UA124478C2 - Конденсована імідазо-піперидинова сполука, яка є інгібітором jak - Google Patents

Abstract

Винахід надає сполуку формули 1 або її фармацевтично прийнятну сіль, корисну як інгібітор JAK. Винахід також надає кристалічні форми сполуки, фармацевтичні композиції, що містять таку сполуку, способи застосування сполуки для лікування захворювань, що піддаються лікуванню інгібітором JAK, і способи, і проміжні сполуки корисні для отримання такої сполуки.

Description

Передумови створення винаходу

Галузь техніки, до якої належить винахід

Винахід спрямований на сполуку, яка є інгібітором ЗАК кінази, яка корисна для лікування різних захворювань, зокрема очних, шкірних і респіраторних захворювань. Винахід також спрямований на кристалічні форми сполуки, фармацевтичні композиції, що містять таку сполуку, способи застосування такої сполуки для лікування захворювань, що піддаються лікуванню інгібітором АК, і способи і проміжні сполуки, корисні для отримання такої сполуки.

Попередній рівень техніки

Цитокіни є міжклітинними сигнальними молекулами, які включають хемокіни, інтерферони, інтерлейкіни, лімфокіни і фактор некрозу пухлини. Цитокіни мають вирішальне значення для нормального росту клітин і імунорегуляції, але також стимулюють імуноопосередковані захворювання і сприяють росту злоякісних клітин. Підвищені рівні багатьох цитокінів залучені до патології великої кількості різних захворювань або станів, особливо тих захворювань, які характеризуються запаленням. Багато з цитокінів, пов'язаних із захворюванням, діють через сигнальні шляхи, що залежать від дапи5 сімейства тирозинкіназ (ЗАК), які передають сигнали через сімейство транскрипційних факторів переносників сигналу і активаторів транскрипції (ЗТАТ).

Сімейство ЧАК включає чотири члени: ЗАК1, ОАК2, ЗАКЗ і тирозинкіназа 2 (ТУК2).

Зв'язування цитокіну з "АК-залежним цитокіновим рецептором індукує димеризацію рецептора, що приводить до фосфорилування тирозинових залишків на УАК-кіназі, викликаючи активацію

ЧУАК. Фосфорилування ЧАК, в свою чергу, зв'язують і фосфорилують різні ЗТАТ білки, які димеризуються, інтерналізуються в ядрі клітини і безпосередньо модулюють транскрипцію генів, приводячи, серед інших ефектів, до низхідних ефектів, пов'язаних із запальним захворюванням. УАК звичайно асоційовані в парі з цитокіновими рецепторами у вигляді гомодимерів або гетеродимерів. Конкретні цитокіни асоційовані з конкретними «АКк- спарюваннями. Кожний з чотирьох членів сімейства ЧАК бере участь в передачі сигналів щонайменше одного з цитокінів, пов'язаних із запаленням.

Запалення відіграє значущу роль в багатьох очних захворюваннях, включаючи увеїт, діабетичну ретинопатію, діабетичний макулярний набряк, синдром сухого ока, вікову

Зо дегенерацію жовтої плями, оклюзію вени сітківки і атопічний кератокон'юнктивіт. Увеїт охоплює множину внутрішньоочних запальних станів і часто є аутоїмунним, виникаючим без відомого інфекційного збудника. За оцінками, на цей стан страждають близько 2 мільйонів пацієнтів в

США. У деяких пацієнтів хронічне запалення, асоційоване з увеїтом, приводить до руйнування тканини, і він є п'ятою основною причиною сліпоти в США. Цитокіни, рівень яких підвищений в очах пацієнтів з увеїтом, які передають сигнали через "АК-5ТАТ шлях, включають І1ЇІ--2, ІІ -4, || - 5, 1-6, 1-10, 1-23 і ІЕМ-у. (Ногаї апа Сабхрі, У Іпіепегоп СуїоКіпе Кев, 2011, 31, 733-744; Ооі єї а,

Сіїпіса! Медісіпе апа ВРезеагси, 2006, 4, 294-309). Існуючі терапії увеїту часто недостатньо ефективні, і у багатьох пацієнтів захворювання погано контролюється. Стероїди, хоч часто ефективні, пов'язані з катарактами і підвищеним внутрішньоочним тиском/глаукомою.

Причиною діабетичної ретинопатії (ОК) є пошкодження кровоносних судин в сітківці. Це найбільш поширена причина втрати зору серед людей з діабетом. Ангіогенні, а також запальні шляхи відіграють важливу роль в захворюванні. Часто ОК прогресує до діабетичного макулярного набряку (ОМЕ), найбільш частої причини втрати зору у пацієнтів з діабетом. За оцінками, тільки в США на це захворювання страждають близько 1,5 мільйона пацієнтів, з яких приблизно у 20 95 захворюванням уражені обидва ока. Вважають, що цитокіни, які передають сигнали по шляху ЧАК-5ТАТ, такі як І/-6б, а також інші цитокіни, такі як ІР-10 ї МОСР-1 (альтернативно називаються ССІ 2), продукція яких частково керується передачею сигналів по шляху УАК-5ТАТ, відіграють роль в запаленні, асоційованому з ОК/ОМЕ (Абсоимег, . Сіїп СеїЇ

Іттипої, 2013, Биррі 1, 1-12; 5оНп евї аЇ., Атегісап доштаї ої ОрінаІтоїоду, 2011, 152, 686-694; Омеп апа Наппеїї, Си Оіаб Вер, 2013, 13, 476-480; Специпо єї а)ї, МоіІєсшціаг Мізіоп, 2012, 18, 830- 837; опо єї аї, МоїІесшціаг Мівіоп, 2013, 19, 1734-1746; Рипаїви єї а!., ОрпіНаІтоіоду, 2009, 116, 73-79). Існуючі методи лікування ЮОМЕ недостатньо ефективні: інтравітреальне анти-МЕСЕ лікування ефективні тільки у частини пацієнтів, а стероїди пов'язані з катарактою і підвищеним внутрішньоочним тиском.

Синдром сухого ока (ЕВ) являє собою багатофакторне захворювання, на яке страждають близько 5 мільйонів пацієнтів в США. Вважається, що запалення поверхні ока відіграє важливу роль в розвитку і поширенні цього захворювання. Підвищені рівні цитокінів, таких як ІІ -1, 1-2, І. 4, 11 -5, 1-6 ї ІЄМ-у, були відмічені в очних рідинах пацієнтів з ОЕО. (б(емепзоп еї аї., Агсп

ОрпНаїтої, 2012, 130, 90-100), а рівні часто корелюють з тяжкістю захворювання. Вважається, бо що вікова дегенерація жовтої плями і атопічний кератокон'юнктивіт пов'язані з "АК-залежними цитокінами.

Оклюзія вен сітківки (ЕМО) є широко поширеним очним інвалідизуючим захворюванням.

Обструкція кровотоку сітківки може привести до пошкодження судинної мережі сітківки, крововиливу і ішемії тканин. Хоча причини КМО є багатофакторними, було показано, що важливе значення мають як судинні, так ії запальні медіатори (ЮОеорпакіа еї аї., Іптегпайіопаї!

Уоигпаї! ої ІпЯаттайцйоп, 2013, апісіє ІЮ 438412). Підвищені рівні цитокінів, які передають сигнали через шлях ЗАК-5ТАТ, таких як 1-6 і ІЇ/-13, а також інших цитокінів, таких як МСР-1, продукція яких частково керується передачею сигналів "АК-ЗТАТ, були виявлені в тканинах очей пацієнтів з РВО (Зпспико еї аї., Іпаіап уоштаї ої Орпіпа!тоїоду, 2015, 63(12), 905-911). Хоча багатьох пацієнтів з РВО лікують фотокоагуляцією, це по своїй суті деструктивна терапія. Анти-МЕСЕ засоби також використовують, але вони ефективні тільки у частини пацієнтів. Стероїдні препарати, які знижують рівень запалення в оці (триамцинолон ацетонід і дексаметазонові імплантати), також, як було показано, дають корисні результати для пацієнтів з деякими формами РВО, але також було показано, що вони викликають катаракти і підвищений внутрішньоочний тиск/глаукому.

Атопічний дерматит (АВ) є поширеним хронічним запальним захворюванням шкіри, на яке страждають приблизно 14 мільйонів людей тільки в Сполучених Штатах. За оцінками, в розвинених країнах АЮ вражає 10-20 95 дітей і 1-3 95 дорослих (Вао еї аї., "АК-5ТАТ, 2013, 2, е24137), і поширеність захворювання збільшується. Підвищення рівня прозапальних цитокінів, які залежать від шляху ЗАК-5ТАТ, зокрема 1І--4, ІІ -5, 1-10, 11-13 ії ІЕМ-у, зв'язують з АЮ (Вао еї а!., Їейпа єї а)., Те дошгтпаї ої Сіїпіса! Іпиевіїдайоп, 2004, 113, 651-657). Крім того, було показано, що активація 1-31, іншого цитокіну, який передає сигнали через спарювання АК, відіграє роль в свербежі, асоційованому з хронічним АО станом. (ЗйпКоїу еї аї., Уоигпаї! ої АПегду апа Сіїпісаї

Іттипоіоду, 2006, 117, 411-417).

Астма являє собою хронічне захворювання дихальних шляхів, для якого не існує ніякої профілактики або лікування. Захворювання характеризується запаленням, фіброзом, гіперчутливістю і ремоделюванням дихальних шляхів, все це сприяє обмеженню повітряного потоку. За оцінками, в світі від астми страждають 300 мільйонів чоловік, і, згідно з оцінками, до 2025 року число людей, які страждають на астму, виросте більше ніж на 100 мільйонів. Хоча

Зо більшість пацієнтів можуть контролювати симптоми астми з використанням інгаляційних кортикостероїдів, які можна комбінувати з модифікатором лейкотриєнів і/або бета-агоністом тривалої дії, залишається підгрупа пацієнтів з тяжкою формою астми, у яких захворювання не контролюється традиційними терапіями. Цитокіни, залучені до запалення при астмі, які передають сигнали через "АК-ЗТАТ шлях, включають ІІ -2, ІІ -3, 11 -4, І -5, 11 -6, 11 -9, 1-11, 11-13,

І -23, 1-31, 11-27, тимічний стромальний лімфопоетин (Т5І Р), інтерферон-у (ІЕМ-у) і гранулоцитарний-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (ОЗМ-С5Е). Запалення дихальних шляхів характерне для інших респіраторних захворювань, крім астми. Хронічна обструктивна хвороба легень (СОРО), кістозний фіброз (СЕ), пневмоніт, інтерстиціальні легеневі захворювання (включаючи ідіопатичний легеневий фіброз), гостре ушкодження легень, гострий респіраторний дистрес-синдром, бронхіт, емфізема, облітеруючий бронхіоліт і саркоїдоз також є захворюваннями дихальних шляхів, патофізіологія яких, як вважають, пов'язана з ЧАК-сигнальними цитокінами.

Враховуючи кількість цитокінів, рівні яких підвищені при запальних захворюваннях, і те, що кожний цитокін асоційований з конкретним ЗАК-спарюванням, хімічний інгібітор з широкою активністю проти всіх членів сімейства ЧАК міг би мати широке застосування для лікування очних, шкірних і респіраторних захворювань. Залишається потреба в сильному інгібіторі різних

УАК.

Суть винаходу

У одному аспекті винахід надає сполука, яка є інгібітором ЧУАК, корисну для лікування запального захворювання.

Зокрема, в одному аспекті винахід надає 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1 Н- індазол-З-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он формули

Е

НО. а

Ус 3

ІЧ. М Си 2 го й "М с не-М Н далі вказана як сполука 1, або її фармацевтично прийнятну сіль.

Винахід також надає кристалічні форми сполуки, Форму 1 і Форму 2.

Винахід також надає фармацевтичну композицію, яка містить сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль і фармацевтично прийнятний носій.

У одному аспекті винахід надає спосіб лікування очного захворювання у ссавця, який включає введення ссавцеві сполуки 1 або фармацевтичної композиції за винаходом. У одному аспекті очне захворювання являє собою увеїт, діабетичну ретинопатію, діабетичний макулярний набряк, синдром сухого ока, вікову дегенерацію жовтої плями, оклюзію вени сітківки і атопічний кератокон'юнктивіт. Зокрема, очне захворювання являє собою діабетичний макулярний набряк або увеїт.

Ще в одному аспекті, що стосується способу, винахід надає спосіб лікування запального захворювання шкіри, зокрема атопічного дерматиту, який включає нанесення сполуки 1 або фармацевтичної композиції за винаходом на шкіру ссавця.

У іншому аспекті винахід надає спосіб лікування респіраторного захворювання у ссавця, який включає введення ссавцеві сполуки 1 або її фармацевтично прийнятній солі або фармацевтичної композиції за винаходом.

У окремих і різних аспектах винахід також надає способи синтезу і проміжні сполуки, описані в даній заявці, які корисні для отримання сполуки 1.

Винахід також надає сполуку 1, описану в даній заявці, для застосування в медичному лікуванні, а також застосування сполуки за винаходом для отримання композиції або лікарського засобу для лікування очного захворювання, шкірного захворювання або респіраторного захворювання у ссавця.

Короткий опис креслень

Різні аспекти даного винаходу проілюстровані з посиланням на прикладені креслення.

Фіг. 1 представляє порошкову рентгенівську дифрактограму (РХКО) кристалічної Форми 2 сполуки 1 (далі Форма 2).

Фіг. 2 представляє термограму диференціальної скануючої калориметрії (05С) кристалічної

Форми 2.

Зо Фі. З представляє термограму термічного гравіметричного аналізу (ТОА) кристалічної

Форми 2.

Фіг. 4 представляє ізотерму динамічної сорбції вологи (ОМ5) кристалічної Форми 2, яку спостерігали при температурі близько 25 "С.

Фіг. 5 представляє отримане за допомогою мікроскопії в поляризованому світлі зображення

Форми 2.

Фіг. 6 представляє порошкову рентгенівську дифрактограму (РХКО) кристалічної Форми 1 сполуки 1 (далі Форма 1).

Фіг. 7 представляє термограму диференціальної скануючої калориметрії (0550) кристалічної

Форми 1.

Фі. 8 представляє термограму термічного гравіметричного аналізу (ТОА) кристалічної

Форми 1.

Фіг. 9 представляє ізотерму динамічної сорбції вологи (0М5) кристалічної Форми 1, яку спостерігали при температурі близько 25 "С.

Фіг. 10 представляє отримане за допомогою мікроскопії в поляризованому світлі зображення

Форми 1.

Детальний опис винаходу

Хімічні структури названі в даній заявці відповідно до номенклатури ІШРАС, що використовується в програмі СпетОгам (РегкіпЕІтег, Іпс., Сатрьгіддє, МА).

Крім того, імідазольна частина тетрагідроімідазопіридинової групи в структурі сполуки за винаходом існує в таутомерних формах. Сполука може бути також представлена в еквівалентній формі

Е но ще

М тм М ві у; нМ-м М

Відповідно до номенклатури ІОРАС, представлені структури приводять до різної нумерації атомів тетрагідроімідазопіридинової частини. Відповідно ця структура вказана як 1-(2-(6-(2-етил-

Б-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-з3-іл)-3,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5- ілу-2-морфоліноетан-і-он. Вона також може бути вказана як 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4- гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-з-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2- морфоліноетан-1-он. Повинно бути зрозуміло, що, хоча структури показані, або названі, в конкретній формі, винахід також включає їх таутомер.

Сполуки за винаходом також містять декілька основних груп, і тому такі сполуки можуть існувати у вигляді вільної основи або в різних сольових формах, таких як моно-протонована сольова форма, ди-протонована сольова форма або їх суміші. Всі такі форми включені в об'єм даного винаходу, якщо не вказане інше.

Даний винахід також включає ізотопно-мічені сполуки формули 1, тобто сполуку формули 1, де один або декілька атомів були заміщені або збагачені атомом, що має той же атомний номер, але атомну масу, відмінну від атомної маси, яка переважає в природі. Приклади ізотопів, які можуть бути включені в сполуку формули 1, включають, але не обмежуються цим, 2Н, ЗН, 10,19, 140, 19М, 19М, 750, 170, 7180 і ЗЕ, Особливий інтерес представляють сполуки формули 1, збагачені тритієм або вуглецем-14, які можна використовувати, наприклад, в дослідженнях розподілу в тканинах. Також особливий інтерес представляють сполуки формули 1, збагачені дейтерієм, особливо на ділянці метаболізму, які, як очікується, будуть мати більшу метаболічну стабільність. Крім того, особливий інтерес представляють сполуки формули 1, збагачені позитроном-випромінювальним ізотопом, таким як "С, 18, 150 і "ЗМ, такі сполуки можна використовувати, наприклад, в дослідженнях методом позитронно-емісійної томографії (РЕТ).

Визначення

При описі даного винаходу, включаючи його різні аспекти і варіанти здійснення, наступні терміни мають наступні значення.

Термін "терапевтично ефективна кількість" означає кількість, достатню для здійснення лікування при введенні пацієнту, який потребує лікування.

Термін "що лікує" або "лікування" означає профілактику, поліпшення або придушення медичного стану, захворювання або розладів, що підлягає лікуванню (наприклад,

Зо респіраторного захворювання) у пацієнта (зокрема, людини); або полегшення симптомів медичного стану, захворювання або розладів.

Термін "фармацевтично прийнятна сіль" означає сіль, яка є прийнятною для введення пацієнту або ссавцеві, такому як людина (наприклад, солі, що мають прийнятну безпеку для ссавця для використовуваного режиму дозування). Типові фармацевтично прийнятні солі включають солі оцтової, аскорбінової, бензолсульфонової, бензойної, камфорсульфонової, лимонної, етансульфонової, 1,2-етандисульфонової, фумарової, гентизинової, глюконової, глюкуронової, глутамінової, гіпурової, бромистоводневої, хлористоводневої, ізетіонової, молочної, лактобіонової, малеїнової, яблучної, мигдалевої, метансульфонової, муцинової, нафталінсульфонової, нафталін-1,5-дисульфонової, нафталін-2,6-дисульфонової, нікотинової, азотної, оротової, памової, пантотенової, фосфорної, янтарної, сірчаної, винної, п- толуолсульфонової і ксинафової кислот і т. п.

Термін "її сіль" означає сполуку, отриману в результаті заміни водню кислоти на катіон, такий як катіон металу або органічний катіон і т. п. Наприклад, катіон може являти собою протоновану форму сполуки формули 1, тобто форму, в якій одна або декілька аміногруп протоновані кислотою. Як правило, сіль являє собою фармацевтично прийнятну сіль, хоча це не потрібно для солей проміжних сполук, які не призначаються для введення пацієнту.

Термін "аміно-захисна група" означає захисну групу, прийнятну для запобігання небажаним реакціям по азоту аміногрупи. Типові аміно-захисні групи включають, але не обмежуються цим, форміл; ацильні групи, наприклад алканоїльні групи, такі як ацетил і трифторацетил; алкоксикарбонільні групи, такі як трет-бутоксикарбоніл (Вос); арилметоксикарбонільні групи, такі як бензилоксикарбоніл (Сб2) і 9-флуоренілметоксикарбоніл (ЕГтос); арилметильні групи, такі як бензил (Вп), тритил (Тіт) і 1,1-ди-(4"-метоксифеніл)метил; силільні групи, такі як триметилсиліл (ТМ5), трет-бутилдиметилсиліл (ТВОМ5), (2-(триметилсиліл)етокси|метил (ЗЕМ); і т. п.

Термін "гідрокси-захисна група" означає захисну групу, прийнятну для запобігання небажаним реакціям по гідроксигрупі. Типові гідрокси-захисні групи включають, але не обмежуються цим, алкільні групи, такі як метил, етил і трет-бутил; ацильні групи, наприклад, алканоїльні групи, такі як ацетил; арилметильні групи, такі як бензил (Вп), п-метоксибензил (РМВ), 9-флуоренілметил (Ет) і дифенілметил (бензгідрил, ЮОРМ); силільні групи, такі як триметилсиліл (ТМ) і трет-бутилдиметилсиліл (ТВ5); і т.п. 60 Різні захисні групи, а також їх введення і видалення описані в Т.М. сгеепе апа Р.с.М. М/иїв,

Ргоїєсііпа Стоирз іп Огдапіс Зупіпевзів, Тпіка Едйіоп, УМіеу, Мем Могк.

Загальні процедури синтезу

Сполуку 1 і її проміжні сполуки можна отримати відповідно до наступних загальних способів і процедур, використовуючи комерційно доступні або отримані рутинним способом початкові речовини і реагенти. Крім того, сполуки, які мають кислотний або основний атом або функціональну групу, можуть бути використані або можуть бути отримані у вигляді солі, якщо не вказане інше (в деяких випадках використання солі в конкретній реакції потребує перетворення сольової форми в несольову, наприклад, в форму вільної основи, використовуючи звичайні процедури перед здійсненням реакції).

Хоча конкретний варіант здійснення даного винаходу може бути показаний або описаний в наступних процедурах, фахівці в даній галузі зрозуміють, що інші варіанти здійснення або аспекти даного винаходу також можуть бути отримані з використанням таких процедур або з використанням інших способів, реагентів і вихідних речовин, відомих фахівцям в даній галузі.

Зокрема, повинне бути зрозуміло, що сполуку 1 можна отримати різними способами, в яких взаємодіючі речовини об'єднують в різному порядку, щоб забезпечити різні проміжні сполуки на шляху до отримання кінцевих продуктів.

Отримання 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1 Н-індазол-3-іл)-1,4,6,7- тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-ону (сполука 1) описано детально в прикладених прикладах. Ключові стадії в загальному вигляді представлені на Схемі 1

Схема 1

НОМ

Е /- Е не ШВА

Впо я Вт д і За ? х Е ме н --я ши

Є и їй й ш-

Мнм о нМ-к М 3 4

Е Е

Впо А. но - хе Е з. Е тент в «Вп і От по з й т й Хе

М нм-м М нм-м М 5 б

Е оше в о о ще зи щ 7 ! р М М р й -ї 1 де реагент 7 являє собою 2,5-діоксопіролідин-1-іл-2-морфоліноацетат, тобто змінна БА являє собою активуючий агент 2,5-діоксопіролідиніл, описаний в Прикладі 1. Альтернативно, морфолін-4-ілоцтову кислоту, тобто КЕ" являє собою водень, використовують як реагент 7 в типових умовах утворення амідного зв'язку, як описано в Прикладі 4.

Проміжну сполуку З можна отримати, як описано в Отриманнях 1 і З нижче. Альтернативний спосіб отримання ключової захищеної проміжної сполуки 5 проілюстрований на Схемі 2.

Схема 2

Но

НМ 00 МАВ пт і Ві Я

Ве мод Е 2 ВГ. най ! Вп ЩІ Ї моя Ва (Я ну 1 к-т пи ООН; ва в НН, і рн Я. ох пн ня ме ОМ мнм о нм М ї 8 9 10 ї Я

Впо ск ВпОо пн ки, ще т ВЕК бує те й -Т вп т. | Я р М- ЗК ту язок нм-м ЩО

Броміндазол альдегід 8 можна піддати взаємодії з бензил-захищеною іміновою сполукою 2 з отриманням проміжної сполуки 9. Реакцію типово здійснюють в присутності бісульфіту натрію 5 при температурі від близько 130 "С до близько 140 "С протягом часу від близько 1 до близько 6 годин або доти, поки реакція по суті не завершиться. Сполуку 9 відновлюють з використанням відновника, такого як борогідрид натрію, з отриманням сполуки 10, яку об'єднують із захищеним фенілтрифторборатом 11 в типових умовах реакції сполучення Сузукі-Міяура з отриманням проміжної сполуки 5. Реакцію типово здійснюють при підвищеній температурі в присутності паладієвого каталізатора. Партнер, що Використовується в реакції Сузукі 11, показаний на

Схемі 2 як сіль трифторборат калію, можна отримати шляхом взаємодії відповідного боронату (Проміжна сполука 1-5 в Отриманні 1 нижче) з гідродифторидом калію з отриманням проміжної сполуки 11. Альтернативно, боронатну проміжну сполуку можна використовувати замість трифторборату 11.

Відповідно, в аспекті, що стосується способу, винахід надає спосіб отримання сполуки формули 1 або її фармацевтично прийнятної солі, який включає взаємодію сполуки формули 6 зі сполукою формули 7, як проілюстровано на Схемі 1, з отриманням сполуки формули 1 або її фармацевтично прийнятної солі.

У додатковому аспекті, що стосується способу, винахід надає сполуку формули 5 і сполуку формули 6, корисні для отримання сполуки формули 1.

Кристалічні форми

У іншому аспекті винахід надає 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-

З-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (1) в кристалічній формі.

Форма 1

Кристалічна форма 1 за винаходом являє собою кристалічну вільну форму сполуки 1. В одному аспекті Форма 1 характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою (РХКО), що має характерні дифракційні піки, в числі інших піків, при значеннях 28 8,16:20,20, 8,9730,20, 15,29-0,20, 16,70-0,20, 18,00-0,20 і 20,18:30,20. Форма 1 також може

Зо характеризуватися порошковою рентгенівською дифрактограмою, що має два або більше додаткових дифракційних піків, в тому числі три або більше і чотири або більше додаткових дифракційних піків при значеннях 28, вибраних з 7,6920,20, 10,66:20,20, 11,46:20,20, 11,91:50,20, 15,8020,20, 17,0230,20, 18,83520,20, 22,39520,20, 22,98:20,20, 24,8950,20 і 26,5420,20. У іншому аспекті Форма 1 характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою, що має три, чотири, п'ять або шість дифракційних піків при значеннях 28, вибраних з 8,16:0,20, 8,97 50,20, 15,29:20,20, 16,70530,20, 18,00520,20 і 20,18:-0,20.

Як добре відомо в галузі рентгенівської порошкової дифракції, положення піків на порошковій рентгенівській дифрактограмі відносно менш чутливі до умов експерименту, таких як умови отримання зразка і інструментальна геометрія, ніж відносна висота піків. Таким чином, в одному аспекті кристалічна форма 1 характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою, на якій положення піків по суті відповідають тим, які показані на Фіг. 6.

У іншому аспекті кристалічна форма 1 характеризується поведінкою при впливі на неї високої температури. Як продемонстровано на Фіг. 7, термограма диференціальної скануючої калориметрії (05С), отримана при швидкості нагрівання 10 "С на хвилину, демонструє пік в ендотермічному тепловому потоці, ідентифікований як перехід в розплав, в діапазоні від близько 210 "С до близько 234 "С, або в діапазоні від близько 215 "С до близько 229 "С, або в діапазоні від близько 220 С до близько 224 "С. Кристалічна форма 1 характеризується термограмою диференціальної скануючої калориметрії, отриманою при швидкості нагрівання

С на хвилину, яка представляє максимум в ендотермічному тепловому потоці з піком при близько 221,7 "С. Термограма термогравіметричного аналізу (ТОА) на Фіг. 8 не показує ніякої 10 істотної втрати маси при температурах нижче температури початку розкладання при близько 29376.

