ES2908756T3 - Compuesto inhibidor de JAK de imidazo-piperidina condensada - Google Patents

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Robert Murray Mckinnell
Venkat R Thalladi
Hao Zhang
Marta Dabros
Jerry Nzerem
Noah Benjamin
Melanie A Kleinschek
Glenn D Crater
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Abstract

Un compuesto de fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto inhibidor de JAK de imidazo-piperidina condensada
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La invención se refiere a un compuesto inhibidor de la cinasa JAK útil para el tratamiento de múltiples enfermedades, particularmente enfermedades oculares, de la piel y respiratorias. La invención también se refiere a formas cristalinas del compuesto, a composiciones farmacéuticas que comprenden tal compuesto, compuesto para su uso en el tratamiento de enfermedades susceptibles de tratamiento con un inhibidor de JAK, y a procedimientos e intermedios útiles para la preparación del compuesto.
Estado de la técnica
Las citocinas son moléculas de señalización intercelular que incluyen quimiocinas, interferones, interleucinas, linfocinas y el factor de necrosis tumoral. Las citocinas son fundamentales para el crecimiento celular normal y la inmunorregulación, pero también propician enfermedades inmunitarias y contribuyen al crecimiento de células malignas. Niveles elevados de muchas citocinas han sido implicados en la patología de un gran número de enfermedades o afecciones, particularmente las enfermedades caracterizadas por inflamación. Muchas de las citocinas implicadas en enfermedades actúan a través de rutas de señalización que dependen de la familia de tirosina cinasas Janus (JAK), que señalizan a través de la familia Transductor de Señales y Activador de la Transcripción (STAT) de factores de transcripción.
La familia JAK comprende cuatro miembros, JAK1, JAK2, JAK3 y tirosina cinasa 2 (TYK2). La unión de una citocina a un receptor de citocinas dependiente de JAK induce la dimerización del receptor, lo que da como resultado la fosforilación de los restos de tirosina en la cinasa JAK, afectando a la activación de JAK. Las JAK fosforiladas, a su vez, se unen a diversas proteínas STAT y las fosforilan, las cuales dimerizan, se internalizan en el núcleo celular y modulan directamente la transcripción génica, conduciendo, entre otros efectos, a los efectos aguas abajo asociados a las enfermedades inflamatorias. Las JAK habitualmente se asocian a receptores de citocinas en parejas como homodímeros o heterodímeros. Citocinas específicas se asocian con emparejamientos de JAK específicos. Cada uno de los cuatro miembros de la familia JAK está implicado en la señalización de al menos una de las citocinas asociadas con inflamación.
La inflamación desempeña un papel destacado en muchas enfermedades oculares, incluyendo uveítis, retinopatía diabética, edema macular diabético, enfermedad del ojo seco, degeneración macular senil, oclusión venosa retiniana y queratoconjuntivitis atópica. La uveítis abarca múltiples afecciones inflamatorias intraoculares y suele ser autoinmunitaria, produciéndose sin un desencadenante infeccioso conocido. Se estima que la afección afecta a aproximadamente 2 millones de pacientes en los EE.UU. En algunos pacientes, la inflamación crónica asociada con la uveítis conduce a la destrucción del tejido y es la quinta causa principal de ceguera en los EE.UU. Las citocinas elevadas en los ojos de los pacientes con uveítis que señalizan a través de la ruta JAK-STAT incluyen a IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-23 y IFN-y. (Horai y Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744; Ooi et al, Clinical Medicine and Research, 2006, 4, 294-309). Las terapias existentes para la uveítis a menudo son deficientes y muchos pacientes están poco controlados. Los esteroides, aunque a menudo eficaces, están asociados a cataratas y aumento de la presión intraocular/glaucoma.
La retinopatía diabética (RD) está provocada por daños en los vasos sanguíneos de la retina. Es la causa más común de pérdida de visión entre las personas con diabetes. Las vías angiogénicas e inflamatorias desempeñan un papel importante en la enfermedad. A menudo, la RD progresará a edema macular diabético (EMD), la causa más frecuente de pérdida visual en pacientes con diabetes. Se estima que la afección afecta a aproximadamente 1,5 millones de pacientes solo en los EE.UU., de los cuales aproximadamente el 20 % tienen enfermedad que afecta a ambos ojos. Las citocinas que señalizan a través de la ruta JAK-STAT, tales como IL-6, así como otras citocinas, tales como IP-10 y MCP-1 (denominada alternativamente CCL2), cuya producción está impulsada en parte por la señalización de la ruta JAK-STAT, se cree que desempeñan un papel en la inflamación asociada con RD/EMD (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Supl. 1, 1-12; Sohn et al., American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686-694; Owen y Hartnett, Curr Diab Rep, 2013, 13, 476-480; Cheung et al, Molecular Vision, 2012, 18, 830-837; Dong et al, Molecular Vision, 2013, 19, 1734-1746; Funatsu et al, Ophthalmology, 2009, 116, 73-79). Las terapias existentes para EMD son deficientes: los tratamientos anti-VEGF intravítreos solo son eficaces en una fracción de pacientes y los esteroides se asocian con cataratas y aumento de la presión intraocular.
La enfermedad del ojo seco (EOS) es un trastorno multifactorial que afecta aproximadamente a 5 millones de pacientes en los EE.UU. Se cree que la inflamación de la superficie ocular desempeña un papel importante en el desarrollo y la propagación de esta enfermedad. Se han observado niveles elevados de citocinas tales como SL-1, lL-2, lL-4, lL-5, IL-6 e IFN-y en los líquidos oculares de pacientes con EOS. (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), y los niveles a menudo se correlacionan con la gravedad de la enfermedad. Además, se cree que la degeneración macular senil y la queratoconjuntivitis atópica están asociadas con citocinas dependientes de JAK.
La oclusión venosa retiniana (OVR) es una enfermedad incapacitante visual de alta prevalencia. La obstrucción del flujo sanguíneo retiniano puede conducir a daños en la vasculatura retiniana, hemorragia e isquemia tisular. Aunque las causas de la OVR son multifactoriales, se ha demostrado que son importantes tanto los mediadores vasculares como los inflamatorios (Deobhakta et al, International Journal of Inflammation, 2013, ID de artículo 438412). Las citocinas que señalizan a través de la ruta JAK-STAT, tales como IL-6 e IL-13, así como otras citocinas, tales como MCP-1, cuya producción está impulsada en parte por la ruta de señalización JAK-STAT, se han detectado en niveles elevados en tejidos oculares de pacientes con OVR (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911). Si bien muchos pacientes con OVR se tratan con fotocoagulación, esta es una terapia inherentemente destructiva. También se utilizan agentes anti-VEGF, pero solo son eficaces en una fracción de pacientes. Además, se ha demostrado que los medicamentos esteroideos que reducen el nivel de inflamación en el ojo (implantes de acetónido de triamcinolona y dexametasona) proporcionan resultados beneficiosos para pacientes con determinadas formas de OVR, pero también se ha demostrado que provocan cataratas y aumento de la presión intraocular/glaucoma.
La dermatitis atópica (DA) es una enfermedad inflamatoria de la piel crónica común, que afecta a unos 14 millones de personas solo en los Estados Unidos. Se estima que la DA afecta al 10-20 % de los niños y al 1-3 % de los adultos en los países desarrollados (Bao et al., JAK-STAT, 2013, 2, e24137) y la prevalencia está aumentando. La elevación de las citocinas proinflamatorias que dependen de la ruta JAK-STAT, en particular, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e IFNy, se ha asociado con la AD (Bao et al., Leung et al., The Journal of Clinical Investigation, 2004, 113, 651-657). Además, la regulación al alza de lL-31, otra citocina que señaliza a través de un emparejamiento de JAK, se ha demostrado que tiene un papel en el prurito asociado con el estado crónico de la DA. (Sunkoly et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2006, 117, 411-417)
El asma es una enfermedad crónica de las vías respiratorias para la que no hay prevención ni cura. La enfermedad se caracteriza por inflamación, fibrosis, hiperreactividad y remodelado de las vías respiratorias, todo lo cual contribuye a la limitación del flujo de aire. Se calcula que 300 millones de personas en todo el mundo padecen asma y se estima que el número de personas con asma aumentará en más de 100 millones para 2025. Aunque la mayoría de los pacientes puede conseguir controlar los síntomas del asma con el uso de corticoesteroides inhalados que pueden combinarse con un modificador de leucotrienos y/o un agonista beta de acción prolongada, sigue existiendo un subconjunto de pacientes con asma grave cuya enfermedad no se controla mediante terapias convencionales. Las citocinas implicadas en la inflamación asmática que señalizan a través de la ruta JAK-STAT incluyen IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, linfopoyetina estromal tímica (TSLP), interferón-y (IFNy) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF). La inflamación de las vías respiratorias es característica de otras enfermedades respiratorias además del asma. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis quística (FQ), la neumonitis, las enfermedades pulmonares intersticiales (incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática), la lesión pulmonar aguda, el síndrome de dificultad respiratoria aguda, la bronquitis, el enfisema, la bronquiolitis obliterante y la sarcoidosis también son enfermedades del aparato respiratorio en las que se cree que la fisiopatología está relacionada con las citocinas de señalización de JAK.
Dada la cantidad de citocinas elevadas en las enfermedades inflamatorias y que cada citocina está asociada con un emparejamiento de JAK en particular, un inhibidor químico con actividad universal contra todos los miembros de la familia JAK podría tener una amplia utilidad para el tratamiento de enfermedades oculares, de la piel y respiratorias. Sigue existiendo la necesidad de un potente inhibidor universal de JAK.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención proporciona un compuesto inhibidor de JAK para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
En particular, en un aspecto, la invención proporciona 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona de fórmula
Figure imgf000003_0001
en lo sucesivo en el presente documento compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
La invención también proporciona formas cristalinas del compuesto, la Forma 1 y la Forma 2.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto 1, o una de sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un transportador farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, la invención proporciona un compuesto I para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad ocular en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero un compuesto 1, o una composición farmacéutica de la invención. En un aspecto, la enfermedad ocular es uveítis, retinopatía diabética, edema macular diabético, enfermedad del ojo seco, degeneración macular senil, oclusión venosa retiniana y queratoconjuntivitis atópica. En particular, la enfermedad ocular es edema macular diabético o uveítis.
En otro aspecto más, la invención proporciona un compuesto I para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria de la piel, en particular, la dermatitis atópica, comprendiendo el método aplicar el compuesto 1 o una composición farmacéutica de la invención en la piel del mamífero.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un compuesto I para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad respiratoria en un mamífero, comprendiendo el método administrar el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica de la invención al mamífero.
En aspectos separados y distintos, la invención también proporciona procedimientos de síntesis e intermedios descritos en el presente documento, que son útiles para la preparación del compuesto 1.
La invención también proporciona el compuesto 1 como se describe en el presente documento para su uso en terapia médica, así como el uso del compuesto de la invención en la fabricación de una formulación o medicamento para el tratamiento de una enfermedad ocular, una enfermedad de la piel o una enfermedad respiratoria en un mamífero. Breve descripción de los dibujos
Se ilustran diversos aspectos de la presente invención por referencia a los dibujos adjuntos.
La figura 1 muestra un patrón de difracción de rayos X de polvo (PXRD) de la forma 2 cristalina del compuesto 1 (en lo sucesivo en el presente documento forma 2).
La figura 2 muestra un termograma de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la forma 2 cristalina.
La figura 3 muestra un gráfico del análisis termogravimétrico (TGA) de la forma 2 cristalina.
La figura 4 muestra una isoterma de sorción dinámica de humedad (DMS) de la forma 2 cristalina observada a una temperatura de aproximadamente 25 °C
La figura 5 muestra una imagen microscópica de luz polarizada de la forma 2.
La figura 6 muestra un patrón de difracción de rayos X de polvo (PXRD) de la forma 1 cristalina del compuesto 1 (en lo sucesivo en el presente documento forma 1).
La figura 7 muestra un termograma de la calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la forma 1 cristalina.
La figura 8 muestra un gráfico del análisis termogravimétrico (TGA) de la forma 1 cristalina.
La figura 9 muestra una isoterma de sorción dinámica de humedad (DMS) de la forma 1 cristalina observada a una temperatura de aproximadamente 25 °C
La figura 10 muestra una imagen microscópica de luz polarizada de la forma 1.
Descripción detallada de la invención
Las estructuras químicas se nombran en el presente documento de acuerdo con las convenciones de la IUPAC implementadas en el software ChemDraw (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA).
Además, la porción imidazo de la parte tetrahidroimidazopiridina en la estructura del presente compuesto existe en formas tautoméricas. El compuesto se podría representar de manera equivalente como
Figure imgf000004_0001
De acuerdo con la convención de la IUPAC, estas representaciones dan lugar a una numeración diferente de los átomos de la porción tetrahidroimidazopiridina. Por consiguiente esta estructura se designa 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-3.4.6.7-tetrahidro-5H-imidazo[4.5-c1piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona. También se puede designar 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1.4.6.7-tetrahidro-5H-imidazo[4.5-c1piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona. Se comprenderá que aunque las estructuras se muestran. o nombran. en una forma particular. la invención también incluye el tautómero de las mismas.
Los compuestos de la invención contienen varios grupos básicos y. por lo tanto. los compuestos pueden existir en forma de base libre o en diversas formas de sal. tales como una forma de sal monoprotonada. una forma de sal diprotonada o mezclas de las mismas. Todas estas formas se incluyen dentro del alcance de la presente invención. a menos que se indique otra cosa.
Esta invención también incluye compuestos marcados isotópicamente de fórmula 1. es decir. compuestos de fórmula 1 en donde un átomo ha sido reemplazado o enriquecido con un átomo que tiene el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica que predomina en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar a un compuesto de fórmula 1 incluyen. pero no se limitan a. 2H. 3H. 11C. 13C. 14C. 13N. 15N. 15O. 17O. 18O y 18F. Son de interés particular los compuestos de fórmula 1 enriquecidos con tritio o con carbono-14. compuestos que se pueden usar. por ejemplo. en estudios de distribución de tejidos. También son de interés particular los compuestos de fórmula 1 enriquecidos con deuterio. especialmente en un sitio de metabolismo. cuyos compuestos se espera que tengan una mayor estabilidad metabólica. Además son de interés particular los compuestos de fórmula 1 enriquecidos con un isótopo de emisión de positrones. tal como 11C. 18F. 15O y 13N. compuestos que se pueden usar. por ejemplo. en estudios de tomografía por emisión de positrones (PET).
Definiciones
Cuando se describe la presente invención incluyendo sus diversos aspectos y realizaciones. los siguientes
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un paciente que necesita tratamiento.
El término "tratar" o "tratamiento" significa prevenir. mejorar o suprimir la afección médica. enfermedad o trastorno que se está tratando (por ejemplo. una enfermedad respiratoria) en un paciente (en particular un ser humano) o aliviar los síntomas de la afección médica. enfermedad o trastorno.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" significa una sal que es aceptable para la administración a un paciente o un mamífero. tal como un ser humano (por ejemplo. sales que tienen una seguridad aceptable en mamíferos para una pauta de dosificación dada). Las sales farmacéuticamente aceptables representativas incluyen las sales de los ácidos acético. ascórbico. bencenosulfónico. benzoico. canforsulfónico. cítrico. etanosulfónico. edisílico. fumárico. gentísico. glucónico. glucurónico. glutámico. hipúrico. bromhídrico. clorhídrico. isetiónico. láctico. lactobiónico. maleico. málico. mandélico. metanosulfónico. múcico. naftalenosulfónico. naftaleno-1.5-disulfónico. naftaleno-2.6-disulfónico. nicotínico. nítrico. orótico. pamoico. pantoténico. fosfórico. succínico. sulfúrico. tartárico. p-toluenosulfónico y xinafoico y similares.
La expresión "sal del mismo" significa un compuesto formado cuando el hidrógeno de un ácido se reemplaza por un catión. tal como un catión metálico o un catión orgánico y similares. Por ejemplo. el catión puede ser una forma protonada de un compuesto de fórmula 1. es decir. una forma en la que uno o más grupos amino han sido protonados por un ácido. Habitualmente. la sal es una sal farmacéuticamente aceptable. aunque esto no es necesario para las sales de los compuestos intermedios que no están destinadas a la administración a un paciente.
La expresión "grupo protector de amino" significa un grupo protector adecuado para prevenir reacciones no deseadas en un nitrógeno de amino. Los grupos protectores de amino representativos incluyen. pero no se limitan a. formilo; grupos acilo. por ejemplo. grupos alcanoílo. tales como acetilo y tri-fluoroacetilo; grupos alcoxicarbonilo. tales como ferc-butoxicarbonilo (Boc); grupos arilmetoxicarbonilo. tales como benciloxicarbonilo (Cbz) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc); grupos arilmetilo. tales como bencilo (Bn). tritilo (Tr) y 1.1-di-(4'-metoxifenil)metilo; grupos sililo. tales como trimetilsililo (TMS). ferc-butildimetilsililo (TBDMS). [2-(trimet¡ls¡l¡l)etox¡]met¡lo (SEM) y similares.
La expresión "grupo protector de hidroxi" significa un grupo protector adecuado para evitar reacciones no deseadas en un grupo hidroxi. Los grupos protectores de hidroxi representativos incluyen. pero no se limitan a. grupos alquilo. tales como metilo. etilo y ferc-butilo; grupos acilo. por ejemplo. grupos alcanoílo. tales como acetilo; grupos arilmetilo. tales como bencilo (Bn). p-metoxibencilo (PMB). 9-fluorenilmetilo (Fm) y difenilmetilo (benzhidrilo. DPM); grupos sililo. tales como trimetilsililo (TMS) y ferc-butildimetilsililo (TBS) y similares.
Se describen numerosos grupos protectores y su introducción y eliminación. en T. W. Greene y P.G.M. Wuts. Protecting Groups in Organic Synthesis. tercera edición. Wiley. Nueva York
Procedimientos de síntesis generales
El compuesto 1 y sus productos intermedios, se pueden preparar de acuerdo con los siguientes métodos y procedimientos generales que usan materiales de partida y reactivos disponibles en el mercado o preparados de manera rutinaria. Además, se pueden usar o se pueden producir compuestos que tienen un átomo o un grupo funcional ácido o básico en forma de una sal a menos que se indique lo contrario (en algunos casos, el uso de una sal en una reacción particular requerirá la conversión de la sal en una forma no de sal, por ejemplo, una base libre, usando procedimientos habituales antes de realizar la reacción).
Aunque puede mostrarse o describirse una realización particular de la presente invención en los siguientes procedimientos, los expertos en la técnica reconocerán que también pueden prepararse otras realizaciones o aspectos de la presente invención usando dichos procedimientos o mediante el uso de otros métodos, reactivos y materiales de partida conocidos por los expertos en la técnica. En particular, se apreciará que el compuesto 1 se puede preparar por diferentes rutas de proceso en las que los reactivos se combinan en órdenes diferentes para proporcionar productos intermedios diferentes en el camino a la producción de los productos finales.
La preparación de 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (compuesto 1) se describe con detalle en los ejemplos adjuntos. Las etapas principales se resumen en el esquema 1
Esquema 1
Figure imgf000006_0001
donde el reactivo 7 es 2-morfolinoacetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, es decir, la variable RA representa el agente de activación 2,5-dioxopirrolidinilo, como se ha descrito en el ejemplo 1. Como alternativa, ácido morfolin-4-il acético, es decir RA representa hidrógeno, se usa como el reactivo 7, en las condiciones habituales de formación de enlace amida, como se ha descrito en el ejemplo 4.
El producto intermedio 3 se puede preparar como se describe en las preparaciones 1 y 3 a continuación. Un método alternativo para la preparación del producto intermedio 5 protegido clave se ilustra en el esquema 2.
Figure imgf000007_0001
El bromoindazol aldehido 8 se puede hacer reaccionar con el compuesto de imina protegida con bencilo 2 para proporcionar intermedio 9. La reacción se realiza habitualmente en presencia de bisulfito sódico, a una temperatura de entre aproximadamente 130 °C y aproximadamente 140 °C durante entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6 horas o hasta que la reacción sustancialmente se complete. El compuesto 9 se reduce usando un agente reductor tal como borohidruro sódico para proporcionar el compuesto 10 , que se combina con el feniltrifluoroborato 11 protegido en las condiciones habituales de acoplamiento de Suzuki-Miyaura para proporcionar el intermedio 5. La reacción habitualmente se lleva a cabo a temperatura elevada en presencia de un catalizador de paladio. El miembro de Suzuki 11, mostrado en el esquema 2 como la sal de trifluoroborato de potasio se puede preparar haciendo reaccionar el boronato correspondiente (Producto intermedio 1-5 de la preparación 1 a continuación) con difluoruro de hidrógeno y potasio para proporcionar intermedio 11. Como alternativa, se puede usar el producto intermedio de boronato en lugar del trifluoroborato 11.
Por consiguiente, en un aspecto del método, la invención proporciona un proceso para preparar un compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, comprendiendo el proceso hacer reaccionar un compuesto de fórmula 6 con un compuesto de fórmula 7 , como se ilustra en el esquema 1, para proporcionar un compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto más del método, la invención proporciona un compuesto de fórmula 5 y un compuesto de fórmula 6, útiles para preparar un compuesto de fórmula 1.
Formas cristalinas
En otro aspecto, la invención proporciona 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (1) en forma cristalina.
Forma 1
La forma 1 cristalina de la invención es una forma libre cristalina del compuesto 1. En un aspecto, La forma 1 está caracterizada por un patrón de difracción de rayos X de polvo (PXRD) que tiene picos de difracción significativos, entre otros picos, a valores de 20 de 8,16 ± 0,20, 8,97 ± 0,20, 15,29 ± 0,20, 16,70 ± 0,20, 18,00 ± 0,20 y 20,18 ± 0,20. La forma 1 se puede caracterizar además por un patrón de PXRD que tiene dos o más picos de difracción adicionales, que incluyen tres o más y cuatro o más picos de difracción adicionales a valores de 20 seleccionados entre 7,69 ± 0,20, 10,66 ± 0,20, 11,46 ± 0,20, 11,91 ± 0,20, 15,80 ± 0,20, 17,02 ± 0,20, 18,83 ± 0,20, 22,39 ± 0,20, 22,98 ± 0,20, 24,89 ± 0,20 y 26,54 ± 0,20. En otro aspecto, la forma 1 está caracterizada por un patrón de PXRD que tiene tres, cuatro, cinco o seis picos de difracción a valores de 20 seleccionados entre 8,16 ± 0,20, 8,97 ± 0,20, 15,29 ± 0,20, 16,70 ± 0,20, 18,00 ± 0,20 y 20,18 ± 0,20.
