WO2011010706A1

WO2011010706A1 - Fgf21シスエレメント結合物質

Info

Publication number: WO2011010706A1
Application number: PCT/JP2010/062383
Authority: WO
Inventors: 俊吾足達; 一紀西; 忠士梅本; 真宏野上; 勝一中尾
Original assignee: 武田薬品工業株式会社; 株式会社Galaxy Pharma
Priority date: 2009-07-23
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2011-01-27
Also published as: EP2458005A1

Abstract

　本発明は、FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る物質、特にAUリッチエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、並びに、該物質、特に該オリゴヌクレオチドを含有してなる医薬、特に抗肥満剤などの生活習慣病予防・治療剤を提供する。

Description

FGF21シスエレメント結合物質

　本発明は、FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る物質及びその物質を含有してなる生活習慣病の予防・治療剤に関する。

（発明の背景）
　細胞内の遺伝子発現の制御は、mRNAの転写及び翻訳のそれぞれの段階において、mRNAの転写量や、転写されたmRNAの安定性及びタンパク質への翻訳量、タンパク質そのものの安定性を制御することにより行われている。現在までに、これら各制御段階をターゲットとした様々な遺伝子発現制御方法（アンチセンス法やRNA干渉など）が開発されている。これらの方法の開発に伴い、近年mRNAの安定性やタンパク質への翻訳量を介した発現制御機構の重要性に大きな注目が集まっている。

　mRNAの安定性や翻訳量は、mRNAの「シスエレメント（cis-element）」と呼ばれる特定配列とこれに結合する「シスエレメント結合因子」により制御されている。

　シスエレメントは、DNA又はRNAの5’及び3’非翻訳領域に存在し、そのDNA鎖又はRNA鎖にコードされる遺伝子の発現制御に関与する領域として定義される。「シスエレメント結合因子」は、遺伝子のシスエレメントに結合してその遺伝子の発現を促進又は抑制するtrans-acting factorとして機能する。

　mRNAに存在するシスエレメントは、mRNAの安定性やタンパク質への翻訳量の制御に関与し、mRNAにコードされた遺伝子産物（タンパク質）の発現量を決定する重要な要素となっている。

　代表的なシスエレメントの一つに、「AUリッチエレメント（本明細書中、AREと略記することがある）」がある。AREは、mRNAの3’非翻訳領域（3’-UTR）に多く存在するアデノシンとウリジンに富む10～150塩基程度の塩基配列である。AREは、当初、サイトカインやリンフォカインの3’-UTRにおいて「AUUUA」の塩基配列が頻繁に重複して存在する領域として見つかった。AREは、現在では全遺伝子の5～8%に存在すると推定されており、ホメオスタシスの維持に関与する多くの遺伝子にAREが存在しているものと考えられている（非特許文献１）。

　AREには、trans-acting factorとしてARE結合タンパク質が結合し、mRNAの安定性や翻訳量を促進又は抑制している（非特許文献２及び３）。さらに、AREには、micro RNA（miRNA）も結合し、同様の制御を行っている（非特許文献４及び５）。

　特許文献１には、Bcl-2 mRNAの3’側の非翻訳領域のAREの一部に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（2’-O-(C1-C3)alkyl-oligonucleotides又は2’-O-methyl/deoxy-gapmers）がアポトーシス関連疾患の治療・予防に有用であることが記載されており、具体的には、ARE周辺の配列に4つのオリゴヌクレオチドの混合物を結合させてmRNAの不安定化を阻害している。

　ところで、線維芽細胞増殖因子21（本明細書中、FGF21と略記することがある）は強力な代謝調節剤として知られている（非特許文献６～８）。この因子は肝臓で選択的に発現し、脂肪細胞のグルコース取り込みを調節している。肥満及び2型糖尿病モデル動物へのFGF21投与により、血漿中のグルコースやトリグリセリドレベルが低下し、LDL-コレステロールの低下及びHDL-コレステロールの増加等、心血管系リスクファクターのレベルが改善されることが報告されている。さらに、FGF21は他のFGFファミリーとは異なり、分裂促進活性がなく、低血糖や体重増加を引き起こさないことから、副作用の少ない新規な生活習慣病治療薬として大いに注目されている。
　しかしながら、FGF21のmRNAを安定化したり、翻訳レベルを制御することにより、内在性FGF21の作用を向上させるといった試みは未だなされていない。

国際公開第03/040182号パンフレット

Nucleic Acids Research, 2001, Vol.29, No. 1, p. 246-254 Nucleic Acids Research, 2005, Vol.33, No. 22, p. 7138-7150 Biochemical Society Transactions, 2002, Vol. 30, part 6, p. 952-958 Cell, 2005, Vol.120, No. 5, p. 623-634 Seminars in Cell and Developmental Biology, 2005, Vol. 16, No.1, p.49-58 Physiological Research, 2009, Vol.58, p. 1-7 Cellular and Molecular Life Science, 2009, Vol.66, p.2067-2073 BioDrugs, 2008, Vol.22, No. 1, p. 37-44

　本発明は、生活習慣病の予防・治療剤を提供することを課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、FGF21のmRNAのシスエレメントに結合する物質を見出すとともに、該シスエレメントとシスエレメント結合因子との結合を阻害することにより、FGF21タンパク質の発現を増加させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