Репрезентативна крива динамічної сорбції вологи (ОМ5) для Форми 1 кристалічної вільної форми за винаходом показана на Фіг. 9. Кристалічна форма 1 показала невеликий гістерезис між двома циклами сорбції і десорбції. Форма 1 показала збільшення маси близько 0,99 95 в діапазоні вологості від 5 95 до 70 95 відносної вологості і збільшення маси близько 1,32 95 в діапазоні вологості від 5 95 до 90 95 відносної вологості при кімнатній температурі, як показано на Фіг. 9. Форма 1 вважається злегка гігроскопічною.

Кристалічна форма 1, як було показано, є стабільною в умовах впливу підвищеної температури і вологості. Через 36 тижнів в прискорених умовах 40 "С ії 75 95 відносній вологості не спостерігали ніяких статистично значущих змін хімічної чистоти.

Форму 1 можна отримати шляхом розчинення сполуки 1 в етанолі при нагріванні з подальшим додаванням ацетонітрилу, де відношення ацетонітрилу до етанолу складає близько 171 або від близько 1:3 до 3:1. Отриману суміш потім нагрівають з подальшим перемішуванням при температурі від близько 20 "С і близько 25 "С протягом часу від близько 4 годин до близько годин або протягом близько 16 годин. Тверду речовину потім фільтрують і сушать з отриманням Форми 1.

Форму 1 також можна отримати шляхом змішування сполуки 1 з етанолом і перемішування суміші при температурі від близько 50 до близько 80 "С протягом близько 2-30 хвилин або близько 10 хвилин, з подальшим повільним додаванням ацетонітрилу при температурі від

Ко) близько 50 до близько 80 "С, де об'ємне відношення ацетонітрилу до етанолу складає від близько 3:1 до 1:11 або близько 1,5:1. Можна додати затравочні кристали Форми 1 і перемішувати реакційну суміш при температурі від близько 20 "С до близько 25 "С протягом часу від близько 4 годин до близько 30 годин або протягом близько 18 годин. Тверду речовину потім фільтрують і сушать з отриманням Форми 1.

Форма 2

Кристалічна форма 2 за винаходом являє собою кристалічну вільну форму сполуки 1. В одному аспекті Форма 2 характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою (РХКО), що має характерні дифракційні піки, в числі інших піків, при значеннях 280 10,61:20,20, 11,84:0,20, 14,9420,20, 18,26520,20 і 19,06:0,20. Форма 2 також може характеризуватися порошковою рентгенівською дифрактограмою, що має додаткові дифракційні піки при значеннях 29 13,32:0,20, 17,69:0,20 і 21,1020,20. Форма 2 також може характеризуватися порошковою рентгенівською дифрактограмою, що має два або більше додаткових дифракційних піків, в тому числі три або більше і чотири або більше додаткових дифракційних піків при значеннях 28, вибраних з 10,85:-0,20, 16,14-0,20, 16,35:20,20, 18,43:20,20, 19,2030,20, 19,49-40,20, 20,7250,20, 21,9450,20, 22,64:30,20, 23,640,20, 25,1940,20 і 28,08:-0,20.

У іншому аспекті Форма 2 характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою, що має три, чотири, п'ять або шість дифракційних піків при значеннях 26, вибраних з 10,61:0,20, 11,8450,20, 13,32:50,20, 14,940,20, 17,69:20,20, 18,26:0,20, 19,06:0,20 і 21,10-0,20.

Як добре відомо в галузі рентгенівської порошкової дифракції, положення піків на порошковій рентгенівської дифрактограмі відносно менш чутливі до умов експерименту, таких як умови отримання зразка і інструментальна геометрія, ніж відносна висота піків. Таким чином, в одному аспекті кристалічна форма 2 характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою, на якій положення піків по суті відповідають тим, які показані на Фіг. 1.

Структура кристалічної Форми 2 також охарактеризована методом рентгенівської дифракції монокристалів. Кристали стосуються орторомбічної кристалічної системи і Роса просторовій групі. Розміри елементарної комірки наступні: а-9,7245(11) А, Б-16,8197(14) А, с-32,604(4) А, а - 902, 8 - 902, у - 902, об'єм-5332,8(10) Аз. Розрахована щільність 1,302 г/см3. Кристали містять вісім молекул на елементарну комірку. Структура підтверджує, що кристали не містять молекули води або іншого розчинника і молекулярна структура відповідає структурі сполуки 60 Прикладу 1, показаній в даній заявці. Рентгенодифракційні піки, передбачені з виведених атомних положень повністю відповідають результатам, що спостерігаються.

У іншому аспекті кристалічна форма 2 характеризується поведінкою при впливі на неї високої температури. Як продемонстровано на Фіг. 2, термограма диференціальної скануючої калориметрії (05С), отримана при швидкості нагрівання 10 "С на хвилину, демонструє пік в ендотермічному тепловому потоці, ідентифікований як перехід в розплав, в діапазоні від близько 268 "С до близько 277 "С, або в діапазоні від близько 270 "С до близько 275 "С, або в діапазоні від близько 271 С до близько 274 "С. Кристалічна форма 2 характеризується термограмою диференціальної скануючої калориметрії, отриманою при швидкості нагрівання

С на хвилину, яка представляє максимум в ендотермічному тепловому потоці з піком при 10 близько 272,6:2 76.

Термограма термогравіметричного аналізу (ТОА) на Фіг. З не показує ніякої істотної втрати маси при температурах нижче температури початку розкладання при близько 269 "с.

Репрезентативна ізотерми динамічної сорбції вологи (0ОМ5) для Форми 2 кристалічної вільної форми за винаходом показана на Фіг. 4. Кристалічна форма 2 не показала ніякого гістерезису між двома циклами сорбції і десорбції і показала виключно низьку тенденцію до гігроскопічності. Форма 2 показала збільшення маси близько 0,18 95 в діапазоні вологості від 5 95 до 90 95 відносної вологості і збільшення маси близько 0,12 95 в діапазоні вологості від 5 95 до 7095 відносної вологості при кімнатній температурі, як показано на Фіг. 4. Форма 2 вважається негігроскопічною.

Форму 2 можна отримати шляхом розчинення сполуки 1 прикладу 1 в ОМ5О (наприклад, при співвідношенні 1 г сполуки 1 на 1-3 мл або близько 2 мл ОМ5О) при температурі близько 45-75 С або при близько 60 "С, з подальшим додаванням метанолу, де об'ємне відношення метанолу до ОМ5О складає від близько 1:4 до близько 1:1 або близько 1:2. Гомогенну суміш потім додають по краплях до попередньо змішаного розчину метанолу і води (де відношення метанолу до ОМ5О знаходиться в межах від 1,5 до З до 1), при температурі між близько 60 і близько 90 "С, або близько 75 "С, де в попередньо змішаному розчині об'ємне відношення метанолу до води складає від близько 0,5:1 до близько 1:22 або близько 1:0,9. Суміш потім залишають для перемішування при температурі між близько 60 і близько 90 "С, або близько 75С, протягом від близько 30 хвилин до близько 2 годин або близько 1 години. Потім можна

Ко) повільно додати воду при температурі між близько 60 і близько 90 "С, або близько 75 "С, де об'ємне відношення води до метанолу знаходиться в межах від 2 і 4. Отриману суспензію потім повільно охолоджують до кімнатної температури (типово до температури від близько 20 до близько 25 "С), типово від близько 2 до близько 12 годин або близько 6 годин. Суспензію потім витримують при кімнатній температурі і потім фільтрують і промивають сумішшю води і метанолу при вмісті води від близько 50 до близько 90 95, або близько 70 95, з отриманням

Форми 2.

У одному аспекті винахід надає спосіб отримання кристалічної форми 2, який включає: (а) утворення гомогенної суміші 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-

З-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-ону в полярному апротонному розчиннику, або в полярному змішуваному з водою розчиннику, або в суміші полярного апротонного розчинника і полярного змішуваного з водою розчинника при температурі між 45 і 75 70; (Б) додавання гомогенної суміші до суміші змішуваного з водою розчинника і води при температурі між 60 і 90 "С з отриманням другої суміші; (с) повільне додавання води до другої суміші при температурі між 60 ї 90 "С з отриманням суспензії; і (а) виділення кристалічної форми з суспензії.

У деяких аспектах полярний апротонний розчинник стадії (а) вибраний з групи, яка складається з ОМ5О, ОМЕ, ММР, ОМАс і нітрометану, полярний змішуваний з водою розчинник стадії (а) вибраний з групи, яка складається з ацетонітрилу, ацетону, метанолу, етанолу і ТНЕ, і змішуваний з водою розчинник стадії (б) вибраний з групи, яка складається з ацетонітрилу, ацетону, метанолу, етанолу, н-пропанолу, ізопропанолу, н-бутанолу, ТНЕ, ОМ5О, ОМЕ, ММР,

РМАс і нітрометану. У деяких аспектах полярний апротонний розчинник стадії (а) являє собою

РМ5О, полярний змішуваний з водою розчинник стадії (а) являє собою метанол, а змішуваний з водою розчинник стадії (Б) являє собою метанол.

У деяких аспектах суспензію, отриману на стадії (с), охолоджують до температури між близько 20 і 25 "С перед стадією (а).

Альтернативно, Форму 2 можна отримати шляхом перемішування сполуки 1, отриманої в прикладі 1, в суміші полярного змішуваного з водою розчинника і води, при температурі між 60 і 60 90 "С. У деяких аспектах відношення розчинника до води складає близько 1:1 або від 2:1 до

0,5:1. У деяких аспектах полярний змішуваний з водою розчинник вибраний з групи, яка складається з ацетонітрилу, ацетону, метанолу, етанолу, н-пропанолу, ізопропанолу, н- бутанолу, ТНЕ, ОМ5О, ОМЕ, ММР, ОМАс і нітрометану.

Фармацевтичні композиції

Сполука 1 і її фармацевтично прийнятні солі типово використовують в формі фармацевтичної композиції або препарату. Такі фармацевтичні композиції можуть бути корисні для введення пацієнту будь-яким прийнятним шляхом введення, включаючи, але не обмежуючись цим, пероральний, інгаляційний, очні ін'єкції, місцевий (включаючи черезшкірний), ректальний, назальний і парентеральний шляхи введення.

Відповідно, в одному з його аспектів, які стосуються композицій, винахід спрямований на фармацевтичну композицію, що містить фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт і сполуку 1, де, як визначено вище, "сполука 1" означає сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль. Необов'язково, такі фармацевтичні композиції можуть містити інші терапевтичні засоби і/або речовини, що використовуються для формулювання препаратів, у разі необхідності. При обговоренні композицій і їх застосувань сполука 1 також може бути вказана як "активна речовина".

У деяких аспектах винахід надає фармацевтичну композицію, що містить сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль, або Форму 1 або Форму 2 і фармацевтично прийнятний носій. У деяких аспектах фармацевтична композиція є прийнятною для очного застосування. У деяких аспектах композиція є прийнятною для ін'єкції в око. У деяких аспектах композиція є прийнятною для інтравітреальної ін'єкції. У деяких аспектах композиція являє собою суспензію.

У деяких аспектах композиція являє собою кристалічну суспензію. У деяких аспектах композиція являє собою суспензію Форми 1 або Форми 2.

Фармацевтичні композиції за даним винаходом звичайно містять терапевтично ефективну кількість сполуки 1. Спеціалістам в даній галузі повинно бути зрозуміло, однак, що фармацевтична композиція може містити більше, ніж терапевтично ефективну кількість, тобто нерозфасовані композиції, або менше, ніж терапевтично ефективну кількість, тобто окремі одиничні дози, призначені для багаторазового введення для досягнення терапевтично ефективної кількості.

Зо Як правило, такі фармацевтичні композиції будуть містити від близько 0,01 до близько 95 95 по масі активної речовини; включаючи, наприклад, від близько 0,05 до близько 30 95 по масі; і від близько 0,1 95 до близько 10 95 по масі активної речовини.

У фармацевтичних композиціях за даним винаходом можна використовувати будь-який звичайний носій або ексципієнт. Вибір конкретного носія або ексципієнта, або комбінацій носіїв або ексципієнтів, буде залежати від способу введення, що використовується для лікування конкретного пацієнта, або від типу медичного стану або хворобливого стану. У цьому відношенні, отримання прийнятної фармацевтичної композиції для конкретного способу введення знаходиться в межах компетенції фахівців в галузі фармацевтики. Крім того, носії або ексципієнти, що використовуються в фармацевтичних композиціях за даним винаходом, є комерційно доступними. Як додаткова ілюстрація, традиційні методи формулювання описані в

Ветіпдіоп: Те Зсієпсе апа Ргасіїсе ої РНаптасу, 201й Едйоп, Іірріпсоїй УУШіатве 5 М/Нйе,

Вайцітоге, Магуїапа (2000); ї Н.С. Апзеї еї аІ., Рпаппасешіса! бозаде ЕБопт5 апа Огид Оеїїмегу

Зувівтв, 7 Еаййоп, Гірріпсоїї М/ Пат» 5 Мне, Вайітоге, Магуїапа (1999).

Репрезентативні приклади речовин, які можуть служити як фармацевтично прийнятні носії, включають, але не обмежуються цим, наступні: цукри, такі як лактоза, глюкоза і сахароза; крохмаль, такий як кукурудзяний крохмаль і картопляний крохмаль; целюлоза, така як мікрокристалічна целюлоза, і її похідні, такі як натрій карбоксиметилцелюлоза, етилцелюлоза і ацетат целюлози; порошкоподібний трагакант; солод; желатин; тальк; ексципієнти, такі як масло какао і віск для супозиторіїв; олії, такі як арахісова олія, бавовняна олія, сафлорова олія, кунжутна олія, оливкова олія, кукурудзяна олія і соєва олія; гліколі, такі як пропіленгліколь; поліоли, такі як гліцерин, сорбіт, маніт і поліетиленгліколь; складні ефіри, такі як етилолеат і етиллаурат; агар; буферні агенти, такі як гідроксид магнію і гідроксид алюмінію; альгінова кислота; апірогенна вода; ізотонічний сольовий розчин; розчин Рінгера; етиловий спирт; фосфатно-буферні розчини; і інші нетоксичні сумісні речовини, що використовуються в фармацевтичних композиціях.

Фармацевтичні композиції звичайно отримують шляхом ретельного і тісного змішування або вимішування активної речовини з фармацевтично прийнятним носієм і одним або декількома необов'язковими інгредієнтами. Отриману однорідно змішану суміш потім можна формувати або завантажувати в таблетки, капсули, пілюлі і т. п., використовуючи звичайні процедури і 60 обладнання.

Фармацевтичні композиції за винаходом переважно упаковані у вигляді стандартної лікарської форми. Термін "стандартна лікарська форма" стосується фізично дискретної одиниці, прийнятної для введення пацієнту, тобто кожна одиниця містить попередньо визначену кількість активної речовини, розраховану для забезпечення бажаного терапевтичного ефекту або окремо, або в комбінації з однією або декількома додатковими одиницями. Наприклад, такими стандартними лікарськими формами можуть бути капсули, таблетки, пілюлі і т. п., або індивідуальні упаковки, прийнятні для очного або парентерального введення.

У одному варіанті здійснення фармацевтичні композиції за винаходом є прийнятними для перорального введення. Прийнятні фармацевтичні композиції для перорального введення можуть бути в формі капсул, таблеток, пілюль, пастилок, саше, драже, порошків, гранул; або у вигляді розчину або суспензії у водній або неводній рідині; або у вигляді рідкої емульсії масло-в- воді або вода-в-маслі; або у вигляді еліксиру або сиропу; і т. п.; при цьому кожна з цих форм містить попередньо визначену кількість сполуки 1 як активного інгредієнта.

Якщо вони призначені для перорального введення в твердій лікарській формі (тобто в формі капсул, таблеток, пілюль і т. п.), фармацевтичні композиції за даним винаходом, як правило, будуть включати активну речовину і один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв.

Необов'язково, такі тверді лікарські форми також можуть включати: наповнювачі або добавки для збільшення об'єму, такі як крохмаль, мікрокристалічна целюлоза, лактоза, дикальційфосфат, сахароза, глюкоза, маніт і/або кремнієва кислота; зв'язуючі, такі як карбоксиметилцелюлоза, альгінати, желатин, полівінілпіролідон, сахароза і/або аравійська камедь; зволожувачв, такі як гліцерин; розпушувачі, такі як натрій кроскармелоза, агар-агар, карбонат кальцію, картопляний або тапіоковий крохмаль, альгінова кислота, деякі силікати і/або карбонат натрію; агенти, які сповільнюють розчинення, такі як парафін; прискорювачі абсороції, такі як четвертинні амонієві сполуки; змочувальні агенти, такі як цетиловий спирт і/або гліцерин моностеарат; абсорбенти, такі як каолінова і/або бентонітова глина; мастильні речовини, такі як тальк, стеарат кальцію, стеарат магнію, тверді поліетиленгліколі, лаурилсульфат натрію і/або їх суміші; барвники; і буферні агенти.

Розділювальні агенти, змочувальні агенти, покривні агенти, підсолоджувачі, віддушки і ароматизатори, консерванти і антиоксиданти також можуть бути присутніми в фармацевтичних

Зо композиціях за винаходом. Приклади фармацевтично прийнятних антиоксидантів включають: водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, цистеїн гідрохлорид, бісульфат натрію, метабісульфат натрію, сульфіт натрію і т. п.; маслорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбіллальмітат, бутилований гідроксіанізол, бутилований гідрокситолуол, лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і т. п.; і метал-хелатуючі агенти, такі як лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота, сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т. п. Покривні агенти для таблеток, капсул, пілюль і т. п. включають агенти, що використовуються для ентеросолюбільних покриттів, такі як ацетатфталат целюлози, полівінілацетатфталат, фталат гідроксипропілметилцелюлози, гідроксипропілметилцелюлоза, метакрилова кислота, співполімери складних ефірів метакрилової кислоти, ацетат-триметиллат целюлози, карбоксиметилетилцелюлоза, ацетат-сукцинат гідроксипропілметилцелюлози і т. п.

Фармацевтичні композиції за винаходом також можна сформулювати для забезпечення повільного або контрольованого вивільнення активної речовини з використанням, наприклад, гідроксипропілметилцелюлози в різних пропорціях; або інших полімерних матриць, ліпосом і/або мікросфер. Крім того, фармацевтичні композиції за винаходом можуть необов'язково містити засоби, що додають непрозорість, і можуть бути сформульовані таким чином, щоб вони вивільняли активний інгредієнт тільки або переважно в певній частині шлунково-кишкового тракту, необов'язково уповільненим чином. Приклади композицій для заливання, які можна використовувати, включають полімерні речовини і віск. Активна речовина також може бути в мікрокапсульованій формі, якщо необхідно, з одним або декількома з вищеописаних ексципієнтів.

Прийнятні рідкі лікарські форми для перорального введення включають, як ілюстрацію, фармацевтично прийнятні емульсії, мікроемульсії, розчини, суспензії, сиропи і еліксири. Рідкі лікарські форми звичайно включають активну речовину і інертний розріджувач, такий як, наприклад, вода або інші розчинники, солюбілізуючі агенти і емульгатори, такі як етиловий спирт, ізопропіловий спирт, етилкарбонат, етилацетат, бензиловий спирт, бензилбензоат, пропіленгліколь, 1,3-бутиленгліколь, олії (зокрема, бавовняну, арахісову, кукурудзяну, зародкову, оливкову, рицинову і кунжутну олії), олеїнова кислота, гліцерин, тетрагідрофуриловий спирт, поліетиленгліколі і складні ефіри сорбітану і жирних кислот і їх суміші. Альтернативно, деякі рідкі композиції можуть бути перетворені, наприклад, шляхом 60 розпилювального сушіння, в порошок, який використовують для отримання твердих лікарських форм звичайними способами.

Суспензії, в доповнення до активного інгредієнта, можуть містити суспендувальні агенти, такі як, наприклад, етоксиловані ізостеарилові спирти, складні ефіри поліоксіетиленсорбітолу і сорбітану, мікрокристалічна целюлоза, метагідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант і їх суміші.

Сполуку 1 також можна вводити парентерально (наприклад, шляхом внутрішньовенної, підшкірної, внутрішньом'язової або інтраперитонеальної ін'єкції. Для парентерального введення активну речовину звичайно змішують з прийнятним носієм для парентерального введення, який включає, як приклад, стерильні водні розчини, фізіологічний розчин, низькомолекулярні спирти, такі як пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинні олії, желатин, складні ефіри жирних кислот, такі як етилолеат, і т. п. Парентеральні композиції можуть також містити один або декілька антиоксидантів, солюбілізаторів, стабілізаторів, консервантів, змочувальних агентів, емульгаторів, буферних агентів або диспергувальних агентів. Ці композиції можна зробити стерильними шляхом використання стерильного ін'єкційного середовища, стерилізуючого агента, фільтрації, опромінення або нагрівання.

Сполуку 1 також можна сформулювати у вигляді стерильної водної суспензії або розчину для очної ін'єкції. Корисні ексципієнти, які можуть бути включені в таку водну композицію, включають полісорбат 80, полімери целюлози, такі як карбоксиметилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, метилцелюлоза, хлорид калію, хлорид кальцію, хлорид натрію, хлорид магнію, ацетат натрію, цитрат натрію, гістидин, дигідрат а-трегалози, сахарозу, полісорбат 20, гідроксипропіл-В-циклодекстрин, бензалконійхлорид, амберліт ІВР-69, ефіри поліоксіетиленгліколю (лауриловий, стеариловий і олеїловий), натрієву сіль етилендіамінтетраоцтової кислоти, таурохолат натрію, сапоніни і кремофор ЕГ,, полікарбофіл- цистеїн, ксантанову камедь, геланову камедь, гіалуронову кислоту, ліпосоми і фосфат натрію. У композицію можуть бути включені підсилювачі проникності, поверхнево-активні речовини, жовчні кислоти, циклодекстрини, такі як 2-гідроксипропіл-В-циклодекстрин, і хелатуючі агенти.

Циліндричні олігонуклеотиди з гідрофільною зовнішньою поверхнею і ліпофільною внутрішньою поверхнею, які здатні утворювати комплекси з активною речовиною, також можуть бути включені в композицію. Бензиловий спирт може служити як консервант, а хлорид натрію може

Зо бути включений для регулювання тонічності. Крім того, до розчину можна додати хлористоводневу кислоту і/або гідроксид натрію для регулювання рН. Можуть бути отримані водні композиції для внутрішньоочних ін'єкцій, що не містять консервантів.

Офтальмологічна композиція може забезпечити можливість уповільненого вивільнення активного інгредієнта в око. Офтальмологічна композиція може бути сформульована у вигляді емульсії (масло-в-воді або вода-в-маслі), суспензії або мазей. Композиція суспензії може містити сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль у вигляді кристалічної форми, наприклад, Форми 1 або Форми 2, або в аморфному стані.

Сполуку 1 також можна сформулювати так, щоб вона була прийнятною для введення у вигляді очних крапель або інтравітреального імплантата. Імплантат може забезпечувати доставку постійних терапевтичних рівнів лікарського засобу. Резервуарні імплантати звичайно отримують з використанням гранульованого лікарського ядра, оточеного нереакційноздатними речовинами, такими як кремній, етиленвінілацетат (ЕМА) або полівініловий спирт (РМА); ці імплантати не є біорозкладаними і можуть доставляти кількість лікарського засобу безперервно протягом часу від декількох місяців до року. Матричні імплантати також можна використовувати.

Звичайно їх використовують для доставки навантажувальної дози з подальшим зниженням дози препарату протягом періоду часу від 1 дня до 6 місяців. Частіше за все їх виготовляють зі співполімерів полімолочної кислоти (РІА) і/або полі-молочної-гліколевої кислоти (РІ СА), які розкладаються до води і діоксиду вуглецю. Також можна використовувати іонофорез. Це неінвазивний метод, в якому невеликий електричний струм застосовується для посилення проникнення іонізованого лікарського засобу в тканини.

Технологію інкапсуляції клітин (ЕСТ), яка являє собою систему доставки на основі клітин, також можна використовувати для доставки терапевтичного засобу в око. Звичайно генетично модифіковані клітини упаковують в порожнисту трубку з напівпроникною мембраною, яка запобігає проникненню імунних клітин і дозволяє поживним речовинам і терапевтичним молекулам вільно дифундувати через мембрану. Два кінці полімерної секції герметично закриті, і титанова петля розташована на анкерному кінці, який імплантується в плоску частину війчастого тіла і прикріплюється до склери.

Сполуку 1 можна сформулювати в будь-яку форму, що забезпечує можливість доставки до задньої частини ока. Приклади способів доставки відомі з літератури (Кипо еї аї., Роїутегв5, 60 2011, 3, 193-221, дає! Ато єї аї., Ощша Оівзсомегу Тодау, 2008, 13, 135-143, Зпоп, Тохісоіодіс

Раїйоіоду, 2008, 36 49-62). Такі способи доставки включають, але не обмежуються цим, супрахоріоїдальну доставку, яка забезпечує доставку в судинну оболонку і сітківку через супрахоріоїдальний простір, доставку в суб-теноновий простір, періокулярну доставку, контактні лінзи, обтуратори слізних точок і склеральні пробки. Сполука 1 також може бути доставлена шляхом періокулярної, супрасклеральної, ретробульбарної, перибульбарної або субкон'юнктивальної ін'єкції.

Сполука 1 може бути доставлена у вигляді емульсії, полімерних мікро- або наносфер, ліпосом, мікро- або наночастинок, мікросфер, міцел або дендримерів. Можна використовувати біорозкладані і біосумісні полімери, такі як поліактид і РІСА. Сполука 1 може бути інкапсульована.

Крім того, сполуку 1 можна сформулювати для місцевого нанесення на шкіру у вигляді мазі або крему. Композиції мазі являють собою напівтверді препарати, що мають основу з маслянистої або жирної речовини, яка звичайно є прозорою. Прийнятні маслянисті речовини для використання в композиціях мазей включають вазелін (вазелінове масло), бджолиний віск, масло какао, масло ши і цетиловий спирт. Мазі необов'язково можуть додатково включати пом'якшувальні засоби і підсилювачі проникнення, якщо це бажано.