Como es bien sabido en el campo de la difracción de rayos X de polvo, las posiciones de los picos del patrón de PXRD son relativamente menos sensibles a los detalles experimentales, tales como los detalles de la preparación de muestras y la geometría del instrumento, que las alturas máximas relativas. Por lo tanto, también se divulga la forma 1 cristalina caracterizada por un patrón de difracción de rayos X de polvo en el que las posiciones pico están sustancialmente de acuerdo con las mostradas en la figura 6.
En otro aspecto, la forma 1 cristalina se caracteriza por su comportamiento cuando se expone a temperatura elevada. Como se ha demostrado en la figura 7, el trazo de la calorimetría diferencial de barrido (DSC) registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto presenta un pico en el flujo de calor endotérmico, identificado como una transición de fusión, en el intervalo de aproximadamente 210 °C a aproximadamente 234 °C o en el intervalo de entre aproximadamente 215 °C a aproximadamente 229 °C, o en el intervalo de entre aproximadamente 220 °C a aproximadamente 224 °C. La forma 1 cristalina está caracterizada por un trazo de calorimetría diferencia de barrido registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto que muestra un máximo en el flujo de calor endotérmico con un pico a aproximadamente 221,7 °C. El trazo del análisis termogravimétrtico (TGA) de la figura 8 no muestra una pérdida de peso significativa a temperaturas por debajo del inicio de la descomposición a aproximadamente 293 °C.
En la figura 9 se muestra un trazo representativo de la sorción dinámica de humedad (DMS) para la forma 1 cristalina en forma libre de la invención. La forma 1 cristalina demostró una pequeña histéresis entre dos ciclos de sorción y desorción. La forma 1 demostró aproximadamente un 0,99 % de aumento de peso en el intervalo de humedad del 5 % al 70 % de humedad relativa y aproximadamente un 1,32 % de aumento de peso en el intervalo de humedad del 5 % al 90 % de humedad relativa a temperatura ambiente, como se muestra en la figura 9. Se considera que la forma 1 es ligeramente higroscópica.
Se ha mostrado que la forma 1 cristalina es estable después de exposición a temperatura y humedad elevadas. Después de 36 semanas en condiciones aceleradas de 40 °C y 75 % de humedad relativa, no se observaron cambios estadísticamente significativos en la pureza química.
La forma 1 se puede preparar disolviendo el compuesto 1 en etanol después de calentamiento, seguido de la adición de acetonitrilo, en donde la proporción de acetonitrilo a etanol es aproximadamente 1:1 o de aproximadamente 1:3 a 3:1. La mezcla resultante se calienta después, seguido de agitación a una temperatura de entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 25 °C durante entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 30 horas o durante aproximadamente 16 horas. Después el sólido se filtra y se seca para proporcionar la forma 1.
También se puede preparar la forma 1 mezclando el compuesto 1 con etanol y agitando la mezcla a una temperatura de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 80 °C durante aproximadamente de 2 a 30 minutos, o aproximadamente 10 minutos, seguido de la adición lenta de acetonitrilo a una temperatura de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 80 °C, en donde la proporción en volumen de acetonitrilo a etanol es de aproximadamente 3:1 a 1:1 o aproximadamente 1,5:1. Se pueden añadir semillas de la forma 1 y agitarse la mezcla de reacción a una temperatura de entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 25 °C durante entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 30 horas o durante aproximadamente 18 horas. Después el sólido se filtra y se seca para proporcionar la forma 1.
Forma 2
La forma 2 cristalina de la invención es una forma libre cristalina del compuesto 1. En un aspecto, la forma 2 está caracterizada por un patrón de difracción de rayos X de polvo (PXRD) que tiene picos de difracción significativos, entre otros picos, a valores de 20 de 10,61 ± 0,20, 11,84 ± 0,20, 14,94 ± 0,20, 18,26 ± 0,20 y 19,06 ± 0,20. La forma 2 se puede caracterizar además por un patrón de PXRD que tiene picos de difracción adicionales a valores de 20 de 13,32 ± 0,20, 17,69 ± 0,20 y 21,10 ± 0,20. La forma 2 se puede caracterizar además por un patrón de PXRD que tiene dos o más picos de difracción adicionales, que incluyen tres o más y cuatro o más picos de difracción adicionales a valores de 20 seleccionados entre 10,85 ± 0,20, 16,14 ± 0,20, 16,35 ± 0,20, 18,43 ± 0,20, 19,20 ± 0,20, 19,49 ± 0,20, 20,72 ± 0,20, 21,94 ± 0,20, 22,64 ± 0,20, 23,64 ± 0,20, 25,19 ± 0,20 y 28,08 ± 0,20.
En otro aspecto, la forma 2 está caracterizada por un patrón de PXRD que tiene tres, cuatro, cinco o seis picos de difracción a valores de 20 seleccionados entre 10,61±0,20, 11,84 ± 0,20, 13,32 ± 0,20, 14,94 ± 0,20, 17,69 ± 0,20, 18,26 ± 0,20, 19,06 ± 0,20 y 21,10 ± 0,20.
Como es bien sabido en el campo de la difracción de rayos X de polvo, las posiciones de los picos del patrón de PXRD son relativamente menos sensibles a los detalles experimentales, tales como los detalles de la preparación de muestras y la geometría del instrumento, que las alturas máximas relativas. Por lo tanto, también se divulga la forma 2 cristalina caracterizada por un patrón de difracción de rayos X de polvo en el que las posiciones pico están sustancialmente de acuerdo con las mostradas en la figura 1.
La estructura de la forma 2 cristalina se ha caracterizado además por análisis de difracción de rayos X de monocristal. Los cristales pertenecen a un sistema cristalino ortorrómbico y un grupo espacial Pbca. Las dimensiones de la unidad celular son: a = 9,7245(11) A, b = 16,8197(14) A, c = 32,604(4) A, a = 90°, p = 90°, y = 90°, volumen = 5332,8(10) A3. La densidad calculada es de 1,302 g/cm3. Los cristales contienen ocho moléculas por unidad celular. La estructura confirma que los cristales no contienen agua u otras moléculas de disolvente y que la estructura molecular es consistente con la estructura del compuesto del ejemplo 1 como se ha representado en el presente documento. Los picos de difracción de rayos X de polvo predichos para las posiciones atómicas derivadas concuerdan bien con los resultados observados.
En otro aspecto, la forma 2 cristalina se caracteriza por su comportamiento cuando se expone a temperatura elevada. Como se ha demostrado en la figura 2, el trazo de la calorimetría diferencial de barrido (DSC) registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto presenta un pico en el flujo de calor endotérmico, identificado como una transición de fusión, en el intervalo de aproximadamente 268 °C a aproximadamente 277 °C o en el intervalo de entre aproximadamente 270 °C a aproximadamente 275 °C o en el intervalo de entre aproximadamente 271 °C a aproximadamente 274 °C. La forma 2 cristaliza está caracterizada por un trazo de calorimetría diferencial de barrido registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto que muestra un máximo en el flujo de calor endotérmico con un pico a aproximadamente 272,6 ± 2 °C.
El trazo del análisis termogravimétrico (TGA) de la figura 3 no muestra una pérdida de peso significativa a temperaturas por debajo del inicio de la descomposición a aproximadamente 269 °C.
En la figura 4 se muestra un trazo representativo de la sorción dinámica de humedad (DMS) para la forma 2 cristalina en forma libre de la invención. La forma 2 cristalina no muestra histéresis entre dos ciclos de sorción y desorción y demuestra una propensión excepcionalmente pequeña a la higroscopicidad. La forma 2 demostró aproximadamente un 0,18 % de aumento de peso en el intervalo de humedad del 5 % al 90 % de humedad relativa y aproximadamente un 0,12 % de aumento de peso en el intervalo de humedad del 5 % al 70 % de humedad relativa a temperatura ambiente, como se muestra en la figura 4. Se considera que la forma 2 no es higroscópica.
La forma 2 se puede preparar disolviendo el compuesto 1 del ejemplo 1 en DMSO (por ejemplo, a una proporción de 1 g de compuesto 1 durante de 1 a 3 ml o aproximadamente 2 ml de DMSO) a una temperatura de entre aproximadamente 45 a 75 °C o a aproximadamente 60 °C, seguido de la adición de metanol, en donde la proporción en volumen de metanol a DMSO es de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 1:1 o aproximadamente 1:2. La mezcla homogénea se añade después gota a gota a una solución premezclada de metanol y agua (en donde la proporción de metanol a DMSO está entre 1,5 y 3 a 1), a una temperatura de entre aproximadamente 60 y aproximadamente 90 °C o aproximadamente 75 °C, en donde la proporción en volumen de la solución premezclada de metanol a agua es de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 1:2 o aproximadamente 1:0,9. Después se deja la mezcla en agitación a una temperatura de entre aproximadamente 60 y aproximadamente 90 °C o aproximadamente 75 °C durante de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 horas o aproximadamente 1 hora. Después se puede añadir agua lentamente a una temperatura de entre aproximadamente 60 y aproximadamente 90 °C o aproximadamente 75 °C, en donde la proporción en volumen de agua a metanol es de entre 2 y 4. La suspensión resultante se enfría después lentamente a temperatura ambiente (habitualmente, una temperatura de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 25 °C), habitualmente durante aproximadamente 2 a aproximadamente 12 horas o aproximadamente 6 horas. La suspensión se mantiene después a temperatura ambiente y después se filtra y se lava con una mezcla de agua y metanol a aproximadamente del 50 a aproximadamente el 90 % o a aproximadamente el 70 % de agua, para proporcionar la forma 2.
En un aspecto, la invención proporciona un método para preparar la forma 2 cristalina que comprende:
(a) formar una mezcla homogénea de 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona en un disolvente aprótico polar o en un disolvente polar miscible en agua o en una mezcla de un disolvente aprótico polar y un disolvente polar miscible en agua, a una temperatura de entre 45 y 75 °C;
(b) añadir la mezcla homogénea a una mezcla de un disolvente miscible en agua y agua a una temperatura de entre 60 y 90 °C para dar una segunda mezcla;
(c) añadir agua lentamente a la segunda mezcla a una temperatura de entre 60 y 90 °C para formar una suspensión y
(d) aislar la forma cristalina de la suspensión.
En algunos aspectos, el disolvente aprótico polar de la etapa (a) se selecciona entre el grupo que consiste en DMSO, DMF, NMP, DMAc y nitrometano, el disolvente polar miscible en agua de la etapa (a) se selecciona entre el grupo que consiste en acetonitrilo, acetona, metanol, etanol y THF y el disolvente miscible en agua de la etapa (b) se selecciona entre el grupo que consiste en acetonitrilo, acetona, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, THF, DMSO, DMF, NMP, DMAc y nitrometano. En algunos aspectos, el disolvente aprótico polar de la etapa (a) es DMSO, el disolvente polar miscible en agua de la etapa (a) es metanol y el disolvente miscible en agua de la etapa (b) es metanol.
En algunos aspectos, la suspensión obtenida en la etapa (c) se enfría a una temperatura de entre aproximadamente 20 y 25 °C antes de la etapa (d).
Como alternativa, la forma 2 se puede formar mediante agitación del compuesto 1 obtenido en ejemplo 1 en una mezcla de un disolvente polar miscible en agua y agua, a una temperatura de entre 60 y 90 °C. En algunos aspectos, la proporción de disolvente a agua es de aproximadamente 1:1 o de 2:1 a 0,5:1. En algunos aspectos, el disolvente polar miscible en agua se selecciona entre el grupo que consiste en acetonitrilo, acetona, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, THF, DMSO, DMF, NMP, DMAc y nitrometano.
Composiciones farmacéuticas
El compuesto 1 y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo se usan habitualmente en la forma de una composición o formulación farmacéutica. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden administrar de manera ventajosa a un paciente por cualquier vía de administración aceptable, que incluye, pero no se limita a, los modos de administración oral, por inhalación, inyección óptica, tópica (incluyendo transdérmica), rectal, nasal y parenteral.
Por consiguiente, en uno de sus aspectos de composiciones, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y el compuesto 1 , donde, como se ha definido anteriormente, "compuesto 1 " significa el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Opcionalmente, dichas composiciones farmacéuticas pueden contener otros agentes terapéuticos y/o de formulación si se desea. Cuando se analizan las composiciones y los usos de las mismas, el compuesto 1 en el presente documento se puede denominar también "principio activo".
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o la forma 1 o la forma 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la composición farmacéutica es adecuada para su aplicación al ojo. En algunos aspectos, la composición es adecuada para su inyección dentro del ojo. En algunos aspectos, la composición es adecuada para inyección intravítrea. En algunos aspectos, la composición es una suspensión. En algunos aspectos, la composición es una suspensión cristalina. En algunos aspectos, la composición es una suspensión de forma 1 o de forma 2.
Las composiciones farmacéuticas de la invención habitualmente contienen una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 1. Los expertos en la técnica reconocerán, sin embargo, que una composición farmacéutica puede contener más de una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, composiciones a granel o menos de una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, dosis unitarias individuales diseñadas para la administración múltiple para conseguir una cantidad terapéuticamente eficaz.
Habitualmente, dichas composiciones farmacéuticas contendrán de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 95 % en peso del agente activo; que incluye, por ejemplo, de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 30 % en peso y de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 % en peso del agente activo.
Puede usarse cualquier vehículo o excipiente convencional en las composiciones farmacéuticas de la invención. La elección de un vehículo o excipiente particular, o combinaciones de vehículos o excipientes, dependerá del modo de administración que se use para tratar a un paciente o tipo de afección médica o patología particular. En este sentido, la preparación de una composición farmacéutica adecuada para un modo particular de administración está bien dentro del alcance de los expertos en las técnicas farmacéuticas. Además, los vehículos o excipientes utilizados en las composiciones farmacéuticas de la presente invención están disponibles en el mercado. A modo de ilustración adicional, las técnicas de formulación convencionales se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000) y H.C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a edición, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).
Los ejemplos representativos de los materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa, tal como celulosa microcristalina y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones de tampón de fosfato y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en composiciones farmacéuticas.
Las composiciones farmacéuticas se preparan normalmente mezclando o combinando completa e íntimamente el agente activo con un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más ingredientes opcionales. Después, la mezcla resultante combinada uniformemente puede conformarse o cargarse en comprimidos, cápsulas, píldoras y similares, usando procedimientos y equipos convencionales.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se envasan preferentemente en una forma farmacéutica unitaria. La expresión "forma farmacéutica unitaria" se refiere a una unidad físicamente aislada adecuada para administrar a un paciente, es decir, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de agente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, ya sea sola o en combinación con una o más unidades adicionales. Por ejemplo, dichas formas farmacéuticas unitarias pueden ser cápsulas, comprimidos, píldoras y similares o envases unitarios adecuados para administración ocular o parenteral.
En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para la administración oral. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, píldoras, pastillas para chupar, obleas, grageas, polvos, gránulos; o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite; o como un elixir o jarabe; y similares; conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del compuesto 1 como principio activo.
Cuando se prevé la administración oral en una forma farmacéutica sólida (es decir, en forma de cápsulas, comprimidos, píldoras y similares), las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán normalmente el agente activo y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Opcionalmente, dichas formas farmacéuticas sólidas pueden comprender: cargas o expansores, tales como almidones, celulosa microcristalina, lactosa, fosfato dicálcico, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; humectantes, tales como glicerol; agentes disgregantes, tales como croscarmelosa de sodio, agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y/o carbonato de sodio; agentes retardantes de la solución, tales como parafina; aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes, tales como alcohol cetílico y/o monoestearato de glicerol; absorbentes, tales como caolín y/o arcilla de bentonita; lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio y/o mezclas de los mismos; agentes colorantes y agentes tamponantes.
También pueden estar presentes en las composiciones farmacéuticas de la invención agentes de liberación, agentes humectantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfato de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamina tetraacético, sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. Los agentes de recubrimiento para comprimidos, cápsulas, píldoras y similares, incluyen los utilizados para recubrimientos entéricos, tales como ftalato de acetato de celulosa, acetato ftalato de polivinilo, ftalato de hidroxipropil metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, ácido metacrílico, copolímeros de éster del ácido metacrílico, trimelitato de acetato de celulosa, carboximetil etil celulosa, acetato succinato de hidroxipropil metil celulosa y similares.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden formularse para proporcionar una liberación lenta o controlada del agente activo usando, a modo de ejemplo, hidroxipropil metil celulosa en proporciones variables u otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Además, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden formularse de manera que liberen el principio activo solamente o, preferentemente, en una determinada parte del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden utilizarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. El agente activo también puede estar en forma microencapsulada, si fuera apropiado, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente.
Las formas farmacéuticas líquidas adecuadas para la administración oral incluyen, a modo de ilustración, emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires. Las formas farmacéuticas líquidas habitualmente comprenden el agente activo y un diluyente inerte, tal como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (esp., de semilla de algodón, de cacahuete, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de sésamo), ácido oleico, glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Como alternativa, determinadas formulaciones líquidas pueden convertirse, por ejemplo, mediante secado por pulverización, en un polvo, que se usa para preparar formas farmacéuticas sólidas mediante procedimientos convencionales.
Las suspensiones, además del principio activo, pueden contener agentes de suspensión tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto y mezclas de los mismos.
El compuesto 1 se puede administrar también por vía parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal). Para la administración parenteral, el agente activo normalmente se mezcla con un vehículo adecuado para la administración parenteral que incluye, a modo de ejemplo, soluciones acuosas estériles, solución salina, alcoholes de bajo peso molecular tales como propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, gelatina, ésteres de ácidos grasos tales como oleato de etilo y similares. Las formulaciones parenterales también pueden contener uno o más antioxidantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, agentes humectantes, emulsionantes, agentes tamponantes o agentes dispersantes. Estas formulaciones se pueden esterilizar usando un medio inyectable estéril, un agente esterilizante, filtración, irradiación o calor.
El compuesto 1 también se puede formular en forma de una suspensión o solución acuosa estéril para inyección ocular. Los excipientes útiles que se pueden incluir en dicha formulación acuosa incluyen polisorbato 80, polímeros de celulosa tales como carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, acetato de sodio, citrato de sodio, histidina, a-a-trehalosa dihidrato, sacarosa, polisorbato 20, hidroxipropil-p-ciclodextrina, cloruro de benzalconio, Amberlite iRP-69, éteres de polioxietilenglicol (laurilo, estearilo y oleílo), sal sódica del ácido etilendiaminatetraacético, taurocolato de sodio, saponinas y Cremophor EL, policarbófilo-cisteína, goma xantana, goma gellan, ácido hialurónico, liposomas y fosfato de sodio. Potenciadores de la permeabilidad, tensioactivos, ácidos biliares, ciclodextrinas tales como 2-hidroxipropilp-ciclodextrina y agentes quelantes pueden estar incluidos en la formulación. También se pueden incluir en la formulación los oligonucleótidos cilindricos con una superficie externa hidrófila y una superficie interna lipófila que tienen la habilidad de formar complejos con un agente activo. El alcohol bencílico puede servir como conservante y se puede incluir cloruro de sodio para ajustar la tonicidad. Además, se pueden añadir ácido clorhídrico y/o hidróxido sódico a la solución para ajustar el pH. Las formulaciones acuosas para inyección ocular se pueden preparar en forma libre de conservantes.
La formulación ocular puede permitir la liberación sostenida del principio activo al ojo. La formulación ocular se puede formular en forma de una emulsión (de aceite en agua o de agua en aceite), una suspensión o una pomada. La formulación en suspensión puede contener el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como una forma cristalina, por ejemplo la forma 1 o la forma 2 o en un estado amorfo.
El compuesto 1 se puede formular también para ser adecuado para la dosificación en gotas para los ojos o en forma de un implante intravítreo. El implante puede permitir el suministro constante de niveles terapéuticos de fármaco. Los implantes de depósito normalmente se fabrican con un núcleo de fármaco en gránulos rodeado de sustancias no reactivas tales como silicio, etileno-acetato de vinilo (EVA) o alcohol polivinílico (PVA); estos implantes no son biodegradables y se pueden suministrar cantidades continuas de un fármaco durante meses o años. También se pueden usar implantes de matriz. Estos habitualmente se usan para suministrar una dosis de carga seguida de dosis decrecientes del fármaco durante un periodo de tiempo de 1 día a 6 meses. Lo más común es que se fabriquen a partir de los copolímeros de ácido poliláctico (PLA) y/o ácido polilacticoglicólico (PLGA), que degradan a agua y dióxido de carbono. También se puede usar iontoforesis. Es una técnica no invasiva en la que se aplica una pequeña corriente eléctrica para aumentar la penetración del fármaco ionizado dentro del tejido.
La tecnología de encapsulamiento celular (ECT), que es un sistema de liberación basado en células, también se puede usar para suministrar el agente terapéutico al ojo. Habitualmente, las células modificadas genéticamente se empaquetan en un tubo hueco de membrana semipermeable, lo cual impide la entrada de células inmunitarias y permite que los nutrientes y las moléculas terapéuticas se difundan libremente a través de la membrana. Dos extremos de la sección de polímero están cerrados herméticamente y se coloca un lazo de titanio en el extremo de anclaje, el cual se implanta en la pars plana y se ancla a la esclerótica.
