WO2005028494A1 - ５'-ホスフィチル化モノマーおよびh-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法 - Google Patents

５'-ホスフィチル化モノマーおよびh-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法 Download PDF

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WO2005028494A1
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Takeshi Wada
Yukiko Kato
Natsuhisa Oka
Kazuhiko Saigo
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Takeshi Wada
Yukiko Kato
Natsuhisa Oka
Kazuhiko Saigo
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a phosphylated nucleoside monomer, a method for producing the same, a novel H-phosphonate oligonucleotide derivative and a phosphite oligonucleotide derivative obtained by using the phosphylated nucleoside monomer, and a method for producing the same.
  • the phosphodiester method was developed by Khorana et al. In the 1960s, but the reaction was performed in the liquid phase, and the product had to be isolated at each step. there were. However, Khorana combined this method with an enzymatic method to synthesize a 77-base yeast alanine tRNA gene in 1972.
  • oligonucleotide synthesis had been automated.
  • One of the uses of synthetic oligonucleotides is pharmaceuticals, which use chemically modified DNA analogs instead of natural DNA.
  • various DNA analogs have been developed, only phosphorothioate DNA in which one of the non-bridging oxygen atoms of the phosphodiester bond has been substituted with a sulfur atom has been put into practical use.
  • phosphorothioate DNA has a strong interaction with proteins and has high cytotoxicity and side effects. Therefore, the development of new DNA analogs is required.
  • BP means a base to which a protecting group is added
  • DMTr indicates a dimethoxytrityl group.
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -endene-toluene.
  • the modification on the phosphorus atom can only be performed with group 16 elements such as oxygen, sulfur, selenium, and coordination bond porane.
  • group 16 elements such as oxygen, sulfur, selenium, and coordination bond porane.
  • the phosphonate method a wide range of modifications can be made, and DNA analogs that cannot be synthesized by the phosphoramidite method can be synthesized. This is because in the phosphoramidite method, the modification is performed via phosphite, which is a phosphite triester, whereas in the ⁇ -phosphonate method, the modification is performed oxidatively via the phosphite diester.
  • the phosphonate method is extremely useful as a method for synthesizing DNA analogs. Since various side reactions occur during the synthesis process, the disadvantage is that the yield of oligonucleotide synthesis is lower than that of the phosphoramidite method. Is pointed out. As a side reaction,
  • pivaloyl chloride (PivCI) is used as the condensing agent, the amino group at the base site is acylated (Froehler, BC-et. Al, Tetrahedron Lett., 1986, 27, 469-472). 2) Since a benzoyl group is used as a protecting group for adenosine, debrination, which is the elimination reaction of the adenine ring, occurs under acidic conditions (for example, Hayakawa, Y. et. Al, /. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12395-12401).
  • Wada et al. Developed an unprotected phosphonet method that overcomes 1)-3) (Wada, T. et. Al, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 12710-1Z 721).
  • this method first, the 3'-hydroxyl group of a nucleoside in which the 5'-hydroxyl group is protected with a dimethoxytrityl group (DMTr group) is functionally selectively phosphonylated with diphenylphosphonate to synthesize a monomer unit.
  • DMTr group dimethoxytrityl group
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, using a nucleoside 5'-phosphite as one monomer unit, the terminal of the extending chain is a phosphonyl group, thereby solving the above-mentioned problems. We found that we could solve it and completed this invention.
  • nucleotide monomer unit represented by the following general formula (1).
  • B represents a pyrimidine base, a purine base or a derivative thereof
  • R 1 represents a protecting group containing a hydrocarbon, provided that they form a ring which may be substituted with each other and which may have a substituent.
  • R 2 represents a hydrogen atom, an optionally substituted acyl group, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted trialkylsilyl group
  • R 3 are a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trialkylsilyloxy group, or a group represented by the following formula:
  • Z 1 is. Z 2, 2 3 and sigma 4 showing a methyl group are each independently of one another, identical or different, a hydrogen atom, a halogen atom, or may have a substituent Alkyl group, alkenyl group, anolequinyl group, cycloalkyl group, cycloalkenyl group, aryl group, aralkyl group, acyl group, Alkoxy group, 7-aryloxy group, aralkyloxy group, alkoxycarbonyl group, aryloxycarbonyl group, aralkyloxycarbonyl group, alkylthiocarbonyl group, alkoxythio group; reponyl group, arylalkyl carboxy group, aralkylthiocarbonyl represents group, a ⁇ Li one Ruo carboxymethyl Chio carboxymethyl sulfonyl group or ⁇ Lal kill O carboxymethyl Chio Cal Po two Honoré group, Z 5 represents an electron withdrawing group.
  • a method for producing the nucleotide monomer unit according to the first aspect of the present invention That is, in a second aspect of the present invention, there is provided a method for producing a nucleotide monomer unit represented by the following general formula (1),
  • B represents a pyrimidine base, a purine base or a derivative thereof
  • R 1 represents a protecting group containing a hydrocarbon, provided that they are cross-linked to each other to form an optionally substituted ring
  • R 2 represents a hydrogen atom, an optionally substituted acyl group, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted trialkylsilyl group
  • R 3 are a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trialkylsilyloxy group, or a group represented by the following formula:
  • Z 1 is. Z 2 showing the methyl group ', 2 3 and sigma 4, respectively, independently of one another, identical or different, a hydrogen atom, a halogen atom, or, may have a substituent Good alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, aralkyl, acyl, a Alkoxy group, aryloxy group, aralkyloxy group, alkoxyl alkoxyl group, aryloxycarbonyl group, aralkyloxycarbonyl group, alkylthiocarbonyl group, alkoxythiocarbonyl group, aryloxycarbonyl group, aralkylthiocarbonyl group, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ And z 5 represents an electron-withdrawing group. ).
  • a nucleoside represented by the following general formula (2):
  • R 1 has the same meaning as described above.
  • a 1 and A 2 are each independently of each other, identical or different, and represent a C i -C 6 alkyl group.
  • a method for producing a nucleotide monomer unit is provided.
  • R 1 is an alkyl group containing at least a secondary carbon or tertiary carbon group, an arylalkyl group containing at least a secondary carbon or tertiary carbon group, at least 2 It is preferably a diarylalkyl 'group containing a tertiary carbon or tertiary carbon group or a group containing a condensed hydrocarbon ring having two or more rings, wherein R 1 is a tributyl group, a 2-phenyl group -1, tridimethylethyl group, 2-(tonaphthyl)-1, tridimethylinoethyl group, diphenylmethyl group, 9-fluorenylmethyl group, 2-cyano -1,1 -dimethylethyl group, 9 -fluorenyl- Dimethylmethyl group, Toxic hexyldimethylmethyl group, Tribenzylmethyl group, Tricyclohexyl
  • Ph represents a phenyl group.
  • the activating agent is pyridine hydrochloride, pyridine sulfonate, pyridine borate, N- (cyanomethyl) amine sulfonate, N- (cyanomethyl) amine borate, N- ( Preference is given to (cyanomethyl) amine phosphate, imidazole sulfonate, triazole resulfonate, N-hydroxycitrazole, benzimidazole sulfonate, imidazole, triazole or tetrazole.
  • a method for removing Ri which is a protecting group, from the nucleotide monomer unit according to the first aspect of the present invention. That is, in a third embodiment of the present invention, one unit of a nucleotide monomer represented by the following general formula (1):
  • B represents a pyrimidine base, a purine base or a derivative thereof
  • R 1 represents a protecting group containing a hydrocarbon, provided that a ring which may be cross-linked to each other and has a substituent is provided.
  • R 2 represents a hydrogen atom, an optionally substituted acyl group, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted trialkylsilyl group
  • R 3 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trialkylsilyloxy group, or a group represented by the following formula:
  • Z 1 represents a methyl group.
  • Z 2 , Z 3 and Z 4 are each independently of one another and may be the same or different and may have a hydrogen atom, a halogen atom or a substituent.
  • Z 5 represents an electron-withdrawing group.
  • a 3 may have a substituent.
  • C 6 -C i which may have an alkyl group or a substituent. Represents an aryl group.
  • a phosphonate represented by the following general formula (5).
  • B represents a pyrimidine base, a purine base or a derivative thereof
  • R 3 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trialkylsilyloxy group, or Group represented by the formula
  • Z 1 represents a methyl group.
  • Z 2 , Z 3 and Z 4 are each independent of each other and are the same or different and each have a hydrogen atom, a halogen atom, or a substituent.
  • Z 5 represents an electron-withdrawing group)
  • ⁇ represents a carrier.
  • a 5′-phospho oligonucleotide derivative represented by the following general formula (7).
  • B represents a pyrimidine base, a purine base or a derivative thereof
  • R 1 represents a protecting group containing a hydrocarbon, provided that they form a ring which may be substituted with each other and which may have a substituent.
  • R 3 may be a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trialkylsilyloxy group, or a group represented by the following formula:
  • Z 1 represents a methyl group.
  • Z 2 , ⁇ 3 and 4 are each independently the same or different and are a hydrogen atom, a halogen atom, or an alkyl which may have a substituent.
  • Z 5 represents an electron-withdrawing group.
  • n an integer of 1 or more.
  • one aspect of the nucleotide monomer according to the first aspect of the present invention and the phosphonate provided in the fourth aspect of the present invention are condensed to form the present invention.
  • a method for producing a dimer which is one aspect of the fifth aspect of the present invention. That is, in one aspect of the sixth embodiment of the present invention, 2466
  • B represents a pyrimidine base, a purine base or a derivative thereof
  • R 1 represents a protecting group containing a hydrocarbon, provided that they form a ring that may be substituted with each other by bridging with each other.
  • R 3 may be a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trialkylsilyloxy group, or a group represented by the following formula:
  • Z 1 is. Z 2 showing a methyl group
  • Party B 3 and 2 4 are each, independently of one another, identical or different, a hydrogen atom, a halogen atom, or may have a substituent Alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, cycloalkenyl group, aryl group, aralkyl group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, aralkyloxy group, alkoxycarbonyl group, aryloxy carbonyl group, arral Z 5 represents a carbonyloxy group, an alkylthiocarbonyl group, an alkoxythiocarbonyl group, an arylthiocarbonyl group, an aralkylthiocarbonyl group, an aryloxycarbonyl group or an aralkyloxycarbonyl group; Represents an electron-withdrawing group.
  • a phosphonate represents a carbonyl group, an alkyl
  • the protecting group is removed from the 5′-phosphite oligonucleotide derivative according to the fifth aspect of the present invention according to the third aspect of the present invention.
  • a method for producing a 5′_phosphite oligonucleotide derivative which is condensed with one embodiment of a nucleotide monomer unit according to the first embodiment of the present invention to extend the chain. That is, in another aspect of the sixth embodiment of the present invention, there is provided a 5′-phosphorylated oligonucleotide derivative represented by the following general formula (7):
  • B represents a pyrimidine base, a purine base, or a derivative thereof
  • R 1 represents a protecting group containing a hydrocarbon, provided that they are mutually cross-linked to form a ring which may have a substituent.
  • R 3 may be a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trialkylsilyloxy group, or a group represented by the following formula:
  • Z 1 represents a methyl group.
  • Z 2 , Z 3 and Z 4 are each independently the same or different and are each a hydrogen atom, a halogen atom, or an optionally substituted alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, and a cycloalkyl group.
  • a 3 represents an optionally substituted C— (: an alkyl group or an optionally substituted C 6 to C. aryl group.]
  • a 4 is a C 1 to C 5 which may have a substituent.
  • a nucleotide monomer unit represented by the following general formula (1a) is added in the presence of a condensing agent.
  • a method for producing an it oligonucleotide derivative is provided.
  • a 5′-phosphonenet oligonucleotide derivative represented by the following formula (9).
  • B represents a pyrimidine base, a purine base or a derivative thereof
  • R 3 is a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trialkylsilyloxy group, or a compound represented by the following formula:
  • Z 1 represents a methyl group.
  • Z 2 , Z 3 and Z 4 are each independently of each other and may be the same or different and may have a hydrogen atom, a halogen atom, or a substituent.
  • R 4 represents a carrier.
  • n represents an integer of 1 or more.
  • B represents a pyrimidine base, a purine base or a derivative thereof
  • R 1 represents a protecting group containing a hydrocarbon, provided that they are cross-linked with each other to have a substituent.
  • R 3 may be a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, 1, a lialkylsilyloxy group, or the following formula:
  • Z 1 is.
  • Z 2 showing a methyl group, sigma 3 and 2 4 are each, independently of one another, identical or different, a hydrogen atom, a halogen atom, or a substituted group Group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, cycloalkenyl group, aryl group, aralkyl group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, aralkyloxy group, alkoxycarbonyl group, 7aryloxycarbonyl group, aralkyl An alkoxycarbonyl group, an alkylthiocarbonyl group, an alkoxythiocarbonyl group, an arylthiocarbonyl group, an aralkyl carbonyl group, an aryloxycarbonyl group or an aralkyloxycarbonyl group; and Z 5 represents an electron. Represents an attraction group.
  • R represents a carrier.
  • n represents an integer of 1 or more.
  • a 3 may have a substituent. . Ce to C optionally having an alkyl group or a substituent. Represents an aryl group. ]
  • a 4 is a C i to C that may have a substituent. Which may have an alkyl group or a substituted group C 6 ⁇ C. Represents an aryl group.
  • a method comprising reacting with one or more deprotecting reagents selected from the group consisting of 1,8-diazavicic mouth [5.4.0] -7-indene to remove R 1 , There is provided a method for producing the indicated 5 '-phosphonate oligonucleotide derivative.
  • B is preferably cytosine, thymine, or a derivative thereof.
  • nucleotide monomer unit represented by the following general formula (1).
  • the nucleotide monomer unit represented by the above formula (1) provided in the first aspect of the present invention is represented by the following reaction formula, and is used in the method for producing a nucleotide monomer unit provided in the second aspect of the present invention.
  • the nucleoside 5, -phosphite represented by the above formula (1) is used as the mono-unitite, the mono-unit synthesis, which is a two-step process in the conventional method and the unprotected-phosphonate method, is used. It can be obtained in one step from the corresponding nucleoside. .
  • a phosphitylating agent represented by the following general formula (3) is used.
  • the phosphitylating agent represented by the above formula (3) is preferably one which regioselectively and functionally selectively phosphitylates the 5′-position of the nucleoside represented by the above formula (2).
  • the protecting group R 1 can be eliminated.
  • R 1 preferably contains a bulky hydrocarbon group.
  • hydrocarbon groups containing at least secondary or tertiary carbon groups (E.g., an alkyl group containing at least a secondary or tertiary carbon group, an arylalkyl group, a diarylalkyl group, etc.), or a fused carbon atom having two or more rings.
  • examples include groups containing a hydrogen ring.
  • two hydrocarbon groups represented by R 1 may be cross-linked to each other to form an optionally substituted ring (for example, a 5- or 6-membered ring).
  • hydrocarbon groups may have a substituent.
  • substituent for example, CiCi. Alkyl group (e.g., methyl, Echiru, propyl, butyl, etc.), C 6 ⁇ C 1 Q Ariru group (e.g., phenyl, etc.), CC i 0 alkoxy groups (e.g., main Bok carboxymethyl, ethoxy, Purobokishi, butoxy, etc.), C 6 -C ⁇ .
  • Examples include an aryloxy group (eg, phenyloxy, naphthoxy, biphenyloxy, etc.), an amino group, a hydroxyl group, a cyano group, a halogen atom (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine) or a silyl group.
  • aryloxy group eg, phenyloxy, naphthoxy, biphenyloxy, etc.
  • an amino group eg, phenyloxy, naphthoxy, biphenyloxy, etc.
  • a cyano group e.g, a cyano group
  • a halogen atom eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine
  • R 1 represents t-butyl group, 2-phenyl-1, tridimethylethyl group, 2- (1-naphthyl) -1,1-dimethylethyl group, diphenylmethyl group, 9-fluorenylmethyl Group, 2-cyano-1, trimethylethyl group, 9-fluorenyl-dimethylmethylyl group, 1-cyclohexyldimethylmethyl group, tribenzylmethyl group, tricyclohexylmethyl group, 1-adamantyl group, di (trifluoromethyl) phenylmethyl group And a 2-trimethylsilyl-1, tridimethylethyl group or a 2-triphenylsilyl-1,1-dimethylethyl group.
  • R 1 may be cross-linked to each other to form a ring together with a phosphorus atom and two oxygen atoms, and in this case, a ring represented by the following formula can be preferably mentioned.
  • Ph represents a phenyl group.
  • a 1 and A 2 are the same or different and are a C alkyl group.
  • examples of the “rC i Ce alkyl group” include, but are not limited to, methylthio, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, and the like. Can be done.
  • a 1 and A 2 are the same or different and are preferably ethyl or isopyl pills.
  • Di (2-triphenylsilyl-1, tridimethylethyl) N, -diisopropyl phosphoramidite can be preferably used.
  • nucleoside represented by the following general formula (2) is phosphitylated with the phosphitylating agent represented by the above formula (3).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an optionally substituted acyl group, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted trialkyl Represents a silyl group.
  • the force does not limit C, _ 6 alkyl Ichiriki Ruponiru (e.g. Mechirukaruponiru, Echirukarupo sulfonyl, etc.), c 6 - 1 Q Ariru one carbonyl (e.g. Benzoiru) and Are listed.
  • examples of the “r trialkylsilyl group” include, but are not limited to, a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a t-butyldimethylsilyl group, and the like.