Композиції кремів можуть бути отримані у вигляді емульсій, що містять масляну фазу і водну фазу, що звичайно включає очищену воду. Компоненти композицій кремів можуть включати: масляні основи, такі як вазелін, мінеральні масла, рослинні олії і тваринні масла і тригліцериди; основи для крему, такі як ланолінові спирти, стеаринова кислота і цетостеариловий спирт; гелеву основу, таку як полівініллвий спирт; розчинники, такі як пропіленгліколь і поліетиленгліколь; емульгатори, такі як полісорбати, стеарати, такі як гліцерилстеарат, октилгідроксистеарат, поліоксилстеарат, ПЕГ стеарилові ефіри, ізопропілпальмітат і сорбітанмоностеарат; стабілізатори, такі як полісахариди і сульфіт натрію; пом'якшувальні засоби (тобто зволожувачі), такі як середньоланцюжкові тригліцериди, ізопропілміристат і диметикон; зміцнювальні агенти, такі як цетиловий спирт і стеариловий спирт; протимікробні засоби, такі як метилпарабен, пропілларабен, феноксіеєтанол, сорбінова кислота, діазолідинілсечовина і бутилований гідроксіанізол; підсилювачі проникнення, такі як М- метилпіролідон, пропіленгліколь, поліетиленгліколь монолаурат і т. п.; і хелатоутворювальні агенти, такі як динатрій едетат.

Альтернативно, фармацевтичні композиції за винаходом формулюють для введення шляхом інгаляції. Прийнятні фармацевтичні композиції для введення шляхом інгаляції звичайно знаходяться в формі аерозолю або порошку. Такі композиції звичайно вводять з використанням добре відомих пристроїв доставки, таких як дозуючий інгалятор, інгалятор сухого порошку, небулайзер або подібний пристрій доставки.

При введенні шляхом інгаляції з використанням контейнера під тиском фармацевтичні композиції за винаходом звичайно включають активний інгредієнт і прийнятний пропелент, такий як дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторетан, діоксид вуглецю або інший прийнятний газ. Крім того, фармацевтична композиція може бути в формі капсули або картриджа (виготовленого, наприклад, з желатину), що містить сполуку 1 і порошок, прийнятний для використання в порошковому інгаляторі. Прийнятні порошкові основи включають, як приклад, лактозу або крохмаль.

Наступні необмежувальні приклади ілюструють репрезентативні фармацевтичні композиції за даним винаходом.

Пероральна тверда лікарська форма у вигляді таблеток

Здійснюють сухе змішування сполуки 1 або її фармацевтично прийнятної солі з мікрокристалічною целюлозою, полівінілпіролідоном і натрій кроскармелозою в співвідношенні 4:5:1:1 і пресують в таблетки з отриманням стандартної дози, наприклад, 5 мг, 20 мг або 40 мг активної речовини на таблетку.

Пероральна тверда лікарська форма у вигляді капсул

Сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль об'єднують з мікрокристалічною целюлозою, полівінілпіролідоном і натрій кроскармелозою в співвідношенні 4:5:1:1 методом мокрого гранулювання і завантажують в желатинові або гідроксипропілметилцелюлозні капсули з отриманням стандартної дози, наприклад, 5 мг, 20 мг або 40 мг активної речовини на капсулу.

Рідка композиція

Рідку композицію, яка містить сполуку 1 (0,1 95), воду (98,9 95) і аскорбінову кислоту (1,0 Об), отримують шляхом додавання сполуки за винаходом до суміші води і аскорбінової кислоти.

Пероральна лікарська форма з ентеросолюбільним покриттям

Сполуку 1 розчиняють у водному розчині, що містить полівінілпіролідон, і наносять бо розпиленням на гранули з мікрокристалічної целюлози або цукру в співвідношенні 1:5 мас./мас.

активна речовина:гранули і потім наносять ентеросолюбільне покриття, яке збільшує масу приблизно на 5 95, що включає акриловий співполімер. Гранули з ентеросолюбільним покриттям завантажують в желатинові або гідроксипропілметилцелюлозні капсули з отриманням стандартної дози, наприклад, 30 мг активної речовини на капсулу.

Пероральна лікарська форма з ентеросолюбільним покриттям

Ентеросолюбільне покриття, яке включає комбінацію Ецагаді-ЇїФ і Ецшагаді-5Ф або ацетат- сукцинат гідроксипропілметилцелюлози, наносять на пероральну дозовану форму у вигляді таблетки або пероральну дозовану форму у вигляді капсули, описану вище.

Водна композиція для очної ін'єкції

Кожний мл стерильної водної суспензії включає від 5 мг до 50 мг сполуки 1, хлорид натрію для тонічності, 0,9995 (мас./0б.) бензилового спирту як консерванту, 0,75 95 натрій карбоксиметилцелюлози і 0,04 95 полісорбату. Можна включити гідроксид натрію або хлористоводневу кислоту для доведення рН до 5-7,5.

Водна композиція для очної ін'єкції

Стерильна водна суспензія, яка не містить консервантів, включає від 5 мг/мл до 50 мг/мл сполуки 1 в 10 мМ фосфату натрію, 40 мМ хлориду натрію, 0,03 95 полісорбату 20 ї 5 95 сахарози.

Композиція мазі для місцевого введення

Сполуку 1 об'єднують з вазеліном, Св-Сіо тригліцеридом, октилгідроксистеаратом і М- метилпіролідоном в такому співвідношенні, щоб отримати композицію, що містить 0,05 95-5 90 мас. активної речовини.

Композиція мазі для місцевого введення

Сполуку 1 об'єднують з медичним вазеліном, пропіленгліколем, моно- і ди-гліцеридами, парафіном, бутилованим гідрокситолуолом і кальцію динатрію едетатом в такому співвідношенні, щоб отримати композицію, що містить 0,05 9о до 5 95 мас. активної речовини.

Композиція мазі для місцевого введення

Сполуку 1 об'єднують з мінеральним маслом, парафіном, пропіленкарбонатом, медичним вазеліном і білим воском з отриманням композиції, що містить 0,05 95-5 95 мас. активної речовини.

Зо Композиція крему для місцевого введення

Мінеральне масло об'єднують зі сполукою 1, пропіленгліколем, ізопропілпальмітатом, полісорбатом 60, цетиловим спиртом, сорбітанмоностеаратом, поліоксил 40 стеаратом, сорбіновою кислотою, метилпарабеном і пропілларабеном з отриманням масляної фази, яку об'єднують з очищеною водою шляхом змішування з високим зусиллям зсуву з отриманням композиції, що містить 0,05 95 до 5 95 мас. активної речовини.

Композиція крему для місцевого введення

Композиція крему, що містить сполуку 1, бензиловий спирт, цетиловий спирт, безводну лимонну кислоту, моно і ди-гліцериди, олеїловий спирт, пропіленгліколь, цетостеарилсульфат натрію, гідроксид натрію, стеариловий спирт, тригліцериди і воду, містить 0,05 95 до 5 95 мас. активної речовини.

Композиція крему для місцевого введення

Композиція крему, що містить сполуку 1, цетилстеариловий спирт, ізопропілміристат, пропіленгліколь, цетомакрогол 1000, диметикон 360, лимонну кислоту, цитрат натрію і очищену воду, з імідсечовиною, метилпарабеном і пропілпарабеном як консервантами, містить 0,05 95 до 5 95 мас. активної речовини.

Композиція сухого порошку

Тонкоподрібнену сполуку 1 (1 г) змішують з подрібненою лактозою (25 г). Отриману суміш потім завантажують в індивідуальні блістери легко відшаровуваної блістерної упаковки в кількості, достатній для отримання від близько 0,1 мг до близько 4 мг сполуки 1 на дозу. Вміст блістерів вводять з використанням інгалятора сухого порошку.

Композиція для дозуючого інгалятора

Тонкоподрібнену сполуку 1 (10 г) диспергують в розчині, отриманому шляхом розчинення лецитину (0,2 г) в демінералізованій воді (200 мл). Отриману суспензію сушать розпиленням і потім тонко подрібнюють з отриманням тонкоподрібненої композиції, що містить частинки, які мають середній діаметр менший ніж близько 1,5 мкм. Тонкоподрібнену композицію потім завантажують в картриджі дозуючого інгалятора, що містять 1,1,1,2-тетрафторетан, який знаходиться під тиском, в кількості, достатній для отримання від близько 0,1 мг до близько 4 мг сполуки 1 на дозу при введенні за допомогою дозуючого інгалятора.

Композиція для небулайзера бо Сполуку 1 (25 мг) розчиняють в розчині, що містить 1,5-2,5 еквіваленти хлористоводневої кислоти, з подальшим додаванням гідроксиду натрію для доведення рН до 3,5-5,5 і З 95 мас. гліцерину. Розчин ретельно перемішують до повного розчинення всіх компонентів. Розчин вводять з використанням небулайзера, який забезпечує близько 0,1 мг до близько 4 мг сполуки 1 на дозу.

Корисність

Сполука 1, як було показано, є сильним інгібітором ферментів сімейства УЗАК: ЗАК1, УЗАК2,

УАКЗ і ТУКО.

Очні захворювання

Було показано, що багато очних захворювань пов'язані з підвищенням рівня прозапальних цитокінів, які залежать від шляху ЧАК-ЗТАТ. Оскільки сполука 1 демонструє сильне інгібування всіх чотирьох ферментів ДАК, очікується, що вона повинна сильно інгібувати передачу сигналів і патогенні ефекти численних цитокінів (таких як 1І--6, ІІ -2 ії ІЕМ-у), які передають сигнали через

ЧУАК, а також перешкоджати підвищенню рівнів інших цитокінів (таких як МСР-1 ії ІР-10), продукція яких залежить від сигнального шляху ЗАК-5ЗТАТ.

Зокрема, сполука 1 показала ріСво значення 6,4 або більше (ІСво значення 400 нМ або менше) для інгібування передачі сигналів ІІ -6б, І -2 ії ІЕМ-у в клітинних аналізах, описаних в

Аналізах 3-6, включаючи аналізи, які реєструють інгібування низхідних ефектів підвищення рівня цитокінів.

Фармакокінетичне дослідження в Аналізі 7 продемонструвало тривалу експозицію в очних тканинах кролика після однієї інтравітреальної ін'єкції і концентрацію в плазмі щонайменше на три порядки нижче, ніж концентрація, що спостерігається в скловидній тканині.

Крім того, інтравітреальне введення сполуки 1 продемонструвало значне інгібування ІІ -6- індукованого роТАТЗ в тканині сітківки/судинної оболонки очей щура, а також значне і стійке інгібування ІРМ-у-індукованого ІР-10 в скловидному тілі кролика, а також в тканинах сітківки/судинної оболонки очей. Внутрішньовітреальне введення сполуки 1 продемонструвало істотне і стійке інгібування ІЄМ-у-індукованого ро5ТАТІ у кролика.

Як очікують, стійке інгібування ЧАК в тканинах очей за відсутності істотних системних рівнів приведе до сильної локальної протизапальної активності в оці без побічних ефектів, які системно викликаються. Таким чином, очікують, що сполука 1 буде корисною для різних очних

Зо захворювань, які включають, але не обмежуються цим, увеїт, діабетичну ретинопатію, діабетичний макулярний набряк, синдром сухого ока, вікову дегенерацію жовтої плями, оклюзію вени сітківки і атопічний кератокон'юнктивіт.

Зокрема, увеїт (Ногаї апа Сабзрі, У Іпіегегоп СуїоКіпе Ке5, 2011, 31, 733-744), діабетична ретинопатія (Арсоимег, У Сіїп СеїІ Іттипої, 2013, Биррі 1, 1-12), діабетичний макулярний набряк (бБойпп еї аї., Атегісап Уойгтта! ої ОріпаІтоїоду, 2011, 152, 686-694), синдром сухого ока (біємепзоп вї аї., Агсп Орпіпаїтої, 2012, 130, 90-100), оклюзія вени сітківки (ЗпспикКОо еї аї, Іпаіап

Уоштаї ої ОрпінаІтоїіоду, 2015, 63(12), 905-911) і вікова дегенерація жовтої плями (КпісКеїреїп еї аі., Іпї Орііна!тої Сіїй, 2015, 55(3), 63-78) характеризуються підвищенням рівнів деяких прозапальних цитокінів, які передають сигнали через "АК-5ТАТ шлях. Відповідно, сполука 1 може полегшувати асоційоване запалення очей і викликати регресію прогресуючого захворювання або забезпечувати полегшення симптомів цих захворювань.

Тому в одному аспекті винахід надає спосіб лікування очного захворювання у ссавця, який включає введення фармацевтичної композиції, що містить /1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4- гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-з-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2- морфоліноетан-1-он або його фармацевтично прийнятну сіль і фармацевтичний носій, в око ссавця. У одному аспекті очне захворювання являє собою увеїт, діабетичну ретинопатію, діабетичний макулярний набряк, синдром сухого ока, вікову дегенерацію жовтої плями, оклюзію вени сітківки або атопічний кератокон'юнктивіт. У одному аспекті спосіб включає введення сполуки 1 шляхом інтравітреальної ін'єкції.

Запальне шкірне захворювання

Наприклад, атопічний дерматит пов'язаний з підвищенням рівня прозапальних цитокінів, які залежать від шляху ЗАК-З5ТАТ, зокрема 1-4, 1/-5, 11-10, 11-13 ї ІЕМ-у. У доповнення до інгібування цитокінів в клітинних аналізах, вказаних вище, сполука 1 показала ІСхо значення 13

НМ для інгібування І-13, як описано в Аналізі 2. Крім того, модельні композиції сполуки 1 в формі крему і мазі продемонстрували стійкі рівні в шкірі протягом щонайменше 2 днів у мишей і щонайменше 7 днів у міні-свинок без експозиції, що виявляється в плазмі.

Очікується, що стійкі рівні в шкірі сполуки 1 за відсутності значних системних рівнів приведуть до сильної місцевої протизапальної і протисвербіжної активності в шкірі без побічних ефектів, викликаних системним впливом. Отже, очікується, що сполука 1 буде корисною при бо різних запальних або свербіжних шкірних станах, які включають, але не обмежуються цим,

осередкову алопецію, вітиліго, шкірну Т-клітинну лімфому, вузликовий свербець, червоний плоский лишай, первинний локальний шкірний амілоїдоз, бульозний пемфігоїд, шкірні вияви хвороби трансплантат-проти-хазяїна, пемфігоїд, дискоїдний вовчак, кільцевидну гранульому, простий хронічний лишай, вагінальний/мошонковий/періанальний свербіж, склерозуючий лишай, свербіж після герметичної невралгії, плоский фолікулярний лишай і декальвуючий фолікуліт. Зокрема, осередкова алопеція (Хіпд еї аїЇ., Маї Мей. 2014, 20, 1043-9), вітиліго (Сгаідіоми єї аі, "АМА Оеєптаїйо!. 2015, 151, 1110-2), вузликовий свербець (Зопкоїу еї аї., У АПегду

Сіїп Іттипої. 2006, 117, 411-7), червоний плоский лишай (У/еї2-Кибріак єї аї!., У Іттипо! Незв. 2015; 2015:854747), первинний локалізований амілоїдоз шкіри (Тапака еї а1., Вг У Оептайоі. 2009,

Оес; 161(6):1217-24), бульозний пемфігоїд (Реїїсіапі еї аї., Іпї У Іттипорайої! РІагтасої. 1999,

Мау-А!цо; 12(2); 55-61) і шкірні вияви реакції трансплантат-проти-хазяїна (ОКіуата еї аї., У Іпмеві

Оептай)!. 2014, Арг; 134(4):992-1000) характеризуються підвищенням рівня деяких цитокінів, які передають сигнали через активацію ЧАК. Відповідно, сполука 1 може полегшувати асоційовані з цими цитокінами шкірні запалення або свербіж. Зокрема, можна очікувати, що сполука 1 буде корисна для лікування атопічного дерматиту і інших запальних захворювань шкіри.

Тому в одному аспекті винахід надає спосіб лікування запального шкірного захворювання у ссавця (наприклад, людини), який включає нанесення фармацевтичної композиції, що містить 1- (2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-З-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазої|4,5- сІпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1ї-он або його фармацевтично прийнятну сіль ( фармацевтичний носій, на шкіру ссавця. У одному аспекті запальне шкірне захворювання являє собою атопічний дерматит.

Сполуку 1 також можна використовувати в комбінації з грампозитивними антибіотиками, такими як мупіроцин і фузидова кислота, для лікування запальних шкірних захворювань. Тому в одному аспекті винахід надає спосіб лікування запального шкірного захворювання у ссавця, який включає нанесення сполуки 1 і грампозитивного антибіотика на шкіру ссавця. У іншому аспекті винахід надає фармацевтичну композицію, що містить 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4- гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-з-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2- морфоліноетан-1-он або його фармацевтично прийнятну сіль, грампозитивний антибіотик і фармацевтично прийнятний носій.

Зо Респіраторні захворювання

Цитокіни, які передають сигнали через Ч"АК-5ТАТ шлях, зокрема 1І--2, ІІ -3, 11 -4, 11 -5, 11 -6, І - 9, 1-11, 11-15, 1-23, 1-31, 1-27, тимічний стромальний лімфопоетин (Т5І Р), інтерферон-у (ЕМ- у) і гранулоцитарний-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (ЗМ-С5Е), також залучені до запалення при астмі і в інші запальні респіраторні захворювання. Як описано вище, було показано, що сполука 1 є сильним інгібітором УАКТ, ЧАК2, УАКЗ ії ТУК2 ферментів і також показало сильне інгібування прозапальних цитокінів в клітинних аналізах.

Протизапальна активність інгібіторів "АК наочно продемонстрована в доклінічних моделях астми (Маїаміуа єї аї., Іпї ІттипорНнаптасої, 2010, 10, 829,-836; Маївипада есеї а!., Віоспет апа

Віорпуз Нез Соттип, 2011, 404, 261-267; Киаїасл еї а!., Єиг ) Ріаптасої, 2008, 582, 154-161.)

Відповідно, очікують що сполука 1 буде корисною для лікування запальних респіраторних розладів, зокрема, астма. Запалення і фіброз легені характерні для інших респіраторних захворювань, крім астми, таких як хронічна обструктивна хвороба легень (СОРО), кістозний фіброз (СЕ), пневмоніт, інтерстиціальні легеневі захворювання (включаючи ідіопатичний легеневий фіброз), гостре пошкодження легень, гострий респіраторний дистрес-синдром, бронхіт, емфізема і облітеруючий бронхіоліт. Тому також очікують, що сполука 1 буде корисна для лікування хронічної обструктивної хвороби легень, кістозного фіброзу, пневмоніту, інтерстиціальних легеневих захворювань (включаючи ідіопатичний легеневий фіброз), гострого пошкодження легень, гострого респіраторного дистрес-синдрому, бронхіту, емфіземи, облітеруючого бронхіоліту і саркоїдозу.

Тому в одному аспекті винахід надає спосіб лікування респіраторного захворювання у ссавця (наприклад, у людини), який включає введення ссавцеві 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4- гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-з-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2- морфоліноетан-1-ону або його фармацевтично прийнятної солі.

У одному аспекті респіраторне захворювання являє собою астму, хронічну обструктивну хворобу легень, кістозний фіброз, пневмоніт, хронічну обструктивну хворобу легень (СОРО), кістозний фіброз (СЕ), пневмоніт, інтерстиціальні легеневі захворювання (включаючи ідіопатичний легеневий фіброз), гостре пошкодження легень, гострий респіраторний дистрес- синдром, бронхіт, емфізему, облітеруючий бронхіоліт або саркоїдоз. У іншому аспекті респіраторне захворювання являє собою астму або хронічну обструктивну хворобу легень. бо У іншому аспекті респіраторне захворювання являє собою легеневу інфекцію, гельмінтоз,

легеневу артеріальну гіпертензію, саркоїдоз, лімфангіолейоміоматоз, бронхоектаз, інфільтративне захворювання легень. Ще в одному аспекті респіраторне захворювання являє собою лікарський пневмоніт, грибковий пневмоніт, алергічний бронхолегеневий аспергільоз, гіперчутгливий пневмоніт, еозинофільний гранулематоз з поліангіїтом, ідіопатичну гостру еозинофільну пневмонію, ідіопатичну хронічну еозинофільну пневмонію, гіпереозинофільний синдром, синдром Леффлера, облітеруючий бронхіоліт з організуючою пневмонією або індукований інгібіторами імунних контрольних точок пневмоніт.

Винахід також забезпечує спосіб лікування астми у ссавця, який включає введення ссавцеві фармацевтичної композиції, що містить 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1 Н- індазол-З-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-і-он або його фармацевтично прийнятну сіль і фармацевтично прийнятний носій.

Сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль також можуть бути корисні для лікування еозинофільних легеневих захворювань. Еозинофільне запалення дихальних шляхів є характерною особливістю захворювань, які в сукупності називаються еозинофільними захворюваннями легень (Сойіп еї аї., Сіп. Спевзі. Меа., 2016, 37(3), 535-56). Еозинофільні захворювання асоційовані з передачею сигналів 1І-4, 1-13 ї 1-5. Еозинофільні захворювання легень включають інфекції (особливо, гельмінтози), лікарському пневмоніт (індукований, наприклад, терапевтичними препаратами, такими як антибіотики, фенітоїн або триптофан або І- триптофан), грибковий пневмоніт (наприклад, алергічний бронхолегеневий аспергільоз), гіперчутливий пневмоніт і еозинофільний гранулематоз з поліангіїтом (раніше відомий як синдром Чарга-Штрауса). Еозинофільні захворювання легень невідомої етіології включають ідіопатичну гостру еозинофільну пневмонію, ідіопатичну хронічну еозинофільну пневмонію, гіпереозинофільний синдром і синдром Леффлера.

Сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль також можуть бути корисні для лікування

РАН. Поліморфізм в гені І/-б6 пов'язують з підвищеними рівнями І/-б і підвищеним ризиком розвитку легеневої артеріальної гіпертензії (РАН) (Рапо еї аї., У Ат 5о0с Нурегієп5., 2017, 113), 171-177). Підтверджуючи роль 1-6 в РАН, інгібування інгібування ланцюга др130 рецептора 1-6 полегшує захворювання в щурячій моделі РАН (Ниапод еї аї., Сап . Сагаїйої., 2016, 32(11), 1356.е1-1356. е10).

Зо Сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль також можуть бути корисні для лікування неалергічних захворювань легких, таких як саркоїдоз і лімфангіолейоміоматоз. Цитокіни, такі як

ІЕМ-у, 12-12 ї ІС-6, залучені до ряду неалергічних захворювань легких, таких як саркоїдоз і лімфангіолейоміоматоз (ЕІ-НазНетіїе єї а!., Ат. У. Везріг. Сеї!Ї Мої. Віо!., 2005, 33, 227-230, і Б!-

НазНетіїе єї аі!., Сапсег Вев., 2004, 64, 3436-3443).

Сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль також можуть бути корисні для лікування бронхоектазу і інфільтративних легеневих захворювань, які являють собою захворювання, асоційовані з хронічним нейтрофільним запаленням. Деякі цитокіни асоційовані з нейтрофільним запаленням (наприклад, 1-6, ІЕМ-у).

Патологічна активація Т-клітин має вирішальне значення в етіології множинних респіраторних захворювань. Аутореактивні Т-клітини відіграють роль в облітеруючому бронхіоліті з організуючою пневмонією (який також називається СОБ5). Подібно до СО5, етіологія відторгнення трансплантата легені пов'язана з аберантною Т-клітинною активацією Т- клітин реципієнтів трансплантованою легенею донора. Відторгнення трансплантата легень можуть статися раніше у вигляді первинної дисфункції трансплантата (РОБ), організуючої пневмонії (ОР), гострого відторгнення (АК) або лімфоцитарного бронхіоліту (ІВ), або вони можуть статися через роки після трансплантації легені у вигляді хронічної дисфункції алотрансплантата легені (СГАВБ). СГ АО раніше був відомий як облітеруючий бронхіоліт (ВО), але тепер вважається синдромом, який може мати різні патологічні вияви, включаючи ВО, рестриктивний СІ АЮ (гСІ АЮ або КАФ) і нейтрофільну дисфункцію алотрансплантата. Хронічна дисфункція алотрансплантата легені (СІ АБ) є серйозною проблемою в довгостроковій тактиці лікування реципієнтів з легеневим трансплантатом, оскільки примушує трансплантовану легеню поступово втрачати функціональність (сСаціпієг еї аї., Сигг Тгапзріапі Кер., 2016, 3(3), 185-191).

СІ АЮ погано реагує на лікування, і, отже, залишається потреба в ефективних сполуках, здатних до запобігання або лікування цього стану. Деякі ЧАК-залежні цитокіни, такі як ІЕМ-у ї 1-5, активуються при СІ АО і відторгненні трансплантата легені (Вегазієднші еї аї., Сіїп Тгапзріапі. 2017, 31, е12898). Крім того, високий рівень хемокінів СХСКЗ в легенях, таких як СХСІ9 і

СХСІ110, які знаходяться на низхідному ЧАК-залежному ІЕМ сигнальному шляху, пов'язані з гіршими наслідками у пацієнтів з трансплантованою легенею (зЗпіпо еї аі, РГО5 Опе, 2017, 12 (7), е0180281). Було показано, що системне інгібування ЧАК ефективне при відторгненні бо трансплантата нирки (мМісепії єї аі!., Атетгтісап Ууошгтпаї ої Тгап5ріапіайоп, 2012, 12, 2446-56). Тому сполука 1 може бути ефективною при лікуванні або профілактиці відторгнення трансплантата легень і СІГАЮ. Подібні події активації Т-клітин, описані як основа для відторгнення трансплантата легені, також вважають основним чинником, що спричиняє захворювання легень, асоційоване з реакцією трансплантат-проти-хазяїна (СУНО), яка може відбуватися після трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин. Як і у випадку з СТАЮ, СУМНО легені є хронічним прогресуючим захворюванням з надто поганими наслідками, і в цей час немає схваленого лікування. Ретроспективне багатоцентрове оглядове дослідження 95 пацієнтів зі стероїд-резистентною гострою або хронічною СМУНО, які отримували системний інгібітор ЗХАК руксолітиніб як консервативну терапію, продемонструвало повну або часткову відповідь на руксолітиніб у більшості пацієнтів, включаючи пацієнтів з ЗМНО легень (7еїз5ег еї аї, І еиКкетіа, 2015, 29, 10, 2062-68). Зовсім нещодавно при більш активному використанні інгібіторів імунних контрольних точок з'явився індукований інгібіторами імунних контрольних точок пневмоніт, ще одне опосередковане Т-клітинами захворювання легень. У хворих на рак, що отримували ці стимулятори Т-клітин, може розвинутися фатальний пневмоніт. Сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль є потенційно можливим новим лікуванням цих недооцінених серйозних респіраторних захворювань.

