RU2764979C2 - Способы лечения с использованием соединения-ингибитора jak - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначена для лечения воспалительного глазного заболевания у млекопитающего. Способ лечения воспалительного глазного заболевания у млекопитающего включает введение фармацевтической композиции, включающей 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, в глаз млекопитающего. Также обеспечивается применение 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли для лечения воспалительного глазного заболевания у млекопитающего. Кроме того, представлен способ лечения респираторного заболевания у млекопитающего, включающий введение млекопитающему фармацевтической композиции, включающей 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, где респираторное заболевание представляет собой легочную инфекцию, гельминтоз, легочную артериальную гипертензию, саркоидоз, лимфангиолейомиоматоз, бронхоэктаз или инфильтративное легочное заболевание и др. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность лечения воспалительных и инфекционно-воспалительных заболеваний. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

Description

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение направлено на способы лечения глазных и некоторых респираторных заболеваний с использованием конкретного соединения–ингибитора JAK или его фармацевтически приемлемой соли.

Предшествующий уровень техники

Цитокины являются межклеточными сигнальными молекулами, которые включают хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфокины и фактор некроза опухоли. Цитокины имеют решающее значение для нормального роста клеток и иммунорегуляции, но также стимулируют иммуноопосредованные заболевания и способствуют росту злокачественных клеток. Повышенные уровни многих цитокинов вовлечены в патологию большого количества различных заболеваний или состояний, особенно тех заболеваний, которые характеризуются воспалением. Многие из цитокинов, связанных с заболеванием, действуют через сигнальные пути, зависящие от Janus семейства тирозинкиназ (JAK), которые передают сигналы через семейство транскрипционных факторов переносчиков сигнала и активаторов транскрипции (STAT).

Семейство JAK включает четыре члена: JAK1, JAK2, JAK3 и тирозинкиназа 2 (TYK2). Связывание цитокина с JAK–зависимым цитокиновым рецептором индуцирует димеризацию рецептора, что приводит к фосфорилированию тирозиновых остатков на JAK–киназе, вызывая активацию JAK. Фосфорилированные JAK, в свою очередь, связывают и фосфорилируют различные STAT белки, которые димеризуются, интернализуются в ядре клетки и непосредственно модулируют транскрипцию генов, приводя, среди других эффектов, к нисходящим эффектам, ассоциированным с воспалительным заболеванием. JAK обычно ассоциированы в паре с цитокиновыми рецепторами в виде гомодимеров или гетеродимеров. Конкретные цитокины ассоциированы с конкретными JAK–спариваниями. Каждый из четырех членов семейства JAK участвует в передаче сигналов по меньшей мере одного из цитокинов, связанных с воспалением.

Воспаление играет значимую роль во многих глазных заболеваниях, включая увеит, диабетическую ретинопатию, диабетический макулярный отек, синдром сухого глаза, возрастную дегенерацию желтого пятна и атопический кератоконъюнктивит. Увеит охватывает множество внутриглазных воспалительных состояний и часто является аутоиммунным, возникающим без известного инфекционного возбудителя. По оценкам, этим состоянием страдают около 2 миллионов пациентов в США. У некоторых пациентов хроническое воспаление, ассоциированное с увеитом, приводит к разрушению ткани, и он является пятой основной причиной слепоты в США. Цитокины, уровень которых повышен в глазах пациентов с увеитом, которые передают сигналы через JAK–STAT путь, включают IL–2, IL–4, IL–5, IL–6, IL–10, IL–23 и IFN–γ. (Horai and Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733–744; Ooi et al, Clinical Medicine and Research, 2006, 4, 294–309). Существующие терапии увеита часто недостаточно эффективны, и у многих пациентов заболевание плохо контролируется. Стероиды, хотя часто эффективны, связаны с катарактами и повышенным внутриглазным давлением/глаукомой.

Причиной диабетической ретинопатии (DR) является повреждение кровеносных сосудов в сетчатке. Это наиболее распространенная причина потери зрения среди людей с диабетом. Ангиогенные, а также воспалительные пути играют важную роль в заболевании. Часто DR прогрессирует до диабетического макулярного отека (DME), наиболее частой причины потери зрения у пациентов с диабетом. По оценкам, только в США от этого заболевания страдают около 1,5 миллиона пациентов, из которых примерно у 20% заболеванием поражены оба глаза. Считают, что цитокины, которые передают сигналы по пути JAK–STAT, такие как IL–6, а также другие цитокины, такие как IP–10 и MCP–1 (альтернативно называемые CCL2), продукция которых частично управляется передачей сигналов по пути JAK–STAT, играют роль в воспалении, ассоциированном с DR/DME (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 1–12; Sohn et al., American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686–694; Owen and Hartnett, Curr Diab Rep, 2013, 13, 476–480; Cheung et al, Molecular Vision, 2012, 18, 830–837; Dong et al, Molecular Vision, 2013, 19, 1734–1746; Funatsu et al, Ophthalmology, 2009, 116, 73–79). Существующие методы лечения DME недостаточно эффективны: интравитреальные анти–VEGF лечения эффективны только у части пациентов, а стероиды связаны с катарактой и повышенным внутриглазным давлением.

Синдром сухого глаза (DED) представляет собой многофакторное заболевание, которым страдают около 5 миллионов пациентов в США. Считается, что воспаление поверхности глаза играет важную роль в развитии и распространении этого заболевания. Повышенные уровни цитокинов, таких как IL–1, IL–2, IL–4, IL–5, IL–6 и IFN–γ, были отмечены в глазных жидкостях пациентов с DED (Stevenson et al., Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90–100), а уровни часто коррелируют с тяжестью заболевания. Также считается, что возрастная дегенерация желтого пятна и атопический кератоконъюнктивит связаны с JAK–зависимыми цитокинами.

Учитывая количество цитокинов, уровни которых повышены при воспалительных заболеваниях, и то, что каждый цитокин ассоциирован с конкретным JAK–спариванием, было бы желательно обеспечить химический ингибитор с широкой активностью против всех членов семейства JAK для лечения глазного заболевания. Однако широкий противовоспалительный эффект таких ингибиторов может подавлять нормальную функцию иммунных клеток, потенциально приводя к повышенному риску инфекции. Поэтому было бы желательно получить ингибитор, который можно доставлять целенаправленно в место действия в глазу, ограничивая таким образом возможность неблагоприятной системной иммуносупрессии.

Принадлежащая тому же правообладателю заявка США с серийным № 15/341226, поданная 02 ноября 2016 года, раскрывает диамино соединения, полезные в качестве ингибиторов JAK. В частности, соединение 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол (соединение 1)

1

специально раскрыто в заявке как сильный ингибитор пан–JAK. Эта заявка раскрывает различные применения соединения 1, в частности лечение респираторных заболеваний, включая астму, хроническую обструктивную болезнь легких, кистозный фиброз, пневмонит, интерстициальные легочные заболевания (включая идиопатический легочный фиброз), острое повреждение легких, острый реапираторный дистресс–синдром, бронхит, эмфизему и облитерирующий бронхиолит. Однако эта заявка не раскрывает применение соединения 1 для лечения глазного заболевания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам лечения глазных заболеваний или их симптомов с использованием ингибитора JAK 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения глазного заболевания у пациента–человека, включающий введение в глаз пациента соединения 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола формулы

1

далее указанного как соединение 1, или его фармацевтически приемлемой соли.

В одном аспекте глазное заболевание представляет собой увеит, диабетическую ретинопатию, диабетический макулярный отек, синдром сухого глаза, возрастную дегенерацию желтого пятна или атопический кератоконъюнктивит. В частности, глазное заболевание представляет собой увеит или диабетический макулярный отек.

В другом аспекте изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола (соединение 1) или его фармацевтически приемлемой соли, где фармацевтическая композиция является подходящей для введения непосредственно в глаз пациента.

Настоящее изобретение также относится к способам применения соединения 1 для лечения некоторых конкретных респираторных заболеваний.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения респираторного заболевания у млекопитающего, включающий введение млекопитающему фармацевтической композиции, включающей соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, где респираторное заболевание представляет собой легочную инфекцию, гельминтоз, легочную артериальную гипертензию, саркоидоз, лимфангиолейомиоматоз, бронхоэктаз или инфильтративное легочное заболевание.

Еще в одном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения респираторного заболевания у млекопитающего, включающий введение млекопитающему фармацевтической композиции, включающей соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, где респираторное заболевание представляет собой лекарственный пневмонит, грибковый пневмонит, аллергический бронхолегочный аспергиллез, гиперчувствительный пневмонит, эозинофильный грануломатоз с полиангиитом, идиопатическую острую эозинофильную пневмонию, идиопатическую хроническую эозинофильную пневмонию, гиперэозинофильный синдром, синдром Леффлера, облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией или индуцированный ингибитором иммунных контрольных точек пневмонит.

Подробное описание изобретения

Химические структуры названы в настоящей заявке в соответствии с номенклатурой IUPAC, используемой в программе ChemDraw (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA).

Кроме того, имидазо часть тетрагидроимидазопиридиновой группы в структуре соединения по изобретению существует в таутомерных формах. Соединение может быть также представлено в эквивалентной форме

В соответствии с номенклатурой IUPAC, представленные структуры приводят к разной нумерации атомов имидазопиридиновой части. Соответственно эта структура указана как 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро– 3 H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол. Должно быть понятно, что, хотя структуры показаны или названы в конкретной форме, изобретение также включает ее таутомер.

Определения

При описании настоящего изобретения следующие термины имеют следующие значения, если не указано иное.

Термины в единственном числе включают соответствующие термины во множественном числе, если контекст явно не диктует иное.

Термин “около” означает ± 5 процентов от указанного значения.

Термин “терапевтически эффективное количество” означает количество, достаточное для осуществления лечения при введении пациенту, нуждающемуся в лечении, например, количество, необходимое для получения желаемого терапевтического эффекта.

Термин “лечащий” или “лечение” означает профилактику, улучшение или подавление медицинского состояния, заболевания или расстройства, подлежащего лечению (например, респираторного заболевания) у пациента (в частности, человека); или облегчение симптомов медицинского состояния, заболевания или расстройства.

Термин "лекарственная форма с однократной дозировкой" или “стандартные дозы” означает физически дискретную единицу, подходящую для дозированного введения пациенту, т.е. каждая единица содержит предварительно определенное количество терапевтического средства, рассчитанное для обеспечения терапевтического эффекта либо отдельно, либо в комбинации с одной или несколькими дополнительными единицами. Примеры включают капсулы, таблетки и т.п.

Предполагается, что все другие термины, используемые в настоящей заявке, имеют их обычное значение, известное специалистам в области, к которой они относятся.

Термин "фармацевтически приемлемый" означает приемлемый для введения пациенту (например, обладающий приемлемой безопасностью для указанного применения).

Термин “фармацевтически приемлемая соль” означает соль, полученную из кислоты или основания (включая цвиттерионы), которая является приемлемой для введения пациенту (например, соль, имеющая приемлемую безопасность для используемого режима дозирования).

Репрезентативные фармацевтически приемлемые соли включают соли уксусной, аскорбиновой, бензолсульфоновой, бензойной, камфорсульфоновой, лимонной, этансульфоновой, 1,2–этандисульфоновой, фумаровой, гентизиновой, глюконовой, глюкуроновой, глутаминовой, гиппуровой, бромистоводородной, хлористоводородной, изетионовой, молочной, лактобионовой, малеиновой, яблочной, миндальной, метансульфоновой, муциновой, нафталинсульфоновой, нафталин–1,5–дисульфоновой, нафталин–2,6–дисульфоновой, никотиновой, азотной, оротовой, щавелевой, памовой, пантотеновой, фосфорной, янтарной, серной, винной, п–толуолсульфоновой и ксинафовой кислот и т.п.

Термин “его соль” означает соединение, образованное в результате замены водорода кислоты катионом, таким как катион металла или органический катион и т.п.

Соединение 1

В способе по настоящему изобретению используют 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол (соединение 1)

1

или его фармацевтически приемлемую соль.

Соединение 1 можно получить, как описано в заявке США с серийным № 15/341226 или в прилагаемых примерах.

В одном аспекте изобретения соединение 1 используют в форме гидрата кристаллического свободного основания, характеризующейся рентгеновской порошковой дифрактограммой (PXRD), имеющей значимые дифракционные пики, среди других пиков, при 2Ɵ значениях 6,20±0,20, 9,58±0,20, 17,53±0,20, 19,28±0,20 и 21,51±0,20. Получение кристаллического гидрата также описано в заявке США с серийным № 15/341226 и в примерах ниже.

Фармацевтические композиции

Соединение по настоящему изобретению 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол (1) и его фармацевтически приемлемые соли обычно используют в форме фармацевтической композиции или состава. Такие фармацевтические композиции могут быть эффективны при введении пациенту любым приемлемым способом введения, включая, но не ограничиваясь этим, пероральный, ингаляционный, глазную инъекцию, местный (включая чрескожный), ректальный, назальный и парентеральный пути введения.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению обычно содержат терапевтически эффективное количество соединения 1. Специалистам в данной области должно быть понятно, однако, что фармацевтическая композиция может содержать больше, чем терапевтически эффективное количество, то есть нерасфасованные композиции, или меньше, чем терапевтически эффективное количество, то есть отдельные единичные дозы, предназначенные для многократного введения для достижения терапевтически эффективного количества. При обсуждении композиций и применений соединение 1 также может быть указано далее как “активное вещество”.

Как правило, такие фармацевтические композиции будут содержать от около 0,01 до около 95% по массе активного вещества; включая, например, от около 0,05 до около 30% по массе; и от около 0,1% до около 10% по массе активного вещества.

В фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно использовать любой обычный носитель или эксципиент. Выбор конкретного носителя или эксципиента, или комбинаций носителей или эксципиентов, будет зависеть от способа введения, используемого для лечения конкретного пациента, или от типа медицинского состояния или болезненного состояния. В этом отношении, получение подходящей фармацевтической композиции для конкретного способа введения находится в пределах компетенции специалистов в области фармацевтики. Кроме того, носители или эксципиенты, используемые в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, являются коммерчески доступными. В качестве дополнительной иллюстрации, традиционные методы формулирования описаны в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); и H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).

Репрезентативные примеры веществ, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают, но не ограничиваются этим, следующие: сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза, такая как микрокристаллическая целлюлоза, и ее производные, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт; фосфатно–буферные растворы; и другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических композициях.

Фармацевтические композиции обычно получают путем тщательного и тесного смешивания или вымешивания активного вещества с фармацевтически приемлемым носителем и одним или несколькими необязательными ингредиентами. Полученную однородно смешанную смесь затем можно формовать или загружать в таблетки, капсулы, пилюли и т.п., используя обычные процедуры и оборудование.

В одном аспекте, фармацевтическая композиция является подходящей для глазной инъекции. В этом аспекте соединение можно сформулировать в виде стерильной водной суспензии или раствора. Полезные эксципиенты, которые могут быть включены в такую водную композицию, включают полисорбат 80, карбоксиметилцеллюлозу, хлорид калия, хлорид кальция, хлорид натрия, хлорид магния, ацетат натрия, цитрат натрия, гистидин, дигидрат α–трегалозы, сахарозу, полисорбат 20, гидроксипропил–β–циклодекстрин и фосфат натрия. Бензиловый спирт может служить в качестве консерванта, а хлорид натрия может быть включен для регулирования тоничности. Кроме того, к раствору можно добавить хлористоводородную кислоту и/или гидроксид натрия для регулирования рН. Могут быть получены водные композиции для внутриглазных инъекций, не содержащие консервантов.

В другом аспекте фармацевтическая композиция является подходящей для ингаляционного введения. Фармацевтические композиции для ингаляционного введения обычно находятся в форме аэрозоля или порошка. Такие композиции обычно вводят с использованием устройств доставки ингаляционных препаратов, таких как ингалятор сухого порошка (DPI), дозирующий ингалятор (MDI), ингалятор–небулайзер или аналогичное устройство доставки.