　すなわち、本発明は以下を提供するものである。
（１）FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る物質。
（２）FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、AUリッチエレメントへのAUリッチエレメント結合因子の結合を阻害し得る上記（１）記載の物質。
（３）FGF21のmRNAのシスエレメントが、配列番号：１で表されるFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から835～842番目の塩基配列である上記（１）記載の物質。
（４）FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る核酸類縁物質又はその塩である上記（１）記載の物質。
（５）FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得るオリゴヌクレオチド又はその塩である上記（１）記載の物質。
（６）LNA（locked nucleic acid）を含むことを特徴とする上記（５）記載の物質。
（７）BNA（bridged nucleic acid）を含むことを特徴とする上記（５）記載の物質。
（８）配列番号：３、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３若しくは配列番号：２４で表される塩基配列又は該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド又はその塩である上記（１）記載の物質。
（９）配列番号：３で表される塩基配列又は該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド又はその塩である上記（４）～（７）のいずれか１項に記載の物質。
（１０）配列番号：１９で表される塩基配列若しくは該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド又はその塩である上記（４）～（７）のいずれか１項に記載の物質。
（１１）TUP#001、TUP#002、TUP#003、TUP#004、TUP#005、TUP#006、TUP#007、TUP#008、TUP#009、TUP#010、TUP#011、TUP#012、TUP#013、TUP#014、TUP#015、TUP#016、TUP#017、TUP#018、TUP#019、TUP#020、TUP#021、TUP#022、TUP#023、TUP#024、TUP#025、TUP#026、TUP#027、TUP#028、TUP#029、TUP#030、TUP#031、TUP#032若しくはTUP#033で表されるオリゴヌクレオチド又はその塩である上記（１）記載の物質。
（１２）上記（１）記載の物質を含有してなる医薬。
（１３）生活習慣病の予防・治療剤である上記（１２）記載の医薬。
（１４）哺乳動物に対し上記（１）記載の物質の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における生活習慣病の予防又は治療方法。
（１５）生活習慣病の予防又は治療剤を製造するための上記（１）記載の物質の使用。
（１６）上記（５）、（８）、（９）、（１０）、又は（１１）記載の物質を含有する担体。

（１７）異なる2種以上の標的タンパク質をコードするそれぞれのmRNAのシスエレメントの少なくとも一部にそれぞれ結合し、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る2種以上の物質を組み合わせてなる医薬。
（１８）物質が、各標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、AUリッチエレメントへのAUリッチエレメント結合因子の結合を阻害し得る物質である上記（１７）記載の医薬。
（１９）物質が、各標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る核酸類縁物質又はその塩である上記（１７）記載の医薬。
（２０）物質が、各標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得るオリゴヌクレオチド又はその塩である上記（１７）記載の医薬。
（２１）物質がLNAを含むオリゴヌクレオチド又はその塩である上記（２０）記載の医薬。
（２２）物質がBNAを含むオリゴヌクレオチド又はその塩である上記（２０）記載の医薬。

（２３）ZFP36L1又はZFP36L2の機能を阻害する物質を含有してなる生活習慣病の予防・治療剤。
（２４）哺乳動物に対し上記（２３）記載の物質の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における生活習慣病の予防又は治療方法。
（２５）生活習慣病の予防又は治療剤を製造するための上記（２３）記載の物質の使用。

　本発明によれば、FGF21のmRNAのシスエレメントに結合する物質を用いて、該シスエレメントとシスエレメント結合因子との結合を阻害することにより、FGF21タンパク質の発現を増加させ、生活習慣病を予防・治療することができる。

ヒトFGF21 mRNA 3’-UTRの部分塩基配列と、ARE-A，ARE-Bをターゲットシスエレメントとして設計したオリゴヌクレオチドα-F21-A，α-F21-Bの塩基配列を示す図である（試験例１）。オリゴヌクレオチドを導入したヒト肝臓由来細胞株（HepG2）中のFGF21 mRNA量をリアルタイムPCR法により測定した結果を示す図である（試験例１）。オリゴヌクレオチドを導入したマウス肝臓由来細胞株（H2.35）中のFGF21 mRNA量をリアルタイムPCR法により測定した結果を示す図である（試験例１）。マウス肝細胞（H2.35）において、WY-14643によるFGF21 mRNAの細胞内転写量増幅効果とアクチノマイシンD処理による転写阻害時のFGF21 mRNAの細胞内不安定性を示す図である（試験例２）。 WY-14643非共存下におけるFGF21 mRNA量に及ぼすオリゴヌクレオチドの導入効果をHepG2細胞で検討した結果を示す図である（試験例２）。 WY-14643共存下におけるFGF21 mRNA量に及ぼすオリゴヌクレオチドの導入効果をH2.35細胞で検討した結果を示す図である（試験例２）。 H2.35細胞におけるFGF21タンパク質分泌量をELISA法で測定した結果を示す図である（試験例２）。 FGF21-3’UTRをベイト（おとり）として同定されたZFP36L1（Ａ）及びZFP36L2（Ｂ）のMSスペクトルデータを示す図である（試験例３）。 ZFP36L1のFGF21 mRNA 3’UTRへの結合能と、α-F21-A(LNA)、α-F21-B(LNA)による結合阻害を、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である（試験例４）。 RNAi（RNA干渉）を用いてZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制した場合のFGF21 mRNA量をリアルタイムPCR法により測定した結果を示す図である（試験例５）。本発明に係るオリゴヌクレオチドによるFGF21の発現増強メカニズムを説明する模式図である。 TUP#003～TUP#033とFGF21 mRNAとの位置関係及びTUP#003～TUP#033におけるLNA修飾塩基の位置を示す図である。図中の「FGF21 mRNA」は、該mRNAの3’UTRの一部（該mRNAの5’末端から826～843番目の部分塩基配列；配列番号：２５）を、3’→5’方向に記載したものである。オリゴヌクレオチドを導入したヒト肝臓由来細胞株Hep3BのFGF21 mRNA量をリアルタイムPCR法により測定した結果を示す図である（試験例６）。オリゴヌクレオチドを導入したマウス肝臓初代培養細胞中のFGF21 mRNA量をリアルタイムPCR法により測定した結果を示す図である（試験例７）。オリゴヌクレオチドを導入したヒト肝臓由来細胞株Hep3BからのFGF21タンパク質分泌量をELISAにより測定した結果を示す図である（試験例８）。オリゴヌクレオチドを導入したマウス肝臓初代培養細胞からのFGF21タンパク質分泌量をELISAにより測定した結果を示す図である（試験例９）。オリゴヌクレオチド（TUP#007）投与後のマウス肝臓中のFGF21 mRNA量をリアルタイムPCR法により測定した結果を示す図である（試験例１０）。

（発明の詳細な説明）
　本発明は、FGF21（fibroblast growth factor 21：線維芽細胞増殖因子21）のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る物質（以下、「本発明の物質」と略記することがある）に関する。

