenafilo, GSK-3772847, levocetirizina, AXP-1275, ADC-3680, timapiprant, abediterol, AZD-7594, bromuro de ipratropio, sulfato de salbutamol, tadekinig alfa, ACT-774312, domasa alfa, iloprost, batefenterol, furoato de fluticasona, alicaforsen, ciclesonida, emeramida, arformoterol, SB-010, Ozagrel, BTT-1023, Dectrekumab, levalbuterol, pranlukast, ácido hialurónico, GSK-2292767, Formoterol, NOV-14, Lucinactant, salbutamol, prednisolona, ebastina, cipecilato de dexametasona, GSK-2586881, BI-443651, GSK-2256294, VR-179, VR-096, hdm-ASIT+, budesónide, GSK-2245035, VTX-1463, emedastina, dexpramipexol, levalbuterol, N-6022, fosfato de dexametasona sódica, PIN-201104, OPK-0018, TEV-48107, suplatast, BI-1060469, Gemilukast, interferón gamma, dalazatide, bilastina, propionato de fluticasona, xinafoato de salmeterol, RP-3128, bromuro de bencicloquidio, reslizumab, PBF-680, antagonista de CRTH2, pranlukast, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, monohidrato de bromuro de tiotropio, masilukast, RG-7990, doxofilina, abediterol, bromuro de glucopirronio, TEV-46017, ASM-024, propionato de fluticasona, bromuro de glucopirronio, xinafoato de salmeterol, salbutamol, TA-270, Flunisólide, cromoglicato sódico, Epsi-gam, ZPL-521, salbutamol, aviptadilo, TRN-157, Zafirlukast, Stempeucel, pemirolast sodio, nadolol, propionato de fluticasona xinafoato de salmeterol, RV-1729, sulfato de salbutamol, dióxido de carbono bromuro de perfluorooctilo, APL-1, dectrekumab VAK-694, acetilsalicilato de lisina, zileuton, TR-4, terapia de células progenitoras mesenquimales derivadas de tejido adiposo alogénico humano, MEDI-9314, PL-3994, HMP-301, TD-5471, NKTT-120, pemirolast, dipropionato de beclometasona, trantinterol, monosodio alfa luminol, IMD-1041, AM-211, TBS-5, ARRY-502, seratrodast, midismasa recombinante, ASM-8, deflazacort, bambuterol, RBx-10017609, ipratropio fenoterol, fluticasona formoterol, epinastina, WIN-901X, VALERGEN-DS,OligoG-COPD-5/20, tulobuterol, Oxis Turbuhaler, DSP-3025, ASM-024, mizolastina, budesónide salmeterol, LH-011, AXP-E, inmunoglobulina humana de histaminas, YHD-001, teofilina, ambroxol erdosteína, ramatrobán, montelukast, pranlukast, AG-1321001, tulobuterol, ipratropio salbutamol, tranilast, suleptanato de metilprednisolona, daropato de colforsín, repirinast y doxofilina.
No es parte de la invención una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la exposición o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y otro u otros agentes terapéuticos. El agente terapéutico puede seleccionarse de la clase de agentes especificada anteriormente y de la lista de agentes específicos indicados anteriormente. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica resulta adecuada para la administración en los pulmones. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica resulta adecuada para la administración inhalada o nebulizada. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica son unos polvos secos o una composición líquida.
No es parte de la invención un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un mamífero que comprende administrar en el mamífero un compuesto de la exposición o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y otro u otros agentes terapéuticos.
Al utilizarlos en terapia de combinación, los agentes pueden formularse en una única composición farmacéutica, o los agentes pueden proporcionarse en composiciones separadas que se administran simultáneamente o en tiempos separados, por la misma vía de administración o por vías de administración diferentes. Dichas composiciones pueden envasarse por separado o pueden envasarse juntas en forma de kit. Los dos o más agentes terapéuticos en el kit pueden administrarse por la misma vía de administración o por vías de administración diferentes.
Ejemplos
Los ejemplos sintéticos y biológicos a continuación se proporcionan a título ilustrativo de la invención y no deben interpretarse en modo alguno como limitativos del alcance de la invención. En los ejemplos, posteriormente, las abreviaturas siguientes presentan los significados siguientes, a menos que se indique lo contrario. Las abreviaturas no definidas a continuación presentan sus significados generalmente aceptados.
ACN = acetonitrilo
DCM = diclorometano
DIPEA= N,N-diisopropiletilamina
DMF = N,N-dimetilformamida
EtOAc = acetato de etilo
h = hora(s)
HATU= hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronio
IPA = alcohol isopropílico
IPAc = acetato de isopropilo
MeOH= metanol
min = minuto(s)
Pd(PPh3)4 = tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0)
TA = temperatura ambiente
TFA = ácido trifluoroacético
THF = tetrahidrofurano
bis(pinacolato)diboron = 4,4,5,5,4',4',5',5'-octametil-[2,2']bi[[1,3,2]dioxaborolanilo]
Los reactivos y solventes se adquirieron de proveedores comerciales (Aldrich, Fluka, Sigma, etc.) y se utilizaron sin purificación posterior. Se realizó un seguimiento de las mezclas de reacción mediante cromatografía de capa fina (CCF), cromatografía líquida de alto rendimiento analítica (HPLC anal.) y espectrometría de masas. Las mezclas de reacción se trataron tal como se ha indicado específicamente en cada reacción; habitualmente se purificaron mediante extracción y otros métodos de purificación, tales como la cristalización dependiente de la temperatura y del solvente, y la precipitación. Además, las mezclas de reacción se purificaron rutinariamente mediante cromatografía de columna o mediante HPLC preparativa, habitualmente utilizando rellenos de columna C18 o BDS y eluyentes convencionales. Las condiciones de HPLC preparativas normales se indican posteriormente.
La caracterización de los productos de reacción se llevó a cabo rutinariamente mediante espectrometría de masas y de RMN-1H. Para el análisis de RMN, las muestras se disolvieron en solvente deuterado (tal como CD3OD, CDCl3 o d6-DMSO) y se adquirieron los espectros de RMN-1H con un instrumento Varian Gemini 2000 (400 MHz) bajo condiciones de observación estándares. La identificación mediante espectrometría de masas de los compuestos se llevó a cabo mediante un método de ionización por electropulverización (ESMS, por sus siglas en inglés) con un instrumento modelo API 150 EX de Applied Biosystems (Foster City, CA) o un instrumento Waters (Milford, MA), acoplado con sistema de autopurificación.
Condiciones de las HPLC preparativas.
Columna: C18, 5 µm.21,2 × 150 mm o C18, 5 µm 21 × 250 o C14, 5 µm 21×150 mm Temperatura de la columna Temperatura ambiente
Caudal: 20,0 ml/min
Fases móviles: A = Agua TFA al 0,05 %
B = ACN TFA al 0,05 %
Volumen de inyección: (100 a 1500 µl)
Longitud de onda del detector: 214 nm
Los compuestos en bruto se disolvieron en agua:ácido acético 1:1 a una concentración aproximada de 50 mg/ml. Se llevó a cabo una tanda de ensayo a escala analítica de 4 minutos utilizando una columna C18 de 2,1x50 mm, seguido de una tanda a escala preparativa de 15 o 20 minutos utilizando una inyección de 100 µl con el gradiente basado en la retención en % de B de la tanda de ensayo a escala analítica. Los gradientes exactos eran dependientes de la muestra. Las muestras con impurezas que eluían próximas se comprobaron con una columna C18 de 21x250 mm y/o con una columna C14 de 21x150 mm, para mejorar la separación. Las fracciones que contenían el producto deseado se identificaron mediante análisis de espectrometría de masas.
Preparación 1: 4-(benciloxi)-2-etilfenil)trifluoro-λ4-borano, sal potásica I-5
Figure imgf000021_0001
(a) 1-(Benciloxi)-3-etilbenceno (I-2)
A una solución bajo agitación de 3-etilfenol (I-1) (25,0 g, 204,0 mmoles) en ACN (250 ml, 10 vol.) se añadió carbonato potásico (42,0 g, 306 mmoles) a temperatura ambiente. La masa de reacción resultante se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de la adición de bromuro de bencilo (24,0 ml, 204 mmoles) gota a gota. La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación durante 6 horas a temperatura ambiente. Tras completarse la reacción (seguimiento mediante CCF), la masa de reacción resultante se vertió en agua (1,0 l), seguido de la extracción del compuesto con EtOAc (2x2 l). Las capas orgánicas agrupadas se lavaron con agua fría y con solución hipersalina, y se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida. A continuación, el producto en bruto se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (100 a 200 M) mediante la utilización de los eluyentes EtOAc al 2 % en hexano, obteniendo el producto deseado (I-2) en forma de compuesto aceitoso ligeramente amarillento (35,0 g, 81 %). RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,46-7,44 (m, 2H), 7,39 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,34-7,31 (m, 1H), 7,21 (t, J = 7,6 Hz), 6,86-6,80 (m, 3H), 5,07 (s, 2H), 2,64 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,24 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
(b) 4-(Benciloxi)-1-bromo-2-etilbenceno (I-3)
A una solución bajo agitación helada de 1-(benciloxi)-3-etilbenceno (I-2) (35,0 g, 164 mmoles) en ACN (525 ml, 15 vol.) se añadió N-bromosuccinimida (32,0 g, 181 mmoles) en partes a lo largo de un periodo de 15 minutos. La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación durante la hora siguiente a temperatura ambiente. Tras completarse la reacción (seguimiento mediante CCF), la masa de reacción resultante se vertió en agua helada (1,50 l), seguido de la extracción del compuesto con EtOAc (2x1 l). Las capas orgánicas agrupadas se lavaron con agua y se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida, obteniendo el producto en bruto. Se añadió n-hexano (250 ml) al material en bruto, resultando en una suspensión, seguido de la filtración a través de un embudo sinterizado. Se evaporó el licor madre bajo presión reducida, obteniendo el producto deseado, I-3, en forma de compuesto aceitoso amarillo pálido (42,0 g, 87 %). RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,52-7,29 (m, 7H), 6,88 (s, 1H), 6,68 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,04 (s, 2H), 2,69 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,20 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
(c) 2-(4-(Benciloxi)-2-etilfenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (I-4)
Una solución bajo agitación of 4-(benciloxi)-1-bromo-2-etilbenceno (1-3) (42,0 g, 144 mmoles), bis(pinacolato)diboro (44,0 g, 173 mmoles) y acetato potásico (28 g, 288 mmoles) en dioxano (440 ml) se desgasificó mediante purga con N2 (g) durante 15 min, seguido de la adición de complejo de PdCl2(dppf)·DCM (11,0 g, 15 mmoles). La mezcla de reacción resultante se calentó a 80 °C durante las siguientes 16 h. Tras completar la reacción (seguimiento mediante CCF), la masa de reacción se filtró a través de un lecho de Celite y el licor madre se evaporó bajo presión reducida, obteniendo el producto en bruto. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (100 a 200 M) mediante la utilización de los eluyentes EtOAc al 1% en hexano, obteniendo el producto deseado (I-4) en forma de compuesto aceitoso ligeramente amarillento (32,0 g, 66 %). RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.45-7.36 (m, 5H), 6.84-6.78 (m, 2H), 5.08 (s, 2H), 2.91 (q, J = 7.6 Hz), 1.33 (s, 12H), 1.19 (t, J = 7.6 Hz, 3H).
(d) 4-(Benciloxi)-2-etilfenil)trifluoro-λ4-borano, sal potásica (I-5)
A una solución bajo agitación de compuesto 2-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (I-4) (20 g, 59,0 mmoles), en acetona:metanol (200 ml, proporción 1:1, 10 vol.), se añadió una solución 3 M de hidrogenofluoruro de potasio (23,0 g, 295 mmoles, disueltos en 98,0 ml de agua). La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 16 horas. Tras completarse la reacción (seguimiento mediante CCF), la masa de reacción resultante se evaporó bajo presión reducida. El sólido obtenido de esta manera se introdujo en agua (100 ml) y se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 30 min. La masa de reacción resultante se filtró a través de un embudo sinterizado, se lavó con n-hexano y se secó bajo presión reducida, proporcionando el producto deseado (I-5) en forma de un sólido blanco (14,0 g, 74 %). RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,43 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,37 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,30 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,22 (d, J = 8,0 Hz), 6,58 (s, 1H), 6,53 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,00 (s, 2H), 2,65 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 1,07 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
Preparación 2: (A)-3-bencil-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(tercbutilo) (I-11)
Figure imgf000022_0001
(a) Ácido (S)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, sal hidrocloruro (I-7)
A una suspensión bajo agitación helada de L-histidina (I-6) (5,0 kg, 32,14 moles) en agua (40 l, 8 vol.) se añadió ácido clorhídrico concentrado (3,93 l, 33,75 moles), seguido de la adición de formaldehído (5,50 l, 67,5 moles, solución acuosa al 37 %) gota a gota. La solución resultante se sometió a agitación durante 30 minutos a la misma temperatura y después se calentó a 80 °C durante 8 horas. Se realizó el seguimiento del progreso de la reacción mediante CL-EM. Se eliminó el agua bajo presión reducida, obteniendo el producto en bruto, y el producto en bruto resultante se sometió a agitación durante 2 horas en tolueno (20 l). Se separaron las capas orgánicas bajo presión reducida para eliminar el exceso de agua y se secó azeotrópicamente el compuesto. A continuación, el material resultante se introdujo en éter dietílico (20 l) y se sometió a agitación durante 2 horas. A continuación, se filtró el material sólido y se secó al aire, obteniendo el producto deseado (I-7) en forma de un sólido blanquecino (6,50 Kg, 85 %). RMN 1H (400 MHz, D2O) δ 8,69 (s, 1H), 4,56 (d, J = 15,4 Hz, 1H), 4,42 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 4,20 (dd, J = 5,5, 5,2 Hz, 1H), 3,42 (dd, J = 5,0, 17,0 Hz, 1H), 3,11 (dd, J = 10,2, 16,8 Hz, 1H).