El compuesto 1 se puede formular en cualquier forma que permita la administración al fondo del ojo. En la bibliografía se conocen ejemplos de los modos de administración (Kuno et al, Polymers, 2011, 3, 193-221, del Amo et al, Drug Discovery Today, 2008, 13, 135-143, Short, Toxicologic Pathology, 2008, 36, 49-62). Dichos modos de administración incluyen, pero no se limitan a, administración supracoroidal, la cual permite la administración a la coroides y la retina a través del espacio supracoroidal, administración subtenoniana, administración periocular, lentes de contacto, tapones lagrimales y tapones esclerales. El compuesto 1 se puede administrar también por inyección periocular, supraescleral, retrobulbar o subconjuntival.
El compuesto 1 se puede administrar en forma de una emulsión, micro o nanosferas poliméricas, liposomas, micro o nanopartículas, microesferas, micelas o dendrímeros. Los polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como polilactida y PLGA se pueden usar. El compuesto 1 se puede encapsular.
Además, el compuesto 1 se puede formular para administración tópica a la piel como una pomada o crema. Las formulaciones en pomada son preparaciones semisólidas que tienen una base de un material oleoso o grasoso que normalmente es transparente. Los materiales oleosos adecuados para su uso en formulaciones en pomada incluyen vaselina (vaselina líquida), cera de abejas, manteca de cacao, manteca de karité y alcohol cetílico. Opcionalmente, las pomadas pueden incluir además emolientes y potenciadores de la penetración, si se desea.
Las formulaciones en crema pueden prepararse como emulsiones que comprenden una fase oleosa y una fase acuosa, incluyendo normalmente agua purificada. Los componentes de las formulaciones en crema pueden incluir: bases oleosas, tales como vaselina, aceites minerales, aceites vegetales y animales y triglicéridos; bases de crema, tales como alcoholes de lanolina, ácido esteárico y alcohol cetoestearílico; una base de gel, tal como alcohol polivinílico; disolventes, tal como, propilenglicol y polietilenglicol; emulsionantes, tales como polisorbatos, estearatos, tales como estearato de glicerilo, octilhidroxiestearato, estearato de polioxilo, PEG estearil éteres, palmitato de isopropilo y monoestearato de sorbitano; estabilizantes, tales como polisacáridos y sulfito de sodio; emolientes (es decir, humectantes), tales como triglicéridos de cadena media, miristato de isopropilo y dimeticona; agentes endurecedores, tales como alcohol cetílico y alcohol estearílico; agentes antimicrobianos, tales como metilparabeno, propilparabeno, fenoxietanol, ácido sórbico, diazolidinil urea e hidroxianisol butilado; potenciadores de la penetración, tales como W-metilpirrolidona, propilenglicol, monolaurato de polietilenglicol y similares y agentes quelantes, tales como edetato disódico.
Como alternativa, las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan para la administración por inhalación. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración por inhalación estarán normalmente en forma de un aerosol o un polvo. Dichas composiciones se administran generalmente usando dispositivos de administración bien conocidos, tales como un inhalador de dosis medida, un inhalador de polvo seco, un nebulizador o un dispositivo de entrega similar.
Cuando se administran por inhalación usando un recipiente presurizado, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán normalmente el principio activo y un propulsor adecuado, tales como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. Además, la composición farmacéutica puede estar en forma de una cápsula o cartucho (hecho, por ejemplo, de gelatina) que comprende el compuesto 1 y un polvo adecuado para su uso en un inhalador de polvo. Las bases en polvo adecuadas incluyen, a modo de ejemplo, lactosa o almidón.
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran composiciones farmacéuticas representativas de la presente invención. Forma farmacéutica sólida oral en comprimido
El compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se combina en seco con celulosa microcristalina, polivinil pirrolidona y croscarmelosa sódica en una proporción de 4:5:1:1 y se comprime en comprimidos para proporcionar una dosis unitaria de, por ejemplo, 5 mg, 20 mg o 40 mg de agente activo por comprimido.
Forma farmacéutica sólida oral en cápsula
El compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se combina con celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona y croscarmelosa de sodio en una relación de 4:5:1:1 mediante granulación húmeda y se cargan en cápsulas de gelatina o hidroxipropil metilcelulosa para proporcionar una dosis unitaria de, por ejemplo, 5 mg, 20 mg o 40 mg de agente activo por cápsula.
Formulación líquida
Una formulación líquida que comprende el compuesto 1 (0,1 %), agua (98,9 %) y ácido ascórbico (1,0 %) se forma mediante la adición de un compuesto de la invención a una mezcla de agua y ácido ascórbico.
Forma farmacéutica oral con recubrimiento entérico
El compuesto 1 se disuelve en una solución acuosa que contiene polivinipirrolidona y se aplica como recubrimiento mediante pulverización sobre celulosa microcristalina o perlas de azúcar en una proporción de 1:5 p/p de agente activo:perlas y después se aplica un aumento de aproximadamente el 5 % en peso de un recubrimiento entérico que comprende un copolímero acrílico. Las perlas con recubrimiento entérico se cargan en cápsulas de gelatina o hidroxipropil metilcelulosa para proporcionar una dosis unitaria de, por ejemplo, 30 mg de agente activo por cápsula. Forma farmacéutica oral con recubrimiento entérico
Un recubrimiento entérico que comprende una combinación de Eudragit-L® y Eudragit-S® o succinato de acetato de hidroxipropil metilcelulosa se aplica a una forma farmacéutica oral en comprimido o una forma farmacéutica oral en cápsula descrita anteriormente.
Formulación acuosa para inyección ocular
Cada ml de una suspensión acuosa estéril incluye de 5 mg a 50 mg del compuesto 1, cloruro sódico para la tonicidad, alcohol bencílico al 0,99 % (p/v) como conservante, carboximetilcelulosa sódica al 0,75 % y polisorbato al 0,04 %. Se pueden incluir hidróxido de sodio o ácido clorhídrico para ajustar el pH a de 5 a 7,5.
Formulación acuosa para inyección ocular
Una suspensión acuosa sin conservantes incluye de 5 mg/ml a 50 mg/ml del compuesto 1 en fosfato sódico 10 mM, cloruro de sodio 40 mM, polisorbato 20 al 0,03 % y sacarosa al 5 %.
Formulación en pomada para administración tópica
El compuesto 1 se combina con vaselina, triglicérido C8-C10, octilhidroxiestearato y W-metilpirrolidona en una relación que proporciona una composición que contiene del 0,05 % al 5 % de agente activo en peso.
Formulación en pomada para administración tópica
El compuesto 1 se combina con vaselina blanca, propilenglicol, mono y diglicéridos, parafina, hidroxitolueno butilado y edetato de calcio disódico en una relación que proporciona una composición que contiene del 0,05 % al 5 % de agente activo por peso.
Formulación en pomada para administración tópica
El compuesto 1 se combina con aceite mineral, parafina, carbonato de propileno, vaselina blanca y cera blanca para proporcionar una composición que contiene del 0,05 % al 5 % de agente activo en peso.
Formulación en crema para administración tópica
Se combina aceite mineral con el compuesto 1, propilenglicol, palmitato de isopropilo, polisorbato 60, alcohol cetílico, monoestearato de sorbitán, estearato de polioxilo 40, ácido sórbico, metilparabeno y propilparabeno para formar una fase oleosa, que se combina con agua purificada mediante combinación por cizalla para proporcionar una composición que contiene del 0,05 % al 5 % de agente activo en peso.
Formulación en crema para administración tópica
Una formulación en crema que comprende el compuesto 1, alcohol bencílico, alcohol cetílico, ácido cítrico anhidro, mono y diglicéridos, alcohol oleílico, propilenglicol, cetoestearil sulfato de sodio, hidróxido de sodio, alcohol estearílico, triglicéridos y agua contiene del 0,05 % al 5 % de agente activo en peso.
Formulación en crema para administración tópica
Una formulación en crema que comprende el compuesto 1, alcohol cetoestearílico, miristato de isopropilo, propilenglicol, cetomacrogol 1000, dimeticona 360, ácido cítrico, citrato de sodio y agua purificada, con imidurea, metilparabeno y propilparabeno, como conservantes, contiene del 0,05 % al 5 % de agente activo en peso.
Composición en polvo seco
El compuesto 1 micronizado (1 g) se mezcla con lactosa molida (25 g). Esta mezcla combinada se carga después en blísteres individuales de un envase blíster desplegable en una cantidad suficiente para proporcionar de entre aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 4 mg del compuesto 1 por dosis. El contenido de los blísteres se administra usando un inhalador de polvo seco.
Composición de inhalador de dosis medida
El compuesto 1 micronizado (10 g) se dispersa en una solución preparada disolviendo lecitina (0,2 g) en agua desmineralizada (200 ml). La suspensión resultante se seca por pulverización y después se microniza para formar una composición micronizada que comprende partículas que tienen un diámetro medio inferior a aproximadamente 1,5 pm. La composición micronizada se carga después en cartuchos de inhalador de dosis medida que contienen 1,1,1,2-tetrafluoroetano presurizado en una cantidad suficiente para proporcionar de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 4 mg del compuesto 1 por dosis cuando se administra mediante el inhalador de dosis medida. Composición del nebulizador
El compuesto 1 (25 mg) se disuelve en una solución que contiene 1,5-2,5 equivalentes de ácido clorhídrico, seguido de la adición de hidróxido de sodio para ajustar el pH de 3,5 a 5,5 y de un 3% en peso de glicerol. La solución se agita bien hasta que se disuelven todos los componentes. La solución se administra usando un dispositivo nebulizador que proporciona de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 4 mg del compuesto 1 por dosis.
Utilidad
El compuesto 1 ha demostrado ser un potente inhibidor de la familia de enzimas JAK: JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Enfermedades oculares
Se ha demostrado que muchas enfermedades oculares están asociadas a elevaciones de citocinas proinflamatorias que dependen de la ruta JAK-STAT. Dado que el compuesto 1 presenta una inhibición potente de las cuatro enzimas JAK, se espera que inhiba potentemente la señalización y los efectos patogénicos de numerosas citocinas (tales como IL-6, IL-2 y IFN-y), que señalizan a través de JAK, así como que prevenga el aumento de otras citocinas (tales como MCP-1 e IP-10), cuya producción está impulsada por la señalización de la ruta JAK-STAT.
En particular, el compuesto 1 presentó valores de pCl50 de 6,4 o más (valores de CI50 de 400 nM o menos) para la inhibición de IL-6, IL-2 e IFNy/ señalización en los ensayos celulares descritos en los Ensayos 3 a 6, incluyendo ensayos que registran la inhibición de los efectos aguas abajo de la elevación de citocinas.
El estudio farmacocinético del Ensayo 7 demostró una exposición mantenida en ojos de conejo después de una única inyección intravítrea y una concentración en plasma al menos tres órdenes de magnitud inferior a la observada en el tejido vitreo.
Adicionalmente, la dosificación intravítrea del compuesto 1 ha demostrado una inhibición significativa de pSTAT3 inducida por IL-6 en el tejido retinianos/coroideo de rata, así como una inhibición significativa y mantenida de IP-10 inducida por IFN-y en el vitreo de conejo, así como en tejidos retinianos/coroideos. La dosificación intravítrea del compuesto 1 ha demostrado una inhibición significativa y mantenida de pSTATI inducida por IFN-y en el conejo.
Se espera que la inhibición mantenida de JAK ocular en ausencia de niveles sistémicos significativos dé lugar a una potente actividad antiinflamatoria local en el ojo sin efectos adversos de origen sistémico. Por tanto, se espera que el compuesto 1 sea beneficioso en una serie de enfermedades oculares que incluyen, pero sin limitación, uveítis, retinopatía diabética, edema macular diabético, enfermedad del ojo seco, degeneración macular senil, oclusión venosa retiniana, y queratoconjuntivitis atópica.
En particular, la uveítis (Horai y Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744), retinopatía diabética (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Supl. 1, 1-12), el edema macular diabético (Sohn et al., American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686-694), la enfermedad del ojo seco (Stevenson et al, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), la oclusión venosa retiniana (Shchuko et al, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911) y la degeneración macular senil (Knickelbein et al., Int Ophthalmol Clin, 2015, 55(3), 63-78) se caracterizan por la elevación de determinadas citocinas proinflamatorias que señalizan a través de la ruta JAK-STAT. Por consiguiente, el compuesto 1 puede ser capaz de aliviar la inflamación ocular asociada y de invertir la progresión de la enfermedad o proporcionar alivio de los síntomas en estas enfermedades.
En un aspecto, por lo tanto, la invención proporciona 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1.4.6.7- tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad ocular en un mamífero, comprendiendo el método administrar una composición farmacéutica que comprende 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y un transportador farmacéutico al ojo del mamífero. En un aspecto, la enfermedad ocular es uveítis, retinopatía diabética, edema macular diabético, enfermedad del ojo seco, degeneración macular senil, oclusión venosa retiniana 0 queratoconjuntivitis atópica. En un aspecto, el método comprende administrar el compuesto 1 por inyección intravítrea.
Enfermedad inflamatoria de la piel
La dermatitis atópica, por ejemplo, se ha asociado a la elevación de las citocinas proinflamatorias que dependen de la ruta JAK-STAT, en particular, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e IFNy. Además de la inhibición de citocinas en los ensayos celulares citados anteriormente, el compuesto 1 presentó un valor de CI50 de 13 nM para la inhibición de IL-13, como se describe en el Ensayo 2. Adicionalmente, las formulaciones en crema y pomada modelo del compuesto 1 han demostrado niveles dérmicos mantenidos durante al menos 2 días en ratones y al menos 7 días en cerditos enanos sin exposición plasmática detectable.
Se espera que los niveles dérmicos mantenidos del compuesto 1 en ausencia de niveles sistémicos significativos den como resultado una actividad antiinflamatoria y antipruriginosa local potente en la piel sin efectos adversos de origen sistémico. Por lo tanto, se espera que el compuesto 1 sea beneficioso en una serie de afecciones inflamatorias o pruriginosas que incluyen, pero sin limitación, alopecia areata, vitíligo, linfoma cutáneo de linfocitos T, prurigo nodular, liquen plano, amiloidosis cutánea primaria localizada, penfigoide ampolloso, manifestaciones cutáneas de la enfermedad del injerto contra el hospedador, penfigoide, lupus discoide, granuloma anular, liquen simple crónico, prurito vulvar/escrotal/perianal, liquen escleroso, picor de la neuralgia posherpética, liquen planopilar y foliculitis decalvante. En particular, la alopecia areata (Xing et al., Nat Med. septiembre de 2014;20(9): 1043-9), el vitíligo (Craiglow et al, JAMA Dermatol. octubre de 2015; 151(10): 1110-2), el linfoma cutáneo de linfocitos T (Netchiporouk et al., Cell Cycle. 2014; 13(21):3331-5), el prurigo nodular (Sonkoly et al., J Allergy Clin Immunol. febrero de 2006; 117(2):411-7), liquen plano (Welz-Kubiak et al., J Immunol Res. 2015;2015:854747), la amiloidosis cutánea primaria localizada (Tanaka et al., Br J Dermatol. 2009 Dec;161(6):1217-24), penfigoide ampolloso (Feliciani et al., Int J Immunopathol Pharmacol. mayo-agosto de 1999;12(2):55-61) y las manifestaciones dérmicas de la enfermedad del injerto contra el hospedador (Okiyama et al., J Invest Dermatol. abril de 2014; 134(4): 992-1000) se caracterizan por la elevación de determinadas citocinas que señalizan a través de la activación de JAK. Por consiguiente, el compuesto 1 puede ser capaz de aliviar la inflamación dérmica asociada o el prurito provocado por estas citocinas. En particular, se espera que el compuesto 1 sea útil para el tratamiento de la dermatitis atópica y otras enfermedades inflamatorias de la piel.
En un aspecto, por lo tanto, la invención proporciona 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1.4.6.7- tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria de la piel en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), comprendiendo el método aplicar una composición farmacéutica que comprende 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y un transportador farmacéutico en la piel del mamífero. En un aspecto, la enfermedad inflamatoria de la piel es dermatitis atópica.
El compuesto 1 de la invención también pueden usarse en combinación con antibióticos para grampositivos, tales como la mupirocina y el ácido fusídico, para tratar enfermedades inflamatorias de la piel. En un aspecto, por lo tanto, la invención proporciona 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria de la piel en un mamífero, comprendiendo el método aplicar el compuesto 1 y un antibiótico para grampositivos en la piel del mamífero. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, un antibiótico para grampositivos y un transportador farmacéuticamente aceptable.
Enfermedades respiratorias
Las citocinas que señalizan a través de la ruta JAK-STAT, en particular IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, linfopoyetina estromal tímica (TSLP), interferón-y (IFNy) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) también se han implicado en la inflamación asmática y en otras enfermedades respiratorias inflamatorias. Como se describe anteriormente, se ha demostrado que el compuesto 1 es un potente inhibidor de las enzimas JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2 y también ha demostrado una potente inhibición de las citocinas proinflamatorias en ensayos celulares.
La actividad antiinflamatoria de los inhibidores de JAK se ha demostrado sólidamente en modelos preclínicos de asma (Malaviya et al., Int Immunopharmacol, 2010, 10, 829,-836; Matsunaga et al., Biochem and Biophys Res Commun, 2011, 404, 261-267; Kudlacz et al., Eur J Pharmacol, 2008, 582, 154-161.) Por consiguiente, se espera que el compuesto 1 sea útil para el tratamiento de trastornos respiratorios inflamatorios, en particular, el asma. La inflamación y la fibrosis del pulmón son características de otras enfermedades respiratorias además del asma, tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística (FQ), neumonitis, enfermedades pulmonares intersticiales (incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática), lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, bronquitis, enfisema y bronquiolitis obliterante. El compuesto 1, por lo tanto, también se espera que sea útil para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la fibrosis quística, la neumonitis, las enfermedades pulmonares intersticiales (incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática), la lesión pulmonar aguda, el síndrome de dificultad respiratoria aguda, la bronquitis, el enfisema, la bronquiolitis obliterante y la sarcoidosis.
En un aspecto, por lo tanto, la invención proporciona 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad respiratoria en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), comprendiendo el método administrar al mamífero 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
En un aspecto, la enfermedad respiratoria es asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, neumonitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística (FQ), neumonitis, enfermedades pulmonares intersticiales (incluyendo la fibrosis pulmonar idiopática), lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, bronquitis, enfisema, bronquiolitis obliterante o sarcoidosis. En otro aspecto, la enfermedad respiratoria es asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
En un aspecto adicional, la enfermedad respiratoria es una infección pulmonar, una helmintosis, hipertensión pulmonar arterial, sarcoidosis, linfangioliomiomatosis, bronquiectasia o una enfermedad pulmonar infiltrante. En otro aspecto más, la enfermedad respiratoria es neumonitis inducida por fármacos, neumonitis inducida por hongos, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, neumonía eosinofílica aguda idiopática, neumonía eosinofílica crónica idiopática, síndrome hipereosinifílico, síndrome de Loffler, bronquiolitis obliterante con neumonía organizada o neumonitis inducida por inhibidores del punto de control inmunitario.
La invención proporciona 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en un método de tratamiento del asma en un mamífero, comprendiendo el método administrar al mamífero una composición farmacéutica que comprende 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y un transportador farmacéuticamente aceptable.
El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también puede ser útil para tratar enfermedades pulmonares eosinofílicas. La inflamación eosinofílica de las vías respiratorias es un rasgo característico de las enfermedades denominadas colectivamente enfermedades pulmonares eosinofílicas (Cottin et al., Clin. Chest. Med., 2016, 37(3), 535-56). Las enfermedades eosinofílicas se han asociado a la señalización de IL-4, IL-13 y IL-5. Las enfermedades pulmonares eosinofílicas incluyen infecciones (especialmente helmintosis), neumonitis inducida por fármacos (inducida, por ejemplo, por fármacos terapéuticos tales como antibióticos, fenitoína o l-triptófano), neumonitis inducida por hongos (por ejemplo, aspergilosis broncopulmonar alérgica), neumonitis por hipersensibilidad y granulomatosis eosinofílica con poliangeítis (antes conocida como síndrome de Churg-Strauss). Las enfermedades pulmonares eosinofílicas de etiología desconocida incluyen neumonía eosinofílica aguda idiopática, neumonía eosinofílica crónica idiopática, síndrome hipereosinofílico y síndrome de Loffler.
El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también puede ser útil para tratar la HAP. Un polimorfismo en el gen de la IL-6 se ha asociado a niveles elevados de IL-6 y un riesgo aumentado de desarrollar hipertensión arterial pulmonar (HAP) (Fang et al., J Am Soc Hypertens., 2017, 11(3), 171-177). Corroborando la función de la IL-6 en la HAP, la inhibición de la cadena del receptor de IL-6 gp130 mejoró la enfermedad en un modelo en rata de HAP (Huang et al., Can J Cardiol., 2016, 32(11), 1356.e1-1356.e10).
El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también puede ser útil para tratar enfermedades pulmonares no alérgicas tales como la sarcoidosis y la linfangioliomiomatosis. Se ha implicado a citocinas tales como IFNy, IL-12 e IL-6 en una gama de enfermedades pulmonares no alérgicas, tales como la sarcoidosis y la linfangioliomiomatosis (El-Hashemite et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2005, 33, 227-230 y El-Hashemite et al., Cancer Res., 2004, 64, 3436-3443).
El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también puede ser útil para tratar la bronquiectasia y enfermedades pulmonares infiltrantes que son enfermedades asociadas con inflamación neutrofílica crónica. Determinadas citocinas están asociadas con la inflamación neutrofílica (por ejemplo, IL-6, IFNy).