　FGF21のmRNA、すなわちFGF21のタンパク質をコードするmRNAの好ましい例としては、例えば、ヒトFGF21 cDNA（配列番号：１で表される塩基配列、GenBank Accession No. NM_019113）の「t」を「u」と読み替えた塩基配列で表されるヒトFGF21のmRNA（本明細書中、「配列番号：１で表されるFGF21 のmRNA」と称することがある。）、あるいはヒト以外の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル）におけるそのホモログ（例えば、配列番号：９で表される塩基配列からなるマウスFGF21 cDNA（GenBank Accession No. NM_020013）の「t」を「u」と読み替えた塩基配列で表されるマウスFGF21のmRNA）、さらにはそれらの天然のアレル変異体などがあげられる。

　本明細書において「シスエレメント」とは、同一mRNA上（即ち翻訳領域の上流又は下流）に存在し、mRNAの安定性やタンパク質への翻訳量の制御に関与し、mRNAにコードされた遺伝子産物（タンパク質）の発現量を決定する重要な要素となっている領域である。シスエレメントの具体例として、AUリッチエレメント、Histone mRNA 3’-UTR stem loop element、Internal ribosome entry site（IRES）、A2RE element、ZIPCODE element、Iron response element（IRE）、Cytoplasmic polyadenylation（CPE）、Nanos translational control、Amyloid precursor protein element（APP）、Ｔranslational regulation element（TGE）/direct repeat element（DRE）、Bruno element（BRE）、15-lipoxygenase differentiation control element（15-LOX-DICE）、G-quartet element、Adh mRNA down-regulation element、Barley yellow dwarf virus element、GLUT1 mRNA-stability control element、Msl-2 3’-UTR control element、Msl-2 5’-UTR control element、Ribosomal S12 mRNA translational control element、Selenocysteine insertion sequence type 1（SECIS-1）、Selenocysteine insertion sequence type 2（SECIS-2）、TNF-mRNA stability control element、Terminal oligopyrimidine tract（TOP）、Vimentin mRNA 3’-UTR control elementなどが挙げられる。上記シスエレメントの特に好ましい例としてAUリッチエレメントが挙げられる。

　AUリッチエレメント（AU-rich element：ARE）は、mRNAの3’-UTR（untranslated region：非翻訳領域）に多く存在するアデノシンとウリジンに富む10～150塩基程度の塩基配列であり、mRNAの安定性や翻訳レベルの制御に関与する配列である。AREは、現在、暫定的に（１）ウリジンに富む配列中に数コピーの「AUUUAペンタマー」を含む領域（ARE I）、（２）少なくとも2以上の重複する「UUAUUUA(U/A)(U/A)ノナマー」を含む領域（ARE II）、（３）「AUUUAペンタマー」を含まないがウリジンに富む領域（ARE III）に分類されている。本発明におけるAUリッチエレメントにはこれら3グループのAREが少なくとも含まれるものとする。

　前記AUリッチエレメントの具体例としては、配列番号：１で表されるFGF21 のmRNA塩基配列の5’末端側から814～821番目の塩基配列（ARE-Aと表記する場合がある）、配列番号：１で表されるFGF21 のmRNA塩基配列の5’末端側から835～842番目の塩基配列（ARE-Bと表記する場合がある）が挙げられる。AUリッチエレメントの好ましい例としては、ARE-Bが挙げられる。

　本明細書において「シスエレメント結合因子」とは、シスエレメントに結合し、該シスエレメントを含むmRNAの安定性を向上又は低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を促進又は抑制する機能を有する因子を意味する。

　上記「シスエレメント結合因子」におけるシスエレメントの例としては、前記したシスエレメントが挙げられる。上記シスエレメントの好ましい例として、AUリッチエレメントが挙げられる。

　本明細書の「シスエレメント結合因子」における結合因子の例として、前記シスエレメントに結合し、該シスエレメントを含むmRNAの安定性を向上又は低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を促進又は抑制する機能を有するタンパク質及びmiRNA（micro RNA）が挙げられる。上記結合因子の好ましい例として、前記シスエレメントに結合し、該シスエレメントを含むmRNAの安定性を低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を抑制する機能を有するタンパク質及びmiRNAが挙げられる。
　上記結合因子のさらに好ましい例として、前記シスエレメントに結合し、該シスエレメントを含むmRNAの安定性を低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を抑制する機能を有するタンパク質が挙げられる。

　前記「シスエレメント結合因子」の好ましい例として、AUリッチエレメント結合因子が挙げられる。AUリッチエレメント結合因子とは、AUリッチエレメントに結合し、該AUリッチエレメントを含むmRNAの安定性を向上又は低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を促進又は抑制する機能を有する因子を意味する。AUリッチエレメントに結合し、該AUリッチエレメントを含むmRNAの安定性を向上又は低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を促進又は抑制する機能を有するAUリッチエレメント結合因子であるタンパク質の具体例として、AUF1、HuR、Hel-N1、Hud、TTP、BRF1、TIA-1、KSRP、GUG-BP2、Nucleotin、TINO、PAIP2、ZFP36L1及びZFP36L2が挙げられ、miRNAの具体例として、miR16が挙げられる。

　AUリッチエレメント結合因子の好ましい例として、前記AUリッチエレメントに結合し、該AUリッチエレメントを含むmRNAの安定性を低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を抑制する機能を有するタンパク質及びmiRNAが挙げられる。上記結合因子のさらに好ましい例として、前記AUリッチエレメントに結合し、該AUリッチエレメントを含むmRNAの安定性を低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を抑制する機能を有するタンパク質が挙げられる。AUリッチエレメントを含むmRNAの安定性を低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を抑制する機能を有するAUリッチエレメント結合因子の具体例としては、ZFP36L1及びZFP36L2が挙げられる。AUリッチエレメントを含むmRNAの安定性を低下し、該シスエレメントを含むmRNAにコードされるタンパク質の発現を抑制する機能を有するAUリッチエレメント結合因子の好ましい例として、ヒトZFP36L1（GenBank Accession No. NM_004926.2）及びヒトZFP36L2(GenBank Accession No. NM_006887.4)が挙げられる。

　本発明の物質は、FGF21のmRNAのシスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害することにより、FGF21のmRNAを選択的に安定化して、該FGF21のmRNAにコードされたFGF21タンパク質の発現、すなわちFGF21の翻訳を促進する。