(b) Ácido (S)-3,5-bis(terc-butoxicarbonil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico (I-8)
A una solución helada bajo agitación de dihidrocloruro de ácido (S)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico (I-7) (6,10 Kg, 25,40 moles) en 1,4-dioxano (48 l, 8 vol.) y agua (48 l, 8 vol.) se añadió trietilamina (12,36 l, 89 moles) gota a gota, seguido de la adición de dicarbonato de di-terc-butilo (18,07 l, 78,74 moles, disueltos en 5 l de 1,4-dioxano) a lo largo de un periodo de 30 min. La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación a temperatura ambiente durante las siguientes 16 horas. Tras completar la reacción (seguimiento mediante CCF y CL-EM), la mezcla de reacción amarillenta se diluyó con agua (10 l) y se lavó sucesivamente con éter dietílico (2×10 l) y EtOAc (2×7,50 l). Se descartó la fase orgánica. La capa acuosa se enfrió y se llevó a pH ~3 con solución de HCl 6 N; la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3×10 l). Las capas orgánicas agrupadas se lavaron con solución hipersalina, se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron bajo presión reducida. El residuo aceitoso se cristalizó a partir de EtOAc al 30 %:hexanos, proporcionando el producto deseado (I-8) en forma de sólido blanquecino (5,1 Kg, 55 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C17H25N3O6: 368,18; observado: 368,21.
(c) (S)-6,7-Dihidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-3,5,6(4H)-tricarboxilato de 6-bencil-3,5-di-terc-butilo (I-9)
A una solución helada de ácido (S)-3,5-bis(terc-butoxicarbonil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico (I-8) (5,1 Kg, 13,88 moles) en DCM (51 l, 10 vol.) se añadió secuencialmente solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (41,0 l, 8 vol.), yoduro de tetrabutilamonio (5,13 Kg, 13,88 moles) y bromuro de bencilo (2,47 l, 20,82 moles). La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación a temperatura ambiente durante las siguientes 16 horas. Tras completar la reacción (seguimiento mediante CCF y CL-EM), se separó la solución bifásica. La capa acuosa se extrajo con DCM (3×10 l). Las capas orgánicas agrupadas se lavaron con solución hipersalina, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida, obteniendo el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía de columna a través de gel de sílice (100-200 M) mediante la utilización de los eluyentes EtOAc al 40 % en hexano, obteniendo el producto deseado (I-9) en forma de aceite viscoso (4,50 Kg, 72 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C24H31N3O6: 458,22; observado: 458,60.
(d) (S)-3,4,6,7-Tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-10)
A una solución helada de 3,5-di-terc-butil (S)-6,7-dihidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-3,5,6(4H)-tricarboxilato de 6-bencilo (I-9) (4,50 Kg, 9,84 moles) en IPA (45 l, 10 vol.) se añadió hidróxido amónico (36 l, 8 vol.) gota a gota. La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación adicional a temperatura ambiente durante las siguientes 16 horas. Tras completar la reacción (seguimiento mediante CCF y CL-EM), la mezcla resultante se diluyó con agua (25 l), seguido de extracción con EtOAc (3×20 l). Las capas orgánicas agrupadas se lavaron con solución hipersalina, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida, rindiendo el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía de columna a través de gel de sílice (100-200 M) mediante la utilización de los eluyentes MeOH al 2 % en DCM, obteniendo el producto deseado (I-10) en forma de un aceite viscoso espeso (2,70 Kg, 77 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C19H23N3O4: 358,17; observado: 358,33.
(e) (S)-3-Bencil-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-11) A una solución helada de (S)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-10) (2,70 kg, 7,55 moles) en DCM (32,4 l, 12 vol.) se añadió hidróxido sódico 1 N acuoso (24,3 l, 9 vol.), seguido de la adición secuencial de yoduro de tetrabutilamonio (2,80 Kg, 7,55 moles) y bromuro de bencilo (0,99 l, 8,31 moles). La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación a temperatura ambiente durante las siguientes 2 horas. Tras completar la reacción (seguimiento mediante CCF y CL-EM), se separó la solución bifásica. La capa acuosa se extrajo con DCM (3×10 l). Las capas orgánicas agrupadas se lavaron con solución hipersalina, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida, rindiendo el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (100-200 M) mediante la utilización de los eluyentes EtOAc al 40 % en hexano, obteniendo el producto deseado (I-11) en forma de un aceite viscoso (1,70 Kg, 63 %). (m/z):
[M+H]+ calc. para C26H29N3O4: 448,22; observado: 448,20.
Preparación 3: (A)-3-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (1-16)
Figure imgf000023_0001
(a) Cloruro de 4-bromo-2-fluorobenzoilo (I-13)
A una solución bajo agitación helada de ácido 4-bromo-2-fluorobenzoico (I-12) (1,25 Kg, 5,71 moles) en DCM (12,5 l, 15 vol.) se añadió cloruro de oxalilo (0,98 l, 11,42 moles) gota a gota. La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación durante 10 min a la misma temperatura. A continuación, se añadió DMF (150 ml) gota a gota a la mezcla de reacción. La masa de reacción resultante se dejó que se calentase hasta la temperatura ambiente y se sometió a agitación durante 2 horas. Tras completar la reacción (seguimiento mediante CCF), se eliminó el exceso de cloruro de oxalilo bajo presión reducida bajo una atmósfera de nitrógeno para obtener el producto en bruto (I-13) (1,08 Kg, 80 %), que se utilizó en la etapa siguiente sin purificación adicional.
(b) (S)-3-Bencil-2-(4-bromo-2-fluorobenzoil)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-14)
A una solución bajo agitación de (S)-3-bencil-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-11) (1,70 Kg, 3,80 moles) en ACN (13,6 l, 8 vol.) se añadió trietilamina (2,11 l, 15,2 moles) seguido de la adición de cloruro de 4-bromo-2-fluorobenzoilo (I-13) (1,08 Kg, 4,56 moles en 3,4 l de ACN, 2 vol.) a temperatura ambiente. Tras completar la adición, el color de la mezcla de reacción resultante cambió de marrón a amarillo pálido. La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación a la misma temperatura durante 30 min, y se realizó un seguimiento mediante CCF del progreso de la reacción. La mezcla de reacción resultante se desactivó con agua helada (10 l), seguido de la extracción con EtOAc (3×5 l) y las capas orgánicas agrupadas se lavaron con solución hipersalina. Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida, rindiendo el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (100-200M) mediante la utilización de los eluyentes EtOAc al 20 % en hexano para obtener el producto deseado (I-14) (1,74 Kg, 71 %). %). (m/z): [M+H]+ calc. para C33H31BrFN3O5: 648,14; observado: 648,20.
(c) (S)-3-bencil-2-(6-bromo-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-15)
A una solución bajo agitación de (S)-3-bencil-2-(4-bromo-2-fluorobenzoyl)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-14) (1,74 kg, 2,68 moles) en THF (26,0 l, 15 vol.) se añadió hidrato de hidrazina (0,705 l, 13,4 moles) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante se calentó a 60 °C durante 3 horas. Tras completarse la reacción (seguimiento mediante CCF), la masa de reacción resultante se vertió en agua helada (10 l), seguido de la extracción del compuesto con EtOAc (3x10 l). Las capas orgánicas agrupadas se lavaron con solución hipersalina y se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida, rindiendo el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (100-200M) mediante la utilización de los eluyentes EtOAc al 20 % en hexano para obtener el producto deseado (I-15) en forma de un sólido blanquecino (1,12 Kg, 65 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C33H32BrN5O4: 642,16; observado: 642,21.
(d) (S)-3-Bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-16)
Se cargó bis(pinacolato)diboro (250 g, 984 mmoles) en un matraz de pared única de 3 cuellos de 5 l previamente esmerilado utilizando química de fluoruro, junto con propán-2-ol (1,882 l, 2,46E+04 mmoles) y la mezcla se sometió a agitación hasta la disolución total. La disolución era endotérmica (-4 °C). En un matraz de Erlenmeyer de 4 l, previamente grabado mediante reacción con flúor, hidroxifluoruro de fluoruro potásico (538 g, 6891 mmoles) se disolvió en agua (2,306 l, 1,28E+05 mmoles), formando una solución de 3M. La disolución era endotérmica (-12 °C). A continuación, la solución se filtró para eliminar la pequeña cantidad de materias insolubles respecto del hidroxifluoruro de fluoruro potásico. Una vez ambas soluciones se habían disuelto por completo, se cargó el contenido del matraz de Erlenmeyer en un matraz de una sola pared por partes a lo largo de 15 minutos. Se observó una exoterma moderada (+10 °C). La solución se tornó una suspensión gris espesa semiopaca y translúcida durante la adición y se incrementó la agitación para mantener el contenido bien mezclado. La mezcla se sometió a agitación durante 1,5 h, y después se filtró a través de un embudo fritado de vidrio grueso (4 l, previamente esmerilado). La filtración requirió 30 a 45 minutos para completarse. Se descartó el filtrado bifásico transparente. Se secaron los sólidos blancos durante 10 minutos en el filtro (se observó agrietamiento de la torta). Se transfirieron los sólidos de vuelta a un matraz de una sola pared de 3 cuellos de 5 litros limpio y se mezclaron nuevamente con agua formando una suspensión (1,33 l, 7,38E+04 mmoles). La suspensión se sometió a agitación durante 2 h, después de las cuales se formó un hidrogel homogéneo transparente. La solución se sometió a agitación durante otra hora, momento en que se separaron los sólidos/gel utilizando un embudo de vidrio grueso de 4 l (previamente esmerilado). Se dejó que los sólidos se secasen sobre el filtro durante 30 minutos. Se transfirieron los sólidos de vuelta a un matraz de una sola pared de 3 cuellos de 5 l y se mezclaron nuevamente en acetona formando una suspensión (1,084 l, 1,48E+04 mmoles). La suspensión blanca/gris se sometió a agitación durante 1 h y a continuación se filtró a través de un embudo de vidrio grueso de 4 l (previamente esmerilado). La filtración requirió 20 minutos para completarse y después se secaron sobre el embudo durante otra hora. Durante este tiempo, los sólidos se sometieron a agitación ocasional para garantizar un secado homogéneo. Después del secado sobre el filtro quedaron unos polvos blancos ligeros. Se secaron los sólidos durante 20 h a 55 °C bajo vacío con una purga lenta de nitrógeno, proporcionando un sólido blanco esponjoso (se recogieron 200,3 g).
A una solución bajo agitación de (S)-3-bencil-2-(6-bromo-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-15) (10,0 g, 16,0 mmoles) en 2-metiltetrahidrofurano (100 ml, 10 vol.) se añadió 4-(benciloxi)-2-etilfenil)trifluoro-λ4-borano, sal potásica (I-5) (8,0 g, 20 mmoles) y el sólido blanco esponjoso obtenido anteriormente (0,20 g). La mezcla de reacción resultante se desgasificó con gas nitrógeno durante 30 minutos. A esta solución, se añadió una solución acuosa preparada de carbonato de cesio (20,0 g, 62,0 mmoles en 60 ml de agua, 6 vol.). La mezcla de reacción resultante se desgasificó adicionalmente durante 15 minutos, seguido de la adición de bis(di-terc-butil(4-dimetilaminofenil)fosfina)dicloropaladio (II) (0,66 g, 0,93 mmoles), y la mezcla de reacción se evacuó bajo vacío y se enjuagó con nitrógeno. La mezcla de reacción resultante se calentó a 110 °C durante 20 horas. Tras completar la reacción (seguimiento mediante CCF y CL-EM), la mezcla de reacción resultante se enfrió hasta la temperatura ambiente y se filtró a través de Celite; después se lavó adicionalmente con EtOAc (3×0,5 l). Las capas orgánicas agrupadas se lavaron con solución de hidróxido sódico 1 N (3×0,5 l). A continuación, se lavaron las capas orgánicas agrupadas con solución hipersalina y se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida, rindiendo el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice (100-200 M) mediante la utilización de los eluyentes EtOAc al 20 % en hexano, obteniendo el producto deseado (I-16) (en forma de mezcla de regioisómeros N-bencilo) en forma de sólido amarillo pálido (8,0 g, 66 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C48H47N5O5: 774,36; observado: 774,59.
6-carboxílico, hidrocloruro (I-18)
Figure imgf000025_0002
(a) (S)-3-Bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxilato de bencilo, hidrocloruro (I-17)
Se disolvió (S)-3-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) (I-16) (1,0 g, 1,292 mmoles) en dioxano (8 ml) y agua (1,5 ml), seguido de la adición de solución de ácido clorhídrico 4 M en dioxano (7 ml, 28,0 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 3 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). A continuación, la mezcla de reacción se congeló y se liofilizó, y el producto en bruto (I-17) se utilizó directamente en la reacción siguiente (se partió de que el rendimiento era cuantitativo). (m/z): [M+H]+ calc. para C43H39N5O3: 674,31; observado: 674,3.
(b) Ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, hidrocloruro (I-18)
Se disolvió (S)-3-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etilfenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxilato de bencilo, hidrocloruro (I-17) (0,918 g, 1,292 mmoles) en 2-propanol (15 ml), solución de ácido clorhídrico 5 M en agua (0,258 ml, 1,292 mmoles) y agua (0,25 ml) a 50 °C; después se añadió paladio, al 10 % en peso sobre carbono, al 50 % en agua (0,138 g, 0,065 mmoles). A continuación, el matraz de reacción se purgó con nitrógeno, se unió un balón de hidrógeno y la mezcla de reacción se sometió a agitación a 50 °C durante 4 días, rellenando el balón de hidrógeno según se necesitase (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). A continuación, se separaron todos los sólidos mediante filtración y se concentró la solución resultante. El residuo se disolvió en ACN/agua 1:1, se congeló y se liofilizó. Los polvos resultantes (I-18) se utilizaron sin purificación adicional (se partió de que el rendimiento era cuantitativo). (m/z): [M+H]+ calc. para C22H21N5O3: 404,17; observado: 404,2.
Preparación 5: ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico (I-19)
Figure imgf000025_0001
Se suspendió ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, HCl (I-18) (0,25 g, 0,568 mmoles) en DMF (2,5 ml) y acetona (2,5 ml); después se añadió ácido acético (0,098 ml, 1,705 mmoles) y cianoborohidruro sódico (0,179 g, 2,84 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 24 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se concentró la mezcla de reacción y a continuación el producto en bruto se purificó mediante cromatografía de fase inversa (gradiente de 50-70 % de ACN/agua, columna C18aq de 50 g), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (149 mg, rendimiento: 47 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C25H27N5O3: 446,21; observado: 446,3.
- - - - - - - - - - - - - , , , - - - , -c]piridín-6-carboxílico (I-20)
Figure imgf000026_0001
Se disolvió ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, HCl (I-18) (0,160 g, 0,364 mmoles) y propionaldehído (0,039 ml, 0,546 mmoles) en metanol (3,0 ml); a continuación, se añadió cianoborohidruro sódico (0,069 g, 1,091 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 24 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se concentró la mezcla de reacción y el producto en bruto se purificó mediante cromatografía de fase inversa (gradiente de 5-70 % de ACN/agua, columna C18 de 50 g), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (78 mg, rendimiento: 38 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C25H27N5O3: 446,21; observado: 446,3.