  • the “acyl group”, “alkyl group”, and “trialkylsilyl group” represented by R 2 may have a substituent.
  • the substituent include a C i C alkoxy group (eg, methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, etc.), and C 6 -C i.
  • Examples include an aryloxy group (eg, phenyloxy, naphthyloxy, biphenyloxy), an amino group, a hydroxyl group, a cyano group, a halogen atom (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine) or a silyl group.
  • R 2 is preferably a hydrogen atom, a benzoyl group, or a phenoxyacetyl group.
  • R 3 is a hydrogen atom, a hydroxy group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trialkylsilyloxy group, or a group represented by the following formula:
  • Z 1 represents a methyl group.
  • Z 2 , Z 3 and Z 4 are each independently of each other and may be the same or different and may have a hydrogen atom, a halogen atom, or a substituent.
  • Z 5 represents an electron-withdrawing group.
  • alkoxy group includes, but is not limited to, methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, pentyloxy and the like.
  • alkenyloxy group is not limited, but includes bieroxy, aryloxy, 1-propenyloxy, isopropenyloxy, 2-methyl-1-propenyloxy, 2-methylaryloxy, 2 One-butenyloxy and the like.
  • examples of the “acyloxy group” include, but are not limited to, C 6 -alkyl-carbonyloxy (eg, methylcarboxyloxy, ethylcarbonylcarbonyl, etc.), C, and the like.
  • Aryl-carbonyl eg benzoyloxy
  • examples of the “trialkylsilyloxy group” include, but are not limited to, a trimethylsilyloxy group, a triethylsilyloxy group, and the like.
  • alkenyl group includes, but is not limited to, vinyl, aryl, propyl, isopropyl, 2-methyl-l-butenyl, 2-methylaryl, 2-butenyl and the like. Can be mentioned.
  • alkynyl group includes, but is not limited to, ethynyl, propynyl, and petynyl.
  • cycloalkyl group includes, but is not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and the like.
  • cycloalkenyl group includes, but is not limited to, cycloprobenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, and the like.
  • aryl group examples include, but are not limited to, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, indenyl, biphenyl, anthryl, phenanthryl and the like.
  • the “aralkyl group” includes, but is not limited to, benzyl, phenethyl, diphenylmethyl, triphenylmethyl, 1-naphthylmethyl, 2-naphthylmethyl, 2,2-diphenylethyl, 3-phenylpropyl , 4-phenylbutyl, 5-phenylpentyl and the like.
  • aryloxy group examples include, but are not limited to, phenyloxy, naphthyloxy, biphenyloxy and the like.
  • examples of the “aralkyloxy group” include, but are not limited to, benzyloxy, phenethyloxy, diphenylmethyloxy, triphenylmethyloxy, 1-naphthylmethyloxy, 2-naphthylmethyloxy, 2,2-diphenylethyloxy, 3-phenylpropyl Xy, 4-phenylbutyloxy, 5-phenylpentyloxy and the like.
  • examples of the “alkoxycarbonyl group” include, but are not limited to, methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, 2-methoxyethoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, and the like.
  • examples of the “aryloxycarbonyl group” include, but are not limited to, phenoxycarbonyl, naphthoxycarbonyl, phenylphenoxycarbonyl and the like.
  • the “aralkyloxycarbonyl group” is not limited, but includes benzyloxycarbonyl, phenethyloxycarbonyl, diphenylmethyloxycarbonyl, and triphenylmethyl. Oxycarbonyl, 1-naphthylmethyloxycarbonyl, 2-naphthylmethyloxycarbonyl, 2,2-diphenylethyloxycarbonyl, 3-phenylphenyloxycarbonyl, 4-phenylbutyloxy And carbonyl, 5-phenylpentyloxycarbonyl and the like.
  • alkylthiocarbonyl group is not limited, but may be methylthiocarbonyl, ethylthiocarbonyl, propylthiocarbonyl, isopropylthiophenol, n-butylthiocarbonyl, sec Examples include monobutylthiocarbonyl, tert-butylthiocarbonyl, pentylthiocarbonyl, and hexylthiocarbonyl.
  • alkoxythiocarbonyl group examples include, but are not limited to, methoxythiocarbonyl, ethoxythiocarbonyl, 2-methoxetoxythiocarbonyl, t-butoxytitol and the like. Can be mentioned.
  • arylthiocarbonyl group examples include, but are not limited to, phenylthiocarbonyl, naphthylthiocarbonyl, and the like.
  • aralkylthiocarbonyl group Benzylthiocarbonyl, phenethylthiocarbonyl, diphenylmethylthiocarbonyl, triphenylmethylthiocarbonyl,
  • aryloxycarbonyl group examples include, but are not limited to, phenoxythiocarbonyl, naphthoxythiocarbonyl, and the like.
  • the “aralkyloxytoxycarbonyl group” is not limited, but includes benzyloxytiocarbonyl, phenethyloxytoxycarbonyl, diphenylmethyloxytoxycarbonyl, and triphenylene.
  • examples of the electron-withdrawing group include, but are not limited to, a cyano group, a nitro group, a trifluoromethyl group, a methylsulfonyl group, a benzenesulfonyl group, fluorine, and chlorine. .
  • R 3 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a methoxy group, or a group represented by the following formula:
  • Z 1 is a methyl group
  • Z 2 , Z 3 and Z 4 are each a hydrogen atom, preferably ⁇ , a cyano group or a nitro group.
  • ⁇ may be different from each other, pyrimidine bases such as thymine, cytosine and peracyl; purine bases such as adenine and guanine; Represents a derivative thereof such as 5-methylcytosine, 5-fluorouracil, and 5-hydroxymethylcytosine.
  • pyrimidine bases such as thymine, cytosine and peracyl
  • purine bases such as adenine and guanine
  • Represents a derivative thereof such as 5-methylcytosine, 5-fluorouracil, and 5-hydroxymethylcytosine.
  • dimethoxytrityl group (DMTr), benzoyl (Bz), isopropylcarbonyl (iBu), phenoxyacetyl (PAC), 4- (t-butyl) phenoxyacetyl ( BPA), aryloxy-powered luponyl (A0C), 2-[(t-butyldiphenylsilyloxy) methyl] benzoyl (SiOMB), 2- (acetylmethyl) benzoyl (AMB), 2-azidobenzoyl (AZMB), etc. May be introduced.
  • B is preferably cytosine, thymine, adenine, guanine or a derivative thereof, or a derivative having a protective group introduced therein.
  • the phosphitylating agent represented by the above formula (3) is reacted with one mole of the nucleoside represented by the above formula (2) in order to selectively react with the 5, hydroxyl group. It is preferably used in an amount of from 0.1 mol to 1.5 mol, more preferably from 0.3 mol to 1.2 mol, even more preferably from 0.5 mol to 1.0 mol.
  • an activator is used.
  • the activator include pyridin hydrochloride; pyridine sulfonate such as pyridium triflate; pyridine borate such as pyridium tetrafluoroborate; 4,5-dicyanoimidazole; and 4,5-dichloroimidazole.
  • Imidazole such as 5-benzyltetrazole, 5-ethylthio-1H-tetrazole, tetrazole such as 1H-tetrazole; imidazole sulfonate such as imidazolidium triflate; N-hydroxybenzotriazole; N-hydroxytriazole; N- (trianomethyl) trisulfonate such as benzimidazolesulfonate such as Ndzimidazole triflate; triazolsulfonate such as triazonium triflate; N- (Cyanomethyl) amine borane such as pyrrolidinum trafluoroborate Salt; N-(Shianomechiru) Pirorijiniumu Application Benefits Fuller DOO etc.
  • the activator in order to complete the reaction, is preferably used in an amount of 1 mol to 10 mol per 1 mol of the phosphitylating agent represented by the above formula (3), and 2 mol It is more preferably used in an amount of from 5 to 5 mol, and even more preferably from 2 to 3 mol.
  • an activator is added to a solution of the nucleoside represented by the above formula (2) and stirred, and then a phosphitylating agent is added and stirred, and The nucleotide monomer unit represented by (1) is obtained. It is not necessary to use the isolated nucleoside (2), and the nucleoside prepared in a solution may be used as it is.
  • the regioselectivity / functional group selectivity when phosphitylating the nucleoside represented by the above formula (2) depends on the solubility of the nucleoside in a solvent. Therefore, a solvent that can dissolve the nucleoside represented by the above formula (2) is preferable as the solvent. Examples include pyridine, a mixed solvent of pyridine and acetonitrile, a mixed solvent of pyridine and N, N-dimethylformamide, and a mixed solvent of pyridine or pyridine and acetonitrile Is preferred.
  • the volume ratio is preferably from 2 to 0.5: 1, more preferably about 1: 1.
  • the reaction temperature is preferably from ⁇ 78 ° C. to 30 ° C., more preferably from 0 ° (: to 30 ° C., even more preferably from 15 ° (: to 25 ° C.)
  • the reaction may be allowed to proceed by shutting off.
  • the pressure is atmospheric pressure.
  • Snow JP2004 / 002466 That is, a nucleotide monomer unit represented by the above general formula (1), a compound represented by the following general formula (4a), a compound represented by the following general formula (4b), and zinc bromide (ZnBr 2 ) , Magnesium bromide (MgBr 2 ), trifluoroacetic acid, trichloroacetic acid, dichloroacetic acid, 2-t-butylimino-2-ethylethylamino-1,3-dimethyl-1,3,2-diazaphosphorinane, -Butylimino) tris (dimethylamino) phosphorane, triethylamine, diisopropylethylamine, and
  • a 3 is optionally substituted. It may have alkyl group or a substituted group C 6 -C. Represents an aryl group.
  • ⁇ represents C which may have a substituent. Which may have an alkyl group or a substituted group C 6 -C i. Represents an aryl group.
  • examples of the “C 6 -C i. Aryl group” include, but are not limited to, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, indenyl, biphenylyl, anthryl, phenanthryl and the like.
  • a substituent may be introduced into “C i -C. Alkyl group” and “C 6 -C 1 Q aryl group” represented by A 3 and A 4 .
  • This substituent is, for example, CiCi. Hydrocarbon groups (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, phenyl, tolyl, xylyl, cumenyl, mesityl, naphthyl, indenyl, tolyl, xylyl, benzyl, etc.), C X ⁇ C! 0 7 Lucoxy groups (eg, methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, etc.), C 6 -C].
  • Hydrocarbon groups eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, phenyl, tolyl, xylyl, cumenyl, mesityl, naphthyl, indenyl, tolyl, xylyl, benzyl
  • Examples include an aryloxy group (eg, phenyloxy, naphthyloxy, biphenyloxy, etc.), an amino group, a hydroxyl group, a halogen atom (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine) or a silyl group.
  • aryloxy group eg, phenyloxy, naphthyloxy, biphenyloxy, etc.
  • an amino group eg, phenyloxy, naphthyloxy, biphenyloxy, etc.
  • a halogen atom eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine
  • a 3 is preferably trifluoromethyl, phenyl, p-methylphenyl, methyl, ethyl, propyl, or isopropyl.
  • the deprotecting reagent is appropriately selected depending on the protecting group R 1 in the above formula (1) to be eliminated.
  • R 1 -methyl group, 2-phenyl-1,2-dimethylethyl group, 2- (1-naphthyl) -1,1-dimethylethyl group, diphenylmethyl group, 1-cyclohexyldimethylmethyl group , Tribenzylmethyl, tricyclohexylmethyl, 1-adamantyl, di (trifluoromethyl) phenylmethyl, 2-trimethylsilyl-1,1-dimethylethyl, 2-triphenylsilyl-1,1-dimethylethyl, etc.
  • the deprotecting reagent or bromide represented by the above formula (4a) or (4b) It is preferable to use zinc (ZnBr 2 ), magnesium bromide (MgBr 2 ), trifluoroacetic acid, trichloroacetic acid, and dichloroacetic acid.
  • Examples of the deprotecting reagent represented by the above formula (4a) or the above formula (4b) include, for example, trimethylsilyl trifluoromethane sulfonate (TMSOTf), trimethylsilyl benzene sulfonate, dimethyl aluminum chloride, dimethyl aluminum chloride, diisopropyl Aluminum chloride can be preferably mentioned.
  • TMSOTf trimethylsilyl trifluoromethane sulfonate
  • TMSOTf trimethylsilyl trifluoromethane sulfonate
  • dimethyl aluminum chloride dimethyl aluminum chloride
  • diisopropyl Aluminum chloride can be preferably mentioned.
  • R 1 is a 9-fluorenylmethyl group, a 9-fluorenyl-dimethylmethyl group, a 2-cyano-1, trimethylethyl group, or the like, 2-toptylimino-2-ethylethylamino- 1,3-Dimethyl-1,3,2-diazaphosphorinane, (t-butylimino) tris (dimethylamino) phosphorane, triethylamine, diisopropylethylamine, or 1,8-diazabicyclo [5.4.0 ] It is preferable to use -7-pandecene as a deprotection reagent.
  • the deprotecting reagent is used for completing the reaction, It is preferably used in an amount of 2 to 20 mol, more preferably 3 to 10 mol, even more preferably 5 to 8 mol, per 1 mol of the nucleotide monomer unit represented by the above formula (1). .
  • R 2 has a substituent such as a benzoyl group and a phenoxyacetyl group. It is preferable that the group be a good acyl group.
  • a solution of quinuclidine octreotide monomer unit represented by the formula (1) it was added deprotecting reagent to remove the protecting group R 1 and stirred. It is not necessary to use an isolated nucleotide monomer unit (1), and one nucleotide monomer unit prepared in a solution may be used as it is.
  • the deprotection reagent is a compound represented by the above formula (4a), for example, TMSOTf
  • the deprotection reagent acts on the nucleotide monomer unit represented by the above formula (1)
  • the protecting group is deprotected. Release to form trimethylsilyl ester, producing trifluoromethanesulfonic acid. Therefore, arbitrarily, the trimethylsilyl group is removed using methanol or the like, and trifluoromethanesulfonic acid is neutralized using triethylamine (TEA) or the like.
  • TSA triethylamine
  • methanol is preferably used in an amount of 6 to 20 mol, more preferably 10 to 16 mol, per 1 mol of the nucleotide monomer unit represented by the above formula (1).
  • the reaction mechanism is shown below.
  • condensation polymerization with a new nucleotide monomer unit (la) can be performed, as described later. Chain extension becomes easier.
  • the solvent is preferably one that can dissolve the nucleotide monomer unit represented by the above formula (1).
  • examples include corridin, pyridine, a mixed solvent of pyridine and acetonitrile, a mixed solvent of pyridine and N, N-dimethylformamide, and a mixed solvent of pyridine or pyridine and acetonitrile Is preferred.
  • the volume ratio is preferably from 2 to 0.5: 1, and more preferably about 1: 1.
  • the reaction temperature is preferably from -30 ° C to 30 ° C, more preferably from 0 ° C to 30 ° C, even more preferably from 15 ° (: to 25 ° C. If desired, light is blocked. The reaction may be allowed to proceed.
  • the pressure is atmospheric pressure.
  • a phosphonate represented by the following general formula (5) represented by the following general formula (5).
  • ⁇ represents a carrier.
  • the carrier is, for example, a known polymer support used in the solid-phase method such as controlled pore glass (CPG) or highly crosslinked polystyrene (HCP), which has as little swelling property as possible, Examples thereof include those which can easily remove the reagent used in the above by washing, and protective groups such as a phenoxyacetyl group and a benzoyl group without particular limitation.
  • CPG controlled pore glass
  • HCP highly crosslinked polystyrene
  • Phosphonate represented by the formula (5) is, for example, 3 'nucleotide monomer one unit synthesized Te month and the second aspect - after the introduction of the carrier R 4 in position, in accordance with a third aspect 5'Hosufuai It can be obtained by removing the protecting group of the mouse.
  • a 5'-phosphite oligonucleotide derivative represented by the following general formula (7) is provided.
  • n represents an integer of 1 or more. n is preferably an integer of 1 to 100, and more preferably an integer of 10 to 30.
  • a sixth aspect of the present invention as one aspect, one aspect of the nucleotide monomer unit according to the first aspect of the present invention and the phosphonate provided in the fourth aspect of the present invention are condensed to form the present invention. There is provided a method for producing a nucleotide dimer which is one aspect of the fifth aspect of the present invention.
  • a nucleoside monomer unit represented by the following general formula (la) is reacted with a phosphonate represented by the following general formula (5) in the presence of a condensing agent to obtain a dimer represented by the following general formula (6).
  • a nucleoside monomer unit represented by the following general formula (la) is reacted with a phosphonate represented by the following general formula (5) in the presence of a condensing agent to obtain a dimer represented by the following general formula (6).
  • a phosphonate (//-phosphonet monoester) represented by the above formula (5) is used as a terminal of the extended chain. Therefore, the intramolecular and intermolecular chain scission reactions, which were confirmed by the conventional method, are suppressed.
  • the nucleotide monomer unit represented by the above formula (la) is converted into the above formula (5) in order to quantitatively advance the condensation reaction.
  • the liquid phase method it is preferably used in an amount of 1 mol to 10 mol, more preferably 1 mol to 5 mol, even more preferably 1 mol to 1.5 mol, per 1 mol of the phosphonate represented by the formula (1).
  • the solid phase method it is preferably used in an amount of 1 mol to 100 mol, more preferably 10 mol to 50 mol, per 1 mol of the phosphonet bonded to the solid support represented by the above formula (5).