В конкретном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят путем ингаляции, используя ингалятор сухого порошка. Такие ингаляторы сухого порошка, как правило, вводят фармацевтическую композицию в виде свободнотекучего порошка, который диспергируется в потоке воздуха при вдыхании пациентом. Чтобы получить композицию свободнотекучего порошка, терапевтическое средство обычно формулируют в композицию с подходящим эксципиентом, таким как лактоза, крахмал, маннит, декстроза, полимолочная кислота (PLA), полилактид–со–гликолид (PLGA) или их комбинации. Как правило, терапевтическое средство измельчают и объединяют с подходящим носителем для образования композиции, подходящей для ингаляции.

Типичная фармацевтическая композиция для применения в ингаляторе сухого порошка включает лактозу и соединение по изобретению в микронизированной форме. Такая сухая порошковая композиция может быть получена, например, путем объединения сухой измельченной лактозы с терапевтическим средством и затем сухого смешивания компонентов. Затем композицию обычно загружают в дозатор сухого порошка или в ингаляционные картриджи или капсулы для использования с устройством доставки сухого порошка.

Устройства доставки в виде ингаляторов сухого порошка, подходящие для введения путем ингаляции, описаны в данной области техники, и примеры таких устройств являются коммерчески доступными. Например, типичные устройства доставки или продукты для ингаляции сухого порошка включают Aeolizer (Novartis); Airmax (IVAX); ClickHaler (Innovata Biomed); Diskhaler (GlaxoSmithKline); Diskus/Accuhaler (GlaxoSmithKline); Ellipta (GlaxoSmithKline); Easyhaler (Orion Pharma); Eclipse (Aventis); FlowCaps (Hovione); Handihaler (Boehringer Ingelheim); Pulvinal (Chiesi); Rotahaler (GlaxoSmithKline); SkyeHaler/Certihaler (SkyePharma); Twisthaler (Schering–Plough); Turbuhaler (AstraZeneca); Ultrahaler (Aventis); и т.п.

В другом конкретном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят путем ингаляции, используя дозирующий ингалятор. Такие дозирующие ингаляторы, как правило, выпускают отмеренное количество терапевтического средства, используя сжатый газ–пропеллент. Соответственно, фармацевтические композиции, вводимые с использованием дозирующего ингалятора, как правило, содержат раствор или суспензию терапевтического средства в сжиженном пропелленте. Может быть использован любой подходящий сжиженный пропеллент, включая гидрофторалканы (HFA), такие как 1,1,1,2–тетрафторэтан (HFA 134a) и 1,1,1,2,3,3,3–гептафтор–н–пропан, (HFA 227); и хлорфторуглероды, такие как CCl₃F. В конкретном варианте осуществления пропеллент включает гидрофторалканы. В некоторых вариантах осуществления композиция гидрофторалкана содержит со–растворитель, такой как этанол или пентан, и/или поверхностно–активное вещество, такое как сорбитантриолеат, олеиновая кислота, лецитин и глицерин.

Типичная фармацевтическая композиция для применения в дозирующем ингаляторе содержит от около 0,01% до около 5% по массе соединения по настоящему изобретению; от около 0% до около 20% по массе этанола; и от около 0% до около 5% по массе поверхностно–активного вещества; остальное количество составляет HFA пропеллент. Такие композиции, как правило, получают путем добавления охлажденного или находящегося под давлением гидрофторалкана в подходящий контейнер, содержащий терапевтическое средство, этанол (если присутствует) и поверхностно–активное вещество (если присутствует). Для получения суспензии терапевтическое средство измельчают, а затем объединяют с пропеллентом. Затем композицию загружают в аэрозольный баллончик, который обычно является частью дозирующего ингаляционного устройства.

Дозирующие ингаляторы, подходящие для введения терапевтических средств путем ингаляции, описаны в данной области техники, и примеры таких устройств являются коммерчески доступными. Например, типичные дозирующие ингаляторы или продукты включают ингаляционную систему AeroBid (Forest Pharmaceuticals); ингаляционный аэрозоль Atrovent (Boehringer Ingelheim); Flovent (GlaxoSmithKline); ингалятор Maxair (3M); ингалятор Proventil (Schering); ингаляционный аэрозоль Serevent (GlaxoSmithKline); и т.п.

В другом конкретном аспекте фармацевтическую композицию вводят путем ингаляции с использованием ингалятора–небулайзера. Такие небулайзеры, как правило, обычно производят поток воздуха с высокой скоростью, который заставляет фармацевтическую композицию распыляться в виде тумана, который переносится в дыхательные пути пациента. Соответственно, при формулировании для использования в ингаляторе–небулайзере терапевтическое средство можно растворить в подходящем носителе для образования раствора. Альтернативно, терапевтическое средство можно подвергнуть микронизации или измельчению до наночастиц и объединить с подходящим носителем для образования суспензии.

Типичная фармацевтическая композиция для применения в ингаляторе–небулайзере включает раствор или суспензию, включающую от около 0,05 мкг/мл до около 20 мг/мл соединения по настоящему изобретению и эксципиенты, совместимые с распыляемыми составами. В одном варианте осуществления раствор имеет pH от около 3 до около 8.

Небулайзеры, подходящие для введения терапевтических средств путем ингаляции, описаны в данной области техники, и примеры таких устройств являются коммерчески доступными. Например, типичные распыляющие устройства или продукты включают ингалятор Respimat Softmist (Boehringer Ingelheim); систему доставки в легкие AERx (Aradigm Corp.); многоразовый небулайзер PARI LC Plus (Pari GmbH); и т.п.

В еще одном аспекте фармацевтические композиции по настоящему изобретению альтернативно можно получить в лекарственной форме, предназначенной для перорального введения. Подходящие фармацевтические композиции для перорального введения могут быть в форме капсул, таблеток, пилюль, пастилок, саше, драже, порошков, гранул; или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло–в–воде или вода–в–масле; или в виде эликсира или сиропа; и т.п.; при этом каждая из этих форм содержит заранее определенное количество соединения по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента.

Если они предназначены для перорального введения в твердой лекарственной форме, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, будут включать активное вещество и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, таких как цитрат натрия или дикальций фосфат. Необязательно или альтернативно, такие твердые лекарственные формы также могут включать: наполнители или добавки для увеличения объема, связующие, увлажнители, замедляющие растворение вещества, ускорители абсорбции, смачивающие вещества, абсорбенты, смазывающие вещества, красители и буферные агенты. В фармацевтических композициях по настоящему изобретению также могут присутствовать агенты, облегчающие высвобождение, смачивающие агенты, агенты покрытия, подсластители, отдушки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.

Альтернативные лекарственные формы также могут включать лекарственные формы с контролируемым высвобождением, жидкие лекарственные формы для перорального введения, трансдермальные пластыри и парентеральные лекарственные формы. Обычные эксципиенты и способы получения таких альтернативных лекарственных форм описаны, например, в ссылочном документе Remington, указанном выше.

Следующие неограничивающие примеры иллюстрируют типичные фармацевтические композиции по настоящему изобретению.

Водная композиция для глазной инъекции

Каждый мл стерильной водной суспензии включает от 5 мг до 50 мг соединения 1, хлорид натрия для тоничности, 0,99% (масс/об) бензилового спирта в качестве консерванта, 0,75% натрий карбоксиметилцеллюлозы и 0,04% полисорбата. Можно включить гидроксид натрия или хлористоводородную кислоту для доведения pH до 5–7,5.

Водная композиция для глазной инъекции

Стерильная не содержащая консервантов водная суспензия включает от 5 мг/мл до 50 мг/мл соединения 1 в 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 0,03% полисорбата 20 и 5% сахарозы.

Сухая порошковая композиция

Микронизированное соединение 1 (1 г) смешивают с измельченной лактозой (25 г). Эту перемешанную смесь затем загружают в отдельные блистеры отслаиваемой блистерной упаковки в количестве, достаточном для обеспечения от около 0,1 до около 4 мг соединения формулы I на дозу. Содержимое блистеров вводят с использованием ингалятора сухого порошка.

Сухая порошковая композиция

Микронизированное соединение 1 (1 г) смешивают с измельченной лактозой (20 г) с образованием объемной композиции, имеющей массовое отношение соединения к измельченной лактозе 1:20. Смешанную композицию упаковывают в устройство для ингаляции сухого порошка, способное доставлять от около 0,1 до около 4 мг соединения формулы I на дозу.

Композиция для дозирующего ингалятора

Микронизированное соединение 1 (10 г) диспергируют в растворе, полученном путем растворения лецитина (0,2 г) в деминерализованной воде (200 мл). Полученную суспензию сушат распылением и затем измельчают с образованием микронизированной композиции, включающей частицы, имеющие средний диаметр менее чем около 1,5 мкм. Микронизированную композицию затем загружают в картриджи дозирующего ингалятора, содержащие 1,1,1,2–тетрафторэтан под давлением, в количестве, достаточном для обеспечения от около 0,1 до около 4 мг соединения формулы I на дозу при введении при помощи дозирующего ингалятора.

Композиция для небулайзера

Соединение 1 (25 мг) растворяют в растворе, содержащем 1,5–2,5 эквивалента хлористоводородной кислоты, с последующим добавлением гидроксида натрия для доведения рН до 3,5–5,5 и 3% по массе глицерина. Раствор тщательно перемешивают до растворения всех компонентов. Раствор вводят с использованием небулайзера, который обеспечивает от около 0,1 мг до около 4 мг соединения формулы I на дозу.

Полезность

Было показано, что соединение по настоящему изобретению 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол, (соединение 1) является сильным ингибитором JAK семейства ферментов: JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2.

Глазные заболевания

Было показано, что многие глазные заболевания связаны с повышением уровня провоспалительных цитокинов, которые зависят от пути JAK–STAT. Поскольку соединение по изобретению демонстрирует сильное ингибирование всех четырех ферментов JAK, ожидается, что оно должно сильно ингибировать передачу сигналов и патогенные эффекты многочисленных цитокинов (таких как IL–6, IL–2 и IFN–γ), которые передают сигналы через JAK, а также препятствовать повышению уровней других цитокинов (таких как MCP–1 и IP–10), продукция которых зависит от сигнального пути JAK–STAT.

В частности, соединение по изобретению показало pIC₅₀ значения 6,7 или больше (IC₅₀ значения 200 нМ или меньше) для ингибирования передачи сигналов IL–2, IL–4, IL–6 и IFNγ в клеточных анализах, описанных в Анализах 3–7, включая анализы, регистрирующие ингибирование нисходящих эффектов повышения уровня цитокинов.

Фармакокинетическое исследование в Анализе 8 продемонстрировало длительную экспозицию в глазных тканях кролика после одной интравитреальной инъекции и концентрацию в плазме по меньшей мере на три порядка ниже, чем концентрация, наблюдаемая в стекловидной ткани.

Кроме того, интравитреальное введение соединения по изобретению продемонстрировало значительное ингибирование IL–6–индуцированного pSTAT3 в ткани сетчатки/сосудистой оболочки глаз крысы, а также значительное ингибирование IFN–γ–индуцированного IP–10 в стекловидном теле кролика, а также в тканях сетчатки/сосудистой оболочки глаз.

Как ожидают, устойчивое ингибирование JAK в тканях глаз в отсутствие существенных системных уровней приведет к сильной локальной противовоспалительной активности в глазу без системно–вызываемых побочных эффектов. Таким образом, ожидают, что соединение по изобретению будет полезным для различных глазных заболеваний, которые включают, но не ограничиваются этим, увеит, диабетическую ретинопатию, диабетический макулярный отек, синдром сухого глаза, возрастную дегенерацию желтого пятна, окклюзию вены сетчатки и атопический кератоконъюнктивит.

В частности, увеит (Horai and Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733–744), диабетическая ретинопатия (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 1–12), диабетический макулярный отек (Sohn et al., American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686–694), синдром сухого глаза (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90–100) и возрастная дегенерация желтого пятна (Knickelbein et al, Int Ophthalmol Clin, 2015, 55(3), 63–78) характеризуются повышением уровней некоторых провоспалительных цитокинов, которые передают сигналы через JAK–STAT путь. Соответственно, соединение по изобретению может облегчать ассоциированное глазное воспаление и вызывать регрессию прогрессирующего заболевания или обеспечивать облегчение симптомов.

Окклюзия вен сетчатки (RVO) является широко распространенным глазным инвалидизирующим заболеванием. Обструкция кровотока сетчатки может привести к повреждению сосудистой сети сетчатки, кровоизлиянию и ишемии тканей. Хотя причины RVO являются многофакторными, было показано, что важное значение имеют как сосудистые, так и воспалительные медиаторы (Deobhakta et al., International Journal of Inflammation, 2013, article ID 438412). Повышенные уровни цитокинов, которые передают сигналы через путь JAK–STAT, таких как IL–6 и IL–13, а также других цитокинов, таких как MCP–1, продукция которых частично управляется передачей сигналов JAK–STAT, были обнаружены в тканях глаз пациентов с РВО (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905–911). Соответственно, соединение 1 может облегчать ассоциированное глазное воспаление и вызывать регрессию прогрессирующего заболевания или обеспечивать облегчение симптомов при этом заболевании. Хотя многих пациентов с РВО лечат фотокоагуляцией, это по своей сути деструктивная терапия. Анти–VEGF средства также используют, но они эффективны только у части пациентов. Стероидные препараты, которые снижают уровень воспаления в глазу (триамцинолон ацетонид и дексаметазоновые имплантаты), также, как было показано, дают полезные результаты для пациентов с некоторыми формами РВО, но также было показано, что они вызывают катаракты и повышенное внутриглазное давление/глаукому.

Поэтому в одном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения глазного заболевания у млекопитающего, включающий введение 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли в глаз млекопитающего. В одном аспекте глазное заболевание представляет собой увеит, диабетическую ретинопатию, диабетический макулярный отек, синдром сухого глаза, возрастную дегенерацию желтого пятна, окклюзию вены сетчатки или атопический кератоконъюнктивит. В одном аспекте способ включает введение соединения по настоящему изобретению путем интравитреальной инъекции.

Респираторные заболевания

Соединение по настоящему изобретению 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол (1) продемонстрировало ингибирование T–клеточной активации, ингибирование цитокинов, ассоциированных с воспалением, и активность в анализах легочной эозинофилии и нейтрофилии у грызунов. Поэтому считают, что соединение будет полезным для лечения некоторых специфических респираторных заболеваний.

Эозинофильное воспаление дыхательных путей является характерной особенностью заболеваний, которые в совокупности называются эозинофильными заболеваниями легких (Cottin et al., Clin. Chest. Med., 2016, 37(3), 535–56). Эозинофильные заболевания ассоциированы с передачей сигналов IL–4, IL–13 и IL 5. Эозинофильные заболевания легких включают инфекции (особенно, гельминтозы), лекарственный пневмонит (индуцированный, например, терапевтическими препаратами, такими как антибиотики, фенитоин или триптофан или l–триптофан), грибковый пневмонит (например, аллергический бронхолегочный аспергиллез), гиперчувствительный пневмонит и эозинофильный гранулематоз с полиангиитом (ранее известный как синдром Чарга–Штрауса). Эозинофильные заболевания легких неизвестной этиологии включают идиопатическую острую эозинофильную пневмонию, идиопатическую хроническую эозинофильную пневмонию, гиперэозинофильный синдром и синдром Леффлера. Было показано, что соединение 1 существенно уменьшает легочную эозинофилию в модели дыхательных путей грызунов в Анализе 13 и сильно ингибирует передачу сигналов IL–13, IL–4 и IL–2 в клеточных анализах.