Preparación 7: ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico (I-21)
Figure imgf000026_0002
Se disolvió ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, HCl (I-18) (0,160 g, 0,364 mmoles) y solución de formaldehído, al 37 % en peso en agua (0,032 ml, 0,436 mmoles) en metanol (3,0 ml); después, se añadió cianoborohidruro sódico (0,069 g, 1,091 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 4 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se añadió borohidruro sódico (14 mg, 0,364 mmoles) para desactivar el exceso de formaldehído; a continuación, se concentró la mezcla de reacción. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía de fase inversa (gradiente de 5-70 % de ACN/agua, columna C18 de 50 g), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (110 mg, rendimiento: 57 %). (m/z):
[M+H]+ calc. para C23H23N5O3: 418,18; observado: 418,2.
Preparación 8: (R)-2-(3-metilpiperazín-1-il)etán-1-ol, dihidrocloruro (I-24)
Figure imgf000026_0003
(a) (R)-4-(2-hidroxietil)-2-metilpiperazín-1-carboxilato de terc-butilo (I-23)
Se disolvió (R)-1-boc-2-metil-piperazina (0,2 g, 0,999 mmoles), DIPEA (0,698 ml, 3,99 mmoles) y 2-bromoetanol (0,085 ml, 1,198 mmoles) en DMF (5 ml) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a 60 °C durante 16 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se concentró la mezcla de reacción; a continuación, se añadieron 10 ml de éter dietílico al residuo. La solución se sometió a sonicación hasta que había desaparecido el gel residual y se había formado un sólido. A continuación, se separó la solución de éter respecto del sólido mediante decantación. Seguidamente, se utilizó el sólido directamente en la reacción siguiente (se partió de que el rendimiento era cuantitativo). (m/z):
[M+H]+ calc. para C12H24N2O3: 245,18; observado: 245,4.
(b) (R)-2-(3-metilpiperazín-1-il)etán-1-ol, dihidrocloruro (I-24)
Se disolvió (R)-4-(2-hidroxietil)-2-metilpiperazín-1-carboxilato de terc-butilo (0,244 g, 0,999 mmoles) en dioxano (3,0 ml) y agua (0,5 ml); a continuación, se añadió solución de ácido clorhídrico 4 M en dioxano (2,0 ml, 65,8 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 3 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). La mezcla de reacción se congeló y se liofilizó y el producto resultante se utilizó sin purificación (se partió de que el rendimiento era cuantitativo). (m/z): [M+H]+ calc. para C7H16N2O: 145,13; observado: 145,4.
Ejemplo 1: (S)-(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)(4-(2-hidroxietil)piperazín-1-il)metanona
Figure imgf000027_0001
Se disolvió ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (I-20) (40 mg, 0,071 mmoles), n-(2-hidroxietil)piperazina (0,018 ml, 0,143 mmoles) y DIPEA (0,025 ml, 0,143 mmoles) en DMF (1,5 ml); a continuación, se añadió HATU (40,8 mg, 0,107 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 3 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se añadió hidrazina (0,011 ml, 0,357 mmoles) para cortar los productos secundarios no deseados; a continuación, la solución se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se concentró y el producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (gradiente de 5-70 % de ACN/agua, columna C18), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (31 mg, rendimiento: 56 %). (m/z):
[M+H]+ calc. para C31H39N7O3: 558,31; observado: 558,3. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,10 (s, 1H), 12,27 (d, J = 48,92 Hz, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,28 (t, J = 8,10 Hz, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,04 (m, 2H), 6,71 (d, J = 2,46 Hz, 1H), 6,64 (dd, J = 2,50, 8,23 Hz, 1H), 4,44 (t, J = 5,31 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 5,26, 2H), 3,96 (m, 1H), 3,86-3,52 (m, 6H), 3,49 (q, J = 6,01 Hz, 2H), 2,95 (m, 2H), 2,48 (q, J = 7,48 Hz, 2H), 2,42-2,21 (m, 4H), 2,37 (t, J = 6,20 Hz, 2H), 1,42 (m, 2H), 1,00 (t, J = 7,52 Hz, 3H), 0,81 (m, 3H).
Ejemplo 2: ((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)((1S,4S)-5-metil-2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptán-2-il)metanona
Figure imgf000027_0002
Se disolvió ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (I-20) (40 mg, 0,071 mmoles), dihidrobromuro de (1S,4S)-5-metil-2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptano (29,4 mg, 0,107 mmoles) y DIPEA (0,062 ml, 0,357 mmoles) en DMF (1,5 ml); después se añadió HATU (40,8 mg, 0,107 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 3 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se añadió hidrazina (0,011 ml, 0,357 mmoles) para cortar los productos secundarios no deseados; a continuación, la solución se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se concentró la mezcla de reacción y el producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (gradiente de 5-70 % de ACN/agua, columna C18), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (32 mg, rendimiento: 59 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C31H37N7O2: 540,30; observado: 540,3.
Ejemplo 3: ((S)-2,4-dimetilpiperazín-1-il)((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)metanona
Figure imgf000027_0003
(a) (S)-4-((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carbonil)-3-metilpiperazín-1-carboxilato de terc-butilo (I-25)
Se disolvió ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (I-21) (55 mg, 0,103 mmoles), (S)-4-n-boc-2-metilpiperazina (41,5 mg, 0,207 mmoles) y DIPEA (0,036 ml, 0,207 mmoles) en DMF (1,5 ml); a continuación, se añadió HATU (59,0 mg, 0,155 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 16 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se añadió hidrazina (0,016 ml, 0,517 mmoles) para cortar los productos secundarios no deseados; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se concentró y el producto en bruto se purificó mediante cromatografía de fase inversa (gradiente de 5-70 % de ACN/agua, columna C18 de 50 g), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (54 mg, rendimiento: 72 %). (m/z):
[M+H]+ calc. para C33H41N7O4: 600,33; observado: 600,3.
(b) ((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)((S)-2-metilpiperazín-1-il)metanona (I-26)
Se disolvió (S)-4-((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carbonil)-3-metilpiperazín-1-carboxilato de terc-butilo, TFA (I-25) (0,126 g, 0,177 mmoles) en dioxano (1,5 ml) y agua (0,3 ml); a continuación, se añadió solución de ácido clorhídrico 4 M en dioxano (1,5 ml, 6,00 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 2 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). La mezcla de reacción se congeló y se liofilizó, y los polvos resultantes se utilizaron directamente en la reacción siguiente (se partió de que el rendimiento era cuantitativo). (m/z): [M+H]+ calc. para C28H33N7O2: 500,27; observado: 500,3.
(c) ((S)-2,4-dimetilpiperazín-1-il)((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)metanona
Se disolvió ((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)((S)-2-metilpiperazín-1-il)metanona, dihidrocloruro (0,101 g, 0,176 mmoles) y solución de formaldehído, al 37 % en peso en agua (0,016 ml, 0,212 mmoles) en metanol (3,0 ml); a continuación, se añadió cianoborohidruro sódico (0,055 g, 0,882 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 16 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se añadió borohidruro sódico (7 mg, 0,176 mmoles) para desactivar cualquier formaldehído remanente. Se concentró la mezcla de reacción; a continuación, se purificó el producto en bruto mediante HPLC preparativa (gradiente de 5-60 % de ACN/agua, columna C18), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (28 mg, rendimiento: 21 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C29H35N7O2: 514,29; observado: 514,3.
Ejemplo 4: (S)-(2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)(4-metil-1,4-diazepán-1-il)metanona
Figure imgf000028_0001
Se disolvió ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (I-19) (50 mg, 0,089 mmoles), 1-metilhomopiperazina (0,022 ml, 0,179 mmoles) y DIPEA (0,031 ml, 0,179 mmoles) en DMF (1,5 ml); a continuación, se añadió HATU (51,0 mg, 0,134 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 3 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se añadió hidrazina (0,014 ml, 0,447 mmoles) para cortar los productos secundarios no deseados y la solución se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se concentró y el producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (gradiente de 2-70 % de ACN/agua, columna C18), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (29 mg, rendimiento: 42 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C31H39N7O2: 542,32; observado: 542,3. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,08 (s, 1H), 12,21 (d, J = 29,9 Hz, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,27 (d, J = 8,33 Hz, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,04 (t, J = 8,05, 2H), 6,71 (d, J = 2,53 Hz, 1H), 6,64 (dd, J = 2,54, 8,23 Hz, 1H), 4,11 (m, 3H), 3,91-3,52 (m, 6H), 2,97 (m, 1H), 2,91-2,53 (m, 4H), 2,49 (q, J = 7,46, 2H), 2,23 (d, J = 13,9 Hz, 3H), 1,76 (m, 2H), 1,0 (m, 9H).
- - - - - - - - - - - - - , , , - - - , - - -il)((R)-4-(2-hidroxietil)-2-metilpiperazín-1-il)metanona
Figure imgf000029_0001
Se disolvió ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (I-21) (55 mg, 0,103 mmoles), (R)-2-(3-metilpiperazín-1-il)etán-1-ol, dihidrocloruro (I-24) (33,7 mg, 0,155 mmoles) y DIPEA (0,090 ml, 0,517 mmoles) en DMF (1,5 ml); a continuación, se añadió HATU (59,0 mg, 0,155 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 16 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se añadió hidrazina (0,016 ml, 0,517 mmoles) para cortar los productos secundarios no deseados; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se concentró y el producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (gradiente de 5-70 % de ACN/agua, columna C18), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (22 mg, rendimiento: 28 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C30H37N7O3: 544,30; observado: 544,3.
Ejemplo 6: ((S)-3-(dimetilamino)pirrolidín-1-il)((S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)metanona
Figure imgf000029_0002
Se disolvió ácido (S)-2-(6-(2-etil-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (I-19) (50 mg, 0,089 mmoles), (S)-(-)-3-(dimetilamino)pirrolidina (0,023 ml, 0,179 mmoles) y DIPEA (0,031 ml, 0,179 mmoles) en DMF (1,5 ml); a continuación, se añadió HATU (51,0 mg, 0,134 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 3 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se añadió hidrazina (0,014 ml, 0,447 mmoles) para cortar los productos secundarios no deseados, y la solución se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se concentró y el producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (gradiente de 5-70 % de ACN/agua, columna C18), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (37 mg, rendimiento: 53 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C31H39N7O2: 542,32; observado: 542,3.
Preparación 9: 2-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano
Figure imgf000029_0003
(a) 1-(Benciloxi)-4-bromo-5-etil-2-fluorobenceno
A una solución of 4-bromo-5-etil-2-fluorophenol (20 g, 910,32 mmoles) en ACN (250 ml) se añadió K2CO3 (31,55 g, 228,3 mmoles) seguido de bromuro de bencilo (13,10 ml, 109,58 mmoles) gota a gota. La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación a 80 °C durante 2 h. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (tres veces), se agrupó y se lavó con solución hipersalina. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se evaporó bajo presión reducida, proporcionando el intermediario del título en forma de un líquido aceitoso amarillo pálido (25 g, rendimiento: 89 %). RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,48 - 7,30 (m, 5H), 7,27 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 5,12 (s, 2H), 2,66 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 1,16 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
(b) 2-(4-(Benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano
A una solución del producto de la etapa anterior (12,5 g, 40,45 mmoles) en dioxano (100 ml) se añadió bis(pinacolato)diboro (15,40 g, 60,67 mmoles) y KOAc (11,9 g, 121,35 mmoles). La mezcla de reacción se purgó con nitrógeno durante 15 min seguido de la adición de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II), complejo con diclorometano (1,65 g, 2,023 mmoles). La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación y se calentó a 110 °C durante 3 h, se filtró a través de Celite y el residuo se lavó con EtOAc. El filtrado se diluyó con un exceso de EtOAc (200 ml) y se lavó con agua (100 ml), seguido de solución hipersalina (100 ml), se secó sobre sulfato sódico y se concentró al vacío, obteniendo el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (100-200), eluyendo con EtOAc al 3-5 %: hexano, proporcionando el producto deseado en forma de un sólido blanquecino (9,50 g, rendimiento: 66 %). RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,54 - 7,27 (m, 6H), 6,81 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 2,84 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 1,32 (s, 12H), 1,14 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
Preparación 10: 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-3-(trimetilestanil)-1H-indazol
Figure imgf000030_0001
(a) 6-(4-(Benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-1H-indazol
A una solución of 6-bromo-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-1H-indazol (50 g, 178,57 mmoles) y 2-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (76,3 g, 214,29 mmoles) en DMF:H2O (480:120 ml) se añadió K3PO4 (94,64 g, 446,86 mmoles). La mezcla de reacción se desgasificó con nitrógeno durante 15 min, seguido de la adición de catalizador Pd(PPh3)2Cl2 (6,26 g, 8,93 mmoles) y la mezcla se desgasificó nuevamente con nitrógeno durante 5 min bajo agitación y se calentó a 100-110 °C durante 5 h. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y el residuo se lavó con EtOAc. El filtrado se diluyó con EtOAc, se lavó con agua fría y solución hipersalina, se secó sobre sulfato sódico y se concentró al vacío, proporcionando el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía de columna flash, proporcionando el intermediario del título en forma de un sólido blanco (65 g, rendimiento: 86 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C27H27FN2O2: 431,21; observado: 431,46. RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 8,06 - 7,98 (m, 2H), 7,70 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,51 - 7,32 (m, 5H), 7,08 (dd, J = 809,6, 8,3 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,76 - 5,64 (m, 1H), 5,20 (s, 2H), 4,04 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 3,72 (t, J = 9,7 Hz, 1H), 2,52 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 2,22 - 2,02 (m, 3H), 1,80 - 1,71 (m, 3H), 1,06 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
(b) 6-(4-(Benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1H-indazol
A una solución del producto de la etapa anterior (65 g, 151,16 mmoles) en metanol (700 ml) se añadió HCl conc. (120 ml) y la solución resultante se calentó a 60-65 °C durante 3 h, se enfrió a TA y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en EtOAc y se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO3 y agua. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío, proporcionando el intermediario del título en forma de un sólido blanco (52 g, 99 % (en bruto)). RMN 1H (400 MHz, Cloroformo-d) δ 8.13 (s, 1H), 7,77 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,59 - 7,30 (m, 6H), 7,10 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,21 (s, 2H), 2,53 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
(c) 6-(4-(Benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3-yodo-1H-indazol
[0166] A una solución of 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1H-indazol (56 g, 161,18 mmoles) en DMF (400 ml) se añadió KOH (36,2 g, 647,39 mmoles) y la mezcla se sometió a agitación durante 5 min. Se añadió una solución de yodo (82,2 g, 323,69 mmoles) en DMF (100 ml) lentamente a 0 °C y se sometió a agitación a TA durante 30 min, se diluyó con agua (3×150 ml) y se extrajo con EtOAc (3×200 ml). La capa orgánica se lavó con solución acuosa saturada de metabisulfito sódico (3×200 ml) y agua (400 ml), se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró bajo presión reducida, obteniendo producto en bruto que se purificó mediante cromatografía de columna, proporcionando el intermediario del título en forma de un semisólido parduzco (64 g, rendimiento: 84 %). RMN 1H (400 MHz, cloroformod) δ 10,49 (s, 1H), 7,57 - 7,32 (m, 7H), 7,16 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,04 - 6,91 (m, 2H), 5,20 (s, 2H), 2,51 (q, J = 7,4 Hz, 2H), 1,04 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
(d) 6-(4-(Benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3-yodo-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-1H-indazol
A una solución helada del producto de la etapa anterior (60 g, 127,12 mmoles) en DCM (700 ml) se añadió ácido ptoluenosulfónico (4,84 g, 25,423 mmoles) seguido de 3,4-dihidro-2H-pirano (17,43 ml, 190,68 mmoles) gota a gota. La mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante la noche, se diluyó con DCM y se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO3 y solución hipersalina. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró bajo presión reducida, proporcionando el producto en bruto, que se purificó mediante cromatografía flash (gel de sílice), proporcionando el intermediario del título en forma de un sólido blanquecino (64 g, rendimiento: 91 %).
