BR112019022648A2 - composto inibidor de jak derivado da fusão de imidazopiperidina - Google Patents

Abstract

a invenção fornece um composto de fórmula 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, útil como um inibidor de jak. a invenção também fornece formas cristalinas do composto, composições farmacêuticas compreendendo o composto, métodos de uso do composto para tratar doenças passíveis de serem tratadas com um inibidor de jak e os processos e intermediários úteis para preparar o composto.

Description

COMPOSTO INIBIDOR DE JAK DERIVADO DA FUSÃO DE

IMIDAZOPIPERIDINA

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

Campo da. invenção

[001] A invenção é direcionada a um composto inibidor de JAK quinase útil para o tratamento de doenças múltiplas, em particular, doenças oculares, cutâneas e respiratórias. A invenção também, é direcionada a composições farmacêuticas que incluem tais compostos, métodos de uso de tais compostos para tratar doenças passíveis de serem tratadas com um inibidor de JAK e processos e intermediários úteis para preparar tais compostos.

Estado da arte

[002] As citocinas são moléculas de sinalização intracelular que incluem quimiocinas, interferonas, interleucinas, linfocinas e fator de necrose tumoral. As citocinas são criticas para o crescimento celular normal e a imunorregulação, mas também disparam doenças mediadas pelo sistema imune e contribuem para o crescimento de células malignas. Níveis elevados de várias citocinas estão envolvidos na patologia de um grande número de doenças ou condições, em particular, aquelas doenças caracterizadas por inflamação. Muitas das citocinas envolvidas na doença agem por meio de vias de sinalização dependentes da família Janus de tirosina quinases (JAKs), que sinalizam via a família de Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição (STAT) de fatores de transcrição.

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[003] A família JAK é composta por quatro membros, JAK1, ϋΑ,Κζ, JAK3 e tirosina quinase 2 í, lYKz) . A ligaçao da citocina a um receptor de citocina dependente de JAK induz a dimerização do receptor que resulta na fosforilação de resíduos de tirosina na JAK quinase, ativando a JAK. As JAKs fosforiladas, por sua vez, se ligam e fosforilam várias proteínas STAT que dimerizam, internalizam no núcleo da célula e modulam diretamente a transcrição do gene, levando entre outros efeitos, a efeitos downstream associados com a doença inflamatória. As JAKs em geral se associam com receptores de citocina em pares como hom.odim.eros e heterodímeros. As citocinas específicas estão associadas com pareamentos específicos de JAK. Cada um dos quatro membros da família JAK está envolvido na sinalização de pelo menos uma das citocinas associadas com a inflamação.

[004] A inflamação desempenha um papel proeminente em muitas doenças oculares, incluindo uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia da retina e ceratoconjuntivite atópica. A uveíte engloba múltiplas condições inflamatórias e é muitas vezes autoimune, surgindo sem um gatilho infeccioso conhecido.

Estima-se que a coi pacientes nos EUA. associada à uveíte principal causa de d 1 ç a o a i. e t e c e r c a. α e Em alguns pacientes, leva à destruição de cegueira nos EUA. As milhões de a inflamação crônica tecido e é a quinta

C _L L O C ± ΙΊ cL S β J_ Θ V <3. Cl 3 S nos olhos de pacientes com uveíte que sinalizam através da via JAK-STAT incluem IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-2.3 e IFN-γ. (Horai e Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744; Ooi et al, Clinicai Medicine and Research, 2006, 4,

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294-309). As terapias existentes para a uveíte são frequentemente subótimas e muitos pacientes são mal controlados. Os esteroides, embora muitas vezes eficazes, estão associados a cataratas e ao aumento da pressão i nt rao cu1a r/g1aucoma.

[005] A retinopatia diabética (RD) é causada por danos nos vasos sanguíneos da retina. É a causa mais comum de perda de visão entre as pessoas com diabetes. A angrogênese, assim como as vias inflamatórias, desempenha um papel importante na doença. Muitas vezes, a RD progride para, edema macular diabético (EMD), a causa mais frequente de perda de visão em pacientes com diabetes. Estima-se que a condição afete cerca de 1,5 milhões de pacientes apenas nos EUA, dos quais cerca de 20% têm doenças que afetam ambos os olhos. Acredita-se que as citocinas que sinalizam, através da via JAK-STAT, como a IL-6, assim como outras citocinas, como a IP-10 e a MCP-1 (alternativamente conhecida como CCL2), cuja produção é impulsionada em parte pela via de sinalização JAK-STAT desempenham, um papel na inflamação associada com DR/EMD (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 1-12; Sohn et al., American Journal of Optnalmiology, 2011, 152, 686-694; Owen e Hartnett, Curr Diab Rep, 2013, 13, 476-480; Cheung et al, Molecular Vision, 2012, 18, 830-837; Dong et al, Molecular Vision, 2013, 19, 1734-1746; Funatsu et al, Ophthalmology, 2009, 116, 73-79) . As terapias existentes para o EMD são subótimas: os tratamentos anti-VEGF intravítreos só são eficazes em uma fração dos pacientes e os esteroides estão associados às cataratas e ao aumento da pressão intraocular.

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[006Ί A doença do olho seco (DED) é uma doença multifatorial que afeta aproximadamente 5 milhões de pacientes nos EUA. Acredita-se que a inflamação da superfície ocular desempenha um papel importante no desenvolvimento e propagação desta doença. Foram observados níveis elevados de citocinas como IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 e ΤΕΝ-γ nos fluidos oculares de pacientes com DED. (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), e frequentemente, os níveis correlacionam-se com a gravidade da doença. A degeneração macular relacionada à idade e a ceratoconjuntivite atópica também estão associadas a citocinas dependentes de JAK.

[007J A oclusão da veia da retina (OVR) é uma doença que compromete a visão e tem. alta prevalência. A obstrução do fluxo sanguíneo da retina pode danificar a vasculatura da retina, causar hemorragia e isquemia tecidual. Embora os casos de OVR sejam multifatoriais, foi demonstrado que os mediadores vasculares e inflamatórios são importantes (Deobhakta et al, International Journal of Inflammation, 2013, artigo ID 438412) . As citocinas que sinalizam através da via JAK-STAT, como a IL-6 e a IL-13, assim como outras citocinas, como a MCP-1, cuja produção é impulsionada em. parte pela via de sinalização JAK-STAT, foram detectadas em níveis elevados nos tecidos oculares de pacientes com OVR (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911). Muitos pacientes com OVR são tratados com fotocoagulação, uma terapia inerentemente destrutiva. Os agentes anti-VEGF também são usados, mas são eficazes apenas em uma fração dos pacientes. Foi demonstrado que os medicamentos esteroides que reduzem o nível de inflamação no

Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 31/160 olho (implantes de acetonida triancinolona e dexametasona) fornecem resultados benéficos para pacientes com certas formas de OVR, mas também foi demonstrado que eles provocam cataratas e aumento da pressão intraocular/glaucoma.

[008] A dermatite atópica (DA) é uma doença inflamatória crônica da pele que afeta cerca de 14 milhões de pessoas apenas nos Estados Unidos. Estima-se que a DA afeta 10-20% das crianças e 1-3% dos adultos nos países desenvolvidos (Bao et al. , JAK-STAT, 2013, 2, e24137) e a prevalência está aumentando. A elevação das citocinas proinflamatórias que dependem, da via JAK-STAT, em. particular, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IFNy está associada com a DA (Bao et al., Leung et al. , The Journal of Clinical Investigation, 2004, 113, 651-657). Além disso, foi demonstrado que a superregulação de IL-31, outra citocina que sinaliza através de um emparelhamento da JAK, participa no processo do prurido associada ao estado crônico da DA. (Sunkoly et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2006, 117, 411-417)

[009] A asma é uma doença crônica das vias aéreas para a qual não há prevenção ou cura. A doença é caracterizada por inflamação, fibrose, hiper-responsividade e remodelamento das vias aéreas, que contribuem para a limitação do fluxo de ar. Estima-se 300 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de asma e estima-se que o número de pessoas com asma vai crescer em mais de 100 milhões até 2025. Embora a maioria dos pacientes possa obter o controle dos sintomas de asma com. o uso de corticosteroides inalatórios que podem, ser combinados com. um modificador de leucotrieno e/ou um beta-agonista de longa ação, ainda existe um subconjunto de pacientes com asma grave cuja doença não é

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6/117 controlada com as terapias convencionais. As citocinas envolvidas na inflamação da asma que sinalizam pela via JAKSTAT incluem IL-2, IL-3, IL-4, TL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL13, IL-23, IL-31, IL-27, linfopoietina do estroma timico (TSLP), gamainterferona (ΙΕΝγ) e fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF). A inflamação das vias aéreas é característica de outras doenças respiratórias além da asma. Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cistica (FC), pneumonite, doenças intersticiais pulmonares (incluindo a fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome da angústia respiratória aguda, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante e sarcoidose também são doenças do trato respiratório nas quais acredita-se que a fisiopatologia está relacionada às citocinas sinalizadoras JAK.

[0010] Considerando o número de citocinas elevadas nas doenças inflamatórias e que cada citocina está associada a um pareamento de JAK particular, um inibidor químico com. atividade abrangente contra todos os membros da família JAK podería ter amplo uso para o tratamento de doenças oculares, cutâneas e respiratórias. Permanece a necessidade de um potente inibidor de JAK de amplo espectro.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0011] Em um aspecto, a invenção fornece um composto inibidor de JAK útil para o tratamento da doença inflamatória.

[0012] Em particular, em um aspecto, a invenção fornece 1- (2- (6- (2-etil-5-fluorO-4-hidrOxifenil)-4-fluoroPetição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 33/160 líf-indazol-3-il )-1,4,6, 7-tetraidro-5.H-imidazo [4, ó-c] piridin5-il)-2-morfolinoetan-l-ona da fórmula

doravante composto 1, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

[0013] A invenção também fornece formas cristalinas do composto, forma 1 e forma 2.

[0014] A invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico.

[0015] Em um aspecto, a invenção fornece um. método de tratamento de uma doença ocular em um mamífero, o método compreendendo' a administrado do composto 1, ou uma composição farmacêutica da invenção ao mamífero. Em um aspecto, a doença ocular é uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia da retina e ceratoconjuntivite atópica. Em particular, a doença ocular é o edema macular diabético ou a uveíte.

[0016] Ainda em outro aspecto do método, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença inflamatória da pele, em particular a dermatite atópica, o método compreendendo a aplicação do composto 1 ou uma composição farmacêutica da invenção na pele de um mamífero.

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[0017] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença respiratória em um mamífero, o método compreendendo a administração do composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico da invenção ao mamífero.

[0018] Em aspectos separados e distintos, a invenção também fornece processos sintéticos e intermediários aqui descritos, úteis para preparar o composto 1.

[0019] A invenção também fornece o composto 1 como aqui descrito para uso na terapia médica, assim como o uso do composto da invenção na fabricação de uma formulação ou medicamento para tratar doença ocular, cutânea ou resOÍratória em um mamífero.

RÁPIDA DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] Vários aspectos da presente invenção estão ilustrados por referências que acompanham os desenhos.

[0021] A Figura. 1 mostra um padrão de difração de raio x de pó (PXRD) da Forma 2 cristalina do composto 1 (doravante Forma 2).

[0022] A Figura 2 mostra um termograma de calorimetria de varredura diferencial (DSC) da Forma 2 c r i s t a 1.1. n a .

[0023] A Figura 3 mostra um gráfico de análise gravimétrica térmica (TGA) da Forma 2 cristalina.

[0024] A Figura 4 mostra um isotermo da adsorção dinâmica da umidade (DMS) da Forma 2 cristalina observada a uma temperatura de cerca, de 2 5 °C

[0025] A figura 5 mostra uma imagem de microscópio de luz polarizada da Forma 2.

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[0026] A Figura 6 mostra um. padrão de difração de raio x do pó (PXRD) da Forma 1 cristalina do composto 1 (a seguir designado Forma 1).

[0027] A Figura 7 mostra um termograma de calorimetria de varredura diferencial (DSC) da Forma 1 cristalina.

[0028] A Figura 8 mostra um gráfico de análise gravimétrica térmica (TGA) da Forma 1 cristalina.

[0029] A Figura 9 mostra um. isotermo da adsorção dinâmica da umidade (DMS) da Forma 1 cristalina observada a uma temperatura de cerca de 2 5 ^,JC

[0030] A figura 10 mostra uma imagem de microscópio de luz polarizada da Forma 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0031] As estruturas químicas são nomeadas nesse relatório de acordo com as convenções da IUPAC como implementado no programa ChemDraw (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA).

[0032] Além disso, a porção imidazo da porção tetraidroimidazopiridina na estrutura do presente composto existe nas formas tautoméricas. O composto podería ser representado de forma equivalente como

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10/117 da porção tetraidroimidazopiridina. Portanto, esta estrutura é designada 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4fluoro-1 H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetraidro-5H-imidazo[4,5c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona. Também pode ser designada 1- (2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluorol.H-indazol-3-il) -1,4, 6, 7-tetraidro-5H-imidazo [4,5-c]piridin5-il)-2-morfolinoetan-1-ona. Deve-se compreender que, embora as estruturas sejam apresentadas ou nomeadas, era uma forma particular, a invenção também inclui seu tautômero.

[0034] Os compostos da invenção têm vários grupos básicos e, portanto, os compostos podem existir como a base livre ou várias formas de sal, como uma forma de sal monoprotonado, diprotonado, triprotonado ou suas misturas. Todas essas formas estão incluídas no escopo de aplicação da presente invenção, salvo indicação ao contrário.

[0035] A presente invenção inclui também compostos da fórmula 1 marcados com isótopos, ou seja, compostos da fórmula 1 onde um átomo foi substituído ou enriquecido com um átomo com. o mesmo número atômico, mas massa atômica diferente da que predomina na natureza. Os exemplos de isótopos que podem ser incorporados em um composto de fórmula 1 incluem, mas nao estão limitados a, ²u, ⁸H, ^1J-C, ²“0, ~⁸N, ^1JO, ¹⁷O, ¹⁸O e ¹⁸F. De particular interesse são os compostos da fórmula 1, enriquecidos com tritio, ou carbono-14, que podem ser usados, por exemplo, em estudos de distribuição tecidual. De particular interesse são também compostos de fórmula 1, enriquecidos com deutério, especialmente em um sítio do metabolismo, cujos compostos tenham maior estabilidade metabólica. Além disso, de particular interesse são compostos de fórmula 1, enriquecidos com. um isótopo emissor de

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11/117 positrons, como, por exemplo, ^UC, ¹⁸F, ¹⁵0 e ¹³N, cujos compostos podem ser usados, por exemplo, em estudos de Tomografia por Emissão de Positrons (PET).

Definições

[0036] Ao descrever a presente invenção, incluindo seus diversos aspectos e modalidades, o seguinte

[0037] O termo quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade suficiente para tratar quando administrado a um doente que precisa de tratamento,

[0038] O termo para tratar ou tratamento significa atenuar ou suprimir a condição médica, doença ou distúrbio médico a ser tratado (p. ex., uma doença respiratória) um paciente (em particular, um humano); ou aliviar os sintomas da doença ou distúrbio médico.

[0039] O termo sal aceitável, do ponto de vista farmacêutico significa um sal que é aceitável para a administração a um paciente ou a um mamífero, como um humano (por exemplo, sais com. segurança aceitável em mamíferos para um determinado esquema de dosagem). Os sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico incluem sais de ácido acético, ascórbico, benzenossulfônico, benzoico, canforsulfônico, cítrico, etanossulfônico, edisílico, fumárico, gentísico, glicônico, glicurônico, glutâmico, hipúrico, bromídrico, clorídrico, isetionônico, lático, lactobiônico, maleico, málico, mandélico, metanossulfônico, múcico, naftalenossulfônico, naftaleno-l,5~dissulfônico, naftaleno2,6-dissulfônico, nicotínico, nítrico, orótico, pamoico, pantotênico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p~ toluenossulfônico e xinafoico e similares.

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[0040] O termo seu sal significa um composto formado quando o hidrogênio de um ácido é substituído por um cátion, como um cátion de metal ou um cátion orgânico e similares. Por exemplo, o cátion pode ser uma forma protonada de um composto da fórmula 1, ou seja, uma forma onde um ou mais grupamentos amino foram, protonados por um ácido. Normalmente, o sal é um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, embora isto não seja necessário para sais de compostos intermediários que não são indicados para administração a um. paciente.

[0041] O termo grupo de proteção do amino significa um grupo de proteção adequado para prevenir reações indesejáveis em um nitrogênio do amino. Os grupos representantes de proteção do amino incluem, mas não estão limitados a, formil; grupos acil, por exemplo, grupos alcanoil, tais como grupos acetil e trifluoroacetil; grupos alcoxicarbonil, tais como terc-butoxicarbonil (Boc); grupos arilmetoxicarbonil, como benziloxicarbonil (Cbz) e 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc); grupos arilmetil, tais como benzil (Bn), tritil (Tr), e l,l~di-(4’metoxifenil)metil; grupos silil, tais como grupos trimetilsilil (TMS), terc-butildimetilsilil (TBDMS), [2(trimetilsilil)-etoxi]metil (SEM); e similares.

[0042] O termo grupo de proteção do hidroxi significa um grupo de proteção adequado para prevenir reações indesejáveis em um grupo hidroxi. Os grupos de proteção do hidroxi representantes incluem, mas não estão limitados a, grupos alquil, como metil, etil e terc-butil; grupos acil, por exemplo, grupos alcanoil, como acetil; grupos arilmetil, como benzil (Bn), ρ-metoxibenzil (PMB),

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9-fluorenilmetil (Fm) e difenilmetil (benzidril, DPM) ; grupos silil, como trimetilsilil (TMS) e tertbutildimetilsilil (TBS); e similares.

[0043] Numerosos grupos protetores e sua introdução e remoção são descritos em T. W. Greene e P.G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, terceira edição, Wiley, Nova York

Procedimentos gerais de síntese

[0044] O composto 1 e seus intermediários podem ser preparados de acordo com os seguintes métodos e procedimentos gerais usando materiais de partida e reagentes disponíveis comercialmente ou preparados na rotina. Além disso, compostos com átomo ácido ou básico ou grupo funcional podem ser usados ou produz idos como um. sal, a menos que indicado de outra forma (em. alguns casos, o uso de um sal em uma reação particular vai exigir a conversão do sal para a forma não sal, por exemplo, uma base livre, usando procedimentos de rotina antes de realizar a reação).

[0045] Embora uma determinada modalidade da presente invenção possa ser mostrada ou descrita nos procedimentos a seguir, aqueles que são versados na técnica vão reconhecer que outras modalidades ou aspectos da presente invenção também, podem ser preparados com tais procedimentos, ou usando outros métodos, reagentes e materiais conhecidos por aqueles que são versados na técnica. Em particular, será apreciado que o composto 1 pode ser preparado por várias vias de processo nas quais os reagentes são combinados em diferentes ordens para fornecer diferentes intermediários na via e produzir os produtos finais.

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[0046] A preparação de 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4hidroxifenil)-4-fluoro~lH-indazol-3“il)-1,4,6,7-tetraidro577-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona (composto 1) está descrita em detalhes nos exemplos em anexo. As etapas chave estão resumidas no Esquema 1

Esquema 1

onde o reagente 7 é 2, 5-dioxopirrolidin-l-ii 2morfolinoacetato, ou seja, a variável R^A representa o agente ativador 2,5~dioxopirrolidinil, como descrito no Exemplo 1. Por outro lado, o ácido morfolin-4-il acético, ou seja, R^A representa o hidrogênio, é usado como reagente 7 sob

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15/117 condições típicas de formação de ligação amida, como descrito no Exemplo 4.

[0047] O intermediário 3 pode ser preparado conforme descrito nas Preparações 1 e 3 a seguir. Um método alternativo de preparação do intermediário chave 5 protegido está ilustrado no Esquema 2.

Esquema 2

[0048] O aldeido bromoindazol 8 pode reagir com o composto imina 2 com benzil protegido para produzir o intermediário 9. A reação é conduzida na presença de bissulfeto de sódio, a uma temperatura entre 130 ^UC e 140 °C por cerca de 1 a cerca de 6 horas ou até que a reação esteja consideravelmente completa. O composto 9 é reduzido usando um agente redutor como boroidreto de sódio para fornecer o composto 10, que é combinado com o feniltrifluoroborato 11 protegido, sob as condições típicas de acoplamento SuzukiMiyaura, para fornecer o intermediário 5. A reação é conduzida normalmente ât temperatura elevada na presença do catalisador paládio. O parceiro Suzuki 11, mostrado no

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Esquema 2, como sal de potássio de trifluoroborato pode ser preparado ao reagir o boronato correspondente (intermediário 1-5 na Preparação 1 a seguir) com o difluoreto de hidrogênio potássio para fornecer o intermediário 11. Por outro lado, o intermediário boronato pode ser usado no lugar do tr111uo rooo ra to 11.

[0049] Assim, em um aspecto do método, a invenção fornece um processo de preparação de um composto de fórmula 1 ou sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, o processo compreendendo reagir um composto de fórmula 6 com um composto de fórmula 7, como ilustrado no Esquema 1 para fornecer um composto de fórmula 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.

[0050] Em um aspecto adicional do método, a invenção fornece um. composto de fórmula 5 e um composto de fórmula 6, úteis na preparação de um composto de fórmula 1. Formas cristalinas l_ 00c.i. ] Em. outro aspecto, a invenção fornece r— (2 — I.6 — (2-Etil~5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-lH-indazol-3-il)1,4,6,7-tetraidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2morfolinoetan-l-ona (1) na forma cristalina.

rma

[0052] A Forma 1 cristalina da invenção é uma forma cristalina livre do composto 1. Em um aspecto, a Forma 1 é caracterizada por um padrão de difração de raio X de pó (PXRD), com significativos picos de difração, entre outros picos, a valores 2Θ de 8,16:10,20, 8,9710,20, 15,2910,20, 16,7010,20, 18,0010,20 e 20,1810,20. A Forma 1 pode ser caracterizada por um padrão de PXRD com dois ou mais picos de difração adicionais, incluindo três ou mais e quatro ou

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7/117 mais picos de difração adicionais em 2Θ valores selecionados a partir de 7, 69+0,20, 10, 66+0,20, 11, 4 6:10,20, 11,91 + 0,20, 15,80 ± 0,20, 17, 02 ± 0,20, 18,83 ± 0,20, 22,39 ± 0,20, 22,98 ± 0,20, 24,89 ± 0,20 e 26,54 ± 0,20. Em outro aspecto, a Forma 1 é caracterizada por um padrão PXRD com três, quatro, cinco ou seis picos de difração em 2Θ valores selecionados a partir de 8,1610,20, 8,9710,20, 15,29+0,20, 16,7010,20, 18,0010,20 e 20,18+0,20.

[0053] Como é bem conhecido no campo de difração de raios x de pó, as posições de pico de padrão PXRD são relativamente menos sensíveis aos detalhes experimentais, como detalhes de preparação da amostra e geometria do instrumento, do que são as alturas relativas de pico. Assim, em um aspecto, a Forma 1 cristalina é caracterizada por um padrão de difração de raios X do pó no qual as posições do pico estão substancialmente de acordo com as posições indicadas na figura 6.

[0054] Em. outro aspecto, a Forma 1 cristalina é caracterizada por seu comportamento quando exposta a alta temperatura. Como demonstrado na Figura 7, o traço da calorimetria diferencial por varredura (DSC) registrado a uma. taxa de aquecimento de 10 °C por minuto exibe um. pico no fluxo de calor endotérmico, identificado como transição de fusão, na faixa de transição de cerca de 210 °C a cerca de 234 °C, ou na faixa entre cerca de 215 °C a cerca de 229 °C, ou na faixa entre cerca de 220 °C a cerca de 224 °C. A Forma 1 cristalina é caracterizada por um traço de calorimetria diferencial exploratória registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto, que mostra um máximo no fluxo de calor endotérmico a um pico de temperatura de cerca

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18/117 de 221,7 °C. A análise gravimétrica térmica (TGA) da Figura 8 não mostra perda de peso significativa em temperaturas abaixo do início da decomposição a cerca de 293 °C.

[0055] A Figura 9 mostra um traço de sorção dinâmica de umidade (DMS) para a Forma 1 cristalina livre da invenção. A Forma 1 cristalina demonstrou uma histerese de sinal entre dois ciclos de sorção e dessorção. A Forma 1 demonstrou um ganho de peso de cerca de 0,99% na faixa de 5% a 70% de umidade relativa e ganho de peso de cerca de 1,32% na faixa de 5% a 90% de umidade relativa à temperatura ambiente, como demonstrado na Figura 9. A Forma 1 é considerada como sendo ligeiramente higroscópica.