  • a condensing agent is used.
  • the condensing agent 2- (benzotriazole trioxy) -1,3-dimethyl Tyl-2-pyrrolidine-1-yl-1,3,2-diazaphosphoridinium hexafluorophosphate ( ⁇ 0 ⁇ ), ⁇ , ⁇ ⁇ -bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) phosphonic chloride (BopCl), and B0MP can be preferably used.
  • the condensing agent is preferably used in an amount of 1 mol to 20 mol by 1 mol of the phosphonate represented by the above formula (5) and 1 mol to 20 mol by the liquid phase method in order to progress the reaction quantitatively. It is more preferable to use 1 mol to 10 mol, and it is even more preferable to use 1 mol to 5 mol.
  • the solid phase method it is preferably used in an amount of 1 mol to 200 mol, more preferably 20 mol to 100 mol, and more preferably 40 mol, per 1 mol of the phosphonate bound to the solid support represented by the above formula (5). It is even more preferred to use up to 60 moles.
  • one unit of the nucleotide monomer represented by the above formula (1a) is dissolved and added to a solution of the phosphonate (5), a condensing agent is added, and the mixture is stirred. To obtain the dimer (6). It is not necessary to use an isolated phosphonate (5), and one unit of a nucleotide monomer prepared in a solution may be used as it is.
  • the solvent is preferably a solvent capable of dissolving the phosphonate represented by the above formula (5).
  • examples thereof include pyridine, a mixed solvent of pyridine and acetonitrile, and a mixed solvent of pyridine and N, N-dimethylformamide, and preferably a mixed solvent of pyridine or a mixture of pyridine and acetonitrile.
  • the volume ratio is preferably from 2 to 0.5: 1, and more preferably about 1: 1.
  • the reaction temperature is preferably 0 ° C. to 50 ° C., more preferably 10 ° C. (: to 30 ° C., still more preferably 15 ° C. to 25 ° C.) If desired, the reaction is performed by blocking light. May be advanced.
  • the pressure is atmospheric pressure.
  • the protecting group is removed from the 5′-phosphophosphate oligonucleotide derivative according to the fifth aspect of the present invention according to the third aspect of the present invention, 5'-Phosphid, which is condensed with one embodiment of the nucleotide monomer unit according to the first embodiment of the present invention to extend the chain by the same procedure as the above-described condensation method according to one embodiment of the sixth embodiment of the present invention.
  • a method is provided for producing a torigo nucleotide derivative.
  • a compound represented by the above general formula (4b) such as TMSOTi
  • ZnBr 2 zinc bromide
  • MgBr 2 magnesium bromide
  • trifluoroacetic acid trichloroacetic acid, dichloroacetic acid, 2-1-butylimino-2-ethylamino- 1,3-Dimethyl-1,3,2_diazaphosphorinane, (toptylimino) tris (dimethylamino) phosphorane, triethylamine, diisopropylethylamine, and 1,8-diazapicic mouth [5.4.0]-
  • the reaction is carried out in the presence of a condenoacetic acid
  • a nucleotide trimer can be obtained by going through (a) a deprotection step and (b) a polycondensation step with a new monomer.
  • the chain can be easily extended by repeating the above steps (a) and (b).
  • the deprotection reagent and reaction conditions for removing and removing R 1 from the 5′-phosphite oligonucleotide derivative represented by the above formula (7) are described in the third embodiment of the present invention. It is the same as doing.
  • a 5 '-//-phosphonate oligonucleotide may be optionally prepared using methanol, TEA, or the like.
  • the condensing agent and the reaction conditions when reacting with the nucleotide monomer unit represented by the above formula (1a) in the presence of the condensing agent are as described above. This is the same as described in one aspect of the sixth embodiment of the present invention.
  • the description of B and R 3 is the same as in the first and second embodiments of the present invention. Further, in the above formula, the description of R is the same as that in the fourth embodiment of the present invention. According to an eighth aspect of the present invention, there is provided a method for producing a 5′-H-phosphonate oligonucleotide derivative according to the seventh aspect of the present invention.
  • the deprotection reagent and reaction conditions for removing and removing R 1 from the 5′-phosphite oligonucleotide derivative represented by the above formula (7) are described in the third embodiment of the present invention. It is the same as doing.
  • the 5′-phosphonenet oligonucleotide derivative represented by the above formula (9) can be obtained.
  • the procedure for obtaining the 5'-phosphonate oligonucleotide derivative after removing the protecting group is the same as that described in the third embodiment of the present invention.
  • methanol is preferably used in an amount of 6 to 20 mol, more preferably 10 to 16 mol, per 1 mol of the nucleotide in the 5′-phosphite oligonucleotide derivative represented by the above formula (7). .
  • the oligonucleotide derivative (9) thus obtained can be modified in a wide range, and a useful DNA analog can be synthesized.
  • a condensing agent it is reacted with R 5 0H, following functional group R 5 is introduced formula (1 0) oligo Obtain nucleotide derivatives.
  • the R 5 include hydrogen, nucleosides, alkyl, Ariru, various fluorescent chromophore, the functional residues such Piochin.
  • Examples of the condensing agent include B0MP and BopCl, and B0MP can be preferably used.
  • DNA analogs can be obtained by oxidizing or chemically converting the obtained oligonucleotide derivative represented by the above formula (10).
  • oligonucleotide derivative represented by the above formula (10) For example, by using the following reagents / solvents (7) to (7), corresponding DNA analogs can be obtained.
  • 3 ′ _ -benzoylthymidine (693.3 mg, 2.0 mmol) was azeotroped three times with dry pyridine (5 ml).
  • 16 ml of a dry pyridine solution of pyridine hydrochloride adjusted to 0.25 M after azeotropic distillation with dry pyridine and dried with Molecular Sieves 3A was added (A).
  • di-tert-butyl ⁇ -getyl phosphoramidite was added dropwise at room temperature over 2 minutes.
  • Example 2 Under an argon atmosphere, the 3, -benzoyl-5'-ri-bis (/-butyl) -phosphitytylthymidine (156.8 mg, 0.3 mniol) obtained in Example 1 was washed three times with dry pyridine (1 ml). The residue was azeotropically dried three times with dry toluene (1 ml). This was made into a 3 ml solution of dry acetonitrile, and trimethylsilyl triflate (110 ⁇ , 0.6 nimol) was added dropwise over 30 seconds.
  • Thymidine (74.5 mg, 0.3 mmol) was azeotropically dried three times with dry pyridine (1 ml). To this was added dry pyridine (3.6 ml) and 10 particles of molecular sieves 3A. Thereafter, the mixture was azeotroped with dry pyridine, adjusted to 0.25 M, and added with 2.4 ml of a dry pyridine solution of pyridine hydrochloride dried with Molecular Sieves 3A. After stirring overnight, to this was added tert-butyl-getyl phosphoramidite dropwise over 3 minutes.
  • 3 ′-(r / -butyldimethylsilyl) thymidine (107.1 mg, 0.3 mmol) was azeotroped with dry pyridine (2 ml) three times. To this was added dry pyridine (0.12 ml) and 15 MS3A particles. Thereafter, the mixture was azeotroped with dry pyridine and adjusted to 0.25 M, and 2.88 ml of a dry pyridine solution of pyridine hydrochloride dried with Molecular Sieves 3A was added. To this, bis- ⁇ -butyl N, -getyl phosphoramidite was added dropwise over 2 minutes.
  • Thymidine 5 ′-(dibutyl) phosphite (418.2 mg, 1 rnmol) obtained in Example 3 was azeotropically dried three times with dry toluene (1 ml) to obtain a 3 ml dry pyridine solution.
  • triethylenmonium 3 '-/-butyldimethylsilylthymidine-5'-ylphosphonenet (897.3 mg, 1.72 mmol) obtained in Example 5 was dissolved in dry pyridine (7 ml) and calorie was determined. After adding BopCl (0.509 g, 2.00 mmol), the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours.
  • the mixture was diluted with black form (30 ml), washed three times with 1 M aqueous triethylammonium carbonate solution (30 ml), and back-extracted five times with black form (30 ml). After drying over anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off to obtain the target compound. Yellow oily substance.
  • Example 7 The procedure was performed in the same manner as in Example 6. However, the phosphonate obtained in Example 7 was used in place of the triethylammonium 3 '-//-butyldimethylsilylthymidine-5'-ylphosphonate obtained in Example 5. Yellow oil.

Description

明細書
5' -ホスフイチル化モノマーおよび H-ホスホネートオリゴヌクレオチド誘 導体の製造方法 技術分野
本発明は、 ホスフイチル化ヌクレオシドモノマー、 その製造方法、 当該 ホスフィチル化ヌクレオシドモノマーを利用して得 られる新規な H-ホス ホネートオリゴヌクレオチド誘導体及びホスフアイ 卜オリゴヌクレオチ ド誘導体並びにそれらの製造方法に関する。 背景技術
DNA 合成の最初の技術であるホスホジエステル法は， 1960 年代に Khorana らによって開発されたが， 反応はすべて液相で行い， 各段階で生 成物を単離しなくてはならないという煩雑な方法であった。 しかし Khoranaは， この方法と酵素法を組み合わせ， 1972 年に 77塩基からなる 酵母ァラニン tRNA遺伝子を合成した。
1980 年代初めまでにこれらの困難で手間のかかる液相法は， はるかに 速い固相法にとって代わられ， オリゴヌクレオチド合成は自動化された。 合成オリゴヌクレオチドの利用の一つに医薬が挙げられるが，それには天 然型の DNAではなく，それに化学的修飾を施した DNA類縁体が用いられて いる。 DNA類縁体としては， 様々なものが開発されているが， 実用化され ているのは，ホスホジエステル結合の非架橋酸素原子の一つを硫黄原子に 置換したホスホロチォエート DNAのみである。 しかし， ホスホロチォエー 卜 DNAは， タンパク質との相互作用が強く， 高い細胞毒性や副作用がある 為， これに代わる新しい DNA類縁体の開発が求められている。
DNA類縁体の合成に今日最も広く用いられている方法は， Le t s inge rが 考案し， Caru the rs らが発展させた反応で， ホスホ ロアミダイ ト法（亜リ ン酸トリエステル法）といわれている。 そのスキームを下記に示す。
Figure imgf000004_0001
(式中、 「BP」 とは、 保護基が付加された塩基を意味し、 「DMTr」 とは、 ジメ トキシトリチル基を指す。 ）
ホスホロアミダイ ト法の開発と並行して， Garegg と Matteucci は， そ れぞれ独立に -ホスホネー ト法を開発した （Garegg, P. J. et. al, Chemica Scripta, 1985, 25, 280-282、 Froehler, B. C. et. al, Tetrahedron Lett., 1986， 27, 469-472) 。 そのスキームを下記に示す。
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000005_0001
(式中、 「DBU」 とは、 1, 8-ジァザビシクロ [5· 4.0] -ゥンデ力-卜ェンを示 す。 ）
DNA類縁体の合成にホスホロアミダイ ト法を利用すると， リン原子上に 修飾を行う際， 16 族元素である酸素， 硫黄， セレン， そして配位結合を するポランによる修飾しか行えない。 一方， -ホスホネート法を利用する と， 幅広い修飾が行え， ホスホロアミダイ ト法では合成することの出来な い DNA類縁体を合成することができる。 これは， ホスホロアミダイ ト法で は亜リン酸トリエステルであるホスファイ トを経由して修飾を行うが， Η - ホスホネート法では亜リン酸ジエステルを経由して酸化的に修飾を行う ためである。
このように， -ホスホネ一卜法は DNA類縁体合成法として極めて有用で ある力 その合成過程において種々の副反応が起こるため， オリゴヌクレ ォチドの合成収率がホスホロアミダイ ト法と比較して低いという欠点が 指摘されている。 副反応としては，
1) 縮合剤としてピバロイルクロリ ド（PivCI) を用いるため， 塩基部位の ァミノ基がァシル化される （Froehler, B. C- et. al, Tetrahedron Lett. , 1986, 27, 469-472) 。 2) アデノシンの保護基としてベンゾィル基を用いる め， 酸性条件下ァ デニン環の脱離反応であるデブリネーションが起こる （例えば、 Hayakawa, Y. et. al, /. Am. Chem. Soc.1998, 120, 12395-12401) 。
3) 酸化反応で I2- H20 を用いるため， 主鎖が部分的に切断される （Wada, T. et. al, Tetrahedron Lett., 1999, 40, 915-918) 。
4) 脱保護した後， 末端の水酸基が近接するリン原子に求核攻撃すること によって， オリゴヌクレオチド鎖の切断反応が起こる （Wada, T. et. al, Tetrahedron Lett. , 1999, 40, 915-918) 。
Wadaらは 1) - 3) を克服した無保護^ホスホネ一ト法を開発した（Wada, T. et. al, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 12710- 1Z 721) 。 この方法で はまず， 5'-水酸基をジメ トキシトリチル基（DMTr 基）で保護したヌクレオ シドの 3'-水酸基をジフエニルホスホネ一卜で官能基選択的にホスホニル 化してモノマー単位を合成する。 次いで， 縮合剤として 2 -（ベンゾトリア ゾール 卜ィルォキシ） -1, 3-ジメチル- 2-ピロリジン- 1- ィル- 1, 3, 2-ジァ ザホスホリジニゥム へキサフルォロホスフェート （B0MP) (下記式参照） を用いてこのモノマー単位を官能基選択的に縮合する 。 これを N, 0- ス トリメチルシリルァセ トアミ ド (BSA)でシリル化した後， ジクロロメタン 中 2- (フエニルスルホニル） -3- (3-二トロフエニル）ォキサジリ ジン（PN0) (下記式参照） で官能基選択的に酸化して， オリゴヌ クレオチドを得る。
Figure imgf000006_0001
しかしながら、 当該方法では、 モノマー単位合成が多段階にわたり煩雑 であり、 また、 上記問題 4)が解決できないという問題点があった.。 発明の開示