(m/z): [M+H]+ calc. para C27H26FIN2O2: 557,10; observado: 557,30. RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 7,56 - 7,31 (m, 7H), 7,14 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,68 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 5,20 (s, 2H), 4,08 - 3,99 (m, 1H), 3,77 - 3,64 (m, 1H), 2,50 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 2,23 - 1,97 (m, 3H), 1,81 - 1,68 (m, 3H), 1,06 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
(e) 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-3-(trimetilestanil)-1H-indazol
A una solución of 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3-yodo-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-1H-indazol (20 g, 35,97 mmoles) en tolueno (150 ml) se añadió hexametildiestaño (9,2 ml, 43,17 mmoles). La mezcla de reacción se desgasificó con nitrógeno durante 20 min, seguido de la adición de tetrakis (2,0 g, 1,80 mmoles) y después se sometió a agitación a 100 °C durante 2 h, se enfrió hasta la TA, se filtró a través de Celite y el residuo se lavó con EtOAc. El filtrado se concentró y se purificó mediante cromatografía de columna (sobre alúmina neutra), eluido con EtOAc al 2-5 %:hexano, proporcionando el compuesto del título (17,50 g, rendimiento: 82 %).
(m/z): [M+H]+ calc. para C30H35FN2O2Sn 595,17, 593,17; observado: 595,49, 593,55. RMN 1H (400 MHz, cloroformod) δ 7,68 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,57 - 7,29 (m, 6H), 7,13 - 7,00 (m, 2H), 6,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,81 - 5,68 (m, 1H), 5,21 (s, 2H), 4,13 - 4,00 (m, 1H), 3,81 - 3,66 (m, 1H), 2,54 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 2,23 - 2,00 (m, 2H), 1,87 - 1,59 (m, 4H), 1,08 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 0,47 (s, 9H).
Preparación 11: (S)-2-yodo-3-((2-trimetilsilil)etoxi)metil)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 5- terc-butil-6-metilo
Figure imgf000031_0001
(a) Ácido (S)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico
A una suspensión bajo agitación de L-histidina (50 g, 322,24 mmoles) en agua (420 ml) se añadió HCl conc. (29 ml) gota a gota a 0 °C seguido de formaldehído (55 ml, 676,72 mmoles) de una vez a 0 °C. La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación durante 30 min y después se calentó a 75 °C durante 6 h y se concentró. El producto en bruto resultante se sometió a agitación durante 2 h con éter dietílico, se filtró y se lavó con IPA:THF (100:300 ml), proporcionando la sal HCl del intermediario del título en forma de un sólido blanquecino (75 g, rendimiento: 99 % (en bruto)). (m/z): [M+H]+ calc. para C7H9N3O2: 168,07; observado: 168,17.
(b) (S)-4,5,6,7-Tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxilato de metilo
A una solución bajo agitación del producto de la etapa anterior (75,0 g, 312,5 mmoles) en metanol (1500 ml) se añadió SOCl2 (45,6 ml, 625 mmoles) gota a gota a 0 °C y se sometió a agitación a TA durante 16 h, después se calentó a reflujo (70 °C) durante 1 h. El solvente se eliminó mediante destilación y el producto en bruto se trituró con metanol, seguido de éter dietílico, proporcionando la sal HCl en bruto del intermediario del título en forma de un sólido blanquecino (80 g en bruto).
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,05 (s, 1H), 4,71 (dd, J = 9,4, 5,2 Hz, 1H), 4,36 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,44 - 3,21 (m, 2H).
(c) (S)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 5-(terc-butil)-6-metilo
A una solución bajo agitación del producto de la etapa anterior (80,0 g, 314,96 mmoles) en metanol (1000 ml) se añadió DIPEA (282 ml, 1574 mmoles) seguido de dicarbonato de di-terc-butilo (172 ml, 787,48 mmoles) a 0 °C. La mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante 16 h y después se añadió NH3 líquido (150 ml, al 25 % en agua) y la mezcla de reacción se sometió a agitación nuevamente durante 16 h a TA, se eliminó el metanol mediante destilación y el residuo se extrajo en DCM (3×200 ml). Los extractos orgánicos agrupados se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía flash (gel de sílice de malla 100-200), se eluyeron con MeOH al 5 %:DCM, proporcionando el intermediario del título (41 g, rendimiento: 46 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C13H19N3O4: 282,14; observado: 282,21. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,85 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 5,18 (dd, J = 49,3, 5,1 Hz, 1H), 4,51 (t, J = 14,2 Hz, 1H), 4,09 (dd, J = 43,9, 16,1 Hz, 1H), 3,59 (s, 3H), 3,08 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 2,94 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 1,45 (s, 9H).
(d) (S)-2-Yodo-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 5-(terc-butil)-6-metilo
A una solución del producto de la etapa anterior (41,0 g, 145,9 mmoles) en THF (500 ml) se añadió A-yodosuccinimida (66,0 g, 291,8 mmoles) a 0 °C y la solución resultante se sometió a agitación a TA durante 4 h, se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La parte orgánica se lavó con solución al 10 % de tiosulfato sódico (3×200 ml). La capa orgánica agrupada se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró, proporcionando el compuesto del título, 60 g (en bruto), que se utilizó en la etapa siguiente sin purificación adicional. (m/z): [M+H]+ calc. para C13H18IN3O4: 408,03; observado: 408,31. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,48 (s, 1H), 5,34 - 4,97 (m, 1H), 4,67 - 4,35 (m, 1H), 4,12 - 3,95 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,14 - 2,82 (m, 2H), 1,44 (s, 9H).
(e) (S)-2-Yodo-3-((2-trimetilsilil)etoxi)metil)-3,4,6,7-tetrahidro -5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 5-(tercbutil)-6-metilo.
A una solución bajo agitación de (S)-2-yodo-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 5-(tercbutil)-6-metilo (40 g, 0,098 moles) en DMF (150 ml) se añadió DIPEA (35,1 ml, 0,19 moles) a 0°C. La mezcla de reacción se sometió a agitación durante 10 min y a continuación se añadió cloruro de 2-(trimetilsilil)-etoximetilo (19,1 ml, 0,10 moles) gota a gota a 0 °C. La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación durante 3 h a TA. Tras 4 h, se añadió agua fría y la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (2×200 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, se concentró y se purificó mediante cromatografía flash, se eluyó con EtOAc al 20-35 %:hexano, proporcionando el producto del título en forma de un líquido viscoso amarillo pálido (27 g). (m/z): [M+H]+ calc. para C19H32IN3O5Si: 538,12; observado: 538,42. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 5,33 - 5,04 (m, 3H), 4,79 - 4,56 (m, 1H), 4,54 - 4,14 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,47 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 3,31 - 3,16 (m, 1H), 2,97 (t, J = 18,9 Hz, 1H), 1,44 (s, 9H), 0,92 - 0,74 (m, 2H), -0,03 (s, 9H).
Preparación 12: ácido (6S)-5-(terc-butoxicarbonil)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico
Figure imgf000032_0001
(a) (6S)-2-(6-(4-(Benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi) metil)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 5-(terc-butil)-6-metilo
A una solución bajo agitación de (S)-2-yodo-3-((2-trimetilsilil)etoxi)metil)-3,4,6,7-tetrahidro -5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 5-(terc-butil)-6-metilo (17,0 g, 31,65 mmoles) en tolueno (500 ml) se añadió 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-3-(trimetilestanil)-1H-indazol (20 g, 34,82 mmoles). La mezcla de reacción se purgó con argón durante 15 min, se añadió Pd(PPh3)4 (3,6 g, 3,16 mmoles) y yoduro de cobre (1,20 g, 6,33 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a 120 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite; el filtrado se concentró bajo presión reducida y se purificó mediante cromatografía de columna en gel de sílice (columna Redisep de 80 g, eluido con DCM durante 10 min y después EtOAc al 15-20 % en hexano, proporcionando el intermediario del título en forma de un sólido amarillo (15,10 g, rendimiento de 58 %).
(m/z): [M+H]+ calc. para C46H58FN5O7Si: 840,41; observado: 840,54. RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) δ 8,43 (s, 1H), 7,54 - 7,33 (m, 6H), 7,20 (s, 1H), 7,05 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,09 - 5,69 (m, 3H), 5,59 - 5,36 (m, 1H), 5,20 (s, 2H), 4,97 - 4,80 (m, 1H), 4,12 - 3,90 (m, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,57 - 3,47 (m, 2H), 3,40 (d, 1H), 3,21 -3,05 (m, 1H), 2,74 - 2,34 (m, 4H), 2,25 - 2,07 (m, 2H), 1,94 - 1,65 (m, 4H), 1,54 (s, 9H), 1,12 - 0,99 (m, 3H), 0,91 - 0,75 (m, 2H), -0,12 (s, 9H).
(b) (6S)-2-(6-(4-(Benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridín-5,6-dicarboxilato de 6-bencil-5-(terc-butilo) A un matraz de fondo redondo se añadió el producto de la etapa anterior (15,0 g, 17,85 mmoles) en tolueno (400 ml), alcohol bencílico (46,3 ml) y Ti(OEt)4 (7,15 ml, 35,70 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a reflujo vigorosamente (140 °C) durante 48 h, se diluyó con agua y se extrajo con DCM. La suspensión se filtró, el filtrado se secó sobre Na2SO4, se concentró bajo presión reducida y se purificó mediante cromatografía de columna en gel de sílice (columna Redisep de 80 g, EtOAc al 0-5 % en hexanos) durante 20 min para eliminar el exceso de alcohol bencílico; después se eluyó con EtOAc al 10-15 % en hexano), proporcionando el intermediario del título. RMN 1H consistente con la estructura. (m/z): [M+H]+ calc. para C52H62FN5O7Si: 916,44; observado: 916,86.
(c) Ácido (6S)-5-(terc-butoxicarbonil)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico
A una solución bajo agitación del producto de la etapa anterior (21,0 g, 22,92 mmoles) en 1:1 IPA:THF (400 ml) se añadió Pd(OH)2 (5,0 g). La mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante 16 h bajo un balón de hidrógeno, se filtró a través de Celite, se concentró bajo presión reducida y se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice (columna Redisep de 80 g, se eluyó con EtOAc al 25-40 % en hexano), proporcionando el compuesto del título (6,1 g, 8,29 mmoles) en forma de un sólido blanquecino). (m/z): [M+H]+ calc. para C38H50FN5O7Si: 736,35; observado: 736,5. RMN 1H consistente con la estructura. (m/z): [M+H]+ calc. para C38H50FN5O7Si: 736,35; observado: 736,5. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,94 (s, 1H), 9,86 (s, 1H), 8,34 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,20 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 6,11 - 5,77 (m, 3H), 5,33 - 5,06 (m, 1H), 4,87 - 4,56 (m, 1H), 4,52 - 4,14 (m, 1H), 3,97 - 3,69 (m, 2H), 3,53 - 3,40 (m, 2H), 3,23 - 3,11 (m, 1H), 3,11 - 2,93 (m, 1H), 2,47 - 2,44 (m, 2H), 2,13 - 1,96 (m, 2H), 1,68 (d, J = 70,9 Hz, 4H), 1,48 (s, 9H), 1,02 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 0,86 - 0,68 (m, 2H), -0,17 (s, 9H).
Preparación 13: ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico
Figure imgf000033_0001
A una solución bajo agitación de ácido (6S)-5-(terc-butoxicarbonil)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1-(tetrahidro-2H-pirán-2-il)-1H-indazol-3-il)-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)-metil)-4,5,6,7-tetrahidro-3/7-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico (5,7 g, 7,75 mmoles) en dioxano:agua 5:1 (60 ml) se añadió HCl conc. (20 ml) gota a gota a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó y se sometió a agitación a 90 °C durante 16 h y se destiló bajo vacío, proporcionando el residuo en bruto, que se trituró secuencialmente con éter dietílico frío y acetonitrilo, proporcionando la sal HCl del compuesto del título (3,6 g, rendimiento: 95 %) en forma de un sólido marrón pálido. (m/z): [M+H]+ calc. para C22H20FN5O3: 422,16; observado: 422,24. RMN 1H (400 MHz, D2O/DMSO-d6) δ 8,22 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,19 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 6,99 (d, J = 11,9 Hz, 1 H), 6,91 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,56-4,51 (m, 1H), 4,36 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 3,35 - 3,25 (m, 1H), 3,15 - 3,05 (m, 1H), 2,4 - 2,55 (m, 2H), 0,97 (t, J = 7,5 Hz, 3H).
Preparación 14: ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico
Figure imgf000034_0001
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, HCl (400 mg, 0,874 mmoles) y propionaldehído (0,095 ml, 1,310 mmoles) en DMF (7 ml) se añadió cianoborohidruro sódico (165 mg, 2,62 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a la TA durante la noche. Se añadió borohidruro sódico (33 mg, 0,874 mmoles), se concentró la solución, y se purificó mediante HPLC preparativa, proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (179 mg, rendimiento: 37 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C25H26FN5O3: 464,20; observado: 464,5.