Полиморфизм в гене IL–6 связывают с повышенными уровнями IL–6 и повышенным риском развития легочной артериальной гипертензии (PAH) (Fang et al., J Am Soc Hypertens., Interleukin–6 –572C/G polymorphism is associated with serum interleukin–6 levels and risk of idiopatic pulmonary arterial hypertension, 2017, ahead of print). Подтверждая роль IL–6 в PAH, ингибирование цепи gp130 рецептора IL–6 облегчает заболевание в крысиной модели PAH (Huang et al., Can J Cardiol., 2016, 32(11), 1356.e1–1356.e10). Было показано, что соединение по изобретению ингибирует передачу сигналов IL–6.

Цитокины, такие как IFNγ, IL–12 и IL–6, вовлечены в ряд неаллергических заболеваний легких, таких как саркоидоз и лимфангиолейомиоматоз (El–Hashemite et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2005, 33, 227–230, и El–Hashemite et al., Cancer Res., 2004, 64, 3436–3443). Было показано, что соединение по изобретению ингибирует передачу сигналов IL–6 и IFNγ.

Бронхоэктаз и инфильтративные легочные заболевания представляют собой заболевания, ассоциированные с хроническим нейтрофильным воспалением. Было показано, что соединение по изобретению ингибирует нейтрофилию дыхательных путей в модели грызунов.

Патологическая активация Т–клеток имеет решающее значение в этиологии множественных респираторных заболеваний. Аутореактивные Т–клетки играют роль в облитерирующем бронхиолите с организующейся пневмонией (также называемой COP [криптогенная организующаяся пневмония]). Совсем недавно при более активном использовании ингибиторов иммунных контрольных точек появился индуцированный ингибиторами иммунных контрольных точек пневмонит, еще одно опосредованное Т–клетками заболевание легких. У больных раком, получавших эти стимуляторы Т–клеток, может развиться фатальный пневмонит. Было показано, что соединение по изобретению ингибирует активацию в T–клетках, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови человека.

Поэтому в одном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения респираторного заболевания у млекопитающего (например человека), включающий введение млекопитающему 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель и соединение по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, где респираторное заболевание представляет собой легочную инфекцию, гельминтоз, легочную артериальную гипертензию, саркоидоз, лимфангиолейомиоматоз, бронхоэктаз или инфильтративное легочное заболевание.

В другом аспекте изобретение обеспечивает способ лечения респираторного заболевания у млекопитающего (например человека), включающий введение млекопитающему соединения по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель и соединение по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, где респираторное заболевание представляет собой лекарственный пневмонит, грибковый пневмонит, аллергический бронхолегочный аспергиллез, гиперчувствительный пневмонит, эозинофильный грануломатоз с полиангиитом, идиопатическую острую эозинофильную пневмонию, идиопатическую хроническую эозинофильную пневмонию, гиперэозинофильный синдром, синдром Леффлера, облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией или индуцированный ингибитором иммунных контрольных точек пневмонит.

Цитокины, передающие сигналы через JAK, также играют большую роль в активации T–клеток, подтипе иммунных клеток, который имеет важное значение для многих иммунных процессов. Патологическая активация Т–клеток имеет решающее значение в этиологии множества респираторных заболеваний. Аутореактивные Т–клетки играют роль в облитерирующем бронхиолите с организующейся пневмонией (также называемом COS). Подобно COS, этиология отторжения трансплантата легкого связана с аберрантной T–клеточной активацией Т–клеток реципиентов трансплантированным легким донора. Отторжения трансплантата легких могут произойти раньше в виде первичной дисфункции трансплантата (PGD), организующейся пневмонии (OP), острого отторжения (AR) или лимфоцитарного бронхиолита (LB), или они могут произойти спустя годы после трансплантации легкого в виде хронической дисфункции аллотрансплантата легкого (CLAD). CLAD ранее был известен как облитерирующий бронхиолит (BO), но теперь считается синдромом, который может иметь различные патологические проявления, включая BO, рестриктивную CLAD (rCLAD или RAS) и нейтрофильную дисфункцию аллотрансплантата. Хроническая дисфункция аллотрансплантата легкого (CLAD) является серьезной проблемой в тактике долгосрочного лечения реципиентов с легочным трансплантатом, поскольку заставляет трансплантированное легкое постепенно терять функциональность (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185–191). CLAD плохо реагирует на лечение, и, следовательно, остается потребность в эффективных соединениях, способных к предотвращению или лечению этого состояния. Некоторые JAK–зависимые цитокины, такие как IFNγ и IL–5, активируются при CLAD и отторжении трансплантата легкого (Berastegui et al, Clin Transplant. 2017, 31, e12898). Кроме того, высокий уровень хемокинов CXCR3 в легких, таких как CXCL9 и CXCL10, которые находятся на нисходящем JAK–зависимом IFN сигнальном пути, связаны с худшими исходами у пациентов с трансплантированным легким (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). Было показано, что системное ингибирование JAK эффективно при отторжении трансплантата почки (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446–56). Поэтому ингибиторы JAK могут быть эффективными при лечении или профилактике отторжения трансплантата легких и CLAD. Подобные события активации Т–клеток, описанные в качестве основы для отторжения трансплантата легкого, также считают основным фактором, вызывающим заболевание легких, ассоциированное с реакцией трансплантат–против–хозяина (GVHD), которая может происходить после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Как и в случае с CLAD, GVHD легкого является хроническим прогрессирующим заболеванием с крайне плохими исходами, и в настоящее время нет одобренного лечения. Ретроспективное многоцентровое обзорное исследование 95 пациентов с стероид–резистентной острой или хронической GVHD, которые получали системный ингибитор JAK руксолитиниб в качестве консервативной терапии, продемонстрировало полный или частичный ответ на руксолитиниб у большинства пациентов, включая пациентов с GVHD легких (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062–68). Поскольку системное ингибирование JAK связывают с неблагоприятными явлениями и низким терапевтическим индексом, остается потребность в ингаляционном, направленно действующем на легкие, несистемном ингибиторе JAK для профилактики и/или лечения отторжения трансплантата легкого или GVHD легкого.

Соответственно, изобретение также обеспечивает способ лечения дополнительных респираторных состояний, описанных выше, у млекопитающего, включающий введение млекопитающему соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли.

Желудочно–кишечное воспалительное заболевание

В качестве ингибитора JAK соединение 1 или его фармацевтическая соль также могут быть полезны при различных желудочно–кишечных воспалительных заболеваниях, которые включают, но не ограничиваются этим, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит (проктосигмоидит, панколит, язвенный проктит и левосторонний колит), болезнь Крона, коллагенозный колит, лимфоцитарный колит, болезнь Бехчета, целиакию, индуцированный ингибитором иммунных контрольных точек колит, илеит, эозинофильный эзофагит, связанный с реакцией трансплантат–против–хозяина колит и инфекционный колит. Язвенный колит (Reimund et al., J Clin Immunology, 1996, 16, 144–150), болезнь Крона (Woywodt et al., Eur J Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267–276), коллагенозный колит (Kumawat et al., Mol Immunology, 2013, 55, 355–364), лимфоцитарный колит (Kumawat et al., 2013), эозинофильный эзофагит (Weinbrand–Goichberg et al., Immunol Res, 2013, 56, 249–260), связанный с реакцией трансплантат–против–хозяина колит (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 3268–3276), инфекционный колит (Stallmach et al., Int J Colorectal Dis, 2004, 19, 308–315), болезнь Бехчета (Zhou et al., Autoimmun Rev, 2012, 11, 699–704), целиакия (de Nitto et al., World J Gastroenterol, 2009, 15, 4609–4614), индуцированный ингибитором иммунных контрольных точек колит (например, индуцированный ингибитором CTLA–4 колит; (Yano et al., J Translation Med, 2014, 12, 191), индуцированный ингибитором PD–1 или PD–L1 колит) и илеит (Yamamoto et al., Dig Liver Dis, 2008, 40, 253–259) характеризуются повышением уровня некоторых провоспалительных цитокинов. Поскольку многие провоспалительные цитокины передают сигналы посредством активации JAK, соединения, описанные в настоящей заявке, могут облегчать воспаление и обеспечивать облегчение симптомов.

Воспалительное кожное заболевание

Атопический дерматит и другие воспалительные заболевания кожи связывают с повышением уровня провоспалительных цитокинов, которые зависят от пути JAK–STAT. Поэтому соединение 1 или его фармацевтически приемлемая соль могут быть полезны при ряде кожных воспалительных или зудящих состояний, которые включают, но не ограничиваются этим, атопический дерматит, очаговую алопецию, витилиго, псориаз, дерматомиозит, кожную Т–клеточную лимфому (Netchiporouk et al., Cell Cycle. 2014; 13, 3331–3335) и подтипы (синдром Сезари, фунгоидный микоз, педжетоидный ретикулез, синдром гранулематозной вялой кожи, лимфоматоидный папулез, хронический лихеноидный парапсориаз, острый лихеноидный и вариолиформный парапсориаз, CD30+ кожную Т–клеточную лимфому, вторичную кожную CD30+ крупноклеточную лимфому, немикозную фунгоидную CD30– кожную крупноклеточную Т–клеточную лимфому, плеоморфную Т–клеточную лимфому, лимфому Леннерта, подкожную Т–клеточную лимфому, ангиоцентрическую лимфому, бластную NK–клеточную лимфому), узловатую почесуху, красный плоский лишай, первичный локализованный амилоидоз кожи, буллезный пемфигоид, кожные проявления реакции трансплантат–против–хозяина, пемфигоид, дискоидную волчанку, кольцевидную гранулему, простой хронический лишай, влагалищный/мошоночный/перианальный зуд, каплевидную склеродермию, зуд при постгерпетической невралгии, плоский фолликулярный лишай и декальвирующий фолликулит. В частности, атопический дерматит (Bao et al., JAK–STAT, 2013, 2, e24137), очаговая алопеция (Xing et al., Nat Med. 2014, 20, 1043–1049), витилиго (Craiglow et al, JAMA Dermatol. 2015, 151, 1110–1112), узловатая почесуха (Sonkoly et al., J Allergy Clin Immunol. 2006, 117, 411–417), красный плоский лишай (Welz–Kubiak et al., J Immunol Res. 2015, ID:854747), первичный локализованный амилоидоз кожи (Tanaka et al., Br J Dermatol. 2009, 161, 1217–1224), буллезный пемфигоид (Feliciani et al., Int J Immunopathol Pharmacol. 1999, 12, 55–61) и кожные проявления реакции трансплантат–против–хозяина (Okiyama et al., J Invest Dermatol. 2014, 134, 992–1000) характеризуются повышением уровня некоторых цитокинов, которые передают сигналы через активацию JAK. Соответственно, соединение 1 или его фармацевтически приемлемая соль может облегчать ассоциированные с этими цитокинами кожные воспаления или зуд.

Другие заболевания

Соединение 1 или его фармацевтически приемлемая соль также могут быть полезными для лечения других заболеваний, таких как другие воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания или рак. Соединение 1 или или его фармацевтически приемлемая соль также могут быть полезными для лечения одного или нескольких заболеваний, выбранных из артрита, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, отторжения трансплантата, ксерофтальмии, псориатического артрита, диабета, инсулинозависимого диабета, заболевания двигательных нейронов, миелодиспластического синдрома, боли, саркопении, кахексии, септического шока, системной красной волчанки, лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоцитарного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, анкилозирующего спондилита, миелофиброза, В–клеточной лимфомы, гепатоцеллюлярной карциномы, болезни Ходжкина, рака молочной железы, множественной миеломы, меланомы, неходжкинской лимфомы, немелкоклеточного рака легкого, светлоклеточного рака яичников, опухоли яичника, опухоли поджелудочной железы, истинной полицитемии, синдрома Шегрена, саркомы мягких тканей, саркомы, спленомегалии, Т–клеточной лимфомы и большой талассемии.

Комбинированная терапия

Соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль можно использовать в комбинации с одним или несколькими средствами, которые действуют по тому же самому механизму или по другим механизмам для лечения заболевания. Разные средства можно вводить последовательно или одновременно, в раздельных композициях или в одной и той же композиции. Подходящие классы средств для комбинированной терапии включают, но не ограничиваются этим, агонист бета 2 адренорецепторов, антагонист мускариновых рецепторов, агонист глюкокортикоидов, антагонист сопряженных с G–белком рецепторов 44, антагонист лейкотриена D4, антагонист мускариновых рецепторов M3, антагонист гистаминовых рецепторов H1, антагонист иммуноглобулина E, ингибитор PDE 4, антагонист IL–4, антагонист мускариновых рецепторов M1, антагонист гистаминовых рецепторов, антагонист IL–13, антагонист IL–5, ингибитор 5–липоксигеназы, агонист бета–адренорецепторов, антагонист хемокина CCR3, стимулятор CFTR, модулятор иммуноглобулина, ингибитор лиганда интерлейкина 33, ингибитор PDE 3, ингибитор дельта–фосфоинозитид–3–киназы, антагонист тромбоксана А2, ингибитор эластазы, ингибитор Kit тирозинкиназы, антагонист лейкотриена E4, антагонист лейкотриенов, антагонист PGD2, ингибитор лиганда TNF альфа, TNF–связывающий агент, ингибитор каскада комплемента, ингибитор лиганда эотаксина, ингибитор глутатионредуктазы, антагонист H4 гистаминовых рецепторов, антагонист IL–6, стимулятор гена IL2, модулятор Fc–рецептора IIB гамма иммуноглобулина, лиганд интерферона гамма, ингибитор лиганда интерлейкина 13, ингибитор лиганда интерлейкина 17, антагонист L–селектина, ингибитор лейкоцитарной эластазы, антагонист лейкотриена С4, ингибитор лейкотриен С4–синтазы, ингибитор мембранной медь–содержащей аминоксидазы, ингибитор металлопротеазы–12, ингибитор металлопротеазы–9, модулятор клещевого аллергена, модулятор мускариновых рецепторов, агонист никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, ингибитор ядерного фактора каппа B, антагонист p–селектина, ингибитор PDE 5, антагонист рецепторв PDGF, ингибитор гамма–фосфоинозитид–3–киназы, агонист TLR–7, антагонист TNF, ингибитор тирозинкиназы Abl, антагонист ацетилхолиновых рецепторов, ингибитор кислой хитиназы млекопитающих, агонист рецепторов ACTH, модулятор полимеризации актина, антагонист рецепторов аденозина А1, стимулятор аденилатциклазы, антагонист адренорецепторов, лиганд адренокортикотропного гормона, ингибитор алкогольдегидрогеназы 5, стимулятор антитрипсин альфа 1, ингибитор альфа–1–протеиназы, модулятор андрогенных рецепторов, стимулятор ангиотензинпревращающего фермента 2, агонист ANP, ингибитор белка Bcr, антагонист бета 1 адренорецепторов, антагонист бета 2 адренорецепторов, модулятор бета 2–адренорецепторов, модулятор бета–амилоидов, ингибитор гена BMP10, ингибитор гена BMP15, ингибитор кальциевых каналов, ингибитор катепсина G, ингибитор гена CCL26, модулятор хемокина CCR3, антагонист хемокина CCR4, ингибитор молекул клеточной адгезии, стимулятор шаперонина, ингибитор хитиназы, антагонист коллагена I, ингибитор комплемента C3, антагонист CSF–1, антагонист хемокина CXCR2, модулятор общей бета–цепи цитокиновых рецепторов, стимулятор цитотоксический Т–лимфоцит–ассоциированного белка 4, стимулятор дезоксирибонуклеазы I, стимулятор дезоксирибонуклеазы, ингибитор дипептидилпептидазы I, ингибитор ДНК–гиразы, модулятор рецепторов простаноидов DP, антагонист E–селектина, ингибитор рецепторов тирозинкиназ семейства EGFR, модулятор эластина, антагонист эндотелина ET–A, антагонист эндотелина ET–B, ингибитор эпоксидгидролазы, антагонист рецепторов FGF3, ингибитор Fyn тирозинкиназы, ингибитор фактора транскрипции GATA 3, модулятор глюкозилцерамидазы, модулятор рецепторов глутамата, ингибитор лиганда GM–CSF, стимулятор гуанилатциклазы, ингибитор H+ K+ АТФазы, модулятор гемоглобина, агонист гепарина, ингибитор гистондеацетилазы, стимулятор гистондеацетилазы–2, ингибитор HMG CoA–редуктазы, ингибитор I–каппа–B–киназы бета, ингибитор гена ICAM1, антагонист IL–17, модулятор рецептора IL–17, антагонист IL–23, модулятор рецептора IL–4, модулятор иммуноглобулина G, агонист иммуноглобулина G1, модулятор иммуноглобулина G1, антагонист иммуноглобулинового эпсилон Fc–рецептора IA, антагонист иммуноглобулинового гамма Fc–рецептора IIB, модулятор иммуноглобулина каппа, сенсибилизатор инсулина, лиганд интерферона бета, антагонист интерлейкин 1–подобного рецептора, ингибитор лиганда интерлейкина 18, антагонист рецепторов интерлейкина 17А, ингибитор лиганда интерлейкина–1 бета, ингибитор лиганда интерлейкина–5, ингибитор лиганда интерлейкина–6, ингибитор потенциал–зависимого калиевого канала–3 KCNA, ингибитор лиганда Kit, агонист ламинина–5, антагонист лейкотриеновых рецепторов CysLT1, антагонист лейкотриеновых рецепторов CysLT2, ингибитор гена LOXL2, ингибитор Lyn тирозинкиназы, ингибитор белка MARCKS, ингибитор MDR–ассоциированного белка 4, модулятор металлопротеазы–2, модулятор металлопротеазы–9, антагонист минералокортикоидных рецепторов, антагонист мускариновых М2 рецепторов, антагонист мускариновых М4 рецепторов, антагонист мускариновых M5 рецепторов, агонист рецепторов натрийуретического пептида А–типа, модулятор рецепторов природных киллерных клеток, стимулятор альфа–7–субъединицы никотинового ACh рецептора, модулятор рецепторов NK–клеток, модулятор ядерного фактора каппа–B, агонист рецепторов опиоидного фактора роста, ингибитор P–гликопротеина, антагонист пуриноцептора P2X3, ингибитор p38 MAP киназы, модулятор пептидазы 1, ингибитор фосфолипазы А2, ингибитор фосфолипазы С, ингибитор активатора плазминогена 1, антагонист рецепторов фактора активации тромбоцитов, агонист PPAR гамма, агонист простациклина, ингибитор протеинтирозинкиназы, стимулятор домена SH2 инозитолфосфатазы 1, ингибитор сигнальной трансдукции, ингибитор натриевых каналов, модулятор STAT–3, ингибитор антигена–1 стволовых клеток, модулятор супероксиддисмутазы, ингибитор CD28 гликопротеина на поверхности Т–клеток, ингибитор CD8 гликопротеина на поверхности Т–клеток, агонист TGF бета, антагонист TGF бета, ингибитор тромбоксансинтетазы, ингибитор лиганда тимусного стромального лимфопоэтина, агонист тимозина, лиганд тимозин бета 4, агонист TLR–8, агонист TLR–9, стимулятор гена TLR9, ингибитор топоизомеразы IV, стимулятор тропонина I быстрых скелетных мышц, стимулятор тропонина Т быстрых скелетных мышц, антагонист рецепторов IL–1 типа I, модулятор рецепторов TNF II типа, модулятор ионных каналов, стимулятор утероглобина и агонист VIP.