　本発明の物質としては、核酸類縁物質（例、オリゴヌクレオチド（天然オリゴヌクレオチド及びその人工類縁体）、miRNA及びその模倣物）（本明細書中、「本発明のオリゴヌクレオチド」と称されることがある）又はその塩、低分子化合物（例、非ペプチド性化合物、ペプチド）又はその塩などを挙げることができる。

　前記核酸類縁物質の具体例として、FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る核酸類縁物質が挙げられる。前記核酸類縁物質の好ましい例としてオリゴヌクレオチド又はその塩が挙げられる。

　本発明において、「一部に相補的な塩基配列」とは、対象シスエレメント配列とハイブリダイズした場合に、有意に標的mRNAを安定化し、翻訳を促進し得るのに十分な塩基長で、相補的な塩基配列をいう。シスエレメントが「UUAUUUA(U/A)(U/A)ノナマー」であるAUリッチエレメントである場合、「一部に相補的な塩基配列」の例として、該ノナマー中の連続する1塩基以上で相補的な塩基配列を挙げることができ、好ましい例として、該ノナマー中の連続する5塩基以上で相補的な塩基配列が挙げられ、さらに好ましい例として、該ノナマー中の連続する6塩基以上で相補的な塩基配列が挙げられる。
　「シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列」は、前記核酸類縁物質に、特定のmRNAのシスエレメントに特異的に結合する能力を付与するのに十分な塩基長で、標的シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的であればよい。シスエレメントがヒトFGF21のmRNAのAUリッチエレメント（ARE）の場合、シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列の例として、該AREの5’側及び3’側の合計で1塩基以上相補的な塩基配列を挙げることができ、好ましい例として、該AREの5’側及び3’側の合計で3～9塩基で相補的な塩基配列が挙げられる。シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列のさらに好ましい例として、ARE-Bの5’側及び3’側の合計で3～9塩基で相補的な塩基配列が挙げられる。
　上記シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列の具体例としては、配列番号：１で表されるFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から828～834番目の塩基配列に相補的な塩基配列、826～834番目の塩基配列に相補的な塩基配列、832～834番目の塩基配列に相補的な塩基配列、830～834番目の塩基配列に相補的な塩基配列が挙げられる。
　上記シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列の好ましい例としては、ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から828～834番目の塩基配列に相補的な塩基配列、826～834番目の塩基配列に相補的な塩基配列が挙げられる。上記シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列のより好ましい例としては、ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から826～834番目の塩基配列に相補的な塩基配列が挙げられる。

　本発明の「オリゴヌクレオチド」は、FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有することで、FGF21のmRNAに特異的に結合して該mRNAを安定化し得る一本鎖核酸であり、該安定化によりFGF21のmRNAからのFGF21タンパク質の翻訳レベルを高めることができる。

　本発明のオリゴヌクレオチドとしては、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは公知の修飾（例えば、当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート）を持つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン）や糖（例、モノサッカライド）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレン）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸））が付加されたものであってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」とは、プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいても良い。このような修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってもよい。修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてもよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンや、脂肪族基などで置換されていたり、又はエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてもよい。

　本発明のオリゴヌクレオチドの長さは、該オリゴヌクレオチドがFGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部を含む配列に特異的にハイブリダイズすることができ、それによって、結果としてFGF21タンパク質への翻訳が促進されるものであれば特に制限されず、短いもので約8塩基程度、長いもので約40塩基であり、好ましくは約12～約20塩基、特に好ましくは12～18塩基である。
　本発明においては、ターゲットとするAREエレメントの領域をより狭い範囲に絞り込み、かつオリゴヌクレオチドをLNA、BNA等で合成することによって、例えば約12mer（12～18mer）という非常に短いアンチセンスオリゴヌクレオチド（この塩基長でも標的mRNAに対する高い親和性と選択性が保持される）でFGF21の発現を制御できる点に大きな特徴がある。

　本発明のオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾が施されたヌクレオチド分子であってもよく、また、核酸類縁物質であってもよい。上記化学修飾の例として、オリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート、ボラノホスフェートなどの化学修飾リン酸残基に置換する修飾が挙げられる。
　また、上記化学修飾の別の例として、各ヌクレオチドの糖の2'位水酸基を別の官能基に置換する修飾が挙げられる。ここで、別の官能基としては、ハロゲン原子（例、フッ素原子)；C_1-6アルキル基（例、メチル基）；C_1-6アルキル基（例、メチル基）で置換されていてもよいアミノ基；-OR（Rは、例えばCH₃（2'-O-Me）、CH₂CH₂OCH₃（2'-O-MOE）、CH₂CH₂NHC(NH)NH₂、CH₂CONHCH₃、CH₂CH₂CNを示す）に置換する修飾が挙げられる。上記化学修飾のさらにまた別の修飾として、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよい。塩基部分に施す化学修飾の例として、ピリミジン塩基の5位へメチル基やカチオン性官能基の導入する修飾、あるいは2位のカルボニル基をチオカルボニル基に置換する修飾が挙げられる。
　また、前記核酸類縁物質の例としては、UNA(unlocked nucleic acid)、HNA、モルフォリーノオリゴ（morpholino oligo）、PNA(peptide nucleic acid)が挙げられる。上記HNAは、そのヘキソピラノース部分の水酸基がデオキシ化されていてもよい。また、上記HNAは、そのヘキソピラノース部分の水酸基がフッ素原子に置換されていてもよい。

　RNAの糖部のコンフォーメーションはC2'-endo（S型）とC3'-endo（N型）の2つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2'酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA、LNA（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）、cEt、cMOE （Seth et al., Journal of Medicinal Chemistry, 51, 10-13, 2009）などもオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド分子として、好ましく用いられ得る。
　BNA、LNAとしては、具体的には、国際公開第2005/021570号、国際公開第03/068695号、国際公開第2001/007455号に記載のものを用いることができ、本発明のオリゴヌクレオチドは、これらBNA及び／又はLNAを含有していてもよい。