Preparación 15: ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico
Figure imgf000034_0002
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, HCl (400 mg, 0,874 mmoles), acetona (0,192 ml, 2,62 mmoles) y ácido acético (0,150 ml, 2,62 mmoles) en DMF (7 ml); se añadió cianoborohidruro sódico (274 mg, 4,37 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante la noche. Se añadió borohidruro sódico (33 mg, 0,874 mmoles), se concentró la solución y se purificó mediante HPLC preparativa, proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (115 mg, rendimiento: 23 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C25H26FN5O3: 464,20; observado: 464,5.
Preparación 16: ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico
Figure imgf000034_0003
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, HCl (8') (300 mg, 0,655 mmoles) y formaldehído al 37 % en peso en agua (0,059 ml, 0,786 mmoles) DMF (5 ml), se añadió cianoborohidruro sódico (165 mg, 2,62 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante la noche. Se añadió borohidruro sódico (25 mg, 0,655 mmoles), se concentró la solución y se purificó mediante cromatografía flash (columna de 100 g, 5-75 % de ACN/agua), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (85 mg, rendimiento: 24 %).
(m/z): [M+H]+ calc. para C23H22FN5O3: 436,17; observado: 436,45.
Ejemplo 7: (S)-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)(4-(2-hidroxietil)piperazín-1-il)metanona C-1
Figure imgf000035_0001
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,052 mmoles), 2-(piperazín-1-il)etanol, 2HCl (0,19 ml, 0,156 mmoles) y DIPEA (0,027 mL, 0,156 mmoles) en DMF (1,5 ml) se añadió HATU (29,6 mg, 0,078 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante la noche. Se añadió hidrazina (5 eq.), se concentró la mezcla de reacción y se purificó mediante HPLC preparativa, proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (15,4 mg, rendimiento: 37 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C31H38FN7O3: 576,30; observado: 576,2.
Ejemplo 8: ((S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)((1S,4S)-5-metil-2,5-diazabiciclo-[2.2.1]heptán-2-il)metanona C-2
Figure imgf000035_0002
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-propil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,052 mmoles), dihidrobromuro de (1S,4S)-5-metil-2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptano (42,7 mg, 0,156 mmoles) y DIPEA (0,064 ml, 0,364 mmoles) en DMF (1,5 ml) se añadió HATU (29,6 mg, 0,078 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante la noche. Se añadió hidrazina (5 eq.), se concentró la mezcla de reacción y se purificó mediante HPLC preparativa, proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (27 mg, rendimiento: 66 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C31H36FN7O2: 558,29; observado: 558,3. RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,17 (dt, 1H), 7,59 - 7,50 (m, 1H), 7,32 (dd, 1H), 6,95 (d, 1H), 6,90 (d, 1H), 5,03 - 4,91 (m, 2H), 4,56 - 4,34 (m, 2H), 4,30 - 3,88 (m, 4H), 3,76 - 3,55 (m, 1H), 3,28 - 3,10 (m, 1H), 3,10 - 2,96 (m, 4H), 2,81 - 2,62 (m, 2H), 2,53 (q, 2H), 2,47 - 2,33 (m, 1H), 2,31 - 2,14 (m, 1H), 1,79 - 1,57 (m, 2H), 1,07 (t, 3H), 0,97 (td, 3H).
Ejemplo 9: ((S)-2,4-dimetilpiperazín-1-il)((S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)metanona C-3
Figure imgf000035_0003
(a) (S)-4-((S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carbonil)-3-metilpiperazín-1-carboxilato de terc-butilo
Se disolvió ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico (0,120 g, 0,276 mmoles), (S)-4-n-boc-2-metilpiperazina (0,110 g, 0,551 mmoles) y DIPEA (0,096 ml, 0,551 mmoles) en DMF (3,0 ml); a continuación, se añadió HATU (0,157 g, 0,413 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 16 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL EM). Se añadió hidrazina (0,043 ml, 1,378 mmoles) para cortar los productos secundarios no deseados; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se concentró y el producto en bruto se purificó mediante cromatografía de fase inversa (gradiente de 5-70 % de ACN/agua, columna C18 de 50 g), proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (126 mg, rendimiento: 62 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C33H40FN7O4: 618,32; observado: 618,3.
(b) ((S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)((S)-2-metilpiperazín-1-il)metanona
Se disolvió (S)-4-((S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carbonil)-3-metilpiperazín-1-carboxilato de terc-butilo, TFA (0,126 g, 0,172 mmoles) en dioxano (1,5 ml) y agua (0,3 ml); a continuación, se añadió ácido clorhídrico 4 M en dioxano (1,5 ml, 49,4 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 1 hora (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). La mezcla de reacción se congeló y se liofilizó, y los polvos resultantes se utilizaron directamente en la reacción siguiente (se partió de que el rendimiento era cuantitativo). (m/z):
[M+H]+ calc. para C28H32FN7O2: 518,26; observado: 518,3.
(c) ((S)-2,4-dimetilpiperazín-1-il)((S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)metanona
Se disolvió ((S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)((S)-2-metilpiperazín-1-il)metanona, dihidrocloruro (0,102 g, 0,173 mmoles) y solución de formaldehído, al 37 % en peso en agua (0,015 ml, 0,207 mmoles) en metanol (3,0 ml); a continuación, se añadió cianoborohidruro sódico (0,054 g, 0,864 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 20 horas (el progreso de la reacción se siguió mediante CL-EM). Se añadió borohidruro sódico (7 mg, 0,173 mmoles) para desactivar cualquier formaldehído remanente. Se concentró la mezcla de reacción; a continuación, el producto en bruto se purificó mediante HPLC preparativa (gradiente de 5-60 % de ACN/agua, columna C18), proporcionando el compuesto del título en forma de sal TFA (59 mg, rendimiento: 45 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C29H34FN7O2: 532,28; observado: 532,3.
Ejemplo 10: (S)-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)(4-metil-1,4-diazepan-1-il)metanona C-4
Figure imgf000036_0001
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,052 mmoles), 1-metilhomopiperazina (0,019 ml, 0,156 mmoles) y DIPEA (0,036 ml, 0,208 mmoles) en DMF (1 ml) se añadió HATU (29,6 mg, 0,078 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante 3 h. Se añadió hidrazina (5 eq.) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante 10 min, se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa, proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (26,9 mg, rendimiento: 66 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C31H38FN7O2: 560,31; observado: 560,2.
Ejemplo 11: ((S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)((R)-4-(2-hidroxietil)-2-metil-piperazín-1-il)metanona C-5
Figure imgf000036_0002
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-metil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (30 mg, 0,052 mmoles), (R)-2-(3-metilpiperazín-1-il)etanol, 2 HCl (35,6 mg, 0,164 mmoles) y DIPEA (0,057 ml, 0,328 mmoles) en DMF (1 ml) se añadió HATU (31,1 mg, 0,082 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a la TA durante la noche. Se añadió hidrazina (8,57 µl, 0,273 mmoles) y se concentró la mezcla de reacción y se purificó mediante HPLC preparativa, proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (15,6 mg, rendimiento: 36 %).
(m/z): [M+H]+ calc. para C30H36FN7O3: 562,29; observado: 562,2.
Ejemplo 12: ((S)-3-(dimetilamino)pirrolidín-1-il)((S)-5-etil-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)metanona C-6
Figure imgf000037_0001
A una solución de ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (179 mg, 0,310 mmoles), (S)-N,N-dimetilpirrolidín-3-amina (0,079 ml, 0,620 mmoles) y DIPEA (0,162 ml, 0,930 mmoles) en DMF (4 ml) se añadió HATU (177 mg, 0,465 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante la noche. Se añadió hidrazina (5 eq.), se concentró la mezcla de reacción y se purificó mediante HPLC preparativa, proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (107 mg, rendimiento: 44 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C31H38FN7O2: 560,31; observado: 560,2. RMN 1H (400 MHz, metanol-d4) δ 8,21 (d, 1H), 7,50 (s, 1H), 7,26 (d, 1H), 6,94 (d, 1H), 6,90 (d, 1H), 4,83 - 4,66 (m, 1H), 4,48 - 4,25 (m, 2H), 4,23 - 4,12 (m, 1H), 4,12 - 3,93 (m, 2H), 3,93 - 3,63 (m, 3H), 3,62 - 3,48 (m, 1H), 3,26 - 3,09 (m, 1H), 2,98 (d, 6H), 2,67 - 2,57 (m, 1H), 2,53 (q, 2H), 2,44 - 2,12 (m, 1H), 1,41 (t, 3H), 1,31 (d, 3H), 1,05 (t, 3H).
Ejemplo 13: (S)-(3-(dimetilamino)azetidín-1-il)(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-il)metanona D-1
Figure imgf000037_0002
A una solución of ácido (S)-2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-1H-indazol-3-il)-5-isopropil-4,5,6,7-tetrahidro-3H-imidazo[4,5-c]piridín-6-carboxílico, TFA (179 mg, 0,310 mmoles), N,N-dimetilazetidin-3-amina, 2 HCl (107 mg, 0,465 mmoles) y DIPEA (0,162 ml, 0,930 mmoles) en DMF (4 ml), se añadió HATU (177 mg, 0,465 mmoles) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a TA durante la noche. Se añadió hidrazina (5 eq.), se concentró la mezcla de reacción y se purificó mediante HPLC preparativa, proporcionando la sal de TFA del compuesto del título (63 mg, rendimiento: 26 %). (m/z): [M+H]+ calc. para C30H36FN7O2: 546,29; observado: 546,7. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,90 (s, 1H), 8,29 (dd, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,07 (d, 1H), 7,01 (d, 1H), 6,89 (d, 1H), 4,35 - 4,18 (m, 1H), 4,11 - 3,94 (m, 1H), 3,94 - 3,73 (m, 3H), 3,70 - 3,57 (m, 2H), 3,06 - 2,94 (m, 2H), 2,87 - 2,66 (m, 2H), 2,48 - 2,40 (m, 2H), 2,13 - 2,00 (m, 6H), 1,07 (t, 3H), 1,03 - 0,93 (m, 6H).
Ensayos biológicos
Los compuestos de la invención se caracterizaron en uno o más de los ensayos biológicos siguientes.
Ensayo 1: ensayos bioquímicos de quinasa JAK.
Se llevó a cabo un panel de cuatro ensayos bioquímicos LanthaScreen de JAK (JAK 1, 2, 3 y Tyk2) en un tampón de reacción de quinasa habitual (HEPES 50 mM, pH 7,5, Brij-35 al 0,01 %, MgCl210 mM y EGTA 1 mM). Los enzimas JAK etiquetados con GST recombinantes y un sustrato peptídico STAT1 etiquetado con GFP se obtuvieron de Life Technologies.
Se preincubaron compuestos diluidos en serie con cada uno de los cuatro enzimas JAK y el sustrato en microplacas blancas de 384 pocillos (Corning) a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, se añadió ATP para iniciar las reacciones de quinasa en un volumen total de 10 µl, con DMSO al 1 %. Las concentraciones de enzima finales para JAK 1, 2, 3 y Tyk2 eran de 4,2 nM, 0,1 nM, 1 nM y 0,25 nM, respectivamente; las concentraciones Km de ATP correspondientes utilizadas fueron de 25 µM, 3 µM, 1.6 µM y 10 µM, mientras que la concentración de sustrato era de 200 nM para la totalidad de los cuatro ensayos. Se dejó que continuasen las reacciones de quinasa durante 1 hora a temperatura ambiente antes de añadir una preparación de 10 µl de EDTA (concentración final: 10 mM) y Tb-anticuerpo anti-pSTAT1 (pTyr701) (Life Technologies, concentración final: 2 nM) en tampón de dilución TR-FRET (Life Technologies). Las placas se dejaron bajo incubación a temperatura ambiente durante 1 h antes de leerlas en el lector EnVision (Perkin Elmer). Se registraron las señales de relación de emisiones (520 nm/495 nm) y se utilizaron para calcular los valores en porcentaje de inhibición basados en los controles de DMSO y de fondo.
Para el análisis de dosis-respuesta, los datos porcentuales de inhibición se representaron frente a las concentraciones de compuesto y se determinaron los valores de IC50 a partir de un modelo de ajuste robusto de 4 parámetros con el software Prism (GraphPad Software). Los resultados se expresaron como pIC50 (logaritmo negativo de IC50) y posteriormente se convirtieron en pKi (logaritmo negativo de la constante de disociación, Ki) utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff.
Los compuestos de ensayo con un valor de Ki más bajo o un valor de pKi más alto en cada uno de los cuatro ensayos de JAK mostraron una mayor inhibición de la actividad de JAK.
Ensayo 2: inhibición de pSTAT5 estimulada por IL-2 en células T Tall-1.
Se midió la potencia de los compuestos de ensayo para la inhibición de la fosforilación de STATS estimulada por interleuquina-2 (IL-2) en la línea celular de linfocitos T humanos Tall-1 (DSMZ) utilizando AlphaLisa. Debido a que IL-2 señaliza a través de JAK1/3, el presente ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK1/3.
Se midió STATS fosforilado mediante el kit AlphaLISA SureFire Ultra pSTAT5 (Tyr694/699) (Perkin Elmer).
Se cultivaron linfocitos T humanos de la línea celular Tall-1 en un incubador a 37 ºC, humidificado y con 5 % de CO2, en RPMI (Life Technologies) complementado con suero de feto bovino inactivado por calor al 15 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies y 1X Pen/Strep (Life Technologies). Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y se dispensaron acústicamente en pocillos vacíos. Los medios de ensayo (DMEM sin rojo fenol (Life Technologies) complementados con FBS al 10 % (ATCC)) se dispensaron (4 µl/pocillo) y las placas se sometieron a agitación a 900 rpm durante 10 min. Las células se sembraron a razón de 45.000 células/pocillo en medio de ensayo (4 µl/pocillo) y se incubaron a 37 ºC, 5 % de CO2 durante 1 hora, seguido de la adición de IL-2 (R&D Systems; concentración final: 300 ng/ml) en medio de ensayo precalentado (4 µl) durante 30 minutos. Tras la estimulación con citoquina, las células se lisaron con 6 µl de 3x tampón de lisis AlphaLisa (Perkin Elmer) que contenía 1x tabletas PhosStop y cOmplete (Roche). El lisado se sometió a agitación a 900 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). Se midieron los STAT fosforilados mediante el kit pSTAT5 AlphaLisa (Perkin Elmer). Se dispensó mezcla de perlas aceptoras recién preparada sobre el lisado (5 µl) bajo luz verde filtrada de <100 lux. Las placas se sometieron a agitación a 900 rpm durante 2 min, se centrifugaron brevemente y se incubaron durante 2 h a TA en la oscuridad. Se dispensaron las perlas donadoras (5 µl) bajo luz verde filtrada de <100 lux. Las placas se sometieron a agitación a 900 rpm durante 2 minutos, se centrifugaron brevemente y se incubaron durante la noche a TA en la oscuridad. Se midió la luminiscencia bajo excitación a 689 nm y emisión a 570 nm utilizando un lector de placas EnVision (Perkin Elmer) bajo luz verde filtrada de <100 lux.