Конкретные средства, которые можно использовать в комбинации с ингибитором JAK по настоящему изобретению, соединением 1, включают, но не ограничиваются этим, росиптор ацетат, умеклидиниум бромид, секукинумаб, метенкефалин ацетат, тридекактид ацетат, флутиказон пропионат, стабилизированный альфа–циклодекстрином сульфорафан, тезепелумаб, мометазон фуроат, BI–1467335, дупилумаб, аклидиний, формотерол, AZD–1419, HI–1640V, ривипансел, CMP–001, маннит, ANB–020, омализумаб, трегализумаб, Митизакс, бенрализумаб, голимумаб, рофлумиласт, иматиниб, REGN–3500, маситиниб, апремиласт, RPL–554, Актиммун, адалимумаб, рупатадин, парогрелил, МК–1029, беклометазон дипропионат, формотерол фумарат, могамулизумаб, сератродаст, UCB–4144, немирализиб, CK–2127107, февипипрант, данириксин, бозентан, абатацепт, EC–18, дувелисиб, доципарстат, ципрофлоксацин, сальбутамол HFA, эрдостеин, PrEP–001, недокромил, CDX–0158, сальбутамол, энобосарм, R–TPR–022, лензилумаб, флутиказон фуроат, вилантерол трифенатат, флутиказон пропионат, сальметерол, PT–007, PRS–060, реместемсел–L, цитруллин, RPC–4046, оксид азота, DS–102, герилимзумаб, Актаир, флутиказон фуроат, умеклидиний, вилантерол, AG–NPP709, Гамунекс, инфликсимаб, Ампион, акумапимод, канакинумаб, INS–1007, CYP–001, сирукумаб, флутиказон пропионат, меполизумаб, питавастатин, солитромицин, этанерцепт, ивакафтор, анакинра, MPC–300–IV, гликопиррония бромид, аклидиния бромид, FP–025, ризанкизумаб, гликопирроний, формотерол фумарат, Adipocell, YPL–001, тиотропий бромид, гликопирроний бромид, индакатерол малеат, андекаликсимаб, олодатерол, эзомепразол, вакцину против пылевого клеща, вакцину против аллергенов пыльцы полыни, ваморолон, гефапиксант, ревефенацин, гефитиниб, ReJoin, типелукаст, бедорадрин, SCM–CGH, SHP–652, RNS–60, бродалумаб, BIO–11006, умеклидиния бромид, вилантерол трифенатат, ипратропия бромид, тралокинумаб, PUR–1800, VX–561, VX–371, олопатадин, тулобутерол, формотерол фумарат, триамцинолон ацетонид, реслизумаб, сальметерол ксинафоат, флутиказон пропионат, беклометазон дипропионат, формотерол фумарат, тиотропия бромид, лигелизумаб, RUTI, бертилимумаб, омализумаб, гликопиррония бромид, SENS–111, беклометазон дипропионат, CHF–5992, LT–4001, индакатерол, гликопиррония бромид, мометазон фуроат, фексофенадин, гликопиррония бромид, азитромицин, AZD–7594, формотерол, CHF–6001, батефентерол, OATD–01, олодатерол, CJM–112, росиглитазон, сальметерол, сетипипрант, ингаляционный бета–интерферон, AZD–8871, плеканатид, флутиказон, сальметерол, моноглицериды эйкозапентаеновой кислоты, лебрикизумаб, RG–6149, QBKPN, Мометазон, индакатерол, AZD–9898, пируват натрия, зилеутон, CG–201, имидафенацин, CNTO–6785, CLBS–03, мометазон, RGN–137, прокатерол, формотерол, CCI–15106, POL–6014, индакатерол, беклометазон, MV–130, GC–1112, Allergovac депо–препарат, MEDI–3506, QBW–251, ZPL–389, уденафил, GSK–3772847, левоцетиризин, AXP–1275, ADC–3680, тимапипрант, абедитерол, AZD–7594, ипратропия бромид, сальбутамол сульфат, тадекиниг альфа, ACT–774312, дорназа альфа, илопрост, батефентерол, флутиказон фуроат, аликафорсен, циклесонид, эмерамид, арформотерол, SB–010, Озагрел, BTT–1023, Дектрекумаб, левальбутерол, пранлукаст, гиалуроновую кислоту, GSK–2292767, Формотерол, NOV–14, Луцинактант, сальбутамол, преднизолон, эбастин, дексаметазон ципецилат, GSK–2586881, BI–443651, GSK–2256294, VR–179, VR–096, hdm–ASIT+, будесонид, GSK–2245035, VTX–1463, Эмедастин, декспрамипексол, левальбутерол, N–6022, дексаметазон натрия фосфат, PIN–201104, OPK–0018, TEV–48107, суплатаст, BI–1060469, Гемилукаст, интерферон гамма, далазатид, биластин, флутиказон пропионат, сальметерол ксинафоат, RP–3128, бенциклокидиум бромид, реслизумаб, PBF–680, антагонист CRTH2, пранлукаст, сальметерол ксинафоат, флутиказон пропионат, тиотропия бромид моногидрат, масилукаст, RG–7990, Доксофиллин, абедитерол, гликопиррония бромид, TEV–46017, ASM–024, флутиказон пропионат, гликопиррония бромид, сальметерол ксинафоат, сальбутамол, ТА–270, Флунизолид, хромогликат натрия, Epsi–gam, ZPL–521, сальбутамол, авиптадил, TRN–157, Зафирлукаст, Stempeucel, пемироласт натрия, надолол, флутиказон пропионат+сальметерол ксинафоат, RV–1729, сальбутамол сульфат, диоксид углерода+перфтороктилбромид, APL–1, дектрекумаб+VAK–694, лизин ацетилсалицилат, зилеутон, TR–4, терапию на основе аллогенных мезенхимальных клеток–предшественников жировой ткани человека, MEDI–9314, PL–3994, HMP–301, TD–5471, NKTT–120, пемироласт, беклометазон дипропионат, трантинтерол, мононатрий альфа–люминол, IMD–1041, AM–211, TBS–5, ARRY–502, сератродаст, рекомбинантную мидисмазу, ASM–8, дефлазакорт, бамбутерол, RBx–10017609, ипратропий+фенотерол, флутиказон+формотерол, эпинастин, WIN–901X, VALERGEN–DS, OligoG–COPD–5/20, тулобутерол, оксис Турбухалер, DSP–3025, ASM–024, мизоластин, будесонид+сальметерол, LH–011, AXP–E, гистамин+иммуноглобулин человека, YHD–001, теофиллин, амброксол+эрдостеин, раматробан, монтелукаст, пранлукаст, AG–1321001, тулобутерол, ипратропий+сальбутамол, траниласт, метилпреднизолон сулептанат, колфорсин даропат, репиринаст и доксофиллин.

Также обеспечивается фармацевтическая композиция, включающая соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль и одно или несколько других терапевтических средств. Терапевтическое средство может быть выбрано из класса средств, указанных выше, и из перечня конкретных средств, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция подходит для доставки в легкие. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция является подходящей для доставки путем ингаляции или с использованием небулайзера. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой сухой порошок или жидкую композицию.

Кроме того, в аспекте, относящемся к способу, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения заболевания или расстройства у млекопитающего, включающий введение млекопитающему соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли и одного или нескольких других терапевтических средств.

При использовании в комбинированной терапии средства могут быть сформулированы в одну фармацевтическую композицию, или средства могут быть представлены в отдельных композициях, которые вводят одновременно или в разное время одним и тем же или разными путями введения. Такие композиции могут быть упакованы отдельно или могут быть упакованы вместе в виде набора. Два или более терапевтических средств в наборе можно вводить одним и тем же путем введения или разными путями введения.

Было продемонстрировано, что соединение по настоящему изобретению является сильным ингибитором ферментов JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2 в ферментных анализах связывания, обладают сильной функциональной активностью без цитотоксичности в клеточных анализах и демонстрируют фармакодинамические эффекты ингибирования JAK в доклинических моделях, как описано в следующих примерах.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры синтеза и биологические примеры предложены для иллюстрации изобретения, и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. В приведенных ниже примерах следующие аббревиатуры имеют следующие значения, если не указано иное. Аббревиатуры, не определенные ниже, имеют общепринятые значения.

ACN = ацетонитрил

DCC = дициклогексилкарбодиимид

DIPEA = N, N–диизопропилэтиламин

DMAc = диметилацетамид

DMF = N, N–диметилформамид

EtOAc = этилацетат

HATU = N, N,N',N'–тетраметил–O–(7–азабензотриазол–1–ил)уроний гексафторфосфат

LDA = диизопропиламид лития

мин = минута(минуты)

MTBE = метил трет–бутиловый эфир

NBS = N–бромсукцинимид

RT = комнатная температура

THF = тетрагидрофуран

бис(пинаколато)дибор = 4,4,5,5,4',4',5',5'–октаметил–[2,2']би[[1,3,2]диоксабороланил]

Pd(dppf)Cl₂–CH₂Cl₂ = комплекс дихлор(1,1’–бис(дифенилфосфино)–ферроцен)–дипалладия(II) с дихлорметаном

Реагенты и растворители приобретали у коммерческих поставщиков (Aldrich, Fluka, Sigma и т.д.) и использовали без дополнительной очистки. Реакции отслеживали при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ), аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (анал. ВЭЖХ) и масс–спектрометрии. Реакционные смеси обрабатывали, как описано конкретно для каждой реакции; обычно их очищали экстракцией и другими методами очистки, такими как температура– и растворитель–зависимая кристаллизация, а также преципитация. Кроме того, реакционные смеси обычно очищали колоночной хроматографией или препаративной ВЭЖХ, обычно с использованием колонок с насадкой C18 или BDS и традиционных элюентов. Типичные условия препаративной ВЭЖХ описаны ниже.

Продукты реакции обычно охарактеризовывали методом масс– и ¹H–ЯМР спектрометрии. Для ЯМР анализа образцы растворяли в дейтерированном растворителе (таком, как CD₃OD, CDCl₃ или d ₆–DMSO) и спектры ¹H–ЯМР получали с использованием устройства Varian Gemini 2000 (400 МГц) в стандартных условиях наблюдения. Масс–спектрометрическую идентификацию соединений осуществляли методом электрораспылительной ионизации (ESMS) с использованием устройства Applied Biosystems (Foster City, CA) модель API 150 EX или устройства Waters (Milford, MA) 3100, соединенных с системами автоочистки.

Условия препаративной ВЭЖХ

Колонка: C18 5 мкм 21,2×150 мм, или C18 5 мкм 21×250, или C14 5 мкм 21×150 мм

Температура колонки: Комнатная температура

Скорость потока: 20,0 мл/мин

Подвижные фазы: A=Вода+0,05% TFA, B=ACN+0,05% TFA

Объем вводимой пробы: (100–1500 мкл)

Длина волны детектора: 214 нм

Неочищенные соединения растворяли в смеси 1:1 вода:уксусная кислота при около 50 мг/мл. 4–минутный цикл в аналитическом масштабе осуществляли, используя колонку C18 2,1×50 мм, с последующим 15– или 20–минутным циклом в препаративном масштабе, используя объем вводимой пробы 100 мкл, с градиентом, основанном на удерживании % B эксперимента в аналитическом масштабе. Точные градиенты зависели от образца. Образцы с близко элюируемыми примесями проверяли на колонке C18 21×250 мм и/или колонке C14 21×150 мм для лучшего разделения. Фракции, содержащие желаемый продукт, идентифицировали при помощи масс–спектрометрического анализа.