　本発明のオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド分子が化学修飾を施されたヌクレオチド分子である場合の本発明のオリゴヌクレオチドの具体例として、オリゴヌクレオチド（例、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４）の一部又は全ての構成ヌクレオチドが、国際公開第2005/021570号パンフレット、国際公開第03/068695号パンフレット、国際公開第2001/007455号パンフレットに記載のBNA（例、2’,4’-BNA^NC、2’,4’-BNA^COC）やLNA（2’,4’-BNA）で置換されたオリゴヌクレオチド、あるいはSオリゴ化されたオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオチド間のリン酸残基が、ホスホロチオエートの化学修飾リン酸残基に置換されたオリゴヌクレオチド）が挙げられる。より具体的には、オリゴヌクレオチドの一部又は全ての構成ヌクレオチドが、実施例１に記載の化合物5（BNA^NC-アデノシンモノマー）や実施例２に記載の化合物9（BNA^NC-グアノシンモノマー）、さらに同様にして合成され得るBNA^NC-ピリミジンモノマーを用いて合成されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。
　前記、オリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオチド間のリン酸残基が、ホスホロチオエートの化学修飾リン酸残基に置換されたオリゴヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオチド間のリン酸残基が化１に示す化学修飾を受けたオリゴヌクレオチドを指す。

　本発明のオリゴヌクレオチドとしては、ヒトFGF21のmRNAのAUリッチエレメント（ARE-A又はARE-B、好ましくはARE-B）の少なくとも一部に結合し得るものが好ましい。
　図１に示す通り、ARE-A（ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から814～821番目の塩基配列）の一部としては、ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から816～821番目の塩基配列などが挙げられる。
　ARE-B（ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から835～842番目の塩基配列）の一部の例として、ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から835～839番目の塩基配列、835～841番目の塩基配列、835～837番目の塩基配列などが挙げられる。ARE-B（ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から835～842番目の塩基配列）の一部の好ましい例として、835～839番目の塩基配列、835～841番目の塩基配列が挙げられる。ARE-B（ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から835～842番目の塩基配列）の一部のさらに好ましい例として、835～841番目の塩基配列が挙げられる。
　ARE-Aの少なくとも一部に結合し得るオリゴヌクレオチドとしては、上記した通り、特に長さは限定されないが、例えば、ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から816～827番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：２）などが用いられる。
　ARE-Bの少なくとも一部に結合し得るオリゴヌクレオチドとしては、上記した通り、特に長さは限定されないが、例えば、ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から、828～839番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：３）、826～843番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：１８）、826～841番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：１９）、828～841番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：２０）、826～839番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：２１）、832～843番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：２２）、830～841番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：２３）、826～837番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：２４）が挙げられる。
　上記した中でも、配列番号：３、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３又は配列番号：２４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号：３又は配列番号：１９で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがさらに好ましい。

　本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい具体例としては、後述の表１に示されるTUP#001～TUP#033（これらのうち、TUP#001はα-F21-B(BNA)、TUP#002はα-F21-B(LNA)と表記する場合もある）が挙げられ、より好ましい例として、TUP#001、TUP#002、TUP#003、TUP#004、TUP#005、TUP#006、TUP#007、TUP#008、TUP#011、TUP#015、TUP#016、TUP#019、TUP#023、TUP#030が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドのさらに好ましい例として、TUP#003、TUP#004、TUP#007、TUP#015、TUP#019が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドの特に好ましい例として、TUP#007が挙げられる。

　本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３又は配列番号：２４で表される塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。

　ここで「実質的に同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド」とは、細胞内の生理的条件下で、FGF21のmRNAのARE-A又はARE-Bの一部に特異的にハイブリダイズし、かつ該mRNAからのFGF21タンパク質の翻訳を促進し得るオリゴヌクレオチドを意味し、具体的には、上記各配列番号で表される塩基配列と80%以上、好ましくは90%以上の同一性を有する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、あるいは、上記各配列番号で表される塩基配列において1もしく2個の塩基が他の塩基で置換された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

　本発明のオリゴヌクレオチドは、上記した各種修飾を含むオリゴヌクレオチドを含め、いずれも国際公開第2005/021570号パンフレット、国際公開第03/068695号パンフレット、国際公開第2001/007455号パンフレットに記載の自体公知の手法あるいはそれに準じる方法により、化学的に合成することができる。また、所望の修飾オリゴヌクレオチドが委託合成により入手可能である（例、株式会社ジーンデザイン）。

　本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、修飾基を付加された形態で供与されうる。こうした特殊形態、付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロール）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3'端又は5'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3'端又は5'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。

　本発明のオリゴヌクレオチドは、無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸等と塩を形成してもよい。上記無機塩基との塩の例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。上記有機塩基との塩の例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミンとの塩が挙げられる。上記無機酸との塩の例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられる。上記有機酸との塩の例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。これらの塩のなかでも、薬理学的に許容される塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、該ヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと複合体を形成していてもよい。

　本発明の物質は、上記のようなFGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列を含む核酸類縁物質に限定されず、FGF21タンパク質の産生を、該シスエレメントへの結合による該mRNAの安定化を介して促進する限り、低分子化合物又はその塩などであってもよい。FGF21のmRNAのシスエレメントに結合して該mRNAからのFGF21タンパク質の翻訳を促進する低分子化合物は、例えば、該シスエレメントと同一の塩基配列を有する核酸と試験化合物との結合能を、該核酸もしくは試験化合物のいずれかを標識することにより検定し、さらに該試験化合物の存在下におけるFGF21のmRNAの安定化又はFGF21タンパク質の産生量の増加を、例えばRT-PCRや各種免疫学的分析を用いて評価することにより取得することができるが、自体公知の他のいかなるスクリーニング法も利用することができる。

　本発明の物質が有するFGF21タンパク質発現促進活性は、FGF21遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外のFGF21遺伝子発現系、又は生体内や生体外のFGF21タンパク質発現系を用いて調べることができる。

　該低分子化合物の塩としては、無毒性の塩であれば如何なるものであってもよいが、例えば、薬理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属、アルカリ土類金属）などとの塩が用いられ、とりわけ薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩を挙げることができる。

　また、本発明は、前記本発明の物質を含有してなる医薬（本明細書中、「本発明の医薬」ともいう）に関する。

　上述の通り、FGF21は糖尿病や肥満症などをはじめとする生活習慣病に対する予防・治療効果が報告されているので、本発明の医薬は、生活習慣病の予防・治療剤として使用することができる。