Шлунково-кишкові захворювання

Як інгібітори ЗАК, сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль також можуть бути корисні при множині інших захворювань. Сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль можуть бути корисні при різних шлунково-кишкових запальних симптомах, які включають, але не обмежуються цим, запальне захворювання кишечнику, виразковий коліт (проктосигмоїдит, панколіт, виразковий проктит і лівосторонній коліт), хворобу Крона, колагенозний коліт, лімфоцитарний коліт, хворобу Бехчета, целіакію, індукований інгібітором імунних контрольних точок коліт, ілеїт, еозинофільний езофагіт, коліт, пов'язаний з реакцією трансплантат-проти- хазяїна, і інфекційний коліт. Виразковий коліт (Кеійтипа еї аї., У Сіїп Іттипоіоду, 1996, 16, 144- 150), хвороба Крони (УМуУсумжмосії еї аі., Еиг У Савзігоепіегоїюду Нераїйоіоду, 1999, 11, 267-276), колагенозний коліт (Китамаї єї а!., Мої Іттипоіоду, 2013, 55, 355-364), лімфоцитарний коліт (Китаулаї еї аї., 2013), еозинофільний езофагіт (УУ/еіпогапа-соісньего еї аї., Іттипої! Рез, 2013, 56, 249-260), коліт, пов'язаний з реакцією трансплантат-проти-хазяїна (Соопії! єї а!., Віоса, 2001,

Зо 117, 3268-3276), інфекційний коліт (Зіайтасп еї аї., Іпї У Соїогесіа! Оі5, 2004, 19, 308-315), хвороба Бехчета (2Ппои еї аї., Ашіоіттип Кем, 2012, 11, 699-704), целіакія (де МіЩО еї аї., УМопіа

Савзігоепієгої, 2009, 15, 4609-4614), коліт, індукований інгібітором імунних контрольних точок (наприклад, коліт, індукований інгібітором СТІ А-4; (Мапо еї аї., У Тгапвіайоп Мед, 2014, 12, 191), коліт, індукований інгібітором РО-1 або РО-1 1) і ілеїт (Уататоїо еї аї., Оід Гімег Сів, 2008, 40, 253-259) характеризуються підвищенням рівня деяких прозапальних цитокінів. Оскільки багато прозапальних цитокінів передають сигнали за допомогою активації УАК, сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль можуть полегшувати запалення і забезпечувати полегшення симптомів. Зокрема, сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль можуть бути корисні для індукції і підтримки ремісії виразкового коліту, а також для лікуванні хвороби Крона, коліту, індукованого інгібітором імунних контрольних точок, і побічних шлунково-кишкових ефектів реакції трансплантат-проти-хазяїна. Отже, в одному аспекті винахід надає спосіб лікування шлунково-кишкового запального захворювання у ссавця (наприклад, у людини), який включає введення ссавцеві сполуки 1 або її фармацевтично прийнятній солі або фармацевтичної композиції, що містить фармацевтично прийнятний носій і сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль.

Інші захворювання

Сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль також можуть бути корисні для лікування інших захворювань, таких як інші запальні захворювання, аутоїмунні захворювання або ракові захворювання.

Сполука 1 або її фармацевтично прийнятна сіль можуть бути корисні для лікування одного або декількох захворювань, вибраних з артриту, ревматоїдного артриту, ювенільного ревматоїдного артриту, відторгнення трансплантата, ксерофтальмії, псоріатичного артриту, діабету, інсулінозалежного діабету, захворювання рухових нейронів, мієлодиспластичного синдрому, болю, саркопенії, кахексії, септичного шоку, системного червоного вовчаку, лейкозу, хронічного лімфоцитарного лейкозу, хронічного мієлоцитарного лейкозу, гострого лімфобластного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, анкілозуючого спондиліту, мієлофіброзу, В-клітинної лімфоми, гепатоцелюлярної карциноми, хвороби Ходжкіна, раку молочної залози, множинної мієломи, меланоми, неходжкінської лімфоми, недрібноклітинного раку легені, світлоклітинного раку яєчників, пухлини яєчника, пухлини підшлункової залози, бо справжньої поліцитемії, синдрому Шегрена, саркоми м'яких тканин, саркоми, спленомегалії, Т-

клітинної лімфоми і великої таласемії.

Комбінована терапія

Сполуки за даним винаходом або їх фармацевтично прийнятний солі можна використовувати в комбінації з одним або декількома засобами, які діють по одному і тому ж механізму або по різних механізмах для лікування захворювання. Різні засоби можна вводити послідовно або одночасно, в окремих композиціях або в одній і тій же композиції. Прийнятні класи засобів для комбінованої терапії включають, але не обмежуються цим, антиангіогенні засоби, стероїди, протизапальні засоби, інгібітор плазменного калікреїну, інгібітор ліганду плацентарного фактора росту, інгібітор ліганду МЕСБ-А, інгібітор ліганду-2 ангіопоетину, інгібітор протеїнтирозинфосфатази бета, стимулятор тирозинкіназного Тек рецептора, інгібітор кальциневрину, інгібітор ліганду МЕСЕ, інгібітор тТОм. комплексу 1, інгібітор ттТОК, антагоніст

І/-17, модулятор кальмодуліну, антагоніст рецептора ЕСЕ, антагоніст рецептора РОСБЕ, антагоніст МЕСЕ рецептора, інгібітор ліганду ТМЕ альфа, ТМЕ-зв'язувальний агент, стимулятор протеоглікану 4, інгібітор ліганду МЕОБЕ-С, інгібітор ліганду МЕСЕ-О, антагоніст СО126, інгібітор каскаду комплементу, агоніст глюкокортикоїду, інгібітор фактора комплементу С5, антагоніст канабіноїдного рецептора, модулятор рецептора-1 сфінгозин-1-фосфату, модулятор рецептора-

З сфінгозин-1-фосфату, модулятор рецептора-4 сфінгозин-1-фосфату, модулятор рецептора-5 сфінгозин-1-фосфату, інгібітор ацетальдегіддегідрогенази, інгібітор тирозинкінази РІЗ, інгібітор тирозинкінази КІії, інгібітор протеїнкінази С, ліганд адренокортикотропного гормону, інгібітор ліганду стромально-клітинного фактора 1, агоніст імуноглобуліну (531; інгібітор ліганду

Інтерлейкіну-ї бета, стимулятор муцину; модулятор ядерного фактора каппа В, стимулятор білка-4 цитотоксичних Т-лімфоцитів, інгібітор глікопротеїну СО28 поверхні Т-клітин, стимулятор ліпопротеїнліпази; агоніст РРАК альфа, агоніст аденозинового АЗ рецептора, антагоніст ангіотензинового ІІ рецептора, антагоніст рецептора УЕСЕ, ліганд інтерферону-бета, модулятор

ЗМАЮ-2; інгібітор ліганду ТОЕ бета 1, агоніст рецептора соматостатину, інгібітор альфа субодиниці ІЇ/-2 рецептора, інгібітор ліганду МЕСБЕ-В, ліганд тимозину бета 4, антагоніст рецептора АТ-1 ангіотензину ІЇ, антагоніст хемокіну ССК2, інгібітор мембранної мідь-вмісної аміноксидази, антагоніст СО11а, інгібітор ІСАМ-1, антагоніст інсуліноподібного фактора росту 1, інгібітор калікреїну, стимулятор фукозилтрансферази б, модулятор фукоза-синтетази СОР,

Зо інгібітор гена СНК, інгібітор гена ІСЕ1, антагоніст рецептора МЕСЕ-1, агоніст альбуміну, антагоніст 1-2, антагоніст СОЕ-1; антагоніст рецептора РОСЕ, антагоніст рецептора МЕСЕ-2, інгібітор ттТОК, агоніст РРАК альфа, інгібітор Кпо ГТФази, інгібітор КПпо-асоційованої протеїнкінази, інгібітор СЗ комплементу, інгібітор транскрипційного фактора ЕСВ-1, модулятор ядерного зв'язаного з еритроїдом-2 фактора, інгібітор ядерного фактора каппа В, антагоніст інтегрину альфа-У/бета-3, агоніст рецептора еритропоетину, агоніст глюкагон-подібного пептиду 1, стимулятор гена ТМЕКЗЕТА, інгібітор ліганду-2 ангиопоетину, інгібітор антиплазміну альфа-2, антагоніст колагену, інгібітор фібронектину, антагоніст ламініну, стимулятор плазміну, ліганд фактора росту нервів, антагоніст рецептора ЕОЕ1, антагоніст рецептора ЕСБЕЗ, інгібітор тирозинкінази НИК, інгібітор тирозинкінази СК, інгібітор тирозинкіназного рецептора ЦК, антагоніст РОСЕ рецептора-альфа, антагоніст РОСЕ рецептора-бета, інгібітор протеїнтирозинкінази, антагоніст МЕСЕ-3 рецептора, інгібітор мембранної мідь-вмісної аміноксидази, агоніст соматостатин 2-рецептора, агоніст соматостатин 4-рецептора, агоніст соматостатин-5 рецептора, інгібітор протеїнкінази С альфа, інгібітор протеїнкінази С бета, протеїнкінази С дельта, інгібітор протеїнкінази С епсилон, інгібітор протеїнкінази С ця, інгібітор протеїнкінази С тета, модулятор анкирину, стимулятор муцину, агоніст пуринергічного рецептора Р2У2, інгібітор білка міжклітинних щілинний контактів альфа-1, антагоніст хемокіну

ССЗ; інгібітор ліганду еотаксину, інгібітор амілорид-чутливих натрієвих каналів, антагоніст рецептора РОСРЕ, інгібітор протеїнтирозинкінази, інгібітор білка пігментного епітелію сітківки, інгібітор матриксної металлопротеїнази, антагоніст рецептора РОСЕ, антагоніст РОСЕ рецептора-бета, інгібітор ліганду РОСЕ-В, антагоніст рецептора гормону росту, інгібітор молекули клітинної адгезії, модулятор інтегрину, антагоніст хемокіну СХСКА, інгібітор білка, що містить суперспіральний домен, модулятор Нер 90, інгібітор Кпо-асоційованої протеїнкінази, інгібітор гена МЕСРЕ, інгібітор ендогліну, антагоніст хемокіну ССКЗ, модулятор калієвих каналів тахіК, стимулятор калієвих каналів тахікК, агоніст РОБ2 альфа, агоніст простаноїдного рецептора, модулятор потенціал-залежних хлоридних каналів 2, антагоніст рецептора С5а комплементу, інгібітор інозинмонофосфатдегідрогенази, інгібітор ліганду інтерлейкіну 18, стимулятор М8 катіонного каналу ТКР, агоніст рецептора СМТЕ, інгібітор гена ТКРМІ, стимулятор дезоксирибонуклеази І, інгібітор гена ІК51, інгібітор Кпо-асоційованої протеїнкінази, інгібітор полі(АДФ-рибоза)полімерази 1, інгібітор полі(АДфФ-рибоза)полімерази 2, інгібітор бо полі(АДФ-рибоза)полімерази 3, агоніст ванілоїдного МАК1, стимулятор гена МЕАТ5, стимулятор муцину, інгібітор тирозинкінази Бук, агоніст альфа 2-адренорецепторов, інгібітор циклооксигенази, інгібітор відкладення амілоїдного білка, інгібітор кінази-3 глікогенсинтази, стимулятор РАБКР, інгібітор відкладення їацй, інгібітор гена О0ОІТ4, модулятор синтезу гемоглобіну, інгібітор ліганду інтерлейкіна-ії бета, антагоніст ТМЕ, стимулятор потенціалу- залежних калієвих каналів КСМО, антагоніст рецептора ММОА, інгібітор циклооксигенази 1, інгібітор циклооксигенази, агоніст 5-НТ та рецептора, інгібітор кальцієвих каналів, модулятор ліганду ЕОБ-2, інгібітор фосфоінозитид З-кінази, антагоніст СО44, модулятор гіалуронідази, агоніст гіалуронової кислоти, антагоніст 1-1, антагоніст 1-1 рецептора І типу, інгібітор фактора

Р комплементу, антагоніст тубуліну, антагоніст бета-амілоїдів, стимулятор гена 1/2, інгібітор 1- каппа В кінази бета, модулятор ядерного фактора каппа В, інгібітор інгібітора 1 активатора плазміногену, ліганд ЕОЕ-2, модулятор протеази і модулятор кортикотропіну.

Конкретні засоби, які можна використовувати в комбінації зі сполуками-інгібіторами ЗАК за даним винаходом, включають, але не обмежуються цим, ланаделумаб, афліберсепт, НО-7716,

АКВ-9778, циклоспорин, бевацизумаб, еверолімус, секукинумаб, флуоцинолон ацетонід, КР- 101, скваламін лактат, рекомбінантний людський лубрицин, ОРТ-302, сарилумаб, дексаметазон, екулізумаб, фінголімод, адалімумаб, репроксалап, мідостаурин, кортикотропін, олаптесед пегол, канакінумаб, рекофлавон, абатацепт, фенофибрат, пікліденосон, ОрКедеп, кандесартан, голімумаб, пегаптаніб, інтерферон-бета, диситертид, октреотид ацетат, анекортав, базиліксимаб, супрахороїдальний триамцинолон ацетонід, КОМ-259, дифлупреднат, НІ -036, авацинкаптад пегол натрій, ірбесартан, пропагерманій, триамцинолон ацетонід, азитроміцин,

ВІ-1467335, ліфітеграст, лотепреднол етабонат, тепротумумаб, КМО-001, 172-101, атезидорсен,

Моу-03, бевацизумаб, АМА-101, ВО-101, воклоспорин, вороланіб, сиролімус, холін фенофібрат,

МХ-210, АРІ-2, СРО-551, еламіпретид, 5Е-0166, цибінетид, еламіпретид, ліраглутид, ЕМ5-606, несвакумаб, афліберцепт, окриплазмін, філготиніб, ценегермін, адипосел, броліцизумаб, ранібизумаб, афліберцепт, паделіпорфин фотодинамічну терапію, пазопаніб, АЗР-8232, велдореотид, сотрастаурин, абіципар пегол, диквафозол тетранатрій, НСВ-1019, конберцепт, бертилімумаб, ЗНР-659, ТНА-317, А! К-001, РАМ-90806, інтерферон альфа-2Б5, флуоцинолон, сунитиніб малат, еміксустат, пІ-сопі, ТВ-403, миноциклін, МА0О9-ПКРЕ клітини, пегплераніб натрій, пегвизомант, лумінат, буриксафор, Н-1129, каротуксимаб, АХР-1275, ранібізумаб,

Зо ізопропілунопростон, тезидолумаб, мікофенолят натрію з ентеросолюбільним покриттям, тадекініг альфа, триамцинолон ацетонід, циклоспорин, 5ЗТ-266, АМХ-012, МТ-501-ЕСТ, тиванізиран, вертепорфин, дорназу альфа, аганірсен, рипасудил, рукапариб фосфат, зукапсаїцин, тетратіомолібдат, диклофенак, І НА-510, АОМ-195263, такролімус, ребаміпід, К- 348, бримонітин тартрат, візомітин, Т-89, І! МЕ-636, ВІ-1026706, римексолон, тобраміцин, ТОР- 1630, талапорфин, бромфенак натрій, триамцинолон ацетонід, давунетид, лотепреднол етабонат, ХЕО-60, ЕС-Міротин, АРО-209, аденовір, РЕ-04523655, гідроксикарбамід, навамепент, ретиналамін, СМТО-2476, ранібизумаб, флупіртин, В27РО, 5-646240, СІ М-230, гідралазин, непафенак, ОехМР, Трегалозу, гіалуронову кислоту, депо-препарат дексаметазону-Са з уповільненим вивільненням, налузотан, гіалуронідазу, гіалуронат натрію, ізунакінра, соматостатин, СІ -561, "С-10Х, ОСА-002, рекомбінантний людський епідермальний фактор росту, пеміроласт, ММ-100, МВ-11316, мононатрій альфа люмінол, ранібизумаб, ІМО-1041,

ІМО-324, НЕ-10, цингіалуронат натрію, ВОМ-Е, мезенхімальні клітини-попередники, дисульфірам, СТО-96, Ра-101, Вейи5йпи, химотрипсин.

Винахід також надає фармацевтичну композицію, що містить сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль і один або більше інших терапевтичних засобів. Терапевтичний засіб може бути вибраний з класу засобів, визначених вище, і з переліку конкретних засобів, описаних вище. У деяких варіантах здійснення фармацевтична композиція є прийнятною для доставки в око. У деяких варіантах здійснення фармацевтична композиція являє собою рідку або суспензійну композицію.

Крім того, в аспекті, що стосується способу, даний винахід надає спосіб лікування захворювання або розладу у ссавця, який включає введення ссавцеві сполуки 1 або її фармацевтично прийнятній солі і одного або декількох інших терапевтичних засобів.

При використанні в комбінованій терапії засоби можуть бути сформульовані в одну фармацевтичну композицію, або засоби можуть бути представлені в окремих композиціях, які вводять одночасно або в різний час одним і тим же або різними шляхами введення. Такі композиції можуть бути упаковані окремо або можуть бути упаковані разом у вигляді набору.

Два або більше терапевтичних засобів в наборі можна вводити одним і тим же шляхом введення або різними шляхами введення.

ПРИКЛАДИ бо Наступні приклади синтезу і біологічні приклади запропоновані для ілюстрації винаходу, і ніяким чином не повинні розглядатися як такі, що обмежують об'єм винаходу. У наведених нижче прикладах наступні абревіатури мають наступні значення, якщо не вказане інше.

Абревіатури, не визначені нижче, мають загальноприйняті значення.

АСМ - ацетонітрил рос - дициклогексилкарбодіїмід

ПОІРЕА - М, М-діїзопропілетиламін

ОМАс - диметилацетамид

ОМЕ - М, М-диметилформамід рм5о - диметисульфоксид

ЕЮОАс - етилацетат

НАТО - М, М.М',М'-тетраметил-О-(7-азабензотриазол-1-іл)уроній гексафторфосфат

ІА - дізопропіламід літію хв. - хвилина(хвилини)

МТВЕ - Метил-трет-бутиловий ефір

Мв5 - М-бромсукцинімід

ММР - М-Метил-2-піролідон

Вт - кімнатна температура

ТНЕ- тетрагідрофуран біс(пінаколато)дибор - 4,455, А455-октаметил-|2,216111,3,21ІІдіоксабороланіл

Ра(арр)СіІ»-СНесСі» - комплекс дихлор(1,1"-бісбідифенілфосфіно)-(фероцен)- дипаладію(Ії) з дихлорметаном

Реагенти і розчинники купували у комерційних постачальників (Аїадгісп, РіоКа, 5ідта і т. д.) і використовували без додаткового очищення. Реакції відстежували за допомогою тонкошарової хроматографії (ТШХ), аналітичної високоефективної рідинної хроматографії (анал. ВЕРХ) і мас- спектрометрії. Реакційні суміші обробляли, як описано конкретно для кожної реакції; звичайно їх очищали екстракцією і іншими методами очищення, такою як температуро- і розчиннико- залежна кристалізація, а також преципітація. Крім того, реакційні суміші звичайно очищали колонковою хроматографією або препаративною ВЕРХ, звичайно з використанням колонок з насадкою С18 або ВО5 і традиційними елюентів. Типові умови препаративною ВЕРХ описані нижче.

Продукти реакції звичайно охарактеризували методом мас- і "Н-ЯМР спектрометрії. Для

ЯМР аналізу зразки розчиняли в дейтерованому розчиннику (такому, як СОзЗОЮ, СОСІіз або ав-

РМ5О) і спектри "Н-ЯМР отримували з використанням пристрою Магіап Сетіпі 2000 (400 МГц) в стандартних умовах спостереження. Мас-спектрометричну ідентифікацію сполук здійснювали методом електророзпилювальної іонізації (Е5М5) з використанням пристрою Арріїед Віозузіеєт5 (Гозієг Спу, СА) модель АРІ 150 ЕХ або пристрої МУаїеге5 (Мійога, МА) 3100, з'єднаних з системами автоочищення.

Умови препаративною ВЕРХ

Колонка: С18 5 мкм 21,2х150 мм, або С18 5 мкм 21х250, або С14 5 мкм 21х150 мм

Температура колонки: Кімнатна температура

Швидкість потоку: 20,0 мл/хв.

Рухомі фази: А Водато,05 95 ТЕА

ВІАСМО,05 95 ТА

Об'єм проби, що вводиться: (100-1500 мкл)

Довжина хвилі детектора: 214 нм

Неочищені сполуки розчиняли в суміші 1:11 вода:оцтова кислота при близько 50 мг/мл. 4- хвилинний цикл в аналітичному масштабі здійснювали, використовуючи колонку С18 2,1х50 мм, з подальшим 15- або 20-хвилинним циклом в препаративному масштабі, використовуючи об'єм проби, що вводиться, 100 мкл, з градієнтом, основаним на втримуванні 96 В експерименту у аналітичному масштабі. Точні градієнти залежали від зразка. Зразки з близько елюйованими домішками перевіряли на колонці С18 21х250 мм і/або колонці С14 21х150 мм для кращого розділення. Фракції, що містять бажаний продукт, ідентифікували за допомогою мас- спектрометричного аналізу.

Отримання 1: 2-(4-(бензилокси)-2-етил-5-фторфеніл)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2- діоксаборолан (1-5)

Е

Е Я й Й і ВПО. ВО. ож

НО. . я ше ВпО. г зе, не ж Ї зе

С --0- - ще -е ки ТОВ ОК і | рен

Ву Бг й -кт | о 1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 (а) 2-(Бензилокси)-4- бром-1-фторбензол (1-2)

Дві реакції здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. Суміш 5-бром-2- фторфенолу (1-1) (850 г, 4,5 моль), бензилброміду (837 г, 4,9 моль) і карбонату калію (923 г, 6,7 моль) в АСМ (5 л) перемішували при 20 С протягом 12 годин. Реакції об'єднували і концентрували, розбавляли водою (8 л) і екстрагували за допомогою ЕЮАсС (Зх З л). Органічний шар відділяли, промивали насиченим сольовим розчином (З л), сушили над сульфатом натрію і концентрували. Неочищений продукт очищали через шар силікагелю (елюювали сумішшю 3:1 петролейний ефір:Е(ОАс) з отриманням вказаної в заголовку проміжної сполуки (1,83 кг, 73 Фо вихід) у вигляді білої твердої речовини. "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ»в) б 7,38-7,46 (м, 5Н), 7,15 (дд, 9-7,6, 2,0 Гц, 1Н), 6,98-7,15 (м, 1Н), 5,12 (с, 2Н). (р) 2-(Бензилокси)-4-етил-1-фторбензол (1-3)

Шість реакцій здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. До розчину продукту попередньої стадії (200 г, 711 ммоль) в ТНЕ (100 мл) додавали карбонат калію (197 г, 1,4 моль). Реакційну суміш З разу продували азотом з подальшим додаванням Ра(арросі»-

СНесСі2 (11,6 г, 14,2 ммоль). Реакційну суміш охолоджували до 0 "С, додавали по краплях діетилцинк (1 М, 1,07 л) і реакційну суміш перемішували при 70 "С протягом 1 години. Реакції об'єднували, охолоджували до 20 "С і повільно виливали у воду (7 л). До суміші додавали водний розчин 4 М НС до рН 6. Органічний шар відділяли і водну фазу екстрагували за допомогою ЕМОАс (3 х 2 л). Об'єднаний органічний шар промивали насиченим сольовим розчином (5 л), сушили над сульфатом натрію, концентрували і очищали через шар силікагелю (елюювали сумішшю 50:11 петролейний ефір:'ЕЇОАс)) з отриманням вказаної в заголовку проміжної сполуки (900 г, 92 95 вихід) у вигляді світло-жовтого масла. "Н ЯМР (400 МГц, СОС») б 7,29-7,43 (м, 5Н), 6,94-6,97 (м, 1Н), 6,82 (д, У-8,0 Гу, 1Н), 6,70 (м, 1Н), 5,09 (с, 2Н), 2,52-2,58 (м, 25. 2Н), 1,17 (т, 9У-7,6 Гц, ЗН). (с) 1-(Бензилокси)-4- бром-5-етил-2-фторбензол (1-4)

Чотири реакції здійснювали паралельно і об'єднували. До розчину 2-(бензилокси)-4-етил-1- фторбензолу (1-3) (293 г, 1,3 моль) в АСМ (1 л) додавали МВ5 (249 г, 1,4 моль) по порціях при 20 "С. Реакційну суміш перемішували при 20 "С протягом 2 годин. Реакційні суміші об'єднували і

Зо концентрували. Залишок розбавляли водою (5 л) і екстрагували за допомогою ЕАсС (2 х 5 л).

Органічну фазу промивали насиченим сольовим розчином (4 л), сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували і концентрували у вакуумі. Неочищений продукт очищали хроматографією на силікагелі (елюювали сумішшю петролейний ефір:'ЕОАс 100:1-10:1) з отриманням вказаної в заголовку проміжної сполуки (1,4 кг, 89 95 вихід) у вигляді світло-жовтого масла. "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 7,29-7,38 (м, 5Н), 7,2 (д, 9-10,4 Гц, 1Н), 6,8 (д, У-8,8 Гц, 1Н), 5,06 (с, 2Н), 2,6 (кв., У-7,6 Гц, 2 Н), 1,1 (т, У-7,6 Гц, ЗН). (а) 2-(4-(бензилокси)-2-етил-5-фторфеніл)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-діоксаборолан (1-5)

Сім реакцій здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. До розчину продукту попередньої стадії (200 г, 647 ммоль) в діоксані (2 л) додавали ацетат калію (190 г, 1,9 моль), біс(пінаколато)дибор (181 г, 712 ммоль) і Ра(аррОСіІ»--СНеСіІ» (10,6 г, 12,9 ммоль) в атмосфері азоту при 20 "С. Суміш перемішували при 120 "С протягом 2 годин. Реакційні суміші об'єднували, концентрували, розбавляли водою (5 л) і екстрагували за допомогою ЕЮАсС (З х 4 л). Об'єднану органічну фазу сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували і концентрували у вакуумі. Неочищений продукт очищали хроматографією на силікагелі (еєлюювали сумішшю петролейний ефір:'ЕЮАс 1:0-5:1) з отриманням вказаної в заголовку сполуки (1,35 кг, 84 95 вихід) у вигляді білої твердої речовини. "Н ЯМР (400 МГц СОСіз) б 7,33- 7,51 (м, 6Н), 6,82 (д, 9-7,6 Гц, 1Н), 5,17 (с, 2Н), 2,85 (кв., У-7,6 Гц, 2Н), 1,33 (с, 12Н), 1,15 (т, -7,6 Гц, ЗН).

Отримання 2: 1-Бензил-4-іміно-1,4-дигідропіридин-3-амін (2)

Нм

НМ М-Ва 2

До розчину піридин-3,4-діаміну (400 г, 3,67 моль) в АСМ (З л) додавали бензилбромід (596 г, 3,49 моль) по порціях при 0 "С і реакційну суміш перемішували протягом 30 хвилин і потім при 20 "С протягом 12 годин і фільтрували. Фільтрувальний коржик промивали АСМ (500 мл) і сушили з отриманням НВг солі вказаної в заголовку сполуки (600 г, 2,14 моль, 58 95 вихід) у вигляді білого порошку. "Н ЯМР (400 МГц, Меоб) б 7,83 (д, 9-5,6 Гц, 1Н), 7,64 (с, 1Н), 7,32-7,40 (м, 5Н), 6,76 (д, уУ-6,8 Гц, 1Н), 5,28 (с, 2Н).