Условия аналитической ВЭЖХ

Метод А

Колонка: Agilent Zorbax Bonus–RP C18, 150×4,60 мм, 3,5 микрон

Температура колонки: 40°C

Скорость потока: 1,5 мл/мин

Объем вводимой пробы: 5 мкл

Подготовка образца: Растворить в 1:1 ACN:1 М HCl

Подвижные фазы: A=Вода: TFA (99,95:0,05), B=ACN:TFA (99,95:0,05)

Длина волны детектора: 254 нм и 214 нм

Градиент: 26 мин всего (время (мин)/% B): 0/5, 18/90, 22/90, 22,5/90, 26/5

Метод В

Колонка: Agilent Poroshell 120 Bonus–RP, 4,6×150 мм, 2,7 мкм

Температура колонки: 30°C

Скорость потока: 1,5 мл/мин

Объем вводимой пробы: 10 мкл

Подвижные фазы: A=ACN:Вода:TFA (2:98:0,1), B=ACN:Вода:TFA (90:10:0,1)

Подготовка образца: Растворить в подвижной фазе В

Длина волны детектора: 254 нм и 214 нм

Градиент: 60 мин всего (время (мин)/% B): 0/0, 50/100, 55/100, 55,1/0, 60/0

Получение 1 : 1–бензил–4–имино–1,4–дигидропиридин–3–амин

Смесь пиридин–3,4–диамина (445 г, 4,078 моль) и ACN (11,0 л) перемешивали в течение 80 минут при температуре от 25°C до 15°C. Добавляли бензилбромид (485 мл, 4,078 моль) в течение 20 минут и реакционную смесь перемешивали при 20°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до 10°C и фильтровали. В реактор добавляли ACN (3 л), который охлаждали до 10°C. Лепешку промывали раствором для промывки реактора и промывали снова ACN (3 л), нагретым до 25°C. Твердое вещество сушили на фильтре в течение 24 часов в атмосфере азота, при 55°C в вакууме в течение 2 часов и затем при комнатной температуре в течение ночи и в течение 4 дней с получением HBr соли указанного в заголовке соединения (1102,2 г, 3,934 моль, выход 96%). ВЭЖХ Метод A Время удерживания 4,12 мин.

Получение 2 : 5–Бензил–2–(6–бром–1 H –индазол–3–ил)–5 H –имидазо[4,5–c]пиридин

(a) 5–Бензил–2–(6–бром–1H–индазол–3–ил)–5H–имидазо[4,5–c]пиридин

Раствор 6–бром–1H–индазол–3–карбальдегида (550 г, 2,444 моль), 1–бензил–4–имино–1,4–дигидропиридин–3–амина HBr (721 г, 2,333 моль) и DMAc (2,65 л) перемешивали в течение 60 минут и добавляли бисульфит натрия (257 г, 2,468 моль). Реакционную смесь нагревали до 135°C и поддерживали в течение 3 часов, и давали охладиться до 20°C и поддерживали при 20°C в течение ночи. Добавляли ацетонитрил (8 л) и реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при 15°C. Суспензию фильтровали на фильтре, работающем под давлением при средней скорости фильтрации. В реактор добавляли ACN (1 л). Лепешку промывали ACN раствором для промывки реактора и сушили в атмосфере азота в течение ночи и затем в вакууме при 50°C в течение 24 часов с получением HBr соли указанного в заголовке соединения (1264 г, 2,444 моль, выход 100%, чистота 94%) в виде плотного мокрого бежевого/коричневого твердого вещества. ВЭЖХ Метод A Время удерживания 8,77 мин.

Смесь продукта предыдущей стадии (1264 г, 2,444 моль), MeTHF (6 л) и воды (2,75 л) нагревали до 65°C и добавляли гидроксид натрия 50% масс. (254 г, 3,177 моль) в течение 5 минут и реакционную смесь перемешивали при 65°C в течение 1 часа, охлаждали до комнатной температуры, затем до 5°C и поддерживали в течение 2 часов. Суспензию фильтровали и реактор и лепешку промывали MeTHF (1 л). Полученное бежево–желтое твердое вещество сушили на фильтре в атмосфере азота в течение 3 дней с получением указанного в заголовке соединения (475 г, 1,175 ммоль, выход 48%) в виде бежевого/желтого твердого вещества. Маточный раствор (около 8 л) концентрировали до около 2 л, при этом начиналось осаждение твердых частиц. Суспензию нагревали до 50°C, поддерживали в течение 2 часов, охлаждали до 5°C в течение 2 часов, перемешивали в течение ночи и фильтровали. Лепешку промывали MeTHF (100 мл) и сушили в течение ночи в вакууме при 40°C с получением дополнительного количества указанного в заголовке соединения (140 г, 0,346 моль, выход 14%).

Смесь всего продукта предыдущей стадии, объединенную с продуктом второй партии в том же масштабе (1500 г, 3,710 моль) и MeTHF (4 л) перемешивали при 20°C в течение 2 часов и фильтровали. Реактор и лепешку промывали MeTHF (1,5 л). Полученное бежевое–желтое твердое вещество сушили в атмосфере азота в течение 3 дней с получением указанного в заголовке соединения в виде бежево–желтого твердого вещества (1325 г, 3,184 моль, выход 86% (общий выход 68%), чистота 97%). ВЭЖХ Метод A Время удерживания 8,77 мин

Получение 3 : 5–бензил–2–(6–бром–1 H –индазол–3–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин

В 15–л колбу добавляли 5–бензил–2–(6–бром–1H–индазол–3–ил)–5H–имидазо[4,5–c]пиридин (440 г, 1,088 моль) с последующим добавлением MeTHF (4,5 л), метанола (2,25 л) и воды (1,125 л). Суспензию охлаждали до 20°C, перемешивали в течение 1 часа и добавляли NaBH₄ (247 г, 6,530 моль). Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 18 часов. Добавляли воду (1,125 л) с последующим добавлением 20% масс. раствора хлорида натрия (1,125 л) и смесь перемешивали в течение 30 минут и слоям давали разделиться. Водный слой сливали. Добавляли предварительно смешанный раствор NaOH (522 г) и воды (5 л) и реакционную смесь перемешивали в течение 60 минут; слоям давали разделиться и водный слой сливали. Получали две дополнительные партии в одинаковом масштабе.

Органический слой из одной партии концентрировали при пониженном давлении в 15–л реакторе с рубашкой, с температурой рубашки, установленной при 50°C, внутренней температурой 20°C. Дополнительные партии добавляли в реактор и концентрировали поочередно с получением суспензии объемом около 6 л. Суспензию нагревали до 50°C, добавляли IPAc (6 л) и смесь поддерживали при 60°C в течение 1,5 часа, охлаждали до 20°C в течение 10 часов, нагревали до 60°C в течение 50 часов, охлаждали до 20°C в течение 5 часов, затем охлаждали до 5°C и поддерживали в течение 3 часов. Смесь фильтровали и реактор и лепешку промывали предварительно смешанным раствором IPAc (1 л) и MeTHF (1 л), предварительно охлажденным до 5°C. Твердые вещества сушили в атмосфере азота на фильтре при 40°C в течение 3 дней с получением указанного в заголовке соединения (1059 г, 2,589 моль, выход 79%) в виде не совсем белого твердого вещества. Это вещество снова сушили в вакуумной печи при 50–60°C в течение 8 часов и при 27°C в течение 2 дней с получением указанного в заголовке соединения (1043 г, 2,526 моль, выход 77%, чистота 99%). ВЭЖХ Метод A Время удерживания 6,73 мин.

Получение 4: (4–(Бензилокси)–2–этил–5–фторфенил)трифторборат, калия

(a) 2–(4–(Бензилокси)–2–этил–5–фторфенил)–4,4,5,5–тетраметил–1,3,2–диоксаборолан

Смесь 1–(бензилокси)–4–бром–5–этил–2–фторбензола (520 г, 1682 ммоль) и диоксане (5193 мл) продували азотом и затем добавляли бис(пинаколато)дибор (641 г, 2523 ммоль) с последующим добавлением ацетата калия (495 г, 5046 ммоль). Реакционную смесь продували азотом; добавляли Pd(dppf)Cl₂ (41,2 г, 50,5 ммоль); реакционную смесь продували азотом, нагревали при 103°C в атмосфере азота в течение 5 часов; и охлаждали до комнатной температуры. Реакционную смесь концентрировали путем вакуумной перегонки и распределяли между этилацетатом (5204 мл) и водой (5212 мл). Реакционную смесь фильтровали через Целит; органический слой промывали насыщенным солевым раствором (2606 мл) с последующим удалением растворителя путем вакуумной перегонки с получением неочищенного продукта в виде густого черного масла (~800 г).

Неочищенный продукт растворяли в DCM (1289 мл) и очищали хроматографией на силикагеле (2627 г диоксида кремния, предварительно суспендированного в гексане, элюировали при смесью 20% этилацетата в гексане (10,35 л)). Растворитель удаляли путем вакуумной перегонки с получением светло–желтого масла (600 г). ВЭЖХ Метод B Время удерживания 33,74 мин.

(b) (4–(бензилокси)–2–этил–5–фторфенил)трифторборат, калия

Продукт предыдущей стадии (200 г, 561 ммоль) смешивали с ацетоном (1011 мл) до полного растворения и добавляли метанол (999 мл) с последующим добавлением 3 M гидродифторида калия (307 г, 3930 ммоль), растворенного в воде (1310 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 3,5 часов. Основную часть органического растворителя удаляли путем вакуумной перегонки. Добавляли воду (759 мл) и полученную густую суспензию перемешивали в течение 30 минут и фильтровали. Лепешку промывали водой (506 мл) и твердые вещества сушили на фильтре в течение 30 мин. Твердые вещества суспендировали в ацетоне (1237 мл) и перемешивали в течение 1 часа. Полученную суспензию фильтровали и твердые вещества промывали ацетоном (247 мл). Ацетоновый раствор концентрировали путем вакуумной перегонки и постоянный объем (2 л) поддерживали медленным добавлением толуола (2983 мл) до выпаривания всего ацетона и воды. Толуольный раствор отгоняли до густой желтой суспензии на роторном испарителе, в это время продукты осаждались в виде белых твердых веществ. К смеси добавляли дополнительную порцию толуола (477 мл) и перемешивали в течение 1 часа. Смесь затем фильтровали и промывали толуолом (179 мл) и сушили в вакууме при 50°C в течение 24 часов с получением указанного в заголовке соединения (104 г, 310 ммоль, выход 55%) в виде свободнотекучего рыхлого не совсем белого твердого вещества. ВЭЖХ Метод B Время удерживания 27,71 мин.

Получение 5: 5–Бензил–2–(6–(4–(бензилокси)–2–этил–5–фторфенил)–1 H –индазол–3–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1 H– имидазо[4,5–c]пиридин

(a) 5–Бензил–2–(6–(4–(бензилокси)–2–этил–5–фторфенил)–1H–индазол–3–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин

Смесь бис(пинаколато)дибора (250 г, 984 ммоль) и IPA (1,88 л) перемешивали до растворения и затем добавляли по порциям раствор гидродифторида калия (538 г, 6,891 моль) в воде (2,31 л) в течение 10 минут. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа и фильтровали. Гелеобразные твердые вещества суспендировали с использованием воды (1,33 л) до образования прозрачного гидрогеля, а затем еще в течение 45 минут. Полученные твердые вещества/гель фильтровали, затем снова суспендировали в ацетоне (1,08 л), фильтровали, сушили на воздухе на фильтре в течение 30 минут и сушили в течение ночи с получением рыхлого белого твердого вещества (196,7 г).

В 5–л колбу добавляли 5–бензил–2–(6–бром–1H–индазол–3–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин (135 г, 331 ммоль), (4–(бензилокси)–2–этил–5–фторфенил)–трифторборат, калия (133 г, 397 ммоль) и продукт предыдущей стадии в виде белого твердого вещества (40,5 г) с последующим добавлением MeTHF (1,23 л) и MeOH (1,75 л). Полученную суспензию дегазировали три раза азотом. К суспензии добавляли дегазированный раствор карбоната цезия (431 г, 1,323 моль) в воде (1,35 л). Суспензию дегазировали два раза, добавляли Pd (amphos)₂Cl₂ (11,71 г, 16,53 ммоль), суспензию снова дегазировали два раза и реакционную смесь перемешивали при 67°C в течение ночи и охлаждали до 20°C. Слои разделяли и обратно экстрагировали при помощи MeTHF (550 мл). Органические слои объединяли и концентрировали на роторном испарителе до осаждения твердых веществ. Добавляли MeTHF (700 мл) и реакционную смесь перемешивали при 65°C. Слои разделяли и водную фазу обратно экстрагировали MeTHF (135 мл). Органические фазы объединяли и концентрировали до около 300 мл с получением густой оранжевой суспензии. К суспензии добавляли MeOH (270 мл) с последующим добавлением 1M HCl (1,325 л) при 20°C при быстром перемешивании. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 минут и добавляли воду (1 л) и полученную суспензию перемешивали в течение 1 часа. Твердые вещества фильтровали, промывали водой (150 мл), сушили на фильтре в течение 10 минут и при 45°C в атмосфере азота в течение 16 часов с получением 2 HCl соли указанного в заголовке соединения (221,1 г, 351 ммоль, чистота 92,2%) в виде светло–желтого твердого вещества. ВЭЖХ Метод B время удерживания 23,41 мин.

Получение 6: 5–этил–2–фтор–4–(3–(4,5,6,7–тетрагидро–1 H –имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол

В 1–л колбу добавляли 5–бензил–2–(6–(4–(бензилокси)–2–этил–5–фторфенил)–1H–индазол–3–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин, 2 HCl (40 г, 63,4 ммоль) в виде суспензии в этаноле (348 мл) и 1,25 M HCl в MeOH (101 мл) и воде (17,14 мл). Реакционную смесь дегазировали азотом в течение 5 минут и добавляли 10% масс. Pd/C, 50% масс. H₂O (4,05 г, 1,903 ммоль). Реактор герметично закрывали, продували H₂, повышали давление до 1–2 ф/дюйм²(0,07–0,14 кг/см²). Нагревали до 50°C и реакционную смесь перемешивали в течение ночи и фильтровали через Целит. Реактор и фильтр промывали метанолом (100 мл).

Отфильтрованный раствор объединяли с продуктом второй партии в масштабе 98 ммоль и концентрировали до 390 г. Медленно добавляли EtOAc (2,04 л) при перемешивании и затем раствор охлаждали до 5°C при перемешивании. Твердые вещества фильтровали, промывали при помощи EtOAc (510 мл) и сушили в течение ночи при 45°C в атмосфере азота с получением 2 HCl соли указанного в заголовке соединения (58 г, выход 80%) в виде не совсем белого твердого вещества. ВЭЖХ Метод B время удерживания 12,83 мин.

Пример 1: Кристаллический гидрат 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1 H –имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1 H –индазол–6–ил)фенола

В 3–л колбу добавляли NMP (239 мл) и 5–этил–2–фтор–4–(3–(4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол, 2 HCl (74,5 г, 165 ммоль) при перемешивании с последующим добавлением NMP (74 мл). Добавляли уксусную кислоту (31,3 мл) и реакционную смесь нагревали до 55°C в течение 10 минут и затем охлаждали до 25°C. Добавляли 1–метилпиперидин–4–он (61,0 мл, 496 ммоль) одной порцией и реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 30 минут и охлаждали до 15°C. Добавляли триацетоксиборогидрид натрия (98 г, 463 ммоль) и устанавливали температуру рубашки 20°C через 5 минут. Через 3 часа добавляли по каплям гидроксид аммония (365 мл, 5790 ммоль) в течение 45 минут, поддерживая температуру ниже 25°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 часа при 20°C, образовывалась не совсем белая суспензия. Добавляли метанол (709 мл) и реакционную смесь медленно перемешивали в течение ночи при 55°C. Добавляли воду (1,19 л) в течение 30 минут при 55°C и смесь охлаждали до 10°C, перемешивали в течение 2 часов и фильтровали. Лепешку промывали смесью 1:1 MeOH:вода (334 мл), сушили на фильтре в течение 20 минут и при 45°C в вакууме при продувке азотом с получением желтого твердого вещества (87 г).

К твердому веществу добавляли смесь 5% воды/ацетон (1,5 л) при 55°C при медленном перемешивании и реакционную смесь нагревали при 55°C в течение 6 часов, охлаждали до 10°C, фильтровали и промывали смесью 5% воды/ацетон (450 мл). Твердые вещества сушили в течение ночи при 50°C в вакууме при продувке азотом, уравновешивали на воздухе в течение 20 часов, сушили в вакуумной печи в течение 48 часов и уравновешивали на воздухе с получением указанного в заголовке соединения (71,3 г, выход 91%) в виде свободнотекучего бледно–желтого твердого вещества. ВЭЖХ Метод B Время удерживания 12,29 мин.