本発明は、 //-ホスホネート法における問題点の 1 ) - 4) を克服しつつ、 モノマ一単位合成およびそれを利用した鎖伸張が簡便に行える方法.を提 供することを目的とする。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、 モノマ 一単位としてヌク オシド 5'-ホスフアイ トを用いて、 伸長する鎖の末端 がホスホニル基とすることで、 上記課題を解決できることを見出し、 本発 明を完成させた。
即ち、 本発明の第 1態様では、 下記一般式 （ 1 ) で示されるヌクレオチ ドモノマー単位が提供される。
Figure imgf000007_0001
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよく、 R2は、 水素原子、 置換基を有していても よいァシル基、置換基を有していてもよいアルキル基又は置換基を有して いてもよいトリアルキルシリル基を表し、 R3は、水素原子、ヒドロキシ基、 アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 卜リアルキルシリ ルォキシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000007_0002
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2， 2 3及び∑ 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 ァノレキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 7リールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルボニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルポニル基、 アルコキシチォ力；レポニル基、 ァリールチオ カルポニル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリ一ルォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルポ二ノレ基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表す。 ]
また、 本発明の第 2態様では、 本発明の第 1態様にかかるヌクレオチド モノマー単位を製造する方法が提供される。 すなわち、 本発明の第 2態様 では、 下記一般式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモノマー単位の製造方法 であって、
[式中、 Bは、ピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよく、 R2は、 水素原子、 置換基を有していても よいァシル基、置換基を有していてもよいアルキル基又は置換基を有して いてもよいトリアルキルシリル基を表し、 R3は、 水素原子、ヒ ドロキシ基、 アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 トリアルキルシリ ルォキシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000008_0001
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2'， 2 3及び∑ 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシ力ルポ ニル基、 ァリールォキシカルポニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルボニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルボニル基、 ァラルキルチオカルポニル基、 ァ υ一ルォキシチォカルボ ル基若しく
Figure imgf000009_0001
ニル基を表し、 z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表す。 ] 活性化剤存在下、 下記一般式 （ 2 ) で示され るヌクレオシドと、
Figure imgf000009_0002
[式中、 B、 R2及び R3は、 前記と同義を表す。 ] 下記一般式 （ 3 ) で示さ れるホスフィチル化剤とを
Figure imgf000009_0003
[式中、 R1は前記と同義を表す。 A1及び A2は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異なって、 C i〜 C 6アルキル基を表す。 ] 反応させることを 特徴とする、 ヌクレオチドモノマー単位の製造方法が提供される。
本発明の第 1態様および第 2態様において、 R1が、 少なく とも 2級炭素 若しくは 3級炭素基を含むアルキル基、少なくとも 2級炭素若しくは 3級 炭素基を含むァリ一ルアルキル基、少なくとも 2級炭素若しくは 3級炭素 基を含むジァリールアルキル'基、 又は、 2個以上の環を有する縮合炭化水 素環を含む基であることが好ましく、 R1が、 卜ブチル基、 2-フエニル- 1 ,卜 ジメチルェチル基、 2 - (卜ナフチル） - 1， 卜ジメチノレエチル基、 ジフエ二ル メチル基、 9-フルォレニルメチル基、 2 -シァノ - 1， 1 -ジメチルェチル基、 9 -フルォレニル-ジメチルメチル基、 トシク口へキシルジメチルメチル基、 卜リベンジルメチル基、 卜リシクロへキシルメチル基、 1 ーァダマンチル 基、ジ（トリフルォロメチル）フエニルメチル基、 2—トリメチルシリル- 1， 1 - ジメチルェチル基、 又は、 2-トリフエ二ルシリリレ- 1 , 卜ジメチルェチル基 であるか、 又は、 R 1が互いに架橋して燐原子及び 2つの酸素原子と共 ί 記式で示される環を形成することがより好ましい。 ·
Figure imgf000010_0001
[式中、 Phはフエ二ル基を示す。 ]
また、 本発明の第 2態様において、 活性化剤が、 ピリジン塩酸塩、 ピリ ジンスルホン酸塩、 ピリジンホウ酸塩、 N- (シァノメチル）ァミンスルホン 酸塩、 N- (シァノメチル）アミンホウ酸塩、 N- (シァノメチル）アミンリ ン酸 塩、 イミダゾールスルホン酸塩、 トリァゾー レスルホン酸塩、 N-ヒ ドロキ シトリアゾール、 ベンズィミダゾールスルホン酸塩、 イミダゾール、 トリ ァゾ一ル又はテトラゾ一ルであることが好ま しい。
また、 本発明の第 3態様では、 本発明の第 1態様にかかるヌクレオチド モノマー単位から保護基である Riを脱離させる方法が提供される。 すな わち、 本発明の第 3態様では、 下記一般式 （ 1 ) で示されるヌクレオチド モノマ一単位と、
Figure imgf000010_0002
[式中、 Bは、 ピリ ミジン塩基、プリ ン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素 を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有し ていてもよい環を形成してもよく、 R2は、 水素原子、 置換基を有していて もよいァシル基、置換基を有していてもよいアルキル基又は置換基を有し ていてもよいトリアルキルシリル基を表し、 R3は、 水素原子、 ヒ ドロキシ 基、 アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 トリアルキル シリルォキシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000011_0001
(式中、 Z 1.はメチル基を示す。 Z2, Z 3及び Z4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリ一ル基、 ァラルキル基、 ァシル基、 7 ルコキシ基、 7リール才キシ基、 ァラルキル才キシ基、 アルコキシ力ルポ ニル基、 ァリールォキシカルポニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルボニル基、 アルコキシチォカルポニル基、 ァリールチオ カルボニル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリールォキシチ才カルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表す。 ] 下記一般式 （4 a) で示される化合物、
Figure imgf000011_0002
[式中、 A3は、 置換基を有していてもよい Cェ〜じ i。アルキル基又は置換 基を有していてもよい C 6〜C i。ァリール基を表す。 ]
下記一般式 （4 b) で示される化合物、
AVAICI (4B)
[式中、 は、 置換基を有していてもよい C丄〜 ェ。アルキル基又は置換 基を有していてもよい c 6〜cェ Qァリール基を表す。 ]
臭化亜鉛（ZnBr2)、 臭化マグネシウム （MgBr2)、 トリフルォロ酢酸、 トリク ロロ酢酸、 ジクロロ酢酸、 2- 1 -プチルイミノー 2 -ジェチルアミノ -1, 3-ジメ チル -1, 3, 2-ジァザホスホリナン、 （卜プチルイミノ） 卜 リス （ジメチルアミ ノ）ホスホラン、 卜リエチルァミン、 ジイソプロピルェチルァミン、 及び 1, 8-ジァザビシク口 [5.4.0]- 7-ゥンデセンからなる群より選ばれる 1種 以上の脱保護試薬とを反応させて、 R1を脱離させることを特徴とする、 保 護基除去方法が提供される。 また、 本発明の第 4態様では、 下記一般式 （ 5 ) で示されるホスホネー 卜が提供される。
Figure imgf000012_0001
[式中、 Bは、ピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R3は、 水素原子、 ヒドロキシ基、 アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァ シルォキシ基、 トリアルキルシリルォキシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000012_0002
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2， Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一また.は異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 7リールォキシカルボニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルポニル基、 アルコキシチォカルポニル基、 ァリールチオ カルポニル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリールォキシチォカルポ 二ル基若しくはァラルキルォキシチォカルポ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、 ^は、 担体を表す。 ]
また、 本発明の第 5態様では、 下記一般式 （ 7 ) で示される 5'-ホスフ アイ トオリゴヌクレオチド誘導体が提供される。
Figure imgf000013_0001
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよく、 R3は、 冰素原子、 ヒドロキシ基、 アルコ キシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 トリアルキルシリルォキ シ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000013_0002
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2 , ∑ 3及び 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニリレ基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリ一ル基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシ力ルポ ニル基、 ァリールォキシカルボニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルポニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルポニル基、 ァラルキルチオカルボニ レ基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、 R4は、 担体を袠す。 nは 1以上の整数を表す。 ] また、 本発明の第 6態様の一側面では、 本発明の第 1態様にかかるヌク レオチドモノマ一単位の一態様と、本発明の第 4態様で提供されるホスホ ネートとを縮合させて、本発明の第 5態様の一態様である二量体を製造す る方法が提供される。 すなわち、 本発明の第 6態様の一側面では、 下記一 2466 般式 （ l a ) で示されるヌクレオチドモノマー単位と
Figure imgf000014_0001
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素 を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有し ていてもよい環を形成してもよく、 R3は、 水素原子、 ヒ ドロキシ基、 アル コキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシル才キシ基、 トリアルキルシリルォ キシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000014_0002
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2， 乙 3及び2 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルポニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルポニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルボニル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルポ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表す。 ] 縮合剤存在下、 下記一般式 （ 5 ) で示される ホスホネートと
Figure imgf000014_0003
[式中、 B及び R3は、 前記と同義を表す。 は、 担体を表す。 ] を反応さ せ、 下記一般式 （ 6 ) で示される二量体を製造する方法が提供される。
Figure imgf000015_0001
[式中、 B、 R R3及び R4は、 前言己と同義を表す。 ]
また、 本発明の第 6態様の他の側面では、 本発明の第 5態様にかかる 5 ' -ホスファイ トオリゴヌクレオチド誘導体から、 本発明の第 3態様にし たがって保護基を除去し、 更に、 本発明の第 1態様にかかるヌクレオチド モノマ一単位の一態様と縮合させて、 鎖を伸張させる、 5 ' _ホスファイ ト オリゴヌクレオチド誘導体を製造する方法が提供される。 すなわち、 本発 明の第 6態様の他の側面では、 下記一般式 （ 7 ) で示される 5'-ホスファ ィ 卜才リゴヌクレオチド誘導体と、
Figure imgf000015_0002
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、プリ ン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよく、 R3は、 水素原子、 ヒドロキシ基、 アルコ キシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 トリアルキルシリルォキ シ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000016_0001
式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2， Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 ァルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルボ二ル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルボ二ル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルボニル基、 ァラルキルチオカルボ二ル基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチすカルポ二ル基を表し、 z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、. R4は、 担体を表す。 nは 1以上の整数を表す。 ] 下記一般式 （4 a) で示される化合物、
Figure imgf000016_0002
[式中、 A3は、 置換基を有していても よい Cェ〜（： 。アルキル基又は置換 基を有していてもよい C 6〜 C 。ァリ ール基を表す。 ]
下記一般式 （4 b) で示される化合物、
A42-AICI (4b)
[式中、 A4は、 置換基を有していても よい C 〜 C 。アルキル基又は置換 基を有していてもよい C 6〜 C 1 Qァリ ール基を表す。 ]
臭化亜鉛（ZnBr2)、 臭化マグネシウム （MgBr2)、 トリフルォロ酢酸、 卜リク 口口酢酸、 ジクロロ酢酸、 2-t_ブチルィミノ _2 -ジェチルアミノ -1， 3 -ジメ チル- 1, 3, 2-ジァザホスホリナン、 -ブチルイミノ） 卜リス （ジメチルアミ ノ）ホスホラン、 卜リェチルアミン、 ジイソプロピルェチルァミン、 及び 1, 8-ジァザビシク口 [5.4.0]- 7 -ゥンデセンからなる群より選ばれる 1種 以上の脱保護試薬とを反応させて、 R1を脱離させた後、 縮合剤存在下、 下 記一般式 （ 1 a) で示されるヌクレオチドモノマー単位と
Figure imgf000017_0001
( ）
[式中、 B、 R1及び R3は、 前記と同義を表す。 ]
を反応させることを特徴とする、 下記一般式 （ 8 ) で示される
アイ 卜オリゴヌクレオチド誘導体の製造方法が提供される。
Figure imgf000017_0002
[式中、 B、 R R3、 R4及び n は、 前記と同義を表す。 ]
また、 本発明の第 7態様では、 下記式 （ 9 ) で示される 5'- -ホスホネ 一卜オリゴヌクレオチド誘導体が提供される。
Figure imgf000017_0003
(9) [式中、 Bは、 ピリミジン塩基、 プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R3は、 水素原子、 ヒ ドロキシ基、 アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァ シルォキシ基、 トリアルキルシ リルォキシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000018_0001
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2， Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルボニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルポニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルボニル基、 ァラルキルチオカルポニル基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルオ シチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、 R4は、 担体を表す。 nは 1以上の整数を表す。 ] また、 本発明の第 8態様では、 本発明の第 7態様にかかる 5 ' -H-ホスホ ネートオリゴヌクレオチド誘導体を製造する方法が提供される。すなわち、 本発明の第 8態様では、 下記一般式 （ 7 ) で示される 5'-ホスフアイ トォ リゴヌクレオチド誘導体と、
Figure imgf000018_0002
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、 プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよ く、 R3は、 水素原子、 ヒドロキシ基、 アルコ キシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 1、リアルキルシリルォキ シ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000019_0001
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2， ∑ 3及び2 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を
Figure imgf000019_0002
基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 7リールォキシカルポニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルボニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルポニル基、 ァラルキルチ才カルボニル基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、 R ま、 担体を表す。 nは 1以上の整数を表す。 ] 下記一般式 （4 a ) で示される化合物、
Figure imgf000019_0003
[式中、 A3は、 置換基を有していてもよい Cェ〜。 。アルキル基又は置換 基を有していてもよい C e〜 C 。ァリール基を表す。 ]
下記一般式 （4 b ) で示される化合物、
A42-AICI (4b)
[式中、 A4は、 置換基を有していてもよい C i〜 Cェ。アルキル基又は置換 基を有していてもよい C 6〜 C 。ァリール基を表す。 ]
臭化亜鉛（ZnB r2)、 臭化マグネシウム （MgB r2)、 トリフルォロ酢酸、 卜リク 口口酢酸、 ジク口口酢酸、 2- 1 -プチルイミノ - 2 -ジェチルアミノ - 1 , 3-ジメ チル- 1， 3, 2-ジァザホスホリナン、 （t -プチルイミノ） トリス（ジメチルアミ ノ）ホスホラン、 トリェチルァミン、 ジイソプロピルェチルァミン、 及び
1, 8 -ジァザビシク口 [5.4.0] - 7 -ゥンデセンからなる群より選ばれる 1種 以上の脱保護試薬とを反応させて、 R1 を脱離させる工程を含む、 下記式 ( 9 ) で示される 5'- -ホスホネー 卜オリゴヌクレオチド誘導体を製造す る方法が提供される。
Figure imgf000020_0001
[式中、 B、 R3、 及び nは、 前記と同義を表す。 ]
本発明の第 3態様〜第 8態様において、 Bがシトシン、 チミンまたはそ れらの誘導体であるこ とが好ましい。
本発明によれば、 従来法である -ホスホネート法における問題点を克 服でき、 かつ、 モノマ一単位合成のみならずオリゴヌクレオチド誘導体の 合成も簡便に行うことができる。 発明を実施するための最良の形態
本発明の第 1態様では、 下記一般式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモノ マー単位が提供される。
Figure imgf000020_0002
[式中、 B、 R 及び R3は、 上記の意味を表す。 ] 本発明の第 1態様で提供される上記式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモ ノマ一単位は、 下記反応式で示される、 本発明の第 2態様で提供されるヌ クレオチドモノマー単位の製造方法によつて得ることができる。すなわち、 活性化剤存在下、 下記一般式 （ 2 ) で示されるヌクレオシドと、 下記一般 式 （ 3 ) で示されるホスフィチル化剤とを反応させることによって製造さ れる。
Figure imgf000021_0001
[式中、 B、 R R2、 R3、 A1及び A2は、 上記の意味を表す。 ]
本発明において、 モノ マーュニッ トとして上記式 （ 1 ) で示されるよう なヌクレオシド 5，-ホスフアイ トを用いるため、 従来法や無保護 -ホスホ ネート法では二段階であつたモノマ一ュニッ ト合成が、対応するヌクレオ シドから一段階で得るこ とができる。 .