Отримання 3: 6-(4-(Бензилокси)-2-етил-5-фторфеніл)-4-фтор-1Н-індазол-3-карбальдегід (3)

Е ши фі во поть | Вво Й

Ср ев г ОО ., - М пт ди и пот у и й з "ОБ поро ' ов

Ї ! Ї і р вон / го нн ве ке: І ит

Н її МАМ ОБ

Е 0

З 3-2 3-5 й

ВО. шт.

СК я - -- 5 2 -65|-« у о Ба ри м. в що Мот-У

Мн о 3 (а) 1-(4- Бром-2,6б-дифторфеніл)-2,2-діетоксіетан-1-он (3-1)

Дев'ять реакцій здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. Розчин 1- бром-3,5-дифторбензолу (100 г, 518 ммоль) в ТНЕ (700 мл) дегазували і продували азотом три рази. Потім додавали 2 М ІГОА (311 мл) при -70 "С і реакційну суміш перемішували при -70 70 протягом 0,5 години в атмосфері азоту. Додавали по краплях розчин етил-2,2-діетоксіацетату (96 г, 544 ммоль) в ТНЕ (200 мл) при -70 "С в атмосфері азоту і реакційну суміш перемішували протягом 1 години. Реакції об'єднували і виливали в крижаний насичений розчин хлориду амоній (10 л) по порціях і екстрагували за допомогою ЕАс (З х З л). Органічний шар відділяли, промивали насиченим сольовим розчином (5 л), сушили над сульфатом натрію, концентрували і очищали хроматографією на силікагелі (евлюювали сумішшю петролейний ефір Е(Ас 1:0-100:1) з отриманням вказаної в заголовку сполуки (1,26 кг, 84 956 вихід) у вигляді жовтого масла. "Н

ЯМР (400 МГц, СОС») 6 7,12 (д, 97,2 Гу, 2Н), 5,15 (с, 1Н), 3,61-3,7 (м, 4Н), 1,2 (т, 9-7,2 Гц, 6Н). (5) 1-(42-(бензилокси)-2'-етил-3,5,5'-трифтор-(1,1"-біфеніл|-4-іл)-2,2-діетоксіетан-1-он (3-2)

П'ять реакцій здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. До суміші 1-(4- бром-2,6б-дифторфеніл)-2,2-діетоксіетан-1-ону (3-1) (189 г, 586 ммоль) в етанолі (150 мл) і толуолі (1,5 л) додавали воду (150 мл), карбонат натрію (84,8 г, 800 ммоль) і 2-(4-(бензилокси)- 2-етил-5-фторфеніл)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-діоксаборолан (1-5) (190 г, 533 ммоль) при 20 "С.

Суспензію дегазували у вакуумі і продували азотом декілька разів. Додавали Ра(аррОСІ»-СНесСіг (13 г, 16 ммоль) і реакційну суміш продували азотом декілька разів і перемішували при 1207

Зо протягом 2 годин. Реакції об'єднували, охолоджували до 20 "С, виливали у воду (5 л) і екстрагували за допомогою ЕАс (3 х 4 л). Об'єднані органічні шари промивали насиченим сольовим розчином (5 л), сушили над сульфатом натрію, фільтрували, концентрували і очищали хроматографією на силікагелі (евлюювали сумішшю петролейний ефір:Е(ЮАс 100:1-5:1)

з отриманням вказаної в заголовку проміжної сполуки (880 г, 70 95 вихід) у вигляді жовтого масла. "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 7,36-7,48 (м, 5Н), 6,94-6,96 (м, 2Н), 6,86-6,92 (м, 2Н), 5,29 (с, 1Н), 5,19 (с, 2Н), 3,67-3,77 (м, 4Н), 2,52 (кв., 9У-7,6 Гц, 2Н), 1,25 (т, У-6,8 Гц, 6Н), 1,07 (т, 9-72 Гц,

ЗН). (с) 6-(4-(бензилокси)-2-етил-5--фторфеніл)-3-(диетоксиметил)-4-фтор-1Н-індазол (3-3)

Чотири реакції здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. До розчину продукту попередньої стадії (220 г, 466 ммоль) в ТНЕ (2 л) додавали гідразин моногідрат (47,6 г, 931 ммоль) при 20 "С. Реакційну суміш перемішували при 100 "С протягом 12 годин. Чотири реакції об'єднували і охолоджували до 20 "С і концентрували. Залишок розчиняли в ЕІОАс (5 л) і промивали розчином 0,1 М НСЇ (2 х 1,5 л). Об'єднані органічні шари промивали насиченим сольовим розчином (1,5 л), сушили над сульфатом натрію, фільтрували і концентрували з отриманням вказаної в заголовку проміжної сполуки (900 г, неочищена) у вигляді жовтої смоли, яку використовували безпосередньо на наступній стадії. "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 7,36-7,48 (м,

БН), 6,94-6,96 (м, 2Н), 6,86-6,92 (м, 2Н), 5,29 (с, 1Н), 5,19 (с, 2Н), 3,67-3,77 (м, 4Н), 2,52 (кв., 15..9-7,6 Гц, 2Н), 1,25 (т, У-6,8 Гц, 6Н), 1,07 (т, 9У-7,2 Гц, ЗН). (а) 6-(4-(Бензилокси)-2-етил-5-фторфеніл)-4-фтор-1Н-індазол-3-карбальдегід (3)

Три реакції здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. До розчину продукту попередньої стадії (300 г, 643 ммоль) в ацетоні (1,5 л) додавали 4 М НСІ (16 мл) по краплях при 20 "С їі реакційну суміш перемішували при 20 "С протягом 0,17 години. Реакції об'єднували, концентрували, розбавляли за допомогою МТВЕ (1 л) і фільтрували.

Фільтрувальний коржик промивали МТВЕ (2 х 300 мл) і сушили при зниженому тиску з отриманням вказаної в заголовку проміжної сполуки (705 г, неочищена) у вигляді жовтої твердої речовини, яку використовували безпосередньо на наступній стадії. (пт/27): (МАНІ розраховано для СгзНівР2М2О» 393,13 знайдено 393,1. "Н ЯМР (400 МГц, ОМ5О-ав) б 14,51 (с, 1Н), 10,17 (д, 93,6 Гц, 1Н), 7,50 (д, 9-7,2 Гц, 2Н), 7,40-7,42 (м, АН), 7,24 (д, 9-84 Гц, 1Н), 7,15 (д, У-12,4 Гц, 1Н), 7,06 (д, У-8,4 Гц, 1Н), 5,25 (с, 2Н), 2,52-2,53 (м, 2Н), 1,03 (т, У-7,6 Гц, ЗН).

Отримання 4: 5-Бензил-2-(6-(4-(бензилокси)-2-етил-5-фторфеніл)-4-фтор-1Н-індазол-З-іл)- 5Н-імідазої|4,5-с|піридин (4)

НМ е НМ М-Вп Е

ВпО. р З ВпО.. ра

Ф | ? ви

СК Е - (« О" - хи ах Я ра Вп й Ц Ж й ) Ц й м- М

Й нших т и о,

Мнм 9 нм-м М 3 4

Зо Чотири реакції здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. До розчину 6-(4-(бензилокси)-2-етил-5-фторфеніл)-4-фтор-1Н-індазол-3-карбальдегіду (3), продукту

Отримання 3 (172 г, 440 ммоль), в ОМЕ (1,1 л) додавали бісульфіт натрію (68,6 г, 659 ммоль) і 1- бензил-4-іміно-1,4-дигідропіридин-3-амін (2) (136 г, 484 ммоль) при 20 "С і реакційну суміш перемішували при 150 С протягом 2 годин. Чотири реакції об'єднували і реакційну суміш концентрували при зниженому тиску. Залишок виливали у воду (10 л) і фільтрували.

Фільтрувальний коржик сушили при зниженому тиску з отриманням вказаної в заголовку проміжної сполуки (990 г, неочищена) у вигляді жовтої твердої речовини, яку використовували безпосередньо без очищення. (Іп/2): (МАНІ" розраховано для Сз5Н2г7Р2М50О 572,2 знайдено 572,3.

Отримання 5: 5-Бензил-2-(6-(4-(бензилокси)-2-етил-5-фторфеніл)-4-фтор-1Н-індазол-З-іл)- 4,5,6,7-тетрагідро-1 Н-імідазо|4,5-с|піридин (5)

ВПО 1 Й по дя Вп. і Ї ва а и я КІ щ ее «Вп и ж ху й

І ЇЇ к-м тре Вп р неси ША ЩІ р пе | Щі як М -и Ше

Ой щ о: нМ-М НМ-« М я 4 5

Три реакції здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. До суміші 5- бензил-2-(6-(4-(бензилокси)-2-етил-5-фторфеніл)-4-фтор-1Н-індазол-3-іл)-5Н-імідазої|4,5- с|Іпіридин (4), продукту Отримання 4 (330 г, 577 ммоль), в метанолі (1,5 л) і ТНЕ (1 л) додавали борогідрид натрію (267 г, 6,9 моль) по порціях при 20 "С і реакційну суміш перемішували при 20 С протягом 24 годин. Три реакції об'єднували і реакційну суміш додавали у воду (10 л), перемішували протягом 10 хвилин і фільтрували. Фільтрат екстрагували за допомогою ЕАс (2 х 5 л) і об'єднану органічну фазу сушили над безводним сульфатом натрію, фільтрували і концентрували у вакуумі. Неочищений продукт розбавляли за допомогою ЕАс (2 л),, перемішували протягом 30 хвилин і фільтрували. Фільтрувальний коржик промивали МТВЕ (Зх 200 мл) з отриманням вказаної в заголовку проміжної сполуки (275 г, 28 95 вихід) у вигляді світло-жовтої твердої речовини. (т/727): (МАНІ розраховано для Сз5НзіБ2М5О 576,25 знайдено 576,3. "Н ЯМР (400 МГц, ОМ5О-ав) б 7,50-7,52 (м, 2Н), 7,35-7,43 (м, 7Н), 7,23-7,25 (м, ЗН), 7,15 (д, 9У-12,0 Гу, 1Н), 6,81 (д, 9У-12,0 Гу, 1Н), 5,25 (с, 2Н), 3,72 (с, 2Н), 3,43 (ушир.с, 2Н), 2,78 (ушир.с, 2Н), 2,66 (ушир.с, 2Н), 2,55 (кв., 2Н), 1,04 (т, У-7,6 Гц, ЗН).

Отримання 6: 5-етил-2-фтор-4-(4-фтор-3-(4,5,6,7-тетрагідро-1Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-2-іл)- 1Н-індазол-б-іл)уфенол (6)

Е є

ВПО. р НО. ше, «Ж -Е Я их й ни ши он ан ) ї Ж пор ун рай ше п | рай й - І Я шо ри ї й М - ра а Ту М би нн-М у НМ-мМ д 5 6

П'ять реакцій здійснювали паралельно і об'єднували для подальшої обробки. До суміші 5- бензил-2-(6-(4-(бензилокси)-2-етил-5-фторфеніл)-4-фтор-1Н-індазол-3-іл)-4,5,6,7-тетрагідро-1 Н- імідазо|4,5-с|Іпіридин (5), продукту Отримання 5 (55 г, 95,5 ммоль), в ТНЕ (500 мл) і метанолі (500 мл) додавали паладій на вуглеці (15 г, 9,6 ммоль) і водний розчин 12 М НСЇ (10 мл).

Суспензію дегазували у вакуумі, продували воднем декілька разів і перемішували в атмосфері водню (50 ф/дюйм-? (3,5 кг/см7)) при 50 "С протягом 12 годин. Реакції об'єднували і реакційну суміш фільтрували. Фільтрат концентрували у вакуумі з отриманням НС! солі вказаної в заголовку проміжної сполуки (150 г, неочищена) у вигляді не зовсім білої твердої речовини. (т/2): (МАНІ розраховано для С2гіНіоР2М5О 396,16 знайдено 396,2. "Н ЯМР (400 МГц, меоб) б 7,АЗ (с, 1Н), 7,07 (д, 9У-11,6 Гц, 1Н), 6,97 (д, У-11,6 Гц, 1Н), 6,91 (д, У-8,8 Гц, 1Н), 4,57 (с, 2Н), 3,74 (с, 2Н), 3,24 (с, 2Н), 2,55 (кв., 9У-7,6 Гц, 2Н), 1,08 (т, 9У-7,6 Гц, ЗН).

Зо Отримання 7: 2,5-діоксопіролідин-1-іл-2-морфоліноацетат (7") о го о ро о го р -ь-

УЖ се ЖЖ С т-4 т" о т (а) трет-Бутил-2-морфоліноацетат (7-1)

До суміші морфоліну (160 г, 1,84 моль) і карбонату калію (381 г, 2,76 моль) в ТНЕ (3 л) додавали трет-бутил-2-бромацетат (341 г, 1,75 моль) повільно при 0 "С. Реакційну суміш перемішували протягом 30 хвилин і потім при 20 "С протягом 12 годин і концентрували.

Додавали воду (1,5 л) і реакційну суміш екстрагували за допомогою Ес (3 х 1 л). Органічний шар відділяли, промивали насиченим сольовим розчином (500 мл), сушили над сульфатом натрію і концентрували з отриманням вказаної в заголовку проміжної сполуки (300 г, 81 95 вихід) у вигляді жовтого масла. "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 3,74 (т, 94,8 Гц, 4Н), 3,10 (с, 2Н), 2,57 (т, 3-48 Гц, 4Н), 1,46 (с, 9Н). (б) 2-Морфолінооцтова кислота (7")

Суміш продукту попередньої стадії (7-1) (300 г, 1,49 моль) в З М НСЇ в діоксані (2,0 л) перемішували при 20 "С протягом 12 годин і концентрували з отриманням НС солі вказаної в заголовку сполуки (270 г, 99 95 вихід) у вигляді блідої твердої речовини, яку використовували безпосередньо на наступній стадії "Н ЯМР (400 МГц, МеОб) 5 4,13 (с, 2Н), 3,93 (ушир.с, 4Н), 3,64 (ушир.с, 4Н). (с) 2,5-діоксопіролідин-1-іл-2-морфоліноацетат (7)

Суміш продукту попередньої стадії (150 г, 826 ммоль), 1-гідроксипіролідин-2,5-діону (95 г, 826 ммоль), ОСС (256 г, 1,24 моль) і ОІРЕА (160 г, 1,24 моль) в ОСМ (2 л) перемішували при 157С протягом 12 годин і фільтрували. Фільтрат концентрували і промивали за допомогою

ЕТАс (800 мл). Тверду речовину збирали фільтруванням і концентрували з отриманням вказаної в заголовку сполуки (150 г, 75 95 вихід) у вигляді білої твердої речовини. "Н ЯМР (400

МГу, ОМ50-ав) 5 3,68 (с, 2Н), 3,58 (т, У-4,68 Гц, 4Н), 2,82 (с, 4Н), 2,57 (т, У-5,2 Гц, 4Н).

Приклад 1: 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1 Н-індазол-3-іл)-1,4,6,7- тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (1)

Е о Е

НО. й жа оо но

А Кк д'тбои С | З оо-ето ди сен Же - о т й ра рай ЕЕ Л Г щ

ПИ Х ми ТМН . ї Ж м вк не - и т р всей Кл 1 ' пр ння в мем нео 6 1

Суміш 5-етил-2-фтор-4-(4-фтор-3-(4,5,6,7-тетрагідро-1 Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-2-іл)-1 Н- індазол-б-ілуфенолу (6) 2 НСІ (100 г, 214 ммоль), 2,5-діоксопіролідин-1-іл-2-морфоліноацетату (7) (67,2 г, 2768 ммоль) і СІРЕА (69 г, 534 ммоль) в ОМЕ (600 мл) перемішували при 1570 протягом 12 годин і фільтрували. Розчин очищали зворотно-фазовою хроматографією (пристрій

Адеїа РГЕХАТМ Е5-11; 2 кг Адеіа С18 БАС колонка; 200 г зразка, розчиненого в ОМЕ (900 мл); швидкість потоку 300 мл/хв.; розчинник А вода, розчинник В АСМ; градієнт (95 В, час (хв.): 0/15, 0-40/45, 40/50) з отриманням вказаної в заголовку сполуки (50,0 г, 44,8 9о вихід) у вигляді світло- жовтої твердої речовини. (Іп/727): МАНІ" розраховано для С27НгвЕ2МвОз 523,22 знайдено 523,0." Н

ЯМР (400 МГц, МеОб) 6 7,22 (с, 1Н), 6,80-6,96 (м, ЗН), 4,68-4,78 (м, 2Н), 3,96 (с, 2Н), 3,65-3,95 (м, 4Н), 3,35-3,38 (м, 2Н), 2,77-2,92 (м, 2Н), 2,52-2,56 (м, 6Н), 1,06 (т, 9У-7,6 Гц, ЗН).

Приклад 2: Кристалічний 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-З-іл)- 1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (1) Форма 1

У 250-мл колбу додавали 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1 Н-індазол-З-іл)- 1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (1), продукт Прикладу 1 (5 г), і етанол (50 мл) і реакційну суміш перемішували при 50-80 "С протягом 10 хвилин і потім повільно додавали АСМ (75 мл) при 50-80 "С з подальшим додаванням затравочних кристалів з

Прикладу 3. Реакційну суміш перемішували при 20-25 "С протягом 18 годин. Отриману тверду речовину збирали фільтруванням і сушили при 50 "С у вакуумі протягом 18 годин з отриманням

Форми 1 вказаної в заголовку сполуки (3,6 г, 72 95 вихід).

Приклад 3: Кристалічний 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-З-іл)- 1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (1) Форма 1

Сполуку 1, продукт Прикладу 1 (1 г), додавали до етанолу (10 мл) і нагрівали до розчинення.

Додавали ацетонітрил (10 мл) і реакційну суміш перемішували і нагрівали і потім перемішували при кімнатній температурі протягом 16 годин, фільтрували і сушили при 50 "С у вакуумі протягом 18 годин з отриманням Форми 1 вказаної в заголовку сполуки (0,23 г).

Приклад 4: 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1 Н-індазол-3-іл)-1,4,6,7- тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (1)

Е Е

Шо о о НО. шк ! но" М І ФІ . ря й а ще т" Є же що їй ! я . МН | о. Митним аа Оман: ДІ нм мем М 6 1

М, М-діізопропілетиламін (0,298 мл, 1,707 ммоль) додавали до розчину 5-етил-2-фтор-4-(4- фтор-3-(4,5,6,7-тетрагідро-1 Н-імідазо|4,5-с|піридин-2-іл)-1Н-індазол-б-іл)уфенолу (135 мг, 0,341 ммоль) (6), НАТИ (156 мг, 0,410 ммоль) і 2-морфолінооцтової кислоти (7") (54,5 мг, 0,376 ммоль) в ОМЕ (0,5 мл) і реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 24 годин.

Додавали гідроксид літію (49,1 мг, 2,049 ммоль) і реакційну суміш перемішували при 657 протягом 1 години і концентрували у вакуумі з отриманням прозорої жовтої рідини. Неочищену рідину очищали препаративною ВЕРХ з отриманням ТЕА солі вказаної в заголовку сполуки (142 мг, 0,223 ммоль, 65,3 95 вихід) у вигляді бежевої твердої речовини.

Приклад 5: Кристалічний 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-З-іл)- 1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (1) Форма 2

Сполуку 1 Прикладу 1 (2,5 г) розчиняли в ОМ5О (5 мл) при 60 "С. Відразу після отримання гомогенного розчину до розчину додавали МеоН (2,5 мл). Гомогенну суміш додавали по краплях протягом 30 хвилин до попередньо змішаного розчину МеОнН (12,75 мл) і НгО (11,25 мл) при 75 "С. Після того, як вся суміш була додана, об'єднану суміш залишали для перемішування при 75 "С протягом 1 години, при цьому утворювалася кристалічна суспензія.

Додавали по краплях НО (36 мл) протягом 2 годин при 75 "С. Після завершення додавання НгО суспензію перемішували при 75 "С протягом 1 години, потім повільно охолоджували до 20" протягом 6 годин. Суспензію витримували при 20 "С ще протягом 10 годин, потім фільтрували, промивали 7095 Н2гО/МеОН (10 мл), сушили при 50"С у вакуумі протягом 18 годин з отриманням Форми 2 вказаної в заголовку сполуки (2,13 г).

Властивості твердих форм за винаходом

Зразки двох безводних форм, Форми 1 і Форми 2 1-(2-(6-(2-Етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4- фтор-1Н-індазол-3-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-ону (1) Прикладів 2 і 5, відповідно, аналізували з використанням методів рентгенівської порошкової дифракції (РХКО), диференціальної скануючої калориметрії (05С), термогравіметричного аналізу (ТОСА), динамічної сорбції вологи (ОМ) і мікроскопії в поляризованому світлі. Форму 2 також аналізували методом рентгенівської дифракції монокристалів.

Приклад 6: Рентгенівська порошкова дифракція

Зо Рентгенівські порошкові дифрактограми, показані на Фіг. 1 і 6, отримували з використанням рентгенівського дифрактометра Вгикег О8-Адмапсе з Си-Ка випромінюванням (А - 1,54051 А), напругою на виході 45 кВ і струмом 40 мА. Пристрій працював в геометрії Брегга-Бретано з вхідною щілиною, щілиною розхідності і щілиною розсіювання, встановлених для максимізації інтенсивності на зразку. Для вимірювання, невелику кількість порошку (5-25 мг) обережно спресовували на тримачі зразка з отриманням рівної поверхні і піддавали рентгенівському опроміненню. Зразки сканували в режимі 29-28 від 27 до 357 в 28 з розміром кроку 0,027 ї швидкістю сканування 0,307 секунд на крок. Збір даних контролювали з використанням програми вимірювань ВгиКег Оійтасзийе і аналізували з використанням програми Чаде (версія 7.5.1). Пристрій калібрували з використанням корундового стандарту, в межах 20,02" кута два- тета. Спостережувані положення піків РХКО два-тета і міжатомний відстані показані в Таблицях 112, відповідно для кристалічної Форми 1 і кристалічної Форми 2.

Таблиця 1

РХЕО дані для кристалічної Форми 1

Продовження таблиці 1

Таблиця 2

РХЕО дані для кристалічної Форми 2

Приклад 7: Термічний аналіз

Диференціальну скануючу калориметрію (052) здійснювали з використанням модуля ТА

Іпвіпитепів Моде! О0-100 з контролером ТПепта! Апаїубї. Дані збирали і аналізували з використанням програми ТА Іпзігитепіб5 Тпепта! Апаїузі5. Зразок кожної кристалічної форми точно відважували в закриту кришкою алюмінієву чашу. Після 5-хвилинного періоду ізотермічного урівноваження при 5 "С зразок нагрівали, використовуючи лінійне підвищення температури 10 "С/хв. від 0 "С до 300 "С.

Репрезентативна Ю5С термограма Форми 1 кристалічної вільної форми за винаходом показана на Фіг. 7. Термограма диференціальної скануючої калориметрії (055), отримана при швидкості нагрівання 10 "С на хвилину, демонструє пік в ендотермічному тепловому потоці, ідентифікований як перехід в розплав, в діапазоні від близько 210 "С до близько 234 "С, або в діапазоні від близько 215 "С до близько 229 "С, або в діапазоні від близько 220 "С до близько 224"С. Кристалічна форма характеризується термограмою диференціальної скануючої калориметрії, отриманої при швидкості нагрівання 10 "С на хвилину, яка показує максимум в ендотермічному тепловому потоці з піком при близько 221,7 "С або при 221,73 "6.

Репрезентативна Ю5С термограма Форми 2 кристалічної вільної форми за винаходом показана на Фіг. 2. Термограма диференціальної скануючої калориметрії (0550), отримана при швидкості нагрівання 10 "С на хвилину, демонструє пік в ендотермічному тепловому потоці, ідентифікований як перехід в розплав, в діапазоні від близько 268 "С до близько 277 "С, або в діапазоні від близько 270 "С до близько 275 "С, або в діапазоні від близько 271 "С до близько 274 С. Кристалічна форма характеризується термограмою диференціальної скануючої калориметрії, отриманої при швидкості нагрівання 10 "С на хвилину, яка показує максимум в ендотермічному тепловому потоці з піком при близько 272,6 "С або при 272,6:52 76.

Термогравіметричний аналіз (ТА) здійснювали з використанням модуля ТА Іпзігитепів

Моде! 0-50 з високою роздільною здатністю. Дані збирали з використанням контролера ТА

Іпзігитепієх Тпептаї Апаїузі і аналізували з використанням програм ТА Іпзігитепів Опімегзаї

Апаїузіз. Зважений зразок вміщували на платинову чашу і сканували при швидкості нагрівання 10 С від температури навколишнього середовища до 300-350 "С. Камери ваг і печі продували потоком азоту в процесі використання.

Репрезентативна ТОА крива Форми 1 кристалічної вільної форми за винаходом показана на

Фіг. 8. Крива термогравіметричного аналізу (ТОА) на Фіг. 8 не показує ніякої істотної втрати маси при температурах нижче температури початку розкладання при близько 293 "С.

Зо Репрезентативна ТОА крива Форми 2 кристалічної вільної форми за винаходом показана на

Фіг. 3. Крива термогравіметричного аналізу (ТОА) на Фіг. З не показує ніякої істотної втрати маси при температурах нижче температури початку розкладання при близько 269 "с.

Приклад 8: Оцінка методом динамічної сорбції вологи

Визначення методом динамічної сорбції вологи (0М5) здійснювали з використанням працюючих при атмосферному тиску мікроваг МТІ, системи 5СА-100 (МТІ Согр., НіаІєан, Р. 33016). Використовували зважений зразок, і на початку аналізу вологість мала найнижче можливе значення (близько 0 95 КН (відносної вологості)). ОМ5 аналіз складався з початкової стадії сушіння (0 95 КН) протягом 120 хвилин, з подальшими двома циклами сорбції і десорбції, зі швидкістю сканування 5 95 КН/стадія в діапазоні вологості від 595 КН до 9095 ВН. ЮМ5 експеримент здійснювали ізотермічно при 25 "С.

Репрезентативна крива ЮМ5 для Форми 1 кристалічної вільної форми за винаходом показана на Фіг. 9.

Кристалічна Форма 1 показала невеликий гістерезис між двома циклами сороції і десороції.

Форма 1 показала збільшення маси близько 0,99 95 в діапазоні вологості від 595 до 70 95 відносної вологості і близько збільшення маси 1,32 95 в діапазоні вологості від 5 95 до 90 95 відносної вологості при кімнатній температурі, як показано на Фіг. 9. Форма 1 вважається злегка гігроскопічною.