Para determinar la potencia de inhibición de los compuestos de ensayo en respuesta a IL-2, se midió la intensidad media de emisión de las perlas unidas a pSTAT5 en una línea celular de linfocitos T humanos. Se determinaron los valores de IC50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de intensidad de señal frente a concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pIC50 (logaritmo decadal negativo de IC50) (medias ± desviaciones estándar).
Resultados de ensayo in vitro.
Tabla 1
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(continuación)
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Ensayo 3: modelo murino (ratón) de inducción de pSTAT6 inducida por IL-13 en tejido pulmonar.
La IL-13 es una citoquina importante que subyace a la fisiopatología del asma (Kudlacz et al., Eur. J. Pharmacol, 2008, 582,154-161). IL-13 se une a receptores de superficie celular que activan miembros de la familia Janus de quinasas (JAK), que a continuación fosforilan STAT6 y en consecuencia activan rutas posteriores de transcripción. En el modelo explicado, se administró una dosis de IL-13 localmente en los pulmones de ratones para inducir la fosforilación de STAT6 (pSTAT6), que a continuación se midió como criterio de valoración.
En el ensayo se utilizaron ratones Balb/c adultos de Harlan. El día del estudio, los animales fueron anestesiados levemente con isoflurano y se les administró vehículo o compuesto de ensayo (1 mg/ml, 50 µl de volumen total a lo largo de varias respiraciones) mediante aspiración oral. Los animales se tumbaron de costado después de la dosis y se les realizó un seguimiento hasta la recuperación total de la anestesia antes de devolverlos a su jaula de origen. Cuatro horas después se anestesiaron brevemente de nuevo y se les retó con vehículo o IL-13 (dosis total administrada de 0,03 µg, volumen total: 50 µl) mediante aspiración oral antes de realizarse un seguimiento para la recuperación de la anestesia y devolverlos a su jaula de origen. Una hora después de la administración de vehículo o IL-13, se recolectó sangre completa y los pulmones tanto para la detección de pSTAT6 en homogenados de pulmón utilizando un kit de ensayo AlphaLISA® SureFire® Ultra™ HV p-STAT6 (Tyr641) de Perkin Elmer, como un análisis de concentración total de fármaco en pulmón y plasma. Se centrifugaron muestras de sangre (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos a aproximadamente 12.000 rpm a 4 ºC para recoger plasma. Se enjuagaron los pulmones en DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco), se secaron superficialmente con papel, se congelaron instantáneamente, se pesaron y se homogeneizaron a una dilución de 1:3 en ácido fórmico al 0,1 % en agua para HPLC. Se determinaron los niveles plasmático y pulmonar de compuesto de ensayo mediante análisis de CL-EM frente a patrones analíticos construidos en una curva patrón en la matriz de ensayo. Se determinó una relación de pulmón a plasma como la proporción entre la concentración en pulmón, en ng/g, y la concentración en plasma, en ng/ml, a las 5 horas.
La actividad en el modelo se puso de manifiesto por una reducción del nivel de pSTAT6 presente en los pulmones de los animales tratados a las 5 horas en comparación con animales de control tratados con vehículo y retados con IL-13. La diferente entre los animales de control que habían sido tratados con vehículo, retados con IL-13 y los animales de control que habían sido tratados con vehículo y retados con vehículo marcó los efectos de inhibición de 0 % y 100 %, respectivamente, en cualquier experimento dado. Los compuestos analizados en el ensayo mostraron una inhibición de la fosforilación de STAT6 a las 5 horas después del reto con IL-13, tal como se documenta posteriormente.
Tabla 2: inhibición de pSTAT6 y exposición en plasma/pulmón observada.
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La observación de una concentración significativa en los compuestos sometidos a ensayo en pulmón de ratón confirmó que la inhibición observada de inducción de pSTAT6 inducida por IL-13 fue un resultado de la actividad del compuesto de ensayo. La relación de pulmón a plasma a las 5 horas mostró que los compuestos 1 a 6 mostraban significativamente más exposición en el pulmón que exposición en plasma en los ratones.
Ensayo 4: inhibición de la liberación de TARC evocada por TSLP en células mononucleares de sangre periférica humana.
La linfopoyetina estromal tímica (TSLP, por sus siglas en inglés) y la quimioquina regulada y activada del timo (TARC, por sus siglas en inglés) se sobreexpresaban en las vías respiratorias asmáticas y se correlacionaban con la gravedad de la enfermedad. En los pulmones, la TSLP podría ser liberada por las células epiteliales bronquiales en respuesta a alérgenos e infecciones víricas. La TSLP señaliza a través de un heterodímero IL-7Rα/TSLPR que se encuentra en un amplio abanico de tejidos y tipos celulares, incluyendo células epiteliales, células endoteliales, neutrófilos, macrófagos y mastocitos. La unión de TSLP a su receptor induce un cambio conformacional que activa JAK1 y JAK2 para fosforilar diversos factores de transcripción, incluyendo STATS y STATS. En las células inmunitarias, lo anterior desencadena una cascada de sucesos intracelulares que resulta en proliferación celular, antiapoptosis, migración de células dendríticas y producción de citoquinas Th2 y quimioquinas. En las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), la TSLP posee un efecto proinflamatorio mediante la activación de las células dendríticas mieloides, atrayendo y estimulando los linfocitos T, un proceso mediado por la TARC quimioatrayente.
En el presente ensayo se mostró que la estimulación de TSLP induce la liberación de TARC a partir de las PBMC, y que esta respuesta resulta atenuada de una manera dependiente de la dosis con el tratamiento con compuesto. Se midieron las potencias de los compuestos de ensayo en la inhibición de la liberación de TARC.
Se descongelaron alícuotas de PBMC (previamente aisladas de sangre completa y congeladas en alícuotas a -80 ºC) procedentes de 3 a 5 donantes, a 37 ºC, y se añadieron gota a gota a 40 ml de medio RPMI completo y filtrado a esterilidad, precalentado, en tubos Falcon de 50 ml. Se peletizaron las células y se resuspendieron en medio completo a razón de 2,24x106 células/ml. Las células se sembraron a razón de 85 µl (190.000 células) por pocillo en una microplaca de fondo plano de 96 pocillos tratada para el cultivo de tejidos. Las células se dejaron en reposo durante 1 hora a 37 ºC con 5 % de CO2.
Los compuestos se recibieron como soluciones patrón 10 mM en DMSO. Se llevaron a cabo diluciones en serie de 3,7 veces, generando 9 concentraciones de compuesto de ensayo en DMSO a 300X la concentración final de ensayo. Se llevaron a cabo diluciones intermedias de 150 veces en medio completo, generando compuesto a 2X la concentración de ensayo final utilizando DMSO al 0,2 %. Tras el periodo de reposo de 1 hora, se añadieron 95 µl de compuesto 2X a cada pocillo de PBMC para un abanico de concentraciones finales del ensayo de 33,3 µM a 0,95 µM. Se añadieron 95 µl de DMSO al 0,2 % en medio completo a los pocillos de control no tratados. Las células se pretrataron con compuesto durante 1 hora a 37 ºC con 5 % de CO2 antes de la estimulación.
Se reconstituyó proteína TLSP humana recombinante a 10 µg/ml en DPBS estéril con BSA al 0,1 % y se almacenó en alícuotas a -20 ºC. Inmediatamente antes del uso, se descongeló una alícuota y se preparó a 20X la concentración de ensayo final en medio completo. Se añadieron 10 µl de 20X TSLP a cada pocillo de PBMC para una concentración de ensayo final de 10 ng/ml. Se añadieron 10 µl de medio completo a los pocillos de control no estimulados. Las células se estimularon en la presencia de compuesto durante 48 horas a 37 ºC con 5 % de CO2.
Tras la estimulación, se recolectaron los sobrenadantes de cultivo celular y se detectaron los niveles de TARC mediante ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) utilizando el kit ELISA Quantikine CCL17/TARC humano (R&D Systems, n.º DDN00) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para el análisis de respuesta a dosis, se representó gráficamente el log [compuesto de ensayo (M)] frente a los valores de respuesta en porcentaje para cada donante, y se determinaron los valores de IC50 utilizando un análisis de regresión no lineal con el software GraphPad Prism utilizando el algoritmo de dosis-respuesta sigmoidal de 4 parámetros con pendiente variable. Los datos se expresaron como valores medios de pIC50 (logaritmo decadal negativo de IC50) calculados a partir de los valores de pIC50 de donantes individuales y redondeados un decimal. Los valores de potencia de inhibición por los compuestos originales y sus análogos desfluoro modificados se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3: valores de potencia de inhibición de los compuestos de ensayo de liberación de TARC evocada por TSLP en células mononucleares de sangre periférica humana.
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Ensayo 5: metabolismo de S9 pulmonar.
Se evaluó la estabilidad metabólica in vitro de los compuestos 1 a 6 y de C-1 a C-6 en la fracción S9 pulmonar humana (compuesto 1 µM; proteína S9, 1 mg/ml). Las muestras de 0, 15, 30 y 60 minutos se analizaron para compuesto parental mediante CL-EM/EM de alta resolución. Las fracciones S9 pulmonares de origen humano (lote n.º 1410245) se adquirieron de XenoTech LLC (Lenexa, KS). Se adquirió NADPH (Sigma Aldrich, N1630) y 5-fosfosulfato de 3-fosfoadenosina (PAPS, por sus siglas en inglés) (Sigma Aldrich, A1651) de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Se obtuvo acetonitrilo y agua de VWR (Radnor, PA) y eran de grado HPLC o superior. El raloxifeno y el ácido fórmico se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Las incubaciones de S9 pulmonar se llevaron a cabo en un baño de agua a 37 ºC en una placa de polipropileno de 96 pocillos. Las soluciones de S9 pulmonar consistían en fosfato potásico 100 mM tamponado a pH 7,4 (BD Biosciences, Woburn, MA) complementado con NADPH 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), cloruro de magnesio 3 mM (Sigma Aldrich, M1028) y en presencia de cofactor PAPS 100 µM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), con concentraciones de proteína en la incubación final de 1 mg/ml. Se diluyeron soluciones madre en DMSO 10 mM de raloxifeno (n=1) y de compuesto (n=1) en tampón y se añadieron a las incubaciones, rindiendo concentraciones de sustrato 1 µM (DMSO al 0,001 % v/v). Los volúmenes de incubación de 400 µl y puntos temporales se obtuvieron a los 0, 15, 30 y 60 minutos mediante la extracción de una alícuota de 70 µl y la dilución en 140 µl de acetonitrilo (ácido fórmico al 0 %). Todas las muestras se centrifugaron a 2250 g durante 10 minutos a 5 ºC. Se extrajo el sobrenadante (50 µl) de las muestras centrifugadas y se diluyó en 100 µl de agua para HPLC que contenía el patrón interno. Las muestras se analizaron en un automuestreador Dionex Ultimate 3000 y se analizaron utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución Thermo Q-Exactive (Thermo, Waltham, MA) en modo de escaneo completo junto con una columna Atlantis T33 µM - 2,1x50 mm (Waters Inc., 186003717). La fase móvil A consistía en agua ácido fórmico al 0,2 % y la fase móvil B consistía en acetonitrilo ácido fórmico al 0,2 %. Se consiguió la integración del pico utilizando el software Gubbs GMSU (Gubbs Inc., Alpharetta, GA). Para cada muestra, se calcularon las relaciones de superficie de los picos mediante la división de la superficie del pico del analito por la superficie del pico del patrón interno. Para cada incubación, se fijaron las relaciones de superficie de pico de los analitos en cada t0 a 100 % y las relaciones de superficies de pico de las muestras del minuto 60 se convirtieron a porcentajes remanentes respecto al t0 correspondiente. La determinación de la formación de metabolito sulfato se realizó cualitativamente mediante observación del pico de elución temprana en el canal del ion parental que, basándose en datos internos históricos, correspondía al metabolito O-sulfato de cada compuesto parental. Los resultados del ensayo se resumen en la Tabla 4 (n=2 réplicas).
Tabla 4: estabilidad metabólica en la fracción S9 pulmonar humana.
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En comparación con sus análogos fluoro correspondientes (compuestos C-1 a C-6), los compuestos 1 a 6 dieron lugar a un metabolismo de sulfatación significativamente inferior en la fracción S9 pulmonar.
Ensayo 6: farmacocinética en plasma y pulmón de ratón.
Se determinaron las concentraciones en plasma y en pulmón de los compuestos de ensayo y las relaciones de los mismos de la manera siguiente. En el ensayo se utilizaron ratones BALB/c de Charles River Laboratories. Los compuestos de ensayo se formularon individualmente en propilenglicol al 20 % en tampón citrato de pH 4 a una concentración de 0,2 mg/ml y se introdujeron 50 µl de la solución de administración en las tráqueas de los ratones mediante aspiración oral. En diversos puntos temporales (normalmente 0,167, 2, 6 y 24 h) después de la administración, se extrajeron muestras de sangre mediante punción cardíaca y se extirparon los pulmones intactos de los ratones. Se centrifugaron muestras de sangre (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos a aproximadamente 12.000 rpm a 4 ºC para recoger plasma. Los pulmones se secaron superficialmente con papel, se pesaron y se homogeneizaron a una dilución 1:3 en agua estéril. Se determinaron las concentraciones plasmática y pulmonar de compuesto de ensayo mediante análisis de CL-EM frente a patrones analíticos construidos en una curva patrón en la matriz de ensayo. Se determinó la relación de pulmón a plasma como la proporción de superficie bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) pulmonar, en µg/h, a AUC plasmática, en µg·h/ml, en donde "AUC" se define convencionalmente como la superficie bajo la curva de concentración de compuesto de ensayo frente al tiempo.
Tabla 5: exposición en plasma y tejido pulmonar tras una única administración mediante aspiración oral de compuestos de ensayo.
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Ensayo 7: ensayo de supervivencia de eosinófilos mediada por IL-5.