La activación patológica de linfocitos T es fundamental en la etiología de múltiples enfermedades respiratorias. Los linfocitos T autorreactivos desempeñan un papel en la bronquiolitis obliterante con neumonía organizada (también denominada BONO). Al igual que en el caso de la BONO, la etiología de los rechazos de trasplantes de pulmón está relacionada con una activación anómala de los linfocitos T de los receptores por el pulmón trasplantado de donante. Los rechazos de trasplantes de pulmón pueden producirse de forma temprana como disfunción primaria del injerto (DPI), neumonía organizada (NO), rechazo agudo (RA) o bronquiolitis linfocítica (BL), o pueden producirse años después del trasplante de pulmón como la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (DCAP). La DCAP se conocía anteriormente como bronquiolitis obliterante (BO), pero ahora se considera un síndrome que puede tener distintas manifestaciones patológicas, incluyendo la BO, la DCAP restrictiva (DCAPr o SAR) y la disfunción neutrofílica del aloinjerto. La disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (DCAP) es un reto importante en el tratamiento a largo plazo de los receptores de trasplantes de pulmón, ya que provoca que el pulmón trasplantado pierda progresivamente su funcionalidad (Gauthier et al., Curr Transplant Rep., 2016, 3(3), 185-191). La DCAP responde mal al tratamiento y, por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de compuestos eficaces capaces de prevenir o tratar esta afección. Varias citocinas dependientes de JAK, tales como IFNy e IL-5, están reguladas al alza en la DCAP y el rechazo de trasplante de pulmón (Berastegui et al., Clin Transplant. 2017, 31, e12898). Además, niveles elevados de quimiocinas CXCR3 en los pulmones, tales como CXCL9 y CXCL10, que se encuentran aguas abajo en la señalización de IFN dependiente de JAK, están relacionados con resultados peores en pacientes de trasplante de pulmón (Shino et al., PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). La inhibición de JAK ha demostrado ser eficaz en el rechazo de trasplante de riñón (Vicenti et al., American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). Por lo tanto, el compuesto 1 puede tener el potencial de ser eficaz en el tratamiento o la prevención del rechazo de trasplante de pulmón y de la DCAP. Acontecimientos de activación de linfocitos T similares a los descritos como base del rechazo de trasplante de pulmón también se consideran el principal impulsor de la enfermedad del injerto contra el hospedador (EICH) pulmonar que puede producirse después de los trasplantes de células madre hematopoyéticas. Análogamente al DCAp , la EICH pulmonar es una afección crónica progresiva con resultados extremadamente malos y no hay tratamientos aprobados actualmente. Un estudio de sondeo multicéntrico retrospectivo de 95 pacientes con EICH aguda o crónica resistente a esteroides que recibieron el inhibidor sistémico de JAK ruxolitinib como terapia de último recurso demostró una respuesta completa o parcial a ruxolitinib en la mayoría de los pacientes, incluyendo aquellos con EICH pulmonar (Zeiser et al., Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). Más recientemente, la neumonitis inducida por inhibidores del punto de control inmunitario, otra enfermedad pulmonar mediada por linfocitos T, surgió con el aumento del uso de inhibidores del punto de control inmunitario. En pacientes con cáncer tratados con estos agentes estimulantes de linfocitos T, puede desarrollarse una neumonitis mortal. El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene el potencial de presentar un tratamiento novedoso para estas enfermedades respiratorias graves desatendidas.
Enfermedades gastrointestinales
Como inhibidor de la JAK, el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también puede ser útil para una diversidad de otras enfermedades. El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede ser útil para una diversidad de indicaciones inflamatorias gastrointestinales que incluyen, pero sin limitación, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa (proctosigmoiditis, pancolitis, proctitis ulcerosa y colitis del lado izquierdo), enfermedad de Crohn, colitis colágena, colitis linfocítica, enfermedad de Behcet, enfermedad celíaca, colitis inducida por inhibidores del punto de control inmunitario, ileítis, esofagitis eosinofílica, colitis relacionada con enfermedad del injerto contra el hospedador y colitis infecciosa. La colitis ulcerosa (Reimund et al., J Clin Immunology, 1996, 16, 144-150), la enfermedad de Crohn (Woywodt et al., Eur J Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), la colitis colágena (Kumawat et al., Mol Immunology, 2013, 55, 355-364), la colitis linfocítica (Kumawat et al., 2013), la esofagitis eosinofílica (Weinbrand-Goichberg et al., Immunol Res, 2013, 56, 249-260), la colitis relacionada con la enfermedad del injerto contra el hospedador (Coghill et al., Blood, 2001, 117, 3268-3276), la colitis infecciosa (Stallmach et al., Int J Colorectal Dis, 2004, 19, 308-315), la enfermedad de Behcet (Zhou et al., Autoimmun Rev, 2012, 11, 699-704), la enfermedad celíaca (de Nitto et al., World J Gastroenterol, 2009, 15, 4609-4614), la colitis inducida por inhibidores del punto de control inmunitario (por ejemplo, la colitis inducida por inhibidores de CTLA-4; (Yano et al., J Translation Med, 2014, 12, 191), la colitis inducida por inhibidores de PD-1 o PD-L1) y la ileítis (Yamamoto et al., Dig Liver Dis, 2008, 40, 253-259) se caracterizan por la elevación de determinados niveles de citocinas proinflamatorias. Como muchas citocinas proinflamatorias señalizan a través de la activación de JAK, el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede aliviar la inflamación y proporcionar una mitigación de los síntomas. En particular, el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede ser útil para la inducción y el mantenimiento de la remisión de la colitis ulcerosa y para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, la colitis inducida por inhibidores del punto de control inmunitario y los efectos adversos gastrointestinales en la enfermedad del injerto contra el hospedador. En un aspecto, por lo tanto, la invención proporciona 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria gastrointestinal en un mamífero (por ejemplo, un ser humano), comprendiendo el método administrar al mamífero, el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que comprende un transportador farmacéuticamente aceptable y el compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Otras enfermedades
El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también pueden ser útil para tratar otras enfermedades tales como otras enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias o cánceres.
El compuesto 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede ser útil para tratar una o más de artritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, rechazo de trasplantes, xeroftalmia, artritis soriásica, diabetes, diabetes de tipo 1, enfermedad neuronas motoras, síndrome mielodisplásico, dolor, sarcopenia, caquexia, choque séptico, lupus eritematoso sistémico, leucemia, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, espondiloartritis anquilosante, mielofibrosis, linfoma de linfocitos B, carcinoma hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, cáncer de mama, mieloma múltiple, melanoma, linfoma no hodkiniano, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma ovárico de células claras, tumor de ovario, tumor de páncreas, policitemia vera, síndrome de Sjoegren, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma, esplenomegalia, linfoma de linfocitos T y talasemia mayor.
Terapia de combinación
Los compuestos de la divulgación o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos pueden usarse en combinación con uno o más agentes que actúan por el mismo mecanismo o por mecanismos distintos para tratar una enfermedad. Los distintos agentes pueden administrarse secuencial o simultáneamente, en composiciones separadas o en la misma composición. Las clases útiles de agentes para la terapia de combinación incluyen, pero sin limitación, un antiangiogénico, un esteroide, antiinflamatorios, un inhibidor de la calicreína plasmática, un inhibidor del ligando del factor de crecimiento placentario, un inhibidor del ligando VEGF-A, un inhibidor del ligando angiopoyetina 2, un inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa beta, un estimulante de la tirosina cinasa receptora Tek, un inhibidor de calcineurina, un inhibidor del ligandos VEGF, un inhibidor del complejo mTOR 1, un inhibidor de mTOR, un antagonista de IL-17, un modulador de calmodulina, un antagonista del receptor de FGF, un antagonista del receptor de PDGF, un antagonista del receptor de VEGF, un inhibidor de ligandos TNF alfa, un agente de unión al TNF, un estimulador de proteoglucano 4, un inhibidor de ligando VEGF-C, un inhibidor de ligando VEGF-D, un antagonista de CD126, un inhibidor de la cascada del complemento, un agonista de glucocorticoides, un inhibidor del factor C5 del complemento, un antagonista del receptor cannabinoide, un modulador del receptor esfingosina-1 -fosfato 1, un modulador del receptor esfingosina-1-fosfato 3, un modulador del receptor esfingosina-1-fosfato 4, un modulador del receptor esfingosina-1-fosfato 5, un inhibidor de la acetaldehído deshidrogenasa, un inhibidor de la tirosina cinasa Flt3, un inhibidor de la tirosina cinasa Kit, un inhibidor de la proteína cinasa C, un ligando de la hormona adrenocorticotrófica, un inhibidor del ligando factor derivado de células estromales 1, un agonista de la inmunoglobulina G1; un inhibidor del ligando interleucina 1 beta, un estimulador de la mucina; un modulador del factor Nuclear kappa B, un estimulador de la proteína de linfocitos T citotóxicos 4, un inhibidor de la glucoproteína de superficie de linfocitos T CD28, un estimulador de lipoproteína lipasa; un agonista de PPAR-alfa, un agonista del receptor de adenosina A3, un antagonista del receptor de angiotensina II, un antagonista del receptor de VEGF, un ligando interferón beta, un modulador de SMAD-2; un inhibidor del ligando TGF beta 1, un agonista del receptor de somatostatina, un Inhibidor de la subunidad alfa del receptor de IL-2, un inhibidor de ligando VEGF-B, un ligando de timosina beta 4, un antagonista del receptor de la angiotensina II AT-1, un antagonista de la quimiocina CCR2, un inhibidor de la amina oxidasa de cobre de membrana, un antagonista de CD11a, un inhibidor de ICAM-1, un antagonista del factor de crecimiento insulínico 1, un inhibidor de calicreína, un estimulador de la fucosiltransferasa 6, un modulador de la GDP fucosa sintasa, un inhibidor del gen de GHR, un inhibidor del gen de IGF1, un antagonista del receptor de VEGF-1, un agonista de la albúmina, un antagonista de IL-2, un antagonista de CSF-1; un antagonista del receptor de PDGF, un antagonista del receptor de VEGF-2, un inhibidor de mTOR, un agonista de PPAR-alfa, un inhibidor de GTPasa Rho, un inhibidor de la proteína cinasa asociada a Rho, un inhibidor de C3 del complemento, un inhibidor del factor de transcripción EGR-1, un modulador del factor relacionado con eritroide nuclear 2, un inhibidor del factor nuclear kappa B, un antagonista de la integrina alfa-V/beta-3, un agonista del receptor de eritropoyetina, un agonista del péptido similar al glucagón 1, un estimulador del gen de TNFRSF1A, un inhibidor del ligando angiopoyetina 2, un inhibidor de la antiplasmina alfa-2, un antagonista del colágeno, un inhibidor de fibronectina, un antagonista de la laminina, un estimulador de la plasmina, un ligando factor de crecimiento nervioso, un antagonista del receptor de FGF1, un antagonista del receptor de FGF3, un inhibidor de la tirosina cinasa itk, un inhibidor de la tirosina cinasa Lck, un inhibidor de la tirosina cinasa Ltk receptora, un antagonista del receptor alfa de PDGF, un antagonista beta del receptor de PDGF, un inhibidor de la proteína tirosina cinasa, un antagonista del receptor de VEGF-3, un inhibidor de la amina oxidasa de cobre de membrana, un agonista del receptor de somatostatina 2, un agonista del receptor de somatostatina 4, un agonista del receptor de somatostatina 5, un inhibidor de la proteína cinasa C alfa, un inhibidor de la proteína cinasa C beta, un inhibidor de la proteína cinasa C delta, un inhibidor de la proteína cinasa C épsilon, un inhibidor de la proteína cinasa C eta, un inhibidor de la proteína cinasa C teta, un modulador de anquirina, un estimulador de la mucina, un agonista de los purinoceptores P2Y2, un inhibidor de la proteína alfa-1 de la unión comunicante, un antagonista de la quimiocina CCR3; un inhibidor del ligando eotaxina, un inhibidor del canal de sodio sensible a la amilorida, un antagonista del receptor de PDGF, un inhibidor de la proteína tirosina cinasa, un inhibidor de la proteína del epitelio pigmentario retiniano, un inhibidor de metaloproteasas de matriz, un antagonista del receptor de PDGF, un antagonista beta del receptor de PDGF, un inhibidor de ligando PDGF-B, un antagonista del receptor de la hormona del crecimiento, un inhibidor de moléculas de adhesión celular, un modulador de integrinas, un antagonista de la quimiocina CXCR4, un dominio de proteínas que contienen dominios de superhélice, un modulador de hsp 90, un inhibidor de la proteína cinasa asociada a Rho, un inhibidor del gen de VEGF, un inhibidor de endoglina, un antagonista de la quimiocina CCR3, un modulador de canales de potasio maxi K, un estimulador de canales de potasio maxi K, un agonista de PGF2 alfa, un agonista del receptor de prostanoides, un modulador de canales de cloruro dependiente de voltaje 2, un antagonista del receptor de C5a del complemento, un inhibidor de la inosina monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor del ligando interleucina 18, un estimulador del canal catiónico RPT M8, un agonista de los receptores de CNTF, un inhibidor del gen de TRPV1, un estimulador de la desoxirribonucleasa I, un inhibidor del gen de IRS1, un inhibidor de la proteína cinasa asociada a Rho, un inhibidor poli ADP ribosa polimerasa 1, un inhibidor poli ADP ribosa polimerasa 2, un inhibidor poli ADP ribosa polimerasa 3, un agonista del VR1 vanilloide, un estimulador del gen de NFAT5, un estimulador de la Mucina, un inhibidor de la tirosina cinasa Syk, un agonista de los receptores adrenérgicos alfa 2, un inhibidor de la ciclooxigenasa, un inhibidor de la deposición de proteína amiloide, un inhibidor de la glucógeno sintasa cinasa 3, un estimulador de la PARP, un inhibidor de la deposición de tau, un inhibidor del gen de DDIT4, un modulador de la síntesis de hemoglobina, un inhibidor del ligando interleucina 1 beta, un antagonista de TNF, un estimulador de canales de potasio dependiente de voltaje KCNQ, un antagonista del receptor de NMDA, un inhibidor de la ciclooxigenasa1, un inhibidor de la ciclooxigenasa, un agonista del receptor 5-HT 1a, un inhibidor de los canales de calcio, un modulador del ligando FGF-2, un inhibidor de la fosfoinosítido 3-cinasa, un antagonista de CD44, un modulador de la hialuronidasa, un agonista del ácido hialurónico, un antagonista de IL-1, un antagonista del receptor de IL-1 de tipo I, un inhibidor del factor P del complemento, un antagonista de la tubulina, un antagonista beta amiloide, un estimulador del gen de IL2, un inhibidor de la I-kappa B cinasa beta, un modulador del factor nuclear kappa B, un inhibidor del inhibidor del activador de plasminógeno 1, un ligando de FGF-2, un modulador de proteasas y un modulador de la corticotropina.
Los agentes específicos que pueden usarse en combinación con el presente compuesto inhibidor de JAK incluyen, pero sin limitación, lanadelumab, aflibercept, RG-7716, AKB-9778, ciclosporina, bevacizumab, everólimus, secukinumab, acetónido de fluocinolona, RP-101, lactato de escualamina, lubricina humana recombinante, OPT-302, sarilumab, dexametasona, eculizumab, fingolimod, adalimumab, reproxalap, midostaurina, corticotropina, olaptesed pegol, canakinumab, recoflavona, abatacept, fenofibrato, piclidenoson, OpRegen, candesartán, golimumab, pegaptanib, interferón beta, disitertida, acetato de octreotida, anecortave, basiliximab, acetónido de triamcinolona supracoroideo, RGN-259, difluprednato, HL-036, avacincaptad pegol de sodio, irbesartán, propagermanio, acetónido de triamcinolona, azitromicina, BI-1467335, lifitegrast, etabonato de loteprednol, teprotumumab, KVD-001, TZ-101, atesidorsén, Nov-03, bevacizumab, AVA-101, RU-101, voclosporina, vorolanib, sirólimus, fenofibrato de colina, VX-210, APL-2, CPC-551, elamipretida, SF-0166, cibinetida, elamipretida, liraglutida, EYS-606, nesvacumab, aflibercept, ocriplasmina, filgotinib, cenegermina, adipocell, brolucizumab, ranibizumab, aflibercept, terapia fotodinámica con padeliporfina, pazopanib, ASP-8232, veldoreotida, sotrastaurina, abicipar pegol, diquafosol tetrasodio, HCB-1019, conbercept, bertilimumab, SHP-659, THR-317, ALK-001, PAN-90806, interferón alfa-2b, fluocinolona, malato de sunitinib, emixustat, hI-con1, TB-403, minociclina, células MA09-hRPE, pegpleranib de sodio, pegvisomant, luminate, burixafor, H-1129, carotuximab, AXP-1275, ranibizumab, isopropil unoprostona, tesidolumab, micofenolato de sodio gastrorresistente, tadekinig alfa, acetónido de triamcinolona, ciclosporina, ST-266, AVX-012, NT-501-ECT, tivanisirán, verteporfina, dornasa alfa, aganirsén, ripasudil, fosfato de rucaparib, zucapsaicina, tetratiomolibdato, diclofenaco, LHA-510, AGN-195263, tacrólimus, rebamipida, R-348, tartrato de brimonidina, vizomitina, T-89, LME-636, BI-1026706, rimexolona, tobramicina, TOP-1630, talaporfina, bromfenaco de sodio, acetónido de triamcinolona, davunetida, etabonato de loteprednol, XED-60, EG-Mirotin, APD-209, adenovir, PF-04523655, hidroxicarbamida, navamepent, retinalamina, CNTO-2476, ranibizumab, flupirtina, B27PD, S-646240, GLY-230, hidralacina, nepafenaco, DexNP, Trehalosa, ácido hialurónico, depósito de liberación mantenida de dexametasona-Ca, naluzotán, hialuronidasa, hialuronato de sodio, isunakinra, somatostatina, CLG-561, OC-10X, UCA-002, factor de crecimiento epidérmico humano recombinante, pemirolast, VM-100, MB-11316, alfa luminol monosódico, ranibizumab, IMD-1041, Lm G-324, HE-10, cinhialuronato de sodio, BDM-E, células precursoras mesenquimatosas, disulfiram, CTC-96, PG-101, Beifushu, quimotripsina.
También se proporciona, en el presente documento, una composición farmacéutica que comprende el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más de otros agentes terapéuticos. El agente terapéutico puede seleccionarse entre la clase de agentes especificados anteriormente y de la lista de agentes específicos descritos anteriormente. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para administración ocular. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una composición liquida o una suspensión.
Además, en un aspecto del método, la invención proporciona el compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más de otros agentes terapéuticos para su uso en un método para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero que comprende administrar al mamífero el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más de otros agentes terapéuticos.
Cuando se usan en terapia de combinación, los agentes pueden formularse en una única composición farmacéutica o los agentes pueden proporcionarse en composiciones separadas que se administran simultáneamente o en momentos separados, por la misma o por diferentes vías de administración. Dichas composiciones pueden envasarse por separado o pueden envasarse juntas en forma de un kit. Los dos o más agentes terapéuticos en el kit pueden administrarse por la misma vía de administración o por vías de administración diferentes.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos de síntesis y biológicos se ofrecen para ilustrar la invención y no han de interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la invención. En los ejemplos a continuación, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados a menos que se indique lo contrario. Las abreviaturas que no se definen a continuación tienen los significados generalmente aceptados.
ACN = acetonitrilo
DCC = diciclohexilcarbodiimida
DIPEA = W,A/-diisopropiletilamina
DMAc = dimetilacetamida
DMF = W,A/-dimetilformamida
DMSO = dimetilsulfóxido
EtOAc = acetato de etilo
HATU = hexafluorofosfato de N,N,N',N'-tetrametil-0-(7-azabenzotriazol-1-il)uronio
LDA = diisopropilamida de litio
min = minuto(s)
MTBE = metil ferc-butil éter
NBS = W-bromosuccinimida
NMP = N-metil-2-pirrolidona
TA = temperatura ambiente
THF = tetrahidrofurano
bis(pinacolato)diboro = 4,4,5,5,4',4',5',5'-octametil-[2,2']bi[[1,3,2]dioxaborolanilo]
Pd(dppf)Cl2-CH2C]2 = complejo de dicloro(1,1'-bis(difenilfosfino)-ferroceno)-dipaladio (II) con diclorometano
Los reactivos y disolventes se adquirieron de proveedores comerciales (Aldrich, Fluka, Sigma, etc.) y se usaron sin más purificación. El progreso de las mezclas de reacción se controló mediante cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía líquida analítica de alta resolución (HPLC analít.) y espectrometría de masas. Las mezclas de reacción se elaboraron como se describe específicamente en cada reacción; normalmente se purificaron mediante extracción y otros métodos de purificación tales como la precipitación y la cristalización dependiente de la temperatura y el disolvente. Además, las mezclas de reacción se purificaron de manera rutinaria mediante cromatografía en columna o mediante HPLC preparativa, normalmente usando rellenos de columna C18 o BDS y eluyentes convencionales. A continuación se describen las condiciones de HPLC preparativa habituales.
La caracterización de los productos de reacción se realizó como habitualmente mediante espectrometría de masas y RMN 1H. Para el análisis por RMN, las muestras se disolvieron en disolvente deuterado (tal como CD3OD, CDCh o cfe-DMSO) y los espectros de RMN-1H se obtuvieron con un instrumento Varian Gemini 2000 (400 MHz) en condiciones de observación convencionales. La identificación espectrométrica de masas de los compuestos se realizó mediante un método de ionización por electronebulización (ESMS) con un instrumento modelo API 150 EX de Applied Biosystems (Foster City, CA) o un instrumento 3100 de Waters (Milford, MA), acoplado a sistemas de autopurificación.
Columna: C18, 5 pm. 21,2 x 150 mm o C18, 5 pm 21 x 250 o C14, 5 pm 21 x 150 mm Temperatura de la columna: Temperatura ambiente
Caudal: 20,0 ml/min
Fases móviles: A = Agua TFA al 0,05 %
B = ACN TFA al 0,05%,
Volumen de inyección: (100-1500 pl)
Longitud de onda del detector: 214 nm
Los compuestos en bruto se disolvieron en agua:ácido acético 1:1 a aproximadamente 50 mg/ml. Se realizó una ejecución de ensayo de escala analítica de 4 minutos usando una columna C18 de 2,1 x 50 mm seguida de una ejecución a escala preparativa de 15 o 20 minutos usando una inyección de 100 pl con el gradiente basado en el % de retención de B de la ejecución de ensayo a escala analítica. Los gradientes exactos fueron dependientes de la muestra. Las muestras con impurezas corrientes cercanas se comprobaron con una columna C18 de 21 x 250 mm y/o una columna C14 de 21 x 150 mm para una mejor separación. Las fracciones que contenían el producto deseado se identificaron mediante análisis espectrométrico de masas.