Репрезентативна крива ЮОМ5 для Форми 2 кристалічної вільної форми за винаходом показана на Фіг. 4. Кристалічна Форма 2 не показала ніякого гістерезису між двома циклами сорбції і десорбції і показала виключно малу схильність до гігроскопічності. Форма 2 показала збільшення маси близько 0,12 95 в діапазоні вологості від 5 95 до 70 95 відносної вологості і збільшення маси близько 0,18 95 в діапазоні вологості від 5 95 до 90 95 відносної вологості при кімнатній температурі, як показано на Фіг. 4. Форма 2 вважається негігроскопічною.

Приклад 9: Рентгенівська дифракція монокристала Форми 2

Дані збирали на Кідаки Охіога Рійтасіоп Зирегпома Юа! Зошигсе, Си аї его, АЧа5 ССО дифрактометрі, забезпеченому охолоджувальним пристроєм Охіога Стгуозузіет5 Собга. Дані збирали з використанням Си Ка-випромінювання. Структуру визначали і уточнювали з використанням пакету програм для кристалографічного аналізу ВгиКкег АХ5 ЗНЕЇГХТІ. Повну інформацію можна знайти в СІЄ. Якщо не вказане інше, атоми водню, приєднані до вуглецю, бо були розташовані геометрично і робили можливим уточнення з параметром ізотропного зміщення. Атоми водню, приєднані до гетероатомів, були розташовані в різницевій карті Фур'є, що забезпечувало можливість вільного уточнення з параметром ізотропного зміщення.

Таблиця З

Дані аналізу рентгенівської дифракції монокристала для Форми 2 111111111111вневтямяА1 00000000 вже нин СЕ НН нн СТ НИ 2 ле 6 2 2 2 2 т (льістьмоледулв елементарній ом 11380111

Діапазони індексів -12:К:20 -38хІ38

Приклад 10: Оцінка стабільності в твердому стані Форми 1

Зразки Форми 1 кристалічної вільної форми за винаходом зберігали при 25"С і 60 95 відносній вологості (КН) і при 40 "С ії 75 95 КН в двох конфігураціях а) відкритий скляний флакон і 5) закритий скляний флакон, розміщений всередині НОРЕ бутля, що містить осушувач. НОРЕ бутель індукційно запаювали. З певними інтервалами вміст репрезентативного зразка пк і аналізували методом ВЕРХ на хімічну чистоту (показана нижче як ВЕРХ чистота (90

Таблиця 4

Кристалічна Форма 1, випробування на стабільність

Часова точка 40"с/75 55вН о о 25 7с/60 вн о о ідкриттів Відкриттів з осушувачем з осушувачем 9872 98,75 98,70 98,75 98,75 ши: 98,80 98,97 98,87 98,75 99,06 98,89 99,02 98,78 98,86 98,71 98,80 98,75

МТ: не випробовували

Приклад 11: Зображення Форми 1 і Форми 2, отримане методом мікроскопії в поляризованому світлі (РІ М)

Зразки Форми 1 і Форми 2 досліджували під оптичним мікроскопом (ОіІутриз ВХ51) з крос- поляризованим світлофільтром. Зображення отримували за допомогою камери РахСат, керованої програмою Рахії Ітадіпд Зоїмаге (версія 6.4). Зразки готували на предметному склі зі світлим мінеральним маслом як імерсійним середовищем. Залежно від розміру частинок для збільшення використовували об'єктив з лінзою 4х, 10х або 20х.

Отримання 8: трет-бутил-2-йод-1-(2-(триметилсиліл)етокси)метил)-1,4,6,7-тетрагідро-5 Н- імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-карбоксилат (С-5)

М-- бото- н

ГА вм ти М, пе но. н Мне зов леж НМ. в бо ес це НС зна ! и ПСІРЕА,

С-ЖЕ бо Метанол, жімн. темп... 15 гол. ї. р, п М я о 1м масн, ме ї птн, й НК! а ай -

М. лВос МІЗ5 - й ТЕ Бос -я---- «о -к - й ни ке В й метанол, 97 о

Етавь ТЕ я свіхлтт тех і н с-Ав нн кімн. темп., -- 2-2 18 ІХ гол. І ке МАС. ман, те,

ОС до кРанНо темп... б год. шо, - тк я й и Й во С-5

До розчину сполуки С-22 (25 г, 135,86 ммоль) в 0,01 М НСІ (500 мл) додавали диметоксиметан (21,64 мл, 244,54 ммоль). Отриманий розчин перемішували при 100"

Зо протягом 18 годин. Розчинник видаляли у вакуумі і залишок розтирали в порошок два рази з діетиловим ефіром і етанолом, фільтрували і сушили з отриманням сполуки С-21 (25,2 г, 94,6 Фо вихід).

До розчину сполуки С-21 (25,0 г, 127,55 ммоль) в метанолі (250 мл) додавали ОІРЕА (57,23 мл, 318,87 ммоль) з подальшим додаванням (Вос)2гО (68,23 мл, 318,87 моль) і реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 18 годин. Отриману реакційну суміш розбавляли водою (150 мл) і екстрагували з використанням етилацетату (3х200 мл).

Об'єднаний органічний шар сушили над безводним сульфатом натрію, декантували і концентрували при зниженому тиску з отриманням неочищеного продукту С-20, який використовували на наступній стадія без додаткового очищення.

До розчину цієї неочищеної сполуки С-20 (40,0 г, 123,8 ммоль) в метанолі (500 мл) додавали 1мМ Маон розчин (200 мл) і отриманий розчин перемішували при кімнатній температурі протягом 18 годин. Розчинник відганяли у вакуумі і отриману неочищену речовину розбавляли водою (200 мл) і екстрагували з використанням етилацетату (3х300 мл). Об'єднаний органічний шар сушили над безводним сульфатом натрію і концентрували при зниженому тиску з отриманням неочищеного продукту, який очищали колонковою хроматографією (100-200 силікагель), елюювали сумішшю 5-10 96 МеонН:ОсСМ з отриманням бажаного продукту С-19 (20 г, 72,4 95 вихід).

До розчину сполуки С-19 (20 г, 89,68 ммоль) в ТНЕ (400 мл) додавали МІЗ (30,26 г, 134,52 ммоль) при кімнатній температурі і отриманий розчин перемішували протягом 2 годин при цій же температурі. Реакційну суміш розбавляли водою (200 мл) і екстрагували етилацетатом (2х300 мл), органічний шар промивали 10 95 водним розчином тіосульфату натрію (3х100 мл), потім насиченим сольовим розчином, сушили над безводним сульфатом натрію і концентрували при зниженому тиску з отриманням неочищеного продукту С-18, який використали на наступній стадії без додаткового очищення.

До розчину з'єднання, що перемішується С-18 (15,0 г, 42,97 ммоль) в ТНЕ (150 мл) додавали

Ман (1,8 9 45,11 ммоль) при 0 "С по порціях і реакційну суміш перемішували протягом 1 години при кімнатній температурі. Потім додавали по краплях ЗЕМ хлорид (8,18 мл, 45,11 ммоль) при 0 "С. Реакційну суміш перемішували протягом б годин при кімнатній температурі. Розвиток

Зо реакції відстежували за допомогою ТШХ, реакцію гасили крижаною водою (200 мл) при 0 "С і екстрагували етилацетатом (2х200 мл). Об'єднаний органічний шар промивали насиченим сольовим розчином і сушили над безводним сульфатом натрію. Органічний шар фільтрували і концентрували при зниженому тиску з отриманням неочищеного продукту, який очищали колонковою хроматографією на (100-200) силікагелі (вевлюювали сумішшю 10-15 96 ЕАс:гексан) з отриманням бажаного продукту С-5 у вигляді в'язкої рідини (11 г, 55 Об).

Отримання 9: 2-(2-етил-5-фтор-4-метоксифеніл)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-діоксаборолан (С- 12) - т вт в шия - |. о - С Ї о о вас те

Е.. п т т ей -Вц у я лу --Н-ННнНнтнм ГА. шт

Ї. -щдв я ри Її І. станол щі и й С Й що За Но -- МА С-15 її ви с-16 І щі а ? расіоррпрОсМ Б. ле во ре ма Кк нт КОде Ї Ї месм най - х о о , і кн -й у ай ве Гов-в сла -З7йта о с-14 ; .

К-2

До перемішуваної суспензії сполуки С-17 (347,6 г, 973,14 ммоль) в безводному ТНЕ (1000 мл), охолодженому до -40 "С, додавали н-бутиллітій (2,5 М в гексані, 362,6 мл, 905,02 ммоль)

протягом 50 хвилин, і при цьому зберігався характерний жовтий колір іліду фосфору. Реакційну суміш нагрівали до -10 "С і перемішували протягом 1 години, потім суміш охолоджували до - 30 "С і додавали розчин сполуки К-1 (50 г, 324,38 ммоль) в безводному ТНЕ (200 мл) протягом 30 хвилин. Отриману суміш нагрівали до температури навколишнього середовища і перемішували протягом ночі. Розвиток реакції відстежували за допомогою ТШХ. Після завершення реакцію гасили шляхом поступового додавання води (500 мл) і екстрагували діетиловим ефіром (3х500 мл). Об'єднаний органічний шар промивали водою (2х500 мл), насиченим сольовим розчином (250 мл), сушили над безводним Маг5О54 і концентрували при зниженому тиску з отриманням неочищеної сполуки. Отриманий неочищений продукт С-16 використовували на наступній стадії без очищення.

До розчину неочищеного С-16 (110 г, 723,39 ммоль) в етанолі (1000 мл) додавали 10 95 Ра/сС (50 г). Встановлювали балон газоподібного водню і реакційну суміш вакуумували і знов заповнювали воднем три рази. Реакційну суміш перемішували в атмосфері водню протягом ночі при кімнатній температурі. Після перемішування при кімнатній температурі протягом ночі реакція завершувалася. Суміш фільтрували через шар целіту і концентрували у вакуумі з отриманням неочищеної сполуки, яку очищали колонковою хроматографією на силікагелі (100- 200), елюювали з використанням суміші 3-5 95 етилацетату/гексан з отриманням бажаного продукту С-15 у вигляді безбарвної рідини (24 г, 48 95 за 2 стадії).

До розчину сполуки С-15 (24,0 г, 155,84 ммоль) в МесМ (200 мл) додавали розчин МВ5 (28,0 г, 157,40 ммоль) в Месм (100 мл). Отриманий розчин перемішували при кімнатній температурі протягом 18 годин. Розчинник видаляли у вакуумі і залишок розбавляли діетиловим ефіром (100 мл). Спостерігали утворення осадка, який видаляли фільтруванням, і фільтрат промивали водним розчином сульфіту натрію (200 мл) і насиченим сольовим розчином (100 мл), сушили над безводним сульфатом натрію і концентрували у вакуумі з отриманням бажаного продукту

С-14 у вигляді жовтого масла (35,0 г, 97 95 вихід).

До розчину сполуки С-14 (20 г, 85,836 ммоль) в діоксані (400 мл) додавали сполуку К-2 (32,69 г, 128,755 ммоль) і КОАс (25,27 г, 257,508 ммоль). Реакційну суміш дегазували азотом протягом 15 хвилин, потім додавали паладієвий каталізатор (3,5 г, 4,29 ммоль). Реакційну суміш перемішували і нагрівали при 110 "С протягом З годин. Реакційну суміш фільтрували через шар

Зо целіту і промивали етилацетатом. Фільтрат розбавляли етилацетатом (200 мл) і промивали водою (2х200 мл) і насиченим сольовим розчином (100 мл), сушили над сульфатом натрію і концентрували у вакуумі. Отриманий неочищений продукт очищали колонковою хроматографією (100-200 силікагель), елюювали сумішшю 3-5905 Е(ОАс:гексан з отриманням бажаного продукту С-12 (20 г, 83 95 вихід).

Отримання 10: 3-(диметил-станіл)-6-(2-етил-5-фтор-4-метоксифеніл)-1-(тетрагідро-2Н-піран- 2-іл)-1!Н-індазол (С-6)

а У а маш. В

Й н плн -- я Ц Тит я дет а я

Ве щих . й з ЕТЗА ВК. пе М. Ї Її Го;

ЩІ й ше ке) ТЕС ї. ший ж За ная вий

М тач М сл с-3 но раеСсеРизЬ, КО,

ОМЕНЮ

' Шк

С. ма «К. тк, ек, / у поши оо мб коді М, ; под пд М,

Й Т м Й не Гм

Фр месн Шен

С-я с-15 йод, Кон

Мк т

В! ді М н ра | | г

ЕТ ман ще «С ї в-ТвОН Ар М, их що 43 ром зей і З ; ! са нз с-7 о Я Ше й нт, : в ц їх - аеРнаХ що Ше 7 о вар и я ратРнзіь тТонмох Я КО лини ня нан Ал ! д-а Бп- с-т в І

Суміш сполуки С-13 (25 г, 126,84 ммоль), 3,4-дигідро-2Н-пірану (134,5 мл, 1471,5 мл) і р-Т5А (5,57 г, 29,18 ммоль) поглинали в ТНЕ (700 мл) і нагрівали при 60 "С протягом ночі. Реакційну суміш виливали в крижану воду і водну фазу екстрагували етилацетатом. Органічний шар сушили над сульфатом натрію і фільтрували. Фільтрат упарювали при зниженому тиску і залишок очищали на колонці з силікагелем (230-400) (евлююючи сумішшю 1-2 95 етилацетату в гексані) з отриманням бажаної сполуки С-11 (23,5 г, 67 95 вихід).

Розчин сполуки С-11 (13,3 г, 47,5 ммоль), сполуки С-12 (15,96 г, 57,0 ммоль) і КзРОх (30,21 г, 142,5 ммоль) в ОМЕ:НгО (396:99 мл) дегазували азотом протягом 15 хвилин, потім додавали паладієвий каталізатор (1,6 г, 2,37 ммоль) і реакційну суміш продували азотом протягом 5 хвилин. Отриману реакційну суміш нагрівали при 100 "С протягом 12 годин при постійному перемішуванні. Реакційну суміш фільтрували через шар целіту і промивали етилацетатом.

Фільтрат розбавляли етилацетатом (200 мл), екстрагували за допомогою ЕАс (2х100 мл) і промивали холодною водою (100 мл) і насиченим сольовим розчином (50 мл), сушили над сульфатом натрію і концентрували у вакуумі з отриманням неочищеного продукту, який очищали флеш-хроматографією (100-200 силікагель), елюювали сумішшю 10 956 ЕІОАс:гексан з отриманням С-10 (14 г, 91,4 95 вихід).

До розчину сполуки С-10 (52 г, 146,89 ммоль) в метанолі (600 мл) додавали концентровану

НСІ (50 мл) і отриманий розчин нагрівали при 60 "С протягом ночі. Реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури і концентрували у вакуумі. Залишок розбавляли за допомогою ЕОАс (200 мл) і промивали насиченим водним розчином МанНСОз (2х150 мл).

Органічний шар сушили над Маг50О» і концентрували з отриманням бажаного продукту С-9 (35 г, 88,9 95 вихід).

До розчину сполуки С-9 (17,5 г, 64,81 ммоль) в ОМЕ (100 мл) додавали КОН (14,5 г, 259,54 ммоль) і суміш перемішували протягом 15 хвилин. Повільно додавали розчин йоду (32,7 г, 129,62 ммоль) в ОМЕ (50 мл) при 0"С і реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Розвиток реакції відстежували за допомогою ТШХ, потім реакційну суміш розбавляли водою (200 мл) і екстрагували етилацетатом (2х200 мл).

Органічний шар промивали насиченим водним розчином метабісульфіту натрію (2х150 мл) і водою (3х100 мл), сушили над Маг50» і концентрували у вакуумі з отриманням неочищеного продукту С-8 (21 г).

До розчину С-8 (21,0 г, 53,02 ммоль) в ОСМ (230 мл) додавали р-Т5оН (1,8 г, 10,60 ммоль) і суміш охолоджували до 0 "С. До цього розчину додавали по краплях з'єднання К-3 (7,04 мл, 19,54 ммоль) і реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі. ТШХ аналіз показав завершення реакції. Реакційну суміш розбавляли ОСМ (2х150 мл) і промивали насиченим водним розчином МанНСОз (200 мл) і насиченим сольовим розчином (200 мл).

Органічний шар сушили над безводним Ма»5О:4 і концентрували у вакуумі з отриманням неочищеного продукту, який очищали флеш-хроматографією з отриманням С-7.

Розчин С-7 (10,0 г, 20,83 ммоль) в толуолі (200 мл) дегазували азотом протягом 20 хвилин з подальшим додаванням К-4 (4,89 мл, 22,91 ммоль) і РЯ(РРз)4 (1,2 г, 1,04 ммоль). Реакційну суміш продували азотом ще протягом 5 хвилин і потім перемішували при 100 "С. Через 2 години

ТШХ аналіз показав завершення реакції. Реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури, фільтрували через шар Целіту і залишок промивали етилацетатом.

Концентрований фільтрат очищали колонковою хроматографією (нейтральний оксид алюмінію), елюювали сумішшю 2-5 956 Е(ОАс:гексан з отриманням продукту С-6 (6,4 г, 57,6 95 вихід).

Отримання 11: 2-(6-(2-етил-5-фтор-4-метоксифеніл)-1Н- індазол-3-іл)-4,5,6,7-тетрагідро-1 Н- імідазо|4,5-с|Іпіридин (С-3) - Ї це: С. о -я йо М «і, г.

А ду Моя Вч ок АЛ в у у - ШК ан І с св ак шо 0о-. ит М. конц. НС), диоксав, Мак а ШИ ик ЧИ; 709, 16 ч и т -- (6 2 - -- -к ї

Е тедиттом ИМИ о ФІ їх не Кос с-4 о

До розчину сполуки С-6 (6,4 г, 12,37 ммоль) в толуолі (100 мл) додавали сполуку С-5 (5,9 г, 12,37 ммоль). Реакційну суміш дегазували азотом протягом 20 хвилин з подальшим додаванням йодиду міді (І) (470 мг, 2,47 ммоль) і РА(РРз)4 (714 мг, 1,237 ммоль), потім перемішували при 100 "С протягом 12 годин. Розвиток реакції відстежували за допомогою ТШХ.

Зо Реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури і фільтрували через шар Целіту, залишок промивали етилацетатом. Органічний шар розбавляли водою, розділяли і органічну частину промивали насиченим сольовим розчином, сушили над Маг5Ох і фільтрували. Фільтрат концентрували при зниженому тиску з отриманням неочищеного продукту, який очищали колонковою хроматографією (силікагель, розмір 100-200 меш), елюювали сумішшю 20 95

ЕОАс:гексан з отриманням С-4 (4 г, 45,9 95).

До розчину сполуки С-4 (4,0 г, 5,6 ммоль) в діоксані (30 мл) додавали концентровану НСІ (30 мл). Реакційну суміш перемішували при 70 "С протягом 16 годин. Розвиток реакції відстежували за допомогою РХМС. Реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури, концентрували у вакуумі, розтирали в порошок з діетиловим ефіром і очищали препаративною ВЕРХ з отриманням бажаної сполуки С-3 (0,65 г, 29,5 Об).

Приклад 12: 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-1 Н-індазол-3-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н- імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (С-1)

о. он а рак АК

Мо кни ТЕ род ян Е

Н С н Є у среди ит у д--йфй не -дМі м-н с НМ. я ще у-МН с-

Е о о но. р но М щі | ри о (то 7" | Я мот ся тя НА нм-м й са

До суміші С-3 (180 мг, 0,460 ммоль) в ОСМ (0,5 мл) при кімнатній температурі додавали розчин 1М триброміду бору в ЮСМ (100 мл) (2,299 мл, 2,299 ммоль). Отриману суміш перемішували протягом З0 хвилин, потім концентрували. Отриманий залишок спільно упарювали з Меон (3х3,0 мл), знов розчиняли в 1:1 суміші АСОН:Н2О (3,0 мл), фільтрували і очищали зворотно-фазовою препаративною ВЕРХ. Бажані фракції об'єднували і сушили заморожуванням з отриманням С-2 (Б5-етил-2-фтор-4-(3-(4,5,6,7-тетрагідро-1Н-імідазо|4,5- с|піридин-2-іл-1 Н-індазол-б-іл)уфенол) у вигляді ТЕА солі.

До суміші С-2 ТЕА (15 мг, 0,031 ммоль) і 7" (2 еквіваленти, 0,061 ммоль) в ОМЕ (0,5 мл) при кімнатній температурі додавали НАТИи (25,5 мг, 0,067 ммоль) і СОІЕА (0,043 мл, 0,244 ммоль).

Отриману суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі. Реакційну суміш розбавляли Меон (0,5000 мл) і водою (0,500 мл). Додавали ГІОН (2,193 мг, 0,092 ммоль).

Отриману суміш нагрівали при 65 "С протягом 1 години. Реакційну суміш потім концентрували, отриманий залишок обробляли сумішшю СМ (0,500 мл) і ТЕА (0,500 мл) при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, концентрували, знов розчиняли в 1:1 суміші АСОН:Н2О (1,5 мл), фільтрували і очищали зворотно-фазовою препаративною ВЕРХ з отриманням сполуки С-1 у вигляді ТРА солі. (пт/2): (МАНІ розраховано для С27НгоЕМевОз 504,23 знайдено 505,2.

Біологічні аналізи

Сполука 1 охарактеризована в одному або декількох з наступних біологічних аналізів.

Аналіз 1: Біохімічні аналізи ЗАК кіназ

Панель з чотирьох І апіпабсгееп біохімічних аналізів ЗАК (АКТ, 2, З і Тук2) здійснювали в звичайному буфері для кіназної реакції (520 мМ НЕРЕЗ5, рН 7,5, 0,01 95 Вгі|-35, 10 мМ Мосі? і 1

ММ ЕСТА). Рекомбінантні з5Т-мічені "АК ферменти і СЕР-мічений ЗТАТІ пептидний субстрат отримували від І Ше Тесппоіодіє5.

Серійно розведену сполуку попередньо інкубували з кожним з чотирьох ЛАК ферментів і субстратом в білих 384-ямкових мікропланшетах (Согпіпду) при температурі навколишнього середовища протягом 1 години. Потім додавали АТФ для ініціювання кіназних реакцій в загальному об'ємі 10 мл, з 1 95 ЮОМ50О. Кінцеві концентрації ферментів для УАКІ, 2, З і Тук2 становили 4,2 НМ, 0,1 нМ, 1 нМ і 0,25 нМ, відповідно; відповідні використовувані Кт АТФ

Зо концентрації становили 25 мМ, З мМ, 1,6 мМ і 10 мМ; при цьому концентрація субстрату становила 200 нМ для всіх чотирьох аналізів. Кіназним реакціям давали здійснитися протягом 1 години при температурі навколишнього середовища, потім додавали 10 мкл препарати ЕОТА (кінцева концентрація 10 мМ) ії Тр-анти-р5ТАТІ (ртТуг/01) антитіло (Іїе Тесппоіодіе5, 2 нм кінцева концентрація) в ТК-ЕКЕТ буфері для розведення (Ше ТесппоЇодіе5). Планшети залишали для інкубації при температурі навколишнього середовища протягом 1 години, потім зчитували на планшет-рідері ЕпМібзіоп (РегКіп ЕІтег). Сигнали емісії (520 нм/495 нм) реєстрували і використовували для розрахунку процента інгібування на основі ОМ5О і фонових контролів.

Для аналізу доза-відповідь проценти інгібування наносили на графік проти концентрацій сполуки і ІСво значення визначали з 4-параметричної робастної моделі припасування з використанням програми Ргізхт (СгарпРайд Зоймаге). Результати виражали як ріСзо (негативний логарифм ІСво) і потім перетворювали в рКі (негативний логарифм константи дисоціації, Кі) з використанням рівняння Ченга-Прусоффа.

Сполука 1 показала наступну активність відносно ферментів.

Таблиця 5

УАК 1 ЧУАК2 УАК З Тукг рКк. рК. рК. рК.

Аналіз 2: Клітинний аналіз активності відносно АК: Інгібування 1-13

АІрпазсгееп клітинний аналіз активності відносно ЗАКІ здійснювали шляхом вимірювання інтерлейкін-13 (1-13, ВО Бувієтв)-індукованого фосфорилування ЗТАТб в епітеліальних клітинах легені людини ВЕАБ-2В (АТСС). Анти-5ТАТб антитіло (Сеї! Зідпаїйпуд Тесппоїодіе5) кон'югували з АІрпабсгееп акцепторними кульками (Регкіп ЕІтег), тоді як анти-рТАТв (ртТугб41) антитіло (Сеї! Зідпаїїпуд ТесппоїІодієз) біотинілювали з використанням Сульфо-МНО-Біотину Е7-

Пк (Тпегто 5сіепііс).

ВЕА5Б-2В клітини вирощували при 37"С в 595 СО» зволоженому інкубаторі в 50 95

ОМЕМ/50 Фо Е-12 середовищі (Ге ТесппоіІодієз), доповненому 10 95 ЕВ5З (Нусіопе), 100 Од./мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину (Се Тесппоодіев5) і 2 мМ сСішамАХ (І їе Тесппоїодіе5). У день 1 аналізу клітини висівали при щільності 7500 клітин/ямку в білі покриті полі-О-лізином 384- ямкові планшети (Согпіпду) з 25 мкл середовища і залишали в інкубаторі протягом ночі для адгезії. У день 2 аналізу середовище видаляли і замінювали на 12 мл аналітичного буфера (збалансований сольовий розчин Хенка/НнВво55, 25 ММ НЕРЕЗ і 1 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну/В5А), що містить доза-відповіді випробовуваних сполук. Сполуку серійно розводили в

РМ5О і потім знов розбавляли 1000-кратно в середовищі для доведення кінцевої концентрації

РМ5О до 0,1 95. Клітини інкубували із випробовуваними сполуками при 37 "С протягом 1 години і потім додавали 12 мкл попередньо нагрітого І--13 (80 нг/мл в аналітичному буфері) для стимуляції. Після інкубації при 37 "С протягом 30 хвилин аналітичний буфер (що містить сполуку і І--13) видаляли і додавали 10 мкл буфера для лізису клітин (25 мМ НЕРЕЗ, 0,1 95

З0О5, 1 96 МР-40, 5 мМ Масіг, 1,3 мМ ЕОТА, 1 мМ ЕСТА і доповненого інгібіторами протеаз

Сотрієїє ОПйга тіпі і Рпо55ТОР від Коспе Оіадповіїс5). Планшети струшували при температурі навколишнього середовища протягом 30 хвилин перед додаванням реагентів для детекції.

Спочатку додавали суміш біотин-анти-рЗТАТв і анти-ЗТАТб-кон'югованих акцепторних кульок і інкубували при температурі навколишнього середовища протягом 2 годин, з подальшим

Зо додаванням стрептавідин-кон'югованих донорних кульок (Регкіп ЕІтег). Після мінімум 2 годин інкубації аналітичні планшети зчитували на планшет-рідері Епмізіоп. Сигнали люмінесценції

АІрпазЗсгееп реєстрували і використовували для розрахунку процента інгібування на основі

ОМ5О і фонових контролів.