La potencia de los compuestos de ensayo para la supervivencia de los eosinófilos mediada por IL-5 puede medirse en eosinófilos humanos aislados a partir de sangre completa humana ("TodasLasCélulas"). Debido a que IL-5 señaliza a través de JAK, el presente ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Se aislaron eosinófilos humanos a partir de sangre completa humana recién extraída (TodasLasCélulas) de donantes sanos. Se mezcló la sangre con dextrano al 4,5 % (Sigma-Aldrich) en una solución de cloruro sódico al 0,9 % (Sigma-Aldrich). Se dejó que los glóbulos rojos se sedimentasen durante 35 minutos. Se separó la capa superior rica en leucocitos y se aplicó en una capa sobre Ficoll-Paque (GE Healthcare) y se centrifugó a 600g durante 30 minutos. Se eliminaron las capas de plasma y células mononucleares antes de lisaron la capa de granulocitos para eliminar cualquier glóbulo rojo contaminante. Se purificaron adicionalmente los eosinófilos utilizando un kit de aislamiento de eosinófilos humanos (Miltenyi Biotec). Se incubó una fracción de los eosinófilos purificados con anti-CD16 FITC (Miltenyi Biotec) durante 10 minutos a 4 ºC en la oscuridad. Se analizó la pureza utilizando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences).
Las células se cultivaron en un incubador a 37 ºC, humidificado y con 5 % de CO2, en RPMI 1640 (Life Technologies) complementado con suero de feto bovino inactivado por calor al 10% (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies y 1X Pen/Strep (Life Technologies). Las células se sembraron a razón de 10.000 células/pocillo en medio (50 µl). Se centrifugó la placa a 300g durante 5 minutos y se separaron los sobrenadantes. Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y, a continuación, se diluyeron 500 veces adicionales hasta una concentración de ensayo final 2x en medio. Los compuestos de ensayo (50 µl/pocillo) se añadieron a las células y se incubaron a 37 ºC, 5 % de CO2 durante 1 hora, seguido de la adición de IL-5 (R&D Systems; concentraciones finales: 1 ng/ml y 10 pg/ml) en medio de ensayo precalentado (50 µl) durante 72 horas.
Tras la estimulación de citoquinas, las células se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos y se lavaron dos veces con DPBS frío (Life Technologies). Para determinar la viabilidad y la apoptosis, las células fueron incubadas con yoduro de propidio (Thermo Fisher Scientific) y APC-anexina V (BD Biosciences) y se analizaron utilizando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences). Se determinaron los valores de IC50 a partir del análisis de las curvas de viabilidad de porcentaje de viabilidad celular frente a concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pIC50 (logaritmo decadal negativo de IC50).
Ensayo 8: inhibición de quimioquinas CXCL9 y CXCL10 inducidas por IFNγ e IL-27 en cultivos 3D de vías respiratorias humanas.
Pueden obtenerse cultivos de tejidos EpiAirway de Mattek (AIR-100). Los cultivos se derivan de donantes asmáticos. En un inserto de cultivo celular, se cultivaron células epiteliales traqueales/bronquiales de origen humano y se diferenciaron sobre un soporte de membrana porosa, dejando una interfaz aire-líquido con medio de cultivo caliente bajo las células y una atmósfera de ensayo gaseoso en la parte superior. Los tejidos se cultivaron en medio de mantenimiento (Mattek, AIR-100-MM) en un incubador humidificado a 37 ºC con 5 % de CO2. Pueden someterse a ensayo cuatro donantes. El día 0, los cultivos de tejidos se trataron con compuestos de ensayo a concentraciones de 10 µM, 1 µM y/o 0,1 µM. Los compuestos se diluyeron en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) hasta una concentración final de 0,1 %. El DMSO a 0,1 % puede utilizarse como control de vehículo. Los compuestos de ensayo se incubaron con cultivos durante 1 hora a 37 ºC y 5 % de CO2 seguido de la adición de medio precalentado que contenía IFNγ (R&D Systems) o IL-27 (R&D Systems) a una concentración final de 100 ng/ml. Los cultivos de tejidos se mantuvieron durante 8 días. Se sustituyó el medio cada 2 días con medio fresco que contenía compuestos e IFNγ o IL-27. El día 8, se recogieron cultivos de tejidos y sobrenadantes para el análisis. Se sometieron a ensayo muestras de sobrenadante para CXCL10 (IP-10) y CXCL9 (MIG) utilizando análisis de Luminex (EMD Millipore). Los datos se expresan como % de inhibición /- desviación estándar (±STDV). Se determinó el porcentaje de inhibición como la potencia inhibidora del compuesto frente a la secreción de CXCL10 o CXCL9 inducida por IFNγ o IL-27 en comparación con células tratadas con vehículo. Los datos son de medias de 3 o 4 donantes.
Ensayo 9: ensayo celular de potencia de JAK: inhibición de IFNγ estimulada por IL-2/anti-CD3 en PBMC humanas.
La potencia de los compuestos de ensayo en la inhibición del interferón gamma (IFNγ) estimulado por interleuquina-2 (IL-2)/anti-D3 puede medirse en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana aisladas a partir de sangre completa humana (Stanford Blood Center). Debido a que IL-2 señaliza a través de JAK, el presente ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
(1) Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas a partir de sangre completa humana de donantes sanos utilizando un gradiente de Ficoll. Las células se cultivaron en un incubador a 37 ºC, humidificado y con 5 % de CO2, en RPMI (Life Technologies) complementado con suero de feto bovino inactivado por calor al 10 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies y 1X Pen/Strep (Life Technologies). Las células se sembraron a razón de 200.000 células/pocillo en medio (50 µl) y se cultivaron durante 1 h. Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y, a continuación, se diluyeron 500 veces adicionales (hasta una concentración de ensayo final de 2x) en medio. Los compuestos de ensayo (100 µl/pocillo) se añadieron a las células y se incubaron a 37 ºC, 5 % de CO2 durante 1 hora, seguido de la adición de IL-2 (R&D Systems; concentraciones finales: 100 ng/ml) y anti-CD3 (BD Biosciences; concentración final: 1 µg/ml) en medio de ensayo precalentado (50 µl) durante 24 h.
(2) Tras la estimulación con citoquina, las células se centrifugaron a 500 g durante 5 min y se separaron los sobrenadantes y se congelaron a -80ºC. Para determinar la potencia de inhibición del compuesto de ensayo en respuesta a IL2-/anti-CD3, se midieron las concentraciones de IFNγ en el sobrenadante mediante ELISA (R&D Systems). Se determinaron los valores de IC50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de la concentración de IFNγ frente a la concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pIC50 (logaritmo decadal negativo de IC50).
Ensayo 10: ensayo celular de potencia de JAK: inhibición de pSTATS estimulada por IL-2 en linfocitos T CD4+.
La potencia de los compuestos de ensayo en la inhibición de la fosforilación de STATS estimulada por interleuquina-2 (IL-2)/anti-CD3 puede medirse en linfocitos T positivos para CD4 (CD4+) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana aisladas a partir de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante citometría de flujo. Debido a que IL-2 señaliza a través de JAK, el presente ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Se identificaron linfocitos T CD4+ utilizando un anticuerpo anti-CD4 conjugado con ficoeritrobilina (PE) (clon RPA-T4, BD Biosciences), mientras que se utilizó un anticuerpo p-STAT5 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY694, clon 47, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STATS.
(1) Se siguió el protocolo del ensayo 9, párrafo (1), con la excepción de que la estimulación de citoquina con anti-CD3 se llevó a cabo durante 30 min en lugar de 24 h.
(2) Tras la estimulación de citoquina, las células se fijaron con solución de fijación precalentada (200 µl, BD Biosciences) durante 10 min a 37 ºC, 5 % de CO2, se lavaron dos veces con tampón DPBS (1 ml, Life Technologies) y se resuspendieron en tampón Perm III helado (1000 µl, BD Biosciences) durante 30 min a 4 ºC. Las células se lavaron dos veces con FBS al 2 % en DPBS (tampón FACS) y después se resuspendieron en tampón de FACS (100 µl) que contenía anti-CD4 PE (dilución 1:50) y anti-CD3 anti-CD3Alexa Fluor 647 (dilución 1:5) durante 60 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras la incubación, las células se lavaron dos veces en tampón FACS antes de analizarlas utilizando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences). Para determinar la potencia de inhibición de los compuestos de ensayo en respuesta a IL-2/anti-CD3, se midió la mediana de la intensidad fluorescencia (MIF) de pSTAT5 en los linfocitos T CD4+. Se determinaron los valores de IC50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de MIF frente a la concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pIC50 (logaritmo decadal negativo de IC50).
Ensayo 11: ensayo celular de potencia de JAK: inhibición de pSTAT6 estimulada por IL-4 en linfocitos T CD3+.
La potencia de los compuestos de ensayo en la inhibición de la fosforilación de STAT6 estimulada por interleuquina-4 (IL-4) puede medirse en linfocitos T positivos para CD3 (CD3+) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana aisladas a partir de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante citometría de flujo. Debido a que IL-4 señaliza a través de JAK, el presente ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Se identificaron linfocitos T CD3+ utilizando un anticuerpo anti-CD3 conjugado con ficoeritrobilina (PE) (clon UCHT1, BD Biosciences), mientras que se utilizó un anticuerpo de p-STAT6 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY641, clon 18/P, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STAT6.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas a partir de sangre completa humana de donantes sanos tal como en los ensayos 9 y 10. Las células se sembraron a razón de 250.000 células/pocillo en medio (200 µl), se cultivaron durante 1 h y después se resuspendieron en medio de ensayo (50 µl) (RPMI complementado con albúmina de suero bovino al 0,1 % (Sigma), Glutamax 2 mM, HEPES 25 mM y 1X Penstrep) que contenía diversas concentraciones de compuestos de ensayo. Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y, a continuación, se diluyeron 500 veces (hasta una concentración de ensayo final 2x) en medio de ensayo. Los compuestos de ensayo (50 µl) se incubaron con células a 37 ºC, 5% de CO2, durante 1 h, seguido de la adición de IL-4 (50 µl) (R&D Systems; concentración final: 20 ng/ml) en medio de ensayo precalentado durante 30 min. Tras la estimulación con citoquinas, las células se fijaron con solución de fijación precalentada (100 µl) (BD Biosciences) durante 10 min a 37 ºC, con 5 % de CO2, se lavaron dos veces con tampón de FACS (1 ml) (FBS al 2 % en DPBS) y se resuspendieron en tampón Perm III helado (1000 µl) (BD Biosciences) durante 30 min a 4 ºC. Las células se lavaron dos veces con tampón de FACS y después se resuspendieron en tampón de FACS (100 µl) que contenía anti-CD3 PE (dilución 1:50) y antipSTAT6 Alexa Fluor 647 (dilución 1:5) durante 60 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras la incubación, las células se lavaron dos veces en tampón FACS antes de analizarlas utilizando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences).
Para determinar la potencia de inhibición del compuesto de ensayo en respuesta a IL-4, se midió la mediana de la intensidad de fluorescencia (MIF) de pSTAT6 en los linfocitos T CD3+. Se determinaron los valores de IC50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de MIF frente a la concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pIC50 (logaritmo decadal negativo de IC50).
Ensayo 12: ensayo celular de potencia de JAK: inhibición de pSTAT3 estimulada por IL-6 en linfocitos T CD3+.
Puede utilizarse un protocolo análogo al del Ensayo 11 para determinar la potencia del compuesto de ensayo para la inhibición de la fosforilación de STATS estimulada por interleuquina-6 (IL-6). Se utilizó un anticuerpo anti-pSTAT3 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY705, clon 4/P, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STATS.
Ensayo 13: modelo murino de inflamación eosinofílica inducida por Alternaria alternata del pulmón.
La eosinofilia de las vías respiratorias es una característica distintiva del asma humano. Alternaria alternata es un alérgeno aéreo fúngico que puede exacerbar el asma en el ser humano y que induce la inflamación eosinofílica en los pulmones de ratones (Havaux et al., Clin Exp Immunol.2005 Feb;139(2): 179-88). En ratones se ha demostrado que Alternaria activa indirectamente las células linfoides innatas de tipo 2 residentes en el tejido del pulmón, que responde (p. ej., IL-2 e IL-7) y libera citoquinas dependientes de JAK (p. ej., IL-5 e IL-13) y coordina la inflamación eosinofílica (Bartemes et al., J Immunol.2012 Feb 1;188(3):1503-13).
En el estudio se utilizaron ratones C57 macho de siete a nueve semanas de edad de Taconic. El día del estudio, los animales fueron anestesiados levemente con isoflurano y se les administró vehículo o compuesto de ensayo (0,03 a 1,0 mg/ml, 50 µl de volumen total a lo largo de varias respiraciones) mediante aspiración orofaríngea. Los animales se tumbaron de costado después de la dosis y se les realizó un seguimiento hasta la recuperación total de la anestesia antes de devolverlos a su jaula de origen. Una hora después se anestesiaron brevemente de nuevo y se les retó con vehículo o extracto de Alternaria (200 µg de extracto administrado en total; volumen total: 50 µl) mediante aspiración orofaríngea antes de realizarse un seguimiento para la recuperación de la anestesia y devolverlos a su jaula de origen. Cuarenta y ocho horas después de la administración de Alternaria, se recogió líquido de lavado broncoalveolar (LLBA) y se realizó un recuento de los eosinófilos en el LLBA utilizando el sistema de hematología Advia 120 (Siemens). La actividad en el modelo se puso de manifiesto por una reducción del nivel de eosinófilos presente en el LLBA de los animales tratados a las cuarenta y ocho horas, en comparación con animales de control retados con Alternaria y tratados con vehículo. Los datos se expresan como porcentaje de inhibición de la respuesta de eosinófilos en el LLBA de animales retados con Alternaria y tratados con vehículo. Para calcular el porcentaje de inhibición, el número de eosinófilos del LLBA para cada condición se convirtió en porcentaje respecto al nivel medio de eosinófilos del LLAB de animales retados con Alternaria y tratados con vehículo y se restó del porcentaje cien.
Ensayo 14: ensayo celular de potencia de JAK: inhibición de pSTAT1 inducida por IFNγ.