[0056] Foi demonstrado que a forma 1 cristalina é estável após exposição a temperatura e umidade elevadas. Após 3 6 semanas em. condições aceleradas de 4 0 °C e 7 5% de umidade relativa, não foram observadas mudanças estatisticamente relevantes na pureza química.

[0057] A Forma 1 pode ser preparada dissolvendo o composto 1 em etanol sob aquecimento, seguido pela adição de acetonitrila, onde a proporção de acetonitrila para etanol é de cerca de 1:1 ou a partir de cerca de 1:3 a 3:1. A mistura resultante é então aquecida, seguida pela adição ao agitar a uma temperatura, entre cerca de 2 0 °C e cerca de 25 °C durante cerca de 4 horas a 30 horas ou. durante cerca de 16 horas. O sólido é então filtrado e seco para fornecer a Forma 1.

[0058] A Forma 1 também pode ser preparada ao misturar o composto 1 com etanol e agitar a mistura a uma temperatura entre cerca de 50 e cerca de 80 °C durante cerca de 2 a 30 minutos ou cerca de 10 minutos, seguido pela adição lenta de acetonitrila a uma temperatura entre cerca

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19/117 de 50 e cerca de 80 °C, onde a proporção no volume de acetonitrila para etanol é a partir de 3:1 a 1:1 ou cerca de 1,5:1. Grãos da Forma 1 podem ser adicionados e a mistura resultante é então agitada a uma temperatura entre cerca de 2 0 °C e cerca de 2 5 °C durante cerca, de 4 horas e cerca de 30 horas ou durante cerca de 18 horas. O sólido é então filtrado e seco para fornecer a Forma 1.

Fo rma 2

[0059] A Forma 2 cristalina da invenção é uma forma cristalina livre do composto 1. Em um aspecto, a Forma 2 é caracterizada por um. padrão de difração de raios x de pó (PXRD) tendo picos de difração significativos, entre outros picos, em valores 2Θ de 10,6110,20, 11,8410,20, 14,94 1 0,20, 18,26 1 0,20 e 19, 06 1 0,20. A. Forma. 2 pode ainda ser caracterizada por um padrão PXRD com picos de difração adicionais em 2Θ valores de 13,3210,20, 17,6910,20 e 21,1010,20. A Forma 2 pode ser caracterizada por um padrão PXRD com dois ou mais picos de difração adicionais, incluindo três ou mais e quatro ou mais picos de difração adicionais em 2Θ valores selecionados a partir de 10, 8510,20, 16, 1410,20, 16, 3510,20, 18,43 1 0,20, 19, 20 1 0,20, 19, 49 1 0,20, 20, 72 1 0,20, 21,94 1 0,20, 22, 64 1 0,20, 2 3,6410,20, 25,1910,20 e 28,08 1 0,20.

[0060] Em outro aspecto, a Forma 2 é caracterizada por um padrão PXRD com três, quatro, cinco ou seis picos de difração em 2Θ valores selecionados a partir de 10,6110,20, 11,8410,20, 13, 3210,20, 14,9410,20, 1.7, 6910,20, 1.8,2 610,20, 19,0610,20 e 21,1010,20.

[0061] Como é bem conhecido no campo de difração de raios x de pó, as posições de pico de padrão PXRD são

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20/117 relativamente menos sensíveis aos detalhes experimentais, como detalhes de preparação da amostra e geometria do instrumento, do que são as alturas relativas de pico. Assim, em um aspecto, a Forma 2 cristalina é caracterizada por um padrão de difração de raios X do pó no qual as posições do pico estão substancialmente de acordo com as posições indicadas na figura 1.

[0062] A estrutura da forma cristalina 2 foi ainda mais caracterizada pela análise de difração de raios x de único cristal. Os cristais pertencem a um sistema cristalino ortorrômbico e grupo espacial Pbca. As dimensões de célula da unidade são: a ~ 9, 7245(11) Â, b ~ 16,8197(14) Â, c 32, 604(4) À, a- 90°, 3==90°, y ===^: 90°, volume^ 5332,8(10) ³. A densidade calculada é de 1,302 g/cm³. Os cristais contêm, oito moléculas por célula da unidade. A estrutura confirma que os cristais não têm água ou outras moléculas de solvente e que a estrutura molecular está consistente com a estrutura do composto do Exemplo 1 como descrito aqui. Os picos de difração de raios x de pó previstos a partir das posições atômicas derivadas estão em boa sintonia com os resultados observados.

[0063] Em outro aspecto, a Forma 2 cristalina, é caracterizada por seu comportamento quando exposta a alta temperatura. Como demonstrado na Figura 2, o traço da calorimetria diferencial por varredura (DSC) registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto exibe um pico no fluxo de calor endotérmico, identificado como transição de fusão, na faixa de transição de cerca de 268 °C a cerca de 277 °C, ou na faixa entre cerca de 270 °C a cerca de 275 °C, ou na faixa entre cerca de 271 °C a cerca de 274 °C. A Forma

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21/117 cristalina é caracterizada por um traço de calorimetria diferencial exploratória registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto, que mostra um máximo no fluxo de calor endotérmico com um pico de cerca de

272,6±2 °C.

[0064] A análise gravimétrica. térmica (TGA) da Figura 3 não mostra perda de peso significativa em temperaturas abaixo do início da decomposição a cerca de 269 °C.

[0065] A Figura 4 mostra um traço de sorção dinâmica de umidade (DMS) para a Forma 2 cristalina livre da invenção. A Forma 2 cristalina não apresentou histerese entre dois ciclos de sorção e dessorção e demonstrou uma propensão excepcionalmente pequena para higroscopicidade. A Forma 2 demonstrou um ganho de peso de cerca de 0,18% na faixa de 5% a 90% de umidade relativa e ganho de peso de cerca de 0,12% na faixa de 5% a 70% de umidade relativa à temperatura ambiente, como demonstrado na Figura 4. A Forma 2 é considerada como sendo não higroscópica.

[0066] A Forma 2 pode ser preparada ao dissolver o composto 1 do exemplo 1 em. DMSO (dimetilsulfóxido, numa proporção de 1 g de composto 1 para 1 a 3 ml ou 2 ml de DMSO) a uma temperatura entre cerca de 45 e 75 °C ou cerca de 60 °C, seguido da adição de metanol, onde a proporção em volume de metanol para. DMSO é de cerca, de 1:4 a cerca de 1:1 ou cerca de 1:2. A. mistura homogênea é então adicionada gota a gota a uma solução pré-misturada de metanol e água (onde a proporção de metanol para DMSO está entre 1,5 e 3 para 1) a uma temperatura entre cerca de 60 e cerca de 90 °C ou cerca de 75 °C, onde a proporção em volume da solução prémisturada de metanol para água está entre cerca de 0,5:1 a

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22/117 cerca de 1:2 ou cerca de 1:0,9. A mistura permanece sob agitação a uma temperatura entre cerca de 60 °C ou cerca de 90 °C ou cerca de 75 °C durante cerca de 30 minutos a horas ou durante cerca de 1 hora. A água pode então ser lentamente adicionada a uma temperatura entre cerca de 60 e cerca de 90 °C ou cerca de 75 °C, onde a proporção em volume de água para metanol está entre 2 e 4 . A pasta fluida resultante é então lentamente resfriada a temperatura ambiente (em. geral, uma temperatura entre cerca de 20 e cerca de 25 °C), tipicamente durante cerca de 2 a cerca de 12 ou cerca de 6 horas. A pasta fluida é mantida à temperatura ambiente e depois filtrada e lavada com uma mistura de água e metanol a cerca de 50 a 90% ou cerca de 70% de água, para fornecer a Forma. 2.

[00 67] Em. um aspecto, a invenção fornece um método de preparação da forma 2 cristalina compreendendo:

(a) formar uma mistura homogênea de 1-(2-(6-(2~etil-5~ f luoro-4-hidroxifenil j -4-f luoro-líf-indazol-3-il) 1,4,6, 7“tetraidro~5ff“imidazo [ 4,5-c] piridin~5~il) -2morfolinoetan-l-ona em um solvente polar aprótico ou um solvente polar miscível em água, ou em uma mistura de solvente aprótico polar e um solvente polar miscível em água a uma temperatura entre 45 e Γ- O .-s / 5 u;

(b) adicionar a mistura homogênea a uma mistura de um solvente miscível água e água a uma temperatura entre 60 e 90 °C para produzir uma segunda mistura;

(c) adicionar lentamente a água à segunda mistura a uma temperatura entre 60 e 90 °C para formar uma pasta fluida; e

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23/117 (d) isolar a forma cristalina a partir da pasta fluida.

[00 68] Em. alguns aspectos, o solvente aprótico polar da etapa (a) é selecionado do grupo consistindo de DMSO, DMF, NMP, DMAc e nitrometano, e o solvente polar miscivel em água da etapa (a) é selecionado a partir do grupo constituído por acetonitrila, acetona, metanol, etanol e THF e 0' solvente miscivel em água da etapa (b) é selecionado a partir do grupo consistindo de acetonitrila, acetona, metanol, etanol. N-propanol, isopropanol, n-butanol, THF, DMSO, DMF, NMP, DMAc e nitrometano. Em. alguns aspectos, o solvente aprótico polar da etapa (a) é DMSO, o solvente polar miscivel em água da etapa (a) é metanol e o solvente miscivel em água da etapa (b) é metanol.

[0069] Em alguns aspectos, a pasta fluida obtida na etapa (c) é resfriada a um. temperatura entre cerca de 2 0 e 25 °C antes da etapa (d).

[0070] Por outro lado, a Forma 2 pode ser produzida ao agitar o composto 1 obtido no exemplo 1 em uma mistura de um solvente polar miscivel em água e água a uma temperatura entre 60 e 90 °C. Em alguns aspectos, a proporção de solvente para água é cerca de 1:1 ou a partir de 2:1 a 0,5;l. Em alguns aspectos, o solvente polar miscivel em água é selecionado do grupo consistindo de acetonitrila, acetona, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, THF, DMSO, DMF, NMP, DMAc e nitrometano.

Composições farmacêuticas

[0071] O composto 1 e seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico são normalmente usados na forma de uma composição ou formulação farmacêutica. Tais composições farmacêuticas podem ser administradas, de forma vantajosa, a

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24/117 um paciente por qualquer via de administração aceitável, incluindo, mas não limitada às formas de administração oral, por inalação, por injeção tópica, tópica (incluindo a transdérmica), retal, nasal e parenteral.

[0072] Assim, em um dos aspectos das composições, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica compreendendo um carreador ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico' e o composto 1, onde, como definido acima, composto 1 significa o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico. Opcionalmente, tais composições farmacêuticas podem, ter outros agentes de formulação e/ou terapêuticos se desejar. Quando falamos de composições e seus usos, o composto 1 também pode ser aqui referido como o agente ativo.

[0073] Em. alguns aspectos, a divulgação fornece uma composição farmacêutica compreendendo o composto 1 ou um. sal aceitável do ponto de vista farmacêutico ou a Forma 1 ou a Forma. 2 e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico. Em. alguns aspectos, a composição farmacêutica é adequada para aplicação no olho. Em alguns aspectos, a composição é adequada para injeção no olho. Em alguns aspectos, a composição é adequada para injeção intravítrea. Em. alguns aspectos, a composição é uma suspensão. Em alguns aspectos, a composição é uma suspensão cristalina. Em alguns aspectos, a composição é uma suspensão da Forma 1 ou da Forma 2.

[0074] As composições farmacêuticas da invenção contêm, em geral uma quantidade terapeuticamente eficaz de composto 1. Aqueles que são versados na técnica vão reconhecer, porém, que uma composição farmacêutica pode ter

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25/117 mais de uma quantidade terapêutica eficaz, ou seja, composições a granel ou menos de uma quantidade terapêutica eficaz, ou seja, doses unitárias individuais projetadas para a administração de doses múltiplas para atingir uma quantidade terapêutica eficaz.

[0075] Normalmente, tais composições farmacêuticas vão conter cerca de 0,01 a 95%, em peso, do agente ativo, incluindo, por exemplo, a partir de cerca de 0,05 a 30%, em peso, do agente ativo, e a partir de 0,1% a cerca de 10% em peso do agente ativo.

[0076] Qualquer carreador ou excipiente convencionais podem ser usados nas composições farmacêuticas da invenção. A escolha de um determinado carreador ou excipiente, ou combinações de carreadores ou excipientes, dependerá do modo de administração a ser usado para tratar um paciente em particular ou tipo do estado de doença ou condição médica. Neste contexto, a preparação de uma composição farmacêutica adequada para um determinado modo de administração está bem dentro do escopo daqueles que são versados na técnica farmacêutica. Além disso, os carreadores ou excipientes usados nas composições farmacêuticas desta invenção estão comercialmente disponíveis. Por meio de outra ilustração, as técnicas de formulação convencionais estão descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^a edição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Mariland (2000); e H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^a edição, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).

[0077] Exemplos representativos de materiais que podem servir como carreadores aceitáveis do ponto e vista

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26/117 farmacêutico incluem, mas não estão limitados a, os seguintes: açúcares, como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como o amido de milho e fécula; celulose, como celulose microcristalina, e seus derivados, como a carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, como a manteiga de cacau e ceras de supositórios; óleos, como óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, como propilenoglicol; poliois, tais como a glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres, como oleato de etila e laurato de etila; àgar; agentes tamponantes, como o hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido alginico; água apirógena;

solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etilico; soluções tampão de fosfato; e outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas em composições farmacêuticas.

[0078] As composições farmacêuticas são geralmente preparadas ao agitar ou misturar completamente e de forma eficiente o agente ativo com um carreador e um ou mais ingredientes opcionais aceitos do ponto de vista farmacêutico. A mistura agitada uniformemente resultante pode então ser moldada ou carregada em. comprimidos, cápsulas, comprimidos e usando procedimentos e equipamentos c ο ηv encionais.

[0079] As composições farmacêuticas da invenção são acondicionadas preferencialmente em forma farmacêutica unitária. O termo forma farmacêutica unitária refere-se a uma unidade separada fisicamente adequada para administrar a um paciente, ou seja, cada unidade contendo uma quantidade

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27/117 predeterminada de agente ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado, isolado ou combinado com. uma o' mais unidades adicionais. Por exemplo, tais formas farmacêuticas unitárias podem ser cápsulas, comprimidos, pílulas, e similares ou embalagens adequadas para administração ocular ou parenteral.

[0080] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção são adequadas para administração oral. As composições farmacêuticas adequadas para administração por via oral podem estar na forma de cápsulas comprimidos, pastilhas, pílulas, drágeas, pós, grânulos, ou como uma solução ou suspensão em um liquido aquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo em água ou água em óleo; ou como um elixir ou xarope e similares; cada uma contendo uma quantidade predeterminada do composto 1 da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0081] Quando destinadas à administração por via oral em. uma forma farmacêutica sólida (ou seja, como cápsulas, comprimidos, pílulas e similares), as composições farmacêuticas da invenção incluirão o agente ativo e um ou mais carreadores aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Opcionalmente, tais formas farmacêuticas sólidas podem incluir: enchimentos ou extensores, tais como amidos, celulose microcristalina, lactose, fosfato dicálcico, sacarose, glicose, manitol e/ou ácido silicico; ligantes, como carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarose e/ou acácia; umectantes, como o glicerol; agentes de desintegração, como croscarm.elo.se sódica, ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, alguns silicatos e/ou carbonato de

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28/117 sódio; agentes retardadores de solução, como a parafina; aceleradores de absorção, como os compostos a base de amônio quaternário; agentes umectantes, como o álcool cetilico e/ou monoestearato de glicerol; absorventes, como caulim e/ou argila bentonita; lubrificantes, como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicois, laurilsulfato de sódio, e/ou suas misturas; corantes e agentes tamponantes.

[0082] Os agentes de liberação, umectantes, de revestimento, adoçantes, edulcorantes e aromatizantes, conservantes e antioxidantes também, podem estar presentes na composição de composições farmacêuticas da invenção. Os exemplos de antioxidantes aceitos do ponto de vista farmacêutico incluem.: antioxidantes solúveis em água, como o ácido ascórbico, cloridrato de cisteina, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; antioxidantes solúveis em óleo, como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, gaiato de propila, alfatocoferol, e similares e agentes quelantes de metais, tais como o ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético, sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares. Os agentes de revestimento para comprimidos, cápsulas, pílulas e similares incluem os usados para revestimentos entéricos, como o ftalato de acetato de celulose, ftalato de acetato de polivinila, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, ácido metacrílico, copolímeros de éster de ácido metacrílico, trimelitato de acetato de celulose, carboximetiletilcelulose, acetato de succinato de hidroxipropilmetilcelulose e similares.

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[0083] As composições farmacêuticas da invenção também podem ser formuladas para proporcionar a liberação lenta ou controlada do agente ativo usado, por exemplo, a hidroxipropilmetilcelulose em diferentes proporções; ou outras matrizes poliméricas, lipossomas e/ou microesferas. Além, disso, as composições farmacêuticas da invenção podem ter agentes opacificantes e podem ser formuladas de modo que liberem apenas o ingrediente ativo, ou, preferencialmente, em uma determinada porção do trato gastrintestinal, de forma retardada. Os exemplos de composições incorporadas que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras. O agente ativo também pode estar na forma microencapsulada, se for adequado, com um ou mais dos excipientes descritos acima.

[0084] As formas farmacêuticas líquidas adequadas para administração por via oral incluem, a título de ilustração, emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. As formas farmacêuticas líquidas adequadas para administração por via oral incluem., a título de ilustração, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificadores, como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de sódio, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, óleos (esp., óleos de semente de algodão, amendoim, milho, gérmen de trigo, azeite, rícino e gergelim), ácido oleico, glicerol, álcool tetraidrofurílico, polietilenoglicois e ésteres de ácidos graxos de sorbitano e suas misturas. Por outro lado, algumas formulações líquidas podem, ser convertidas, por exemplo, a secagem por spray a um pó, que é

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30/117 usado para preparar as formas farmacêuticas sólidas por meio de procedimentos convencionais.

[0085] As suspensões, além do ingrediente ativo, podem conter agentes de suspensão, como, por exemplo, alcoóis isoestearilicos etoxilados, polioxietileno sorbitano, sorbitol e ésteres de sorbitol, celulose microcristalina, metaidróxido de alumínio, bentonita, àgarágar e tragacanto, e suas misturas.

[0086] O composto 1 também pode ser administrado por via parenteral (p. ex., injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intraperitonial). No caso da administração parenteral, o agente ativo é misturado com um veículo adequado para administração parenteral incluindo, por exemplo, soluções aquosas estéreis, solução salina, alcoóis de baixo peso molecular, como propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, gelatina, ésteres de ácidos graxos como oleato de etila e similares. As formulações parenterais também, podem conter um. ou mais antioxidantes, solubilizadores, estabilizantes, conservantes, agentes umectantes, emulsificantes, agentes de tampão ou agentes de dispersão. Essas formulações podem ser esterilizadas através de um meio injetável estéril, um agente esterilizante, filtração, irradiação, ou calor.

[0087] O composto 1 também pode ser formulado como uma suspensão ou solução aquosa estéril para injeção ocular. Os excipientes úteis que podem ser incluídos em tal formulação aquosa incluem polissorbato 80, polímeros de c e1u1o se como c a rbox imet i1c e1u1o s e, hidroxipropilmetilcelulose, metilcelulose, cloreto de potássio, cloreto de sódio, cloreto de sódio, cloreto de

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31/117 magnésio, acetato de sódio, citrato de sódio, histidina, aα-trehalose di-idrato, sacarose, polissorbato 20, hidroxipropil-p-ciclodextrina, cloreto de benzalcônio, Amberlite IRP-69, éteres de polioxietileno glicol (lauril, estearil e oleil), sal sódico do ácido etilenodiaminotetra acético, taurocolato de sódio, saponinas e cromóforo EL, policarbofila-cisteina, goma xantana, goma gelana, ácido hialurôriico, lipossomos e fosfato de sódio. Os acentuadores de permeabilidade, surfactantes, ácidos biliares, ciclodextrinas como 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina e agentes quelantes podem ser incluídos na formulação. Os oligonucleotideos cilíndricos com uma superfície externa hidrofilica e uma superfície internai lipofílica com a capacidade de formar complexos com um agente ativo também podem ser incluídos na formulação. O álcool benzílico pode servir como conservante e o cloreto de sódio pode ser incluído para ajustar a tonicidade. Além disso, o ácido clorídrico e/ou hidróxido de sódio podem ser adicionados à solução para ajustar o pH. As formulações aquosas para injeção ocular podem ser preparadas sem conservantes.

[0088] A formulação ocular pode permitir a liberação sustentada do ingrediente ativo para o olho. A formulação ocular pode ser formulada como uma emulsão (óleo em água ou água em óleo), uma suspensão ou uma pomada. A formulação da suspensão pode conter o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, como uma forma cristalina, por exemplo, Forma 1 ou Forma 2 ou em um. estado amorfo.

[0089] O composto 1 também pode ser formulado para ser adequado para administração de gota oftálmica ou como um implante intravítreo. O implante pode permitir a liberação

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32/117 de níveis terapêuticos constantes do fármaco. Os implantes de reservatório são normalmente feitos com. um núcleo de fármaco peletizado circundado por substâncias não reativas, como silício, acetato de vinil etileno (EVA) ou álcool polivinílico ÍPVA), esses implantes não são biodegradáveis e podem liberar quantidades contínuas de um fármaco durante meses a anos. Também podem ser usados implantes de matriz. São em geral usados para fornecer uma dose de ataque seguida de doses reduzidas do fármaco durante um. período de 1 dia a 6 meses. São mais comumente produzidos a partir de copolímeros de ácido polilático (PLA) e/ou ácido poliláticoglicólico (PLGA), que se degradam em água e dióxido de carbono. A iontoforese também pode ser usada. A iontoforese é uma técnica não invasiva na qual uma pequena corrente elétrica é aplicada para potencializar a penetração do fármaco ionizado na pele.

[0090] A tecnologia de célula encapsulara (TCE), que é um sistema de liberação baseado na célula também, pode ser usado para liberar o agente terapêutico nos olhos. Tipicamente, as células geneticamente modificadas são acondicionadas em um tubo oco de membrana semipermeável, o que impede a entrada de células imunes e permite que os nutrientes e as moléculas terapêuticas se dispersem livremente pela membrana. As duas extremidades do corte do polímero estão seladas e uma alça de titânio é colocada na extremidade de ancoragem, que é implantada na parte plana e ancorada na esclera.

[0091] O composto 1 pode ser formulado em. qualquer forma que permita a liberação na parte posterior do olho. Os exemplos de modos de liberação são conhecidos na literatura

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33/117 (Kuno et al, Polymers, 2011, 3, 193-221, del Amo et al, Drug Discovery Today, 2008, 13, 135-143, Short, Toxicologic Pathology, 2008, 36, 49-62) . Tais modos de liberação incluem, mas não estão limitados a, liberação supracoroide, o que permite a liberação no coroide e na retina através do espaço supracoroide, liberação sub-Tenon, liberação periocular, lentes de contato, plugues pontuais e plugues de esclera. 0 composto 1 também pode ser liberado por injeção periocular, supraescleral, retrobulbar, peribulbar ou subconjuntival.

[0092] 0 composto 1 pode ser liberado como uma emulsão, micro ou nanoesferas poliméricas, lipossomos, micro ou nanopartícuias, microesferas, micelas ou dendrímeros. Podem ser usados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, como o ácido politáctico e PLGA. 0 composto 1 pode ser encapsulado.

[0093] Além disso, o composto 1 pode ser formulado para administração tópica, na pele como pomada ou creme. As formulações de pomada são preparações semissólidas com uma. base de um material gorduroso ou oleoso que, em geral, é clara. Materiais oleosos adequados para uso em formulações de pomada: petrolato (vaselina), cera de abelha, manteiga de cacau, manteiga de karité, e álcool cetílico. As pomadas podem, adicionalmente, incluir emolientes e potencializadores de penetração, se for desejado.