Preparación 1: 2-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (1-5)
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Se realizaron dos reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. Una mezcla de 5-bromo-2-fluorofenol (1­ 1) (850 g, 4,5 mol), bromuro de bencilo (837 g, 4,9 mol) y carbonato potásico (923 g, 6,7 mol) en ACN (5 l) se agitó a 20 °C durante 12 h. Las reacciones se combinaron y se concentraron, se diluyeron con agua (8 l) y se extrajeron con EtOAc (3 x 3 l). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera (3 l), se secó sobre sulfato sódico y se concentró. El producto en bruto se purificó a través de un lecho de gel de sílice (eluyendo con éter de petróleo:EtOAc 3:1) para dar el producto intermedio del título (1,83 kg, 73 % de rendimiento) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (400 MHz, CDCls) 57,38-7,46 (m, 5H), 7,15 (dd, J = 7,6, 2,0 Hz, 1H), 6,98-7,15 (m, 1H), 5,12 (s, 2H).
(b) 2-(benciloxi)-4-etil-1-fluorobenceno (1-3)
Se realizaron seis reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. A una solución del producto de la etapa anterior (200 g, 711 mmol) en THF (100 ml) se le añadió carbonato potásico (197 g, 1,4 mol). La mezcla de reacción se purgó con nitrógeno 3 veces, seguido de la adición de Pd(dppf}Cl2-CH2Cl2 (11,6 g, 14,2 mmol). La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C, se añadió dietilcinc (1 M, 107 l) gota a gota y la mezcla de reacción se agitó a 70 °C durante 1 h. Las reacciones se combinaron, se enfriaron a 20 °C y se vertieron en agua (7 l) lentamente. A la mezcla se le añadió HCl ac. 4 M a pH 6. La capa orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 2 l). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (5 l), se secó sobre sulfato sódico, se concentró a través de un lecho de gel de sílice (eluyendo con éter de petróleo:EtOAc 50:1)) para dar el producto intermedio del título (900 g, 92 % de rendimiento) en forma de un aceite de color amarillo claro. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 57,29-7,43 (m, 5H), 6,94-6,97 (m, 1H), 6,82 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,70 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 2,52-2,58 (m, 2H), 117 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
(c) 1-(benciloxi)-4-bromo-5-etil-2-fluorobenceno (1-4)
Se realizaron cuatro reacciones en paralelo y se combinaron. A una solución de 2-(benciloxi)-4-etil-1-fluorobenceno (1-3) (293 g, 1,3 mol) en ACN (1 l) se le añadió NBS (249 g, 1,4 mol) en porciones a 20 °C. La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 2 h. Las mezclas de reacción se combinaron y se concentraron. El residuo se diluyó con agua (5 l) y se extrajo con EtOAc (2 x 5 l). La fase orgánica se lavó con salmuera (4 l), se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con éter de petróleo:EtOAc 100:1-10:1) para dar el producto intermedio del título (1,4 kg, 89 % de rendimiento) en forma de un aceite de color amarillo claro. RMN 1H (400 MHz, CDCls) 57,29-7,38 (m, 5H), 7,2 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 6,8 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 5,06 (s, 2H), 2,6 (c, J = 7,6 Hz, 2 H), 1,1 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
(d) 2-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (1-5)
Se realizaron siete reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. A una solución del producto de la etapa anterior (200 g, 647 mmol) en dioxano (2 l) se le añadió acetato potásico (190 g, 1,9 mol), bis(pinacolato)diboro (181 g, 712 mmol) y Pd(dppf}C]2-CH2Cl2 (10,6 g, 12,9 mmol) en atmósfera de nitrógeno a 20 °C. La mezcla se agitó a 120 °C durante 2 h. Las mezclas de reacción se combinaron, se concentraron, se diluyeron con agua (5 l) y se extrajeron con EtOAc (3 x 4 l). La fase orgánica combinada se secó con sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El producto en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con éter de petróleo:EtOAc 1:0 - 5:1) para dar el compuesto del título (1,35 kg, 84 % de rendimiento) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 57,33-7,51 (m, 6H), 6,82 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,17 (s, 2H), 2,85 (c, J = 7,6 Hz, 2H), 1,33 (s, 12H), 1,15 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
Preparación 2: 1-bencil-4-imino-1,4-dihidropiridin-3-amina (2)
Figure imgf000022_0001
A una solución de piridin-3,4-diamina (400 g, 3,67 mol) en ACN (3 l) se le añadió bromuro de bencilo (596 g, 3,49 mol) en porciones a 0 °C y la mezcla de reacción se agitó durante 30 min y después a 20 °C durante 12 h y se filtró. La torta de filtro se lavó con ACN (500 ml) y se secó para dar la sal de HBr del compuesto del título (600 g, 2,14 mol, 58 % de rendimiento) en forma de un polvo de color blanco. RMN 1H (400 MHz, MeOD) 57,83 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,32-7,40 (m, 5H), 6,76 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 5,28 (s, 2H).
Preparación 3: 6-(4-(bencNoxi)-2-etN-5-fluorofeml)-4-fluoro-1H-mdazol-3-carbaldehído (3)
Figure imgf000022_0002
(a) 1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2,2-dietoxietan-1-ona (3-1)
Se realizaron nueve reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. Una solución de 1-bromo-3,5-difluorobenceno (100 g, 518 mmol) en THF (700 ml) se desgasificó y se purgó con nitrógeno tres veces. Después se añadió LDA 2 M (311 ml) a -70 °C y la mezcla de reacción se agitó a -70 °C durante 0,5 h en atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de 2,2-dietoxiacetato de etilo (96 g, 544 mmol) en THF (200 ml) a -70 °C en atmósfera de nitrógeno y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. Las reacciones se combinaron y se vertieron cloruro de amonio saturado enfriado con hielo (10 l) en porciones y se extrajeron con EtOAc (3 x 3 l). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera (5 l), se secó sobre sulfato sódico, se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con éter de petróleo EtOAc 1:0 - 100:1) para dar el compuesto del título (1,26 kg, 84 % de rendimiento) en forma de un aceite de color amarillo. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) 87,12 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 5,15 (s, 1H), 3,61-3,7 (m, 4H), 1,2 (t, J = 7,2 Hz, 6H).
(b) 1-(4'-(benciloxi)-2'-etil-3,5,5'-trifluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)-2,2-dietoxietan-1-ona (3-2)
Se realizaron cinco reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. A una mezcla de 1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2,2-dietoxietan-1-ona (3-1) (189 g, 586 mmol) en etanol (150 ml) y tolueno (1,5 l) se le añadió agua (150 ml), carbonato sódico (84,8 g, 800 mmol) y 2-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (1-5) (190 g, 533 mmol) a 20 °C. La suspensión se desgasificó al vacío y se purgó con nitrógeno varias veces. Se añadió Pd(dppf)Cl2-CH2Ch (13 g, 16 mmol) y la mezcla de reacción se purgó con nitrógeno varias veces y se agitó a 120 °C durante 2 h. Las reacciones se combinaron, se enfriaron a 20 °C, se vertieron en agua (5 l) y se extrajeron con EtOAc (3 x 4 l). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (5 l), se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron, se concentraron y se purificaron por cromatografía sobre gel de sílice (eluyendo con éter de petróleo:EtOAc 100:1 - 5:1) para dar el producto intermedio del título (880 g, 70 % de rendimiento) en forma de un aceite de color amarillo. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 87,36-7,48 (m, 5H), 6,94-6,96 (m, 2H), 6,86-6,92 (m, 2H), 5,29 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 3,67-3,77 (m, 4H), 2,52 (c, J = 7,6 Hz, 2H), 1,25 (t, J = 6,8 Hz, 6H), 1,07 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
(c) 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-3-(dietoximetil)-4-fluoro-1 H-indazol (3-3)
Se realizaron cuatro reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. A una solución del producto de la etapa anterior (220 g, 466 mmol) en THF (2 l) se le añadió hidrazina monohidrato (47,6 g, 931 mmol) a 20 °C. La mezcla de reacción se agitó a 100 °C durante 12 h. Las cuatro reacciones se combinaron y se enfriaron a 20 °C y se concentraron. El residuo se disolvió en EtOAc (5 l) y se lavó con HCl 0,1 M (2 x 1,5 l). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (1.5 l), se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron para dar el producto intermedio del título (900 g, en bruto) en forma de una goma de color amarillo, que se usó directamente en la siguiente etapa. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 87,36-7,48 (m, 5H), 6,94-6,96 (m, 2H), 6,86-6,92 (m, 2H), 5,29 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 3,67­ 3,77 (m, 4H), 2,52 (c, J = 7,6 Hz, 2H), 1,25 (t, J = 6,8 Hz, 6H), 1,07 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
(d) 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-177-indazol-3-carbaldehído (3)
Se realizaron tres reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. A una solución del producto de la etapa anterior (300 g, 643 mmol) en acetona (1,5 l) se le añadió HCl 4 M (16 ml) gota a gota a 20 °C y la mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 0,17 h. Las reacciones se combinaron, se concentraron y se diluyeron con MTBE (1 l) y se filtraron. La torta de filtro se lavó con MTBE (2 x 300 ml) y se secó a presión reducida para dar el producto intermedio del título (705 g, en bruto) en forma de un sólido de color amarillo, que se usó directamente en la siguiente etapa. (m/z): [M+H]+ calc. para C23H18F2N2O2393,13 encontrado 393,1. RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 814,51 (s, 1H), 10,17 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,40-7,42 (m, 4H), 7,24 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,25 (s, 2H), 2,52-2,53 (m, 2H), 1,03 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
Preparación 4: 5-bencN-2-(6-(4-(bencMoxi)-2-etN-5-fluorofeml)-4-fluoro-1H-mdazol-3-N)-5H-imidazo[4,5-c]piridina (4)
Figure imgf000023_0001
Se realizaron cuatro reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. A una solución de 6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-carbaldehído (3), el producto de la preparación 3 (172 g, 440 mmol) en DMF (1,1 l) se le añadió bisulfito sódico (68,6 g, 659 mmol) y 1-bencil-4-imino-1,4-dihidropiridin-3-amina (2) (136 g, 484 mmol) a 20 °C y la mezcla de reacción se agitó a 150 °C durante 2 h. Las cuatro reacciones se combinaron y la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se vertió en agua (10 l) y se filtró. La torta de filtro se secó a presión reducida para dar el producto intermedio del título (990 g, en bruto) en forma de un sólido de color amarillo, que se usó directamente sin purificación, (m/z): [M+H]+ calc. para C35H27F2N5O 572,2, encontrado 572,3.
Preparación 5: 5-bencil-2-(6-(4-(bencMoxi)-2-etN-5-fluorofeml)-4-fluoro-1H-mdazol-3-M)-4,5,6,7-tetrahidro-1H- imidazo[4,5-e]piridina (5)
Figure imgf000024_0001
Se realizaron tres reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. A una mezcla de 5-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-5H-imidazo[4,5-c]piridina (4), el producto de la preparación 4 (330 g, 577 mmol) en metanol (1,5 l) y THF (1 l) se le añadió borohidruro sódico (267 g, 6,9 mol) en porciones a 20 °C y la mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 24 h. Las tres reacciones se combinaron y la mezcla de reacción se añadió a agua (10 l), se agitó durante 10 min y se filtró. El filtrado se extrajo con EtOAc (2 x 5 l) y la fase orgánica combinada se secó con sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El producto en bruto se diluyó con EtOAc (2 l), se agitó durante 30 min y se filtró. La torta de filtro se lavó con MTBE (3 x 200 ml) para dar el producto intermedio del título (275 g, 28 % de rendimiento) en forma de un sólido de color amarillo claro. (m/z): [M+H]+ calc. para C35H31F2N5O 576,25, encontrado 576,3. RMN 1H (400 MHz, DMSO-da) 87,50-7,52 (m, 2H), 7,35-7,43 (m, 7H), 7,23-7,25 (m, 3H), 7,15 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 5,25 (s, 2H), 3,72 (s, 2H), 3,43 (s a, 2H), 2,78 (s a, 2H), 2,66 (s a, 2H), 2,55 (c, 2H), 1,04 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
Preparación 6: 5-etN-2-fluoro-4-(4-fluoro-3-(4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridm-2-M))-1H-mdazol-6-il)fenol (6)
Figure imgf000024_0002
Se realizaron cinco reacciones en paralelo y se combinaron para tratamiento. A una mezcla de 5-bencil-2-(6-(4-(benciloxi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (5), el producto de la preparación 5 (55 g, 95,5 mmol) en THF (500 ml) y metanol (500 ml) se le añadió paladio sobre carbono (15 g, 9,6 mmol) y HCl ac. 12 M (10 ml). La suspensión se desgasificó al vacío, se purgó con hidrógeno varias veces y se agitó en atmósfera de hidrógeno (344,738 kPa (50 psi)) a 50 °C durante 12 h. Las reacciones se combinaron y la mezcla de reacción se filtró. El filtrado se concentró al vacío para proporcionar la sal de HCl del producto intermedio del título (150 g, en bruto) en forma de un sólido de color blanquecino, (m/z): [M+H]+ calc. para C21H19F2N5O 396,16, encontrado 396,2. RMN 1H (400 MHz, MeOD) 87,43 (s, 1H), 7,07 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,57 (s, 2H), 3,74 (s, 2H), 3,24 (s, 2H), 2,55 (c, J = 7,6 Hz, 2H), 1,08 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
Preparación 7: 2-morfolinoacetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (7')
Figure imgf000024_0003
(a) 2-morfolinoacetato de tere-butilo (7-1)
A una mezcla de morfolina (160 g, 1,84 mol) y carbonato potásico (381 g, 2,76 mol) en THF (3 l) se le añadió lentamente 2-bromoacetato de tere-butilo (341 g, 1,75 mol) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min y después a 20 °C durante 12 h y se concentró. Se añadió agua (1,5 l) y la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (3 x 1 l). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera (500 ml), se secó sobre sulfato sódico y se concentró para dar el producto intermedio del título (300 g, 81 % de rendimiento) en forma de un aceite de color amarillo. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 5 3,74 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,10 (s, 2H), 2,57 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 1,46 (s, 9H).
(b) Ácido 2-morfolinoacético (7")
Una mezcla del producto de la etapa anterior (7-1) (300 g, 1,49 mol) en HCl 3 M en dioxano (2,0 l) se agitó a 20 °C durante 12 h y se concentró para dar la sal de HCl del compuesto del título (270 g, 99 % de rendimiento) en forma de un sólido claro, que se usó directamente en la siguiente etapa RMN 1H (400 MHz, MeOD) 54,13 (s, 2H), 3,93 (s a, 4H), 3,64 (s a, 4H).
(c) 2-morfolinoacetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (7')
Una mezcla del producto de la etapa anterior (150 g, 826 mmol), 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona (95 g, 826 mmol), DCC (256 g, 1,24 mol) y DIPEA (160 g, 1,24 mol) en DCM (2 l) se agitó a 15 °C durante 12 h y se filtró. El filtrado se concentró y se lavó con EtOAc (800 ml). El sólido se recogió por filtración y se concentró para dar el compuesto del título (150 g, 75 % de rendimiento) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 53,68 (s, 2H), 3,58 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 2,82 (s, 4H), 2,57 (t, J = 5,2 Hz, 4H).
Ejemplo 1: 1-(2-(6-(2-etN-5-fluoro-4-hidroxifeml)-4-fluoro-1H-mdazol-3-N)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (1)
Figure imgf000025_0001
Una mezcla de 5-etil-2-fluoro-4-(4-fluoro-3-(4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1H-indazol-6-il)fenol (6) 2 HCl (100 g, 214 mmol), 2-morfolinoacetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (7') (67,2 g, 278 mmol) y DIPEA (69 g, 534 mmol) en DMF (600 ml) se agitó a 15 °C durante 12 h y se filtró. La solución se purificó por cromatografía de fase inversa (instrumento Agela FLEXATM FS-1L; columna de 2 kg Agela C18 DAC; 200 g de muestra disueltos en DMF (900 ml); caudal 300 ml/min; disolvente A agua, disolvente B ACN; gradiente (13 %, tiempo (min): 0/15, 0-40/45, 40/50) para proporcionar el compuesto del título (50.0 g, 44,8% de rendimiento) en forma de un sólido de color amarillo claro. (m/z): [M+H]+ calc. para C27H28F2N6O3523,22 encontrado 523,0. RMN 1H (400 MHz, MeOD) 57,22 (s, 1H), 6,80-6,96 (m, 3H), 4,68-4,78 (m, 2H), 3,96 (s, 2H), 3,65-3,95 (m, 4H), 3,35-3,38 (m, 2H), 2,77-2,92 (m, 2H), 2,52-2,56 (m, 6H), 1,06 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
Ejemplo 2: 1-(2-(6-(2-etN-5-fluoro-4-hidroxifeml)-4-fluoro-1H-mdazol-3-N)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona cristalina (1) Forma 1
A un matraz de 250 ml se le añadió 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (1), el producto del ejemplo 1 (5 g) y etanol (50 ml) y la mezcla de reacción se agitó a 50-80 °C durante 10 min y después se añadió lentamente ACN (75 ml) a 50-80 °C seguido de semillas del ejemplo 3. La mezcla de reacción se agitó a 20-25 °C durante 18 h. El sólido resultante se recogió por filtración y se secó a 50 °C al vacío durante 18 h para proporcionar la forma 1 del compuesto del título (3,6 g, 72 % de rendimiento)
Ejemplo 3: 1-(2-(6-(2-etN-5-fluoro-4-hidroxifeml)-4-fluoro-1H-mdazol-3-N)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona cristalina (1) Forma 1
El compuesto 1, el producto del ejemplo 1, (1 g) se añadió a etanol (10 ml) y se calentó hasta su disolución. Se añadió acetonitrilo (10 ml) y la mezcla de reacción se agitó y se calentó y después se agitó a TA durante 16 h, se filtró y se secó a 50 °C al vacío durante 18 h para proporcionar el compuesto del título Forma 1 (0,23 g).
Ejemplo 4: 1-(2-(6-(2-etN-5-fluoro-4-hidroxifeml)-4-fluoro-1H-mdazol-3-N)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (1)
Figure imgf000026_0001
Se añadió W,A/-diisopropiletilamina (0,298 ml, 1,707 mmol) a una solución de 5-etil-2-fluoro-4-(4-fluoro-3-(4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1H-indazol-6-il)fenol (135 mg, 0,341 mmol) (6), HATU (156 mg, 0,410 mmol) y ácido 2-morfolinoacético (7") (54,5 mg, 0,376 mmol) en DMF (0,5 ml) y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 24 h. Se añadió hidróxido de litio (49,1 mg, 2,049 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 65 °C durante 1 h y se concentró al vacío para producir un líquido transparente de color amarillo. El líquido en bruto se purificó por HPLC preparativa para producir la sal de TFA del compuesto del título (142 mg, 0,223 mmol, 65,3 % de rendimiento) en forma de un sólido de color beis.
Ejemplo 5: 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona cristalina (1) Forma 2
El compuesto 1 del ejemplo 1 (2,5 g) se disolvió en DMSO (5 ml) a 60 °C. Una vez se obtuvo una solución homogénea, se añadió MeOH (2,5 ml) a la solución. La mezcla homogénea se añadió gota a gota durante 30 min a una solución premezclada de MeOH (12,75 ml) y H2O (11,25 ml) a 75 °C. Una vez se hubo añadido toda la mezcla, la mezcla combinada se dejó en agitación a 75 °C durante 1 h mientras se formaba una suspensión cristalina. Se añadió H2O (36 ml) gota a gota durante 2 h a 75 °C. Después de completarse la carga de H2O, la suspensión se agitó a 75 °C durante 1 h, después se enfrió lentamente a 20 °C durante 6 h. La suspensión se mantuvo a 20 °C durante otras 10 h antes de filtrarla, se lavó con H2O al 70 %/MeOH (10 ml), se secó a 50 °C al vacío durante 18 h para proporcionar el compuesto del título Forma 2 (2,13 g).
Propiedades de las formas sólidas de la invención
Muestras de las dos formas anhidras. La forma 1 y la forma 2 de 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (1) de los ejemplos 2 y 5, respectivamente, se analizaron mediante difracción de rayos X de polvo (PXRD), calorimetría diferencial de barrido (DSC), análisis termogravimétrico (TGA), sorción dinámica de humedad (DMS) e imagen microscópica con luz polarizada. La forma 2 también se analizó mediante difracción de rayos X de monocristal.
Ejemplo 6: Difracción de rayos X de polvo
Los patrones de difracción de rayos X de polvo de las figuras 1 y 6 se obtuvieron con un difractómetro de rayos X Bruker D8-Advance usando radiación Cu-Ka (A = 1,54051 Á) con un voltaje de salida de 45 kV y una corriente de 40 mA. El instrumento se hizo funcionar en geometría Bragg-Brentano con ranuras de incidencia, divergencia y dispersión configuradas para maximizar la intensidad en la muestra. Para la medición, se presionó suavemente una pequeña cantidad de polvo (5-25 mg) sobre un soporte de muestra para formar una superficie lisa y se sometió a exposición a rayos X. Las muestras se barrieron en modo 20-20 de 2° a 35° en 20 con un tamaño de etapa de 0,02° y una velocidad de barrido de 0,30° segundos por etapa. La obtención de datos se controló mediante el software de medición Bruker DiffracSuite y se analizó mediante el software Jade (versión 7.5.1). El instrumento se calibró con un patrón de corindón, dentro de un ángulo de dos theta ± 0,02°. Las posiciones de los picos de dos-theta de la PXRD observados y los espacios d se muestran en las tablas 1 y 2, respectivamente para la forma cristalina 1 y la forma cristalina 2.
Tabl 1: D l PXRD r l f rm ri lina 1
Figure imgf000026_0002
continuación
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Ta 2
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Ejemplo 7 : Análisis térmico
La calorimetría diferencial de barrido (DSC) se realizó usando un módulo Modelo Q-100 de TA Instruments con un controlador Thermal Analyst. Los datos se recogieron y analizaron usando el software Thermal Analysis de TA Instruments. Se pesó con precisión una muestra de cada forma cristalina en un recipiente de aluminio cubierto. Después de un período de equilibrio isotérmico de 5 minutos a 5 °C, la muestra se calentó usando una rampa de calentamiento lineal de 10 °C/min de 0 °C a 300 °C.