本発明にかかるヌク レオチドモノマー単位の製造方法では、下記一般式 ( 3 ) で示されるホスフイチル化剤が用いられる。
R1-0ヽ メ
P— N
R1-0ノ" V
(3)
上記式 （ 3 ) で示されるホスフイチル化剤は、 上記式 （ 2 ) で示される ヌクレオシドの 5'-位を位置選択的かつ官能基選択的にホスフィチル化す るものであることが好ましい。 しかも、 得られる上記式 （ 1 ) で示される ヌクレオチドモノマ一単位をオリ ゴヌク レオチド合成に使用する場合に は、 保護基である R1が脱離できるものであることが好ましい。
以上の観点から、 上 己式 （ 3 ) 中、 R1は、 嵩高い炭化水素基を含むもの であることが好ましい。
たとえば、 少なく とも 2級炭素若しく は 3級炭素基を含む炭化水素基 (たとえば、 少なく とも 2級炭素若しくは 3級炭素基を含むアルキル基、 ァリ一ルアルキル基、 ジァリールアルキル基等) を挙げることができ、 あ るいは、 2個以上の環を有する縮合炭化水素環を含む基を挙げることがで さる。
あるいは、 2つの R1 で示される炭化水素基が互いに架橋して置換基を 有していてもよい環 （例えば 5員〜 6員環） を形成してもよい。
これらの炭化水素基は置換基を有していてもよい。 この置換基としては 、 例えば、 C i C i。アルキル基 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル等) 、 C 6〜 C 1 Qァリール基 (例えば、 フエニル等） 、 C C i 0 アルコキシ基 (例えば、 メ 卜キシ、 エトキシ、 プロボキシ、 ブトキシ等） 、 C 6〜 C〗。ァリールォキシ基 (例えば、 フエニルォキシ、 ナフチルォキ シ、 ビフエニルォキシ等） 、 アミノ基、 水酸基、 シァノ基、 ハロゲン原子 (例えば、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素） 又はシリル基などを挙げること ができる。 この場合、 置換基は、 置換可能な位置に 1個以上導入されてい てもよく、 好ましく は 1個〜 4個導入されていてもよい。 置換基数が 2個 以上である場合、 各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
本発明において、 R1 としては、 t -ブチル基、 2-フエニル- 1,卜ジメチル ェチル基、 2- ( 1 -ナフチル) - 1 , 1 -ジメチルェチル基、ジフエニルメチル基、 9-フルォレニルメチル基、 2-シァノ - 1， 卜ジメチルェチル基、 9 -フルォレ ニル -ジメチルメチリレ基、 1 -シクロへキシルジメチルメチル基、 トリベン ジルメチル基、 トリ シクロへキシルメチル基、 1 ーァダマンチル基、ジ（ト リフルォロメチル) フエニルメチル基、 2-トリメチルシリル- 1,卜ジメチ ルェチル基、 又は、 2 -卜リフエニルシリル- 1, 1 -ジメチルェチル基を好ま しく挙げることができる。
あるいは、 R1が互いに架橋して燐原子及び 2つの酸素原子と共に環を形 成してもよく、 この場合に形成される環としては、 下記式で示される環を 好ましく挙げることができる。
Figure imgf000023_0001
[式中、 Phはフエ 二ル基を示す。 ]
上記式 （ 3 ) 中、 A1及び A2は、 同一または異なって、 C アルキ ル基である。
本明細書において、 rC i C eアルキル基」 としては、 制限するわけ ではないが、 メチフレ、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 n—ブチル、 s e c -ブチル、 t e r t -ブチル、 ペンチル、 へキシル等を挙げることが できる。
本発明において、 A1及び A2は、 同一または異なって、 ェチル、 イソプ 口ピルであること力 s好ましい。
本発明において、 ホスフイチル化剤としては、
ジ（/-プチル） N, -ジェチルホスホロアミダイ ト、
ジ（/-プチル） N -ジイソプロピルホスホロアミダイ 卜、
ジ（2-フエニル- 1, 1-ジメチルェチル) N, -ジェチルホスホ口アミダイ 卜、
ジ（2-フエニル- 1, 1-ジメチルェチル） N, ^ジイソプロピルホスホロァ ミダイ ト、
ジ（2- (Γ -ナフチル） -1, 卜ジメチルェチル) N, -ジェチルホスホロァミ ダイ 卜、
ジ（2- ナフチリレ） - 1, 1-ジメチルェチル） N, -ジイソプロピルホスホ 口アミダイ 卜、
ジ (1, 2 -ジフエ二 レ- 1, 2-ジメチルプロピル) N, -ジェチルホスホロァ ミダイ ト、
ジ（1, 2-ジフエ二ノレ- 1, 2-ジメチルプロピル） N, -ジイソプロピルホス ホロアミダイ 卜、
ジ（ジフエニルメテル) N, -ジェチルホスホロアミダイ ト、 ジ（ジフエニルメチル） N, -ジイソプロピルホスホロアミダイ 卜、 ジ（9-フルォレニルメチル） N, -ジェチルホスホロアミダイ ト、 ジ（9-フルォレニルメチル) N, ノ V-ジイソプロピルホスホロアミダイ 卜、 ジ（2-シァノ -1, 1-ジメチルェチル） ϋ -ジェチルホスホロアミダイ ト、 ジ（2-シァノ -1， 1-ジメチルェチル） N, N -ジイソプロピルホスホロアミ ダイ 卜、
ジ（9-フルォレニル-ジメチルメチル） N, -ジェチルホスホロアミダイ 卜、
ジ（9-フルォレニル -ジメチルメチル) N, N-ジイソプロピルホスホロァ ミダイ 卜、
ジ（1-シク口へキシルジメチルメチル) N, -ジェチルホスホロアミダイ 卜、
ジ（卜シクロへキシルジメチルメチル） N, -ジイソプロピルホスホロァ ミダイ 卜、
ジ（トリベンジルメチル) N, -ジェチルホスホロアミダイ 卜、
ジ（トリベンジルメチル） N -ジイソプロピルホスホロアミダイ 卜、 ジ（トリシクロへキシルメチル） N' -ジェチルホスホロアミダイ ト、 ジ（トリシクロへキシルメチル) N, -ジイソプロピルホスホロアミダイ 卜、
ジ（1 ーァダマンチル） N, ^ジェチルホスホロアミダイ ト、
ジ ( 1 ーァダマンチル) N, -ジイソプロピルホスホロアミダイ ト、 ジ（ジ (トリフルォロメチル) フエニルメチル） N, ジェチルホスホロ アミダイ 卜、
ジ（ジ (トリフルォロメチル) フエニルメチル） a -ジイソプロピルホ スホロアミダイ ト、
ジ（2-卜リメチ レシリル- 1, 1-ジメチルェチル） N, -ジェチルホスホロ アミダイ ト、
ジ（2 -卜リ メチリレシリル- 1, 1-ジメチルェチル） N, -ジィソプロピルホ スホロアミダイ 卜、 ジ（2-卜リフエニルシリル- 1,卜ジメチルェチル） a -ジェチルホスホ 口アミダイ ト、 又は、
ジ（2-トリフエニルシリル- 1,卜ジメチルェチル） N, -ジイソプロピル ホスホロアミダイ トを好ましく用いることができる。
本発明では、 上記式 （ 3 ) で示されるホスフイチル化剤によって、 下記 一般式 ( 2 ) で示されるヌクレオシドをホスフィチル化する。
Figure imgf000025_0001
上記式（ 2 ) 中、 R2は、 水素原子、 置換基を有していてもよいァシル基、 置換基を有していてもよいアルキル基又は置換基を有していてもよいト リアルキルシリル基を表す。
本明細書において、 「ァシル基」 としては、 制限するわけではない力 C ,_6アルキル一力ルポニル （たとえばメチルカルポニル、 ェチルカルポ ニル等） 、 c 6— 1 Qァリール一カルボニル （たとえばベンゾィル） などが挙 げられる。
本明細書において、 rトリアルキルシリル基」 としては、 制限するわけ ではないが、 トリメチルシリル基、 トリェチルシリル基、 t 一プチルジメ チルシリル基などを挙げることがでさる。
本発明において、 R2で示される 「ァシル基」 、 「アルキル基」 、 「トリ アルキルシリル基」 は置換基を有していてもよい。 この置換基としては、 例えば、 C i C cアルコキシ基 （例えば、 メ トキシ、 エトキシ、 プロボ キシ、 ブ卜キシ等） 、 C 6〜C i。ァリールォキシ基 (例えば、 フエニルォ キシ、 ナフチルォキシ、 ビフエ二ルォキシ等） 、 アミノ基、 水酸基、 シァ ノ基、 ハロゲン原子 （例えば、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素） 又はシリル 基などを挙げることができる。 この場合、 置換基は、 置換可能な位置に 1 個以上導入されていてもよく、好ましくは 1個〜 4個導入されていてもよ い。 置換基数が 2個以上である場合、 各置換基は同一であっても異なって いてもよい。 本発明において、 R2は、 水素原子、 ベンゾィル基、 フエノキシァセチル 基であることが好ましい。
上記式 （ 2 ) 中、 R3は、 水素原子、 ヒドロキシ基、 アルコキシ基、 アル ケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 トリアルキルシリルォキシ基、 または 下記式で表される基
Figure imgf000026_0001
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2， Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シク ロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリ ールォキシカルポニル基、 ァラルキルォキシカルボ二ル基、 アルキルチオカルボニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルポニル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しく はァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表す。
本明細書において、 「アルコキシ基」 としては、 制限するわけではない が、 メ トキシ、 エトキシ、 プロボキシ、 ブトキシ、 ペンチルォキシ等を挙 げることができる。
本明細書において、 「アルケニルォキシ基」 としては、 制限するわけで はないが、 ビエルォキシ、 ァリルォキシ、 1 一プロべニルォキシ、 イソプ ロぺニルォキシ、 2—メチルー 1 一プロぺニルォキシ、 2ーメチルァリル ォキシ、 2 一ブテニルォキシ等を挙げることができる。
本明細書において、 「ァシルォキシ基」 としては、 制限するわけではな いが、 C 卜6アルキル一カルボニルォキシ (たとえばメチルカルポ二ルォ キシ、 ェチルカルボニルォキシ等) 、 C ,。ァリール—カルボニル (たと えばベンゾィルォキシ） などが挙げられる。 本明細書において、 r卜リアルキルシリルォキシ基」 としては、 制限す るわけではないが、 トリメチルシリルォキシ基、 トリェチルシリルォキシ 基などを挙げることができる。
本明細書において、 「アルケニル基」 としては、 制限するわけではない が、 ビニル、 ァリル、 プロぺニル、 イソプロぺニル、 2 _メチル— 1ープ 口べニル、 2 —メチルァリル、 2 -ブテニル等を挙げることができる。 本曰月細書において、 「アルキニル基」 としては、 制限するわけではない 、 ェチニル、 プロピニル、 プチ二ル等を挙げることができる。
本明細書において、 「シクロアルキル基」 としては、 制限するわけでは ないが、、 シクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシ ル等を挙げることができる。
本明細書において、 「シクロアルケニル基」 としては、 制限するわけで はないが、 シクロプロべニル、 シクロブテニル、 シクロペンテニル、 シク 口へキセニル等を挙げることができる。
本明細書において、 「ァリール基」 としては、 制限するわけではないが 、 フエニル、 1 一ナフチル、 2—ナフチル、 インデニル、 ビフエ二リル、 アン卜リル、 フエナントリル等を挙げることができる。
本明細書において、 「ァラルキル基」 としては、 制限するわけではない カ^ ベンジル、 フエネチル、 ジフエニルメチル、 トリフエニルメチル、 1 一ナフチルメチル、 2 —ナフチルメチル、 2， 2—ジフエニルェチル、 3 —フエニルプロピル、 4—フエニルブチル、 5—フエ二ルペンチル等を挙 げることができる。
本明細書において、 「ァリールォキシ基」 としては、 制限するわけでは ないが、 フエニルォキシ、 ナフチルォキシ、 ビフエ二ルォキシ等を挙げる こと力 Sできる。
本明細書において、 「ァラルキルォキシ基」 としては、 制限するわけで はないが、ベンジルォキシ、フエネチルォキシ、ジフエニルメチルォキシ、 トリフエニルメチルォキシ、 1 一ナフチルメチルォキシ、 2 一ナフチルメ チル才キシ、 2， 2—ジフエニルェチルォキシ、 3 —フエニルプロピルォ キシ、 4ーフェニルブチルォキシ、 5—フエ二ルペンチルォキシ等を挙げ ることができる。
本明細書において、 「アルコキシカルポニル基」 としては、 制限するわ けではないが、 メ 卜キシカルボニル、 エトキシカルボニル、 2—メ トキシ 工トキシカルボニル、 t 一ブトキシカルボ二ル等を挙げることができる。 本明細書において、 「ァリールォキシカルポニル基」 としては、 制限す るゎ すではないが、 フエノキシカルボニル、 ナフ トキシカルボニル、 フエ ニルフエノキシカルボ二ル等を挙げることができる。
本明細書において、 「ァラルキルォキシカルボ二ル基」 としては、 制限 するわけではないが、 ベンジルォキシカルボニル、 フエネチルォキシカル ポニ レ、 ジフエ二ルメチルォキシカルボニル、 トリフエニルメチルォキシ カルボニル、 1 一ナフチルメチルォキシカルボニル、 2 一ナフチルメチル ォキシ力ルポニル、 2 , 2 —ジフエニルェチルォキシカルボニル、 3 —フ ェニフレプロピルォキシカルボニル、 4一フエニルブチルォキシカルポニル、 5 -フエ二ルペンチルォキシカルボ二ル等を挙げることができる。
本明細書において、 「アルキルチオカルボ二ル基」 としては、 制限する わけではないが、 メチルチオカルボニル、 ェチルチオカルボニル、 プロピ ルチ才カルボニル、 イソプロピルチオ力ルポ二ル、 n一ブチルチオカルボ ニル、 s e c 一プチルチオカルボニル、 t e r t ーブチルチオカルボニル 、 ペンチルチオカルボニル、 へキシルチオカルボ二ル等を挙げることがで さる。
本明細書において、 「アルコキシチォカルボニル基」 としては、 制限す るわけではないが、 メ トキシチォカルボニル、 エトキシチォカルボニル、 2— メ トキシェトキシチォカルボニル、 t —ブトキシチ才力ルポ二ル等を 挙げることができる。
本明細書において、 「ァリールチオカルボニル基」 としては、 制限する わけではないが、 フエ二ルチオカルボニル、 ナフチルチオカルボ二ル等を 挙げることができる。
本明細書において、 「ァラルキルチオカルボニル基」 としては、 制限す るわけではない力^べンジルチオカルボニル、フエネチルチオカルボニル、 ジフエ二ルメチルチオカルボニル、 トリフエ二ルメチルチオ力ルポニル、
1 一ナフチルメチルチオ力ルポニル、 2—ナフチルメチルチオ力ルポニル、 2 , 2 ージフエ二ルェチルチオカルボニル、 3 一フエニルプロピルチオ力 ルボニル、 4一フエ二ルブチルチオカルボニル、 5—フエ二ルペンチルチ ォカルボ二ル等を挙げることができる。
本明細書において、 「ァリールォキシカルポニル基」 としては、 制限す るわけではないが、 フエノキシチォカルボニル、 ナフトキシチォカルボ二 ル等を挙げることができる。
本明細書において、 「ァラルキルォキシチォカルボ二ル基」 としては、 制限するわけではないが、 ベンジルォキシチォカルボニル、 フエネチルォ キシチォカルボニル、 ジフエ二ルメチルォキシチォカルボニル、 トリフエ ニ レメチルォキシチォカルポニル、 1 一ナフチルメチルォキシチォカルボ エル、 2 _ナフチルメチルォキシチォカルボニル、 2 , 2—ジフエニルェ チリレオキシチォカルボニル、 3 一フエニルプロピルォキシチォカルボニル、 4一フエ二ルブチルォキシチォカルボニル、 5 一フエ二ルペンチルォキシ チォカルポ二ル等を挙げることができる。
本明細書において、 電子吸引基としては、 制限するわけではないが、 シ ァノ基、 ニトロ基、 卜リフルォロメチル基、 メ夕ンスルホニル基、 ベンゼ ンスルホニル基、 フッ素、 塩素等を挙げることができる。
本発明において、 R3は、 水素原子、 ヒ ドロキシ基、 メ トキシ基、 または 下記式で表される基
Figure imgf000029_0001
であって、 式中、 Z 1がメチル基であり、 Z 2 , Z 3及び Z 4が、 水素原子 であり、 τ Ί、 シァノ基又はニトロ基であることが好ましい。
上記式 （ 2 ) 中、 Βは、 互いに異なっていてもよい、 チミン、 シトシン、 ゥラシル等のピリミジン塩基； ァデニン、 グァニン等のプリン塩基； また は 5-メチルシトシン、 5-フルォロウラシル、 5—ヒ ドロキシメチルシト シン等のそれらの誘導体を表す。
溶媒への溶解度を向上させるために、 塩基部位に、 ジメ トキシトリチル 基 （DMTr)、 ベンゾィル（Bz)、 イソプロピルカルポニル（iBu)、 フエノキシ ァセチル (PAC)、 4- (t -プチル）フエノキシァセチル (BPA)、 ァリルォキシ力 ルポニル (A0C)、 2- [ ( t -プチルジフエニルシリルォキシ）メチル]ベンゾィ ル（S i OMB)、 2- (ァセチルメチル）ベンゾィル（AMB)、 2-アジドベンゾィル (AZMB)等の保護基を導入してもよい。
本発明において、 Bは、 シトシン、 チミン、 アデニン、 グァニンまたは それらの誘導体、あるいはそれらに保護基が導入されたものであることが 好ましい。
本発明の第 2態様において、 上記式 （ 3 ) で示されるホスフイチル化剤 は、 5，水酸基に対して選択的に反応させるために、 上記式 （ 2 ) で示され るヌクレオシド 1モルに対して 0. 1モル〜 1. 5モル用いることが好ましく 、 0. 3モル〜 1. 2モル用いることが更に好ましく、 0. 5モル〜 1. 0モル用い ることが更になお好ましい。
本発明の第 2態様では、 活性化剤を用いる。 活性化剤としては、 ピリジ ン塩酸塩； ピリジゥム トリ フラート等のピリジンスルホン酸塩； ピリジゥ ムテトラフルォロボレート等のピリジンホウ酸塩； 4， 5-ジシァノイミダゾ —ル、 4， 5-ジクロロイミダゾ一ル等のィミダゾール； 5-ベンジルテトラゾ ール、 5-ェチルチオ- 1H-テトラゾ一ル、 1H-テトラゾール等のテ トラゾー ル；イミダゾリゥム トリ フラ一ト等のイミダゾ一ルスルホン酸塩； 5-二ト 口べンズィ ミダゾリ ゥム トリ フラー 卜等のベンズィミダゾ一ルスルホン 酸塩 ； トリァゾリ ウム トリ フラート等の 卜リァゾ一ルスルホン酸塩 ； 1 - ヒ ドロキシベンズ卜リアゾール等の N-ヒ ドロキシ卜リアゾール ； トリア ゾール ； N- (シァノメチル） ピロリジニゥムテ トラフルォロボレー ト等の N -（シァノメチル）アミンホウ酸塩； N- (シァノメチル） ピロリジニゥム ト リ フラー ト等の N -（シァノメチル）ァミンスルホン酸塩 ； N- (シァノメチル) ピロリジニゥムへキサフルォロホスフェート等の N -（シァノメチル）アミ ンリ ン酸塩等を挙げることができ、 ピリジン塩酸塩、 ピリジンスルホン酸 塩、 ピリジンホウ酸塩、 イミダゾ一ル、 又はテトラゾ一ルを好ましく挙げ ることができる。
本発明の第 2態様において、 活性化剤は、 反応を完結させるために、 上 記式 （ 3 ) で示されるホスフィチル化剤 1モルに対して 1 モル〜 1 0 モル 用いることが好ましく、 2 モル〜 5 モル用いることが更に好ましく、 2 モ ル〜 3モル用いることが更になお好ましい。
本発明の第 2態様において、 典型的には、 上記式 （ 2 ) で示されるヌク レオシドの溶液に、 活性化剤を添加して攪拌し、 次いでホスフイチル化剤 を添加し攪拌して、 上記式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモノマー単位を 得る。 ヌクレオシド （ 2 ) は単離されたものを用いる必要はなく、 溶液中 で調製されたヌクレオシドをそのまま用いても良い。