[0094] As formulações de creme podem ser preparadas como emulsões, compreendendo uma fase oleosa e uma fase aquosa, geralmente incluindo água purificada. Os componentes de formulações em creme podem incluir: bases de óleo, como petrolato, óleos minerais, óleos vegetais e animais, e

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34/117 triglicerídios; bases de creme, como, alcoóis de lanolina, ácido esteárico e álcool cetoestearílico; a base de gel, como, álcool polivinílico; solventes, como propilenoglicol e polietilenoglicol; emulsificantes, como os polissorbatos, estearatos, como estearato de glicerila, octilidroxistearato, estearato de polioxil, éteres estearílicos de PEG, palmitato de isopropila e monoestearato de sorbitano; estabilizadores, tais como polissacarídeos e sulfito de sódio; emolientes (ou seja, hidratantes), como triglicerídios de cadeia média, miristato de isopropila, e dimeticona; agentes enrijecedores, como álcool cetílico e álcool estearílico, agentes antimicrobianos, como metilparabeno, propilparabeno, fenoxietanol, ácido sórbico, diazolidinil ureia e hidroxianisol butilado;

potenci a1izado re s de penet ração, como N-met i1pi rro1idona, propilenoglicol, monolaurato de polietilenoglicol e similares e agentes quelantes, como edta dissódico.

[0095] Alternativamente, as composições farmacêuticas da invenção são formuladas para administração por inalação. As composições farmacêuticas adequadas para administração por inalação estarão na forma de aerossol ou pó. Tais composições são geralmente administradas por dispositivos bem conhecidos, tais como inalador dosimetrado, inalador de pó seco, nebulizador ou dispositivo semelhante.

[0096] Quando administradas por inalação usando um recipiente pressurizado, as composições farmacêuticas da invenção vão incluir o ingrediente ativo e um propelente adequado, tais como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás apropriado. Além disso, a composição

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35/117 farmacêutica pode estar na forma de cápsula ou cartucho (preparada, por exemplo, a partir da gelatina) compreendendo o composto 1 e um. pó adequado para uso em inalador de pó. As bases em pó adequadas incluem, por exemplo, lactose ou amido.

[0097] Os seguintes exemplos não limitantes ilustram composições farmacêuticas representantes da presente invenção.

Forma farmacêutica de comprimido oral sólido

[0098] O composto 1, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, é misturado a seco com celulose microcristalina, polivinil pirrolidona e croscarmelose sódica na proporção de 4:5:1:1 e prensado em. comprimidos para fornecer uma dose unitária de, por exemplo, 5 mg, 20 mg ou 40 mg de agente ativo por comprimido.

Forma farmacêutica de cápsula oral sólida

[0099] O composto 1, ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico é misturado a seco com celulose microcristalina, polivinil pirrolidona e croscarmelose sódica na proporção de 4:5:1:1 e carregado em cápsulas de gelatina ou hidroxipropilmetilcelulose para fornecer uma dose unitária de, por exemplo, 5 mg, 20 mg ou 40 mg de agente ativo qoi capsula*

Formulação líquida.

[00100] Uma formulação liquida compreendendo o composto 1 (0,1%), água (98,9%) e ácido ascórbico (1,0%) é formada pela adição de um composto da invenção a uma mistura de água e ácido ascórbico.

Forma farmacêutica, oral com revestimento entérico

[00101] O composto 1 é dissolvido em uma solução aquosa contendo polivinil pirrolidona e aplicada como revestimento em spray em pérolas de celulose microcristalina

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36/117 ou de açúcar numa proporção de 1:5 p/p ingrediente ativo/pérolas e então um ganho de aproximadamente 5% de um revestimento entérico compreendendo um copolimero acrílico é aplicado. As pérolas com revestimento entérico são carregadas em cápsulas de gelatina ou hidroxipropilmetilcelulose para fornecer uma dose unitária de, por exemplo, 30 mg de agente ativo por cápsula.

Forma farmacêutica oral com revestimento entérico [00102] Um revestimento entérico compreendendo uma combinação de Eudragit-L® e Eudragit-S®, ou hidroxipropilmetilcelulose ou succinato de acetato é aplicado a uma forma farmacêutica oral, comprimido ou cápsula, descrita acima.

Formulação aquosa para, injeção ocular

[00103] Cada ml de uma suspensão aquosa estéril inclui de 5 mg a 50 mg do composto 1, cloreto de sódio para a tonicidade, álcool benzílico a 0,99% (p/v) como conservante, carboximetilcelulose de sódio a 0,75% e polissorbato a 0,04%. Hidróxido de sódio ou ácido clorídrico podem ser incluídos para ajustar o pH para 5 a 7,5.

Formulação aquosa para injeção ocular

[00104] Uma suspensão aquosa estéril sem. conservantes inclui 5 mg./ml a 50 mg/ml do composto 1 em fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 40 mM, polissorbato 20 0,03% e sacarose 5%.

Formulação de pomada para administração tópica [00105] O composto 1 é combinado com petrolato, triglicerídios de cadeia Cs-Cio, octilidroxistearato, e nmetilpirrolidona em uma proporção para fornecer uma composição contendo de 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

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Formulação de pomada para administração tópica

[00106] O composto 1 é combinado com o petrolato branco, propilenoglicol, mono e di-glicerideos, parafina, hidroxitolueno butilado e edta cálcio dissódico em uma proporção para fornecer uma composição contendo de 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Formulação de pomada para administração tópica

[00107] O composto 1 é combinado com óleo mineral, parafina, carbonato de propileno, petrolato branco e cera branca para fornecer uma composição contendo de 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Formulação de creme para administração tópica

[00108] O óleo mineral é combinado com o composto 1, propilenoglicol, palmitato isopropilico, polissorbato 60, álcool cetilico, monoestearato de sorbitano, estearato de polioxila 40, ácido sórbico, metilparabeno e propilparabeno para formar uma fase oleosa, que é combinada com água purificada por mistura de cisalhamento para fornecer uma composição contendo 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Formulação de creme para administração tópica

[00109] Uma formulação de creme compreendendo o composto 1, álcool benzilico, álcool cetilico, ácido citrico anidro, mono e diglicerídeos, álcool oleilico, propilenoglicol, cetostearil sulfato de sódio, hidróxido de sódio, álcool estearilico, trigliceridios e água contém de 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Formulação de creme para administração tópica

[00110] Uma formulação de creme compreendendo o composto 1, álcool cetoestearilico, miristato de isopropila, propilenoglicol, cetomacrogol 1000, dimeticona 360, ácido

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38/117 cítrico, citrato de sódio e água purificada, com imidureia, metilparabeno, propilparabeno, como conservantes, contém de 0,05% a 5% de agente ativo em peso.

Composição do pó seco

[00111] O composto 1 micronizado (1 g) é misturado com lactose triturada (25 g). Esta mistura combinada é então carregada em blisters individuais de um pacote de blister de fácil abertura em uma quantidade suficiente para fornecer entre cerca de 0,1 mg a 4 mg do composto 1 por dose. O conteúdo dos blisters são administrados usando um inalador

Q Θ pó S6CO*

Composição do inalador dosimetrado

[00112] O composto micronizado 1 (10 g) é disperso em uma solução preparada dissolvendo lecitina (0,2 g) em água desmineralizada (200 ml). A suspensão resultante é secada com. spray e micronizada para formar uma composição micronizada compreendendo partículas com um diâmetro médio de menos de 1,5 um. A composição micronizada é então carregada em cartuchos de inalador dosimetrado contendo 1,1,1,2tetrafluoroetano pressurizado em uma quantidade suficiente para fornecer cerca de 0,1 a cerca de 4 mg do composto 1 por dose quando administrado por inalador dosimetrado.

Composição do nebulizador

[00113] O composto 1 (25 mg) é dissolvido em uma solução contendo 1,5-2,5 equivalentes de ácido clorídrico, seguida pela adição de hidróxido de sódio para ajustar o pH para 3,5 a 5,5 e 3% em peso de glicerol. A solução é agitada bem até que todos os componentes estejam dissolvidos. A solução é administrada com um dispositivo nebulizador que fornece cerca de 0,1 mg a cerca de 4 mg do composto 1 por dose.

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U t .1.11 d a α θ

[00114] Foi demonstrado que o composto 1 é um potente inibidor da família de enzimas JAK: JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2. Doenças oculares

[00115] Foi demonstrado que muitas doenças oculares estão associadas com. a elevação de citocinas próinflamatórias que dependem da via JAK-STAT. Como o composto 1 apresenta potente inibição para todas as quatro enzimas JAK, assim espera-se que a sinalização e os efeitos patogênicos de várias citocinas (como IL-6, IL-2 e IFN-γ), que sinalizam através de JAK sejam potencialmente inibidos, assim como o aumento de outras citocinas (como MCP-1 e ΤΡΙΟ), cuja produção é acionada pela sinalização via JAK-STAT, seja evitado.

[00116] Em. particular, o composto 1 exibiu valores de pICso de 6,4 ou superiores (valores de IC50 de 400 nM ou menos) para inibição da sinalização de IL-6, IL-2, e IFNy em ensaios com células descritos nos Ensaios 3 a 6, incluindo ensaios que registram a inibição dos efeitos downstream, da elevação de citocinas.

[00117] O estudo farmacocinético do Ensaio 7 demonstrou exposição sustentada nos olhos de coelhos após uma única injeção intravitrea e uma concentração no plasma de pelo menos três ordens de magnitude menores do que a concentração observada no tecido vitreo.

[00118] Além disso, a administração intravitrea do composto 1 demonstrou significativa inibição de pSTAT3 induzida por IL-6 na retina/tecido coroide de rato assim como inibição significativa e sustentada de IP-10 induzida por IFN-γ no vitreo de coelho assim como na retina/tecido

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40/117 coroide. A administração intravitrea do composto 1 demonstrou inibição significativa e sustentada de pSTATl induzida por IFN-γ no coelho.

[00119] Espera-se que a inibição ocular de JAK sustentada na ausência de níveis sistêmicos significativos resultará em. potente atividade anti-inflamatória local no olho sem os efeitos adversos sistêmicos direcionados. Assim, espera-se que o composto 1 seja benéfico em várias doenças oculares que incluem., mas não estão limitadas a, uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia da retina e ceratoconjuntivite atópica.

[00120] Em particular, uveíte (Horai e Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744), retinopatia diabética (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 112), edema macular diabético (Sohn et al., American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686-694), doença do olho seco (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), oclusão da veia da retina (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911) e degeneração macular relacionada à idade (Knickelbein et al, Int Ophthalmol Clin, 2015, 55(3), 63-78) são caracterizadas pela elevação de algumas citocinas pró-inflamatórias que sinalizam através da via JAK-STAT. Desta forma, o composto 1 pode ser capaz de aliviar a inflamação ocular associar e reverter a progressão da doença ou proporcionar alívio dos sintomas nestas doenças.

[00121] Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença ocular em um mamífero, o método compreendendo administrar uma composição farmacêutica compreendendo 1-(2-( 6- (2-etil-5-fluorO-4-hidrOxifenil)-4

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41/117 fluoro-líf-indazol-3-il) -1,4, 6, 7-tetraidro-5H-imidazo [4,5c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e urn carreador farmacêutico para o olho do mamífero. Em um aspecto, a doença ocular é uveite, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia da retina ou ceratoconjuntivite atópica. Em um aspecto, o método compreende administrar o composto 1 por injeção intravítrea.

Doença inflamatória da pele

[00122] A. derm.atite atópica, por exemplo, está associada à elevação de citocinas pró-inflamatórias que dependem da via JAK-STAT, em particular, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e IFNv. Além da inibição de citocinas nos ensaios celulares citados acima, o composto 1 exibiu um valor de IC50 de 13 nM para inibição da IL-13, como descrito no Ensaio 2. Além disso, as formulações de pomada creme e formulações do composto 1 demonstraram níveis dérmicos contínuos por pelo menos 2 dias em camundongos e, pelo menos, 7 dias em porquinhos sem exposição plasmática detectável.

[00123] Espera-se que os níveis cutâneos contínuos do composto 1 na ausência de níveis sistêmicos significativos resultará, em potente atividade anti-inflamatória e antipruriginosa local na pele sem efeitos adversos sistêmicos direcionados. Espera-se que o composto 1 seja benéfico em várias condições dérmicas inflamatórias ou pruriginosas, que incluem, mas não estão limitados a, alopecia areada, vitiligo, linfoma cutâneo de células T, prurigo nodular, líquen plano, amiloidose cutânea primária localizada, penfigoide bolhoso, manifestações cutâneas da

Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 68/160 doença enxerto versus hospedeiro, penfigoide, lúpus discoide, granuloma anular, líquen simples crônico, prurido vulvar/escrotal/perianal, líquen escleroso, prurido neurálgico pós-herpes, líquen planopilar e foliculite decalvante. Era particular, alopecia areada (Xing et al., Nat Med. 2014 Set;20 ( 9) :1043-9), vitiligo (Craiglow et al, JAMA Dermatol. 2015 Out;151(10) :1110-2) , linfoma cutâneo de células T (Netchiporouk et al., Cell Cycle.

2014; 13 (21) :3331-5), prurigo nodular (Sonkoly et al., J Allergy Clin Immunol. 2006 Fev;117(2):411-7), liquen piano (Welz-Kubiak et al., J Immunol Res. 2015;2015:854747), amiloidose cutânea primária localizada (Tanaka et al., Br J Dermatol. 2009 Dez;161(6):1217-24), penfigoide bolhoso (Feliciani et al., Int J Immunopathol Pharmacol. 1999 MaioAgo;12(2):55-61) e manifestações dérmicas da doença enxerto versus hospedeiro (Okiyama et al., J Invest Dermatol. 2014 fibr; 134 (4 ) : 992-1000) são caracterizadas pela elevação de algumas citocinas que sinalizam via ativação JAK. Desta forma, o composto 1 pode ser capaz de aliviar o prurido associado à inflamação cutânea ou disparado por essas citocinas. Em particular, espera-se que o composto 1 seja útil para o tratamento da dennatite atópica e outras doenças inflamatórias da pele.

[001241 Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença cutânea inflamatória em ura mamífero (por exemplo, um humano) , o raétodo compreendendo a aplicação de uma composição farmacêutica compreendendo 1(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-l-indazol-3il) -1,4,6, 7-tetraidro-5JF-imidazo [ 4,5-c] piridin-5-il) -2morfolinoetan-l-ona ou um sal aceitável do ponto de vista

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43/117 farmacêutico e um carreador farmacêutico para a pele do mamífero. Em um aspecto, a doença inflamatória de pele é a dermatite atópica.

[00125] O composto 1 também pode ser usado combinado com antibióticos gram positivos, como a mupirocina e o ácido fusídico, para o tratamento de doenças inflamatórias da pele. Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença de pele inflamatória em um mamífero, o método compreendendo aplicar o composto 1 e um antibiótico gram-positivo na pele de mamíferos. Em. outro aspecto, a. invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo 1-(2-(6-(2-etil“5-fluoro-4-hidroxifenil)-4fluoro-lA-indazol-3-il) -1,4,6, 7-tetraidro-5/í-imidazo [4,5c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, um antibiótico gram positivo e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Doenças respiratórias

[00126] As citocinas que sinalizam pela via JAK-STAT, em particular IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL13, IL-23, IL-31, IL-27, linfopoietina do estroma tímico (TSLP), gamainterferona (IFNy) e fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) também estão envolvidas na inflamação da asma e outras doenças respiratórias inflamatórias. Como descrito acima, foi demonstrado que o composto 1 é um potente inibidor das enzimas JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2 e potente inibição de citocinas pró-inflamatórias nos ensaios celulares.

[00127] A atividade anti-inflamatória de inibidores de JAK foi demonstrada em modelos pré-clínicos de asma (Malaviya et al., Int Immunopharmacol, 2010, 10, 829,-836;

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Matsunaga et al., Biochem Sind Biophys B.es Comuiun, 2011, 404, 261-267; Kudlacz et al., Eur J Pharmacol, 2008, 582, 154161.) Assim, espera-se que o composto 1 seja útil para ο tratamento de distúrbios respiratórios inflamatórios, em particular, a. asma. A inflamação e fibrose do pulmão é característica de outras doenças respiratórias além, de asma como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC), pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome de angústia respiratória aguda, bronquite, enfisema e bronquiolite obliterante. Espera-se, portanto, que o composto 1 seja útil para o tratamento da doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome de angústia respiratória aguda, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante e sarcoidose.

[0012 8] Em. um aspecto, portanto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença respiratória em um mamífero (por exemplo, um humano), o método compreendendo a administração de 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4fluoro-l.H-indazol-3-il) -1,4, 6, 7-tetraidro-5H-imidazo [4,5c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico a um. mamífero.

[00129] Em um aspecto, a doença respiratória é asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC), pneumonite, doenças pulmonares intersticiais (incluindo fibrose pulmonar idiopática), lesão pulmonar aguda, síndrome de angústia respiratória aguda, bronquite, enfisema, bronquiolite obliterante e sarcoidose. um our.ro

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45/117 aspecto, a doença respiratória é asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica.

[00130] Em outro aspecto, a doença respiratória é uma infecção pulmonar, uma infecção por helminto, hipertensão arterial pulmonar, sarcoidose, linfangioleiomiomatose, bronquiectasia ou uma doença pulmonar infiltrativa. Em outro aspecto, a doença respiratória é a pneumonite induzida por fármacos, pneumonite induzida por fungo, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonite por hipersensibilidade, granulomatose eosinofilica com. poliangiite, pneumonia eosinofilica idiopática aguda, pneumonia eosinofilica idiopática crônica, síndrome hipereosinofílica, síndrome de Loffler, bronquiolite obliterante com pneumonia em organização ou pneumonia.

[001311 A invenção fornece um método para tratar asma em um mamífero, o método compreendendo administrar um composto farmacêutico compreendendo 1-(2-( 6-(2-etil-5-fluoro~4hidroxifenil)-4-fluoro-lH-indazol-3-il)-1,4, 6, 7-tetraidro-5Himidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico a um mamífero.

[00132] O composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis para tratar doenças pulmonares eosinofílicas. A inflamação eosinofilica das vias aéreas é uma característica de doenças coletivamente denominadas doenças pulmonares (Cottin et al., Clin. Chest. Med., 2016, 37(3), 535-56). As doenças eosinofílicas estão associadas com sinalização de IL-4, IL-13 e IL-5. As doenças pulmonares eosinofílicas incluem infecções (especialmente infecções helmínticas), pneumonite induzida por fármacos

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46/117 (induzidas por exemplo, por fármacos como antibióticos, fenitoína ou 1-triptofano), pneumonite induzida por fungos (p.e x., aspergilose broncopulmonar alérgica), pneumonite por hipersensibilidade e granulomatose eosinofilica com poliangiite (anteriormente conhecida como síndrome de ChurgStrauss). As doenças pulmonares eosinofílicas de etiologia desconhecida incluem pneumonia eosinofilica idiopática aguda, pneumonia eosinofilica idiopática crônica, síndrome hipereosinofílica e síndrome de Lõffler.

[00133] O composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis para tratar HAP. Um polimorfismo no gene da IL-6 tem sido associado com elevados níveis de IL-6 e um risco aumentado de desenvolvimento de hipertensão arterial pulmonar (HAP) (Fang et al., J Am Soc Hypertens., 2017, 11(3), 171-177). Corroborando com o papel da IL-6 na HAP, a inibição da cadeia do receptor de IL-6 gp!30 melhorou a doença em um modelo de rato de HAP (Huang et al. , Can J Cardiol., 2016, 32 (11), 13 5 6.e1-13 5 6.e10) .

[00134] O composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis para tratar doenças pulmonares não alérgicas, como sarcoidose e linfangioleiomiomatose. As citocinas como ΙΡΝγ, IL-12 e IL-6 estão envolvidas em uma variedade de doenças pulmonares não alérgicas como sarcoidose e linfangioleiomiomatose (ElHashemite et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2005, 33, 227-230, e El-Hashemite et al., Cancer Res._f 2004, 64, 34363443) .

[00135] O composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis no tratamento de

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47/117 bronquiectasias e doenças pulmonares infiltrativas que são doenças associadas à inflamação neutrofílica crônica.

Algumas citocinas estão associadas a inflamação neutrofílica (p. ex., IL~6, IFNy) .

[00136] A ativação patológica das células T é fundamental na etiologia de várias doenças respiratórias. As células T autorreativas desempenham um papel na bronquiolite obliterante com pneumonia em organização (também chamada BOOP). Similar à BOOP, a etiologia das rejeições de transplante pulmonar está associada a uma ativação aberrante da ativação das células T dos receptores pelo pulmão transplantado do doador. As rejeições de transplante pulmonar podem ocorrer cedo como disfunção primária do enxerto (PGD), pneumonia em organização (PO), rejeição aguda (RA) ou bronquiolite linfocítica (BL) ou podem, ocorrer anos após o transplante pulmonar como disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD). A CLAD era anteriormente conhecida como bronquiolite obliterante (BO), mas agora é considerado uma sindrome que pode ter diferentes manifestações patológicas incluindo BO, CLAD restritiva (rCLAD ou RAS) e disfunção neutrofílica do enxerto. A disfunção crônica do enxerto pulmonar (CLAD) é um grande desafio para o manejo em. longo prazo dos receptores de transplante pulmonar, pois ela faz com que o pulmão transplantado perda sua funcionalidade de forma progressiva (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185-191). A CLAD é pouco sensível ao tratamento e, portanto, permanece a necessidade de compostos eficazes capazes de prevenir ou tratar esta condição. Várias citocinas dependentes de JAK, como IFNy e IL-5 são superreguladas na CLAD e na rejeição do transplante de

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48/117 pulmão (Berastegui et al, Clin Transplant. 2017, 31, el2898). Além disso, altos níveis de quimiocinas CXCR3 pulmonares como CXCL9 e CXCL10 que estão downstream (a jusante) à sinalização de IFN dependente de JAK estão relacionados a piores desfechos nos pacientes submetidos a transplante de pulmão (Shino et al, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). Foi demonstrado que a inibição de JAK é eficaz na rejeição do transplante renal (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). Portanto, o composto 1 tem o potencial para ser eficaz no tratamento ou prevenção do transplante pulmonar e CLAD. Eventos similares à ativação de células T como descrito como a base para a rejeição do transplante pulmonar também são considerados o principal fator da doença do enxerto contra o hospedeiro pulmonar (DECH) que pode ocorrer após transplante de células-tronco hematopoéticas. Similar à CLAD, a DECH pulmonar é uma condição progressiva com desfechos extremamente fracos e não existe tratamento atualmente aprovado. Um. estudo de pesquisa multicêntrico, retrospectivo de 95 pacientes com DECH aguda ou crônica refratária à esteroide que receberam o inibidor sistêmico de JAK ruxolitini.be como terapia de resgate demonstrou resposta completa ou parcial para ruxolitinibe na. maioria, dos pacientes, incluindo aqueles com. DECH pulmonar (Zeiser et al, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). Mais recentemente, o inibidor do ponto de verificação imunológico induziu pneumonite, outra doença pulmonar mediada por célula T surgiu com. o uso crescente de inibidores de ponto de verificação imunológico. Os pacientes com câncer tratados com esses agentes estimulantes de células T podem

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49/117 desenvolver pneumonite fatal. 0 composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico tem o potencial de apresentar um novo tratamento para essas doenças respiratórias graves desassistidas.

Doenças gastrointestinais

[00137] Como inibidor de JAK, o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis para uma variedade de outras doenças. O composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser úteis para várias indicações inflamatórias gastrointestinais que incluem, mas não estão limitados a, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa (proctosigmoidite, pancolite, proctite ulcerativa e colite do lado esquerdo), Doença de Crohn, colite colagenosa, colite linfocítica, Doença de Behcet, doença celíaca, colite induzida por inibidor do ponto de verificação imunológico, ileite, esofagite eosinofílica, colite relacionada à doença enxerto versus hospedeiro e colite infecciosa. Colite ulcerativa (Reimund et al,, J Clin Immunology, 1996, 16, 144-150), doença de Crohn (Woywodt et al., Eur J Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), colite colagenosa (Kumawat et al., Mol Immunology, 2013, 55, 355-364), colite linfocítica (Kumawat et al., 2013), esofagite eosinofílica (Weinbrand-Goichberg et al., rmmunol Res, 2013, 56, 249-260), colite relacionada à doença enxerto versus hospedeiro (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 32683276), colite infecciosa (Stallmach et al., Int J Colorectal Dis, 2004, 19, 308-315), doença de Behcet (Zhou et al., Autoímmun Rev, 2012, 11, 699-704), doença celíaca (de Nitto et al.. World J Gastroenterol, 2009, 15, 4609-4614), colite induzida por inibidor (ponto de verificação) checkpoint

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50/117 imunológico (p. ex., colite induzida por inibidor de CTLA-4; (Yano et al., J Translation Med, 2014, 12, 191), ou colite induzida por inibidor de PD-1- ou PD-L1) e ileite (Yamamoto et al., Dig Liver Dis, 2008, 40, 253-259) são caracterizadas pela elevação dos níveis de algumas citocinas próinflamatórias. Como muitas citocinas pró-inflamatórias sinalizam via ativação de JAK, o composto 1 ou um. sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser capazes de aliviar a inflamação e fornecer alívio para seus sintomas. Em particular, o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser úteis para a indução e manutenção da remissão da colite ulcerativa inespecífica, e para o tratamento da doença de Crohn, colite induzida por inibidor de checkpoint (ponto de verificação) imunológico, e os efeitos adversos gastrintestinais da doença enxerto versus hospedeiro. Em um aspecto, portanto, a invenção fornece um método para tratar uma doença gastrointestinal inflamatória em. um mamífero (por exemplo, humano), o método compreendendo a administração ao mamífero do composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico e o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de v .1 s t a f a rma c ê u 11. c o .