Пример 2: Рентгеновская порошковая дифракция

Рентгеновскую порошковую дифрактограмму (PXRD) продукта Примера 1 получали с использованием рентгеновского дифрактометра Bruker D8–Advance с Cu–Kα излучением (λ = 1,54051 Å), напряжением на выходе 45 кВ и током 40 мА. Устройство работало в геометрии Брэгга–Бретано с входной щелью, щелью расходимости и щелью рассеивания, установленных для максимизации интенсивности на образце. Для измерения небольшое количество порошка (5–25 мг) осторожно спрессовывали на держателе образца с получением ровной поверхности и подвергали рентгеновскому облучению. Образцы сканировали в режиме 2Ɵ–2Ɵ от 2° до 40° в 2Ɵ с размером шага 0,02° и скоростью сканирования 0,30° секунд на шаг. Сбор данных контролировали с использованием программы измерений Bruker DiffracSuite и анализировали с использованием программы Jade (версия 7.5.1). Устройство калибровали с использованием корундового стандарта, в пределах ±0,02° угла два–тета. Наблюдаемые положения пиков PXRD два–тета и межатомные расстояния показаны в Таблице 1.

Таблица 1 PXRD данные для кристаллического гидрата
2–Тета	d(Å)	Площадь	A%
6,20	14,24	81639	45,70
9,58	9,22	178629	100,00
10,34	8,55	30022	16,80
10,65	8,30	12801	7,20
11,54	7,66	27220	15,20
12,77	6,93	27705	15,50
13,01	6,80	48785	27,30
13,39	6,61	9261	5,20
16,94	5,23	40031	22,40
17,53	5,05	83718	46,90
18,67	4,75	9542	5,30
19,28	4,60	152922	85,60
20,02	4,43	22391	12,50
20,61	4,31	30308	17,00
21,51	4,13	92875	52,00
22,10	4,02	37495	21,00
22,79	3,90	13802	7,70
23,22	3,83	12117	6,80
25,16	3,54	13792	7,70
28,80	3,10	14487	8,10
29,62	3,01	14810	8,30
30,20	2,96	9709	5,40

Биологические анализы

5–Этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол (соединение 1) был охарактеризован в следующих биологических анализах.

Анализ 1: Биохимические анализы JAK киназ

Панель из четырех LanthaScreen биохимических анализов JAK (JAK1, 2, 3 и Tyk2) осуществляли в обычном буфере для киназной реакции (50 мМ HEPES, pH 7,5, 0,01% Brij–35, 10 мМ MgCl₂ и 1 мМ EGTA). Рекомбинантные GST–меченные JAK ферменты и GFP–меченный STAT1 пептидный субстрат получали от Life Technologies.

Серийно разведенное соединение предварительно инкубировали с каждым из четырех JAK ферментов и субстратом в белых 384–луночных микропланшетах (Corning) при температуре окружающей среды в течение 1 часа. Затем добавляли АТФ для инициирования киназных реакций в общем объеме 10 мкл, с 1% DMSO. Конечные концентрации ферментов для JAK1, 2, 3 и Tyk2 составляли 4,2 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ и 0,25 нМ, соответственно; соответствующие используемые Km АТФ концентрации составляли 25 мкМ, 3 мкМ, 1,6 мкМ и 10 мкМ; при этом концентрация субстрата составляла 200 нМ для всех четырех анализов. Киназным реакциям давали осуществиться в течение 1 часа при температуре окружающей среды, затем добавляли 10 мкл препарата EDTA (конечная концентрация 10 мМ) и Tb–анти–pSTAT1 (pTyr701) антитело (Life Technologies, 2 нМ конечная концентрация) в TR–FRET буфере для разведения (Life Technologies). Планшеты оставляли для инкубации при температуре окружающей среды в течение 1 часа, затем считывали на планшет–ридере EnVision (Perkin Elmer). Сигналы эмиссии (520нм/495нм) регистрировали и использовали для расчета процента ингибирования на основании DMSO и фоновых контролей.

Для анализа доза–ответ проценты ингибирования наносили на график против концентраций соединения и IC₅₀ значения определяли из 4–параметрической робастной модели подгонки с использованием программы Prism (GraphPad Software). Результаты выражали как pIC₅₀ (отрицательный логарифм IC₅₀) и затем преобразовывали в pK_i (отрицательный логарифм константы диссоциации, Ki) с использованием уравнения Ченга–Прусоффа.

Соединение по изобретению показало следующую активность в отношении ферментов.

Таблица 2
JAK 1 pK i	JAK 2 pK i	JAK 3 pK i	Tyk2 pK i
10,2	10,8	9,7	9,8

Анализ 2: Клеточный анализ активности в отношении JAK: Ингибирование IL–13

AlphaScreen клеточный анализ активности в отношении JAKI осуществляли путем измерения интерлейкин–13 (IL–13, R&D Systems)–индуцированного фосфорилирования STAT6 в эпителиальных клетках легкого человека BEAS–2B (ATCC). Анти–STAT6 антитело (Cell Signaling Technologies) конъюгировали с AlphaScreen акцепторными шариками (Perkin Elmer), тогда как анти–pSTAT6 (pTyr641) антитело (Cell Signaling Technologies) биотинилировали с использованием Сульфо–NHS–Биотина EZ–Link (Thermo Scientific).

BEAS–2B клетки выращивали при 37°C в 5% CO₂ увлажненном инкубаторе в 50% DMEM/50% F–12 среде (Life Technologies), дополненной 10% FBS (Hyclone), 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Life Technologies) и 2 мМ GlutaMAX (Life Technologies). В день 1 анализа клетки высевали при плотности 7500 клеток/лунка в белые покрытые поли–D–лизином 384–луночные планшеты (Corning) с 25 мкл среды и оставляли в инкубаторе в течение ночи для адгезии. В день 2 анализа среду удаляли и заменяли на 12 мкл аналитического буфера (сбалансированный солевой раствор Хэнкса/HBSS, 25 мМ HEPES и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумин/BSA), содержащего доза–ответы испытываемых соединений. Соединение серийно разводили в DMSO и затем снова разбавляли 1000–кратно в среде для доведения конечной концентрации DMSO до 0,1%. Клетки инкубировали с испытываемыми соединениями при 37°C в течение 1 часа и затем добавляли 12 мкл предварительно нагретого IL–13 (80 нг/мл в аналитическом буфере) для стимуляции. После инкубации при 37°C в течение 30 минут аналитический буфер (содержащий соединение и IL–13) удаляли и добавляли 10 мкл буфера для лизиса клеток (25 мМ HEPES, 0,1% SDS, 1% NP–40, 5 мМ MgCl₂, 1,3 мМ EDTA, 1 мМ EGTA и дополненный ингибиторами протеаз Complete Ultra mini и PhosSTOP от Roche Diagnostics). Планшеты встряхивали при температуре окружающей среды в течение 30 минут перед добавленим реагентов для детекции. Сначала добавляли смесь биотин–анти–pSTAT6 и анти–STAT6–конъюгированных акцепторных шариков и инкубировали при температуре окружающей среды в течение 2 часов, с последующим добавлением стрептавидин–конъюгированных донорных шариков (Perkin Elmer). После минимум 2 часов инкубации аналитические планшеты считывали на планшет–ридере EnVision. Сигналы люминесценции AlphaScreen регистрировали и использовали для расчета процента ингибирования на основании DMSO и фоновых контролей.

Для анализа доза–ответ процент ингибирования наносили на график против концентраций соединения и определяли IC₅₀ значения из 4–параметрической робастной модели подгонки с использованием программы Prism. Результаты также могут быть выражены как отрицательный логарифм IC₅₀ значения, pIC₅₀. В этом анализе соединение по изобретению показало pIC₅₀ значение 8,2.

Анализ 3: Клеточный анализ активности в отношении JAK: Ингибирование IL–2/анти–CD3–стимулированного IFNγ в человеческих PBMC

Активность испытываемого соединения для ингибирования интерлейкин–2 (IL–2)/анти–CD3–стимулированного интерферона гамма (IFNγ) измеряли в мононуклеарных клетках периферической крови человека (PBMC), выделенных из человеческой цельной крови (Stanford Blood Center). Поскольку IL–2 передает сигналы через JAK, этот анализ обеспечивает определение активности в отношении JAK в клетках.

(1) Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) выделяли из человеческой цельной крови здоровых доноров с использованием градиента фиколла. Клетки культивировали в 37°C, 5% CO₂ увлажненном инкубаторе в RPMI (Life Technologies), дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS, Life Technologies), 2 мМ Glutamax (Life Technologies), 25 мМ HEPES (Life Technologies) и 1X пенициллина/стрептомицина (Life Technologies). Клетки высевали при плотности 200000 клеток/лунка в среду (50 мкл) и культивировали в течение 1 часа. Соединение серийно разводили в DMSO и затем снова разбавляли 500–кратно (до 2x конечной анализируемой концентрации) в среде. Испытываемые соединения (100 мкл/лунка) добавляли к клеткам и инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 1 часа с последующим добавлением IL–2 (R&D Systems; конечная концентрация 100 нг/мл) и анти–CD3 (BD Biosciences; конечная концентрация 1 мкг/мл) в предварительно нагретой среде для количественного определения (50 мкл) в течение 24 часов.

(2) После стимуляции цитокинами клетки центрифугировали при 500 g в течение 5 минут и супернатанты удаляли и замораживали при –80°C. Для определения ингибиторной активности испытываемых соединений в ответ на IL–2/анти–CD3 измеряли концентрации IFNγ в супернатанте методом ELISA (R&D Systems). IC₅₀ значения определяли из анализа кривых ингибирования, представляющих концентрацию IFNγ против концентрации соединения. Данные выражены как pIC₅₀ (отрицательный десятичный логарифм IC₅₀) значения. В этом анализе соединение по изобретению показало pIC₅₀ значение около 7,3.

Анализ 4: Клеточный анализ активности в отношении JAK: Ингибирование IL–2–стимулированного pSTAT5 в CD4+ T–клетках

Активность испытываемого соединения для ингибирования интерлейкин–2 (IL–2)/анти–CD3–стимулированного фосфорилирования STAT5 измеряли в CD4–положительных (CD4+) T–клетках в мононуклеарных клетках периферической крови человека (PBMC), выделенных из человеческой цельной крови (Stanford Blood Center), с использованием проточной цитометрии. Поскольку IL–2 передает сигналы через JAK, этот анализ обеспечивает определение активности в отношении JAK в клетках.

CD4+ T–клетки идентифицировали с использованием фикоэритробилин (PE)–конъюгированного анти–CD4 антитела (Клон RPA–T4, BD Biosciences), тогда как Alexa Fluor 647–конъюгированное анти–pSTAT5 антитело (pY694, Клон 47, BD Biosciences) использовали для детекции фосфорилирования STAT5.

(1) Следовали протоколу Анализа 3, параграф (1), за исключением того, что стимуляцию цитокином с анти–CD3 осуществляли в течение 30 минут вместо 24 часов.

(2) После стимуляции цитокинами клетки фиксировали предварительно нагретым фиксирующим раствором (200 мкл; BD Biosciences) в течение 10 минут при 37°C, 5% CO₂, промывали два раза DPBS буфером (1 мл, Life Technologies) и ресуспендировали в ледяном Perm Буфере III (1000 мкл, BD Biosciences) в течение 30 минут при 4°C. Клетки промывали два раза 2% FBS в DPBS (FACS буфер) и затем ресуспендировали в FACS буфере (100 мкл), содержащем анти–CD4 PE (1:50 разведение) и анти–CD3 анти–CD3Alexa Fluor 647 (1:5 разведение), в течение 60 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации клетки промывали два раза в FACS буфере, затем анализировали с использованием проточного цитометра LSRII (BD Biosciences). Для определения ингибиторной активности испытываемого соединения в ответ на IL–2/анти–CD3 измеряли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) pSTAT5 в CD4+ T–клетках. IC₅₀ значения определяли из анализа кривых ингибирования, представляющих MFI против концентрации соединения. Данные выражены как pIC₅₀ (отрицательный десятичный логарифм IC₅₀) значения. В этом анализе соединение по изобретению показало pIC₅₀ значение около 7,7.

Анализ 5: Клеточный анализ активности в отношении JAK: Ингибирование IL–4–стимулированного pSTAT6 в CD3+ T клетках

Эффективность ингибирования испытываемым соединением интерлейкин–4(IL–4)–стимулированного фосфорилирования STAT6 измеряли в CD3–положительных (CD3+) Т–клетках мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС), выделенных из цельной крови человека (Stanford Blood Center), с использованием проточной цитометрии. Поскольку IL–4 передает сигналы через JAK, этот анализ обеспечивает показатель эффективности в клетках в отношении JAK.

CD3+ T–клетки идентифицировали, используя конъюгированное с фикоэритробилином (PE) анти–CD3 антитело (Клон UCHT1, BD Biosciences), при этом конъюгированное с Alexa Fluor 647 анти–pSTAT6 антитело (pY641, Клон 18/P, BD Biosciences) использовали для детекции фосфорилирования STAT6.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) выделяли из цельной крови человека здоровых доноров, как в Анализах 3 и 4. Клетки высевали при 250000 клеток/лунка в среду (200 мкл) и культивировали в течение 1 часа и затем ресуспендировали в среде для анализа (50 мкл) (RPMI, дополненная 0,1% бычьим сывороточным альбумином (Sigma), 2мМ Glutamax, 25мМ HEPES и 1X Penstrep), содержащей различные концентрации испытываемых соединений. Соединения серийно разводили в DMSO и затем еще 500–кратно разводили (до конечной анализируемой концентрации 2x) в среде для анализа. Испытываемые соединения (50 мкл) инкубировали с клетками при 37°C, 5% CO₂ в течение 1 часа, с последующим добавлением IL–4 (50 мкл) (R&D Systems; конечная концентрация 20 нг/мл) в предварительно нагретой среде для анализа в течение 30 мин. После стимуляции цитокинами клетки фиксировали предварительно нагретым фиксирующим раствором (100 мкл) (BD Biosciences) в течение 10 минут при 37°C, 5% CO₂, дважды промывали FACS буфером (1 мл) (2% FBS в DPBS) и ресуспендировали в охлажденном льдом Perm Буфере III (1000 мкл) (BD Biosciences) в течение 30 минут при 4°C. Клетки дважды промывали FACS буфером и затем ресуспендировали в FACS буфере (100 мкл), содержащем анти–CD3 PE (1:50 разведение) и анти–pSTAT6 Alexa Fluor 647 (1:5 разведение), в течение 60 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации клетки дважды промывали в FACS буфере перед анализом с использованием проточного цитометра LSRII (BD Biosciences).

Для определения ингибирующей активности испытываемого соединения в ответ на IL–4, среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) pSTAT6 измеряли в CD3+ T–клетках. Значения IC₅₀ определяли из анализа кривых ингибирования, представляющих MFI против концентрации соединения. Данные выражены в виде значений pIC₅₀ (отрицательный десятичный логарифм IC₅₀). В этом анализе соединение по изобретению показало pIC₅₀ значение 8,1.

Анализ 6: Клеточный анализ активности в отношении JAK: ингибирование IL–6–стимулированного pSTAT3 в CD3+ T–клетках

Использовали протокол, аналогичный протоколу Анализа 5, для определения эффективности ингибирования испытываемым соединением интерлейкин–6(IL–6)–стимулированного фосфорилирования STAT3. Конъюгированное с Alexa Fluor 647 анти–pSTAT3 антитело (pY705, Клон 4/P, BD Biosciences) использовали для детекции фосфорилирования STAT3.