本発明の第 2態様において、 上記式 （ 2 ) で示されるヌクレオシドをホ スフィチル化する際の位置選択性 ·官能基選択性は、 ヌクレオシドの溶媒 に対する溶解度に依存する。 したがって、 溶媒としては上記式 （ 2 ) で示 されるヌク レオシドが溶解できるものが好ましい。 たとえば、 ピリジン、 ピリジンとァセ トニ トリルとの混合溶媒、 ピリジンと N, N-ジメチルホル ムアミ ドとの混合溶媒を挙げることができ、 ピリジン、 又は、 ピリジンと ァセ トニトリルとの混合溶媒であることが好ましい。
本発明の第 2態様において、 ピリジンとァセトニトリルとの混合溶媒を 用いる場合は、 その体積割合が、 2〜0. 5： 1であることが好ましく、 約 1 ： 1であることがより好ましい。
反応温度としては、 - 78°C〜30 °Cが好ましく、 0° (：〜 30°Cがさらに好まし く、 1 5 ° (：〜 2 5 °Cが更になお好ましい。 所望により、 光を遮断して反応を進 行させてもよい。
圧力は、 大気圧であることが好ましい。 本発明の第 3態様では、本発明の第 1態様で提供されたヌクレオチドモ ノマー単位から、 保護基である R1 を除去する方法が提供される。 すなわ JP2004/002466 ち、 上記一般式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモノマー単位と、 下記一般 式 （4 a) で示される化合物、 下記一般式 （4 b) で示される化合物、 臭 化亜鉛（ZnBr2)、 臭化マグネシウム（MgBr2)、 トリ フルォロ酢酸、 トリクロ 口酢酸、 ジクロロ酢酸、 2-t -プチルイミノ- 2 -ジェチルァミノ- 1， 3 -ジメチ ル- 1, 3， 2-ジァザホスホリナン、 は -プチルイミノ） トリス （ジメチルアミ ノ）ホスホラン、 トリェチルァミン、 ジイソプロピルェチルァミン、 及び
1, 8 -ジァザビシク口 [5.4. 0] -7-ゥンデセンからなる群より選ばれる 1種 以上の脱保護試薬とを反応させて、 R'を脱離させることを特徴とする、 保 護基除去方法が提供される。
Figure imgf000032_0001
A4 2-AICI (4b)
上記式 （4 a ) 中、 A3は、 置換基を有していてもよい C ェ。アルキ ル基又は置換基を有していてもよい C 6〜C 。ァリール基を表す。 また、 上記式 （ 4 b) 中、 ^は、 置換基を有していてもよい C 。アルキル 基又は置換基を有していてもよい C 6〜C i。ァリ一ル基を表す。
本明細書において、 「C 6〜C i。ァリール基」 としては、 制限するわけ ではないが、 フエニル、 1 一ナフチル、 2—ナフチル、 インデニル、 ビフ ェニリル、 アントリル、 フエナントリル等を挙げることができる。
本発明において、 A3及び A4で示される 「C i〜C 。アルキル基」 、 「 C 6〜C 1 Qァリール基」 には、 置換基が導入されていてもよい。 この置換 基としては、 例えば、 C i C i。炭化水素基 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 フエニル、 トリル、 キシリル、 クメニル、 メシチル、 ナフチル、 インデニル、 トリル、 キシリル、 ベンジル等) 、 C X~C！ 07 ルコキシ基 (例えば、 メ トキシ、 エトキシ、 プロボキシ、 ブトキシ等) 、 C 6 ~ C】。ァリールォキシ基 (例えば、 フエニルォキシ、 ナフチルォキシ 、 ビフエニルォキシ等） 、 アミノ基、 水酸基、 ハロゲン原子 （例えば、 フ ッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素） 又はシリル基などを挙げることができる。 こ の場合、 置換基は、 置換可能な位置に 1個以上導入されていてもよく、 好 ましくは 1個〜 4個導入されていてもよい。置換基数が 2個以上である場 合、 各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
本発明において、 A3は、 トリフルォロメチル、 フエニル、 p-メチルフエ ニル、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピルであることが好ましい。
また、 本発明において、 は、 メチル、 ェチル、 又はイソプロピルであ ることが好ましい。
本発明の保護基除去方法において、 脱保護試薬は、 脱離すべき上記式 ( 1 ) 中の保護基 R1 によって適宜選択される。 たとえば、 R1カ^ 卜プチ ル基、 2-フエニル- 1， 卜ジメチルェチル基、 2- (1-ナフチル） - 1,卜ジメチル ェチル基、 ジフエ二ルメチル基、 1 -シク口へキシルジメチルメチル基、 ト リベンジルメチル基、 トリシクロへキシルメチル基、 1 ーァダマンチル基、 ジ （トリフルォロメチル） フエニルメチル基、 2-トリメチルシリル- 1, 1- ジメチルェチル基、 2-トリフエニルシリル- 1， 1 -ジメチルェチル基など、 あるいは、 R1が互いに架橋して燐原子及び 2つの酸素原子と共に環を形成 する場合には、 上記式 （4 a ) 、 上記式 （4 b ) で示される脱保護試薬あ るいは臭化亜鉛（ZnBr2)、 臭化マグネシウム （MgBr2)、 トリフルォロ酢酸、 トリ クロロ酢酸、 ジクロロ酢酸を用いることが好ましい。上記式（ 4 a )、 上記式 （4 b ) で示される脱保護試薬としては、 たとえば、 トリメチルシ リルトリ フルォロメ夕ンスルホネート （TMSOTf)、 トリメチルシリルペンゼ ンスルホネー ト、ジメチル塩化アルミニウム、ジェチル塩化アルミニウム、 ジィソプロピル塩化アルミニウムを好ましく挙げることができる。
また、 R1 が、 9-フルォレニルメチル基、 9-フルォレニル-ジメチルメチ ル、 2-シァノ -1, 卜ジメチルェチル基などである場合には、 2-卜プチルイ ミ ノ - 2 -ジェチルァミ ノ - 1, 3 -ジメチル - 1, 3, 2-ジァザホスホリナン、 (t - プチルイミ ノ） 卜リス （ジメチルァミノ）ホスホラン、 卜リエチルァミン、 ジイソプロピルェチルァミン、 又は 1, 8-ジァザビシクロ [5.4.0] -7-ゥン デセンを脱保護試薬として用いることが好ましい。
本発明の第 3態様において、 脱保護試薬は、 反応を完結させるために、 上記式 （ 1 ) で示されるヌク レオチドモノマー単位 1モルに対して 2モル 〜20 モル用いることが好ましく、 3 モル〜 10 モル用いることが更に好ま しく、 5モル〜 8モル用いることが更になお好ましい。
本発明の第 3態様において、 上記式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモノ マー単位中、 3'位を保護する観点から、 R2は、 ベンゾィル基、 フエノキシ ァセチル基等の置換基を有していてもよいァシル基であることが好まし い。
本発明の第 3態様において、 典型的には、 上記式 （ 1 ) で示されるヌク レオチドモノマー単位の溶液に、 脱保護試薬を添加し、 攪拌して保護基 R1を除去する。 ヌクレオチドモノマー単位 （ 1 ) は単離されたものを用い る必要はなく、溶液中で調製されたヌクレオチドモノマ一単位をそのまま 用いても良い。
脱保護試薬が、 例えば TMSOT f といった上記式 （4 a ) で示される化合 物である場合には、 上記式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモノマー単位に 脱保護試薬を作用させると、 保護基が脱離し、 卜リメチルシリルエステル になり、 トリフルォロメタンスルホン酸が生成する。 従って、 任意に、 メ タノ一ル等を用いてトリメチルシリル基を除去し、 更に、 トリェチルアミ ン（TEA)等を用いてトリフルォロメタンスルホン酸を中和し、 -ホスホネ 一トモノエステルの トリェチルァミン塩とすることができる。 この場合、 メタノールは、 上記式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモノマー単位 1 モル に対して、 6 モル〜 20モル用いることが好ましく、 10モル〜 16モル用い ることが更に好ましい。 反応機構を下記に示す。
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000035_0002
[式中、 B、 R 1 , R2及び R3は、 上記の意味を表す。 ]
なお、 上記反応機構は仮説であり、 本発明はこの反応機構に限定される ものではない。
上記反応機構のように、ヌクレオチドモノマー単位の保護基を脱離させ た後に 5 ' - -ホスホネートとすることで、 後述するように、 新たなヌクレ ォチドモノマー単位 （ l a ) と縮重合することができるため鎖の伸張が容 易となる。
本発明の第 3態様において、 溶媒としては、 上記式 （ 1 ) で示されるヌ クレオチドモノマー単位が溶解できるものが好ましい。 たとえば、 コリジ ン、 ピリ ジン、 ピリジンとァセトニトリルとの混合溶媒、 ピリジンと N, N- ジメチルホルムアミ ドとの混合溶媒を挙げることができ、ピリジン、又は、 ピリジンとァセトニトリルとの混合溶媒であることが好ましい。
本発明の第 3態様において、 ピリジンとァセトニトリルとの混合溶媒を 用いる場合は、 その体積割合が、 2〜0. 5： 1であることが好ましく、 約 1 ： 1であることがより好ましい。
反応温度としては、 - 30°C〜30°Cが好ましく、 0°C〜30°Cがさらに好まし く、 1 5° (：〜 25°Cが更になお好ましい。 所望により、 光を遮断して反応を進 行させてもよい。
圧力は、 大気圧であることが好ましい。 本発明の第 4態様では、 下記一般式 （ 5 ) で示されるホスホネートが提 供される。
Figure imgf000036_0001
上記式中、 B及び R3についての説明は、 本発明の第 1態様〜第 2態様に おいてしたのと同様である。
上記式中、 ^は、 担体を表す。 担体としては、 たとえば、 調節多孔性ガ ラス （controlled pore glass :CPG)、 高架橋性ポリスチレン（HCP)といった 固相法に用いられる公知の高分子支持体であって、できるだけ膨潤性がな く、 過剰に用いた試薬を洗浄によって簡単に除去できるものや、 フエノキ シァセチル基やベンゾィル基のような保護基などを、特に制限なく挙げる ことができる。
本発明において、 は、 好ましくは、 フエノキシァセチル基である。 上記式 （ 5 ) で示されるホスホネートは、 例えば、 第 2態様にしたがつ て合成したヌクレオチドモノマ一単位の 3' -位に担体 R4を導入した後に、 第 3態様にしたがって 5'-ホスフアイ 卜の保護基を除去することによって 得ることができる。 本発明の第 5態様では、 下記一般式 （ 7 ) で示される 5'-ホスファイ ト オリゴヌクレ才チド誘導体が提供される。
Figure imgf000037_0001
上記式中、 B、 R1及び R3についての説明は、 本発明の第 1態様〜第 2態 様においてしたのと同様である。 また、 上記式中、 R4についての説明は、 本発明の第 4態様においてしたのと同様である。
上記式中、 nは 1以上の整数を表す。 nは、 1〜100の整数であること が好ましく 、 10〜30の整数であることがよ り好ま しい。 本発明の第 6態様では、 一側面と して、 本発明の第 1態様にかかるヌク レオチドモノマー単位の一態様と、本発明の第 4態様で提供されるホスホ ネートとを縮合させて、本発明の第 5態様の一態様であるヌクレオチドニ 量体を製造する方法が提供される。 すなわち、 縮合剤存在下、 下記一般式 ( l a ) で示されるヌグレオチドモノマー単位と、 下記一般式 （ 5 ) で示 されるホスホネー トとを反応させ、 下記一般式 （ 6 ) で示される二量体を 製造する。
Figure imgf000038_0001
上記式中、 B、 R 1及び R3についての説明は、 本発明の第 1態様〜第 2態 様においてしたのと同様である。 また、 上記式中、 R4 についてめ説明は、 本発明の第 4態様においてしたのと同様である。
本発明の第 6態様では、 伸長鎖の末端として上記式 （ 5 ) で示されるホ スホネー卜 （//-ホスホネ一 卜モノエステル） を用いる。 したがって、 従来 法で確認されていた副反応である分子内，分子間の鎖切断反応が抑制され る。
本発明の第 6態様において、 二量体 （ 6 ) を製造するためには、 上記式 ( l a ) で示されるヌクレオチドモノマー単位は、 縮合反応を定量的に進 行させるために、 上記式 （ 5 ) で示されるホスホネート 1モルに対して液 相法では 1モル〜 10モル用いることが好ましく、 1モル〜 5モル用いるこ とが更に好ましく、 1 モル〜 1. 5 モル用いることが更になお好ましい。 ま た、 固相法では、 上記式 （ 5 ) で示される固相担体に結合したホスホネ一 ト 1モルに対して 1 モル〜 100 モル用いることが好ましく、 1 0 モル〜 50 モル用いることが更に好ましく、 20 モル〜 30モル用いることが更になお 好ましい。
本発明にかかるオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法では、縮合剤を用 いる。 縮合剤としては、 2- (ベンゾトリアゾール 卜ィルォキシ） - 1, 3-ジメ チル- 2-ピロリジン- 1- ィル- 1, 3， 2-ジァザホスホリジニゥム へキサフ ルォロホスフェート （Β0ΜΡ)、 Ν, Ν-ビス （2-ォキソ -3-ォキサゾリジニル） ホスホニッククロリ ド （BopC l)等を挙げることができ、 B0MPを好ましく用 いることができる。
本発明の第 6態様において、 縮合剤は、 反応を定量的に進行させるため に、 上記式 （ 5 ) で示されるホスホネー卜 1モルに、 液相法では 1 モル〜 20 モル用いることが好ましく、 1 モル〜 10 モル用いることが更に好まし く、 1 モル〜 5 モル用いることが更になお好ましい。 また、 固相法では、 上記式 （ 5 ) で示される固相担体に結合したホスホネート 1モルに対して 1 モル〜 200モル用いることが好ましく、 20モル〜 100モル用いることが 更に好ましく、 40モル〜 60モル用いることが更になお好ましい。
本発明の第 6態様において、典型的には、ホスホネー ト （ 5 )の溶液に、 上記式 （ 1 a ) で示されるヌクレオチドモノマ一単位.を溶解して加え、 縮 合剤を添加し、 攪拌して二量体 （ 6 ) を得る。 ホスホネート （ 5 ) は単離 されたものを用いる必要はなく、溶液中で調製されたヌクレオチドモノマ 一単位をそのまま用いても良い。
本発明の第 6態様において、 溶媒としては、 上記式 （ 5 ) で示されるホ スホネートが溶解できるものが好ましい。 たとえば、 ピリジン、 ピリジン とァセトニトリルとの混合溶媒、 ピリジンと N, N-ジメチルホルムアミ ド との混合溶媒を挙げることができ、 ピリジン、 又は、 ピリジンとァセトニ トリルとの混合溶媒であることが好ましい。
本発明の第 6態様において、 ピリジンとァセトニトリルとの混合溶媒を 用いる場合は、 その体積割合が、 2〜0. 5： 1であることが好ましく、 約 1 ： 1であることがより好ましい。
反応温度としては、 0°C〜50°Cが好ましく、 10° (：〜 30°Cがさらに好まし く、 15°C〜25°Cが更になお好ましい。 所望により、 光を遮断して反応を進 行させてもよい。
圧力は、 大気圧であることが好ましい。 JP2004/002466 本発明の第 6態様の他の側面では、 本発明の第 5態様にかかる 5'-ホス フアイ トオリゴヌクレオチド誘導体から、本発明の第 3態様にしたがって 保護基を除去し、 更に、 前述した本発明の第 6態様の一側面にかかる縮合 方法と同様の手順で、本発明の第 1態様にかかるヌクレオチドモノマー単 位の一態様と縮合させて、 鎖を伸張させる、 5'-ホスファイ トオリ ゴヌク レオチド誘導体を製造する方法が提供される。
すなわち、 本発明の第 6態様の他の側面では、 下記一般式 （ 7 ) で示さ れる 5'-ホスフアイ 卜オリゴヌクレオチド誘導体と、 例えば、 TMSOTiといつ た上記一般式 （4 a) で示される化合物、 上記一般式 （4 b) で示される 化合物、臭化亜鉛（ZnBr2)、臭化マグネシウム（MgBr2)、 卜リフルォロ酢酸、 トリクロ口酢酸、 ジクロロ酢酸、 2- 1 -プチルイミノ- 2-ジェチルァミノ - 1, 3 -ジメチル- 1, 3, 2_ジァザホスホリナン、 （卜プチルイミノ） トリス （ジ メチルァミノ）ホスホラン、 トリェチルァミン、 ジイソプロピルェチルァ ミン、 及び 1, 8-ジァザピシク口 [5.4.0] -7-ゥンデセンからなる群より選 ばれる 1種以上の脱保護試薬とを反応させて、 R1を脱離させた後、 縮合剤 存在下、 下記一般式 （ 1 a) で示されるヌクレオチドモノマー単位とを反 応させることを特徴とする、 下記一般式 （ 8 ) で示される 5'-ホスフアイ トオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法が提供される。
Figure imgf000041_0001
[式中、 B、 R R3、 及び n、 上記の意味を表す。 ]
たとえば、 第 6態様で得られた二量体を出発物質として、 （ a ) 脱保護 工程、 （ b ) 新たなモノマーとの縮重合工程を経ることでヌクレオチド三 量体を得ることができる。 更に鎖を伸ばす場合には、 以上の （ a ) 工程、 ( b ) 工程を繰り返すことで容易に鎖を伸張させることができる。
本発明の第 6態様において、 上記式 （ 7 ) で示される 5'-ホスファイ ト オリゴヌクレオチド誘導体から R1 を脱離除去する際の脱保護試薬、 反応 条件は、 本発明の第 3態様で説明したのと同様である。 保護基を脱離させ た後、 任意に、 メタノールや TEA等を用いて、 5 ' -//-ホスホネートオリゴ ヌクレオチドにしてもよい。
また、 本発明の第 6態様において、 保護基を脱離させた後、 縮合剤存在 下、 上記式 （ 1 a ) で示されるヌクレオチドモノマー単位と反応させる際 の縮合剤、 反応条件は、 前述した本発明の第 6態様の一側面において説明 したのと同様である。 本発明の第 7態様では、 下記式 （ 9 ) で示される 5 '- -ホスホネ一トォ リ ゴヌクレオチド誘導体が提供される。
Figure imgf000042_0001
[式中、 B、 R3、 R4及び n、 上記の意味を表す。 ]
上記式中、 B及び R3についての説明は、 本発明の第 1態様〜第 2態様に おいてしたのと同様である。 また、 上記式中、 R こついての説明は、 本発 明の第 4態様においてしたのと同様である。 本発明の第 8態様では、 本発明の第 7態様にかかる 5' -H-ホスホネート オリゴヌクレオチド誘導体を製造する方法が提供される。 すなわち、 本発 明の第 8態様では、 下記一般式 （ 7 ) で示される 5'-ホスファイ トオリゴ ヌクレオチド誘導体と、 例えば、 TMSOTiといった上記一般式 （4 a) で示さ れる化合物、 上記一般式 （ 4 b) で示される化合物、 臭化亜鉛（ZnBr2)、 臭化マグネシウム （MgBr2)、 トリフルォロ酢酸、 トリクロ口酢酸、 ジクロ 口酢酸、 2 - 1 -プチルイミノ -2-ジェチルアミノ - 1, 3-ジメチル- 1, 3, 2 -ジァ ザホスホリナン、 _プチルイミノ） 卜リス （ジメチルァミ ノ）ホスホラン、 トリェチルァミン、 ジィソプロピルェチルアミン、 及び 1, 8-ジァザビシ クロ [5.4.0]- 7-ゥンデセンからなる群より選ばれる 1種以上の脱保護試 薬とを反応させて、 R1を脱離させる工程を含む、 下記式 （ 9 ) で示される 5'_ -ホスホネートオリ ゴヌクレオチド誘導体を製造する方法が提供され る。 2004/002466
Figure imgf000043_0001
[式中、 B、 IK R3、 及び nは、 上記の意味を表す。 ]
本発明の第 8態様において、 上記式 （ 7 ) で示される 5'-ホスファイ ト オリゴヌクレオチド誘導体から R1 を脱離除去する際の脱保護試薬、 反応 条件は、 本発明の第 3態様で説明したのと同様である。 保護基を脱離させ た後、 メタノールや TEA等を用いて処理することで、 上記式 （ 9 ) で示さ れる 5' - -ホスホネ一 トオリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。 保護基除去後、 5' - -ホスホネ一トオリゴヌクレオチド誘導体を得る手 順については、 本発明の第 3態様において説明したのと同様である。 ただ し、 メタノールは、 上記式 （ 7 ) で示される 5' -ホスファイ トオリゴヌク レオチド誘導体中のヌクレオチド 1モルに対して、 6モル〜 20モル用いる ことが好ましく、 10モル〜 16モル用いることが更に好ましい。