Outras doenças

[00138] 0 composto 1 ou um. sal. aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser úteis para o tratamento de outras doenças como doenças inflamatórias, doenças autoimunes ou cânceres.

[00139] O composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico podem ser úteis para o tratamento de um

Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 77/160 ou mais de artrite, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, rejeição de transplante, xeroftalmia, artrite psoriática, diabetes, diabetes insulina dependente, doença do neurônio motor, síndrome mielodisplásica, dor, sarcopenia, caquexia, choque séptico, lúpus eritematoso sistêmico, leucemia, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogênica aguda, espondilite anquilosante, mielofibrose, linfoma de células B, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer de mama, mieloma múltiplo, melanoma, linfoma não Hodgkin, câncer de célula não pequena do pulmão, câncer de células claras do ovário, tumor ovariano, tumor de pâncreas, policitemia vera, síndrome de Sjoegrens, sarcoma de partes moles, sarcoma, esplenomegalia, linfoma de células T e talassemia maior.

Terapia combinada

[00140] Os compostos da divulgação ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico também podem ser usados combinados com. um ou mais agentes que agem, pelo mesmo mecanismo ou por mecanismos diferentes para tratar uma doença. Os diferentes agentes podem ser administrados em sequência ou simultaneamente, em composições separadas ou na mesma composição. As classes úteis de agentes para terapia combinada incluem., mas não estão limitadas a, antiangiogênico, esteroide, anti-inflamatório, inibidor da calicreina plasmática, inibidor do fator de crescimento da placenta, inibidor do ligante VEGF-A, inibidor do ligante da angiopoietina~2, inibidor da proteína tirosina fosfata.se beta, estimulador do receptor da tirosina quinase Tek, inibidor de calcineurina, inibidor de ligante VEGF, inibidor

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52/117 do complexo mTOR 1, inibidor do mTOR, antagonista da IL-17, modulador de calmodulins, antagonista do receptor FGF, antagonista do receptor PDGF, antagonista do receptor VEGF, inibidor do ligante alfa-TNF, agente ligante TNF, estimulador da proteoglicana 4, inibidor do ligante VEGF-C, inibidor do ligante VEGF-D, antagonista da CD126, inibidor da cascata do complemento, agonista de glicocorticoide, inibidor do fator C5 do complemento, antagonista do receptor de canabinoide, modulador do receptor-1 de esfingosina-l-fosfato, modulador do receptor-3 de esfingosina-l-fosfato, modulador do receptor-4 de esfingosina-l-fosfato,modulador do receptor 5 da esfingosina-l-fosfato, inibidor da acetaldeido desidrogenase, inibidor da tirosina quinase Flt3, inibidor da tirosina quinase Kit, inibidor da proteína quinase C, ligante do hormônio adrenocorticotrófico, inibidor do ligante do fator 1 derivado das células estromais, agonista da imunoglobulina Gl; inibidor do ligante da interleucina-1 beta, estimulador da mucina; modulador do fator nuclear kappa B, estimulador da proteína-4 dos linfócitos T citotóxicos, inibidor da glicoproteína CD28 da superfície da célula T, estimulador da lipoproteina lipase; agonista do PPAR-alfa, agonista do receptor A3 da adenosina, antagonista do receptor da angiotensina II, antagonista do receptor VEGF, ligante da betainterferona, modulador SMAD-2; inibidor de ligante TGF beta 1, agonista do receptor de somatostatina, inibidor da subunidade alfa do receptor IL-2, inibidor de ligante de VEGF-B, antagonista do receptor de timosina beta 4, antagonista do receptor AT-1 da angiotensina II, antagonista da quimiocina CCR2, inibidor da amino oxidase com cobre de membrana, antagonista de CDlla, inibidor de ICAM-1,

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53/117 antagonista do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1, inibidor da calicreina, estimulador da fucosiltransferase 6, modulador da GDP-fucose sintase, inibidor do gene GHR, inibidor do gene IGF1, antagonista do receptor VEGF-1, agonista da albumina, antagonista da IL-2, antagonista do CSF-1; antagonista do receptor PDGF, antagonista do receptor VEGF-2, inibidor do mTOR, agonista de PPAR-alfa, inibidor de Rho GTPase, inibidor da Rho quinase associado à proteína, inibidor do complemento C3, inibidor do fator de transcrição EGR-1, modulador do fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator, inibidor do fator nuclear kappa B, antagonista da integrina alfa-V/beta-3, agonista do receptor de eritropoietina, agonista do peptideo semelhante ao glucagon 1, estimulador do gene TNFRSF1A, inibidor do ligante 2 da angiopoietina, inibidor da alfa 2-antiplasmina, antagonista do colágeno, inibidor da fibronectina, antagonista da laminina, estimulador do plasmina, ligante do fator de crescimento nervoso, antagonista do receptor FGF1, antagonista do receptor FGF3, inibidor da tirosina quinase itk, inibidor da tirosina quinase Lck, inibidor da tirosina quinase Ltk, antagonista do alfa- receptor PDGF, antagonista do beta-receptor PDGF, inibidor da proteína tirosina quinase, antagonista do receptor VEGF-3, inibidor da amino oxidase com. cobre de membrana, agonista do receptor de somatostatina subtipo 2, agonista do receptor de somatostatina subtipo 4, agonista do receptor de somatostatina subtipo 5, inibidor da proteína quinase C alfa, inibidor da proteína quinase C beta, inibidor da proteína quinase C delta, inibidor da proteína quinase C épsilon inibidor da proteína quinase C eta, inibidor da proteína quinase C teta, modulador da anquilrina,

Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 80/160 estimulador da mucina, agonista do purinoceptor P2Y2, inibidor da proteína alfa-Γι. da junção gap, antagonista da quimiocina CCR3; inibidor do ligante da eotaxina, inibidor do canal de sódio sensível à amilorida, antagonista do receptor PDGF, inibidor da proteína tirosina quinase, inibidor da proteína do epitélio pigmentar da retina, inibidor da metaloprotease da matriz, antagonista do receptor PDGF, antagonista do beta-receptor PDGF, inibidor do ligante PDGFB, antagonista do receptor do hormônio do crescimento, inibidor da molécula de adesão celular, modulador de integrina, antagonista da quimiocina. CX.CR4, domínio de bobina enrolada contendo inibidor de proteína, modulador do Hsp 90, inibidor da Rho quinase associado à proteína, inibidor do gene VEGF, inibidor da endoglina, antagonista da quimiocina CCR3, modulador do canal de potássio maxi K, estimulador do canal de potássio maxi K, agonista de PGF2 alfa, agonista do receptor para prostanoide, modulador do canal 2 de cloreto dependente de voltagem, antagonista do receptor C5a do complemento, inibidor da inosina monofosfato desidrogenase, inibidor do ligante da interleucina 18, estimulador do canal catiônico TRP M8, agonista do receptor CNTF, inibidor do gene TRPV1, estimulador da desoxirribonuclea.se I, inibidor do gene IRS1, inibidor da Rho quinase associado à proteína, inibidor da poli ADP ribose polimerase 1, inibidor da poli ADP ribose polimerase 2, inibidor da poli ADP ribose polimerase 3, agonista do vaniloide VR1, estimulador do gene NFAT5, estimulador de Mucina, inibidor da tirosina quinase Syk, agonista do alfa 2 adrenoceptor, inibidor da ciclo-oxigenase, inibidor da deposição de proteína amiloide, inibidor da glicogênio sintase quinase-3, estimulador de PARP, inibidor

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55/117 da deposição de tau, inibidor do gene DDIT4, modulador da síntese de hemoglobina, inibidor do ligante da interleucina-1 beta, antagonista do TNF, estimulador do canal de potássio KCNQ dependente de voltagem, antagonista do receptor NMDA, inibidor da ciclo-oxigenase 1, inibidor da ciclo-oxigenase, agonista do receptor 5-HT la, inibidor do canal de cálcio, modulador do ligante FGF-2, inibidor do fosfoinositol 3quinase, antagonista do CD44, modulador da hialuronidase, agonista do ácido hialurônico, antagonista da IL-1, antagonista do receptor da IL-1 tipo I, inibidor do fator de complemento P, antagonista da tubulina, antagonista da beta amiloide, estimulante do gene IL2, inibidor beta da quinase I-kappa B, modulador do fator nuclear kappa B, inibidor do ativador do plasminogênio 1, ligante de FGF-2, modulador da protease e modulador da corticotropina.

[00141] Os agentes específicos que podem ser usados combinados com o atual composto inibidor de JAK incluem, mas não estão limitados a, lanadelumabe, aflibercepte, RG-7716, AKB-9778, ciclosporina, bevacizumabe, everolimo, secukinumabe, fluocinolona acetonida, RP-101, lactato de esqualamina, lubricina humana recombinante, OPT-302, sarilumabe, dexametasona, eculizumabe, fingolimode, adalimumabe, reproxalape, midostaurina, corticotropina, olaptesed pegol, canakinumabe, recoflavona, abatacepte, fenofibrato, piclidenoson, OpRegen, candesartana, golimumabe, pegaptanibe, betainterferona, disitertide, acetato de octreotato, anecortave, basiliximabe, triancinolona acetonida supracoroidal, RGN-259, di fluprednato, HL-036, avacincaptad pegol sódico, irbesartana, propagermânio, triancinolona acetonida, azitromicina, BI-1467335, lifitegraste, etabonato

Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 82/160 de loteprednol, teprotumumabe, KVD-001, TZ-101, atesidorsen, Nov-03, bevacizuma.be, AVA-101, RU-101, voclosporina, vorolanibe, sirolimo, fenofibrato de colina, VX-210, APL-2, CPC-551, elamipretide, SF-0166, cibinetida, elamipretide, 1iragluti da, EYS- 6 0 6, ne svacumabe, a flibercepte, ocriplasmina, filgotinibe, cenegermina, adipocell, brolucizumabe, ranibizumabe, aflibercepte, terapia fotodinâmica com padeliporfina, pazopanibe, ASP-8232, veldoreotide, sotrastaurina, abicipar pegol, diquafosol tetrassódio, HCB-1019, conbercepte, bertilimumabe, SHP-659, THR-317, ALK-001, PAN-90806, alfa-2b-interferona, fluocinolona, malato de sunitinibe, emixustate, hi-conl, TB403, minociclina, células MA09-hRPE, pegpleranibe sódico, pegvisomante, luminate, burixafor, H-1129, carotuxima.be, AXP 1275, ranibizumabe, isopropil unoprostona, tesidolumabe, micofenolato de sódio com revestimento entérico, tadekinig alfa, triancinolona acetonida, ciclosporina, ST-266, 7WX-012 NT-501-ECT, tivanisiran, verteporfina, alfa-dornase, aganirsen, ripasudil, fosfato de rucaparibe, zucapsaicina, tetratiomolibdato, diclofenaco, LHA-510, AGN-195263, tacrolimo, rebamipida, R-348, tartrato de brimonidina, vizomitina, T-89, LME-636, BI-1026706, rimexolona, tobramicina, TOP-1630, talaporfina, bronfenaco sódico, triancinolona acetonida, davunetida, etabonato de loteprednol, XED-60, EG-Mirotin, APD-209, adenovir, PF04523655, hidroxicarbamida, navamepente, retinalamina, CNTO2476, ranibizumabe, flupirtina, B27PD, S-646240, GLY-230, hidralazina, nepafenaco, DexNP, Trealose, ácido hialurônico, depósito de liberação sustentada de dexametasona-Ca, naluzotano, hialuronidase, hialuronato de sódio, isunakinra,

Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 83/160 somatostatins, CLG-561, OC-IOX, UCA-002, fator de crescimento epidérmico humano recombinante, pemirolaste, VM-100, MB11316, al fa-luminol monossódico, ranibizumabe, IMD-1041, LMG324, HE-10, cinialuronato de sódio, BDM-E, células p r e cu r s o r a s me s e n qu imai s, d i s s u1f i r am, C T C-9 6, PG-101, Beifushu, quimotripsina.

[001421 Aqui também é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um ou mais agentes terapêuticos. O agente terapêutico pode ser selecionado da classe de agentes especificados acima e da lista de agente específico descrita acima. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da invenção é adequada para liberação para os olhos. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é um líquido ou uma composição em. suspensão.

[00143] Além disso, em um aspecto do método, a invenção fornece um método para tratar uma doença ou desordem em um mamífero compreendendo a administração ao mamífero do composto 1 ou um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico e um ou mais agentes terapêuticos.

[00144] Quando usado em combinação terapêutica, os agentes poderão ser formulados em uma única composição farmacêutica, ou os agentes podem ser fornecidos em diferentes composições que são administradas simultaneamente ou em tempos distintos, pela mesma via ou por diferentes vias de administração. Tais composições podem ser acondicionadas separadamente ou podem ser acondicionadas como um kit. Os dois ou mais agentes terapêuticos no kit podem ser administrados pela mesma via de administração ou por diferentes vias de administração.

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EXEMPLOS

[00145] Os exemplos sintéticos e biológicos a seguir são fornecidos para ilustrar a invenção, e não são para ser interpretados de qualquer forma, como uma limitação do escopo da invenção. Nos exemplos abaixo, as abreviaturas têm. os seguintes significados, a menos que seja indicado de outra forma. As abreviaturas não definidas abaixo têm seus significados aceitos.

ACN = acetonitrila

DCC = dicicloexilcarbodiimida

DIPEA = N, AFdi-isopropietilamina

DMAc = dimetilacetamida

DMF = N, AZ-dimetiltormamida

DMSO = dimetilsulfóxido

EtOAc == acetato de etila

HATU = hexafluorofosfato de Ν,Ν,Ν' ,N'-tetrametil-O(7-azabenzotriazol-l-il)urônio

LDA = di-isopropilamida de litio min. === minuto(s)

MTBE = éter metil tert-butílico

NBS = N-bromossuccinimida

NMP = N-metil-2-pirrolidona

TA = temperatura ambiente

THF === tetraidrof urano bis(pinacolato)diboron = 4,4,5, 5, 4', 4',5’,5’-octametil[2,2']bi[[1,3,2]dioxaborolanil]

Pd (dppf) CÍ2“CH₂C12 = complexo de dicloro (1,1'~ bis(difenilofosfino)-ferroceno)dipaládio(II) com diclorometano

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[001461 Qs reagentes e solventes foram comprados de fornecedores comerciais (Aldrich, Fluka, Sigma etc.), e usados sem purificação. O progresso da mistura da reação foi monitorado por cromatografia em camada fina (TLC), cromatografia liquida de alta eficiência analítica (CLA.E/HPLC analítica) e espectrometria de massa. As misturas da reação foram trabalhadas como descrito especificamente em cada reação; foram purificadas por métodos de extração e outros de purificação, como cristalização e precipitação dependentes de temperatura e solvente. Além disso, as misturas da reação foram, purificadas por cromatografia em coluna ou HPLC preparativa, geralmente usando empacotamento C18 ou BDS de coluna e eluentes convencionais. As condições típicas de HPLC preparativa estão descritas abaixo.

[00147] A caracterização dos produtos da reação foi feita usando espectrometria de massa e ¹H-RMN. Para análise por PMN, as amostras foram dissolvidas; em solventes deuterados (como CD3OD, CDCI3, ou dg-DMSO) , e foram, adquiridos os espectros de ^H-RMN com o instrumento Varian Gemini 2000 (400 MHz) sob condições de observação padrões. A identificação por espectrometria de massa dos compostos foi feita por um. método de ionização por electrospray (ESMS) com. um. instrumento da Applied Biosystems, (Foster City CA) modelo A.PI 150 EX ou um instrumento da Waters (Milford, MA) 3100, acoplados a sistemas de autopurificação.

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Condições da HPLC ρ r e p a. r a t i v a

Coluna:

C18 , 5 pm.. 21,2 x 15 0 mm ou C18 , pm 21 x 250 ou C14, 5 pm 21x150 mm

Temperatura da coluna:

Vazão do fluxo:

Fases móveis:

Volume de injeção:

Comprimento de onda d?

Temperatura ambiente 20,0 ml/min.

A = Água + 0,05% TFA B = ACN + 0,05% TFA, (100-1500 pl)

214 nm.

detector:

[001481 Os compostos brutos foram dissolvidos em. 1:1 de água:ácido acético em cerca de 50 mg/ml. Uma corrida de 4 minuto de escala analítica de teste toi realizada usando uma coluna C18 2,1 x 50 mm, seguida de uma corrida de escala preparativa de 15 ou 20 minutos usando injeção de 100 pL com 0' gradiente baseado na retenção de % B da corrida da escala analítica de teste. DOs gradientes precisos dependiam da amostra. .Amostras com impurezas com tempos de retenção próximos foram verificadas com uma coluna C18 21 x 250 mm e/ou coluna C14 21 x 150 mm para melhor separação. A/s frações com o produto desejado foram identificadas por análise de espectrometria de massa.

Preparação 1: 2-(4-(benziloxi)-2-etil-S-fluorofenil)4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolano (1-5)

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[0014 9] Duas reações foram realizadas em. paralelo e combinadas para o trabalho. Uma mistura de 5-bromo-2fluorofenol (1—1) (850 g, 4,5 mol), brometo de benzila (837 g, 4,9 mol) e carbonato de potássio (923 g, 6,7 mol) em ACN (5 L) foi agitada a 20 °C durante 12 h. As reações foram combinadas e concentradas, diluídas com. água (8 1) e extraídas com EtCAc (3 x 3 1). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura (3 L), seca sobre sulfato de sódio e concentrada. O produto bruto foi purificado através de um bloco de silica gel (eluição com. 3:1 éter de petróleo:EtCAc) para produzir o titulo intermediário (1,83 kg, rendimento de 73%) como um sólido branco. RMN Hí (4 00 MHz, CDC1₃) δ 7,38-7,4 6 (m, 5H) , 7,15 (dd, J ------ 7,6, 2,0 H z, 1H) , 6,98-7,15 1, m, 1H) , 5, 12 ( s, 2 H ,1 .

(b) 2-(Benziloxi)-4-etil-l-fluorobenzeno (1-3)

[00150Ί Seis reações foram realizadas em paralelo e combinadas parva o trabalho. A uma solução do produto da etapa anterior (200 g, 711 mmol) em THE (100 ml) foi adicionado carbonato de potássio (197 g, 1,4 mol). A mistura reacional foi purgada com nitrogênio 3 vezes, seguida pela adição de Pd (dppf) CI2-CH2CI2 (11,6 g, 14,2 mmol). A mistura reacional foi resfriada a 0 °C, foi adicionado dietilzinco (1 M, 1,07 1) gota a gota e a mistura reacional foi agitada a 70 °C durante 1 h. As reações foram combinadas, resfriadas a 20 °C e despejadas em água (7 1) lentamente. À mistura foi adicionado aq. 4 M HC1 para pH 6. A camada orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída com EtCAc (3 x 2 1). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura (5 1), seca sobre sulfato de sódio, concentrada e purificada através de um bloco de silica gel (eluído com 50:1 éter de

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62/117 petróleo :EtOAc) para produzir o titulo intermediário (900 g,

92% de rendimento) como um óleo amarelo claro. RMN ¹H (400 MHz, CDCI3) δ 7,29-7,43 (m, 5H) , 6, 94-6, 97 (m, 1H) , 6,82 (d, J -------- 8,0 Hz, 1H) , 6,70 (m, 1H) , 5,09 (s, 2H) , 2,522,58 (m, 2H) , 1,17 (t, J = 7,6 Hz, 3H) .

(c) 1-(Benziloxi)-4-bromo-5~etil-2-fluorobenzeno (1-4)

[00151] Quatro reações foram realizadas em paralelo e combinadas. A uma solução de 2-(benziloxi)-4-etil-lfluorobenzeno(1-3) (293 g, 1,3 mol) em AON (1 1) foi adicionado NBS (249 g, 1,4 mol) em. porções a 20 °C. A mistura reacional foi agitada a 20 ^UC durante 2 h. As misturas reacionais foram combinadas e concentradas. O resíduo foi diluído com água (5 1) e extraído com EtOAc (2 x 5 1). A camada orgânica foi lavada com salmoura (4 1), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia em silica gel (eluição com 100:1 - 10:1 éter de petróleo: EtOAc) para produzir o título intermediário (1,4 kg, rendimento de 89%) como óleo amarelo claro. RMN ^:lH (400 MHz, CDCI3) δ 7,29-7,38 (m, 5H) , 7,2 (d, J = 10,4 Hz, 1H) , 6,8 (d, J ------- 8,8 Hz, 1H) , 5,0 6 (s, 2H) , 2,6 (q, J ------- 7,6 Hz, 2 H) , 1,1 (t, J= 7,6 Hz, 3H) .

(d) 2-(4-(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5

t.etrametil-1,3, 2-dioxaborolano (1-5)

[00152] Sete reações foram realizadas em paralelo e combinadas para o trabalho. A uma solução do produto da etapa anterior (200 g, 647 mmol) em dioxano (2 1) foi adicionado acetato de potássio (190 g, 1,9 mol), bis(pinacolato)diboron (181 g, 712 mmol) e Pd(dppf)CI2-CH2CI2 (10,6 g, 12,9 mmol) sob nitrogênio a 20 °C. A mistura foi

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63/117 agitada a 120 °C durante 2 h. As misturas reacionais foram combinadas, concentradas, diluídas com. água (5 1) e extraídas com EtOAc (3 x 4 1) . A. camada orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada sob vácuo. O produto bruto foi purificado por cromatografia em. silica gel (eluição 1:0 - 5:1 éter de petróleo: EtOAc) para produzir o título composto (1,35 kg, 84% de rendimento) como um sólido branco. PÍMN H-I (400 MHz, CDC1₃) δ 7,33-7,51 (m,

6H) , 6,82 (d, J= 1,6 Hz, 1H) , 5,17 (s, 2H) , 2,85 (q, J =

7,6 H z, 2 H) , 1,33 ( s, 12 H) , 1, 15 (t, J = /, 6 H z, 3 H) .

Preparação 2: l-Benzil-4-imino-l,4-di-idropiridin-3amina (2)

[00153] A uma solução de piridina-3,4-diamina (400 g, 3,67 mol) em ACN (3 L) foi adicionado brometo de benzila (596 g, 3,49 mol) em porções a 0 °C e a mistura reacional foi agitada durante 30 min. e depois a 20 °C durante 12 h e filtrada. O material insolúvel foi lavado com ACN (500 ml) e seco para produzir o sal HBr do título composto (600 g, 2,14 mol, 58% rendimento) como um pó branco. RMN ³H (400 MHz, MeOD) δ 7,83 (d, J= 5,6 Hz, 1H) , 7,64 (s, 1H) , 7,32-7,4 0 (m, 5H) , 6,76 (d, J = 6,8 Hz, 1H) , 5,28 (s, 2H).