В этом анализе соединение по изобретению показало pIC₅₀ значение 7,4.

Анализ 7: Клеточный анализ активности в отношении JAK: Ингибирование IFNγ–индуцированного pSTAT1

Активность испытываемого соединения для ингибирования интерферон гамма (IFNγ)–стимулированного фосфорилирования STAT1 измеряли в CD14–положительных (CD14+) моноцитах, выделенных из человеческой цельной крови (Stanford Blood Center), с использованием проточной цитометрии. Поскольку IFNγ передает сигналы через JAK, этот анализ обеспечивает определение активности в отношении JAK в клетках.

Моноциты идентифицировали с использованием флуоресцеинизотиоцианат (FITC)–конъюгированного анти–CD14 антитела (Клон RM052, Beckman Coulter), а Alexa Fluor 647–конъюгированное анти–pSTAT1 антитело (pY701, Клон 4a, BD Biosciences) использовали для детекции фосфорилирования STAT1.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) выделяли из человеческой цельной крови здоровых доноров с использованием градиента фиколла. Клетки культивировали в 37°C, 5% CO₂ увлажненном инкубаторе в RPMI (Life Technologies), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Life Technologies), 2 мМ Glutamax (Life Technologies), 25 мМ HEPES (Life Technologies) и 1X пенициллина/стрептомицина (Life Technologies). Клетки высевали при плотности 250000 клеток/лунка в среду (200 мкл), культивировали в течение 2 часов и ресуспендировали в среде для количественного определения (50 мкл) (RPMI, дополненной 0,1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma), 2 мМ Glutamax, 25 мМ HEPES и 1X пенициллина/стрептомицина), содержащей различные концентрации испытываемых соединений. Соединение серийно разводили в DMSO и затем снова разбавляли 1000–кратно в среде для доведения конечной концентрации DMSO до 0,1%. Разведения испытываемого соединения инкубировали с клетками при 37°C, 5% CO₂, в течение 1 часа с последующим добавлением предварительно нагретого IFNγ (R&D Systems) в среде (50 мкл) при конечной концентрации 0,6 нг/мл в течение 30 минут. После стимуляции цитокинами клетки фиксировали предварительно нагретым фиксирующим раствором (100 мкл) (BD Biosciences) в течение 10 минут при 37°C, 5% CO₂, промывали два раза FACS буфером (1 мл) (1% BSA в PBS), ресуспендировали в смеси 1:10 анти–CD14 FITC:FACS буфер (100 мкл) и инкубировали при 4°C в течение 15 минут. Клетки промывали один раз и затем ресуспендировали в ледяном Perm Буфере III (BD Biosciences) (100 мкл) в течение 30 минут при 4°C. Клетки промывали два раза FACS буфером и затем ресуспендировали в смеси 1:10 анти–pSTAT1 Alexa Fluor 647:FACS буфер (100 мкл) в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, промывали два раза в FACS буфере и анализировали с использованием проточного цитометра LSRII (BD Biosciences).

Для определения ингибиторной активности испытываемого соединения среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) pSTAT1 измеряли в CD14+ моноцитах. IC₅₀ значения определяли из анализа кривых ингибирования, представляющих MFI против концентрации соединения. Данные выражены как pIC₅₀ (отрицательный десятичный логарифм IC₅₀) значения. В этом анализе соединение по изобретению показало pIC₅₀ значение около 7,5.

Анализ 8: Фармакокинетика в глазной ткани кролика

Целью этого анализа было определение фармакокинетики испытываемого соединения в глазных тканях кролика.

Композиция раствора

Соединение по изобретению 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол (1) растворяли либо в 10% растворе 2–гидроксипропил–β–циклодекстрина до достижения целевой концентрации 4 мг/мл, либо в очищенной воде до достижения целевой концентрации 1 мг/мл. Билатеральную интравитреальную инъекцию (50 мкл/глаз) раствора испытываемого соединения вводили новозеландским белым кроликам в двух дозовых группах, 200 мкг/глах и 50 мкг/глаз, соответственно, для композиций в циклодекстрине и воде, соответственно. Концентрацию испытываемого соединения измеряли в глазных тканях: стекловидном теле, внутриглазной жидкости, сетчатке/сосудистой оболочке и иридо–цилиарной зоне в заранее определенных точках времени после инъекции (30 минут, 4 ч, 1 д, 3 д, 7 д, 14 д). Введение осуществляли двум кроликам (четыре глаза) для каждой временной точки. В ткани стекловидного тела соединение 1 показало двухфазное снижение концентрации, характеризующееся начальным снижением концентрации с периодом полужизни примерно 12 часов и в завершение с конечным периодом полужизни примерно 3,6 дня. Было обнаружено, что соединение также быстро распределяется в сетчатке и в сосудистой оболочке и показывает такой же фармакокинетический профиль, как в ткани стекловидного тела.

Композиция суспензии

Композицию суспензии получали путем объединения соединения 1 Примера 1 с раствором 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC E5) + 0,02% Tween 80 до достижения целевой концентрации 10 мг/мл. Билатеральную интравитреальную инъекцию (50 мкл/глаз) суспензии испытываемого соединения вводили новозеландским белым кроликам (500 мкг/глаз). Концентрацию испытываемого соединения измеряли в глазных тканях, как в анализе композиции суспензии, через 30 минут, 2 недели, 4 недели, 6 недель и 8 недель после инъекции. Соединение показало линейное снижение концентрации лекарственного средства в ткани стекловидного тела от 30 минут до 6 недель при скорости выведения лекарственного средства из организма примерно 3 мкг/мл/день. Такие свойства соответствуют растворимости соединения 1 в носителе и фармакокинетике в глазных тканях при использовании композиции раствора. Измеряли концентрацию лекарственного средства в плазме, и было найдено, что она по меньшей мере на 3 порядка величины ниже, чем концентрация в ткани стекловидного тела.

Анализ 9: Фармакодинамический анализ: Ингибирование IL6–индуцированного pSTAT3 у крыс

Способность испытываемого соединения при разовом интравитреальном введении ингибировать IL–6–индуцированный pSTAT3 измеряли в гомогенатах сетчатки/сосудистой оболочки крыс.

Композиции суспензии получали путем объединения кристаллического соединения 1 Примера 1 с 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC E5 LV), 0,02% Tween 80 и 0,9% хлорида натрия в очищенной воде до достижения целевой концентрации 3 мг/мл и 10 мг/мл.

Самкам крыс Lewis интравитреально (и/в) вводили (5 мкл/глаз) композицию суспензии или носитель лекарственного средства. Через три дня интравитреально вводили IL–6 (Peprotech; 0,1 мг/мл; 5 мкл/глаз) или носитель для индукции pSTAT3. Глазные ткани иссекали через один час после второй и/в инъекции IL–6. Ткани сетчатки/сосудистой оболочки гомогенизировали и уровни pSTAT3 измеряли с использованием ELISA (Cell Signaling Technology). Процент ингибирования IL–6–индуцированного pSTAT3 рассчитывали по сравнению с группами носитель/носитель и носитель/IL–6. Ингибирование больше чем 100% отражает снижение уровней pSTAT3 до ниже тех, которые наблюдали в группе носитель/носитель.

При предварительном лечении за 3 дня до IL–6–стимуляции доза 15 мкг и 50 мкг соединения по изобретению, вводимая с использованием композиции суспензии, ингибировала IL–6–индуцированный pSTAT3 на 33% и 109%, соответственно, в ткани сетчатки/сосудистой оболочки.

Анализ 10: Фармакодинамический анализ: Ингибирование IFNγ–индуцированного IP–10 у кроликов

Способность испытываемого соединения при разовом интравитреальном введении ингибировать уровни интерферон–гамма (IFNγ)–индуцированного IP–10 белка измеряли в стекловидном теле и тканях сетчатки/сосудистой оболочки кролика.

Композиции растворов при концентрациях 1 мг/мл и 4 мг/мл соединения 1 Примера 1 получали как в Анализе 8. Композицию суспензии получали путем объединения кристаллического соединения 1 Примера 1 с раствором 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC E5), 0,02% Tween 80 и 9 мг/мл хлорида натрия в очищенной воде до достижения целевой концентрации 20 мг/мл.

Для исследований использовали самцов новозеландских белых кроликов (Liveon Biolabs, India). Животным давали акклиматизироваться после их доставки в лабораторию для проведения исследований (Jubilant Biosys Ltd., India). Каждому кролику делали две интравитреальные (и/в) инъекции с общим объемом дозы 50 мкл/глаз. Первая и/в инъекция (45 мкл/глаз) обеспечила доставку испытываемого соединения или носителя в определенной временной точке (т.е. 24 часа для композиций растворов или 1 неделя для композиции суспензии). Вторая и/в инъекция (5 мкл/глаз) обеспечила доставку IFNγ (1 мкг/глаз; исходный раствор 1 мг/мл; Kingfisher Biotech) или носителя для индукции IP–10. Вкратце, в день введения инъекций кроликов анестезировали внутримышечной инъекцией кетамина (35 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг). При достижении глубокой анестезии каждый глаз промывали стерильным физиологическим раствором и вводили и/в инъекции с использованием 0,5 мл инсулинового шприца (50 единиц=0,5 мл) с иглой 31 калибра на надназальной стороне обоих глаз, отмечая положение при помощи фиксированного штангенциркуля Браунштейна (2 3/4”) на расстоянии 3,5 мм от прямой мышцы и 4 мм от лимба.

Ткани собирали через 24 часа после второй и/в инъекции IFNγ. Ткани стекловидного тела (VH) и ткани сетчатки/сосудистой оболочки (R/C) собирали и гомогенизировали, и уровни белка IP–10 измеряли с использованием набора CXCL10 (IP–10) ELISA для кролика (Kingfisher Biotech). Процент ингибирования IFNγ–индуцированного IP–10 рассчитывали по сравнению с группами носитель/носитель и носитель/IFNγ.

При предварительном лечении за 24 часа до IFNγ–стимуляции композиция раствора, включающая 45 мкг соединения 1, ингибировала IFNγ–индуцированный IP–10 на 70% и 86% в стекловидном теле и тканях сетчатки/сосудистой оболочки, соответственно, тогда как композиция, включающая 180 мкг соединения, ингибировала IFNγ–индуцированный IP–10 на 91% и 100% в стекловидном теле и тканях сетчатки/сосудистой оболочки, соответственно.

При предварительном лечении за 1 неделю до IFNγ–стимуляции композиция в форме кристаллической суспензии соединения 1 ингибировала IFNγ–индуцированный IP–10 на 100% как в стекловидном теле, так и в тканях сетчатки/сосудистой оболочки.

Анализ 11: Фармакокинетика в плазме и легких у мышей

Уровни испытываемого соединения в плазме и легких и их соотношения определяли следующим образом. В анализе использовали мышей BALB/c от Charles River Laboratories. Испытываемые соединения отдельно формулировали в 20% растворе пропиленгликоля в pH 4 цитратном буфере при концентрации 0,2 мг/мл и 50 мкл раствора вводили в трахею мыши путем оральной аспирации. В различных временных точках (типично 0,167, 2, 6, 24ч) после введения дозы брали образцы крови путем сердечной пункции и у мышей вырезали интактные легкие. Образцы крови центрифугировали (центрифуга Эппендорфа, 5804R) в течение 4 минут при приблизительно 12000 об/мин при 4°C для сбора плазмы. Легкие сушили, промакивая тампоном, взвешивали и гомогенизировали при разведении 1:3 в стерильной воде. Уровни испытываемого соединения в плазме и легких определяли анализом ЖХ–МС против аналитических стандартов, построенных в виде стандартной кривой в тестируемой матрице. Отношение легкие:плазма определяли как отношение AUC в мкг*ч/г в легких к AUC мкг*ч/мл в плазме, где AUC обычно определяют как площадь под кривой концентрации испытываемого соединения в зависимости от времени.

Соединение по изобретению показало экспозицию в легких мыши примерно в 55 раз больше, чем экспозиция в плазме.

Анализ 12: Мышиная (мышь) модель IL–13–индуцированной индукции pSTAT6 в ткани легкого

IL–13 является важным цитокином, лежащим в основе патофизиологии астмы (Kudlacz et al. Eur. J. Pharmacol, 2008, 582,154–161). IL–13 связывается с рецепторами клеточной поверхности, активируя членов семейства Janus киназ (JAK), которые затем фосфорилируют STAT6, и затем активирует дальнейшие пути транскрипции. В описанной модели дозу IL–13 доставляли локально в легкие мышей для индукции фосфорилирования STAT6 (pSTAT6), которое затем измеряли в качестве конечной точки.

В анализе использовали взрослых мышей balb/c от Harlan. В день исследования животных слегка анестезировали изофлураном и вводили либо носитель, либо испытываемое соединение (0,5 мг/мл, общий объем 50 мкл за несколько вдохов) посредством оральной аспирации. Животных помещали в боковое лежачее положение после введения дозы и проверяли на полное восстановление после анестезии перед возвращением в их клетку. Через четыре часа животных снова ненадолго анестезировали и вводили либо носитель, либо IL–13 (общая доставленная доза 0,03 мкг, общий объем 50 мкл) посредством оральной аспирации, а затем проверяли на восстановление от анестезии и возвращали в их клетки. Через один час после введения носителя или IL–13 легкие собирали для определения pSTAT6 с использованием анти–pSTAT6 ELISA (кроличье mAb иммобилизованное/покрывающее антитело; мышиное mAb детекторное/репортерное антитело: анти–pSTAT6–pY641; вторичное антитело: анти–мышиное IgG–HRP) и анализировали на общую концентрацию лекарственного средства, как описано выше в Анализе 11.

Об активности в модели свидетельствует снижение уровня pSTAT6, присутствующего в легких обработанных животных через 5 часов, по сравнению с обработанными носителем IL–13–индуцированными контрольными животными. Разница между контрольными животными, которые были обработаны носителем и IL–13–индуцированы, и контрольными животными, которые были обработаны носителем и индуцированы носителем, определяла ингибирующий эффект 0% и 100%, соответственно, в любом данном эксперименте. Соединение по изобретению показало примерно 60% ингибирование фосфорилирования STAT6 через 4 часа после IL–13 индукции.

Анализ 13: Мышиная модель Alternaria alternata –индуцированного эозинофильного воспаления легких

Эозинофилия дыхательных путей является отличительным признаком астмы человека. Alternaria alternata является грибковым аэроаллергеном, который может усугублять астму у людей и вызывать эозинофильное воспаление в легких мышей (Havaux et al. Clin Exp Immunol. 2005; 139(2):179–88). На мышах было продемонстрировано, что альтернария опосредованно активирует присутствующие в ткани легких врожденные лимфоидные клетки типа 2, которые отвечают на (например, IL–2 и IL–7) и высвобождают JAK–зависимые цитокины (например, IL–5 и IL–13) и координируют эозинофильное воспаление (Bartemes et al. J Immunol. 2012; 188(3):1503–13).

В исследовании использовали самцов мышей C57 в возрасте от семи до девяти недель от Taconic. В день исследования животных слегка анестезировали изофлураном и вводили либо носитель, либо испытываемое соединение (0,1–1,0 мг/мл, общий объем 50 мкл за несколько вдохов) посредством орофарингеальной аспирации. Животных помещали в боковое лежачее положение после введения дозы и проверяли на полное восстановление от анестезии перед их возвращением в клетку. Через один час животных снова ненадолго анестезировали и индуцировали либо носителем, либо экстрактом альтернарии (общее количество доставленного экстракта 200 мкг, общий объем 50 мкл) посредством орофарингеальной аспирации, а затем проверяли на полное восстановление от анестезии и возвращали в их клетки. Через сорок восемь часов после введения альтернарии собирали жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF) и подсчитывали эозинофилы в BALF с использованием гематологической системы Advia 120 (Siemens).