　本発明の医薬により予防・治療され得る生活習慣病としては、具体的には、糖尿病、脳卒中、脳出血、脳梗塞、心臓病（例、心筋梗塞、狭心症）、高脂血症、高血圧、肥満、メタボリックシンドローム、慢性気管支炎、COPD（慢性閉塞性肺疾患）、肺気腫、肺扁平上皮癌、大腸癌、アルコール性肝炎、痛風などが挙げられる。なかでも、糖尿病、肥満が好ましい。

　本発明のオリゴヌクレオチドは、担体に結合、封入して医薬に含有させることができる。

　本発明のオリゴヌクレオチドを結合、封入させる担体の例としては、リポソーム、リポプレックスが挙げられる。特に、本発明の物質を細胞内に運搬しやすくするためにはリポソームが好ましい。好ましいリポソームとしては、正電荷リポソーム、正電荷コレステロール、膜透過性ペプチド結合リポソームが挙げられる（中西守ら、タンパク質核酸酵素、44: 1590-1596 (1999)、二木史朗、化学と生物、43: 649-653 (2005)、Clinical Cancer Research 59: 4325-4333 (1999) など）。

　FGF21遺伝子の転写産物に相補的に結合し、該転写産物の翻訳レベルを高めることができる本発明のオリゴヌクレオチドは、生体内におけるFGF21タンパク質の機能や作用を促進し、生活習慣病の予防・治療剤として使用することができる。

　本発明の物質または本発明の医薬は低毒性であり、そのまま、又は適当な剤型の医薬組成物として、哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒト）に対して経口的又は非経口的に投与（例、血管内投与、皮下投与、直腸投与、経尿道投与、腹腔内投与）することができる。

　本発明のオリゴヌクレオチドを上記の生活習慣病の予防・治療剤として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。該オリゴヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。

　さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記オリゴヌクレオチドを単独又はリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。

　本発明の医薬は、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤などを含むものであってよい。本発明の医薬は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。

　本発明の医薬を非経口的に投与する場合には、例えば、注射剤、坐剤として投与される。上記注射剤には静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形が包含される。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、又は油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕を併用してもよい。上記油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。上記坐剤は、公知の方法に従って調製することができ、例えば、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製できる。

　本発明の医薬を経口的に投与する場合には、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等として投与される。本発明の医薬は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。本発明の医薬が錠剤である場合、該錠剤は錠剤用の担体、賦形剤（例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム）を含有していてもよい。

　本発明の医薬は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位に調製されることが好都合である。活性成分の投与量に適合するような投薬単位に調製される剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明の物質は、例えば、投薬単位剤形当たり通常5～500mg、とりわけ注射剤では5～100mg、その他の剤形では10～250mg含有されていることが好ましい。

　本発明の医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の糖尿病または肥満の治療・予防のために使用する場合には、本発明の核酸を１回量として、通常0.01～20mg/kg体重程度、好ましくは0.1～10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1～5mg/kg体重程度を、1日1～5回程度、好ましくは1日1～3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与及び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。

　本発明の医薬は、本発明の物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。

　さらに、本発明の医薬は、他の薬剤、例えば、インスリン抵抗性改善薬（例、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン等のチアゾリジン誘導体）、血糖降下薬（例、グリベンクラミド、グリメピリド、トルブタミド、グリコピラミド、アセトヘキサミド等のスルホニルウレア薬、グリミジン、グリブゾール等のスルホンアミド薬、メトフォルミン、ブフォルミン等のビグアナイド薬）、アルドース還元酵素阻害薬（例、エパルレスタット）、α-グルコシダーゼ阻害薬（例、ボグリボース、アカルボース）、ソマトメジンＣ製剤（例、メカセルミン）などの抗糖尿病薬；中枢性抗肥満薬（例、デキスフェンフルラミン、フェンフルラミン、フェンテルミン）、MCH受容体拮抗薬（例、SB-568849、SNAP-7941）、ニューロペプチドＹ拮抗薬（例、CP-422935）、カンナビノイド受容体拮抗薬（例、SR-141716、SR-147778）、グレリン拮抗薬、レプチン、β3アゴニストなどの抗肥満薬と併用してもよい。これら薬剤の投与量は、その臨床用量を参照して、適宜選択すればよい。本発明の医薬及び上記薬剤は、同時又は異なった時間に患者に投与すればよい。

　本発明の別の実施態様としては、異なる2種以上の標的タンパク質をコードするそれぞれのmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る2種以上の物質を組み合わせてなる医薬が挙げられる。

　異なる2種以上の標的タンパク質とは、例えば、FGF21や、mRNAがシスエレメント結合因子によってFGF21と同じく不安定化していたり、mRNAからの翻訳が抑制されている遺伝子からなる群より選択された2種以上のタンパク質をいう。

　上記物質としては、具体的には、各標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、該シスエレメント（好ましくは、AUリッチエレメント）へのシスエレメント結合因子（好ましくは、AUリッチエレメント結合因子）の結合を阻害し得る物質が挙げられる。

　ここで、シスエレメント及びシスエレメント結合因子の例としては、前述したシスエレメント及びシスエレメント結合因子が挙げられる。

　より詳細には、該物質は、各標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る核酸類縁物質であり、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはその塩である。

　該オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド分子は、前記化学修飾を施されたヌクレオチド分子であってもよい。該オリゴヌクレオチドはLNA又はBNAを含むことが好ましく、BNAを含むことがさらに好ましい。上記オリゴヌクレオチドは、Sオリゴ化されたオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオチド間のリン酸残基が、ホスホロチオエートの化学修飾リン酸残基に置換されたオリゴヌクレオチド）であってもよい。

　１つの標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る物質の例としては、オリゴヌクレオチド、LNAを含むオリゴヌクレオチド、BNAを含むオリゴヌクレオチド、及びその他の核酸類縁物質、又はそれらの塩が挙げられ、好ましい例としてLNAを含むオリゴヌクレオチド又はその塩、及びBNAを含むオリゴヌクレオチド又はその塩が挙げられる。

　また、他の標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、該シスエレメント結合因子の結合を阻害し得る物質の例として、オリゴヌクレオチド、LNAを含むオリゴヌクレオチド、BNAを含むオリゴヌクレオチド、及びその他の核酸類縁物質、又はそれらの塩が挙げられ、好ましい例としてLNAを含むオリゴヌクレオチド又はその塩、及びBNAを含むオリゴヌクレオチド又はその塩が挙げられる。