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Preparação 3: 6“(4-(Benziloxi)-2-etil“5-fluorofenil)-4f luoro-lJf-indazol-3-carbaldeido (3)

(3-1)

[00154] Nove reações foram realizadas em paralelo e combinadas para o trabalho. Uma solução de l-bromo-3,5difluorobenzeno (100 g, 518 mmol) em THF (700 ml) foi desgaseifiçada e purgada com nitrogênio três vezes. Então foi adicionado 2 M LDA (311 ml) a -70 °C e a mistura reacional foi agitada a -70 °C durante 0,5 h sob nitrogênio. Uma solução de etil 2,2-dietoxiacetato (96 g, 544 mmol) em THF (200 ml) foi adicionada gota a gota a -70 °C sob nitrogênio e a mistura reacional foi agitada durante 1 h. As reações foram combinadas e vertidas em cloreto de amônio saturado em gelo (10 1) em porções e extraídas com. EtOAc (3 x 3 1) . A camada orgânica foi separada, lavada, com salmoura (5 1), seca sobre sulfato de sódio, concentrada e purificada

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65/117 com cromatografia em silica, gel (eluido com 1:0 - 100:1 éter de petróleo :EtOAc) para produzir o titulo intermediário (1,26 kg, 84% de rendimento) como um óleo amarelo. RMN ²Η (4 00 MHz, CDCI3) δ 7,12 (d, J == 7,2 Hz, 2H) , 5,15 (s, 1H) , 3, 61 — 3, / (,m, 4H) , 1,2 (t, J = 7,2 Hz, ÓH) .

(b) 1-(4'-(benziloxi)-2'-etil-3, 5,5’-trifluoro-[1,1’bifenil]-4-il)-2,2-dietoxietan-l-ona (3-2)

[00155] Cinco reações foram realizadas em paralelo e combinadas para o trabalho. A. uma mistura de l-(4-bromo-2,6difluorofenil)-2,2-dietoxietan-l-ona (3-1) (189 g, 586 mmol) em etanol (150 ml) e tolueno (1,5 L) foi adicionada água (150 ml), carbonato de sódio (84,8 g, 800 mmol) e 2-(4(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-l,3,2dioxaborolano (1-5) (190 g, 533 mmol) a 20 °C. A suspensão foi desgaseificada sob vácuo e purgada com. nitrogênio várias vezes. Pd (dppf) CI2--CH2CI2 (13 g, 16 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi purgada com nitrogênio várias vezes e agitada a. 120 °C durante 2 h. As reações foram, combinadas, resfriadas a 2 0 °C, despejadas em água (5 1) e extraídas com. EtOAc (3 x 4 L).. As camadas orgânicas foram lavadas com salmoura (5 L), secas sobre sulfato de sódio, filtradas, concentradas e purificadas com cromatografia em silica gel (eluido com 100:1 - 5:1 éter de petróleo: EtOAc) para produzir o título intermediário (880 g, 70% de rendimento) como um óleo amarelo. RMN ¹H (400 MHz, CDCI3) δ 7,36-7,48 (m, 5H) , 6, 94-6, 96 (m, 2H) , 6, 86-6, 92 (m, 2H) , 5,29 (s, 1H) , 5,19 ( s, 2 H) , 3,6/-3,/7 (m, 4 H) , 2,52 (, q, J = 7,6 H z, 2 H) , 1,25 (t, J= 6,8 Hz, 6H) , 1,07 (t, J= 7,2 Hz, 3H) .

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66/117 (c) 6-(4-(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3(dietoximetil)-4-fluoro-lH-indazol (3—3)

[00156] Quatro reações foram realizadas em paralelo e combinadas para o trabalho. A uma solução do produto da etapa anterior (220 g, 466 mmol) em THF (2 1) foi adicionada hidrazina monoidrato (47,6 g, 931 mmol) a 20 °C. A mistura reacional foi agitada a 100 °C durante 12 h. Quatro reações foram combinadas e resfriadas a 20 °C e concentradas. O resíduo foi dissolvido com EtOAc (5 ml) e lavado com. 0,1 HC1 (2 x 1,5 1) . As camadas orgânicas combinadas foram, lavadas com salmoura (1,5 1), secadas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas para dar o titulo intermediário (900 g, bruto) como goma amarela, que foi usada diretamente na próxima etapa. RMN (400 MHz, CDCI3) δ 7,36-7,48 (m, 5H) , 6, 94-6, 96 (m, 2H) , 6, 86-6, 92 (m, 2H) , 5,29 (s, 1H) , 5,19 (s, 2H) , 3, 67-3, 77 (m, 4H) , 2,52 (q, J ------- 7,6 Hz, 2H) , 1,2 5 (t, J -------- 6,8 Hz, 6H) , 1,07 (t, J ------ 7,2 Hz, 3H) .

(d) 6-(4-(Benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fIuoro-1Hindazol-3-carbaldeído (3)

[001571 Três reações foram realizadas em paralelo e combinadas para o trabalho. A uma solução do produto da etapa anterior (300 g, 643 mmol) em acetona (1,5 1) foi adicionado 4 M HC1 (16 ml) gota a gota a. 20 °C e a mistura reacional foi. agitada a 20 °C durante 0,17 h. As reações foram, combinadas, concentradas, diluídas com MTBE (11) e filtradas. O material insolúvel foi lavado com MTBE (2 x 300 ml) e seco sob pressão reduzida para produzir o título intermediário (705 g, bruto) como um. sólido amarelo, que foi usado diretamente na próxima etapa, (m/z) : [M+HJ⁺ calculado para 393, 1 de C23H18F2N2O2 foi encontrado 393, 13. RMN -Ή (4 00 MHz, DMSO-dg) δ 14,51 (s, 1H) ,

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10,17 (d, J= 3,6 Hz, 1H) , 7,50 (d, J= 7,2 Hz, 2H) , 7,407,42 (m, 4H), 7,24 (d, J= 8,4 Hz, 1H) , 7,15 (d, J= 12,4 Hz,

1H) , 7,06 (d, J 8,4 Hz, 1H) , 5,25 (s, 2H) , 2,52-2,53 (m,

2H) , 1,03 (t, J 7,6 Hz, 3H) .

Preparação 4: S-Benzil-2-(6-(4-(benziloxi)-2-etil-Sfluorofenil)-4-fluoro-lH-indazol-3-il)-SH-imidazo[4,5 cjpiridina (4)

combinadas para o trabalho. A. uma solução de 6-(4 (benziloxi)-2-e t i 1 - 5 - f 1 u o r o f e n i 1)-4-f1uo ro-1H-i n d a z o 1-3 carbaldeido (3), o produto da Preparação 3 (172 g, 440 mmol) em DMF (1,1 1) foi adicionado bissulfito de sódio (68,6 g, 659 mmol) e l-benzil-4-imino-l,4-di-idropiridina-3-amina (2) (136 g, 484 mmol) a 20 °C e a mistura reacional foi agitada a 150 °C durante 2 h. As quatro reações foram combinadas e a mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi vertido em água (10 1) e filtrado. O material insolúvel foi seco sob pressão reduzida para produzir o título intermediário (990 g, bruto) como um sólido amarelo, que foi usado diretamente sem purificação, (m/z): [M+H]⁺ calculado para 572,2 de C35H27F2N5O foi encontrado 572,3.

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Preparação 5: 5-Benzil-2- (6- (4- (benziloxi) -2-etil-5fluorofenil) -4-fluoro-lH-indazol-3-il) -4,5,6,7-tetraidro-lHimidazo[4,5-c]piridina (5)

5

[00159] Três reações foram realizadas em paralelo e combinadas para o trabalho. A uma mistura de 5-benzil-2-(6(4-(benziloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-lH-indazol-3il)-Sn-imidazo[4,5-c]piridina (4), o produto da Preparação 4 (330 g, 577 mmol) em metanol (1,5 1) e THF (1 L) em boroidreto de sódio (267 g, 6,9 mol) em. porções a 20 °C e a mistura reacional foi agitada a 20 °C durante 24 h. As três reações foram combinadas e a mistura reacional foi adicionada à água (10 1), agitada durante 10 min. e filtrada. O filtrado foi extraído com. EtOAc (2 x 5 L) e a camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada sob vácuo. O produto bruto foi diluído com EtOAc (2 1), agitado durante 30 min. e filtrado. O material insolúvel foi lavado com MTBE (3 x 200 ml) para produzir o título intermediário (275 g, 28% de rendimento) como um sólido amarelo claro, (m/z): [M+H]+ calculado para 57 6,25 de C35H31F2N5O foi encontrado 57 6,3. RMN J-H (400 MHz, DMSO-dg) δ 7,50-7,52 (m, 2H) , 7,35-7,43 (m, 7H), 7,23-7,25 (m, 3H), 7,15 (d, J= 12,0 Hz, 1H), 6,81 (d, J ------- 12,0 Hz, 1H) , 5,25 (s, 2H) , 3,72 (s, 2H) , 3,43 (brs, s,

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2H) , 2,/8 (br, s, 2H) , 2,66 (br, s, 2H) , 2,5b (q, 2H) , 1,04 (t, J = 7,6 Hz, 3H) .

Preparação 6: 5~Etil~2~fluoro~4~(4“fluoro~3~(4,5,6,7 tetraidro-lH-imidazo [4,5-~dpiridin-2~il) - lH-m.nda.zo 1---6-il)fenol (6)

[001601 Cinco reações foram realizadas em paralelo e combinadas para o trabalho. A uma mistura de 5-benzil-2-(6(4- (benziloxi) ~2~etil~5-fluorofenil) ~4-fluoro~l.H--indazol~3il) ~4,5, 6, 7-~tetraidro-lH-~imidazo [4,5-~c] piridina (5), o produto da Preparação 5 (55 g, 95,5 nunol) em THF (500 ml) e metanol (500 ml) foi adicionado paládio sobre carbono (15 g, 9,6 mmol) e aq. 12 M HC1 (10 ml). A suspensão foi desgaseificada sob vácuo, purgada com hidrogênio várias vezes e agitada sob hidrogênio (50 psi) a 50 °C durante 12 h. A.s reações foram, combinadas e a mistura reacional foi filtrada. O filtrado foi concentrado sob vácuo para produzir o sal HC1 do título intermediário (150 g, bruto) como um sólido quase branco, (m/z): [M+H]⁺ calculado para 396,16 de C21H19F2N5O foi encontrado 396, 2. RMN ¹H (400 MHz, MeOD) δ

7,43 ( s, 1H) , 7,07 (O, J --- 11,6 Ηz, 1H) , 6,9 7 (d., J ---11,6

Hz, 1H) , 6,91 (d, J ------- 8,8 Hz, 1H) , 4,57 (s, 2H) , 3,74(s,

2H) , 3,24 (s, 2H) , 2,55 (q, J= 7,6 Hz, 2H) , 1,08 (t,J =

7,6 Hz, 3H) .

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Preparação 7: 2,5-dioxopirrolidin-l-i 2morfolinoacetato (7’)

(a) terc-Butil 2-morfolinoacetato (7-1)

[00161] A uma mistura de morfolina (160 g, 1,84 mol) e carbonato de potássio (381 g, 2,76 mol) em THF (3 1) foi adicionado terc-butil 2-bromoacetato (341 g, 1,75 mol) lentamente a 0 °C. A mistura reacional foi agitada durante 30 min. e então a 20 °C durante 12 h e concentrada. Foi adicionada água (1,5 1) e a mistura reacional foi extraída com EtOAc (3 x 1 1). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura (500 ml), seca sobre sulfato de sódio e concentrada para produzir o titulo intermediário (300 g, 81% de rendimento) como um óleo amarelo. RMN ¹H (400 MHz, CDCI3) δ 3,74 (t, J 4,8 Hz, 4H) , 3,10 (s, 2H) , 2,57 (t, J ------ 4,8

H z, 4 H) , 1,46 (s, 9H) .

(b) ácido 2-morfolinoacético (7’’)

[00162] Uma mistura do produto da etapa anterior (7-1) (300 g, 1,49 mol) em 3 M HC1 em dioxano (2,0 1) foi agitada a 20 °C durante 12 h e concentrada para produzir um sal HC1 do titulo composto (270 g, 99% de rendimento) como um sólido claro, que foi usado diretamente na próxima etapa RMN ^]-H (400 MHz, MeOD) δ 4,13 (s, 2H) , 3,93 (br. s, 4H) , 3,64 (br. s, 4H).

(c) 2,5-dioxopirrolidin-l-il 2-morfolinoacetato (7’) [00163] Uma mistura do produto da etapa anterior (150 g, 826 ml), l-hidroxipirrolidina-2,5-diona (95 g, 826 mmol), DCC (256 g, 1,24 mol) e DIPEA (160 g, 1,24 mol) em

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DCM (2 1) foi agitada a 15 °C durante 12 h e filtrada. 0 filtrado foi concentrado e lavado com EtOAc (800 ml). O sólido foi coletado por filtração e concentrado para fornecer o titulo composto (150 g, 75% de rendimento) como um sólido branco. RMN (400 MHz, DMSO-dg) δ 3,68 (s, 2H) , 3, 58 (t, J= 4,8 Hz, 4H), 2,82 (s, 4H), 2,57 (t, J= 5,2 Hz, 4H).

Exemplo 1: 1-(2-(6~ (2~Etil~5~fluoro~4--hidroxifenil) ~4~ fluoro-lJf-indazol-3-il) -1,4,6,7~tet.raidro-5Jf-imidazo [4,5c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona (1)

[00164] Uma mistura de 5-etil-2-fluoro-4-(4-fluoro-3(4,5,6, 7-tetraidro-l.H-imidazo [ 4,5-c] piridin-2-il) -1Hindazol-6-il)fenol (6) 2 HC1 (100 g, 214 mmol), 2,5dioxopirrolidin-l-il 2-m.orf olinoacetato (7’) (67,2 g, 278 mmol) e DIPEA (69 g, 534 mmol) em DMF (600 ml) foi agitada a 15 °C durante 12 h e filtrada. A solução foi purificada por cromatografia em fase reversa (instrumento Agela FLEXATM FS-1L; 2 kg de coluna DAC Cl8 Agela, 2 00 g de amostra dissolvida em DMF (900 ml); vazão de fluxo de

300 ml/min.; solvente A: água, solvente B: ACN; gradiente (% B, tempo (min.): 0/15, 0-40/45, 40/50) para obter o titulo composto (50,0 g, 44,8% de rendimento) como um sólido amarelo claro, (m/z): [M+H]⁺ calculado para 523,0 de C27H28F2N6O3 foi encontrado 523,22. RMN ⁱH (400 MHz, MeOD) δ 7,22 (s, IH) , 6, 80-6, 96 (m, 3H) , 4, 68-4,78 (m, 2H) , 3,96 (s,

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2H) , 3, 65-3, 95 (m, 4H) , 3, 35-3, 38 (m, 2H) , 2,77-2,92 (m, 2H), 2,52-2,56 (m, 6H), 1,06 (t, J= 7,6 Hz, 3H).

Exemplo 2: Forma 1 cristalina 1-(2-(6-(2-etil~5~fluoro4-hidroxifenil) --4--fluoro~lJf--indazol--3-11) -1,4,6,7-tetraidro5H-imidazo[4,5-c]piridin-5“il)-2-morfolinoetan-l-ona (1) [001651 A um balão de 250 ml foi adicionado 1-(2-(6(2-eti1-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazo1-3-i1) 1,4,6, 7-tetraidro-5H-imidazo [4,5-c]piridin-5-il) -2morfolinoetan-l-ona (1), o produto do Exemplo 1 (5 g) e etanol (50 ml) e a mistura reacional foram agitados a 5080 °C durante 10 min. e depois ACN (75 ml) foi adicionada lentamente a 50-80 °C seguida pelas sementes do Exemplo 3. A mistura reacional foi agitada a 20-25 °C durante 18 h. 0 sólido resultante foi coletado por filtração e seco a 50 °C sob vácuo durante 18 h para fornecer o titulo composto de Forma 1 (3,6 g, 72% de rendimento).

Exemplo 3: Forma 1 cristalina 1-(2-(6-(2-etil-S-fluoro4-hidroxifenil) -4-fluoro-lJí“indazol“3-il) -1,4,6,7-tetraidroSH-imidazo [4,5-c]piridin-5“il) -2-morfolinoetan-l-ona (1) [00166] O composto 1, o produto do Exemplo 1, (1 g) foi adicionado ao etanol (10 ml) e aquecido para dissolver. Acetonitrila (10 ml) foi adicionada e a mistura reacional foi agitada e aquecida e então agitada a TA durante 16 h, filtrada e seca a 50 °C sob vácuo durante 18 h para fornecer o titulo composto de Forma 1 (0,23 g).

Exemplo 4: 1-(2-(6-(2-Etil“5-fluorO“4-hidroxifenil)-4fluoro-lJí-indazol-3-il) -1,4,6,7-tetraidro-5Jí-imidazo [4,5c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona (1)

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[00167 ] Ν,Λί-di-isopropilet ilamina (0,298 ml, 1,707 mmol) foi adicionada a uma solução de 5-etil-2-fluoro4-(4-fluoro-3-(4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5-c]piridin-2il)-lA-indazol-6-il) fenol (135 mg, 0,341 mmol) (6), HATU (156 mg, 0,410 mmol) e ácido 2-morfolinoacético (7’’) (54,5 mg, 0,376 mmol) em DMF (0,5 ml) e a mistura reacional foi agitada a TA durante 24 h. Foi adicionado hidróxido de litio (49,1 mg, 2,049 mmol) e a mistura reacional foi agitada a 65 °C durante 1 h e concentrada sob vácuo para produzir um liquido amarelo claro. O líquido bruto foi purificado por HPLC preparativa para fornecer o sal da TFA do titulo composto (142 mg, 0,223 mmol, 65,3% de rendimento) como um sólido de cor bege.

Exemplo 5: Forma 2 cristalina 1-(2-(6- (2-etil5-fluoro··· 4-hidroxifenil) -4-fluoro-lJf-indazol-3“il) -1,4,6,7-tetraidro5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona (1) [001681 O composto 1 do exemplo 1 (2,5 g) foi dissolvido em DMSO (5 ml) a 60 °C. Assim que foi obtida a solução homogênea, foi adicionado MeOH (2,5 ml) à solução. A mistura homogênea foi adicionada gota a gota durante 30 min. a uma solução pré-misturada de MeOH (12,75 ml) e H₂O (11,25 ml) a 75 °C. Após a mistura ter sido totalmente adicionada, a mistura combinada foi agitada a 75 °C durante 1 h, enquanto se formava uma pasta cristalina. Foi adicionada H₂O (36 ml) gota a gota durante 2 h a 75 °C. Após

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74/117 a carga de H₂0 estar completa, a pasta fluida foi agitada a 75 °C durante 1 h e então lentamente resfriada a 20 °C durante 6 h. A pasta fluida foi mantida a 20 °C por mais 10 h antes de ser filtrada, lavada com 70% de H₂O/MeOH (10 ml), secada a 50 °C sob vácuo durante 18 h para fornecer o título composto de Forma 2 (2,13 g).

Propriedades das formas sólidas da invenção

[00169] Amostras das duas formas anidras, Forma 1 e Forma 2 de 1-(2-(6-(2-Etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4fluoro-lH-indazol-3-il) -1,4, 6, 7-tetraidro-5.fi-imidazo [4,5c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona (1) dos Exemplos 2 e 5, respectivamente, foram analisadas por difração de raios X de pó (PXRD), calorimetria diferencial por varredura (DSC), análise termogravimétrica (TGA), sorção dinâmica de umidade (DMS) e imagem de microscópio. A forma 2 também foi analisada por difração de raios x de cristal único.

Exemplo 6: Difração por raios X do pó l_ 001 /0 j Os paaroes de dxfraçao de raios x do ρο das Figuras 1 e 6 foram obtidos com um difratômetro de raios X Bruker D8-Advance usando radiação Cu-Koí (λ = 1,54051 Â) com tensão de saída de 45 kV e corrente de 40 mA. O instrumento foi operado na geometria Bragg-Brentano com fendas incidentes, de divergência e de espalhamento ajustadas para maximizar a intensidade na amostra. Para medição, uma pequena quantidade de pó (5-25 mg) foi gentilmente pressionada em um suporte de amostra para formar uma superfície lisa e submetida à exposição aos raios X. As amostras foram, examinadas no modo 2Θ-2Θ de 2° a 35° em. 2Θ com; um tamanho de etapa de 0,02° e uma velocidade de leitura de 0,30°segundo por etapa. A aquisição de dados foi

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75/117 controlada pelo programa de medida DiffracSuite Bruker e analisados pelo programa Jade (versão 7.5.1). 0 instrumento foi calibrado com um padrão de corindo, dentro do ângulo de dois tetas ±0,02°. As posições do pico PXRD 2-teta e os espaçamentos-d observados são apresentados nas Tabelas 1 e

2, respectivamente para a Formas 1 e 2 cristalinas.

Tabela 1: Dados de PXRD para Forma 1 Cristalina

2-Teta	d (Â)	Área	A%
7, 6 9	11,49	5 5 7 0	7,3 0
8,16	10,83	3 68 4 7	4 8, 60
8,97	9, 8 5	7 5 8 7 7	100,00
10, 6 6	8,2 9	7 32 3	9,70
11,46	7,7 2	5 8 41	7,7 0
11,91	7,43	1496	2,00
15,29	5, 7 9	7115	9, 4 0
15, 80	5, 60	7841	10,30
1 6, 7 0	5,31	14 679	19,30
17, 02	5,20	8024	10,60
18,00	4,92	17834	23,50
18,83	4,71	2 658	3,50
2 0,18	4,4 0	18 636	24,60
22,39	3,97	7067	9,30
22, 98	3,8 7	9 u 2 9	11,90
2 4,89	3,57	8561	11,30
2 6, 5 4	3,36	7 8 31	10,30

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Tabela 2: Dados de PXRD para a Forma 2 Cristalina

2~Teta	d (Â)	Área	A%
10, 61	8,33	706299	100,00
10,85	8,15	192921	27,30
11,84	7,4 7	487816	6 9, 1 0
13,32	6,64	97 98 0	13, 90
14,94	5, 93	519 3 8 6	73,50
16, 14	5,49	110314	15, 60
16, 35	5,42	7 5483	10,70
17, 69	5, 01	197341	27, 90
18,26	4,85	445270	63,00
18,43	4,81	152845	21, 60
19, 0 6	4, 65	564088	7 9,90
19,2 0	4, 62	427174	60,50
19, 49	4,55	266328	37,7 0
2 0, /2	4,2 8	72244	10,20
21,10	4,21	236517	33,50
21,94	4, 05	2 8 7 4 8 5	40,70
22, 64	3,93	121406	17,2 0
23, 64	.3,7 6	152841	21, 6 0
25,19	3 3 3	6822 0	9,70
28,08	3,17	139597	19,80

Exemplo 7: Análise térmica

[00171] Foi realizada a calorimetria diferencial exploratória (DSC) usando um módulo de TA Instruments Model Q-100 com um controlador de Analista Térmico. Os dados foram coletados e analisados usando o programa de análise térmica de TA Instruments. Uma amostra de cada forma cristalina foi

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77/117 pesada com precisão em um cadinho de alumínio. Depois de um período de 5 minutos de equilíbrio isotérmico a 5 °C, a amostra foi aquecida através de uma rampa linear de aquecimento de 10 °C/min. de 0 °C a 300 °C.

[00172] A Figura 7 mostra um termograma DSC representativo para a Forma 1 cristalina livre da invenção. O traço da calorimetria diferencial por varredura (DSC) registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto exibe um pico no fluxo de calor endotérmico, identificado como transição de fusão, na faixa de transição de cerca de 210 °C a cerca de 234 °C, ou na faixa entre cerca de 215 °C a cerca de 229 °C, ou na faixa entre cerca de 220 °C a cerca de 224 °C. A forma cristalina é caracterizada por um traço de calorimetria diferencial exploratória registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto, que mostra um máximo no fluxo de calor endotérmico a uma temperatura de cerca de 221,7 °C ou a 221,713 °C.

[00173] A Figura 2 mostra um termograma DSC representativo para a Forma 2 cristalina livre da invenção. O traço da calorimetria diferencial por varredura (DSC) registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto exibe um pico no fluxo de calor endotérmico, identificado como transição de fusão, na faixa de transição de cerca de 268 °C a cerca de 277 °C, ou na faixa entre cerca de 270 °C a cerca de 275 °C, ou na faixa entre cerca de 271 °C a cerca de 274 °C. A forma cristalina é caracterizada por um traço de calorimetria diferencial exploratória registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto, que mostra um máximo no fluxo de calor endotérmico a uma temperatura de cerca de 272,6 °C ou a 272,612 °C.

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[00174] As medidas de análises termogravimétricas (TGA) foram realizadas usando um módulo de TA Instruments Model Q-50, equipado com alta capacidade de resolução. Os dados foram coletados usando o controlador de Analista Térmico de TA Instruments e analisados usando o programa TA Instruments Universal Analysis. Uma amostra pesada foi colocada em um cadinho de platina e examinada com uma taxa de aquecimento de 10 °C a partir da temperatura ambiente até 300-350 °C. As câmaras de equilíbrio e forno foram purgadas com fluxo de nitrogênio durante o uso.