En la figura 7 se muestra un termograma de la DSC representativo de la forma cristalina libre Forma 1 de la invención. El trazo de la calorimetría diferencial de barrido (DSC) registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto presenta un pico en el flujo de calor endotérmico, identificado como una transición de fusión, en el intervalo de aproximadamente 210 °C a aproximadamente 234 °C o en el intervalo de entre aproximadamente 215 °C a aproximadamente 229 °C o en el intervalo de entre aproximadamente 220 °C a aproximadamente 224 °C. La forma cristalina se caracteriza por un trazo de calorimetría diferencial de barrido registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto que muestra un máximo en el flujo de calor endotérmico con un pico a aproximadamente 221,7 °C o a 221,7 ± 3 °C.
En la figura 2 se muestra un termograma de la DSC representativo de la forma cristalina libre Forma 2 de la invención. El trazo de la calorimetría diferencial de barrido (DSC) registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto presenta un pico en el flujo de calor endotérmico, identificado como una transición de fusión, en el intervalo de aproximadamente 268 °C a aproximadamente 277 °C o en el intervalo de entre aproximadamente 270 °C a aproximadamente 275 °C o en el intervalo de entre aproximadamente 271 °C a aproximadamente 274 °C. La forma cristalina se caracteriza por un trazo de calorimetría diferencial de barrido registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto que muestra un máximo en el flujo de calor endotérmico con un pico a aproximadamente 272,6 °C o a 212,6 2 °C.
Las mediciones de análisis termogravimétrico (TGA) se realizaron usando un módulo Modelo Q-50 de TA Instruments equipado con capacidad de resolución alta. Los datos se recogieron usando el controlador Thermal Analyst de TA Instruments y se analizaron usando el software Universal Analysis de TA Instruments. Una muestra pesada se colocó sobre una bandeja de platino y se escaneó con una velocidad de calentamiento de 10 °C desde temperatura ambiente hasta 300-350 °C. Las cámaras de equilibrio y horno se purgaron con flujo de nitrógeno durante su uso.
En la figura 8 se muestra un trazo del TGA de la forma cristalina libre Forma 1 de la invención. El trazo del análisis termogravimétrico (TGA) de la figura 8 no muestra una pérdida de peso significativa a temperaturas por debajo del inicio de la descomposición a aproximadamente 293 °C.
En la figura 3 se muestra un trazo del TGA de la forma cristalina libre Forma 2 de la invención. El trazo del análisis termogravimétrico (TGA) de la figura 3 no muestra una pérdida de peso significativa a temperaturas por debajo del inicio de la descomposición a aproximadamente 269 °C.
Ejemplo 8: Evaluación de sorción dinámica de la humedad
La medición de la sorción dinámica de humedad (SHD) se realizó usando una microbalanza atmosférica VTI, sistema SGA-100 (VTI Corp., Hialeah, FL 33016). Se usó una muestra pesada y la humedad fue el valor más bajo posible (cercano a una HR del 0%) al comienzo del análisis. El análisis de DMS consistió en una etapa inicial de secado (0 % de RH) durante 120 minutos, seguida de dos ciclos de sorción y desorción con una velocidad de exploración de una HR del 5 %/etapa en el intervalo de humedad de una HR del 5 % a una HR del 90 %. La realización de la DMS se realizó de manera isoterma a 25 °C.
En la figura 9 se muestra un trazo de la DMS representativo de la forma libre cristalina Forma 1 de la invención.
La forma 1 cristalina demostró una pequeña histéresis entre dos ciclos de sorción y desorción. La forma 1 demostró aproximadamente un 0,99 % de aumento de peso en el intervalo de humedad del 5 % al 70 % de humedad relativa y aproximadamente un 1,32 % de aumento de peso en el intervalo de humedad del 5 % al 90 % de humedad relativa a temperatura ambiente, como se muestra en la figura 9. Se considera que la forma 1 es ligeramente higroscópica.
En la figura 4 se muestra un trazo de la DMS representativo de la forma libre cristalina Forma 2 de la invención. La forma 2 cristalina no muestra histéresis entre dos ciclos de sorción y desorción y demuestra una propensión excepcionalmente pequeña a la higroscopicidad. La forma 2 demostró aproximadamente un 0,12 % de aumento de peso en el intervalo de humedad del 5 % al 70 % de humedad relativa y aproximadamente un 0,18 % de aumento de peso en el intervalo de humedad del 5 % al 90 % de humedad relativa a temperatura ambiente, como se muestra en la figura 4. Se considera que la forma 2 no es higroscópica.
Ejemplo 9: Difracción de rayos X de monocristal de la Forma 2
Los datos se recogieron en una fuente Rigaku Oxford Diffraction Supernova Dual, Cu a cero, difractómetro Atlas CCD equipado con un dispositivo de refrigeración Oxford Cryosystems Cobra. Los datos se recogieron usando radiación Cu Ka. La estructura se resolvió y se refinó usando el software cristalográfico Bruker AXS SHELXTL suite. Los detalles completos se pueden encontrar en el CIF. A menos que se indique otra cosa, los átomos de hidrógeno unidos al carbono se colocaron geométricamente y se permitió su refinado con un parámetro de desplazamiento isotrópico encabalgado. Los átomos de hidrógeno unidos a los heteroátomos se localizaron en un mapa de Fourier diferente y se dejaron refinar libremente con un parámetro de desplazamiento isotrópico.
Tabl a 2
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(continuación)
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Ejemplo 10: Evaluación de estabilidad del estado sólido de la forma 1
Se almacenaron muestras de la forma libre cristalina Forma 1 de la invención a 25 °C y el 60 % de humedad relativa (RH) y a 40 °C y el 75 % de RH con dos configuraciones a) recipiente de vidrio abierto y b) recipiente de vidrio cerrado colocado dentro de un frasco de HDPE que contiene desecante. La botella de HDPE se cerró herméticamente por inducción. A intervalos específicos, los contenidos de una muestra representativa se eliminaron y se analizaron por HPLC para su pureza química (mostrada a continuación como pureza de la HPLC (% a/a)).
Tabla 4: Estudio de estabilidad de la forma 1 cristalina
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Ejemplo 11: Imagen microscópica con luz polarizada (PLM) de Forma 1 y Forma 2
Las muestras de Forma 1 y Forma 2 se examinaron con un microscopio óptico (Olympus BX51) con filtro de luz polarizada cruzada. Las imágenes se recogieron con una cámara PaxCam controlada por el software PaxIt Imaging (versión 6.4). Las muestras se prepararon sobre portaobjetos de vidrio con aceite mineral ligero como medio de inmersión. Dependiendo del tamaño de las partículas, se usó una lente de objetivo de 4x, 10x o 20x para los aumentos.
Preparación 8: 2-yodo-1-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridina-5-carboxilato de tere-butilo (C-5)
A una solución del compuesto C-22 (25 g, 135,86 mmol) en HCl 0,01 M (500 ml) se le añadió dimetoximetano (21,64 ml, 244,54 mmol). La solución resultante se agitó a 100 °C durante 18 h. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo se trituró dos veces con éter dietílico y etanol, se filtró y se secó para proporcionar el compuesto C-21 (25,2 g, 94,6 % de rendimiento).
A una solución del compuesto C-21 (25,0 g, 127,55 mmol) en metanol (250 ml) se le añadió DIPEA (57,23 ml, 318,87 mmol) seguido de la adición de (Boc)2O (68,23 ml, 318,87 mol) y la reacción se agitó a TA durante 18 h. La reacción resultante se diluyó con agua (150 ml) y se extrajo usando acetato de etilo (3x200 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato sódico anhidro, se decantó y se concentró a presión reducida para obtener el producto C-20 en bruto, el cual se llevó a la etapa siguiente sin más purificación.
A una solución de este compuesto C-20 en bruto (40,0 g, 123,8 mmol) en metanol (500 ml) se le añadió solución 1 M de NaOH (200 ml) y la solución resultante se agitó a TA durante 18 h. El disolvente se eliminó por destilación al vacío y el producto en bruto resultante se diluyó con agua (200 ml) y se extrajo usando acetato de etilo (3x300 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró a presión reducida para obtener el producto en bruto que se purificó a través de cromatografía en columna (100-200 gel de sílice), eluyendo con MeOH al 5-10 %:DCM para obtener el producto C-19 deseado (20 g, 72,4 % de rendimiento).
A una solución del compuesto C-19 (20 g, 89,68 mmol) en THF (400 ml) se le añadió NIS (30,26 g, 134,52 mmol) a TA y la solución resultante se agitó durante 2 horas a la misma temperatura. La mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml) y se extrajo en acetato de etilo (2x300 ml), la capa orgánica se lavó con una solución acuosa al 10 % de tiosulfato de sodio (3x100 ml) seguido de salmuera, se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró a presión reducida para obtener el producto C-18 en bruto, que se usó en la etapa siguiente sin más purificación.
A una solución en agitación del compuesto C-18 (15,0 g, 42,97 mmol) en THF (150 ml) se le añadió NaH (1,8 g 45,11 mmol) a 0 °C en porciones y la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a TA. Después se añadió cloruro de SEM (8,18 ml, 45,11 mmol) gota a gota a 0 °C. La reacción se agitó durante 6 horas a TA. El progreso de la reacción se controló por TLC, la reacción se interrumpió con agua enfriada con hielo (200 ml) a 0 °C y se extrajo con acetato de etilo (2x200 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato sódico anhidro. La capa orgánica se filtró y se concentró a presión reducida para obtener el producto en bruto, que se purificó por cromatografía en columna (100-200) sílice (eluyendo con 10-15 % de EtOAc:hexano) para obtener el producto C-5 deseado en forma de un líquido viscoso (11 g, 55 %).
Preparación 9: 2-(2-etil-5-fluoro-4-metoxifenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (C-12)
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A una suspensión en agitación del compuesto C-17 (347,6 g, 973,14 mmol) en THF anhidro (1000 ml) enfriada a -40 °C, se le añadió n-butil litio (2,5 M en hexano, 362,6 ml, 905,02 mmol) durante 50 min, momento en el que el color amarillo característico del iluro fosforoso persistió. La mezcla de reacción se calentó a -10 °C y se agitó durante 1 h, después la mezcla se enfrió a -30 °C y se añadió una solución del compuesto R-1 (50 g, 324,38 mmol) en THF anhidro (200 ml) durante 30 min. La mezcla resultante se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. El progreso de la reacción se controló por TLC. Cuando se completó, la reacción se interrumpió mediante la adición gradual de agua (500 ml) y se extrajo con éter dietílico (3x500 ml). La capa orgánica combinada se lavó con agua (2x500 ml) y salmuera (250 ml), se secó sobre (Na2SO4 anhidro) y se concentró a presión reducida para dar el compuesto en bruto. El producto en bruto C-16 obtenido se usó en la siguiente etapa sin purificación.
A una solución del producto en bruto C-16 (110 g, 723,39 mmol) en etanol (1000 ml) se le añadió Pd al 10 %/C (50 g).
Se montó un globo de gas hidrógeno y la reacción se evacuó y se volvió a llenar con hidrógeno tres veces. La reacción se agitó en una atmósfera de hidrógeno durante una noche a temperatura ambiente. Después de agitar a TA durante una noche, la reacción se completó. Se filtró a través de un lecho de Celite y se concentró al vacío para proporcionar el compuesto en bruto, que se purificó a través de cromatografía en columna (100-200) gel de sílice, se eluyó usando 3-5 % de acetato de etilo/hexano para obtener el producto deseado C-15 en forma de un líquido incoloro (24 g, 48 % durante las 2 etapas).
A una solución del compuesto C-15 (24,0 g, 155,84 mmol) en MeCN (200 ml) se le añadió una solución de NBS (28,0 g, 157,40 mmol) en MeCN (100 ml). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo se diluyó con éter dietílico (100 ml). Se observó precipitación, que se eliminó por filtración y el filtrado se lavó con solución acuosa de sulfito sódico (200 ml) y salmuera (100 ml), se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró al vacío para dar el producto deseado C-14 en forma de un aceite de color amarillo (35,0 g, 97 % de rendimiento).
A una solución del compuesto C-14 (20 g, 85,836 mmol) en dioxano (400 ml) se le añadió el compuesto R-2 (32,69 g, 128,755 mmol) y KOAc (25,27 g, 257,508 mmol). La mezcla de reacción se desgasificó con nitrógeno durante 15 minutos, después se añadió catalizador de paladio (3,5 g, 4,29 mmol). La mezcla de reacción se agitó y se calentó a 110 °C durante 3 horas. La reacción se filtró a través de un lecho de Celite y se lavó con acetato de etilo. El filtrado se diluyó con acetato de etilo (200 ml) y se lavó con agua (2 x 200 ml)) y salmuera (100 ml), se secó sobre sulfato sódico y se concentró al vacío. El producto en bruto obtenido se purificó a través de cromatografía en columna (100-200 gel de sílice), se eluyó con EtOAc al 3-5 %:hexano para dar el producto deseado C-12 (20 g, 83 % de rendimiento).
Preparación 10: 3-(dimetil-estannil)-6-(2-etil-5-fluoro-4-metoxifenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1H-indazol (C-6)
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-
Una mezcla del compuesto C-13 (25 g, 126,84 mmol), 3,4-dihidro-2H-pirano (134,5 ml, 1471,5 ml) y p-TSA (5,57 g, 29,18 mmol) se recogió en THF (700 ml) y se calentó a 60 °C durante una noche. La mezcla de reacción se vertió en agua enfriada con hielo y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico y se filtró. El filtrado se evaporó a presión reducida y el residuo se purificó sobre una columna de gel de sílice (230­ 400) (eluyendo con 1-2 % de acetato de etilo en hexano) para dar el compuesto deseado C-11 (23,5 g, 67 % de rendimiento).
Una solución del compuesto C-11 (13,3 g, 47,5 mmol), compuesto C-12 (15,96 g, 57,0 mmol) y K3PO4 (30,21 g, 142,5 mmol) en DMF:H2O (396:99 ml) se desgasificó con nitrógeno durante 15 minutos, después se añadió catalizador de paladio (1,6 g, 2,37 mmol) y la mezcla de reacción se purgó con nitrógeno durante 5 minutos. La mezcla de reacción resultante se calentó a 100 °C durante 12 h en condiciones de agitación. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de Celite y se lavó con acetato de etilo. El filtrado se diluyó con acetato de etilo (200 ml), se extrajo con EtOAc (2x100 ml) y se lavó con agua fría (100 ml) y salmuera (50 ml), se secó sobre sulfato sódico y se concentró al vacío para obtener el producto en bruto, que se purificó por cromatografía ultrarrápida (100-200 gel de sílice), eluyendo con EtOAc al 10 %:hexano para dar C-10 (14 g, 91,4 % de rendimiento)).
A una solución del compuesto C-10 (52 g, 146,89 mmol) en metanol (600 ml) se le añadió HCl concentrado (50 ml) y la solución resultante se calentó a 60 °C durante una noche. La mezcla de reacción se enfrió a TA y se concentró al vacío. El residuo se diluyó con EtOAc (200 ml) y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 (2x150 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró para obtener el producto deseado C-9 (35 g, 88,9 % de rendimiento).
A una solución del compuesto C-9 (17,5 g, 64,81 mmol) en DMF (100 ml) se le añadió KOH (14,5 g, 259,54 mmol) y la mezcla se agitó durante 15 minutos. Una solución de yodo (32,7 g, 129,62 mmol) en DMF (50 ml) se añadió lentamente a 0 °C y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 30 min. El progreso de la reacción se controló por TLC, después la mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2x200 ml). La capa orgánica se lavó con solución acuosa saturada de metabisulfito sódico (2x150 ml) y agua (3x100 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró al vacío para obtener el producto en bruto C-8 (21 g).
A una solución de C-8 (21,0 g, 53,02 mmol) en DCM (230 ml) se le añadió p-TsOH (1,8 g, 10,60 mmol) y la mezcla se enfrió a 0 °C. El compuesto R-3 (7,04 ml, 79,54 mmol) se añadió gota a gota a la solución anterior y la mezcla de reacción se agitó a t A durante una noche. El control por TLC mostró que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (2x 150 ml) y se lavó con solución acuosa saturada de NaHCO3 (200 ml) y salmuera (200 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró al vacío para dar el producto en bruto que se purificó por cromatografía ultrarrápida para dar C-7.
Una solución de C-7 (10,0 g, 20,83 mmol) en tolueno (200 ml) se desgasificó con nitrógeno durante 20 minutos, seguido de la adición de R-4 (4,89 ml, 22,91 mmol) y Pd(PPh3)4 (1,2 g, 1,04 mmol). La mezcla de reacción se purgó con nitrógeno durante otros 5 minutos y después se agitó a 100 °C. Después de 2 h, el análisis por TLC mostró la finalización de la reacción. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró a través de un lecho de Celite y el residuo se lavó con acetato de etilo. El filtrado concentrado se purificó por cromatografía en columna (alúmina neutra), se eluyó con EtOAc al 2-5 %:hexano para dar el producto C-6 (6,4 g, 57,6 % de rendimiento).
Preparación 11: 2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-metoxifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5.6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (C-3)
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A una solución del compuesto C-6 (6,4 g, 12,37 mmol) en tolueno (100 ml) se le añadió el compuesto C-5 (5,9 g, 12,37 mmol). La mezcla de reacción se desgasificó con nitrógeno durante 20 minutos, seguido de la adición de yoduro de cobre (I) (470 mg, 2,47 mmol) y Pd(PPh3)4 (714 mg, 1,237 mmol), después se agitó a 100 °C durante 12 h. El progreso de la reacción se controló por TLC. La reacción se enfrió a TA y se filtró a través de un lecho de Celite, el residuo se lavó con acetato de etilo. La capa orgánica se diluyó con agua, se separó y la 'parte orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se filtró. El filtrado se concentró a presión reducida para dar el producto en bruto que se purificó por cromatografía en columna (100-200 mesh de tamaño del sílice), eluyendo con EtOAc al 20 %:hexano para dar C-4 (4 g, 45,9 %).
A una solución del compuesto C-4 (4,0 g, 5,6 mmol) en dioxano (30 ml) se le añadió HCl concentrado (30 ml). La mezcla de reacción se agitó a 70 °C durante 16 h. El progreso de la reacción se controló por LCMS. La reacción se enfrió a TA, se concentró al vacío, se trituró con éter dietílico y se purificó a través de HPLC prep. para dar el compuesto deseado C-3 (0,65 g, 29,5 %).
Ejemplo 12: 1-(2-(6-(2-etN-5-fluoro-4-hidroxifeml)-1H-mdazol-3-M)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]pmdm-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (C-1)
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A la mezcla de C-3 (180 mg, 0,460 mmol) en DCM (0,5 ml) a ta se le añadió tribromuro de boro, 1 m en DCM [100 ml) (2,299 ml, 2,299 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 30 min antes de concentrarla. El residuo resultante se coevaporó con MeOH (3x3,0 ml), se redisolvió en una mezcla 1:1 de AcOH:H2O (3,0 ml), se filtró y se purificó por HPLC prep. de fase inversa. Las fracciones deseadas se combinaron y se liofilizaron para dar C-2 ((5-etil-2-fluoro-4-(3-(4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1H-indazol-6-il)fenol) en forma de una sal de TFA.
A la mezcla de C-2, TFA (15 mg, 0,031 mmol) y 7" (2 equivalentes, 0,061 mmol) en DMF (0.5 ml) a ta se le añadió HATU (25,5 mg, 0,067 mmol) y DIEA (0,043 ml, 0,244 mmol). La mezcla resultante se agitó a ta durante una noche. La reacción se diluyó con MeOH (0,5000 ml) y agua (0,500 ml). Se añadió LiOH (2,193 mg, 0,092 mmol). La mezcla resultante se calentó a 65 °C durante 1 h. Después, la reacción se concentró, el residuo resultante se trató con una mezcla de DCM (0,500 ml) y TFA (0,500 ml) a ta. durante 30 min, se concentró, se volvió a disolvente en una mezcla 1:1 de AcOH:H2O (1,5 ml), se filtró y se purificó por HPLC prep. de fase inversa para dar el compuesto C-1 en forma de una sal de TFA. (m/z): [M+H]+ calculado para C27H29FN6O3504,23 encontrado 505,2.
Ensayos biológicos
El compuesto 1 se ha caracterizado en uno o más de los siguientes ensayos biológicos.
Ensayo 1: Ensayos bioquímicos de cinasas JAK
Se llevó a cabo un panel de cuatro ensayos bioquímicos de JAK de LanthaScreen (JAK1, 2, 3 y Tyk2) en un tampón de reacción de cinasa común (HEPES 50 mM, pH 7,5, Brij-35 al 0,01 %, MgCh 10 mM y EGTA 1 mM). Se obtuvieron enzimas JAK etiquetadas con GST recombinantes y un sustrato peptídico STAT1 etiquetado con GFP en Life Technologies.
El compuesto diluido en serie se preincubó con cada una de las cuatro enzimas JAK y el sustrato en microplacas blancas de 384 pocillos (Corning) a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente se añadió ATP para iniciar las reacciones de cinasa en un volumen total de 10 pl, con DMSO al 1 %. Las concentraciones finales de enzima para JAK 2, 3 y Tyk2 son 4,2 nM, 0,1 nM, 1 nM y 0,25 nM respectivamente; las concentraciones de ATP de Km correspondientes utilizadas son 25 jM , 3 |jM, 1,6 |jM y 10 |jM; mientras que la concentración del sustrato es de 200 nM para los cuatro ensayos. Se permitió que las reacciones de las cinasas continuaran durante 1 hora a temperatura ambiente antes de que se añadiese una preparación de 10 jl de EDTA (concentración final 10 mM) y anticuerpo Tbanti-pSTAT1 (pTyr701) (Life Technologies, concentración final 2 nM) en tampón de dilución de TR-FRET (Life Technologies). Se dejaron incubar las placas a temperatura ambiente durante 1 h antes de que se leerlas en el lector EnVision (Perkin Elmer). Las señales de relación de emisión (520 nm/495 nm) se registraron y utilizaron para calcular los valores de porcentaje de inhibición basados en DMSO y en los controles de actividad de fondo.