　該物質の1種以上は、低分子化合物又はその塩であってもよい。このような低分子化合物は、上記FGF21のmRNAのシスエレメントに結合する低分子化合物と同様の手法により取得することができる。また、該低分子化合物の塩としては、上記FGF21のmRNAのシスエレメントに結合する低分子化合物の塩と同様のものが例示される。

　本発明の他の実施態様としては、ZFP36L2又はZFP36L1の機能を阻害する物質を含有してなる生活習慣病の予防・治療剤を挙げることができる。

　ここでZFP36L2、ZFP36L1は本明細書における「シスエレメント結合因子」の一例である。

　ZFP36L2、ZFP36L1の機能を阻害する物質は、該タンパク質の発現を抑制したり、該タンパク質に結合して、FGF21等のターゲットmRNAのシスエレメントへの結合を阻害することにより、結果的に上記本発明の物質と同等の効果を発揮する。このような阻害物質としては、例えば、ZFP36L2（配列番号：６、８）もしくはZFP36L1（配列番号：５、７）mRNAに対するアンチセンス核酸、siRNA、shRNA、miRNA又はリボザイム核酸、ZFP36L2もしくはZFP36L1タンパク質に対する中和抗体、アプタマー又はアンタゴニスト化合物が挙げられる。これらの阻害物質は、ZFP36L2及びZFP36L1の塩基配列及びアミノ酸配列情報に基づいて、例えば国際公開第2008/102777号公報に記載される方法を適用することにより、当業者であれば容易に取得可能である。

　生活習慣病の具体例は前述の通りである。

　予防・治療剤としては、前記物質をそのまま用いても良いが、本発明の医薬と同様の添加物と共に使用しても良い。

　また、該予防・治療剤は、本発明の医薬に関して前述の投与方法・投与量で使用することができる。

　本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。

　DNA         ：デオキシリボ核酸
　cDNA        ：相補的デオキシリボ核酸
　  A         ：アデニン
　  T         ：チミン
　  G         ：グアニン
　  C         ：シトシン
　RNA         ：リボ核酸
　mRNA        ：メッセンジャーリボ核酸
　dATP        ：デオキシアデノシン三リン酸
　dTTP        ：デオキシチミジン三リン酸
　dGTP        ：デオキシグアノシン三リン酸
　dCTP        ：デオキシシチジン三リン酸
　ATP         ：アデノシン三リン酸
　EDTA        ：エチレンジアミン四酢酸
　SDS         ：ドデシル硫酸ナトリウム
　Gly         ：グリシン
　Ala         ：アラニン
　Val         ：バリン
　Leu         ：ロイシン
　Ile         ：イソロイシン
　Ser         ：セリン
　Thr         ：スレオニン
　Cys         ：システイン
　Met         ：メチオニン
　Glu         ：グルタミン酸
　Asp         ：アスパラギン酸
　Lys         ：リジン
　Arg         ：アルギニン
　His         ：ヒスチジン
　Phe         ：フェニルアラニン
　Tyr         ：チロシン
　Trp         ：トリプトファン
　Pro         ：プロリン
　Asn         ：アスパラギン
　Gln         ：グルタミン
　pGlu        ：ピログルタミン酸
　Sec         ：セレノシステイン（selenocysteine）
　THF         ：テトラヒドロフラン
　HPLC        ：高速液体クロマトグラフィー
　DMSO        ：ジメチルスルホキシド
　PCR         ：ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）
　RT-PCR      ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse Transcription-
　            　Polymerase Chain Reaction）
　FBS         ：ウシ胎仔血清
　DMEM        ：ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagl
　　　　　　　　e Medium）
　MEM         ：最小必須培地（Minimal Essential Medium）

　本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
　ヒトFGF21 cDNAの塩基配列を示す（GenBank Accession No. NM_019113.2）。
〔配列番号：２〕
　ARE-Aの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
　ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
　FGF21 mRNAに対して相補性を有しないオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
　ヒトZFP36L1をコードするcDNAの塩基配列を示す（GenBank Accession No. NM_004926.2）。
〔配列番号：６〕
　ヒトZFP36L2をコードするcDNAの塩基配列を示す（GenBank Accession No. NM_006887.4）。
〔配列番号：７〕
　マウスZFP36L1をコードするcDNAの塩基配列を示す（GenBank Accession No. NM_007564.3）。
〔配列番号：８〕
　マウスZFP36L2をコードするcDNAの塩基配列を示す（GenBank Accession No. NM_001001806.2）。
〔配列番号：９〕
　マウスFGF21をコードするcDNAの塩基配列を示す（GenBank Accession No. NM_020013.4）。
〔配列番号：１０〕
　ヒトβ-アクチン mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
　ヒトβ-アクチン mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
　ヒトFGF21 mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
　ヒトFGF21 mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
　マウスβ-アクチン mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
　マウスβ-アクチン mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
（GenBank Accession No. NM_004926.2）。
〔配列番号：１６〕
　マウスFGF21 mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
（GenBank Accession No. NM_006887.4）。
〔配列番号：１７〕
　マウスFGF21 mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
　ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
　ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
　ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
　ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
　ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
　ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
　ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
　ヒトFGF21 mRNAの5’側末端から826～843番目の部分塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
　ヒトFGF21 mRNAの5’側末端から791～860番目の塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
　ヒトβ-アクチン　mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
　ヒトβ-アクチン　mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
　ヒトβ-アクチン用プローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
　ヒトFGF21 mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
　ヒトFGF21 mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
　ヒトFGF21用プローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
　マウスβ-アクチン mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
　マウスβ-アクチン mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
　マウスβ-アクチン用プローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
　マウスFGF21 mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
　マウスFGF21 mRNA増幅用プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
　マウスFGF21用プローブの塩基配列を示す。