[001751 A Figura 8 mostra um. traço significativo de TGA para a Forma 1 cristalina livre da invenção. A análise gravimétrica térmica (TGA) da Figura 8 não mostra perda de peso significativa em temperaturas abaixo do inicio da decomposição a cerca de 293 °C.

[001761 A Figura 3 mostra um traço significativo de TGA para a Forma 2 cristalina livre da invenção. A análise gravimétrica térmica (TGA) da Figura 3 não mostra perda de peso significativa em temperaturas abaixo do inicio da decomposição a cerca de 269 °C.

Exemplo 8: Avaliação da sorção dinâmica de umidade [001771 A. medida da sorção dinâmica de umidade (DMS) foi realizada usando uma microbalança atmosférica VTI, sistema SGA-100 (VTI Corp., Hialeah, FL 33016). Uma amostra pesada foi usada e a umidade era o menor valor possível (perto de 0% UR), no início da análise. A análise de DMS consistiu em. uma primeira etapa de secagem (0% UR) durante 120 minutos, seguida por dois ciclos de sorção e dessorção com uma taxa de leitura de 5% UR/etapa na faixa de umidade de 5% a 90% UR. A DMS foi feita com isotermia a 25 °C.

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[001781 A Figura 9 mostra um traço significativo de DMS para a Forma 1 cristalina livre da invenção.

[00179] A Forma 1 cristalina demonstrou uma histerese de sinal entre dois ciclos de sorção e dessorção. A Forma 1 demonstrou um ganho de peso de cerca de 0,99% na faixa de 5% a 70% de umidade relativa e ganho de peso de cerca de 1,32% na faixa de 5% a 90% de umidade relativa à temperatura ambiente, como demonstrado na Figura 9. A Forma 1 é considerada como sendo ligeiramente higroscópica.

[00180] A Figura 4 mostra um traço significativo de DMS para a Forma 2 cristalina livre da invenção. A Forma 2 cristalina não apresentou histerese entre dois ciclos de sorção e dessorção e demonstrou uma propensão excepcionalmente pequena para higroscopicidade. A Forma 2 demonstrou um ganho de peso de cerca de 0,12% na faixa de 5% a 70% de umidade relativa e ganho de peso de cerca de 0,18% na faixa de 5% a 90% de umidade relativa à temperatura ambiente, como demonstrado na Figura 4. A Forma 2 é considerada como sendo não higroscópica.

Exemplo 9: Difraçâo de raio x de cristal único da Forma 2 [00181] Os dados foram coletados em um difratômetro Rigaku Oxford Diffraction Supernova Dual Source, Cu at Zero, Atlas CCD, equipado com um. dispositivo de resfriamento Oxford Cryosystems Cobra. Os dados foram, coletados usando radiação Cu Κα. A estrutura foi resolvida e refinada usando o programa de cristalografia de suíte Bruker AXS SHELXTL. O CIF pode fornecer detalhes completos. Salvo indicação em. contrário, os átomos de hidrogênio ligados ao carbono foram colocados geometricamente e refinados com um parâmetro de deslocamento isotrópico. Os átomos de hidrogênio ligados aos

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80/117 heteroátomos estavam localizados em um mapa de Fourier diferente e foram refinados livremente com. um parâmetro de deslocamento isotrópico.

Tabela 3: Dados da analiso do difraçao do raios x do cristal único para a Forma 2

Fórmula empírica	C27H28F2F6O3
Peso da fórmula (molecular)	522,55
Tamanho do cristal	0,14 x 0,10 x 0,02 mm3
Temperatura de coleta de dados	2 93(2) K
Comprimento de onda usado para coleta de dados	1,54178 Â
Sistema cristalogrâfico	Ortorrômbico
G r up o e s p a. c i a 1	Pb ca
Dimensões da célula da unidade	a == 9, 7245 (11) Â
	b = 16,8197(14) Â
	c = 32, 604(4) Â
	u = 90°
	fi == 90°
	γ = 90°
Volume da célula da unidade	5332,8(10) A3
Z (número de moléculas na célula da unidade)	8
D e n s i d ade (c a 1 c u .1 a d a)	1,3 0 2 g / cm3
Intervalo teta para coleta de d 3 d O S	5, 2 6 - 6 6, 6 0 °
Intervalos de índices	-11 < h < 11 -12 < k < 2 0 — 3 8 < 1 < 3 8

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Reflexões	coletadas	24516
Reflexões i	n d e p e n d e n t. e s	47 08 [Rínt = 0, 0 927]
IndicesR finais [F2 >	RI == 0, 0808, wR2 ==
2 s i gma(F2 ) ]	0,2159
índices R (todos os dados)	RI = 0, 1452, wR2 = 0,2859

Exemplo 10: Avaliação da estabilidade do estado sólido da Forma 1

[00182] Amostras da forma 1 cristalina livre da invenção foram armazenadas a 25 °C e 60% de umidade relativa (UR) e a 40 °C e 75% de UR sob duas configurações a) frasco de vidro aberto e b) frasco de vidro fechado dentro de uma garrafa HOPE contendo dessecante. A garrafa HOPE foi selada por indução. Em intervalos específicos, o conteúdo de uma amostra representativa foi removido e analisado por HPLC para obter a pureza química (mostrado a seguir como Pureza por HPLC (% a/a)).

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Tabela 4: Estudo de estabilidade da Forma 1 cristalina

Tempos (semanas)	Condição
40 °C/75% UR Fechado Com dessecante	40 °C/75% UR Aberto	25 °C/60% UR Fechado Com dessecante	25 °C/60% UR Aberto
r.	'Ώ CO CO
2	NT	98,72	NT	NT
4	98,75	9 8 7 0	9 8,7 5	98, '5
8	9 8,80	98,97	98,87	98,75
2 4	99, 06	98,89	99, 02	98,7 8
36	98,86	98,71	98,80	98,75

NT: Não testado

Exemplo 11: Imagem de microscopia de luz polarizada (PLM) da Forma 1 e Forma 2

[00183] Amostras da Forma 1 e Forma 2 foram examinadas sob microscópio óptico (Olympus BX.51) com filtro de luz de polarização cruzada. As imagens foram coletadas com uma câmera PaxCam controlada pelo programa Paxlt Imaging (versão 6.4). As amostras foram preparadas em lâminas de vidro com óleo mineral leve como meio de imersão. Dependendo do tamanho das partículas, foram usadas lentes objetivas 4x, lOx ou 20x para aumento.

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Preparação 8: terc-butil 2-iodo-l- ( (2(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,4,6,7-tetraidro-5Himidazo[4,5-c]piridina-5-carboxilato (C-5)

2HC!

NH₂

C-22 „BQC

M

ÍMiS

C-Í8

O ^.o.ü/mho 100 C.18 h ₄..Soc N

C-19

Q. ,.Q, O

C-21

H

X.HCÍ

1M NaOH,

Metanol,

RT ,18 h i DiPEA, ΐ Metanol,

RT.18h * O

NT

C-2.0

SEM-CI, NaH, THF, 0 Ό â RT.6 h . ,B®s

Ν'

Si

C-5

[00184] A uma ão do comoosto C-22 (25 mmol) em HC1 dimetoximetano (21,64 ml, 244,54 mmol). A solução resultante foi agitada a 100 °C durante 18 h. O solvente foi removido sob vácuo e o resíduo foi triturado duas vezes com éter etílico e etanol, filtrado e seco para fornecer o composto C-21 (25,2 g, 94,6% de rendimento).

[00185] A uma solução do composto C-21 (25,0 g, 127,55 mmol) em metanol (250 ml) foi adicionado DIPEA (57,23 ml, 318,87 mmol) seguida pela adição de (Βοο)₂0

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84/117 (68,23 ml, 318,87 mol) e a reação foi agitada à TA durante 18 h. A reação resultante foi diluída com água (150 ml) e extraída usando acetato de etila (3 x 200 ml). A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio anidro, decantada e concentrada sob pressão reduzida para obter o produto bruto C-20, que foi levado para a etapa seguinte sem. purificação adicional.

[00186] A uma solução deste composto bruto C-20 (40,0 g, 123,8 mmol) em metanol (500 ml) foi adicionada solução de NaOH 1 M (200 ml) e a solução resultante foi agitada a TA durante 18 h. O solvente foi destilado sob vácuo e o produto bruto resultante foi diluído em água (200 ml) e extraído usando acetato de etila (3 x 300 ml). A camada orgânica, combinada foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada sob pressão reduzida para obter o produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 silica gel), eluído com 5-10% de MeOH: DCM para obter o produto desejado C-19 (20 g, 72,4% de rendimento).

[00187] Ά uma solução do composto C-19 (20 g, 89,68 mmol) em THF (400 ml) foi adicionado NIS (30,26 g, 134,52 mmol) a TA e a solução resultante foi agitada durante 2 horas na mesma temperatura. A mistura reacional foi diluída com água (200 ml.) e extraída com acetato de etila (2 x 300 ml), a camada orgânica foi lavada com. solução aquosa de tiossulfato de sódio a 10% (3x100 ml) seguida por salmoura, seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada sob pressão reduzida para obter o produto bruto C-18 que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional.

[00188] A. uma solução agitada do composto C-18 (15,0 g, 42,97 mmol) em THF (150 ml) foi adicionado NaH

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85/117 (1,8 g, 45,11 mmol) a 0 °C em porções e a mistura reacional foi agitada durante 1 hora a TA. Então foi adicionado cloreto de SEM (8,18 ml, 45,11 mmol) gota a gota a 0 °C. A reação foi agitada durante 6 horas a TA. 0 progresso da reação foi monitorado por cromatografia em. camada fina (CCF) , a reação foi atenuada com. água gelada (200 ml) a 0 °C e extraída com acetato de etila (2 x 200 ml). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura e seca sobre sulfato de sódio anidro. A camada orgânica foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em coluna de silica (100-200) (eluído com 10-15% EtOAc: Hexano) para obter o produto C-5 desejado como um líquido viscoso (11 g, 55%).

Preparação 9: 2-(2-etil-5-fluoro-4-metoxifenil)4,4,5,5-tetrameti1-1,3,2-dioxaborolano (C-12)

Pd/C/H_a

EtanoL

C-15 nbs

MeCN

Pda_s{dppf)DCM

KOAc

...;,.O O../

[ BB i j-θ' b-r

R-2

C-12

[00189]

A uma suspensão agitada do c omp o s t o C-17 (347,6 g, 973,14 mmol) em THF anidro (1000 ml) resfriada a foi adicionado n-Butil lítio (2,5 M em hexano,

362,6 ml, 905,02 mmol) durante 50 min., no ponto onde a cor

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86/117 amarela característica do ileto de fósforo persistiu. A mistura reacional foi aquecida a -10 ^UC e agitada durante lhe então a mistura foi resfriada a -30 °C e uma solução do composto R-l (50 g, 324,38 mmol) em THF anidro (200 ml) foi adicionada durante 30 min. A mistura resultante foi aquecida à temperatura e agitada durante a noite. O progresso da reação foi monitorado com CCF. Após a conclusão, a reação foi atenuada pela adição gradual de água (500 ml) e extraída com éter etílico (3 x 500 ml). A camada orgânica combinada foi lavada com água (2 x 500 1), salmoura (250 ml), seca (Na^SCh anidro) e concentrada sob pressão reduzida para produzir o composto bruto. O produto bruto C16 obtido foi usado na etapa seguinte sem purificação.

[00190] A uma solução bruta de C-16 (110 g, 723,39 mmol) em etanol (1000 ml) foi adicionado 10% Pd/C (50 g). Um balão de gás hidrogênio foi montado e a reação foi esvaziada e preenchida com hidrogênio três vezes. A reação foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio durante a noite à temperatura ambiente. Após agitação a TA durante a noite, a reação estava completa. Ela foi filtrada através de um bloco de Celite e concentrada em vácuo para fornecer o composto bruto, que foi purificado através de cromatografia com silica gel (100-200), eluído com 3-5% acetato de etila/hexano para obter o produto desejado C-15 como líquido incolor (24 g, 48% nas duas etapas).

[00191] A uma solução de composto C-15 (24,0 g, 155,84 mmol) em MeCN (200 ml) foi adicionada uma solução de NBS (28,0 g, 157,40 mmol) em MeCN (100 ml). A solução resultante foi agitada a temperatura ambiente durante 18 h. O solvente foi removido no vácuo e o resíduo foi diluído com

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87/117 éter etilico (100 ml). A precipitação observada foi removida por filtração e o filtrado lavado com solução aquosa de sulfito de sódio (200 ml) e salmoura (100 ml), seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrado no vácuo para produzir o produto desejado C-14 como óleo amarelo (35,0 g, 97% de rendimento).

[00192] A uma solução do composto C-14 (20 g, 85,836 mmol) em Dioxano (400 ml) foi adicionado o composto R-2 (32,69 g, 128,755 mmol) e KOAc (25,27 g, 257,508 mmol). A mistura reacional foi desgaseifiçada com. nitrogênio durante 15 minutos e então foi adicionado o catalisador paládio (3,5 g, 4,29 mmol). A mistura reacional foi agitada e aquecida a 110 °C durante 3 horas. A reação foi filtrada através cie um bioco cie Ceiice e lavada com aceLato cie etila. O filtrado foi diluído com. acetato de etila (200 ml) e lavado com água (2 x 200 ml) e salmoura (100 ml), seco sobre sulfato de sódio e concentrado sob vácuo. O produto bruto obtido foi purificado por cromatografia em. coluna (100-200 silica gel) e eluido com. 3-5% EtOAc: Hexano para obter o produto desejado C-12 (20 g, 83% de rendimento).

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Preparação 10: 3-(dimetil-estanil)~6~(2~etil“5~fluoro“

4-metoxifenil) -1- (tetraidro-~2H~piran--2-~il) -IH-indazol (C-6)

[00193] Uma mistura do composto C-13 (25 g,

126, 84 mmol), 3,4-di.-idro-2H-piran (134,5 ml, 1471,5 ml) e p-TSA. (5,57 g, 29,18 mmol) foi incorporada em THF (700 ml) e aquecida a 60 °C durante a noite. A mistura reacional foi despejada em água gelada e a fase aquosa foi extraída com acetato de etila.

A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e filtrada. O filtrado foi evaporado sob pressão

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89/117 reduzida e o resíduo purificado na coluna de silica gel (230-400) (eluindo com 1-2% de acetato de etila em hexano) para produzir o composto desejado C-ll (23,5 g, 67% de rendimento).

[00194] Uma solução do composto C-ll (13,3 g, 47,5 mmol), composto C-12 (15,96 g, 57,0 mmol) e K3PO4 (30,21 g, 142,5 mmol) em DMFiPQO (396:99 ml) foi desgaseifiçada com nitrogênio durante 15 minutos e o catalisador paládio (1,6 g, 2,37 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi purgada com nitrogênio durante 5 minutos. A mistura resultante da reação foi aquecida a 100 °C durante 12 h sob agitação continua. A mistura reacional foi filtrada através de um bloco de Celite e lavada com acetato de etila. O filtrado foi diluído com acetato de etila (200 mL), extraído com EtOAc (2 x 100 ml) e lavado com água fria (100 ml) e salmoura (50 mL), seco sobre sulfato de sódio e concentrado sob vácuo para obter o produto bruto que foi purificado por cromatografia flash (100-200 silica gel), eluido com. 10% EtOAc:Hexano para produzir C-10 (14 g, 91,4% de rendimento).

[00195] A. uma solução do composto C-10 (52 g, 146, 89 mmol) em metanol (600 ml) foi. adicionado HC1 concentrado (50 ml) e a solução resultante foi aquecida a 60 °C durante a noite. A. mistura reacional foi resfriada a TA. e concentrada sob vácuo. O resíduo foi dissolvido com EtOAc (200 ml) e lavado com solução saturada de NaHCOs (2 x 150 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SÜ4 e concentrada para obter o produto desejado C-9 (35 g, 88,9% de rendimento).

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[00196] A uma solução do composto C-9 (17,5 g, 64,81 mmol) em. DMF (100 ml) foi adicionado KOH (14,5 g, 259,54 mmol) e a mistura foi agitada durante 15 minutos. Uma solução de iodo (32,7 g, 129,62 mmol) em DMF (50 ml) fol adicionada lentamente a 0 °C e a mistura reacional fol agitada a TA durante 30 min. O progresso da reação foi monitorado com CCF então a mistura reacional foi diluída com água (200 ml) e extraída com acetato de etila (2 x 200 ml). A. camada orgânica foi lavada com. solução aquosa saturada de metabissulfito de sódio (2 x 150 ml) e água (3 x 100 ml), seca sobre Na₂SO4 e concentrada sob vácuo para obter o produto bruto C~8 (21 g).

[00197] A uma solução de C~8 (21,0 g, 53,02 mmol) em DCM (230 ml) foi adicionado p-TsOH (1,8 g, 10,60 mmol) e a mistura foi resfriada a 0 °C. O composto R-3 (7,04 ml, 79,54 mmol) foi adicionado gota a gota na solução descrita acima e a mistura reacional foi agitada a TA durante a noite. O monitoramento por CCF mostrou a conclusão da reação. A. mistura reacional foi dissolvida com DCM (2 x 150 mil) e lavada com solução aquosa saturada de NaHCCg (200 ml) e salmoura (200 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na₂SO4 anidro e concentrada, em vácuo para obter o produto bruto que foi purificado por cromatografia flash para obter o composto C-7.

[00198] Uma solução de C-7 (10,0 g, 20, 83 mmol) em. Tolueno (200 ml) foi desgaseifiçada com nitrogênio durante 20 minutos seguida pela adição de R-4 (4,89 ml, 22,91 mmol) e Pd(PPh3)4 (1,2 g, 1,04 mmol) . A. mistura reacional foi purgada com nitrogênio por mais 5 minutos e então agitada a 100 °C. Após 2 h, a CCF mostrou a conclusão da reação. A

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91/117 mistura reacional foi resfriada até a temperatura ambiente, filtrada por um bloco de Celite e o resíduo lavado com. acetato de etila. 0 filtrado concentrado foi purificado por cromatografia em coluna (alumina neutra), eluído com 2-5% EtOAc: Hexano para obter o produto C-6 (6,4 g, 57,6% de rendimento).

Preparação 11: 2~(6~(2~et.il~5~fluoro--4~metoxifenil)--lH~ indazol-3-il)-4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5-c]piridina (C-3)

[00199] Ά uma solução do composto C-6 (6,4 g, 12,37 mm.ol) em tolueno (100 ml) foi adicionado o composto C5 (5,9 g, 12,37 ml) . A. mistura reacional foi desgaseifiçada com nitrogênio durante 20 minutos, seguida pela adição de iodeto de cobre (I) (470 mg, 2,47 mmol) e Pd(PPh₃)4 (714 mg, 1,237 mmol) e então agitada a 100 °C durante 12 h. O progresso da reação foi monitorado com CCF. A reação foi resfriada a TA e filtrada por um bloco de Celite, o resíduo lavado com acetato de etila. A camada orgânica foi diluída com água, separada e a parte orgânica foi lavada com.

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92/117 salmoura, seca sobre Na₂SO4 e filtrada. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna (silica com tamanho de malha 100-200), eluido com 20% EtOAc: Hexano para obter C-4 (4 g, 45,9%).

[00200] A uma solução do composto C-4 (4,0 g, 5,6 mmol) em dioxano (30 ml) foi adicionado HC1 concentrado (30 ml). A mistura reacional foi agitada a 70 °C durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado com LCMS. A reação foi resfriada a TA, concentrada em vácuo, triturada com éter etilico e purificada através de HPLC preparativa para obter o composto C-3 desejado (0,65 g, 29,5%).

Exemplo 12: l-~(2~(6“(2~Etil“5~fluoro-4--hidroxifenil)l/f-indazol-3-il) -1,4,6,7-tetraidro-SJí-imidazo [4,5-a] piridin5-il)-2-morfolinoetan-l-ona (C-l)

F

C-l

[00201] À mistura de C-3 (180 mg, 0,460 mmol) em DCM (0,5 ml) a TA foi adicionado tribrometo de boro, 1 ml em DCM (100 ml) (2,299 ml, 2,299 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 30 minutos antes de ser concentrada. O resíduo resultante foi coevaporado com MeOH (3 x 3,0 ml),

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93/117 redissolvido na mistura 1:1 de AcOH:H₂O (3,0 ml), filtrado e purificado por HPLC de fase reversa. As frações desejadas foram combinadas e congeladas a seco para produzirem. C-2 ((5-etil-2-fluoro-4-(3-(4,5,6,7-tetraidro-lH-imidazo[4,5— c] piridin-2-il)-lH-indazol-6-il) fenol) como um. sal TFA.

[002021 À mistura de C-2, TFA (15 mg, 0,031 mmol) e 7’’ (2 equivalentes, 0,061 mmol) em DMF (0,5 ml) a TA foi adicionado HATU (25,5 mg, 0,067 mmol) e DIEA (0,043 ml, 0,244 mmol). A mistura reacional foi agitada a TA durante a noite. A reação foi diluída com MeOH (0,5000 ml) e água (0,500 ml). Foi adicionado LiOH (2,193 mg, 0,092 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 65 °C durante 1 h. A reação foi então concentrada, o resíduo resultante foi tratado com uma mistura de DCM (0,500 ml) e TFA (0,500 ml) a TA durante 30 minutos, concentrada, redissolvida na mistura de 1:1 de AcOH:H₂O (1,5 ml), filtrada e purificada por HPLC preparativa de fase reversa para obter o composto C-l como sal TFA. ι,γώ/ζ) : [M+u]^T calculado para 504,23 de C27H29FN6U3 foi encontrado 505,2.

Ensaios biológicos

O composto 1 foi caracterizado' em um ou mais dos seguintes ensaios biológicos.

Ensaio 1: Ensaios bioquímicos da quinase JAK

[00203] Um painel de quatro ensaios bioquímicos LanthaScreen JAK (JAK1, 2, 3 e Tyk2) foi realizado em um tampão de reação comum para quinase (50 mM de HEPES, pH 7,5, 0,01% Brij-35, 10 mM de MgCl.2 e 1 mM de EGTA) . As enzimas JAK marcadas com GST recombinante e o substrato de peptidio STAT1 marcado com GFP foram adquiridos da Life Technologies.

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[00204] O composto com diluição em série foi préincubado com cada uma das quatro enzimas JAK e o substrato em 384 microplacas de poço brancas (Corning) à temperatura ambiente durante 1 h. ATP foi adicionado posteriormente para iniciar as reações de quinase em 10 uL de volume total, com. 1% de DMSO. As concentrações enzimáticas finais para JAK1, 2, 3 e Tyk2 são 4,2 nM, 0,1 nM, 1 nM, e 0,25 nM, respectivamente; as concentrações correspondentes de Km ATP usadas são 25 μΜ, 3 μΜ, 1,6 μΜ, e 10 μΜ; enquanto a concentração de substrato é de 200 nM para todos os quatro ensaios. As reações da quinase continuaram por 1 hora à temperatura ambiente antes de serem adicionados uma preparação de 10 μΐ de EDTA (10 mM de concentração final) e anticorpo Tb-anti,-pSTATl (pTyr701) (Life Technologies, 2 nM concentração final) em. tampão de diluição TR-FRET (Life Technologies). As placas foram incubadas a temperatura ambiente por 1 hora antes de serem lidas no leitor EnVision (Perkin Elmer). Os sinais de taxa de emissão (520 nm/495 nm) foram registrados e usados para calcular a percentagem de valores de inibição com base no DMSO e nos controles de fundo.

[0020oj Para a analisa cia dose-resposta, daaos cia inibição percentual foram aplicados em. um gráfico versus as concentrações dos compostos, e os valores de IC50 foram determinados a partir de um modelo de ajuste robusto de 4 parâmetros com o software Prism (GraphPad Software). Os resultados foram expressos como pICso (logaritmo negativo de IC50) e, posteriormente, convertidos para pKi (logaritmo negativo da constante de dissociação, Kl) usando a equação de Cheng-Prusoff.

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[00206] O composto 1 exibiu a seguinte potência enzimática.