Para el análisis de respuesta a la dosis, se representaron gráficamente los datos de porcentaje de inhibición frente a las concentraciones de compuesto y se determinaron los valores de CI50 a partir de un modelo de ajuste robusto de 4 parámetros con el programa informático Prism (programa informático GraphPad). Los resultados se expresaron como pCl50 (logaritmo negativo de CI50) y posteriormente se convirtieron en pKi (logaritmo negativo de la constante de disociación, Ki) usando la ecuación de Cheng-Prusoff.
El compuesto 1 presentó la siguiente potencia enzimática.
Tabla 5
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Ensayo 2: Ensayo de potencia de JAK celular: Inhibición de IL-13
El ensayo de potencia JAKI celular de AlphaScreen se llevó a cabo midiendo la fosforilación de STAT6 inducida por la interleucina 13 (IL-13, R&D Systems) en células epiteliales pulmonares humanas BEAS-2B (ATCC). El anticuerpo anti-STAT6 (Cell Signaling Technologies) se conjugó con perlas aceptoras AlphaScreen (Perkin Elmer), mientras que el anticuerpo anti-pSTAT6 (pTyr641) (Cell Signaling Technologies) se biotiniló usando Sulfo-NHS-Biotina EZ-Link (Thermo Scientific).
Se cultivaron células BEAS-2B a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % en medio DMEM al 50 %/F-12 al 50% (Life Technologies) complementado con SFB al 10% (Hyclone), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 jig/ml (Life Technologies) y GlutaMAX 2 mM (Life Technologies). El día 1 del ensayo, las células se sembraron a una densidad de 7.500 células/pocillo en placas de color blanco de 384 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (Corning) con 25 jil de medio y se les permitió adherirse durante una noche en la incubadora. El día 2 del ensayo, el medio se retiró y se sustituyó con 12 jil de tampón de ensayo (solución salina equilibrada de Hank/HBSS, h Ep ES 25 mM y seroalbúmina bovina/BSA 1 mg/ml) que contenía dosis de respuesta de compuestos de ensayo. El compuesto se diluyó en serie en DMSO y después se diluyó otras 1000 veces en medio para llevar la concentración final de DMSO al 0,1 %. Las células se incubaron con los compuestos de prueba a 37 °C durante 1 h seguido de la adición de 12 jl de IL-13 precalentada (80 ng/ml en tampón de ensayo) para la estimulación. Después de incubar a 37 °C durante 30 min, se retiró el tampón de ensayo (que contenía el compuesto e IL-13) y 10 jl de tampón de lisis celular (HEPES 25 mM, SDS al 0,1 %, NP-40 1 %, MgCh 5 mM, EDTA 1,3 mM, EGTA 1 mM y complemento con inhibidores de proteasa Complete Ultra mini y PhosSTOP de Roche Diagnostics). Las placas se agitaron a temperatura ambiente durante 30 min antes de la adición de reactivos de detección. En primer lugar, se añadió una mezcla de perlas aceptoras conjugadas con anti-pSTAT6 y biotina-anti-STAT6 y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de la adición de perlas donantes conjugadas con estreptavidina (Perkin Elmer). Después de un mínimo de 2 h de incubación, las placas de ensayo se leyeron en el lector de placas EnVision. Se registraron señales de luminiscencia de AlphaScreen y se usaron para calcular los valores de porcentaje de inhibición basados en DMSO y en los controles de actividad de fondo.
Para el análisis de respuesta a la dosis, se representaron gráficamente los datos de porcentaje de inhibición frente a las concentraciones de compuesto y se determinaron los valores de CI50 a partir de un modelo de ajuste robusto de 4 parámetros con el programa informático Prism. Los resultados también pueden expresarse como el logaritmo negativo del valor de CI50, pCI50. El compuesto 1 presentó en este ensayo un valor de pCI50 de 7,9.
Ensayo 3: Ensayo de potencia de JAK celular: Inhibición de IFNy estimulado por IL-2/anti-CD3 en CMSP humanas
La potencia del compuesto de prueba para la inhibición del interferón gamma (IFNy) estimulado por interleucina 2 (IL-2)/anti-CD3 se midió en células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) aisladas de sangre entera humana (Stanford Blood Center). Debido a que IL-2 señaliza a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
(1) Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana de sangre entera humana de donantes sanos usando un gradiente de ficoll. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % a 37 °C, en RPMI (Life Technologies) complementado con suero fetal bovino al 10 % inactivado por calor (SFB, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies) y Pen/Estrep IX (Life Technologies). Las células se sembraron a 200.000 células/pocillo en medio (50 jl) y se cultivaron durante 1 h. El compuesto se diluyó en serie en DMSO y después se diluyó otras 500 veces (hasta una concentración de ensayo final 2x) en medio. Las diluciones del compuesto de prueba (100 ul/pocillo) se añadieron a las células y se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 h, seguido de la adición de IL-2 (R&D Systems; concentración final 100 ng/ml) y anti-CD3 (BD Biosciences; concentración final 1 jg/ml) en medio de ensayo precalentado (50 jl) durante 24 h. (2) Después de la estimulación con citocinas, las células se centrifugaron a 500 g durante 5 min y los sobrenadantes se retiraron y se congelaron a -80 °C. Para determinar la potencia inhibidora de los compuestos de prueba en respuesta a IL-2/anti-CD3, se midieron las concentraciones de IFNy del sobrenadante a través de ELISA (R&D Systems). Se determinaron valores de CI50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de concentración de IFNy frente a concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pCl50 (logaritmo decimal negativo de la CI50). El compuesto 1 presentó un valor de pCl50 de aproximadamente 6,7 en este ensayo.
Ensayo 4: Ensayo de potencia de JAK celular: Inhibición de pSTAT5 estimulada por IL-2 en linfocitos T CD4+
Se midió la potencia del compuesto de prueba para la inhibición de la fosforilación de STAT5 estimulada por interleucina 2 (IL-2)/anti-CD3 en linfocitos T positivos para CD4 (CD4+) en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana aisladas de sangre completa entera (Stanford Blood Center) usando citometría de flujo. Debido a que IL-2 señaliza a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Se identificaron linfocitos T CD4+ usando un anticuerpo anti-CD4 conjugado con ficoeritrobilina (PE) (Clon RPA-T4, BD Biosciences), al tiempo que se utilizó un anticuerpo anti-pSTAT5 conjugado con Alexa Fluor 647 (pY694, Clon 47, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STAT5.
(1) Se siguió el protocolo párrafo (1) del Ensayo 3 con la excepción de que la estimulación de citocinas con IL-2/anti-CD3 se realizó durante 30 min en lugar de 24 h.
(2) Después de la estimulación con citocinas, las células se fijaron con solución de fijación precalentada (200 jl; BD Biosciences) durante 10 min a 37 °C, CO2 5%, se lavaron dos veces con tampón DPBS (1 ml, Life Technologies) y se resuspendieron en tampón Perm III enfriado con hielo (1000 jl, BD Biosciences) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con SFB al 2 % en DPBS (tampón de FACS) y después se resuspendieron en tampón de FACS (100 jl) que contenía PE anti-CD4 (dilución 1:50) y Alexa Fluor 647 anti-CD3 anti-CD3 (dilución 1:5) durante 60 min a temperatura ambiente en oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces en tampón de FACs antes de analizarlas usando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences). Para determinar la potencia inhibidora del compuesto de prueba en respuesta a IL-2/anti-CD3, se midió la intensidad de fluorescencia media (IFM) de pSTAT5 en linfocitos T CD4+. Se determinaron los valores de CI50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de IFM frente a la concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pCI50 (logaritmo decimal negativo de la CI50). El compuesto 1 presentó en este ensayo un valor de pCI50 de aproximadamente 7,7.
Ensayo 5: Ensayo de potencia de JAK celular: Inhibición de CCL2 estimulada por IL-6 (MCP-1) en CMSP humanas
La potencia del compuesto de prueba para la inhibición de CCL2 (MCP-1) estimulada por interleucina 6 (IL-6) se midió en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana aisladas de sangre entera humana (Stanford Blood Center). Debido a que IL-6 señaliza a través de JAK, este ensayo proporciona una medida distal de la potencia de JAK celular.
(1) Se siguió el protocolo del párrafo (1) del Ensayo 3 hasta la incubación con compuestos de prueba. En el presente ensayo, después de añadir los compuestos de prueba a los pocillos y de incubar, se añadió IL-6 (R&D Systems; concentración final 10 ng/ml) en medio de ensayo precalentado (50 jl).
(2) Después de la estimulación con la citocina durante 48 h, las células se centrifugaron a 500 g durante 5 min y los sobrenadantes se retiraron y se congelaron a -80 °C. Para determinar la potencia inhibidora del compuesto de prueba en respuesta a la IL-6, se midieron las concentraciones de CCL2 (MCP-1) en el sobrenadante a través de ELISA (R&D Systems). Se determinaron los valores de CI50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de concentración de CCL2/MCP-1 frente a la concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pCI50 (logaritmo decimal negativo de la CI50). El compuesto 1 presentó un valor de pCI50 de aproximadamente 6,4 en este ensayo.
Ensayo 6: Ensayo de potencia de JAK celular: Inhibición de pSTAT1 inducida por IFNy
Se midió la potencia del compuesto de prueba para la inhibición de la fosforilación de STAT1 estimulada por interferón gamma (IFNy) en monocitos positivos para CD14 (CD14+) obtenidos de sangre completa humana (Stanford Blood Center) usando citometría de flujo. Debido a que IFNy señaliza a través de JAK, este ensayo proporciona una medida de la potencia celular de JAK.
Los monocitos se identificaron usando un anticuerpo anti-CD 14 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Clon RM052, Beckman Coulter) y se usó un anticuerpo anti-pSTATI conjugado con Alexa Fluor 647 (pY701, Clon 4a, BD Biosciences) para detectar la fosforilación de STAT1.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana de sangre completa entera de donantes sanos usando un gradiente de ficoll. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % a 37 °C, en RPMI (Life Technologies) complementado con suero fetal bovino al 10 % (SFB, Life Technologies), Glutamax 2 mM (Life Technologies), HEPES 25 mM (Life Technologies) y Pen/Estrep 1x (Life Technologies). Las células se sembraron a 250.000 células/pocillo en medio (200 jl), se cultivaron durante 2 h y se resuspendieron en medio de ensayo (50 jl) (RPMI complementado con seroalbúmina bovina al 0,1 % (Sigma), Glutamax 2 mM, HEPES 25 mM y Pen/estrep 1x) que contenía diversas concentraciones de compuestos de prueba. Los compuestos se diluyeron en serie en DMSO y a continuación se diluyeron otras 1000 veces en medio para llevar la concentración final de DMSO al 0,1 %. Las diluciones del compuesto de prueba se incubaron con las células a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 h, seguido de la adición de IFNy precalentado (R&D Systems) en medio (50 jl) a una concentración final de 0,6 ng/ml durante 30 min. Después de la estimulación con citocina, las células se fijaron con solución de fijación precalentada (100 jl) (BD Biosciences) durante 10 min a 37 °C, CO2 al 5 %, se lavaron dos veces con tampón de fAc S (1 ml) (BSA al 1 % en PBS), se resuspendieron en anti-CD14 FITC:tampón de FACS 1:10 (100 jl) y se incubó a 4 °C durante 15 min. Las células se lavaron una vez y después se resuspendieron en Tampón Perm III enfriado con hielo (BD Biosciences) (100 jl) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón de FACS y después se resuspendieron en anti-pSTAT1 Alexa Fluor 647:tampón de FACS 1:10 (100 jl) durante 30 min a TA en oscuridad, se lavaron dos veces en tampón de FACS y se analizaron usando un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences).
Para determinar la potencia inhibidora del compuesto de prueba, la intensidad de fluorescencia media (IFM) de pSTAT1 se midió en monocitos CD14+. Se determinaron los valores de CI50 a partir del análisis de las curvas de inhibición de IFM frente a la concentración de compuesto. Los datos se expresan como valores de pCI50 (logaritmo decimal negativo de la CI50). El compuesto 1 presentó en este ensayo un valor de pCI50 de aproximadamente 7,1.
Ensayo 7: Farmacocinética ocular en ojos de conejo
El objetivo de este ensayo fue determinar la farmacocinética de un compuesto de prueba en tejidos oculares de conejo.
Formulaciones en solución
Se disolvió la 1-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (1), preparada en el Ejemplo 2, en 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina al 2 % para alcanzar una concentración objetivo de 1 mg/ml. Se administró una inyección intravítrea bilateral (50 jl/ojo) de la solución del compuesto de prueba a conejos blancos New Zealand (50 jg / ojo). La concentración del compuesto de prueba se midió en tejidos oculares: vitreo, acuoso, retina/coroides e iris-cuerpo ciliar en puntos de tiempo posinyección predeterminados (30 min, 4 h, 1 d, 3 d, 7 d, 14 d). Se administraron dosis a dos conejos (cuatro ojos) para cada punto de tiempo. En el tejido vitreo, el compuesto 1 presentó una disminución de dos fases en la concentración caracterizada por una disminución inicial en la concentración con una semivida de aproximadamente 9 horas y finalmente una semivida terminal de aproximadamente 2 días. Se descubrió que el compuesto también se distribuye rápidamente en la retina y la región coroidea y muestra un perfil farmacocinético similar al del tejido vitreo.
Formulación de suspensión
Se preparó una formulación en suspensión combinando el compuesto 1 del Ejemplo 2 (Forma 1), con hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC E5) al 0,5% Tween 80 al 0,02% en solución salina normal para alcanzar una concentración objetivo de 5 mg/ml, 20 mg/ml y 80 mg/ml para las dosis de 0,25 mg/ojo, 1 mg/ojo y 4 mg/ojo, respectivamente. Se administró una inyección intravítrea bilateral (50 jl/ojo) de la suspensión del compuesto de prueba a conejos blancos New Zealand. La concentración del compuesto de prueba se midió en tejidos oculares como en el ensayo de formulación en solución, a los 30 min, 4 h, 24 h, 72 h, 7 d, 14 d, 28 d, 56 d y 84 d posinyección. Para el grupo de dosis de 4 mg/ojo, también se recogió un punto de tiempo adicional a los 168 d posinyección. Todos los grupos de dosis demostraron una concentración medible de fármaco en el ojo hasta el último punto de tiempo evaluado en este estudio. Se observó una exposición mantenida robusta para todas las dosis a las 12 semanas (84 d). Se observó exposición mantenida a las 24 semanas (84 d) para el grupo de dosis de 4 mg/ojo. El compuesto mostró una disminución lineal en la concentración de fármaco en el tejido vítreo desde los 30 min hasta las 24 semanas con una tasa de depuración del fármaco de aproximadamente 5 a 10 jg/ml/día. La tasa de depuración es compatible con la solubilidad del compuesto 1 en el vehículo y el comportamiento farmacocinético ocular en la formulación en solución. Todos los grupos de dosis demostraron una concentración medible de fármaco en el ojo hasta el último punto de tiempo evaluado en este estudio. Por lo tanto, es plausible que la exposición al fármaco sea más prolongada que la observada en este estudio. Se midió la concentración de fármaco en plasma y se encontró que era al menos 3 órdenes de magnitud inferior que la concentración en tejido vítreo en las tres concentraciones.
Se preparó una formulación en suspensión combinando el compuesto 1 del Ejemplo 5 (Forma 2), con hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC E5) al 0,5% Tween 80 al 0,02% en solución salina normal para alcanzar una concentración objetivo de 0,4 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml y 20 mg/ml para las dosis de 0,02 mg/ojo, 0,05 mg/ojo, 0. 1 mg/ojo y 1 mg/ojo, respectivamente. Se administró una inyección intravítrea bilateral (50 pl/ojo) de la suspensión del compuesto de prueba a conejos Dutch Belted. La concentración del compuesto de prueba se midió en humor vitreo, humor acuoso, iris-cuerpo ciliar, retina, células coroideas/epiteliales del pigmento retiniano y plasma a los 30 min, 7 d, 14 d, 28 d, 42 d y 56 d posinyección. El compuesto mostró una disminución muy gradual en la concentración de fármaco en el tejido vitreo desde los 30 min hasta el último punto de tiempo probado (28 d para la dosis de 0,02 mg/ojo, 42 d para las dosis de 0,05 mg/ojo y 1 mg/ojo y 56 d para la dosis de 0,1 mg/ojo). Todos los grupos de dosis demostraron una concentración medible de fármaco en el ojo hasta el último punto de tiempo evaluado en este estudio. Por lo tanto, es plausible que la exposición al fármaco sea más prolongada que la observada en este estudio. Se midió la concentración de fármaco en plasma y se encontró que era al menos 3 órdenes de magnitud inferior que la concentración en tejido vitreo en las tres concentraciones. Los 3 órdenes de magnitud corresponden a una escala logarítmica (es decir, 1000 en una escala no logarítmica).
Ensayo 8: Ensayo farmacodinámico: Inhibición de pSTAT3 inducida por IL6 en ratas
La capacidad de una única administración intravítrea del compuesto de prueba para inhibir pSTAT3 inducida por IL-6 se midió en homogeneizados de retina/coroides de rata.
Se preparó una formulación en suspensión combinando el compuesto 1 del Ejemplo 2, con hidroxipropilmetilcelulosa al 0,5 % (HPMC E5 LV), Tween 80 al 0,02 % y cloruro de sodio 9 mg/ml en agua purificada para alcanzar una concentración objetivo de 10 mg/ml.
Se les dosificó (5 pl por ojo) a ratas Lewis hembra la formulación en suspensión por vía intravítrea (i.v.). Tres días más tarde, se administró IL-6 (Peprotech; 0,1 mg/ml; 5 pl por ojo) o vehículo por vía intravítrea para inducir la pSTAT3. Los tejidos oculares se disecaron una hora después de la segunda inyección i.v. con IL-6. Los tejidos retinianos/coroideos se homogeneizaron y se midieron los niveles de pSTAT3 usando ELISA (Cell Signaling Technology). Se calculó el porcentaje de inhibición de pSTAT3 inducida por IL-6 en comparación con los grupos de vehículo/vehículo y vehículo/IL-6. Una inhibición superior al 100% refleja una reducción de los niveles de pSTAT3 por debajo de los observados en el grupo de vehículo/vehículo.
Con un pretratamiento de 3 días antes de la exposición a IL-6, una dosis de 50 pg del compuesto 1 administrada mediante la formulación en suspensión inhibió la pSTAT3 inducida por IL-6 en un 116% en los tejidos retinianos/coroideos.
Ensayo 9: Ensayo farmacodinámico: Inhibición de IP-10 inducida por IFNy en ojos de conejo
Se midió en tejidos vítreos y retinianos/coroideos de conejo la capacidad de una única administración intravítrea del compuesto de prueba para inhibir los niveles de proteína IP-10 inducidos por interferón-gamma (IFNy).
Se preparó una formulación en suspensión combinando el compuesto 1 del Ejemplo 2 (Forma 1), con hidroxipropilmetilcelulosa al 0,5 % (HPMC E5), Tween 80 al 0,02 % y cloruro de sodio 9 mg/ml en agua purificada para alcanzar una concentración objetivo de 20 mg/ml.
Para los estudios se utilizaron conejos blancos New Zealand White machos (Liveon Biolabs, India). Los animales se aclimataron después de su llegada a las instalaciones de investigación (Jubilant Biosys Ltd., India). Cada conejo recibió un total de dos inyecciones intravítreas (i.v.) con un volumen de dosis total de 50 pl por ojo. La primera inyección i.v. (45 pl por ojo) suministró 0,9 mg del compuesto de prueba o vehículo. Una semana después, una segunda inyección 1. v. (5 pl por ojo) administró IFNy (1 pg/ojo; solución madre de 1 mg/ml; Kingfisher Biotech) o vehículo para la inducción de IP-10. El día de las inyecciones, los conejos se anestesiaron con una inyección intramuscular de ketamina (35 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg). Una vez anestesiados profundamente, cada ojo se aclaró con solución salina estéril y se realizaron inyecciones i.v. utilizando una jeringuilla de insulina de 0,5 ml (50 unidades = 0,5 ml) con una aguja de calibre 31 en el lado supranasal de ambos ojos marcando la posición con un calibrador fijo Braunstein (6,98 mm (2 3/4") a 3,5 mm del músculo recto y a 4 mm del limbo.
Los tejidos se recogieron 24 horas después de la segunda inyección i.v. con IFNy. Se recogieron y homogeneizaron humor vítreo (HV) y tejidos retinianos/coroideos (R/C), y se midieron los niveles de proteína IP-10 usando un kit de ELISA de conejo para CXCL10 (IP-10) (Kingfisher Biotech). Se calculó el porcentaje de inhibición de IP-10 inducida por IFNy en comparación con los grupos de vehículo/vehículo y vehículo/IFNY.
Con un pretratamiento de 1 semana antes de la exposición a IFNy, la formulación en suspensión del compuesto 1 inhibió la IP-10 inducida por IFNy en un 81 % y un 80% en el humor vítreo y los tejidos retinianos/coroideos, respectivamente. Además, se observó una eficacia similar con un pretratamiento de 1 mes antes de la exposición a IFNy.
Ensayo 10: Farmacocinética dérmica en piel de ratón y de cerditos enanos
El objetivo de este ensayo era determinar la farmacocinética epidérmica, dérmica y plasmática de un compuesto de prueba después de una exposición de 24 horas para la piel intacta de ratones o de cerditos enanos.
Se formuló 1-(2-(6-(2-Etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (1) al 0,5 % (p/p) en crema o pomada como se describe, como Formulación A o Formulación B, respectivamente en la Tabla 6.