Активность в модели подтверждается снижением уровня эозинофилов, присутствующих в BALF обработанных животных через сорок восемь часов, по сравнению с обработанными носителем, зараженными альтернарией контрольными животными. Данные выражены как процент ингибирования ответа обработанных носителем альтернария–индуцированных эозинофилов в BALF. Для расчета процента ингибирования количество эозинофилов в BALF для каждого состояния преобразуют в процент от среднего числа обработанных носителем альтернария–индуцированных эозинофилов в BALF и вычитают из ста процентов. Соединение по изобретению показало примерно 88% ингибирование количества эозинофилов в BALF через сорок восемь часов после заражения альтернарией.

Анализ 14: Мышиная модель LPS/G–CSF/IL–6/IFNγ коктейль–индуцированного нейтрофильного воспаления дыхательных путей модели легких

Нейтрофилия дыхательных путей является отличительным признаком ряда респираторных заболеваний человека. Соединение 1 испытывали в модели нейтрофильного воспаления дыхательных путей с использованием LPS/G–CSF/IL–6/IFNγ коктейля для индукции нейтрофилии дыхательных путей.

В анализе использовали семи–девятинедельных мышей Balb/C (дикого типа) от Jackson Laboratory. В день исследования животных слегка анестезировали изофлураном и вводили либо носитель, либо испытываемое соединение (1,0 мг/мл, общий объем 50 мкл за несколько вдохов) посредством орофаригеальной аспирации. Животных помещали в боковое лежачее положение после введения дозы и проверяли на полное восстановление после анестезии перед возвращением в их клетку. Через один час животных снова ненадолго анестезировали и вводили либо носитель, либо LPS; 0,01 мг/кг/G–CSF; 5 мкг/IL–6; 5 мкг/IFNγ; 5 мкг (общий объем 100 мл) посредством орофаригеальной аспирации (OA). Через двадцать четыре часа после введения LPS/G–CSF/IL–6/IFNγ коктейля собирали жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF) и подсчитывали количество нейтрофилов.

После OA обработки соединением 1 наблюдали статистически значимое уменьшение нейтрофилов в дыхательных путях (84% по сравнению с мышами, обработанными носителем), указывающее на то, что блокада JAK–зависимой передачи сигналов имеет эффекты на нейтрофильное воспаление дыхательных путей.

Анализ 15: Ингибирование IFNγ– и IL–27 индуцированных хемокинов CXCL9 и CXCL10 в 3D культурах ткани дыхательных путей человека

Тканевые культуры эпителия дыхательных путей получали от Mattek (AIR–100). Культуры были получены от астматических доноров. Во вставке для культивирования клеток человеческие эпителиальные клетки трахеи/бронхов выращивали и дифференцировали на подложке из пористой мембраны, обеспечивая границу раздела воздушной и жидкой среды с нагретой культуральной средой ниже клеток и газообразной атмосферой испытания выше. Ткани культивировали в поддерживающей среде (Mattek, AIR–100–MM) в 37°С, 5% СО₂ увлажненном инкубаторе. Были протестированы четыре донора. В день 0 культуры тканей обрабатывали испытываемыми соединениями при 10 мкМ, 1 мкМ и/или 0,1 мкМ. Соединения разбавляли в диметилсульфоксиде (DMSO, Sigma) до конечной концентрации 0,1%. DMSO при концентрации 0,1% использовали в качестве контроля. Испытываемые соединения инкубировали с культурами в течение 1 часа при 37°C, 5% CO₂, с последующим добавлением предварительно нагретой среды, содержащей IFNγ (R&D Systems) или IL–27 (R&D Systems) в конечной концентрации при 100 нг/мл. Тканевые культуры поддерживали в течение 8 дней. Среду заменяли каждые 2 дня свежей средой, содержащей соединения и IFNγ или IL–27. В день 8 культуры тканей и супернатанты собирали для анализа. Образцы супернатантов анализировали на CXCL10 (IP–10) и CXCL9 (MIG) с использованием luminex анализа (EMD Millipore). Данные выражены как % ингибирования +/– стандартное отклонение (± STDV). Процент ингибирования определяли на основании ингибирующей активности соединения против IFNγ–или IL–27–индуцированной секреции CXCL10 или CXCL9 по сравнению с клетками, обработанными носителем. Данные представляют собой среднее значение от 3 или 4 доноров. Соединение 1 было способно ингибировать IFNγ–индуцированную секрецию CXCL10 на 99%±2,0 (при 10мкМ), 71%±19 (при мкМ) и 17%±12 (при 0,1мкМ) при сравнении с носителем, используемым в качестве контроля. Соединение 1 было способно ингибировать IFNγ–индуцированную секрецию CXCL9 на 100%±0,3 (при 10мкМ), 99%±0,9 (при 1мкМ) и 74%±17 (при 0,1мкМ) при сравнении с носителем. Соединение 1 было способно ингибировать IL–27–индуцированную секрецию CXCL10 на 108%±11 (при 10мкМ), 98%±10 (при 1мкМ) и 73%±8,5 (при 0,1мкМ) при сравнении с носителем, используемым в качестве контроля. Соединение 1 было способно ингибировать IL–27–индуцированную секрецию CXCL9 на 100%±0 (при 10мкМ), 95%±3,7 (при 1мкМ) и 75%±3,5 (при 0,1мкМ) при сравнении с носителем, используемым в качестве контроля.

Анализ 16: Анализ IL–5–опосредованного выживания эозинофилов

Активность испытываемого соединения в отношении IL–5–опосредованного выживания эозинофилов измеряли в эозинофилах человека, выделенных из цельной крови человека (AllCells). Поскольку IL–5 передает сигналы через JAK, этот анализ обеспечивает измерение активности в клетках в отношении JAK.

Эозинофилы человека выделяли из свежей цельной крови человека (AllCells) от здоровых доноров. Кровь смешивали с 4,5% декстраном (Sigma–Aldrich) в 0,9% растворе хлорида натрия (Sigma–Aldrich). Эритроциты оставляли для осаждения в течение 35 минут. Верхний слой, богатый лейкоцитами, отделяли и наслаивали на Ficoll–Paque (GE Healthcare) и центрифугировали при 600g в течение 30 минут. Слои плазмы и мононуклеарных клеток удаляли до того, как слой гранулоцитов лизировали водой, для удаления любых загрязняющих эритроцитов. Эозинофилы дополнительно очищали с использованием набора для выделения эозинофилов человека (Miltenyi Biotec). Фракцию очищенных эозинофилов инкубировали с анти–CD16 FITC (Miltenyi Biotec) в течение 10 минут при 4°C в темноте. Чистоту анализировали с использованием проточного цитометра LSRII (BD Biosciences).

Клетки культивировали в 37°С, 5% СО₂ увлажненном инкубаторе в RPMI 1640 (Life Technologies), дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS, Life Technologies), 2 мМ Glutamax (Life Technologies), 25 мМ HEPES (Life Technologies) и 1X Пенициллина/Стрептомицина (Life Technologies). Клетки высевали при 10000 клеток/лунка в среду (50 мкл). Планшет центрифугировали при 300 g в течение 5 минут и супернатанты удаляли. Соединения серийно разводили в DMSO, а затем еще 500–кратно разбавляли до 2х конечной анализируемой концентрации в среде. Испытываемые соединения (50 мкл/лунка) добавляли к клеткам и инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 1 часа с последующим добавлением IL–5 (R&D Systems; конечные концентрации 1 нг/мл и 10 пг/мл) в предварительно нагретой среде для анализа (50 мкл) в течение 72 часов.

После стимуляции цитокинами клетки центрифугировали при 300 g в течение 5 минут и дважды промывали холодным DPBS (Life Technologies). Для достижения жизнеспособности и апоптоза клетки инкубировали с пропидий йодидом (Thermo Fisher Scientific) и APC аннексином V (BD Biosciences) и анализировали с использованием проточного цитометра LSRII (BD Biosciences). Значения IC₅₀ определяли из анализа кривых жизнеспособности, представляющих процент жизнеспособных клеток в зависимости от концентрации соединения. Данные выражены в виде значений pIC₅₀ (отрицательный десятичный логарифм IC₅₀). Соединение 1 показало pIC₅₀ значение 7,9±0,5 в присутствии 10 пг/мл IL–5 и pIC₅₀ значение 6,5±0,2 в присутствии 1 нг/мл IL–5

Анализ 17: Фармакодинамический Анализ: Ингибирование IFNγ–индуцированного pSTAT1 в глазах кролика

Способность испытываемого соединения при разовом интравитреальном введении ингибировать интерферон–гамма (IFNγ)–индуцированное фосфорилирование STAT1 белка (pSTAT1) измеряли в ткани сетчатки/сосудистой оболочки кролика.

Композицию суспензии получали путем объединения соединения 1 Примера 1 с 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC E5), 0,02% Tween 80 и 9 мг/мл хлорида натрия в очищенной воде до достижения целевой концентрации 20 мг/мл.

Для исследований использовали самцов новозеландских белых кроликов (Liveon Biolabs, India). Животным давали акклиматизироваться после их доставки в лабораторию для проведения исследований (Jubilant Biosys Ltd., India). Каждому кролику делали две интравитреальные (и/в) инъекции с общим объемом дозы 50 мкл/глаз. Первая и/в инъекция (45 мкл/глаз) обеспечила доставку 0,9 мг испытываемого соединения или носителя. Спустя одну неделю вторая и/в инъекция (5 мкл/глаз) обеспечила доставку IFNγ (1 мкг/глаз; исходный раствор 1 мг/мл; Kingfisher Biotech) или носителя для индукции IP–10. В день введения инъекций кроликов анестезировали внутримышечной инъекцией кетамина (35 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг). При достижении глубокой анестезии каждый глаз промывали стерильным физиологическим раствором и вводили и/в инъекции с использованием 0,5 мл инсулинового шприца (50 единиц=0,5 мл) с иглой 31 калибра на надназальной стороне обоих глаз, отмечая положение при помощи фиксированного штангенциркуля Браунштейна (2 3/4”) на расстоянии 3,5 мм от прямой мышцы и 4 мм от лимба.

Ткани собирали через 2 часа после второй и/в инъекции IFNγ. Ткани сетчатки/сосудистой оболочки (R/C) собирали и гомогенизировали, и уровни белка pSTAT1 измеряли с использованием количественного вестерн–блот анализа на устройстве ProteinSimple WES. Процент ингибирования IFNγ–индуцированного pSTAT1 рассчитывали по сравнению с группами носитель/носитель и носитель/IFNγ.

При предварительном лечении за 1 неделю до IFNγ–стимуляции суспензионная композиция соединения 1 ингибировала IFNγ–индуцированный pSTAT1 на 85%.

Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные аспекты или варианты его осуществления, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что возможны различные изменения, или можно использовать заменяющие эквиваленты без отступления от сущности и объема изобретения. Кроме того, в той степени, в которой это допускается применимыми патентными законами и положениями, все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящей заявке, включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте в той же степени, как если бы каждый документ был отдельно включен в настоящую заявку посредством ссылки.

Claims (25)

1. Способ лечения воспалительного глазного заболевания у млекопитающего, включающий введение фармацевтической композиции, включающей 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, в глаз млекопитающего.

2. Способ по п. 1, где воспалительное глазное заболевание представляет собой увеит, диабетическую ретинопатию, диабетический макулярный отек, синдром сухого глаза, возрастную дегенерацию желтого пятна или атопический кератоконъюнктивит.

3. Способ по п. 2, где воспалительное глазное заболевание представляет собой увеит или диабетический макулярный отек.

4. Способ по п. 1, где фармацевтическую композицию вводят путем инъекции.

5. Применение 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли для лечения воспалительного глазного заболевания у млекопитающего.

6. Применение по п. 5, где воспалительное глазное заболевание представляет собой увеит, диабетическую ретинопатию, диабетический макулярный отек, синдром сухого глаза, возрастную дегенерацию желтого пятна или атопический кератоконъюнктивит.

7. Применение 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения воспалительного глазного заболевания у млекопитающего.

8. Способ лечения респираторного заболевания у млекопитающего, включающий введение млекопитающему фармацевтической композиции, включающей 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, где респираторное заболевание представляет собой легочную инфекцию, гельминтоз, легочную артериальную гипертензию, саркоидоз, лимфангиолейомиоматоз, бронхоэктаз или инфильтративное легочное заболевание.

9. Способ по п. 8, где фармацевтическую композицию вводят путем ингаляции.

10. Способ по п. 9, где фармацевтическую композицию вводят при помощи ингалятора–небулайзера.

11. Способ по п. 9, где фармацевтическую композицию вводят при помощи ингалятора сухого порошка.

12. Способ лечения респираторного заболевания у млекопитающего, включающий введение млекопитающему фармацевтической композиции, включающей 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенол или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, где респираторное заболевание представляет собой лекарственный пневмонит, грибковый пневмонит, аллергический бронхолегочный аспергиллез, гиперчувствительный пневмонит, эозинофильный грануломатоз с полиангиитом, идиопатическую острую эозинофильную пневмонию, идиопатическую хроническую эозинофильную пневмонию, гиперэозинофильный синдром, синдром Леффлера, облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией или индуцированный ингибитором иммунных контрольных точек пневмонит.

13. Способ по п. 12, где фармацевтическую композицию вводят путем ингаляции.

14. Способ по п. 13 где фармацевтическую композицию вводят при помощи ингалятора–небулайзера.

15. Способ по п. 13, где фармацевтическую композицию вводят при помощи ингалятора сухого порошка.

16. Применение 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли для лечения респираторного заболевания у млекопитающего, где респираторное заболевание представляет собой легочную инфекцию, гельминтоз, легочную артериальную гипертензию, саркоидоз, лимфангиолейомиоматоз, бронхоэктаз или инфильтративное легочное заболевание.

17. Применение 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли для лечения респираторного заболевания у млекопитающего, где респираторное заболевание представляет собой лекарственный пневмонит, грибковый пневмонит, аллергический бронхолегочный аспергиллез, гиперчувствительный пневмонит, эозинофильный грануломатоз с полиангиитом, идиопатическую острую эозинофильную пневмонию, идиопатическую хроническую эозинофильную пневмонию, гиперэозинофильный синдром, синдром Леффлера, облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией или индуцированный ингибитором иммунных контрольных точек пневмонит.

18. Применение 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения респираторного заболевания у млекопитающего, где респираторное заболевание представляет собой легочную инфекцию, гельминтоз, легочную артериальную гипертензию, саркоидоз, лимфангиолейомиоматоз, бронхоэктаз или инфильтративное легочное заболевание.

19. Применение по п. 18, где лекарственное средство является подходящим для введения путем ингаляции.

20. Применение по п. 19, где лекарственное средство является подходящим для введения при помощи ингалятора–небулайзера.

21. Применение по п. 19, где лекарственное средство является подходящим для введения при помощи ингалятора сухого порошка.

22. Применение 5–этил–2–фтор–4–(3–(5–(1–метилпиперидин–4–ил)–4,5,6,7–тетрагидро–1H–имидазо[4,5–c]пиридин–2–ил)–1H–индазол–6–ил)фенола или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения респираторного заболевания у млекопитающего, где респираторное заболевание представляет собой лекарственный пневмонит, грибковый пневмонит, аллергический бронхолегочный аспергиллез, гиперчувствительный пневмонит, эозинофильный грануломатоз с полиангиитом, идиопатическую острую эозинофильную пневмонию, идиопатическую хроническую эозинофильную пневмонию, гиперэозинофильный синдром, синдром Леффлера, облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией или индуцированный ингибитором иммунных контрольных точек пневмонит.

23. Применение по п. 22, где лекарственное средство является подходящим для введения путем ингаляции.

24. Применение по п. 23, где лекарственное средство является подходящим для введения при помощи ингалятора–небулайзера.

25. Применение по п. 24, где лекарственное средство является подходящим для введения при помощи ингалятора сухого порошка.