Tabela 5

JAtC 1 pKx	pKx	JAtC 3 pKx	Tyk2 pK±
10	10,6	9, 7	θ / 7

Ensaio 2: Ensaio da potência celular da JAK: Inibição da IL-13

[00207] 0 ensaio da potência celular AlphaScreen JAKI foi feito ao medir a fosforilação de STAT6 induzida por interleucina-13 (IL-13, R&D Systems) em células epiteliais do pulmão humano BEAS-2B (ATCC). O anticorpo anti-STAT6 (Cell Signaling Technologies) foi conjugado a pérolas de aceptor AlphaScreen (Perkin Elmer), enquanto o anticorpo anti-pSTAT6 (pTyr641) (Cell Signaling Technologies) foi biotinilado usando a sulfo-NHS-biotina EZ-Link (Thermo Scientific).

[00208] As células BEAS-2B foram cultivadas a 37 °C em uma incubadora umidificada a 5% de CO₂ no meio 50% DMEM/50% F-12 (Life Technologies), suplementado com 10% de FBS (Hyclone), 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina (Life Technologies) e 2 mM de GlutaMAX (Life Technologies). No dia 1 do ensaio, as células foram semeada; a uma densidade de 7.500 células/poço em. placas brancas com. 384 poços revestidos com poli-D-lisina (Corning) com 25 μΐ de meio, e ficaram durante a noite na incubadora para aderência. No dia 2 do ensaio, o meio foi removido e substituído com 12 pL de tampão de ensaio (Hank’s Balanced

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Salt Solution, 25 mM HEPES, e 1 mg/ml de albumina sérica bovina/BSA.) contendo respostas-dose dos compostos em teste. 0 composto foi diluído em série em DMSO e, então, diluído

1000 vezes nos meios para chegar a concentração final de 0,1% de DMSO. As células foram, incubadas com os compostos de teste a. 37 ^,JC por 1 h, seguida pela adição de 12 μΐ de IL-13 pré-aquecído (80 ng/ml em tampão de ensaio) para estimulação. Após incubação a 37 °C durante 30 min., o tampão do ensaio (contendo composto e IL-13) foi removido, e 10 μΐ de tampão de Use celular (25 mM HEPES, 0,1% SDS, 1%

NP-40, 5 mM de MgC.l₂, 1,3 mM, 1. mM de EDTA, EGTA e suplementar com os inibidores de protease Ultra mini e PhosSTOP da Roche Diagnostics). As placas foram agitadas a temperatura ambiente por 30 minutos antes da adição dos reagentes de detecção. Uma mistura de pérolas aceptoras conjugadas anti-bíotína-pSTA_T6 e anti~STAT6 foi adicionada primeiro e incubada à temperatura ambiente durante 2 h, seguida pela adição de pérolas doadoras conjugadas a. estreptavidina (Perkin Elmer). Após um mínimo de 2 h de incubação, as placas de ensaio foram lidas no leitor de placa EnVision. Os sinais de luminescência AlphaScreen foram gravados e usados para calcular a valores percentuais de inibição com base em DMSO e controles de fundo.

[002091 Para análise de resposta-dose, os dados percentuais de inibição foram inseridos em um gráfico versus as concentrações de compostos, e os valores de IC50 foram determinados a partir de um modelo de ajuste robusto de 4 parâmetros com. o programa. Prism. Os resultados também, podem ser expressos como o logaritmo negativo do valor de IC50,

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97/117 pIC₅₀. O composto 1 exibiu um valor de pICso de cerca de 7,9 nesse

Ensaio 3: Ensaio da potência celular da JAK: inibição de IL-2/anti“CD3 estimulada por IFNy em PBMCs humanos [00210] A potência do composto de teste para inibição da interleucina-2 (IL-2)/anti-CD3 estimulada pela gama interferona (ΙΕΝγ) foi medida em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas do sangue humano total (Stanford Blood Center). Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK.

[00211] (1) As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis usando um gradiente Ficoll. As células foram cultivadas a 37 °C, em incubadora umidificada a 5% de CO₂ em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 10% de Soro Fetal Bovino Inativado pelo Calor (SFB, Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e IX Pen/Strep (Life Technologies). As células foram semeadas em 200.000 células/poço nos meios (50 pl) e cultivadas durante 1 h. O composto foi diluído em série em DMSO e, então, diluído 500 vezes (para uma concentração final de ensaio de 2x) nos meios. As diluições do composto do teste (100 ul/poço) foram adicionadas às células e incubadas a 37 °C, 5% de CO₂ durante 1 hora, seguida pela adição de IL-2 (R&D Systems; concentração final de 100 ng/ml) e anti-CD3 (BD Biosciences; concentração final de 1 pg/ml) em. meios de ensaio pré-aquecido (50 pi) durante 24 horas.

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[00212] (2) Após a estimulação de citocina, as células foram centrifugadas a 500 g durante 5 minutos e o sobrenadante removido e congelado a -80 °C. Para determinar a potência inibitória dos compostos em teste em resposta à IL-2/anti-CD3, foram medidas as concentrações de IFNy sobrenadante via ELISA (R&D Systems). Os valores de IC50 foram determinados a partir da análise das curvas de concentração de IFNv versus a concentração dos compostos. Oi dados foram expressos em. valores de pICso (IC50 logaritmo decádico negativo). O composto 1 exibiu um valor de pICso de cerca de 6,7 nesse ensaio.

Ensaio 4: Ensaio da potência celular da JAK: inibição de pSTAT5 estimulada por IL-2 em células T CD4+

[00213] A potência do composto de teste para inibição da fosforilação de STAT5 estimulada pela interleucina-2 (IL· 2)/anti-CD3 foi medida em células T CD4-positivos (CD4+), células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas do sangue humano total (Stanford Blood Center) usando a citometria de fluxo. Como a IL-2 sinaliza por meio da JAK, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK.

[00214] Células T CD4+ foram identificadas usando um anticorpo anti-CD4 conjugado com ficoeritrobilina (PE) (Clone RPA-T4, BD Biosciences), enquanto foi usado um anticorpo anti-pSTAT5 conjugado Alexa Fluor 647 (pY694, Clone 47, BD Biosciences) para detectar a fosforilação de STAT5.

[00215] (1) O protocolo do parágrafo 3 do ensaio (1) fo.

seguido com exceção que a estimulação de citocinas com. IL2/anti-CD3 foi realizada durante 30 minutos em vez de 24 h.

[00216] (2) Após a estimulação de citocinas, as células foram fixadas com solução de fixação pré aquecida

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99/117 (2UΟ μΐ; BD Biosciences) durante 1U nun. a. 3 / °C, 5% de Cth, lavadas duas vezes com tampão DPBS (1 ml, Life Technologies), e ressuspendidas em tampão III Perm resfriado (1000 μΐ, BD Biosciences) durante 30 min. a 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com 2% de SFB DPBS (tampão FACS) e então ressuspendidas em tampão FACS (100 μΐ) contendo antiCD4 PE (diluição 1:50) e anti-CD3 anti~CD3Alexa Fluor 647 (diluição 1:5) durante 60 min. à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS antes de serem analisadas usando o citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences). Para determinar a potência inibitória do composto de teste em resposta a IL-2/anti-CD3, foi medida a intensidade fluorescente mediana (IFM) de pSTA.T5 em células T CD4+. Os valores de IC50 foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da IMF versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pICso (IC50 logaritmo decádico negativo). O composto 1 exibiu um valor de pICso de cerca de 7,7 nesse ensaio.

Ensaio 5: Ensaio da potência celular da JAK: inibição de CCL2 estimulado por IL-6 (MCP-1) em PBMCs humanas

[00217] A potência do composto do teste para inibição da produção de CCL2 (MCP-1) estimulada pela interleucina-6 (IL-6) foi medida em. células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) isoladas do sangue total humano (Stanford Blood Center). Como a IL-6 sinaliza por meio da JAK, este ensaio fornece uma medida distai da potência c e1u1a r de JAK.

[00218] (1) O protocolo do parágrafo (1) do ensaio 3 foi seguido até a incubação com os compostos do teste. No

Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 126/160 presente ensaio, após a. adição dos compostos do teste nos poços e incubados, foi adicionada IL-6(R&D Systems; concentração final 10 ng/ml) nos meios de ensaio préaquecidos (50 μΐ).

[00219] (2) Após a estimulação com. citocina durante h, as células foram centrifugadas a 500 g durante 5 min. e o sobrenadante removido e congelado a -80 °C. Para determinar a potência inibitória do composto em teste em resposta à IL-6, foram medidas as concentrações de CCL2 (MCP-1) sobrenadante via ELISA (R&D Systems). Os valores de IC50 foram determinados a partir da análise das curvas de concentração de CCL2/MCP-1 versus a concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pICso (IC50 logaritmo decádico negativo). O composto 1 exibiu um valor de pICso de cerca de 6,4 nesse ensaio.

Ensaio 6: Ensaio da potência celular da JAK: inibição de INF-γ induzida por pSTATl

[00220] A potência do composto do teste para inibição da fosforilação de STAT1 estimulada pela gamainterferona (ΙΕΝγ) foi medida em monócitos CD14-positivos (CD14+) derivados do sangue total (Stanford Blood Center) usando citometria de fluxo. Como ΙΕΝγ sinaliza por meio da JAK, este ensaio fornece uma medida de potência celular de JAK.

[00221] Os monócitos foram identificados usando anticorpo anti-CD14 conjugado com isotiocianato de fluoresceina (FITC) (Clone RM052, Beckman Coulter) e um anticorpo anti-pSTATl conjugado Alexa Fluor 647 (pY701, Clone 4a, BD Biosciences) foi usado para detectar a fosforilação de STAT1.

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[00222] As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue humano total de doadores saudáveis usando um gradiente Ficoll. As células foram cultivadas a 37 °C, incubadora umidificada a 5% de CO? em RPMI (Life Technologies), suplementadas com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS, Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) e IX Pen/Strep (Life Technologies). As células foram semeadas numa taxa de 250.000 células/poço em. meios (200 μΐ), cultivadas por 2 h e ressuspendidas em. meios de ensaio (50 μΐ) (RPMI suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino (Sigma), 2 mM Glutamax, 25 mM HEPES e IX Penstrep) contendo diferentes concentrações dos compostos de teste. O compostos foram diluídos em série em. DMSO e, então, diluído 1000 vezes nos meios para chegar à concentração final de 0,1% de DMSO. As diluições do composto do teste foram incubada com as células a 37 °C, 5% de CO? durante 1 h, seguida pela adição de IFNy pré-aquecido (R&D Systems) nos meios (50 μΐ) a uma concentração final de 0,6 ng/ml durante 30 minutos. Após a estimulação com citocinas, as células foram fixadas com solução de fixação pré-aquecida (100 μΐ) (BD Biosciences) por 10 min. a 3/ °C, 5% de CO2, lavadas duas vezes com. tampão de FACS (1 ml) (1% de BSA em. PBS), ressuspendidas em 1:10 de anti~CD14FITC: tampão FACS (100 μΐ), e incubadas a 4 °C durante 15 min. As células foram lavadas uma vez e, em seguida, ressuspendidas em tampão Perm Ill gelado i,BD Biosciences) (100 μΐ,ι durance .30 minutos a. 4 °C. As células foram lavadas duas vezes com. tampão FACS e ressuspendidas em 1:10 de Alexa Fluor 647 anti-pSTATl:tampão FACS (100 μΐ) por 30 min. a TA no escuro

Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 128/160 lavadas duas vezes em tampão FACS, e analisadas através de um citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences).

[00223] Para determinar a potência inibitória do composto do teste, a intensidade fluorescente mediana (IFM) de pSTATl foi medida em monócitos CD14+. Os valores de IC50 foram determinados a partir da análise das curvas de inibição da IMF versus concentração dos compostos. Os dados foram expressos em valores de pIC.50 (IC50 logaritmo decádico negativo). O composto 1 exibiu um valor de pIC₅₀ de cerca de 7,1 nesse ensaio.

Ensaio 7: Farmacocinética ocular em olhos de coelho

[00224] O objetivo deste ensaio foi determinar a farmacocinética de um composto de teste em tecidos oculares o e c o e 1 η o s .

Formulação da solução

[00225] 1-(2-(6-(2-etil~5-fluoro-4-hidroxifenil)-4 fluoro-1 ü-indazol-3-il)-1,4,6, 7-tetraidro-5H-imidazo[4, δη Jpiridin-5-il)-2-morfolinoetan-l-ona (1), preparada no Exemplo 2, foi dissolvida em 2% de 2-hidroxipropil-3ciclodextrina para obter a concentração alvo de 1 mg/ml. Injeção intravitrea bilateral (50 μΐ/olho) da solução do composto do teste foi administrada a coelhos brancos da Nova Zelândia (50 μΐ/olho), A concentração do composto do teste foi medida nos tecidos oculares: vítreo aquoso, retina/coroide e corpo íris-ciliar em pontos de tempo predeterminado após a injeção (30 min., 4 h, 1 d, 3d, 7 d, 14 d). Dois coelhos (quatro olhos) foram dosados para cada ponto de tempo. No tecido vítreo, o composto 1 apresentou uma diminuição de duas fases na concentração caracterizada por uma diminuição inicial da concentração com meia-vida de aproximadamente 9 horas e

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103/117 finalmente uma meia-vida terminal de aproximadamente 2 dias. Foi verificado que o composto se distribuía rapidamente na região da retina e coroide também e mostra um perfil farmacocinético similar como no tecido vítreo.

Formulação de suspensão

[00226] Foi preparada uma formulação de suspensão ao combinar o composto 1 do exemplo 2 (Forma 1) com 0,5% de hídroxipropilmetilcelulose (HPMC E5) + 0,02% de Tween 80 em soro fisiológico normal para atingir uma concentração-alvo de 5 mg/ml, 20 mg/ml e 80 mg/ml para as respectivas doses de 0,25 mg/olho, 1 m.g/olho e 4 mg/olho. Injeção intravítrea bilateral (50 μΐ/olho) da suspensão do composto do teste foi administrada a coelhos brancos da Nova Zelândia. A concentração do composto do teste foi medida após a injeção nos tecidos oculares como no ensaio de formulação de solução a 30 min., 4 h, 24 h, 72 h, 7 d, 14 d, 28 d, 56 d e 84 d. Para o grupo de dose 4 mg/olho, foi coletado um ponto de tempo adicional de 168 d após a injeção. Todos os grupos de dose demonstraram, concentração do fármaco mensurável no olho até o último ponto de tempo testado neste estudo. Foi observada exposição robusta e sustentada para todas as doses com 12 semanas (84 d). Foi observada exposição sustentada com 24 semanas (84 d) para o grupo de dose de 4 mg/olho. O composto mostrou uma diminuição linear na concentração do fármaco no tecido vítreo de 30 min. a 24 semanas com uma taxa de depuração do fármaco de aproximadamente 5 a 10 qg/ml/dia. A taxa de depuração é consistente com. a solubilida.de do composto 1 no veículo e o comportamento farmacocinético ocular na formulação da solução. Todos os grupos de dose demonstraram concentração do fármaco mensurável no olho até o

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104/117 último ponto de tempo testado neste estudo. Portanto, é plausível que a exposição ao fármaco seja mais longa do que a observada neste estudo. A concentração do fármaco no plasma foi medida e encontrada como sendo pelo menos 3 ordens de magnitude inferior à concentração no tecido vítreo em todas as três concentrações.

[00227] Foi preparada uma formulação de suspensão ao combinar o composto 1 do exemplo 5 (Forma 2) com 0,5% de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC E5) + 0,02% de Tween 80 em soro fisiológico normal para atingir uma concentração-alvo de 0,4 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml e 20 mg/ml para as respectivas doses de 0,02 mg/olho, 0,05 mg/olho, 0,1 mg/olho e 1 mg/olho. Injeção intravítrea bilateral (50 μΐ/olho) da suspensão do composto do teste foi administrada a coelhos brancos da raça Dutch Belted. A concentração do composto do teste foi medida no humor vítreo, humor aquoso, corpo írisciliar, retina, células do epitélio pigmentário da retina/coroidal e plasma em 30 min., 7d, 14d, 28d, 42d e 56d pós-inj eção. O composto mostrou uma diminuição muito gradual, na concentração' do fármaco no tecido vítreo de 3 0 min. até o último ponto de tempo testado (28d para dose de 0,02 mg/olho, 42d para doses de 0,05 mg/olho e 1 mg/olho e 56d para dose 0,1 mg/olho). Todos os grupos de dose demonstraram, concentração do fármaco mensurável no olho até o último ponto de tempo testado neste estudo. Portanto, é plausível que a exposição ao fármaco seja mais longa do que a observada, neste estudo. A concentração do fármaco no plasma foi medida e encontrada como sendo pelo menos 3 ordens de magnitude inferior à concentração no tecido vítreo em todas as três concentrações. As três ordens de magnitude

Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 131/160 correspondem a uma escala logaritmica (ou seja, 1000 em uma escala não logaritmica).

Ensaio 8: Ensaio farmacodinâmico: inibição do pSTAT3 induzido por IL6 em ratos

[00228] A capacidade de uma única administração intravitrea do composto do teste em inibir o pSTAT3 induzido por IL-6 foi medida em homogenados de retina/coroide de ratos.

[00229] Foi preparada uma formulação de suspensão ao combinar o composto 1 do exemplo 2 com 0,5% de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC E5 LV), 0,02% de Tween 80 e 9 mg/ml de cloreto de sódio em água purificada para atingir uma concentração-alvo de 10 mg/ml.

[00230] Ratos fêmeas da raça Lewis receberam dose intravitrea (IVT) (5 μΐ/olho) com a formulação da suspensão. Três dias depois, foi administrado IL-6 (Peprotech;

0,1 mg/ml; 5 μΐ/olho) ou veiculo de maneira intravitrea para induzir o pSTAT3. Os tecidos oculares foram dissecados uma hora após a segunda injeção IVT com IL-6. Os tecidos da retina/coroide foram, homogeneizados e os níveis de pSTAT3 foram medidos usando um ELISA (Tecnologia de Sinalização Celular). A percentagem de inibição de pSTAT3 induzido por IL-6 foi calculada em comparação com. os grupos veículo/veículo e veículo/IL-6. A inibição de mais de 100% reflete uma redução dos níveis de pSTAT3 para abaixo dos valores observados no grupo veículo/veículo.

[00231] Com um pré-tratamento de 3 dias antes do desafio com IL-6, uma dose de 50 pg de composto 1 administrada pela formulação da suspensão inibiu pSTAT3 induzida pela IL-6 em 116% nos tecidos.

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Ensaio 9: Ensaio farmaoodinâmico: inibição do IP-10 induzida por IFNy nos Olhos de Coelho

[00232] A capacidade de uma única administração intravitrea do composto do teste para inibir os níveis da proteína IP-IO induzida por gamainterferona (IFNy) fo.í medida nos tecidos vítreo e retina/coroide.

[00233] Foi preparada uma formulação de suspensão ao combinar o composto 1 do exemplo 2 (Forma 1) com 0,5% de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC E5), 0,02% de Tween 80 e 9 mg/ml de cloreto de sódio em água purificada para atingir uma concentração-alvo de 20 mg/ml.

[00234] Foram usados coelhos machos brancos da Nova Zelândia (Liveon Biolabs, índia) para os estudos. Os animai foram aclimatados após a chegada às instalações de pesquisa (Jubilant Biosys Ltd., índia) . Cada coelho recebeu um total de duas injeções intravítreas (IVT) com um volume de dose total de 50 μΐ por olho. A primeira injeção IVT (45 μΐ por olho) forneceu 0,9 mg do composto do teste ou veículo. Uma semana depois, uma segunda injeção de TIV (5 μΐ por olho) forneceu IFNy (1 pg/olho; solução estoque 1 mg/ml; Kingfisner Biotech) ou veiculo para a indução da proneína IB-iO. No dia das injeções, os coelnos foram anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina (35 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) . Assim que estivessem, profundamente anestesiados, cada olho foi lavado com soro fisiológico estéril e foram feitas injeções IVT usado uma seringa de insulina 0,5 ml (50 unidades = 0,5 ml) com uma agulha de calibre 31 no lado supranasal de ambos os olhos ao marcar a posição com um paquímetro fixo Braunstein (2 3/4) 3,5 mm distante do músculo reto e 4 mm do limbo.

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[00235] Os tecidos foram coletados 24 horas após a segunda injeção IVT com IFNy. O humor vítreo (VH) e os tecidos retina/coroide (R/C) foram coletados e homogeneizados e os níveis da proteína IP-10 foram medidos usando um kit ELISA para coelho CXCL10 (IP-10) (Kingfisher Biotech). A percentagem de inibição de IP-10 induzida por IFNy foi calculada em comparação com os grupos veículo/veículo e veículo/IFNy.

[00236] Com um pré-tratamento de 1 semana antes do desafio com IFNy, a formulação da suspensão do composto 1 inibiu o IP-10 induzido pelo IFNy em. 81% e 80% no humor vítreo e nos tecidos retina/coroide, respectivamente. Foi observada eficácia semelhante com um pré-tratamento de 1 mês antes do desafio com. IFNy.

Ensaio 10: Farmacocinética dérmica na pele de camundongos e mini porcos

[00237] O objetivo deste ensaio é determinar a farmacocinética plasmática da. epiderme, derme e plasmática de um composto após exposição de 24 horas na pele intacta de camundongo ou mini porco.

[00238] 1-(2-(6-(2-etí1-5-fluorO-4~hidroxifenil)-4flu.oro-l.H-indazol-3-il) -1,4, 6, 7-tetraídro-5H-imidazo [4,5— c]pírídín-5-í1)-2-morfolínoetan-l-ona (1) foi formulada como um creme ou pomada a 0,5% (ρ/ρ) corno descrito, como Formulação A ou Formulação B, respectivamente, na Tabela 6.

[00239] Vinte e quatro horas antes da administração, o pelo foi raspado na. parte do dorso de camundongos machos Balb/c de 25 g, expondo uma área de pelo menos 6 cm² (cerca de 10% da superfície corporal) e, em um experimento separado, mini-porcos Gottingen de 10 kg, expondo uma área

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108/117 de pelo menos 450 cm² (cerca de 10% da superfície corporal) . No tempo zero, após anestesia com isoflurano, o composto do teste foi aplicado no dorso de camundongos ou mini-porcos na dose de 25 μΐ/cm². A pele estava coberta com um adesivo para evitar a perda do composto na gaiola ou estrado.

[002401 Após 24 h de exposição, os dorsos foram lavados suavemente com água e sabão para remover o fármaco não absorvido e secados de leve. Imediatamente após esta lavagem, o sangue foi colhido por punção cardíaca dos camundongos e através de punção venosa dos mini-porcos. A pele exterior (estrato córneo) foi então removida com fita adesiva. Após exposição da epiderme, foi retirada uma biópsia por perfuração de 0,5 cm. A. epiderme e derme rapidamente foram separadas, pesadas e o congeladas. Amostras semelhantes foram, obtidas na pós-administração de 48 h em camundongos e em 48 h, 94 h e 168 h (7 dias) pósadministração em mini-porcos.

[00241] As amostras de epiderme e derme foram homogeneizadas em 1:10 (p/v) de água usando um homogeneizador ultrassônico Covaris. As amostras foram extraídas em 3 volumes de acetonitrilo e quantificadas contra uma curva-padrão através de análise LC-MS. Como evidenciado pelo parâmetro farmacocinético AUCo-t· para o plasma, epiderme e derme apresentado na Tabela 7 abaixo, foi observada significativa exposição do composto em camadas da epiderme e derme, enquanto a exposição plasmática foi insignificante em camundongos na Formulação A e abaixo do limite de quantificação na Formulação B em. camundongos e em ambas as Formulações no mini-porco.