Se midió la potencia de los compuestos de ensayo en la inhibición de la fosforilación de STAT1 estimulada por interferón gamma (IFNγ) en monocitos positivos para CD14 (CD14+) derivados de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante citometría de flujo. Debido a que IFNγ señaliza a través de JAK, el presente ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Se identificaron los monocitos utilizando un anticuerpo anti-CD14 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés) (clon RM052, Beckman Coulter) y se utilizó un anticuerpo anti-pSTAT1 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY701, clon 4a, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STAT1.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas a partir de sangre completa humana de donantes sanos utilizando un gradiente de Ficoll. Las células se cultivaron en un incubador a 37 ºC, humidificado y con 5 % de CO2, en RPMI (Life Technologies) complementado con suero de feto bovino inactivado por calor al 10 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies y 1X Pen/Strep (Life Technologies). Las células se sembraron a razón de 250.000 células/pocillo en medio (200 µl), se cultivaron durante 2 h y después se resuspendieron en medio de ensayo (50 µl) (RPMI complementado con albúmina de suero bovino al 0,1 % (Sigma), Glutamax 2 mM, HEPES 25 mM y 1X Penstrep) que contenía diversas concentraciones de compuesto de ensayo. El compuesto se diluyó en serie en DMSO y, a continuación, se diluyeron 1000 veces adicionales en medio para llevar la concentración de DMSO final a 0,1 %. Se incubaron las diluciones de compuesto de ensayo con células a 37 ºC y 5 % de CO2 durante 1 h, seguido de la adición de IFNγ precalentado (R&D Systems) en medio (50 µl) a una concentración final de 0,6 ng/ml durante 30 min. Tras la estimulación de citoquinas, se fijaron las células con solución de fijación precalentada (100 µl) (BD Biosciences) durante 10 min a 37 ºC, 5 % de CO2; se lavaron dos veces con tampón de FACS (1 ml) (BSA al 1 % en PBS), se resuspendieron en anti-CD14 FITC:tampón de FACS 1:10 (100 µl) y se incubaron a 4 ºC durante 15 min. Las células se lavaron una vez y después se resuspendieron en tampón Perm Buffer III helado (BD Biosciences) (100 µl) durante 30 min a 4 ºC. Las células se lavaron dos veces con tampón de FACS y después se resuspendieron en anti-pSTAT1 Alexa Fluor 647:tampón de FACS 1:10 (100 µl) durante 30 min a TA en la oscuridad, se lavaron dos veces en tampón de FACS y se analizaron utilizando un citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi).
Para determinar la potencia de inhibición del compuesto de ensayo, se midió la mediana de la intensidad de fluorescencia (MIF) de pSTAT1 en los monocitos CD14+. Se determinaron los valores de IC50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de MIF frente a la concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pIC50 (logaritmo decadal negativo de IC50). El compuesto 1 mostró un valor de pIC50 de 7,5 en este ensayo. El compuesto 4 mostró un valor de pIC50 de 7,3 en este ensayo.
Ensayo 15: ensayo celular de potencia de JAK: inhibición de pSTATS inducida por GM-CSF.
Se midió la potencia de los compuestos de ensayo en la inhibición de la inhibición de la fosforilación de STATS estimulada por factor estimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF) en monocitos derivados de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante citometría de flujo. Debido a que GM-CSF señaliza a través de JAK, el presente ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Se identificaron los monocitos utilizando un anticuerpo anti-CD14 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (clon RM052, Beckman Coulter) y se utilizó un anticuerpo anti-pSTAT5 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY694, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STATS.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas a partir de sangre completa humana de donantes sanos utilizando un gradiente de Ficoll. Las células se cultivaron en un incubador a 37 ºC, humidificado y con 5 % de CO2, en RPMI (Life Technologies) complementado con suero de feto bovino inactivado por calor al 10 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies y 1X Pen/Strep (Life Technologies). Las células se sembraron a razón de 250.000 células/pocillo en medio (200 µl), se cultivaron durante 2 h y después se resuspendieron en medio de ensayo (50 µl) (RPMI complementado con albúmina de suero bovino al 0,1 % (Sigma), Glutamax 2 mM, HEPES 25 mM y 1X Penstrep) que contenía diversas concentraciones de compuesto de ensayo. El compuesto se diluyó en serie en DMSO y, a continuación, se diluyeron 1000 veces adicionales en medio para llevar la concentración de DMSO final a 0,1 %. Se incubaron las diluciones de compuesto de ensayo con células a 37 ºC y 5 % de CO2 durante 1 h, seguido de la adición de IFNγ precalentado (R&D Systems) en medio (50 µl) a una concentración final de 0,3 ng/ml durante 15 min. Tras la estimulación de citoquinas, se fijaron las células con solución de fijación precalentada (100 µl) (BD Biosciences) durante 10 min a 37 ºC, 5 % de CO2; se lavaron dos veces con tampón de FACS (1 ml) (BSA al 1 % en PBS), se resuspendieron en anti-CD14 FITC:tampón de FACS 1:10 (100 µl) y se incubaron a 4 ºC durante 15 min. Las células se lavaron una vez y después se resuspendieron en tampón Perm Buffer III helado (BD Biosciences) (100 µl) durante 30 min a 4 ºC. Las células se lavaron dos veces con tampón de FACS y después se resuspendieron en anti-pSTAT1 Alexa Fluor 647:tampón de FACS 1:10 (100 µl) durante 30 min a TA en la oscuridad, se lavaron dos veces en tampón de FACS y se analizaron utilizando un citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi).
Para determinar la potencia de inhibición del compuesto de ensayo, se midió la mediana de la intensidad de fluorescencia (MIF) de pSTAT5 en los monocitos CD14+. Se determinaron los valores de IC50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de MIF frente a la concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pIC50 (logaritmo decadal negativo de IC50). El compuesto 1 mostró un valor de pIC50 de 6,7 en este ensayo. El compuesto 4 mostró un valor de pIC50 de 6,7 en este ensayo.
Ensayo 16: ensayo celular de potencia de JAK: inhibición de pSTAT4 inducida por IL-12.
Se midió la potencia de los compuestos de ensayo en la inhibición de la fosforilación de STAT4 estimulada por interleuquina-12 (IL-12) en linfocitos T positivos para CD3 (CD3+) derivados de sangre completa humana (Stanford Blood Center) mediante citometría de flujo. Debido a que IL-12 señaliza a través de JAK, el presente ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Se identificaron linfocitos T CD3+ utilizando un anticuerpo anti-CD3 conjugado con ficoeritrina (PE) (clon UCHT1, BD Biosciences), mientras que se utilizó un anticuerpo anti-STAT4 conjugado con Alexa Fluor 647 (clon 38/p-Stat4, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STAT4.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas a partir de sangre completa humana de donantes sanos utilizando un gradiente de Ficoll. Las células se cultivaron en RPMI (Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10 % (FBS, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies), 1X Pen/Strep (Life Technologies), anticuerpo anti-CD3 purificado unido a placa (5 µg/ml, clon UCHT1, BD Biosciences) y anticuerpo anti-CD28 soluble (1 µg/ml, clon CD28.2, BD Biosciences) durante 3 días en un incubador humidificado a 37 ºC con 5 % de CO2. Se recolectaron las células, se lavaron con medio y después se resuspendieron en medio que contenía interleuquina-2 (IL-2, 10 ng/ml, R&D Systems). Las células se cultivaron durante 3 días en un incubador humidificado a 37 ºC con 5 % de CO2. Se recolectaron las células, se lavaron con RPMI y se sembraron a razón de 250.000 células/pocillo en medio (200 µl), se cultivaron durante 2 h y se resuspendieron en medio de ensayo (50 µl) (RPMI complementado con albúmina de suero bovino al 0,1 % (Sigma), Glutamax 2 mM, HEPES 25 mM y 1X Penstrep) que contenía diversas concentraciones de los compuestos de ensayo. El compuesto se diluyó en serie en DMSO y, a continuación, se diluyeron 1000 veces adicionales en medio para llevar la concentración de DMSO final a 0,1 %. Las diluciones de los compuestos de ensayo se incubaron con células a 37 ºC, 5% de CO2, durante 1 h, seguido de la adición de IL-12 (R&D Systems) en medio (50 µl) a una concentración final de 10 ng/ml durante 30 min. Tras la estimulación con citoquinas, las células se fijaron con solución de fijación precalentada (100 µl) (BD Biosciences) durante 10 min a 37 ºC, con 5 % de CO2; se lavaron dos veces con tampón de FACS (1 ml) (BSA al 1% en PBS) y se resuspendieron en tampón Perm III helado (1000 µl) (BD Biosciences) durante 30 min a 4 ºC. Las células se lavaron dos veces con tampón de FACS y después se resuspendieron en tampón de FACS (100 µl) que contenía anti-CD3 PE (dilución 1:50) y anti-pSTAT4 Alexa Fluor 647 (dilución 1: 10) durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras la incubación, las células se lavaron dos veces en tampón de FACS antes de analizarlas utilizando un citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi). Para determinar la potencia de inhibición del compuesto de ensayo, se midió la mediana de la intensidad de fluorescencia (MIF) de pSTAT4 en los linfocitos CD3+. Se determinaron los valores de IC50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de MIF frente a la concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pIC50 (logaritmo decadal negativo de IC50). El compuesto 1 mostró un valor de pIC50 de 6,2 en este ensayo. El compuesto 4 mostró un valor de pIC50 de 6,0 en este ensayo.
Estructura cristalina.
Se obtuvo una estructura cocristalina del compuesto D-1 unido a JAK1 humano a una resolución de 2,28 Å. Se observó que el ligando se unía al sitio de unión de ATP. Se identificaron siete interacciones de enlace de hidrógeno específicas basándose en la distancia de 3,5 Å o menos entre los átomos donante y aceptor. Cabe destacar que se identificó una interacción de enlace de hidrógeno entre el carbonilo de la amida exocíclica del compuesto D-1 y la cadena lateral de Arg879 de la JAK1. Puede esperarse una interacción similar para los compuestos de la invención. En estudios de modelado anteriores, dicha interacción se ha propuesto como una manera de proporcionar selectividad a JAK1 sobre otras tirosina-quinasas, ya que quinasas de otro modo estrechamente relacionadas (p. ej., TRKA, VEGFR y ABL1) no poseen un residuo de arginina en la posición equivalente. Los resultados observados de interacción de enlace de hidrógeno en la estructura cristalina y la selectividad mejorada del quinoma en comparación con la serie que no posee la amida exocíclica valida esta hipótesis de diseño.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000047_0001
en la que:
A es un anillo heterociclilo monocíclico de 6 a 7 elementos que contiene dos átomos de nitrógeno, en el que A está conectada al grupo carbonilo en (I) mediante un átomo de nitrógeno; A está sustituida con 1 a 3 grupos R2 y, opcionalmente, dos grupos R2 forman un anillo puenteado con -(CH2)- con A; o A es pirrolidinilo, en el que el pirrolidinilo está conectado al grupo carbonilo en (I) mediante un átomo de nitrógeno y en el que el pirrolidinilo está sustituido con NR3R4;
R1 es alquilo C1-3;
cada R2 es, independientemente, alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH;
R3 es alquilo C1-3;
y R4 es alquilo C1-3;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El compuesto según la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que presenta la fórmula (I'):
Figure imgf000047_0002
o un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000047_0003
en la que:
R1 es alquilo C1-3;
A1 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000047_0004
en el que R2 es alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH,
o
un compuesto de fórmula (III):
Figure imgf000048_0001
en la que:
R1 es alquilo C1-3,
A2 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000048_0002
en la que cada R2 es, independientemente, alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH; R3 es alquilo C1-3 y R4 es alquilo C1-3,
o
un compuesto de fórmula (IV):
Figure imgf000048_0003
en la que:
R1 es alquilo C1-3,
A3 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000048_0004
en la que cada R2 es, independientemente, alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH, R3 es alquilo C1-3 y R4 es alquilo C1-3.
3. El compuesto según la reivindicación 1 o 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo, propilo e isopropilo, por ejemplo, metilo y propilo.
4. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que A se selecciona del grupo que consiste en piperazinilo, 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptanilo y 1,4-diazacicloheptanilo, cada uno de los cuales está sustituido con 1 o 2 grupos R2, en el que cada R2 es, independientemente, alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH o A es pirrolidinilo sustituido con NR3R4, en el que R3 es alquilo C1-3 y R4 es alquilo C1-3.
5. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que A se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000049_0001
en la que R2 es alquilo C1-3 sustituido opcionalmente con -OH, R3 es alquilo C1-3 y R4 es alquilo C1-3.
6. Compuesto según la reivindicación 1 que presenta la fórmula:
Figure imgf000049_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. El compuesto según la reivindicación 1 que presenta la fórmula:
Figure imgf000049_0003
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
8. El compuesto según la reivindicación 1 que presenta la fórmula:
Figure imgf000049_0004
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. El compuesto según la reivindicación 1 que presenta la fórmula:
Figure imgf000050_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
10. El compuesto según la reivindicación 1 que presenta la fórmula:
Figure imgf000050_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. El compuesto según la reivindicación 1 que presenta la fórmula:
Figure imgf000050_0003
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. Un compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para uso en el tratamiento de una enfermedad respiratoria en un mamífero.
14. El compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la utilización según la reivindicación 13, en el que la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo que consiste en asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, neumonitis, fibrosis pulmonar idiopática, lesión pulmonar aguda, síndrome de distrés respiratorio agudo, bronquitis, enfisema, bronquiolitis obliterante, sarcoidosis, una enfermedad eosinofílica, una infección helmíntica, hipertensión arterial pulmonar, linfangioleiomiomatosis, broncoectasia, una enfermedad pulmonar infiltrante, neumonitis inducida farmacológicamente, neumonitis inducida por hongo, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, granulomatosis eosinofílica con poliangiitis, neumonía eosinofílica aguda idiopática, neumonía eosinofílica crónica idiopática, síndrome hipereosinofílico, síndrome de Löffler, bronquiolitis obliterante con neumonía organizada, enfermedad del injerto pulmonar contra el huésped y neumonitis inducida por inhibidor de punto de control inmunitario.
15. El compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la utilización según la reivindicación 13, en el que la enfermedad respiratoria es asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
16. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la utilización en el tratamiento del rechazo del trasplante pulmonar en un mamífero.
17. El compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la utilización según la reivindicación 16, en el que el rechazo del trasplante pulmonar se selecciona del grupo que consiste en disfunción primaria del injerto, neumonía organizada, rechazo agudo, bronquiolitis linfocítica y disfunción crónica del aloinjerto pulmonar.
18. El compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la utilización según la reivindicación 16, en el que el rechazo del trasplante pulmonar es rechazo agudo del trasplante pulmonar.
19. El compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la utilización según la reivindicación 16, en el que el rechazo del trasplante pulmonar es disfunción crónica del aloinjerto pulmonar.
20. El compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la utilización según la reivindicación 16, en el que el rechazo del trasplante pulmonar se selecciona del grupo que consiste en bronquiolitis obliterante, disfunción crónica restrictiva del aloinjerto pulmonar y disfunción neutrofílica del aloinjerto.
21. El compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la utilización según la reivindicación 14, en el que la enfermedad respiratoria es lesión pulmonar aguda.
22. El compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la utilización según la reivindicación 14, en el que la enfermedad respiratoria es el síndrome agudo de distrés respiratorio.
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