Для аналізу доза-відповідь процент інгібування наносили на графік проти концентрацій сполуки і визначали ІСво значення з 4-параметричної робастної моделі припасування з використанням програми Ргізт. Результати також можуть бути виражені як негативний логарифм ІСвзо значення, ріСво. У цьому аналізі сполука 1 показала ріСвзо значення 7,9.

Аналіз 3: Клітинний аналіз активності відносно АК: Інгібування І--2/анти-СО3- стимульованого ІЕМ-у в людських РВМС

Активність випробовуваної сполуки для інгібування інтерлейкін-2 (І-2)/анти-СОЗ3- стимульованого інтерферону гамма (ІЕМ-у) вимірювали в мононуклеарних клітинах периферичної крові людини (РВМС), виділених з людської цільної крові (гаптога Віоса Сепіег).

Оскільки І/-2 передає сигнали через АК, цей аналіз забезпечує визначення активності відносно УАК в клітинах. (1) Мононуклеарні клітини периферичної крові людини (РВМС) виділяли з людської цільної крові здорових донорів з використанням градієнта фікола. Клітини культивували в 37 "С, 5 96

Со» зволоженому інкубаторі в КРМІ (І їе Тесппоіодіє5), доповненому 10 95 термоїнактивованою фетальною бичачою сироваткою (ЕВ5, І їе Тесппоїодіє5), 2 мМ Сішатах (І їе Тесппоіодієв), 25

ММ НЕРЕБЗ (ІШе Тесппоіодіе5) і 1Х пеніциліну/стрептоміцину (Ійе Тесппоїіодіе5). Клітини висівали при щільності 200000 клітин/'ямку в середовище (50 мкл) і культивували протягом 1 години. Сполуку серійно розводили в ОМ5О і потім знов розбавляли 500-кратно (до 2-кінцевої аналізованої концентрації) в середовищі. Розведення випробовуваної сполуки (100 мкл/ямку) додавали до клітин і інкубували при 37 "С, 5 95 СО» протягом 1 години з подальшим додаванням

І -2 (К80О0 Буз(ет»5; кінцева концентрація 100 нг/мл) і анти-СОЗ (ВО Віозсіепсе5; кінцева концентрація 1 мкг/мл) в попередньо нагрітому середовищі для кількісного визначення (50 мкл) протягом 24 годин. (2) Після стимуляції цитокінами клітини центрифугували при 500 д протягом 5 хвилин і супернатанти видаляли і заморожували при -80 "С. Для визначення |інгібіторної активності випробовуваних сполук у відповідь на ІІ/-2/анти-СОЗ вимірювали концентрації ІЕМ-у в супернатанті методом ЕГІЗБА (КО Бувзіет5). ІСво значення визначали з аналізу кривих інгібування, що представляють концентрацію ІЕМ-у проти концентрації сполуки. Дані виражені як ріСво (негативний десятеричний логарифм ІСвзо) значення. У цьому аналізі сполука 1 показала ріСво значення близько 6,7.

Аналіз 4: Клітинний аналіз активності відносно ДАК: Інгібування ІІ -2-стимульованого рРетТАТ5 в Сра4-- Т-клітинах

Активність випробовуваної сполуки для інгібування інтерлейкін-2 (І-2)/анти-СОЗ3- стимульованого фосфорилування ЗТАТ5О вимірювали в СО4-позитивних (СО4-) Т-клітинах в мононуклеарних клітинах периферичної крові людини (РВМС), виділених з людської цільної крові (5бапітога Віооа Сепіег), з використанням проточної цитометрії. Оскільки ІЇ/-2 передає сигнали через ЗАК, цей аналіз забезпечує визначення активності відносно АК в клітинах. ср4- Т-клітини ідентифікували з використанням фікоеритробілін (РЕ)-кон'югованого анти-

С04 антитіла (Клон КРА-Т4, ВО Віозсіепсев5), тоді як АІеха РіІшог 647-кон'юговане анти-рТАТЬ антитіло (ру694, Клон 47, ВО Віозсіепсе5) використовували для детекції фосфорилування

ЗТАТЬ. (1) Слідували протоколу Аналізу 3, параграф (1), за винятком того, що стимуляцію цитокіном з використанням ІІ -2/анти-СОЗ здійснювали протягом 30 хвилин замість 24 годин. (2) Після стимуляції цитокінами клітини фіксували попередньо нагрітим фіксувальним розчином (200 мкл; ВО Віозсіепсе5) протягом 10 хвилин при 37 "С, 5595 СО», промивали два рази ОРВЗ буфером (1 мл, І їе ТесппоЇодіе5) і ресуспендували в крижаному Репгт Буфері ІП (1000 мкл, ВО Віозсіепсе5) протягом 30 хвилин при 4 "С. Клітини промивали два рази 2 95 ЕВ5 в

ОРВ5 (БГАСЗ5 буфер) і потім ресуспендували в ЕАС5З буфері (100 мкл), що містить анти-СО04 РЕ (1:50 розведення) і анти-СОЗ анти-СОЗАЇїеха Ріпог 647 (1:5 розведення), протягом 60 хвилин при кімнатній температурі в темряві. Після інкубації клітини промивали два рази в ЕАС5 буфері,

Зо потім аналізували з використанням проточного цитометра ГКІ (ВО Віозсіеєпсе5). Для визначення |інгібіторної активності випробовуваної сполуки у відповідь на ІІ -2/анти-СО3, вимірювали середню інтенсивність флуоресценції (МЕ!) реТАТ5 в СО4- Т-клітинах. ІСво значення визначали з аналізу кривих інгібування, що представляють МЕЇ проти концентрації сполуки. Дані виражені як ріСво (негативний десятеричний логарифм ІСзо) значення. У цьому аналізі сполука 1 показала ріСво значення близько 7,7.

Аналіз 5: Клітинний аналіз активності відносно АК: Інгібування ІІ -6б-стимульованого ССІ 2 (МОР-1) в людських РВМС

Активність випробовуваної сполуки для інгібування інтерлейкін-б (ІІ-6)-стимульованої продукції СС 2 (МСР-1) вимірювали в мононуклеарних клітинах периферичної крові людини (РВМС5), виділених з людської цільної крові ((аптога Віооа Сепіег). Оскільки І/-6 передає сигнали через АК, цей аналіз забезпечує дистальне визначення активності відносно УАК в клітинах. (1) Слідували протоколу Аналізу 3, параграф (1), для інкубації із випробовуваними сполуками. У цьому аналізі після додавання в ямки випробовуваних сполук і інкубації додавали

І/-6 (К8О Бузіетв5; кінцева концентрація 10 нг/мл) в попередньо нагрітому середовищі для кількісного визначення (50 мкл). (2) Після стимуляції цитокінами протягом 48 годин клітини центрифугували при 500 4д протягом 5 хвилин і супернатанти видаляли і заморожували при -80 "С. Для визначення інгібіторної активності випробовуваної сполуки у відповідь на І/-6 вимірювали концентрації

ССІ2 в супернатанті (МСР-1) методом ЕГІЗА (КО зузіептв). ІСво значення визначали з аналізу кривих інгібування, що представляють концентрацію ССІ 2/МОСР-1 проти концентрації сполуки.

Дані виражені як ріСво (негативний десятеричний логарифм ІСзо) значення. У цьому аналізі сполука 1 показала ріСво значення близько 6,4.

Аналіз 6: Клітинний аналіз активності відносно ЗАК: Інгібування ІЄМ-у-індукованого роТАТ1

Активність випробовуваної сполуки для інгібування інтерферон гамма (ІЄМ-у)- стимульованого фосфорилування ЗТАТІ вимірювали в СО14-позитивних (СО14-) моноцитах, виділених з людської цільної крові (Збйапіога Віоо4 Сепіег), з використанням проточної цитометрії. Оскільки ІЕМ-у передає сигнали через ЗАК, цей аналіз забезпечує визначення активності відносно УАК в клітинах. бо Моноцити ідентифікували з використанням флуоресцеїнізотиоціанат (РІТС)-кон'югованого анти-СО14 антитіла (Клон ЕМО52, ВесКктап СошйКег), а АІеха Рісог 647-кон'юговане анти-р5ТАТІ антитіло (рЖ701, Клон 4а, ВО Віозсіепсе5) використовували для детекції фосфорилування

ЗТАТІ1.

Мононуклеарні клітини периферичної крові людини (РВМС) виділяли з людської цільної крові здорових донорів з використанням градієнта фікола. Клітини культивували в 37 "С, 5 96

СО» зволоженому інкубаторі в ЕРМІ (Се Тесппоїодіе5), доповненої 10 95 фетальної бичачої сироватки (ЕВ5, І Ше Тесппоодіеб5), 2 мМ Сішатах (Іїе ТесппоІодіе5), 25 мМ НЕРЕЗ (І їе

Тесппоподіев5) і 1Х пеніциліну/стрептоміцину (І їе Тесппоіодіє5). Клітини висівали при щільності 250000 клітин/ямку в середовище (200 мкл), культивували протягом 2 годин і ресуспендували в середовищі для кількісного визначення (50 мкл) (КРМІ, доповненої 0,195 бичачого сироваткового альбуміну (Зідта), 2 мМ Сішатах, 25 мМ НЕРЕЗ і 1Х пеніциліну/стрептоміцину), що містить різні концентрації випробовуваних сполук. Сполуку серійно розводили в ОМ5О і потім знов розбавляли 1000-кратно в середовищі для доведення кінцевої концентрації ОМ5О до 0,1 95. Розведення випробовуваної сполуки інкубували з клітинами при 37 "С, 5 95 СО», протягом 1 години з подальшим додаванням попереднє нагрітого ІЄМ-у (К8О Бузіетв) в середовищі (50 мкл) при кінцевій концентрації 0,6 нг/мл протягом 30 хвилин. Після стимуляції цитокінами клітини фіксували попередньо нагрітим фіксуючим розчином (100 мкл) (ВО Віозсіепсев5) протягом 10 хвилин при 37 "С, 5 95 СО», промивали два рази ЕАС5 буфером (1 мл) (1 95 ВБА в

РВ5), ресуспендували в суміші 1:10 анти-СО14 РІТС:РАС5 буфер (100 мкл) і інкубували при 4 "С протягом 15 хвилин. Клітини промивали один раз і потім ресуспендували в крижаному

Регт Буфері ІП (ВО Віозсіепсе5) (100 мкл) протягом 30 хвилин при 4 "С. Клітини промивали два рази ЕАСЗ буфером і потім ресуспендували в суміші 1:10 анти-рРОТАТІ АЇеха Рійог 647:"єАС5 буфер (100 мкл) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі в темряві, промивали два рази в

ЕАСЗ буфері і аналізували з використанням проточного цитометра І КІ! (ВО Віозсіепсев).

Для визначення |інгібіторної активності випробовуваної сполуки середню інтенсивність флуоресценції (МЕ) р2ТАТІ1 вимірювали в СО14-- моноцитах. ІСво значення визначали з аналізу кривих інгібування, що представляють МРЇ проти концентрації сполуки. Дані виражені як ріСзо (негативний десятеричний логарифм ІСво) значення. У цьому аналізі сполука 1 показала ріСво значення близько 7,1.

Зо Аналіз 7: Фармакокінетика в очній тканині кролика

Метою цього аналізу було визначення фармакокінетики випробовуваної сполуки в очних тканинах кролика.

Композиція розчину 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1 Н-індазол-3-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н- імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (1), отриманий в Прикладі 2, розчиняли в 2 95 2-гідроксипропіл-В-циклодекстрині до досягнення цільової концентрації 1 мг/мл. Білатеральну інтравітреальну ін'єкцію (50 мкл/око) розчину випробовуваної сполуки вводили новозеландським білим кроликам (50 мкг/око). Концентрацію випробовуваної сполуки вимірювали в очних тканинах: скловидному тілі, внутрішньоочній рідині, сітківці/судинній оболонці і іридо-циліарній зоні в попередньо визначених точках часу після ін'єкції (30 хвилин, 4 год., 1 д, З д, 7 д, 14 д). Введення здійснювали двом кроликам (чотири ока) для кожної часової точки. У тканині скловидного тіла сполука 1 показала двофазне зниження концентрації, що характеризується початковим зниженням концентрації з періодом напівжиття приблизно 9 годин і на завершення з кінцевим періодом напівжиття приблизно 2 дні. Було виявлено, що сполука також швидко розподіляється в сітківці і в судинній оболонці і показує такий же фармакокінетичний профіль, як в тканині скловидного тіла.

Композиція суспензії

Композицію суспензії отримували шляхом об'єднання сполуки 1 Прикладу 2 (Форма 1) з 0,5 95 гідроксипропілметилцелюлози (НРМС Е5) ж 0,02 95 Туееєп 80 в фізіологічному розчині до досягнення цільової концентрації 5 мг/мл, 20 мг/мл і 80 мг/мл для доз 0,25 мг/око, 1 мг/око і 4 мг/око, відповідно. Білатеральну інтравітреальну ін'єкцію (50 мкл/око) суспензії випробовуваної сполуки вводили новозеландським білим кроликам. Концентрацію випробовуваної сполуки вимірювали в очних тканинах, як в аналізі композиції розчину, через 30 хвилин, 4 год., 24 год., 72 год., 7 д, 14 д, 28 д, 56 д і 84 д після ін'єкції. Для групи введення дози 4 мг/око також збирали дані в додатковій часовій точці через 168 днів. Всі дозові групи показали вимірювану концентрацію лікарського засобу в оці аж до останньої часової точки, що аналізується в цьому дослідженні. Стійку тривалу експозицію спостерігали для всіх доз через 12 тижнів (84 дні).

Тривалу експозицію спостерігали через 24 тижні (84 дні) для дозової групи 4 мг/око. Сполука показала лінійне зниження концентрації лікарського засобу в тканині скловидного тіла від 30 60 хвилин до 24 тижнів при швидкості виведення лікарського засобу приблизно 5-10 мкг/мл/день.

Швидкість виведення відповідає розчинності сполуки 1 в носії і фармакокінетиці в очних тканинах при використанні композиції розчину. Всі дозові групи показали вимірювану концентрацію лікарського засобу в оці аж до останньої часової точки, що аналізується в цьому дослідженні. Тому цілком ймовірно, що експозиція лікарського засобу є більш тривалою, ніж спостережувана в цьому дослідженні. Вимірювали концентрацію лікарського засобу в плазмі і було знайдено, що вона щонайменше на З порядки величини нижча, ніж концентрація в тканині скловидного тіла, при всіх трьох концентраціях.

Композицію суспензії отримували шляхом об'єднання сполуки 1 Прикладу 5 (Форма 2) з 0,5 95 гідроксипропілметилцелюлози (НРМС Е5) ж 0,02 95 Туееєп 80 в фізіологічному розчині до досягнення цільової концентрації 0,4 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл і 20 мг/мл для доз 0,02 мг/око, 0,05 мг/око, 0,1 мг/око і 1 мг/око, відповідно. Білатеральну інтравітреальну ін'єкцію (50 мкл/око) суспензії випробовуваної сполуки вводили голландським кроликам. Концентрацію випробовуваної сполуки вимірювали в рідкій частині скловидного тіла, внутрішньоочній рідини, іридо-циліарній зоні, сітківці, клітинах пігментного епітелію сітківки/хороїдальних клітинах і плазмі через 30 хв., 7 д, 14 д, 28 д, 42 д і 56 д після ін'єкції. Сполука показало дуже поступове зниження концентрації лікарського засобу в тканині скловидного тіла від 30 хвилин до останньої аналізованої часової точки (28 д для дози 0,02 мг/око, 42 д для дози 0,05 мг/око і доз 1 мг/око і 56 д для дози 0,1 мг/око). Всі дозові групи показали вимірювану концентрацію лікарського засобу в оці аж до останньої часової точки, що аналізується в цьому дослідженні. Тому цілком ймовірно, що експозиція лікарського засобу є більш тривалою, ніж спостережувана в цьому дослідженні. Вимірювали концентрацію лікарського засобу в плазмі, і було знайдено, що вона щонайменше на З порядки величини нижча, ніж концентрація в тканині скловидного тіла, при всіх трьох концентраціях. З порядки величини відповідають логарифмічній шкалі (тобто 1000 по нелогарифмічній шкалі).

Аналіз 8: Фармакодинамічний аналіз: Інгібування ІІ б-індукованого ретТАТЗ у щурів

Здатність випробовуваної сполуки при разовому інтравітреальному введенні інгібувати ІІ -6- індукований роТАТЗ вимірювали в гомогенатах сітківки/судинної оболонки щурів.

Композицію суспензії отримували шляхом об'єднання сполуки 1 Прикладу 2 з 0,595 гідроксипропілметилцделюлози (НРМСОС Е5 ІМ), 0,02 95 Тмееп 80 і 9 мг/мл хлориду натрію в

Зо очищеній воді до досягнення цільової концентрації 10 мг/мл.

Самицям щурів Гемі5 інтравітреально (і/в) вводили (5 мкл/око) композицію суспензії. Через три дні інтравітреально вводили 1-6 (Рергоїесй; 0,1 мг/мл; 5 мкл/око) або носій для індукції рОТАТЗ. Очні тканини вирізали через одну годину після другої і/в ін'єкції І/-б6. Тканини сітківки/судинної оболонки гомогенізували і рівні РОТАТЗ вимірювали з використанням ЕГІЗА (Се! Зідпаїйпоа Тесппоіоду). Процент інгібування ІІ-6б-індукованого рЗТАТЗ розраховували порівняно з групами носій/носій і носій/ІІ -6. Інгібування більше ніж 100 95 відображає зниження рівнів РТАТЗ до нижче за ті, які спостерігали в групі носій/носій.

При попередньому лікуванні за З дня до ІІ-б-стимуляції доза 50 мкг сполуки 1, що вводиться з використанням композиції суспензії, інгібувала ІІ-6б-індукований реТАТЗ на 116 95 в тканині сітківки/судинної оболонки.

Аналіз 9: Фармакодинамічний аналіз: Інгібування ІЕМ-у-індукованого ІР-10 в очах кролика

Здатність випробовуваної сполуки при разовому інтравітреальному введенні інгібувати інтерферон-гамма (ІЕМ-у)-індуковані рівні ІР-10 білка вимірювали в скловидному тілі і тканинах сітківки/судинної оболонки кролика.

Композицію суспензії отримували шляхом об'єднання сполуки 1 Прикладу 2 (Форма 1) з 0,5 95 гідроксипропілметилцелюлози (НРМС Е5), 0,02 90 Тмееєп 80 і 9 мг/мл хлориду натрію в очищеній воді до досягнення цільової концентрації 20 мг/мл.

Для досліджень використали самців новозеландських білих кроликів (ІГімеоп Віоїаб», Іпаіа).

Тваринам давали акліматизуватися після їх доставки в лабораторію для проведення досліджень (Гімеоп Віоїаб5, Іпдіад. Кожному кролику робили дві інтравітреальні (і/в) ін'єкції із загальним об'ємом дози 50 мкл/око. Перша і/в ін'єкція (45 мкл/око) забезпечила доставку 0,9 мг випробовуваної сполуки або носія. Через один тиждень друга і/в ін'єкція (5 мкл/око) забезпечила доставку ІЕМ-у (1 мкг/око; вихідний розчин 1 мг/мл; Кіподііхпег Віоїесії) або носія для індукції ІР- 10. У день введення ін'єкцій кроликів анестезували внутрішньом'язовою ін'єкцією кетаміну (35 мг/кг) і ксилазину (5 мг/кг). При досягненні глибокої анестезії кожне око промивали стерильним фізіологічним розчином і вводили і/в ін'єкції з використанням 0,5 мл інсулінового шприца (50 одиниць-0,5 мл) з голкою 31 калібру на надназальній стороні обох очей, відмічаючи положення за допомогою фіксованого штангенциркуля Браунштейна (2 3/4") на відстані 3,5 мм від прямого м'яза і 4 мм від лімба.

Тканини збирали через 24 години після другої і/в ін'єкції ІЕМ-у. Тканини скловидного тіла (МН) ї тканини сітківки/судинної оболонки (К/С) збирали і гомогенізували, і рівні білка ІР-10 вимірювали з використанням набору СХСІ 10 (ІР-10) ЕГІЗА для кролика (Кіпоїізпег Віоїтесп).

Процент інгібування ІЄМ-у-індукованого ІР-10 розраховували порівняно з групами носій/носій і носійЛЕМ-у.

При попередньому лікуванні за 1 тиждень до ІЕМ-у-стимуляції суспензійна композиція сполуки 1 інгібувала ІЄМ-у-індукований ІР-10 на 81 95 і 8095 в скловидному тілі і тканинах сітківки/судинної оболонки, відповідно. Аналогічну ефективність також спостерігали при попередньому лікуванні за 1 місяць до ІЕМ-у-стимуляції.

Аналіз 10: Фармакокінетика в тканинах шкіри мишей і міні-свинок

Метою цього аналізу було визначення фармакокінетики випробовуваної сполуки в епідермісі, дермі і плазмі після 24-годинного впливу на шкіру інтактної миші або міні-свинки. 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1 Н-індазол-3-іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н- імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-он (1) формулювали у вигляді 0,5 9о (мас./мас.) крему або мазі, як описано, у вигляді Композиції А або Композиції В, відповідно, показаних в

Таблиці 6.

У 25 г самців мишей Ваїр/с за двадцять чотири години до введення ін'єкції збривали волосся зі спини, оголюючи площу щонайменше б см? (близько 10 95 поверхні тіла) і, в окремому експерименті, у 10 кг міні--винок Сойіпдеп оголювали площу щонайменше 450 см? (близько 10 95 поверхні тіла). У час 0, після анестезії ізофлураном, випробовувану сполуку наносили на спину мишей або міні-свинок в дозі 25 мкл/сме. Шкіру покривали адгезивним покриттям, щоб запобігти втраті сполуки, коли тварина знаходилася в клітці або на підстилці.

Після 24-годинного впливу спини обережно промивали милом і водою для видалення неабсорбованого лікарського засобу і висушували. Відразу ж після цього промивання відбирали кров шляхом серцевої пункції у мишей і венопункції у міні-свинок. Зовнішній шар (роговий шар) потім видаляли з використанням липкої стрічки. Після впливу на епідерміс робили 0,5 см пункційну біопсію. Епідермис і дерму швидко розділяли, зважували і швидко заморожували.

Подібні зразки були отримані через 48 год. після введення дози у мишей і через 48 год., 94 год. і 168 год. (7 днів) після введення дози у міні-свинок.

Зо Зразки епідермісу і дерми гомогенізували у воді 1:10 (мас./об.) з використанням ультразвукового гомогенізатора Сомагіх. Зразки екстрагували в 3 об'ємах ацетонітрилу і здійснювали кількісні визначення на основі стандартної кривої з використанням РХ-МС аналізу.

Як свідчать фармакокінетичні параметри АОСої для плазми, епідермісу і дерми, показані в наведеній нижче Таблиці 7, значна експозиція сполуки була в шарах епідермісу і дерми, в той час як експозиція в плазмі була незначною у мишей при використанні Композиції А і нижче межі кількісного визначення у мишей при використанні Композиції В ії при використанні обох

Композицій у міні-свинок.

Таблиця 6 пр ПО ефір)

ВКІУ 520 (ПЕГ 20 стеариловий 6,92 95

ПЕ Пенні ПО и ПОМАНН о МеаМетилпіролідино 7777777 1096 ЇЇ пЕГЯОЮ 77777771 лов Її ши 7777 7 717 зворотного осмосу

Таблиця 7

Плазма Епідерміс Дерма

АШОсСої АШОсСої АШсСо- мкг"год./мл) мкг"год./г) мкг"год./г) ення! ме 1ою |в

А

Міні-свинка

Міні-свинка

Аналіз 11: Фармакокінетика в легенях і плазмі у мишей

Концентрації сполуки 1 в плазмі і легенях і їх співвідношення визначали таким чином. У аналізі використовували мишей ВАГВ/с від Спагіез Кімег І арогагіез. Сполуку 1 Форми 1 прикладу 2 формулювали у вигляді суспензії в 0,01 96 Пмуееп 80 в фізіологічному розчині (0,9 Фо хлориду натрію у воді) в концентрації 0,1 мг/мл. 50 мкл суспензійного препарату вводили в трахею миші шляхом оральної аспірації. У різних часових точках (0,083, 1, 4, 24, 48, 72 і 96 годин). Після введення дози брали зразки крові шляхом серцевої пункції і у мишей вирізали інтактні легені. Зразки крові центрифугували (центрифуга Еппендорфа, 5804) протягом 4 хвилин при приблизно 12000 об./хв. при 4 "С для збору плазми. Легені сушили, промокали тампоном, зважували і гомогенізували при розведенні 1:3 в стерильній воді. Концентрації сполуки 1 в плазмі і легенях визначали аналізом РХ-МС проти аналітичних стандартів, побудованих у вигляді стандартної кривої в тестованій матриці. Хороша експозиція в легенях була виявлена при АШС (0-96 год.) 360 мкг'год./л. Період напівжиття в легенях був розрахований як такий, що становить приблизно 40 годин. Відношення легені:плазма визначали як відношення АС в мкг'год./г в легенях до АС мкг"год./мл в плазмі (де АОС звичайно визначають як площа під кривою концентрації випробовуваної сполуки залежно від часу).

Відношення АС значень легені:плазма становило 1780, що вказує на дуже низьку експозицію в плазмі.

Аналіз 12: Фармакодинамічний Аналіз: Інгібування ІЕМ-у-індукованого рО5ТАТІ1 в очах кролика

Здатність випробовуваної сполуки при разовому інтравітреальному введенні інгібувати інтерферон-гамма (ІЄМ-у)-індуковане фосфорилування ЗТАТІ білка (р5ТАТІ) вимірювали в тканині сітківки/судинної оболонки кролика.

Композицію суспензії отримували шляхом об'єднання сполуки 1 Прикладу 2 (Форма 1) з 0,5 95 гідроксипропілметилцелюлози (НРМС Е5), 0,02 90 Тмееєп 80 і 9 мг/мл хлориду натрію в очищеній воді до досягнення цільової концентрації 20 мг/мл.

Для досліджень використали самців новозеландських білих кроликів (І їмеоп Віоїабв», Іпаїа).

Зо Тваринам давали акліматизуватися після їх доставки в лабораторію для проведення досліджень (Гімеоп Віоїабв5, Іпаіа). Кожному кролику робили дві інтравітреальні (і/в) ін'єкції із загальним об'ємом дози 50 мкл/око. Перша і/в ін'єкція (45 мкл/око) забезпечила доставку 0,9 мг випробовуваної сполуки або носія. Через один тиждень друга і/в ін'єкція (5 мкл/око) забезпечила доставку ІЕМ-у (1 мкг/око; вихідний розчин 1 мг/мл; Кіподііхпег Віоїесі)) або носія для індукції ІР- 10. У день введення ін'єкцій кроликів анестезували внутрішньом'язовою ін'єкцією кетаміну (35 мг/кг) і ксилазину (5 мг/кг). При досягненні глибокої анестезії кожне око промивали стерильним фізіологічним розчином і вводили /і/в ін'єкції з використанням 0,5 мл інсулінового шприца (50 одиниць-0,5 мл) з голкою 31 калібру на надназальній стороні обох очей, відмічаючи положення за допомогою фіксованого штангенциркуля Браунштейна (2 3/4") на відстані 3,5 мм від прямого м'яза і 4 мм від лімба.