こう して得られたオリゴヌクレオチド誘導体 （ 9 ) は、 幅広い修飾が行 え、 有用な DNA類縁体を合成することができる。 たとえば、 縮合剤存在下 で、 R50H と反応させて、 官能基 R5が導入された下記式 （ 1 0 ) のオリゴ ヌクレオチド誘導体を得る。
Figure imgf000044_0001
[式中、 B、 R3、 及び nは、 上記の意味を表す。 ]
R5としては、 水素、 ヌクレオシド、 アルキル、 ァリール、 各種蛍光発色 団、 ピオチン等の機能性残基を挙げることができる。
縮合剤としては、 B0MPおよび BopC l を挙げることができ、 B0MP を好ま しく用いることができる。
次いで、 得られた上記式 （ 1 0 ) で示されるオリゴヌクレオチド誘導体 を酸化又は化学変換することにより各種 DNA類縁体を得ることができる。 たとえば、 下記のような ）〜（7)の試薬/溶媒を用いることで、 対応する 各種 DNA類縁体を得ることができる。
Figure imgf000045_0001
酸化又は化学変換
Figure imgf000045_0002
[式中、 B、 R3, R4、 R5及び nは、 上記の意味を表す。 Rとは、 アルキル基 を示す。 ] 実施例
以下、 本発明を実施例に基づいて説明する。 ただし、 本発明は、 下記の 実施例に制限されるも のではない。
反応に用いた溶媒は、市販のものを蒸留した後ナトリウムまたはモレキ ユラ一シ一ブ 4Αで乾燥したものを用いた。 テ卜ラヒ ドロフラン、 ジェチ ルエーテルについては、用いる直前にナ ト リウムベンゾフエノンケチル存 在下で蒸留したものを用いた。
また、 ジ- t er t-プチ）]/ N, iV-ジェチルホスホロアミダイ 卜、 3'-り-ベンゾ ィルチミジン、 3 ' - - r /-プチルジメチルシリルチミジンについては、 既 知の方法で合成した。
各種分析機器は、 以下に示した機種を用いた。
'Η -核磁気共鳴スペク トル -丽 R) ： ノ リアン Mercury 300 (300匪 z) 31P-核磁気共鳴スぺク トル（31P -匪 R) ： バリアン Mercury 300 (121.5MHz) カラムクロマ トグラフィーに充填するシリカゲルには、 KANTO CHEMICAL の Silica Gel 60 を用いた。 実施例 1 (3'-末端の合成）
3'- ^ベンゾィル -5'- -（ジ -ブチル） -ホスフィチルチミジン
Figure imgf000046_0001
アルゴン雰囲気下、 3' _ -ベンゾィルチミジン （693.3 mg, 2.0 mmol) を ドライ ピリジン (5 ml) で 3 回共沸した。 これに、 ドライピリジンで 共沸してから 0.25 Mに調製し、 モレキュラーシーブス 3Aで乾燥したピリ ジン塩酸塩のドライ ピリジン溶液を 16 ml加えた （A) 。 これに、 ジ- tert- ブチル ^ -ジェチルホスホロアミダイ トを室温で 2分かけて滴下した。 滴下終了後、 室温で 1.5時間撹拌した後、 クロ口ホルム （50 ml) で希釈 し、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 （40 ml) で洗浄した。 水層をクロ口 ホルム（50 ml)で逆抽出し、 すべての有機層を集めて無水硫酸ナトリウム で乾燥し、 溶媒を留去した後、 カラムクロマトグラフィ一 （へキサン-酢 酸ェチル -トリェチルァミン（75:25:2, v/v/v)で分離精製した。 卜リエチ ルァミンを減圧して除去した後、 ドライ トルエン （2 nd) で 3 回、 ドラ イジクロロメタン （2 ml) で 3 回共沸することにより、 目的化合物を収 率 91%で得た。 白色泡状固体。
Ή NMR (CDC13) δ 1.4, 1.44 (2s, 18H), 1.960， 1.964 (2s, 3H) , δ 2.31-2.41 (m, 1H), δ 2.49-2.56 (m, 1H), δ 3.98-4.04 (m, 1H) , δ 4.27-4.36 (HI, 2H) , ^ 5.56-5.60 (m, 1H) , ^6.53 (dd, 1H) , δΐ.44-7.50 (m, 2H), δΊ.57-7.63 (m, 1H), δΊ.800, 7.804 (2s, 1H) , ^ 8.04-8.08 (m, 2H), ^8.54 (brs, 1H)
3IP NMR (CDC13) ^134.4 実施例 2 (3'-末端の合成）
トリェチルアンモニゥム 3' - -ベンゾィルチミジン- 5' -ィル ホスホ ネー卜
Figure imgf000047_0001
アルゴン雰囲気下、 実施例 1で得られた 3， - -ベンゾィル -5 '-り-ビス （/- プチル）-ホスフイチルチミジン （156.8 mg, 0.3 mniol) を ドライ ピリジ ン （1 ml) で 3 回、 ドライ トルエン （1 ml) で 3回共沸乾燥した。 これ を 3 ml のドライアセトニトリル溶液にして、 卜リメチルシリルトリフラ —卜 （110 μΐ, 0.6 nimol) を 30秒かけて滴下した。 滴下終了後， 室温で 10分間撹拌した後， メタノール （49 μΐ, 1.2 mmol) で脱保護し、 トリエ チルァミン （170 μΐ, 1.2 mmol) で中和した。 これをカラムクロマトグ ラフィー （ジクロロメタン - トリェチルァミン （98:2, v/v)—ジクロロ メタン—メタノール一卜リエチルァミン (96:4:2, v/v/v) ) で分離精製し, トルエン （3 ml) で 3 回、 クロ口ホルム （3 ml) で 3 回共沸した。 その 後、 ジクロロメタン （2 ml) で希釈し、 1 M 炭酸卜リエチルアンモニゥ ム水溶液 - ピリ ジン （1:1, v/v) (2 ml) で洗浄した。 これを無水硫酸 ナトリウムで乾燥し， 溶媒を留去した後， トルエン （1 ml) で 3 回、 ジ クロロメタン （1 ml) で 3回共沸し、 目的化合物を収率 25%で得た。 白色 泡状固体。
Ή-NMR (CDC13) 61.35 (t, 9H, -CH of Et3N, 3JHH = 7.2 Hz), δ 1.97 (s, 3H, -CH3 of thymine) , δ 2.47-2.50 (m, 2H, 2'-H) , δ 3.11 (Q, 6H, -CH3 of Et3N, 3JHH = 7.2 Hz) , δ 3.52-3.65 (ddd, 1H, 5， - H) , δ 4.12-4.30 (ddd, 1H, 5"-H), (54.34 (m, 1H, 4'-H) , (35.64 (m, 1H, 3'-H) , δ 6.53 (t, 1H, l'-H), 6.91 (d, 1H, H of P-H, 'JPH = 583 Hz), δ 7.43-7.49 (m, 2H, o-of Bz), δ 7.57-7.62 (m, 1H, p- of Bz) , 7.99-8.05 (m, 2 H, m-oi Bz)
31P-NMR (CDC13) δ 4.53 CJPH=618 Hz 実施例 3 (モノマーユニッ トの合成）
チミジン 5' - -ビス Uert-プチ )ホスフアイ 卜
Figure imgf000048_0001
チミジン （74.5 mg, 0.3 mmol) をドライピリジン （1 ml) で 3 回共沸 乾燥した。 これに、 ドライ ピリジン（3.6 ml) と、 モレキュラーシ一ブス 3A 10 粒を加えた。 その後、 ドライピリジンで共沸してから 0.25 M に調 製して、 モレキュラーシーブス 3Aで乾燥したピリジン塩酸塩のドライピ リジン溶液を 2.4 ml 加えた。 終夜で撹拌した後、 これに、 ス- tert -ブ チル -ジェチルホスホロアミダイ トを 3分かけて滴下した。 滴下終了 後、 室温で 1.5時間撹拌した後、 濾過により MS3Aを除去して、 クロロホ ルム （10 ml) で希釈して飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 （10 ml) で洗 浄した後にクロ口ホルム （10 ml) で 3回逆抽出した。 これを無水硫酸ナ トリウムで乾燥し、 溶媒を留去した後、 カラムクロマトグラフィー （へキ サン 一 酢酸ェチル ― トリェチルァミン (80:20:2, v/v/v) - へキサン -酢酸ェチル - トリェチルァミン （50:50:2, v/v/v) ) で分離精製した。 ト リェチルァミンを減圧して除去した後、 ドライ トルエン . （2 ml) で 3 回、 クロ口ホルム （2 ml) で 3 回共沸することにより、 '目的化合物を収 率 で得た。 白色泡状固体。 実施例 4 (3'-末端の合成) 3' -り-（ -プチルジメチルシリル） -5' -。-ビス ( -ブチル） -ホスフィチルチ ミジン
Figure imgf000049_0001
アルゴン雰囲気下、 3' - -（ r /-プチルジメチルシ リ ル）チミ ジン (107.1 mg, 0.3 mmol) をドライピリジン （2 ml) で 3回共沸した。 これ に、 ドライピリジン（0.12 ml) と、 MS3A 15粒を加えた。 その後、 ドライ ピリジンで共沸してから 0.25 Mに調製して、 モレキュラーシ一ブス 3Aで 乾燥したピリジン塩酸塩のドライ ピリジン溶液を 2.88ml加えた。これに、 ビス- ^ -ブチル N, -ジェチルホスホロアミダイ トを 2分かけて滴下し た。滴下終了後、室温で 15分間撹拌した後、濾過により MS3Aを除去して、 クロ口ホルム （30 ml) で希釈して飽和炭酸水素ナ ト リ ウム水溶液 （30 ml) で洗浄した。 これを無水硫酸ナトリゥムで乾燥し、溶媒を留去した後、 カラムクロマ トグラフィー (へキサン 一 酢酸ェチル 一 トリェチルアミ ン （96:16:2, v/v/v) - へキサン - 酢酸ェチル - トリェチルァミン (80:20:2, v/v/v) ) で分離精製した。 トリェチルァミンを減圧して除去し た後、 ドライ トルエン （2 ml) で 3 回、 クロロホルム （2 ml) で 3 回共 沸することにより、 目的化合物を収率 79%で得た。 白色泡状固体。
Ή-NMR (CDC13) δ 0.08 (s, 6H) , <50.87 (s, 9Η) , δ 1.41 (s, 18H), 61.93 (s, 3Η) , δ 2.00-2.28 (m, 2Η) , δ 4.01-4.02 (m, 3Η) , δ 4.40-4.41 (m, 1Η) , δ 6.33-6.38 (dd, 1Η), δ 7.69 (s, 1Η) , δ 8.26 (s, 1Η) 31Ρ 匪 R (CDC13) 133.2 実施例 5 (3'-末端の合成）
ト リェチルアンモニゥム 3' - -（/-プチルジメチルシリル）チミジン ィル ホスホネー ト Et3NH+
Figure imgf000050_0001
アルゴン雰囲気下、 実施例 4で得られた 3' - -（/-プチルジメチルシリ ル）- 5' - -ビス （/-プチル）-ホスフイチルチミジン (4.26 nig, 8 mmol) を 5 mlの ドライジクロ口メタン溶液にして、 トリフルォロ酢酸 （8.0 ml, 103 匪 ol) を 3分かけて滴下した。 滴下終了後、 室温で 1時間撹拌した後、 ト リエチルァミン （17.3 ml, 40 mmol) で中和した。 これを 1 M 炭酸トリ ェチルアンモニゥム水溶液 （80 ml) で洗浄した。 これを無水硫酸ナト リ ゥムで乾燥し、 溶媒を留去した後、 トルエン （10 ml) で共沸した。 カラ ムクロマトグラフィー (ジクロロメタン - トリェチルァミン (100:0.5, v/v) ジクロロメタン メタノール - トリエヂルァミン (97:3:0.5, v/v/v) ) で分離精製し、 トルエン （10 ml) で 3回、 ジクロロメタン （10 ml) で 3回共沸し、 目的化合物を収率 98%で得た。 白色泡状固体。
Ή-NMR (CDC13) δ 0.08 (s, 6H) , <50.89 (s, 9Η) , δ 1.31-1.36 (t, 9Η) , δ 1.96 (s, 3Η), δ 2.14-2.19 (m, 2Η) , δ 3.06-3.08 (πι, 6Η) , δ 4.01-4.01 (ηι, 3Η), 54.48 (m, 1Η) , δ 6.35-6.40 (dd, 1Η) , δ 6.90 (s, 1Η, J = 618. O Hz), (57.76 (s, 1H) , δ 8.76 (s, 1H)
3,P-NM (CDC δ 5.24 (s, J = 620.4 Hz) 実施例 6 (二量体の合成）
3' - - -ブチルジメチルシリル）チミジン- 5'-ィル- チルホスフィチル) チミジン- 3' -ィル Hホスホネー
Figure imgf000051_0001
実施例 3で得られたチミジン 5 '- -（ジ トブチル）ホスファイ ト (418.2 mg, 1 rnmol) をドライ トルエン （1 ml) で 3 回共沸乾燥し、 3 ml のドライピリジン溶液にした。 これに実施例 5で得られたトリェチ レアン モニゥム 3'- /-プチルジメチルシリルチミジン- 5'-ィル ホスホネ 一卜 （897.3 mg， 1.72 mmol) をドライピリジン （7 ml)に溶解してカロえ、 BopCl (0.509 g， 2.00 mmol) を加えた後、 室温で 1.5時間撹拌し た。 ピ リジンを減圧下で留去した後、 クロ口ホルム （100 ml)で希釈し、 飽和炭 酸水素ナトリウム水溶液 （100 ml) で 3回洗浄した、 クロ口ホルム (100 ml) で 1回逆抽出をした。 これを無水硫酸ナ 卜リゥムで乾燥した 、 溶媒 を留去して、 目的化合物を定量的に得た。 白色泡状固体。
Ή-NMR (CDC13) δ 0.09 (m, 6H) , δ 0.89 (s, 9Η)， <51.40 (s, 3Η) , <5 1..89-1.93 (m, 3Η) , δ 2.14-2.35 (ni, 2Η) , 5 2.43-2.61 (m， 2 Η) , δ 3.36-3.55 (m, 2Η), δ 3.80 (s, 6Η) , <53.98-4.03 (m, 2Η) , δ 4.05-4.42 (πι, 4Η) , δ 5.25 (m, 2Η) , δ 4.05-4.42 (dd, 1Η)， δ 6. 10-6.14 ( t, 1Η), δ 6.19-6.23 (t, 1Η)， δ 6.43-6.46 (m, 2Η) , δ 6.892 (d, 1Η, 717 Hz), 66.933 (d, 1Η, 716 Hz), δ 7.16-7.37 (i, 13H), <58.50-8.75 (m, 2H) 3IP -腿 R (CDCリ δ 133.53, 133.46, δ 9. 16 (s, J = 704.8 Hz), 7 - 72 (s, J = 708.2 Hz) 実施例 7 (二量体の脱保護) Β3Ν
Figure imgf000052_0001
実施例 6で得られた 3' - 0 - ( -プチルジメチルシリル）チミ ジン- 5' -ィル - 15'- - (ビス /er -ブチルホスフィチル) チミジン- 3'-ィル Πホスホネー ト（41.0 mg, 0.05 匪 ol) をドライ トルエン （1 ml) で 3 回共沸乾燥し、 5 ml のドライジクロロメタン溶液にした。 これにトリフルォロ酢酸 （50 a 1, 0.649 匪 ol) を加え、 室温で 25 時間撹拌した。 クロ 口ホルム （30 ml)で希釈し、 1 M 炭酸トリェチルアンモニゥム水溶液 （30 ml) で 3 回 洗浄した、 クロ口ホルム （30 ml) で 5回逆抽出をした。 これを無水硫酸 ナトリウムで乾燥した後、 溶媒を留去して、 目的化合物を得た。 黄色油状 物質。
31P-匪 R (CDC13) δ 8.97 (m, ΊΡ„=708.3 Hz), 8.85 (m, 'JPH=708.3 Hz), 54.90 (m, 'JP1)=619.4 Hz), 4.781 (m, 'JP„=619.4 Hz) 実施例 8 (三量体の合成）
Figure imgf000052_0002
実施例 6と同様の手順で行った。 但し、 実施例 5で得られたトリェチル アンモニゥム 3'- -/ /-プチルジメチルシリルチミジン -5'-ィル ホス ホネートの代わりに、 実施例 7で得られたホスホネートを用いた。 黄色油 状物質。
31P-NMR (CDC13) δ 133.72 (t), δ 133.69 は）， 6133.34 (t)， δ 133.31 (t), δ 9.91 (HI) , δ 9.73 (m) , δ 9.26 (m) , 59.07 (m) , 68.19 (m) , δ 8.07 (m) , <57.83 (m) , δ 7.77 (m) 実施例 9 (塩基性条件下での脱保護）
1， 8-ジァザビシク口 [5, 4, 0] 1 -ゥンデセニゥム
チル）チミジン- 5' -ィル ホスホネート
Figure imgf000053_0001
0-Ph
アルゴン雰囲気下、 3'- -（フエノキシァセチル） - 5' - -ビスジメチルシ ァノエチルホスフイチルチミジン (36.2 mg, 0.06 龍 ol) をドライ ピリ ジン （1 ml) で 3回、 ドライ トルエン （1 ml) で 3 回共沸した。 これを ドライ重ァセトニ卜リル-ァセトニトリル （1:4, v/v) (0.6 ml) 溶液に して、 DBUを添加した。 22時間後、 クロ口ホルム （3 ml) で希釈し、 DBU 重炭酸塩（3 ml) で洗浄した。 これを無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 溶媒 を留去して目的化合物を得た。
1P 羅 R (CDC13) 0.15
Figure imgf000053_0002
Hz)

Claims

下 ZCLI一般式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモノマー単位。
C ZZII
Figure imgf000054_0001
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基青、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよく、 R2のは、 水素原子、 置換基を有していても よいァシル基、置換基を有していてもよいアルキル基又は置換基を有して いてもよいトリアルキルシリル基を表し、 R3は、水素原子、 ヒ ドロキシ基、 囲
アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 ト リアルキルシリ ルォキシ基、 または下記式で表される基
0 I、 ノ 0
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2 , Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アフレコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルポニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルボ二ル基、 アルコキシチォカルポニル基、 ァリールチオ カルボニル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリ一ルォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルポ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表す。 ]
2 . R 1カ^ 少なくとも 2級炭素若しくは 3級炭素基を含むアルキル基、 少なく とも 2級炭素若しくは 3級炭素基を含むァリ一ルアルキル基、少な く とも 2級炭素若しくは 3級炭素基を含むジァリールアルキル基、 又は、 2個以上の環を有する縮合炭化水素環を含む基である、請求項 1記載のヌ クレオチドモノマー単位。