Veinticuatro horas antes de la dosificación, se afeitó el pelo del lomo de ratones Balb/c machos de 25 g, exponiendo un área de al menos 6 cm2 (aproximadamente el 10 % de la superficie corporal) y, en un experimento distinto, de cerditos enanos Gottingen de 10 kg exponiendo un área de al menos 450 cm2 (aproximadamente el 10% de la superficie corporal). En el tiempo cero, después de la anestesia con isoflurano, el compuesto de prueba se aplicó en el lomo de los ratones o los cerditos enanos a una dosis de 25 pl/cm2. La piel se cubrió con una cubierta adhesiva para impedir la pérdida de compuesto en la jaula o la cama.
Después de 24 h de exposición, los lomos se lavaron suavemente con agua y jabón para eliminar el fármaco no absorbido y se secaron con golpecitos. Inmediatamente después de este lavado, se extrajo sangre mediante punción cardíaca de los ratones y a través de venopunción de los cerditos enanos. La piel externa (estrato córneo) se retiró a continuación por abrasión con esparadrapo. Tras la exposición de la epidermis, se tomó una biopsia en sacabocados de 0,5 cm. La epidermis y la dermis se separaron rápidamente, se pesaron y se congelaron instantáneamente. Se obtuvieron muestras similares a las 48 h posdosificación en ratones y a las 48 h, 94 h y 168 h (7 días) posdosificación en cerditos enanos.
Las muestras de epidermis y dermis se homogeneizaron en agua 1:10 (p/v) usando un homogeneizador ultrasónico Covaris. Las muestras se extrajeron en 3 volúmenes de acetonitrilo y se cuantificaron contra una curva patrón a través de análisis por LC-MS. Como lo demuestran los parámetros farmacocinéticos ABCü-t para el plasma, la epidermis y la dermis mostrados a continuación en la Tabla 7, se presentó una exposición significativa al compuesto en las capas de la epidermis y la dermis, mientras que la exposición plasmática fue insignificante en los ratones en la Formulación A y por debajo del límite de cuantificación en la Formulación B en ratones y en ambas formulaciones en cerditos enanos.
Tabla 6
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Tabla 7
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Ensayo 11: Farmacocinética pulmonar y plasmática en ratones
Las concentraciones plasmáticas y pulmonares del compuesto 1 y las relaciones de las mismas se determinaron de la siguiente manera. En el ensayo se usaron ratones BALB/c de Charles River Laboratories. La Forma 1 del compuesto 1 del ejemplo 2 se formuló en Tween 80 al 0,01 % en solución salina normal (cloruro de sodio al 0,9 % en agua) a una concentración de 0,1 mg/ml como suspensión. Se introdujeron 50 pl de la formulación en suspensión en la tráquea de un ratón mediante aspiración oral. En diversos puntos de tiempo (0,083, 1, 4, 24, 48, 72 y 96 horas). Después de la dosificación, se extrajeron muestras de sangre a través de punción cardíaca y se extirparon los pulmones intactos de los ratones. Las muestras de sangre se centrifugaron (centrífuga Eppendorf, 5804R) durante 4 minutos a aproximadamente 12.000 rpm a 4 °C para recoger el plasma. Los pulmones se secaron, se pesaron y se homogeneizaron a una dilución de 1:3 en agua estéril. Se determinaron las concentraciones plasmáticas y pulmonares del compuesto 1 mediante análisis por LC-MS frente a patrones analíticos incorporados en una curva patrón en la matriz de prueba. Se encontró una buena exposición en los pulmones con un ABC pulmonar (0-96 horas) de 360 pg hora/g. La semivida pulmonar se calculó como de aproximadamente 40 horas. La relación de pulmón respecto a plasma se determinó como la relación entre el ABC de pulmón en |jg hora/g y el ABC de plasma en |jg hora/ml (en que ABC se define convencionalmente como el área bajo la curva de concentración del compuesto de prueba frente al tiempo). La relación ABC de pulmón con respecto a plasma fue de 1780, mostrando una exposición muy baja en el plasma.
Ensayo 12: Ensayo farmacodinámico: Inhibición de pSTATI inducida por IFNy en ojos de conejo
Se midió la capacidad de una única administración intravítrea del compuesto de prueba para inhibir la fosforilación de la proteína STAT1 (pSTATI) inducida por interferón-gamma (IFNy) en el tejido retiniano/coroideo de conejo.
Se preparó una formulación en suspensión combinando el compuesto 1 del Ejemplo 2 (Forma 1), con hidroxipropilmetilcelulosa al 0,5 % (HPMC E5), Tween 80 al 0,02 % y cloruro de sodio 9 mg/ml en agua purificada para alcanzar una concentración objetivo de 20 mg/ml.
Para los estudios se utilizaron conejos blancos New Zealand White machos (Liveon Biolabs, India). Los animales se aclimataron después de su llegada a las instalaciones de investigación (Jubilant Biosys Ltd., India). Cada conejo recibió un total de dos inyecciones intravítreas (i.v.) con un volumen de dosis total de 50 jl por ojo. La primera inyección i.v. (45 jl por ojo) suministró 0,9 mg del compuesto de prueba o vehículo. Una semana después, una segunda inyección i.v. (5 jl por ojo) administró IFNy (1 jg/ojo; solución madre de 1 mg/ml; Kingfisher Biotech) o vehículo para la inducción de IP-10. El día de las inyecciones, los conejos se anestesiaron con una inyección intramuscular de ketamina (35 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg). Una vez anestesiados profundamente, cada ojo se aclaró con solución salina estéril y se realizaron inyecciones i.v. utilizando una jeringuilla de insulina de 0,5 ml (50 unidades = 0,5 ml) con una aguja de calibre 31 en el lado supranasal de ambos ojos, marcando la posición con un calibrador fijo Braunstein (6,98 mm (2 3/4") a 3,5 mm del músculo recto y a 4 mm del limbo.
Los tejidos se recogieron 2 horas después de la segunda inyección i.v. con IFNy. Se recogieron y homogeneizaron tejidos retinianos/coroideos (R/C), y se midieron los niveles de pSTAT1 mediante transferencia de Western cuantitativa en el instrumento ProteinSimple WES. Se calculó el porcentaje de inhibición pSTAT1 inducida por IFNy en comparación con los grupos de vehículo/vehículo y vehículo/IFNY.
Con un pretratamiento de 1 semana antes de la exposición a IFNy, la formulación en suspensión del compuesto 1 inhibió a la pSTAT1 inducida por IFNy en un 85 %. Después de un pretratamiento de 3 meses con una dosis única de la formulación en suspensión antes de la exposición a IFNy, la formulación en suspensión del compuesto 1 inhibió a la pSTATI inducida por IFNy en un 76 %.
Se preparó una formulación en suspensión combinando el compuesto 1 del Ejemplo 5 (Forma 2), con hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC E5) al 0,5% Tween 80 al 0,02% en solución salina normal para alcanzar una concentración objetivo de 11,1, 3,3, y 1,1 mg/ml.
Para los estudios se utilizaron conejos blancos New Zealand White machos (Liveon Biolabs, India). Los animales se aclimataron después de su llegada a las instalaciones de investigación (Jubilant Biosys Ltd., India). Cada conejo recibió un total de dos inyecciones intravítreas (i.v.) con un volumen de dosis total de 50 jl por ojo. La primera inyección i.v. (45 jl por ojo) suministró 500 jg, 150 jg o 50 jg del compuesto de prueba o vehículo. Dos semanas después, una segunda inyección i.v. (5 jl por ojo) administró IFNy (1 jg/ojo; solución madre de 1 mg/ml; Kingfisher Biotech) o vehículo para la inducción de IP-10. El día de las inyecciones, los conejos se anestesiaron con una inyección intramuscular de ketamina (35 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg). Una vez anestesiados profundamente, cada ojo se aclaró con solución salina estéril y se realizaron inyecciones i.v. utilizando una jeringuilla de insulina de 0,5 ml (50 unidades = 0,5 ml) con una aguja de calibre 31 en el lado supranasal de ambos ojos marcando la posición con un calibrador fijo Braunstein (6,98 mm (23/4") a 3,5 mm del músculo recto y a 4 mm del limbo.
Los tejidos se recogieron 2 horas después de la segunda inyección i.v. con IFNy. Se recogieron y homogeneizaron tejidos retinianos/coroideos (R/C), y se midieron los niveles de pSTAT1 mediante transferencia de Western cuantitativa en el instrumento ProteinSimple WES. Se calculó el porcentaje de inhibición pSTAT1 inducida por IFNy en comparación con los grupos de vehículo/vehículo y vehículo/IFNY.
Con un pretratamiento de 2 semana antes de la exposición a IFNy, la formulación en suspensión del compuesto 1 inhibió a la pSTAT1 inducida por IFNy en un 79 % para la dosis de 500 jg, en un 58 % para las dosis de 150 jg y en un 61 % para la dosis de 50 jg.
Ensayo 13: Exploración de cinomas y coeficiente de GINI
Los compuestos 1 y C-1 se exploraron frente a otras cinasas para evaluar su perfil de selectividad.
Se cultivaron cepas de fago T7 etiquetado con cinasa en paralelo en bloques de 24 pocillos en un hospedador de E. coli procedente de la cepa BL21. Se cultivaron E. coli hasta la fase logarítmica y se infectaron con fago T7 a partir de una reserva congelada (multiplicidad de infección = 0,4) y se incubaron con agitación a 32 °C hasta la lisis (90-150 minutos). Los lisados se centrifugaron (6000 x g) y se filtraron (0,2 |jm) para eliminar residuos celulares. Las cinasas restantes se produjeron en células HEK-293 y posteriormente se etiquetaron con ADN para la detección mediante qPCR.
Se trataron perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina con ligandos biotinilados de molécula pequeña durante 30 minutos a temperatura ambiente para generar resinas de afinidad para ensayos de cinasa. Las perlas con ligando se bloquearon con exceso de biotina y se lavaron con tampón de bloqueo (SeaBlock (Pierce), BSA al 1 %, Tween 20 al 0,05 %, DTT 1 mM) para eliminar el ligando no unido y reducir la unión de fagos inespecífica. Las reacciones de unión se ensamblaron combinando cinasas, perlas de afinidad con ligando y compuestos de prueba en tampón de unión 1x (SeaBlock al 20 %, PBS 0,17x, Tween 20 al 0,05 %, DTT 6 mM). Los compuestos de prueba se prepararon como soluciones madre 40x en DMSO al 100 % y se diluyeron directamente en el ensayo. Todas las reacciones se realizaron en placas de polipropileno de 384 pocillos en un volumen final de 0,04 ml. Las placas de ensayo se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora y las perlas de afinidad se lavaron con tampón de lavado (PBS 1x, Tween 20 al 0,05 %). Las perlas se resuspendieron en tampón de elución (PBS 1x, Tween 20 al 0,05 %, ligando de afinidad no biotinilado 0,5 jM ) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos. La concentración de cinasa en las fracciones eluidas se midió mediante qPCR.
Los compuestos se exploraron a 1 jM , y los resultados de las interacciones de unión de la exploración primaria de las Tablas 8 y 9 se informan como "% de inhibición" (=100-((señal del compuesto de prueba-señal del control positivo)/((señal del control negativo)-(señal del control positivo))x100), en que el control negativo es DMSO y el control positivo es un compuesto de control.
Tabla 8
Figure imgf000040_0001
Tabla 9
Figure imgf000040_0002
Se descubrió que el compuesto 1 presentaba una inhibición de la unión significativamente menor para CDK7 y CDK9 que el compuesto C-1. El compuesto 1 también tenía una inhibición de la unión más baja para varias otras cinasas.
Ambos compuestos 1 y C-1 se exploraron frente a 35 cinasas distintas. Se determinó el coeficiente de Gini para ambos compuestos. El compuesto 1 tenía un coeficiente GINI de 0,62 y el compuesto C-1 tenía un coeficiente GINI de 0,46. El coeficiente de Gini se utiliza para expresar la selectividad de un compuesto frente a un panel de cinasas (Graczyk, J. Med. Chem., 2007, 50, 5773-5779). Un número más alto corresponde a un compuesto más selectivo.
La única diferencia estructural entre el compuesto 1 y el compuesto C-1 es la presencia de un grupo fluoro en el núcleo. Se ha demostrado que esta diferencia estructural tiene un efecto importante sobre la selectividad de cinoma del compuesto.
Ensayo 14: Ensayo de citotoxicidad
Se llevó a cabo un ensayo de viabilidad/citotoxicidad celular luminiscente CellTiter-Glo en células epiteliales de pulmón humano BEAS-2B (ATCC) en condiciones normales de crecimiento.
Se cultivaron las células a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % en medio DMEM al 50 %/F-12 al 50 % (Life Technologies) complementado con SFB al 10 % (Hyclone), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 jg/ml (Life Technologies) y GlutaMAX 2 mM (Life Technologies). El día 1 del ensayo, se sembraron células a una densidad de 500 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 384 pocillos blancas (Corning) con 25 jl de medio y se les permitió adherirse durante una noche en la incubadora. El día 2 del ensayo, se añadieron 5 jl de medio que contenía dosis de respuesta de los compuestos de prueba y se incubó a 37 °C durante 48 h. Posteriormente se añadieron 30 jl de solución de detección CellTiter-Glo (Promega), se mezclaron en un agitador orbital durante 5 min y se incubaron durante 10 min adicionales antes de la lectura en el lector EnVision. Se registraron las señales de luminiscencia y se calcularon los valores porcentuales del control de DMSO.
Para el análisis de respuesta a la dosis, se representaron gráficamente los datos porcentuales del control de DMSO frente a las concentraciones de compuesto para obtener curvas de respuesta a la dosis por línea que conecta cada punto de datos. La concentración a la que cada curva cruza el umbral de inhibición del 15 % se define como CC15.
Se espera que los compuestos de prueba que presentan un valor de CC15 más alto en este ensayo tengan menos probabilidad de provocar citotoxicidad.
El compuesto 1 presentó una CC15 de 3,16 pM mientras que el compuesto C-1 presentó una CC15 de 630 nM. Por lo tanto, basándose en este ensayo es significativamente menos probable que el compuesto 1 provoque citotoxicidad que el compuesto C-1.
La única diferencia estructural entre el compuesto 1 y el compuesto C-1 es la presencia de un grupo fluoro en el núcleo. Se ha demostrado que esta diferencia estructural tiene un efecto importante sobre la citotoxicidad del compuesto.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de fórmula:
    Figure imgf000042_0001
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula:
    Figure imgf000042_0002
    3. Una forma cristalina del compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 de fórmula:
    Figure imgf000042_0003
    en donde la forma cristalina está caracterizada por un patrón de difracción de rayos X de polvo que comprende picos de difracción a valores de 20 de 10,61 ± 0,20, 11,84 ± 0,20, 14,94 ± 0,20, 18,26 ± 0,20 y 19,06 ± 0,20.
    4. La forma cristalina de la reivindicación 3 en donde el patrón de difracción de rayos X en polvo está además caracterizado por tener picos de difracción adicionales a valores de 20 de 13,32 ± 0,20, 17,69 ± 0,20 y 21,10 ± 0,20.
    5. La forma cristalina de la reivindicación 4 en donde el patrón de difracción de rayos X de polvo además está caracterizado por tener dos o más picos de difracción adicionales a valores de 20 seleccionados de 10,85 ± 0,20, 16,14 ± 0,20, 16,35 ± 0,20, 18,43 ± 0,20, 19,20 ± 0,20, 19,49 ± 0,20, 20,72 ± 0,20, 21,94 ± 0,20, 22,64 ± 0,20, 23,64 ± 0,20, 25,19 ± 0,20 y 28,08 ± 0,20.
    6. La forma cristalina de la reivindicación 4, en donde el patrón de difracción de rayos X de polvo además está caracterizado por tener picos de difracción adicionales a valores de 20 seleccionados de 10,85 ± 0,20, 16,14 ± 0,20, 16,35 ± 0,20, 18,43 ± 0,20, 19,20 ± 0,20, 19,49 ± 0,20, 20,72 ± 0,20, 21,94 ± 0,20, 22,64 ± 0,20, 23,64 ± 0,20, 25,19 ± 0,20 y 28,08 ± 0,20.
    7. La forma cristalina de la reivindicación 3 en donde la forma cristalina está caracterizada por un trazo de calorimetría diferencial de barrido registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto que muestra un máximo en el flujo de calor endotérmico a una temperatura de entre 268 °C y 277 °C.
    8. La forma cristalina de la reivindicación 3 en donde la forma cristalina está caracterizada por un trazo de calorimetría diferencial de barrido registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto que muestra un máximo en el flujo de calor endotérmico con un pico a 272,6 ± 2 °C.
    9. Una forma cristalina del compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 de fórmula:
    Figure imgf000043_0001
    en donde la forma cristalina está caracterizada por un patrón de difracción de rayos X de polvo que comprende picos de difracción a valores de 20 de 8,16 ± 0,20, 8,97 ± 0,20, 15,29 ± 0,20, 16,70 ± 0,20, 18,00 ± 0,20 y 20,18 ± 0,20. 10. La forma cristalina de la reivindicación 9 en donde el patrón de difracción de rayos X de polvo además está caracterizado por tener dos o más picos de difracción adicionales a valores de 20 seleccionados entre 7,69 ± 0,20, 10,66 ± 0,20, 11,46 ± 0,20, 11,91 ± 0,20, 15,80 ± 0,20, 17,02 ± 0,20, 18,83 ± 0,20, 22,39 ± 0,20, 22,98 ± 0,20, 24,89 ± 0,20 y 26,54 ± 0,20.
    11. La forma cristalina de la reivindicación 9, en donde el patrón de difracción de rayos X de polvo además está caracterizado por tener picos de difracción adicionales a valores de 20 seleccionados entre 7,69 ± 0,20, 10,66 ± 0,20, 11,46 ± 0,20, 11,91 ± 0,20, 15,80 ± 0,20, 17,02 ± 0,20, 18,83 ± 0,20, 22,39 ± 0,20, 22,98 ± 0,20, 24,89 ± 0,20 y 26,54 ± 0,20.
    12. La forma cristalina de la reivindicación 9 en donde la forma cristalina está caracterizada por un trazo de calorimetría diferencial de barrido registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto que muestra un máximo en el flujo de calor endotérmico a una temperatura de entre 215 °C y 229 °C.
    13. La forma cristalina de la reivindicación 9 en donde la forma cristalina está caracterizada por un trazo de calorimetría diferencial de barrido registrado a una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto que muestra un máximo en el flujo de calor endotérmico con un pico a 221,7 ± 3 °C.
    14. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la reivindicación 1 o 2 o la forma cristalina de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
    15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, en donde la composición es adecuada para su aplicación al ojo.
    16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, en donde la composición es adecuada para inyección intravítrea.
    17. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en donde la composición es una suspensión.
    18. Un proceso para preparar un compuesto de fórmula 1
    Figure imgf000043_0002
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, comprendiendo el proceso:
    (a) hacer reaccionar un compuesto de fórmula 6:
    Figure imgf000044_0001
    en donde RA es hidrógeno o 2,5-dioxopirrolidinilo y
    (b) opcionalmente preparar una sal farmacéuticamente aceptable para proporcionar un compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    19. Un compuesto de fórmula 6:
    Figure imgf000044_0002
    o una sal del mismo.
    20. Un método para preparar la forma cristalina de la reivindicación 3 que comprende:
    (a) formar una mezcla homogénea de 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroxifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona en un disolvente aprótico polar o en un disolvente polar miscible en agua o en una mezcla de un disolvente aprótico polar y un disolvente polar miscible en agua, a una temperatura de entre 45 y 75 °C;
    (b) añadir la mezcla homogénea a una mezcla de un disolvente miscible en agua y agua, a una temperatura de entre 60 y 90 °C para dar una segunda mezcla;
    (c) añadir agua lentamente a la segunda mezcla a una temperatura de entre 60 y 90 °C para formar una suspensión y
    (d) aislar la forma cristalina de la suspensión.
    21. El método de la reivindicación 20, en donde el disolvente aprótico polar de la etapa (a) se selecciona entre el grupo que consiste en DMSO, DMF, NMP, DMAc y nitrometano, el disolvente polar miscible en agua de la etapa (a) se selecciona entre el grupo que consiste en acetonitrilo, acetona, metanol, etanol y THF, y el disolvente miscible en agua de la etapa (b) se selecciona entre el grupo que consiste en acetonitrilo, acetona, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, THF, DMSO, DMF, NMP, DMAc y nitrometano.
    22. El compuesto según la reivindicación 1 o 2, o la forma cristalina según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular en un mamífero.
    23. El compuesto o forma cristalina para el uso según la reivindicación 22, en donde la enfermedad ocular es uveítis, retinopatía diabética, edema macular diabético, enfermedad del ojo seco, degeneración macular senil, oclusión venosa retiniana o queratoconjuntivitis atópica.
    24. El compuesto o forma cristalina para el uso según la reivindicación 23, en donde la enfermedad ocular es uveítis.
    25. El compuesto o forma cristalina para el uso según la reivindicación 23, en donde la enfermedad ocular es edema macular diabético.
    26. El compuesto según la reivindicación 1 o 2, o la forma cristalina según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria de la piel en un mamífero.
    27. El compuesto o forma cristalina para el uso según la reivindicación 26, en donde la enfermedad inflamatoria de la piel es dermatitis atópica.
    28. El compuesto según la reivindicación 1 o 2, o la forma cristalina según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, para su uso en el tratamiento de una enfermedad respiratoria en un mamífero.
    29. El compuesto o forma cristalina para el uso según la reivindicación 28, en donde la enfermedad respiratoria es asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, neumonitis, fibrosis pulmonar idiopática, lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, bronquitis, enfisema, rechazo de trasplante de pulmón, disfunción primaria del injerto, neumonía organizada, rechazo de trasplante de pulmón agudo, bronquiolitis linfocítica, disfunción crónica del aloinjerto pulmonar, disfunción crónica del aloinjerto pulmonar restrictiva, disfunción neutrofílica del aloinjerto o bronquiolitis obliterante.
    30. El compuesto o forma cristalina para el uso según la reivindicación 29, en donde la enfermedad respiratoria es asma, disfunción crónica del aloinjerto pulmonar o enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
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