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Tabela 6

Formulação A	Formulação B
Composto 1	0,5%	Composto 1	0,5%
Ácido esteárico	b%	0 ctilidroxistearato	b-è
Álcool c e t o e s t e a. r i 1 i c o	5%	Trigliceridio de c a d. e 1 a C 8—C10	Z) /?
P a. 1 m i t a t. o d e isopropila	4%	Vaselina. (Pet.ro lato)	-.1 <0 ·> σι O\O
Octilidroxistearato	2 %	Ai-Me t i ip i rro 1 i dona.	10%
BRIJ S2 (PEG 2 éter estearilico)	1,08%
BRIJ S20 (PEG 20 éter estearilico)	6, 92%
ϊ'Ρ-Metilpirrolidina	10%
PEG400	10%
Água RO	5 h 5%

Tabela 7

	Fia sma AUCo-t (pg*h/ml)	Epiderme AUCo-t (pg*h/g)	Derme AUCo-t (pg*h/g)
C anoando n g'o d a r o aTil u 1 a ç a ο Ά	0, 022	1370	99
Camundongo da Fo rmu1a ção B	<0,001	107 0 0	1110
Mini porco da r o r m u 1 a ç a ο Ά	<0,001	1220	44
Mini porco da Fo rmu1a ção B	<0,001	2 4 60	8 8

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Ensaio 11: Farmacoainética do pulmão e plasma em camundongos

[ 00242j As concentrações plasmática e de pulmão do composto 1 e suas proporções foram determinadas da seguinte maneira. Foram, usados BALB/c de camundongos de Charles River Laboratories no ensaio. A Forma 1 do composto 1 do exemplo 2 foi formulado em 0,01% de Tween 80 em soro fisiológico normal (0,9% de cloreto de sódio na água) a uma concentração de 0,1 mg/ml como uma suspensão. Foi introduzida 50 pl da formulação de suspensão na traqueia de um camundongo por aspiração oral. Em vários pontos de tempo (0,083, 1, 4, 24, 48, 72 e 96 hr). Após a administração, foram retiradas amostras de sangue através de punção cardíaca e pulmões intactos foram retirados dos ratos. As amostras de sangue foram centrifugadas (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos a aproximadamente 12.000 rpm a 4 °C para coletar o plasma. Os pulmões foram acolchoados a seco, pesados e homogeneizados em uma diluição de 1:3 em água estéril. Os níveis plasmáticos e de pulmão do composto 1 foram determinados por análise LC-MS contra padrões analíticos construídos em uma curva padrão na matriz do teste. A boa exposição nos pulmões foi encontrada com. uma área sob a curva (ASC) (0-96 h) do pulmão de 360 pg h/g. A meia-vida pulmonar foi calculada em aproximadamente 40 horas. Foi determinada uma razão pulmão para plasma como a proporção de ASC do pulmão em pg h/ml para a ASC plasmática em pg h/ml, onde a ASC está convencionalmente definida como a área sob a curva do composto do teste versus tempo. A razão de ASC pulmão para plasma foi 1780, mostrando exposição muito baixa no plasma.

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Ensaio 12: Ensaio farmacodinâmico: inibição do pSTATl induzida por IFNy nos Olhos de Coelho

[00243] A capacidade de uma única administração intravitrea do composto do teste para inibir a fosforilação da proteína STATI (pSTATl) induzida por gamainterferona (ΙΓΝγ) foi medida nos tecidos vítreo e retina/coroide.

[00244] Foi preparada uma formulação de suspensão ao combinar o composto 1 do exemplo 2 (Forma 1) com 0,5% de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC E5), 0,02% de Tween 80 e 9 mg/ml de cloreto de sódio em. água purificada para atingir uma concentração-alvo de 20 mg/ml.

[00245] Foram usados coelhos machos brancos da Nova Zelândia (Liveon Biolabs, índia) para os estudos. Os animai foram aclimatados após a chegada às instalações de pesquisa (Jubilant Biosys Ltd., India). Cada coelho recebeu um total de duas injeções intravítreas (IVT) com um volume de dose total de 50 μΐ por olho. A primeira injeção IVT (45 μΐ por olho) forneceu 0,9 mg do composto do teste ou veículo. Uma semana depois, uma segunda injeção de TIV (5 μΐ por olho) forneceu IFNy (1 pg/olho; solução estoque 1 mg/ml; Kingfisner Biotech) ou veiculo para a indução da proteína IP-i0. No dia das injeções, os coelnos foram anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina (35 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) . Assim que estivessem, profundamente anestesiados, cada olho foi lavado com soro fisiológico estéril e foram feitas injeções IVT usado uma seringa de insulina 0,5 ml (50 unidades = 0,5 ml) com uma agulha de calibre 31. no lado supranasal de ambos os olhos ao marcar a posição com um paquímetro fixo Braunstein (2 3/4) 3,5 mm distante do músculo reto e 4 mm do limbo.

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[002461 Os tecidos foram coletados 2 horas após a segunda injeção IVT com IFNy. Os tecidos da retina/coroide (R/C) foram coletados e homogeneizados e os níveis de pSTATl foram medidos por Western Blot quantitativo no instrumento ProteinSimple WES. A percentagem de inibição de pSTATl induzida por IFNy foi calculada em comparação com os grupos veículo/veículo e veículo/IFNy.

[002471 Com um pré-tratamento de 1 semana antes do desafio com IFNy, a formulação da suspensão do composto 1 inibiu o pSTATl induzido pelo IFNy em 85%. Após um prétratamento de 3 meses com uma dose única da formulação da suspensão antes do desafio com IFNy, a formulação da suspensão do composto 1 inibiu o pSTATl induzido pelo IFNy em 76%.

[00248] Foi preparada uma formulação de suspensão ao combinar o composto 1 do exemplo 5 (Forma 2) com. 0,5% de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC E5) + 0,02% de Tween 80 em soro fisiológico normal para atingir uma concentração-alvo de 11,1 3,3 e 1,1 mg/ml.

[00249] Foram usados coelhos machos brancos da Nova Zelândia (Liveon Biolabs, índia) para os estudos. Os animais foram aclimatados após a chegada às instalações de pesquisa (Jubilant Biosys Ltd., índia). Cada coelho recebeu um total de duas injeções intravítreas (IVT) com. um volume de dose total de 50 μΐ por olho. A primeira injeção IVT (45 μΐ por olho) forneceu 500 μμ, 150 μμ, ou 50 μμ do composto do teste ou veículo. Duas semanas depois, uma segunda injeção de TIV (5 μΐ por olho) forneceu IFNy (1 μμ/olho; solução estoque 1 mq/ml; Kinqfisher Biotech) ou veículo para a indução da proteína IP-10. No dia das injeções, os coelhos foram

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113/117 anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina (35 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) . Assim, que estivessem profundamente anestesiados, cada olho foi lavado com soro fisiológico estéril e foram feitas injeções IVT usado uma seringa de insulina 0,5 ml (50 unidades = 0,5 ml) com uma agulha, de calibre 31 no lado supranasal de ambos os olhos ao marcar a posição com um paquimetro fixo Braunstein (2 3/4) 3,5 mm distante do músculo reto e 4 mm do limbo.

[00250] Qs tecidos foram coletados 2 noras após a segunda injeção IVT com IFNy. Qs tecidos da retina/coroide (R/C) foram coletados e homogeneizados e os níveis de pSTATl foram medidos por Western Blot quantitativo no instrumento ProteinSimple WES. A percentagem de inibição de pSTATl induzida por IFNy foi calculada em comparação com os grupos veiculo/veiculo e veiculo/IFNy.

[00251] Com um pré-tratamento de 2 semanas antes do desafio com IFNy, a formulação da suspensão do composto 1 inibiu a PSTATl induzida pelo IFNy em 79% para a dose de 50 0 pg, 58% para a. dose de 150 ug e 61% para a dose de 50 pg.

Ensaio 13: Triagem Kinome e coeficiente GINI [00252] Os compostos 1 e C-l foram rastreados em relação a outras quinases para avaliar seu perfil de s e 1 e t i v .1 d a. d e .

[00253] As cepas de fago T7 marcadas com quinase cresceram em paralelo em blocos de 24 poços em um hospedeiro de E. coli derivada da cepa BL21. A bactéria E. coli foi cultivada em fase logaritmica e infectada com. fago T7 de um estoque congelado (multiplicidade de infecção = 0,4) e incubada com agitação a 32 °C até a ruptura da célula (90Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 140/160

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150 minutos) . Os Usados foram centrifugados (6.000 x g) e filtrados (0,2 μπι) para remover os resíduos celulares. As quinases restantes foram produzidas em células HEK-293 e posteriormente marcadas com DNA para detecção por qPCR.

[00254] Pérolas magnéticas revestidas com estreptavidina foram, tratadas com pequenas moléculas ligantes biotiniladas durante 30 minutos à temperatura ambiente para gerar resinas de afinidade para os ensaios de quinase. As pérolas ligadas foram bloqueadas com. excesso de biotina e lavadas com tampão de bloqueio (SeaBlock (Pierce) 1% de BSA., 0,05% de Tween 20, 1 mM de DTT) para remover o ligante não ligado e reduzir a ligação não especifica do fago. As reações de ligação foram montadas ao combinar quinases, pérolas de afinidade ligadas e compostos de teste em. tampão de ligação 1 x (20% de SeaBlock, 0,17x PBS, 0,05% de Tween 20, 6 mM de DTT). Os compostos do teste foram preparados como estoques de 40x em 100% de DMSO e diluídos diretamente no ensaio. Todas as reações foram realizadas em 384 poços em. placas de polipropileno em. um volume final de 0,04 ml. As placas de ensaio foram incubadas à temperatura com agitação durante 1 hora e as pérolas de afinidade foram lavadas com tampão de lavagem (Ix PBS, 0,05% de Tween 20). As pérolas foram então ressuspendidas em tampão de eluição (Ix PBS, 0,05%; de Tween 20, 0,5 μΜ de ligante de afinidade não-biotinilado) e incubadas à temperatura ambiente com agitação durante 30 minutos. A concentração de quinase nos eiuatos zoi medida por pPCR.

[00255] Os compostos foram, filtrados a 1 μΜ e os resultados das interações de ligação da triagem primária na Tabelas 8 e 9 são relatados como % de inibição (=100Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 141/160

115/117 ((sinal do composto de teste-sinal do controle positivo)/((sinal do controle negativo)-(sinal do controle positivo))xlOO), onde o controle negativo é DMSO e o controle positivo é um composto de controle.

Tabela 8

Composto/Quinase	ALK	AURKA	CDK2	CDK7	CDK9	CSF1R	EPHB6
1	/ b	11	6	7 4	9	98	8 8	31
C-l	81	57	5 3	99	95	10 0	98	68

Tabela 9

Compo sto/Quinase	KIT	PAK4	PKAC- ALPHA	PLK4	SLK	SRC	SYK	VEGFR2
1	87	93	20	58	10 0	93	46	4 2
C-l	99	99	T Q	68	10 0	10 0	78	6 3

[00256] O Composto 1 apresentou inibição de ligação significativamente menor para CDK7 e CDK9 do que o composto C-l. O composto 1 também, teve inibição de ligação menor para várias outras quinases.

[00257] Ambos os compostos 1 e C-l foram testados contra 35 diferentes quinases. O coeficiente de Gini foi determinado para ambos os compostos. O composto 1 teve um coeficiente GINI de 0,62 e o composto C-l teve um coeficiente GINI de 0,46. O coeficiente de Gini é usado para expressar a seletividade de um composto em. relação a um painel de quinases (Graczyk, J. Med. Cheia., 2007, 50, 57735779). Um número superior corresponde a um. composto mais seletivo.

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[00258] A única diferença estrutural entre o composto 1 e o composto C-l é a presença de um grupo fluoro no núcleo. Foi demonstrado que esta diferença estrutural tem um efeito importante na seletividade do kinoma do composto.

Ensaio 14: Ensaio de citotoxidade

[002591 Um ensaio luminescente de viabilidade celular/citotoxicidade Titer-Glo foi realizado em células epiteliais BEAS-2B do pulmão humano (ATCC), sob condição de crescimento normal.

[002 60] As células foram cultivadas a 37 °C em. uma incubadora umidificada a 5% de CO₂ no meio 50% DMEM/50% F-12 (Life Technologies), suplementado com 10% de FBS (Hyclone), 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina (Life Technologies) e 2 mM de GlutaMAX (Life Technologies). No dia 1 do ensaio, as células foram semeadas a uma densidade de 500 células/poço em placas com 384 poços para cultura de tecido (Corning) com 25 μΐ de meio, e ficaram durante a noite na incubadora para aderência. No dia 2 do ensaio, 5 μΐ de meio de cultura contendo as dose-respostas de compostos de teste foram adicionados, e incubado a 37 °C por 48 horas. 30 pL de solução de detecção CellTiter-Gloe (Promega) foi posteriormente adicionado, misturado em um agitador orbital por 5 min. e incubado por mais 10 min. antes de ser lido no leitor EnVision. Os sinais de luminescência foram registrados e calculados os valores de controle de DMSO.

[00261] Para a análise da dose-resposta, os dados de controle de percentagem de DMSO foram inseridos em gráfico versus as concentrações dos compostos para obter as curvas de dose-resposta por linha conectando cada ponto dos dados.

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A concentração na qual cada curva cruza o limiar de 15% de inibição é definida como a CC15.

[00262] É esperado que os compostos de teste exibindo maior valor de CC15 nesse ensaio tenham menor probabilidade de causar citotoxicidade.

[002631 O composto 1 exibiu um CC15 de 3,16 μΜ enquanto o composto C-l exibiu um CC15 de 630 riM. Portanto, o composto 1 tem menor probabilidade de causar citotoxicidade do que o composto C-l com base neste ensaio.

[00264] A única diferença estrutural entre o composto e o composto C-l é a presença de um grupo fluoro no núcleo. Foi demonstrado que esta diferença estrutural tem um efeito importante na citotoxicidade do composto.

[00265] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a aspectos específicos ou suas modalidades, aqueles que são versados na técnica compreenderão que diversas alterações podem ser feitas ou equivalentes podem, ser substituídos, sem se afastar do verdadeiro espírito e do escopo da invenção. Além disso, na medida do permitido pelos estatutos e pelos regulamentos aplicáveis sobre patentes, todas as publicações, patentes e pedidos citados aqui são incorporados por referência em. sua totalidade, da mesma forma como se cada documento tivesse sido incorporado individualmente por sua referência.

Claims (43)

1. REIVINDICAÇÕES

   0 QUE SE REIVINDICA É:

   Um composto de fórmula:

   
2. 2. Um composto de fórmula:

   

   

   onde a forma cristalina é caracterizada por um padrão de difração de raio X do pó que inclui picos de difração no 2Θ va 1 ores de 10,61 ±0,20, 11, 84±0,2u, 14,94 + 0,2u, 18,26+0,2 e 19,06±0,20.
3. 4. A forma cristalina da Reivindicação 3, onde o padrão de difração de raio x do pó é ainda caracterizado pc

   Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 145/160 ter picos de ditração adicionais nos 2Θ valores de 13,3210,20, 17, 6910,20, e 21,1010,20.
4. 5. A forma cristalina da Reivindicação 4, onde o padrão de difração de raio x do pó é ainda caracterizado por ter dois ou mais picos de difração nos 2Θ valores selecionados a partir de 10,8510,20, 16,1410,20, 16,3510,20, 18,4310,20, 19,2010,20, 19,4910,20, 20,7210,20, 21,9410,20, 22,6410,20, 23,6410,20, 25,1910,20 e 28,0810,20.
5. 6. A forma cristalina da. Reivindicação 3, onde a forma cristalina é caracterizada por um padrão de difração de raios x do pó, no qual as posições dos picos estão substancialmente de acordo com as posições dos picos do padrão mostrado na Figura 1.
6. 7. A forma cristalina da Reivindicação 3 onde a forma cristalina é c. a r a c t e r i z a d a por um. traço de calorimetria diferencial exploratória registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto, que mostra um máximo no fluxo de calor endotérmico a uma temperatura, entre 268 °C e 277 °C.
7. 8. A forma cristalina da Reivindicação 3 onde a forma cristalina é caracterizada por um traço de calorimetria diferencial exploratória registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto, que mostra um. máximo no fluxo de calor endotérmico a uma temperatura entre 272,6 °C± 2 °C.
8. 9. A forma cristalina da Reivindicação 3, onde a forma cristalina é caracterizada por um traço de calorimetria diferencial exploratória substancialmente de acordo com o indicado na Figura. 2.
9. 10. Uma forma cristalina do composto de fórmula:

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   onde a forma cristalina é caracterizada por um padrão de difração de raio x do pó compreendendo os picos de driração nos 2Θ valores de 8,1U, 2 0, 8,9 !± u, 2 0, 15, 29±u,20, 16,7010,20, 18,0010,20 e 20,1810,20.
10. 11. A forma cristalina da Reivindicação 10 onde o padrão de difração de raios x de pó é caracterizado com dois ou mais picos de difração adicionais em valores 2Θ selecionados a partir de 7,69 1 0,20, 10,66 1 0,20, 11,46 1 0, 20, 11, 91 1 0,20, 15, 80 1 0, 20, 17,02 1 0,20, 18, 83 1 0,20, 22,39 1 0,20, 22,98 1 0,20, 24,89 1 0, 20 e 2 6, 54 1 0,20.
11. 12. A forma cristalina da Reivindicação 10, onde a forma cristalina é caracterizada por um padrão de difração de raios x do pó, no qual as posições dos picos estão substancialmente de acordo com as posições dos picos do padrão mostrado na Figura 6.
12. 13. A forma cristalina da Reivindicação 10 onde a forma cristalina é caracterizada por um traço de calorimetria diferencial exploratória registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto, que mostra um máximo no fluxo de calor endotérmico a uma temperatura entre 215 °C e 229 °C.
13. 14. A forma cristalina da Reivindicação 10 onde a forma cristalina é caracterizada por um traço de calorimetria diferencial exploratória registrado a uma taxa de aquecimento de 10 °C por minuto, que mostra um máximo no fluxo de calor endotérmico a uma temperatura entre 221,7 °C ± 3 °C.

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    4/9
14. 15. A forma cristalina da Reivindicação 10, onde a forma cristalina é c a r ac ter i z a da por um traço de calorimetria diferencial exploratória substancialmente de acordo com o indicado na Figura 7.
15. 16. Uma composição farmacêutica caracterizada por o composto das Reivindicações 1 ou 2 ou a forma cristalina de qualquer uma das Reivindicações 3 a 15 e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico.
16. 17. A composição farmacêutica da Reivindicação 16, on cie a composição é a de qua cia para aplrcaçao o curar.
17. 18. A composição farmacêutica da Reivindicação 17, onde a composição é adequada para injeção intravítrea.
18. 19. A composição farmacêutica da Reivindicação 18, onde a composição é uma. suspensão.

    

    Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 148/160 com um composto de formula 7:

    

    Onde R^A é hidrogênio ou 2,5-dioxopirrolidinil e (b) preparando opcionalmente um sal aceitável do ponto de vista farmacêutico para fornecer um composto de fórmula 1 ou seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico.
19. 21. Um composto da fórmula 6:

    

    ou seu sal.
20. 22. Um método de preparação da forma cristalina da. Reivindicação 3 compreendendo:

    (a) formar uma mistura homogênea de 1-(2-( 6-(2-etil-5fluoro-4-hidroxifenili~4-fluoro-lH-indazol-S-il) 1,4,6,7-tetraidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2morfolinoetan-l-ona em um solvente polar aprótico ou um solvente polar miscivel em água, ou em uma mistura de solvente aprótico polar e um solvente polar miscivel em água a uma temperatura entre 45 e 75 °C;

    (b) adicionar a mistura homogênea a uma mistura de um solvente miscivel água e água, a uma temperatura entre 60 e 90 °C para produzir uma segunda mistura;

    Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 149/160 (c) adicionar lentamente a água à segunda mistura a uma temperatura entre 60 e 90 ^,JC para formar uma pasta fluida; e (d) isolar a forma cristalina a partir da pasta fluida.
21. 23. O método da Reivindicação 22, onde o solvente aprótico polar da etapa (a) é selecionado a partir do grupo consistindo de DMSO, DMF, NMP, DM.A.C e nitrometano, o solvente polar miscível em água da etapa (a) é selecionado a partir do grupo consistindo de acetonitrila, acetona, metanol, etanol e THF e o solvente miscível em. água da etapa (b) é selecionado do grupo consistindo de acetonitrila, acetona, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, nbutanol, THF, DMSO, DMF, NMP, DMAc e nitrometano.
22. 24. O composto como reivindicado na Reivindicação 1 ou 2 ou a forma cristalina como reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 3 a 15, para uso no tratamento de uma doença ocular em um mamífero.
23. 25. O composto ou a forma cristalina da Reivindicação 24, onde a doença ocular é uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia da retina ou ceratoconjuntivite atópica.
24. 26. O composto ou a forma cristalina da Reivindicação 25, onde a doença ocular é edema macular diabético ou uveíte.
25. 27. Uso de um composto como reivindicado nas Reivindicações 1 ou 2 ou a forma cristalina em qualquer uma das Reivindicações 3 a 15 para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença ocular em. um mamífero.
26. 28. O uso da Reivindicação' 27, onde a doença ocular é uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético,

    Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 150/160 doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia da retina ou ceratoconjuntivite atópica.
27. 29. Um método para tratar uma doença ocular em um mamífero, o método compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo o composto da Reivindicação 1 ou 2 ou a forma cristalina de qualquer uma das Reivindicações 3 a 15 e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico para o olho do mamífero.
28. 30. O método da Reivindicação 29, onde a doença, ocular é uveíte, retinopatia diabética, edema macular diabético, doença do olho seco, degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia da retina ou ceratoconjuntivite atópica.
29. 31. O método da Reivindicação 30, onde a doença ocular é uveíte ou edema macular diabético.
30. 32. O composto como reivindicado na Reivindicação 1 ou 2 ou a forma cristalina como reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 3 a 15, para uso no tratamento de uma doença de pele em um mamífero.
31. 33. O composto ou a forma cristalina da Reivindicação 32, onde a doença inflamatória da pele é dermatite atópica.
32. 34. Uso de um composto como reivindicado nas Reivindicações 1 ou 2 ou a forma cristalina em qualquer uma das Reivindicações 3 a 15 para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença de pele em um mamífero.
33. 35. O uso da Reivindicação 34, na qual a doença inflamatória da pele é dermatite atópica.
34. 36. Um método de tratamento de uma doença inflamatória de pele em. um mamífero, o método compreendendo aplicar uma composição farmacêutica compreendendo o composto da Reivindicação 1 ou 2 ou a forma cristalina de qualquer uma

    Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 151/160

    8/9 das Reivindicações 3 a 15 e urn carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico para a pele do mamífero.
35. 37. 0 método da Reivindicação 36, na qual a doença inflamatória da pele é dermatite atópica.
36. 38. 0 composto de qualquer uma das Reivindicações 1 ou

    2 ou a forma cristalina como reivindicado em. qualquer uma das Reivindicações 3 a 15 para uso no tratamento de uma doença respiratória em um mamífero.
37. 39. 0 composto ou a forma cristalina da Reivindicação

    38, onde a doença respiratória é asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, pneumonite, fibrose pulmonar idiopática, lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, rejeição do transplante pulmonar, disfunção primária do enxerto, pneumonia em organização, rejeição aguda do transplante pulmonar, bronquiolite linfocítica, disfunção crônica restritiva do enxerto pulmonar, disfunção neutrofílica do enxerto ou bronquiolite obliterante.
38. 40. O composto ou a forma cristalina da Reivindicação 39, onde a doença respiratória é asma, disfunção crônica do enxerto pulmonar ou doença pulmonar obstrutiva.
39. 41. Uso de um composto como reivindicado nas Reivindicações 1 ou 2 ou a forma cristalina em. qualquer uma das Reivindicações 3 a 15 para a produção de um medicamento para o tratamento de uma doença respiratória em um mamífero.
40. 42. O uso da Reivindicação 41, onde a doença respiratória é asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, pneumonite, fibrose pulmonar idiopática, lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, rejeição do transplante

    Petição 870190110020, de 29/10/2019, pág. 152/160 pulmonar, disfunção primária do enxerto, pneumonia em organização, rejeição aguda do transplante pulmonar, bronquiolite linfocítica, disfunção crônica restritiva do enxerto pulmonar, disfunção neutrofílica do enxerto ou bronquiolite obliterante.
41. 43. Um. método para tratar uma doença respiratória em um mamífero, o método comipreendendo administrar ao mamífero uma composição farmacêutica compreendendo o composto das Reivindicações 1 ou 2, ou a forma cristalina de qualquer uma das Reivindicações 3 a 15 e um carreador aceitável do ponto de vista farmacêutico.
42. 44. 0 método da Reivindicação 43, onde a doença respiratória é a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cistica, pneumonite, fibrose pulmonar idiopática, lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, bronquite, enfisema, rejeição do transplante pulmonar, disfunção primária do enxerto, pneumonia em organização, rejeição aguda do transplante pulmonar, bronquiolite linfocítica, disfunção crônica restritiva do enxerto pulmonar, disfunção neutrofílica do enxerto ou bronquiolite obliterante.
43. 45. 0 método da Reivindicação 44, onde a doença respiratória é asma, disfunção crônica do enxerto pulmonar ou doença pulmonar obstrutiva crônica.