Тканини збирали через 2 години після другої і/в ін'єкції ІЕМ-у. Тканини сітківки/судинної оболонки (К/С) збирали і гомогенізували, і рівні білка РОТАТІ вимірювали з використанням кількісного вестерн-блот аналізу на пристрої Ргоїеіпзітріе УУМЕ5. Процент інгібування ІЕМ-у- індукованого роТАТІ1 розраховували порівняно з групами носій/носій і носійЛЕМ-у.

При попередньому лікуванні за 1 тиждень до ІЕМ-у-стимуляції суспензійна композиція сполуки 1 інгібувала ІЄМ-у-індукований роТАТІ на 85 95. Після попереднього введення разової дози суспензійної композиції за З місяці до ІЕМ-у-стимуляції суспензійна композиція сполуки 1 інгібувала ІЕМ-у-індукований реТАТІ на 76 95.

Композицію суспензії отримували шляхом об'єднання сполуки 1 Прикладу 5 (Форма 2), з 0,5 95 гідроксипропілметилцелюлози (НРМС Е5) ж 0,02 95 Туееєп 80 в фізіологічному розчині до досягнення цільової концентрації 11,1, 3,3 і 1,1 мг/мл.

Для досліджень використали самців новозеландських білих кроликів (І їмеоп Віоїарв, Іпаїа).

Тваринам давали акліматизуватися після їх доставки в лабораторію для проведення досліджень (ибіїапі Віозу5 Ца., Іпаіа). Кожному кролику робили дві інтравітреальні (і/в) ін'єкції із загальним об'ємом дози 50 мкл/око. Перша і/в ін'єкція (45 мкл/око) забезпечила доставку 500 мкг, 150 мкг або 50 мкг випробовуваної сполуки або носія. Через два тижні друга і/в ін'єкція (5 мкл/око) забезпечила доставку ІЕМ-у (1 мкг/око; вихідний розчин 1 мг/мл; Кіподіїхпег Віоїесі) або носія для індукції ІР-10. У день введення ін'єкцій кроликів анестезували внутрішньом'язовою ін'єкцією кетаміну (35 мг/кг) і ксилазину (5 мг/кг). При досягненні глибокої анестезії кожне око промивали стерильним фізіологічним розчином і вводили і/в ін'єкції з використанням 0,5 мл інсулінового шприца (50 одиниць-О,5 мл) з голкою 31 калібру на надназальній стороні обох очей, відмічаючи положення за допомогою фіксованого штангенциркуля Браунштейна (2 3/4") на відстані 3,5 мм від прямого м'яза і 4 мм від лімба.

Тканини збирали через 2 години після другої і/в ін'єкції ІЕМ-у. Тканини сітківки/судинної оболонки (К/С) збирали і гомогенізували, і рівні білка РОТАТІ вимірювали з використанням кількісного вестерн-блот аналізу на пристрої Ргоїеіпбітріє М/Е5. Процент інгібування ІЕМ-у- індукованого роТАТІ розраховували порівняно з групами носій/носій і носійЛЕМ-у.

При попередньому лікуванні за 2 тижні до ІЕМ-у-стимуляції суспензійна композиція сполуки 1 інгібувала ІЄМ-у- індукований роТАТІ на 79 95 для дози 500 мкг, на 58 95 для дози 150 мкг і на 61 95 для дози 50 мкг.

Аналіз 13: Скринування кінома і коефіцієнт СІМІ

Сполуки 1 і С-1 скринували проти інших кіназ для оцінки їх профілю селективності.

Мічені кіназою штами фага Т7 вирощували паралельно в 24-ямкових блоках в хазяїні Е. соїїЇ, отриманому зі штаму ВІ21. Е. сої вирощували до лог-фази і інфікували Т7 фагом із замороженого штаму (множинність зараження::0,4) і інкубували при струшуванні при 32 "С до

Зо лізису (90-150 хвилин). Лізати центрифугували (6000 х д) і фільтрували (0,2 мкм) для видалення клітинного дебрису. Інші кінази були продуковані в клітинах НЕК-293 і потім помічені ДНК для

КПЛР детекції.

Покриті стрептавідином магнітні кульки обробляли біотинільованими низькомолекулярними лігандами протягом 30 хвилин при кімнатній температурі для отримання афінних смол для кіназних аналізів. Ліганд-зв'язані кульки блокували надлишком біотину і промивали блокуючим буфером (ЗеавВІіоск (Ріегсе), 1 95 В5А, 0,05 95 Тмееп 20, 1 мМ ОТ) для видалення незв'язаного ліганду і зменшення неспецифічного зв'язування з фагом. Реакції зв'язування об'єднували шляхом об'єднання кіназ, ліганд-зв'язаних афінних кульок і випробовуваних сполук в їх зв'язувальному буфері (20 95 ЗеаВіоск, 0,17 х РВ5, 0,05 95 Тмееєп 20, 6 мм ОТ). Випробовувані сполуки готували у вигляді 40х вихідних розчинів в 100 95 ЮОМ5О і безпосередньо розбавляли в аналізі. Всі реакції здійснювали в поліпропіленових 384-ямкових планшетах в кінцевому об'ємі 0,04 мл. Аналітичні планшети інкубували при кімнатній температурі при струшуванні протягом 1 години і афінні кульки промивали промивальним буфером (їх РВ5, 0,05 95 Тмееп 20). Потім кульки ресуспендували в елююючому буфері (їх РВ5, 0,0595 Тмееп 20, 0,5 мкм небіотинільованого афінного ліганду) і інкубували при кімнатній температурі при струшуванні протягом 30 хвилин. Концентрацію кінази в елюатах вимірювали кількісною ПЛР.

Сполуки скринували при 1 мкМ, і результати зв'язуючих взаємодій для первинного скринінгу в Таблицях 8 і 9 представлені як "95 інгібування" («100-((сигнал випробовуваної сполуки-сигнал позитивного контролю)/(сигнал негативного контролю)-(сигнал позитивного контролю)) х 100), де негативний контроль являє собою ЮМ5О, а позитивний контроль являє собою контрольну сполуку.

Таблиця 8 1171111 1751... | 6 | 741 9 | вв | вв | з ся 811 5 | 5 | ве | 95 | л00 | вв | єв

Таблиця 9 сшнння ДеЦнно| Ді ям як| зе | зи лот.

Сполука/Кіназа КІТ | РАКА | АЛЬФА |РІК4А4|5ІК ідо; ЗУК | МЕСЕН2 си 189) 899 | 70 | вв | 100) л0о | 78 | з

Було виявлено, що сполука 1 показує значно більш низьке інгібування зв'язування для СОК7 і СОКУ, ніж сполука С-1. Сполука 1 також мало більш низьке інгібування зв'язування для деяких інших кіназ.

Обидві сполуки 1 і С-1 скрининували проти 35 різних кіназ. Коефіцієнт СІМІ був визначений для обох сполук. Сполука 1 мала коефіцієнт СІМІ 0,62, а сполука С-1 мала коефіцієнт СІМІ 0,46.

Коефіцієнт СІМ! використовується для вираження селективності сполуки відносно панелі кіназ (Стасгук, у). Мей. Спет., 2007, 50, 5773-5779). Вище значення відповідає більш селективній сполуці.

Єдина структурна відмінність між сполукою 1 і сполукою С-1 полягає в наявності фторгрупи в ядрі. Було показано, що ця структурна відмінність істотно впливає на селективність сполуки відносно кінома.

Аналіз 14: Аналіз цитотоксичності

Се ТПіег-сіо люмінесцентнний аналіз клітинної життєздатності/цитотоксичності здійснювали в епітеліальних клітинах легені людини ВЕА5-2В (АТСС) в нормальних умовах росту.

Клітини вирощували при 37 "С в 5 95 С0О2 зволоженому інкубаторі в 50 95 ОМЕМ/50 95 Б-12 середовищі (І їе Тесппоіодіе5), доповненому 10 95 ЕВ5 (Нусіопе), 100 Од./мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину (І їе Тесппоіодіев) і 2 мм сСішамАХ (І їе Тесппоїодіє5). У день 1 аналізу клітини висівали при щільності 500 клітин/'ямку в білі 384-ямкові планшети для тканинних культур (Сопіпо) з 25 мкл середовища і залишали для адгезії протягом ночі в інкубаторі. У день 2 аналізу додавали 5 мкл середовища, що містить доза-відповіді випробовуваних сполук, і інкубували при 37 "С протягом 48 годин. Потім додавали 30 мл розчину для детекції СейПТйег-

СіІо (Рготеда), змішували на орбітальному шейкері протягом 5 хвилин і інкубували ще протягом 10 хвилин, потім зчитували на планшет-рідері Епмізіоп. Реєстрували сигнали люмінесценції і розраховували контрольні значення процента ОМ5О.

Для аналізу доза-відповідь контрольні дані процента ОМ5О наносили на графік проти концентрацій сполуки для отримання кривих доза-відповідь, проводячи лінію, що з'єднує кожну точку даних. Концентрацію, при якій кожна крива перетинає поріг 15 95 інгібування, визначають

Зо як СС.

Як очікують випробовувані сполуки, що демонструють вище Сс':5 значення в цьому аналізі, менш ймовірно можуть викликати цитотоксичність.

Сполука 1 показала СсС;і5 значення, яке дорівнює 3,16 мкМ, тоді як сполука С-1 показала

СС.» значення, яке дорівнює 630 нМ. Тому, на основі цього аналізу, сполука 1 із значно меншою імовірністю буде викликати цитотоксичність, ніж сполука С-1.

Єдиною структурною відмінністю між сполукою 1 і сполукою С-1 є присутність фторгрупи в ядрі. Ця структурна відмінність, як було показано, істотно впливає на цитотоксичність сполуки.

Хоча даний винахід був описаний з посиланням на конкретні аспекти або варіанти його здійснення, фахівцям в даній галузі техніки повинно бути зрозумілим, що можливі різні зміни, або можна використовувати замінюючі еквіваленти без відхилення від суті і об'єму винаходу.

Крім того, в тій мірі, в якій це допускається застосовними патентними законами і положеннями, всі публікації, патенти і патентні заявки, процитовані в даній заявці, включені в дану заявку за допомогою посилання у всій їх повноті в тій же мірі, як якби кожний документ був окремо включений в дану заявку за допомогою посилання.

Claims (43)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Сполука формули Е но і Е о ро НМ жк або її фармацевтично прийнятна сіль.

2. Сполука формули: Е но Ф); о З Ан М "М М рили й

3. Кристалічна форма сполуки формули: Е но і Е о ро ГА ру ЧИ й нм-м М ща де кристалічна форма характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою, що містить дифракційні піки при значеннях 29 10,61-20,20, 11,84:20,20, 14,94:20,20, 18,26:20,20 і 19,06:0,20.

4. Кристалічна форма за п. З, де рентгенівська порошкова дифрактограма додатково характеризується тим, що має додаткові дифракційні піки при значеннях 289 13,32:50,20, 17,69:0,20 і 21,1020,20.

5. Кристалічна форма за п. 4, де рентгенівська порошкова дифрактограма додатково характеризується тим, що має два або більше додаткових дифракційних піків при значеннях 29, вибраних з 10,85:-0,20, 16,14-0,20, 16,35:20,20, 18,43:20,20, 19,2030,20, 19,49-40,20, 20,7250,20, 21,9450,20, 22,64:30,20, 23,640,20, 25,1940,20 і 28,08:-0,20.

б. Кристалічна форма за п. 3, де кристалічна форма характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою, на якій положення піків по суті відповідають положенням піків на дифрактограмі, показаній на Фіг. 1.

1. Кристалічна форма за п. 3, де кристалічна форма характеризується кривою диференціальної скануючої калориметрії отриманою при швидкості нагрівання 10 "С на хвилину, яка представляє максимум в ендотермічному тепловому потоці при температурі між 268 і 277 76.

8. Кристалічна форма за п. 3, де кристалічна форма характеризується кривою диференціальної скануючої калориметрії отриманою при швидкості нагрівання 10 "С на хвилину, яка Зо представляє максимум в ендотермічному тепловому потоці з піком при 272,6:2 76.

9. Кристалічна форма за п. 3, де кристалічна форма характеризується кривою диференціальної скануючої калориметрії по суті відповідно до кривої, показаної на Фіг. 2.

10. Кристалічна форма сполуки формули:

Е но дЕ / «І Е о (о Ще М я - - М нМ-ю Н де кристалічна форма характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою, що містить дифракційні піки при значеннях 29 8,16:0,20, 8,97-0,20, 15,29:0,20, 16,7050,20, 18,0050,20 і 20,18:2-0,20.

11. Кристалічна форма за п. 10, де рентгенівська порошкова дифрактограма додатково характеризується тим, що має два або більш додаткових дифракційних піків при значеннях 28, вибраних з 7,69-0,20, 10,66:50,20, 11,46:30,20, 11,91-0,20, 15,80-0,20, 17,02520,20, 18,83:50,20, 22,3950,20, 22,98:0,20, 24,89:20,20 і 26,5450,20.

12. Кристалічна форма за п. 10, де кристалічна форма характеризується порошковою рентгенівською дифрактограмою, на якій положення піків по суті відповідають положенням піків на дифрактограмі, показаній на Фіг. 6.

13. Кристалічна форма за п. 10, де кристалічна форма характеризується кривою диференціальної скануючої калориметрії отриманою при швидкості нагрівання 10 С на хвилину, яка представляє максимум в ендотермічному тепловому потоці при температурі між 2151229 76.

14. Кристалічна форма за п. 10, де кристалічна форма характеризується кривою диференціальної скануючої калориметрії отриманою при швидкості нагрівання 10 С на хвилину, яка представляє максимум в ендотермічному тепловому потоці з піком при 221,73 76.

15. Кристалічна форма за п. 10, де кристалічна форма характеризується кривою диференціальної скануючої калориметрії по суті відповідно до кривої, показаної на Фіг. 7.

16. Фармацевтична композиція, яка містить сполуку за п. 1 або 2 або кристалічну форму за будь-яким з пп. 3-15 і фармацевтично прийнятний носій.

17. Фармацевтична композиція за п. 16, де композиція є прийнятною для очного застосування.

18. Фармацевтична композиція за п. 17, де композиція є прийнятною для інтравітреальної ін'єкції.

19. Фармацевтична композиція за п. 18, де композиція являє собою суспензію.

20. Спосіб отримання сполуки формули 1 Е НО ше - сума чи: З т КУ не: А. А М.

М. ве и? ж те о х р Ме й М те у кі лу і ш-- я нен і або її фармацевтично прийнятної солі, який включає: Зо (а) взаємодію сполуки формули 6: Е но ох р Е ! Т М. ев їй "м Ки ННЧ-М Я б зі сполукою формули 7:

о го соди щи ще су ме ва 7 де ВА являє собою водень або 2,5-діоксопіролідиніл, і (Б) необов'язково отримання фармацевтично прийнятної солі, з отриманням сполуки формули 1 або її фармацевтично прийнятної солі.

21. Сполука формули 6 Е НО шен, 5 ре , й

Тф-. ту і ние що ще ке и нк- Я 6 або її сіль.

22. Спосіб отримання кристалічної форми за п. 3, який включає: (а) утворення гомогенної суміші 1-(2-(6-(2-етил-5-фтор-4-гідроксифеніл)-4-фтор-1Н-індазол-3- іл)-1,4,6,7-тетрагідро-5Н-імідазо|4,5-с|Іпіридин-5-іл)-2-морфоліноетан-1-ону в полярному апротонному розчиннику або в полярному змішуваному з водою розчиннику, або в суміші полярного апротонного розчинника і полярного змішуваного з водою розчинника, при температурі між 45 і 75 70; (б) додавання гомогенної суміші до суміші змішуваного з водою розчинника і води при температурі між 60 і 90 "С з отриманням другої суміші; (с) повільне додавання води до другої суміші при температурі між 60 і 90 "С з отриманням суспензії; і (а) виділення кристалічної форми з суспензії.

23. Спосіб за п. 22, де полярний апротонний розчинник стадії (а) вибраний з групи, яка складається з ОМ5ЗО, ОМЕ, ММР, ОМАс і нітрометану, полярний змішуваний з водою розчинник стадії (а) вибраний з групи, яка складається з ацетонітрилу, ацетону, метанолу, етанолу і ТНЕ, і змішуваний з водою розчинник стадії (б) вибраний з групи, яка складається з ацетонітрилу, ацетону, метанолу, етанолу, н-пропанолу, ізопропанолу, н-бутанолу, ТНЕ, ОМ5О, ОМЕ, ММР, ОМАс і нітрометану.

24. Сполука за п. 1 або 2 або кристалічна форма за будь-яким з пп. 3-15 для застосування в лікуванні очного захворювання у ссавця.

25. Сполука або кристалічна форма за п. 24, де очне захворювання являє собою увеїт, діабетичну ретинопатію, діабетичний макулярний набряк, синдром сухого ока, вікову дегенерацію жовтої плями, оклюзію вени сітківки або атопічний кератокон'юнктивіт. Зо

26. Сполука або кристалічна форма за п. 25, де очне захворювання являє собою діабетичний макулярний набряк або увеїт.

27. Застосування сполуки за п. 1 або 2 або кристалічної форми за будь-яким з пп. 3-15 для отримання лікарського засобу для лікування очного захворювання у ссавця.

28. Застосування за п. 27, де очне захворювання являє собою увеїт, діабетичну ретинопатію, діабетичний макулярний набряк, синдром сухого ока, вікову дегенерацію жовтої плями, оклюзію вени сітківки або атопічний кератокон'юнктивіт.

29. Спосіб лікування очного захворювання у ссавця, який включає введення фармацевтичної композиції, що містить сполуку за п. 1 або 2 або кристалічну форму за будь-яким з пп. 3-15 і фармацевтично прийнятний носій, в око ссавця.

30. Спосіб за п. 29, де очне захворювання являє собою увеїт, діабетичну ретинопатію, діабетичний макулярний набряк, синдром сухого ока, вікову дегенерацію жовтої плями, оклюзію вени сітківки або атопічний кератокон'юнктивіт.

31. Спосіб за п. 30, де очне захворювання являє собою увеїт або діабетичний макулярний набряк.

32. Сполука за п. 1 або 2 або кристалічна форма за будь-яким з пп. 3-15 для застосування в лікуванні запального захворювання шкіри у ссавця.

33. Сполука або кристалічна форма за п. 32, де запальне захворювання шкіри являє собою атопічний дерматит.

34. Застосування сполуки за п. 1 або 2 або кристалічної форми за будь-яким з пп. 3-15 для отримання лікарського засобу для застосування в лікуванні запального захворювання шкіри у ссавця.

35. Застосування за п. 34, де запальне захворювання шкіри являє собою атопічний дерматит.

36. Спосіб лікування запального захворювання шкіри у ссавця, який включає нанесення фармацевтичної композиції, що містить сполуку за п. 1 або 2 або кристалічну форму за будь- яким з пп. 3-15 і фармацевтично прийнятний носій, на шкіру ссавця.

37. Спосіб за п. 36, де запальне захворювання шкіри являє собою атопічний дерматит.

38. Сполука за п. 1 або 2 або кристалічна форма за будь-яким з пп. 3-15 для застосування в лікуванні респіраторного захворювання у ссавця.

39. Сполука або кристалічна форма за п. 38, де респіраторне захворювання являє собою астму, хронічну обструктивну хворобу легень, кістозний фіброз, пневмоніт, ідіопатичний легеневий фіброз, гостре пошкодження легень, гострий респіраторний дистрес-синдром, бронхіт, емфізему, відторгнення трансплантата легені, первинну дисфункцію трансплантата, організуючу пневмонію, гостре відторгнення трансплантата легені, лімфоцитарний бронхіоліт, хронічну дисфункцію алотрансплантата легені, рестриктивну хронічну дисфункцію алотрансплантата легені, нейтрофільну дисфункцію алотрансплантата або облітеруючий бронхіоліт.

40. Сполука або кристалічна форма за п. 39, де респіраторне захворювання являє собою астму, хронічну дисфункцію алотрансплантата легені або хронічну обструктивну хворобу легень.

41. Застосування сполуки за п. 1 або 2 або кристалічної форми за будь-яким з пп. 3-15 для отримання лікарського засобу для лікування респіраторного захворювання у ссавця.

42. Застосування за п. 41, де респіраторне захворювання являє собою астму, хронічну обструктивну хворобу легень, кістозний фіброз, пневмоніт, ідіопатичний легеневий фіброз, гостре пошкодження легень, гострий респіраторний дистрес-синдром, бронхіт, емфізему, відторгнення трансплантата легені, первинну дисфункцію трансплантата, організуючу пневмонію, гостре відторгнення трансплантата легені, лімфоцитарний бронхіоліт, хронічну дисфункцію алотрансплантата легені, рестриктивну хронічну дисфункцію алотрансплантата легені, нейтрофільну дисфункцію алотрансплантата або облітеруючий бронхіоліт. Зо 43. Спосіб лікування респіраторного захворювання у ссавця, який включає введення ссавцеві фармацевтичної композиції, що містить сполуку за п. 1 або 2 або кристалічну форму за будь- яким з пп. 3-15 і фармацевтично прийнятний носій.

44. Спосіб за п.

43, де респіраторне захворювання являє собою астму, хронічну обструктивну хворобу легень, кістозний фіброз, пневмоніт, ідіопатичний легеневий фіброз, гостре пошкодження легень, гострий респіраторний дистрес-синдром, бронхіт, емфізему, відторгнення трансплантата легені, первинну дисфункцію трансплантата, організуючу пневмонію, гостре відторгнення трансплантата легені, лімфоцитарний бронхіоліт, хронічну дисфункцію алотрансплантата легені, рестриктивну хронічну дисфункцію алотрансплантата легені, нейтрофільну дисфункцію алотрансплантата або облітеруючий бронхіоліт.

45. Спосіб за п. 44, де респіраторне захворювання являє собою астму, хронічну дисфункцію алотрансплантата легені або хронічну обструктивну хворобу легень.

і Е д | : ж 80 | ! т 40 | ши о) і ! ! і дО і о . і ще АН ! 3 | ! ї і |; В х і 5 В 30700044 48 49 0023 97 Зм 35 260)

фіг. 1 05 пиши пи рент ре 505 Її я !

ВО. к ЕН ке З : 5 100 15 200 - За - сут дю КУ Температура (20)

Фіг. 2

З ! Я по й ПМ с 89 і І с сх Й. я

ВВ. і Я 97 5 С нен пн пи нн пн нн 0 50 100 150 200 чо ЗО Температура (20)

Фіг. З 06 ннтЕнЕчЕчТчТчьнин ще . пов В до я ней ин зе В ой нон Перша сороція о ; -й- Перша десорбнія 544 - сну Друга сорбція «а- Друга десоронія - , в прокол ротори оеперусоососоовоовотосоно о о 40 60 8о 190 Відносна вологість (бе)

Фіг. 4 сок і.» щ. ОКО Кн З о осо. о ї . г ОБ с ОЗ ПОЗ М ОХ с о. . с с пшш с о 0 по АНТ с о. о. с че 0 с є г ОК КЕ НК о В КК о. о ОО Я Б. ХО КОВО 5 о сосВ п ЗБ що ЗОН ОО ВХ ЗМН о о. ОО п У ОК до ОХ зх й о. . о - й ВО ПИ а о. о.

о. п5 с ОО шо. ОВ о. ОККО СХ ХХХ СХ ВО ОО с ОХ о. т ОО п ОН . су о. її. ОО Х ОН З ВВ КО о. о. Б о с я 5. п п КОХ ОО КК КК а ща Б с її. ОВ В ОМВК с о. с її ОО ях . З . о . о. МОЄ ООП ХМК ВОИЯ КК По ХОББІ КОВО о : о М ЗК Ох х УТ КВ Я ОЗ ОХ сх ХХ що о. о. . їх я. о су а Ж Ох У ХЕ кВ о ХО хо шо -. о.

о. ОКХ В ОО. . ХК о ОО с ОО До ОВ я ОМ КО Ох о її с 5. с . Б С М ОО с . с о. о. ОКХ ЗО ОК с МОХ ХК ХХ . с г ЖЕ о зх МОЯ Зх КОХ ЕКО ОК ОВК ОКО КО ХЕ с б с : ОО о. ь ший В о 0. шо. о то Порох ооо ЮО.: с З г п. о. : З .

с. : с ЩЕ ОВК о о ОМС ТИЖ З ОКХ МОХУ с а . о. п а п ОМ

100 ши Ж ї г с : ; в Я . Кк ї Е не я уч: Що Х во . і Ї В ЕК окр КЕ ї : Н ї ї ЩО ї А. ї я Я нс в а в в о Вс а З 7 й Ес: ж МИ пу НИЄ зе

Фіг. б Кех - ПУ у у дос еккесскн я МІНИ Не Я деки ї щоб м ж і і : Е 1: : в 04 ї. : Ка 3 Е ї . й : ну ЕХ он пен хххекккуухук юю укк у уууккккх керутттттетккт торт З БО 1 ЕК ОВ - За дов суку КИМ Темпторатура

ФГ. 7

Я, пр нн ше : х І що 85 г в Е С Ж і І : і ї кі ї хі : І о 5ББ ОБ БО 8300 БО щю Зж зі же ху МО Температува

Фіг. Я

2.0 нн ТЯ Ж ІЗ яки а ї ме З щі - Ва и ш Ма а штат Е : Й ей ем Перша сореція оця ВО саке Пернх дегорбтія В г я «ек Друга сорбнія Е ре Друга десороняя о КВ що 50 В "о Відносна кологість 159)

Фіг. 5

ПО В о. о БО сс, оС С СС ОКО пи ОО В В о Її ФД(((.- ОО М В ЗМО ММ ОМ ММ ММ ММ п, о, о. с ОО С КО МОХ п. ОК Ох З КЗ ОО ХХ КОВО ОХ ХО М МО ХХ пи с З с с о. с о. хх а. с ОО ВО В В В В ВК о.

с о. с с 5 с БО с о. у, о. о» с о с Ко БО с о п о. 0. оо С Ох о ОВ о. СКК .

0. о, о,

с 5. п о.

ОК . І КОВО о. ВОНА, ОО ОО ОКХ В КК КК В Ко ВОК у.

о. о оС С о ЗО о.

сс. с ши ССС . ооо. ЕВ о. В п. о. о. у, о о . о . пон НН НН жнг. 10