3 . R1が、 t -ブチル基、 2 -フエニル- 1 , 卜ジメチノレエチル基、 2- ( 1 -ナフ チル） - 1 , 卜ジメチルェチル基、 ジフエニルメチル基、 9 -フルォレニルメチ ル基、 2_シァノ - 1 ,卜ジメチルェチル基、 9 -フルォレニル-ジメチルメチル 基、 1 -シク口へキシルジメチルメチル基、 トリベンジルメチル基、 卜リシ ク口へキシルメチル基、 1 —ァダマンチル基、 ジ ( トリ フルォロメチル) フエニルメチル基、 2 -トリメチルシリル- 1， 卜ジメ チルェチル基、 又は、 2 -トリ フエニルシリル- 1 , 卜ジメチルェチル基であ るか、 又は、 R1 が互い に架橋して燐原子及び 2つの酸素原子と共に下記式で示される環を形成 する、 請求項 2記載のヌクレオチドモノマー単位。
Figure imgf000055_0001
[式中、 Phはフエ二ル基を示す。 ]
4 . 下記一般式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモ ノマー単位の製造方法 であって、
Figure imgf000055_0002
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、 プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよく、 R2は、 水素原子、 置換基を有していても よいァシル基、置換基を有していてもよいァノレキル基又は置換基を有して いてもよいトリアルキルシリル基を表し、 R3は、水素原子、ヒ ドロキシ基、 アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシル才キシ基、 トリアルキルシリ たは下記式で表される基
Figure imgf000056_0001
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2 ， Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハ ロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカル.ポ ニル基、 ァリールォキシカルポニル基、 7ラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルボニル基、 アルコキシチォカルポニル基、 ァリールチオ カルポニル基、 ァラルキルチオカルポニル基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルポ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表す。 ] '
活性化剤存在下、 下記一般式 （ 2 ) で示さ れるヌクレオシドと、
Figure imgf000056_0002
[式中、 B、 R2及び R3は、 前記と同義を表す。 ]
下記一般式 ( 3 ) で示されるホスフイチ レ化剤とを
Figure imgf000056_0003
[式中、 R1は前記と同義を表す。 A '及び A2は、 それぞれ、 互いに独立し、 同一または異なって、 ^ C eアルキル基を表す。 ]
反応させることを特徴とする、 ヌクレオチドモノマー単位の製造方法。
5 . R1が、 少なく とも 2級炭素若しくは 3級炭素基を含むアルキル基、 少なく とも 2級炭素若しくは 3級炭素基を含むァリールアルキル基、少な く とも 2級炭素若しくは 3級炭素基を含むジァリールアルキル基、 又は、 2個以上の環を有する縮合炭化水素環を含む基である、請求項 4記載のヌ ク レオチドモノマー単位の製造方法。
6 . R1が、 t -ブチル基、 2-フエニル- 1 , 卜ジメチルェチル基、 2- (卜ナフ チル） - 1 , 卜ジメチルェチル基、 ジフ ェニルメチル基、 9-フルォレニルメチ ル基、 2 -シァノ - 1， 1 -ジメチルェチ ·レ基、 9 -フルォレニル-ジメチルメチル 基、 卜シクロへキシルジメチルメチル基、 ト リベンジルメチル基、 卜リシ ク口へキシルメチル基、 1 ーァダマンチル基、 ジ (トリフルォロメチル） フエニルメチル基、 2-トリメチルシリル- 1， 卜ジメチルェチル基、 又は、 2-トリフエニルシリル- 1， 卜ジメチノレエチル基であるか、 又は、 R1 が互い に架橋して燐原子及び 2つの酸素原子と共に下記式で示される環を形成 する、 請求項 5記載のヌクレオチドモノマー単位の製造方法。
Figure imgf000057_0001
[式中、 Phはフエ二ル基を示す。 ]
7 . 活性化剤が、 ピリジン塩酸塩、 ピリジンスルホン酸塩、 ピリジンホ ゥ酸塩、 N- (シァノメチル）ァミンスルホン酸塩、 N -（シァノメチル）ァミン ホウ酸塩、 N- (シァノメチル）アミン リ ン酸塩、ィミダゾールスルホン酸塩、 卜リァゾールスルホン酸塩、 N-ヒ ド ロキシ卜リァゾ一ル、 ベンズィミダゾ 一ルスルホン酸塩、ィミダゾ一ル、 卜リァゾール又はテ卜ラゾールである、 請求項 4〜 6のいずれか記載のヌク レオチドモノマー単位の製造方法。
8 . 下記一般式 （ 1 ) で示されるヌクレオチドモノマー単位と、
Figure imgf000058_0001
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 は炭化水素 を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有し ていてもよい環を形成してもよく、 R2は、 水素原子、 置換基を有していて もよいァシル基、置換基を有していてもよいアルキル基又は置換基を有し ていてもよいトリアルキルシリ レ基を表し、 R3は、 水素原子、 ヒドロキシ 基、 アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 トリアルキル シリルォキシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000058_0002
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2， Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 7K素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を
Figure imgf000058_0003
基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 7 ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシ力ルポ ニル基、 ァリールォキシカルボ二ル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルポニル基、 ァリレコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルボニル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表す。 ] 、
下記一般式 （4 a ) で示される化合物、
Figure imgf000058_0004
[式中、 A3は、 置換基を有していてもよい C i〜C i。アルキル基又は置換 基を有していてもよい C 6〜 C 。ァリール基を表す。 ]
下記一般式 （4 b) で示される化合物、
A4 2-AICI {4b)
[式中、 A4は、 置換基を有していてもよい C 〜 C 。アルキル基又は置換 基を有していてもよい c 6〜c 1 Qァリール基を表す。 ]
臭化亜鉛（ZnBr2)、 臭化マグネシウム（MgBr2)、 トリフルォロ酢酸、 トリク ロロ酢酸、 ジクロロ酢酸、 2-t_プチルイミノ- 2 -ジェチルァミノ -1, 3-ジメ チル- 1, 3, 2-ジァザホスホリナン、 （t-プチルイミノ） トリス （ジメチルアミ ノ）ホスホラン、 トリェチルァ ミン、 ジイソプロピルェチルァミン、 及び 1, 8-ジァザビシク口 [5.4.0]- 7-ゥンデセンからなる群より選ばれる 1種 以上の脱保護試薬とを反応させて、 R1を脱離させることを特徴とする、 保 護基除去方法。
9. Bが、 シトシン、 チミンまたはそれらの誘導体である、 請求項 8記 載の保護基除去方法。
1 0. 下記一般式 （ 5 ) で示されるホスホネート。
Figure imgf000059_0001
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、 プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 3は、 水素原子、 ヒ ドロキシ基、 アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァ シルォキシ基、 トリアルキルシリルォキシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000059_0002
(式中、 Z 1はメチル某を示す。 Z 2， Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリ ールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルボ二ル基、 ァラルキルォキシカルボ二ル基、 アルキルチオカルボニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルボ二ル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリ一ルォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチ才力ルポ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、 は、 担体を表す。 ]
1 1 . 下記一般式 （ 1 a ) で示されるヌクレオチドモノマー単位と
[式中、 Bは、 ピリ ミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素 を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有し ていてもよい環を形成してもよく、 R3は、 水素原子、 ヒドロキシ基、 アル コキシ基、 ァルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 トリアルキルシリルォ キシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000060_0001
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2 , Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリ ールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシ力ルボ ニル基、 ァリールォキシカルボニル基、 ァラルキルォキシカルボ二ル基、 アルキ レチォカルボニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルボ二ル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 7リ一ルォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表す。 ]
縮合斉 (J存在下、 下記一般式 （ 5 ) で示されるホスホネートと
Figure imgf000061_0001
[式中、 B及び R3は、 前記と同義を表す。 R4は、 担体を表す。 ] を反応させ、 下記一般式 （ 6 ) で示される二量体を製造する方法。
Figure imgf000061_0002
[式中、 B、 1, R3及び は、 前記と同義を表す。 ]
1 2. 下記一般式 （ 7 ) で示される 5'-ホスフアイ トオリゴヌクレオチ ド誘導体。
Figure imgf000061_0003
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよく、 R3は、 水素原子、 ヒドロキシ基、 アルコ キシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 トリアルキルシリルォキ シ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000062_0001
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2， ∑ 3及び2 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シク口アルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルボニル基、 ァラルキルォキシカルボ二ル基、 アルキルチオカルボニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルポニル基、 ァラルキルチオカルポニル基、 ァリ一ルォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、 R4は、 担体を表す。 nは 1以上の整数を表す。 ]
1 3 . 下記一般式 ( 7 ) で示される 5，-ホスフアイ 卜オリゴヌクレオチ ド誘導体と、
Figure imgf000062_0002
[式中、 Bは、 ピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよく、 R3は、 水素原子、 ヒドロキシ基、 アルコ キシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 卜リアルキルシリルォキ シ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000063_0001
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2 , Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルボニル基、 ァラルキルォキシカルボ二ル基、 アルキルチオカルポニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ 力ルポニル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチ才力ルポ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、 R4は、 担体を表す。 nは 1以上の整数を表す。 ] 下記一般式 （4 a ) で示される化合物、
Figure imgf000063_0002
[式中、 A3は、 置換基を有していてもよい C i〜C i。アルキル基又は置換 基を有していてもよい C 6〜C i。ァリール基を表す。 ]
下記一般式 （ 4 b ) で示される化合物、 '
A4 2-AICI (4b)
[式中、 A4は、 置換基を有していてもよい C 〜 C 。アルキル基又は置換 基を有していてもよい C 6〜 Cェ。ァリール基を表す。 ] 臭化亜鉛（ZnBr2)、 臭化マグネシウム （MgBr2)、 トリフルォロ酢酸、 トリ ク ロロ酢酸、 ジクロロ酢酸、 2 - 1 -プチルイミノ -2 -ジェチルアミノ- 1， 3 -ジメ チル- 1, 3, 2-ジァザホスホリナン、 （t -プチルイミノ） トリス （ジメチルアミ ノ）ホスホラン、 1、リエチルァミン、 ジイソプロピルェチルァミン、 及び 1, 8-ジァザビシク口 [5.4.0] - 7-ゥンデセンからなる群より選ばれる 1種 以上の脱保護試薬 を反応させて、 R1を脱離させた後、 縮合剤存在下、 下 記一般式 （ 1 a ) で示されるヌクレオチドモノマー単位と
Figure imgf000064_0001
[式中、 B、 R1及び R3は、 前記と同義を表す。 ]
を反応させることを特徴とする、 下記一般式 （ 8 ) で示される 5'-ホスフ アイ トオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法。
Figure imgf000064_0002
B、 R R3、 R4及び nは、 前記と同義を表す。 ] 下記式 （ 9 ) で示される 5'-//-ホスホネートオリゴヌクレオチド
Figure imgf000065_0001
[式中、 Bは、 ピリ ミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R3は、 水素原子、 ヒ ドロキシ基、 アルコキシ基、 アルケニルォキシ基、 ァ シルォキシ基、 トリアルキルシリルォキシ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000065_0002
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2 , Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルボニル基、 ァラルキルォキシカルポニル基、 アルキルチオカルボ二ル基、 アルコキシチォカルポニル基、 ァリールチオ カルボニル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリ一ルォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、 は、 担体を表す。 nは 1以上の整数を表す。
1 5 . 下記一般式 ( 7 ) で示される 5'-ホスフアイ トオリゴヌクレオチ ド誘導体と、
Figure imgf000066_0001
[式中、 Bは、ピリミジン塩基、プリン塩基またはそれらの誘導体を表し、 R1は炭化水素を含む保護基を表し、 但し、 互いに架橋して置換基を有して いてもよい環を形成してもよく、 R3は、 水素原子、 ヒドロキシ基、 アルコ キシ基、 アルケニルォキシ基、 ァシルォキシ基、 卜リアルキルシリルォキ シ基、 または下記式で表される基
Figure imgf000066_0002
(式中、 Z 1はメチル基を示す。 Z 2 , Z 3及び Z 4は、 それぞれ、 互いに 独立し、 同一または異なって、 水素原子、 ハロゲン原子、 又は、 置換基を 有していてもよいアルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 シクロアル キル基、 シクロアルケニル基、 ァリール基、 ァラルキル基、 ァシル基、 ァ ルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァラルキルォキシ基、 アルコキシカルボ ニル基、 ァリールォキシカルボニル基、 ァラルキルォキシカルボニル基、 アルキルチオカルボニル基、 アルコキシチォカルボニル基、 ァリールチオ カルボ二ル基、 ァラルキルチオカルボニル基、 ァリールォキシチォカルボ ニル基若しくはァラルキルォキシチォカルボ二ル基を表し、 Z 5は、 電子 吸引基を表す。 ） を表し、 R4は、 担体を表す。 nは 1以上の整数を表す。 ] 下記一般式 （4 a ) で示される化合物、
Figure imgf000066_0003
[式中、 A3は、 置換基を有していてもよい Cェ〜 i Qアルキル基又は置換 基を有していてもよい C 6〜C 1。ァリール基を表す。 ]
下記一般式 （4 b ) で示される化合物、
A42-AICI (4b)
[式中、 A4は、 置換基を有していてもよい（ 〜。 ^アルキル基又は置換 基を有していてもよい C 6〜C 。ァリール基を表す。 ]
臭化亜鉛（ZnBr2)、 臭化マグネシウム （MgBr2)、 トリフルォロ酢酸、 卜リク ロロ酢酸、 ジクロロ酢酸、 2-卜プチルイミノ- 2-ジェチルァミノ- 1, 3 -ジメ チル- 1, 3， 2-ジァザホスホリナン、 （t -プチルイミノ） トリス （ジメチルアミ ノ）ホスホラン、 トリェチルアミ ン、 ジイソプロピルェチルァミン、 及び 1， 8-ジァザピシク口 [5.4. 0] - 7-ゥンデセンからなる群より選ばれる 1種 以上の脱保護試薬とを反応させて、 R1 を脱離させる工程を含む、 下記式 ( 9 ) で示される 5'- -ホスホネー トオリゴヌクレオチド誘導体を製造す る方法。
Figure imgf000067_0001
[式中、 B、 R3、 R4及び nは、 前記と同義を表す。 ]
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