　以下に実施例および試験例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。

（実施例１）BNA^NC-アデノシンモノマーユニットの合成
　原材料1（680mg、1.17mmol）及び6-N-ベンゾイルアデニン（1.4g、5.9mmol）をトルエン（11mL）中に懸濁させた。懸濁液にN,O-ビス-トリメチルシリルアセトアミド（BSA）を加え100℃に加温した後、1時間攪拌を行なった。反応液に対して、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（TMSOTf）を加えさらに30分間攪拌を行なった。反応液を冷却し酢酸エチル（200mL）で希釈を行なった後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水（各100mL）で洗浄を行なった。得られた有機層は硫酸ナトリウムによって乾燥を行なった後、濃縮を行なった。混合物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン－酢酸エチル）によって精製を行ない目的とする保護されたBNA^NC-アデノシンヌクレオシド（化合物2：533mg、0.81mmol）を得た。
¹H NMR (600MHz, CHLOROFORM-d) δ 0.91-1.20 (m, 28H), 2.68 (d,J=11.00, 1H),2.81 (s, 3H), 3.01(d,J=11.00, 1H), 3.73 (d,J=12.84, 1H), 4.04 (d,J=12.84, 1H), 4.50 (d,J=2.93, 1H), 4.77 (d,J=2.57, 1H), 6.79 (s, 1H), 7.52 (t,J=7.70, 2H), 7.61 (t,J=7.30, 1H), 8.03 (d,J=7.70, 2H), 8.35 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 9.17 (s, 1H).

　化合物2（530mg、0.81mmol）をTHF 10mLに溶解させ、トリエチルアミン（200μL、1.42mmol）、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（460μL、2.84mmol）を加え室温で1時間30分攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチル（10mL）で希釈した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル-メタノール）で精製を行なった。（化合物3：330mg、0.81mmol）
¹H NMR (300MHz, DMSO-d6) δ 2.72 (s, 3H), 2.86 (s, 2H), 3.62 (m, 2H), 4.18 (dd,J=5.5, 3.2, 1H), 4.52 (d,J=3.0, 1H), 5.12 (t,J=5.9, 1H), 5.47 (d,J=5.5, 1H), 6.67 (s, 1H), 7.48-7.72 (m, 3H), 8.01-8.09 (m, 2H), 8.60 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 11.22 (br. s, 1H).

　化合物3（300mg、0.72mmol）を乾燥ピリジンで共沸乾燥を行ない、ピリジン（4mL）に溶解させた。4,4’-ジメトキシトリチルクロリド（271mg、0.8mmol）を加え、室温で12時間攪拌を行なった。反応液に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10mL）を加えた後、水層を酢酸エチル（25mL）で抽出を行なった。得られた有機層は、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10mL）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させた後、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン-酢酸エチル）によって精製を行ない、化合物4を得た。（化合物4：416mg、0.58mmol）
¹H NMR (300MHz, CHLOROFORM-d) δ 2.78 (s, 3H), 2.82-3.11 (m, 3H), 3.38 (s, 2H), 3.77 (s, 6H), 4.39 (br. s, 1H), 4.67 (d,J=2.8, 1H), 6.75-6.89 (m, 5H), 7.15-7.64 (m, 12H), 8.00 (d, 2H), 8.33 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 9.17(br. s, 1H).

　化合物4（410mg、0.57mmol）を無水アセトニトリルで2度共沸乾燥を行ない、無水アセトニトリル（2.5mL）に溶解させた。N,N,N’,N’-テトライソプロピル-2-シアノエチルホスホロジアミダイト（200μL、0.63mmol）及び、4,5-ジシアノイミダゾール（71mg、0.6mmol）を順次加えた。室温で2時間の攪拌の後、反応液を酢酸エチル（20mL）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10mL）を加えて反応を停止させた。有機層はさらに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10mL）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Diol-シリカゲル（富士シリシア社製、ヘキサン-アセトン）を用いて精製を行ない目的物とするBNA^NC-アデノシンモノマーを得た。（化合物5：480mg、0.52mmol）
¹H NMR (300MHz, CHLOROFORM-d) δ 0.92-1.22 (m, 12H), 2.26-2.48 (m, 2H), 2.76, 2.78 (2s, 3H), 2.82-2.95 (m, 2H), 3.27-3.64 (m,4H), 3.78-3.79 (m, 6H), 4.44-4.59 (2m,1H), 4.81-4.89 (m, 1H), 6.75-6.89 (m, 5H), 7.16-7.66 (m, 12H), 7.99-8.07 (m, 2H), 8.35, 8.42 (2s, 1H), 8.84 (s, 1H), 9.05 (br. s, 1H).
³¹P NMR (121MHz) δ 149.08, 149.36

（実施例２）BNA^NC-グアノシンモノマーユニットの合成
　原材料1（1.0g、1.7mmol）及び6-O-ジフェニルカルバモイル-2-N-アセチルグアニン（3.6g、8.6mmol）をトルエン（10mL）中に懸濁させた。懸濁液にN,O-ビス-トリメチルシリルアセトアミド（BSA）を加え100℃で、30分間攪拌を行なった。反応液に対し、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（TMSOTf）を加えさらに30分間攪拌を行なった。反応液を冷却し酢酸エチル（50mL）で希釈を行なった後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水（各50mL）で洗浄を行なった。得られた有機層は硫酸ナトリウムによって乾燥を行なった後、ろ過によって不溶物を除去した後、濃縮を行なった。混合物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン-酢酸エチル）によって精製を行ない目的とする保護されたBNA^NC-グアノシンヌクレオシド（化合物6：325mg、0.4mmol）を得た。
¹H NMR (600MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 0.77-1.19 (m, 28H), 2.60 (s, 3H), 2.67 (d,J=11.00Hz, 1H), 2.79 (s, 3H), 2.98 (d,J=11.00Hz, 1H), 3.72 (d,J=12.84Hz, 1H), 4.06 (d,J=12.84Hz, 1H), 4.22 (d,J=2.93Hz, 1H), 4.53 (d,J=2.93Hz, 1H), 6.63 (s, 1H), 7.12-7.56 (m, 10H), 8.02 (s, 1H), 8.29 (s, 1H).

　化合物6（320mg、0.4mmol）をTHF 5mlに溶解させ、トリエチルアミン（98μL、0.7mmol）、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（228μL、1.4mmol）を加え室温で1時間30分攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチル（10mL）で希釈した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－メタノール）で精製を行ない、化合物7を得た。（化合物7：180mg、0.32mmol）
¹H NMR (300MHz, CHLOROFORM-d) δ 2.38 (s, 3H), 2.59-2.92 (m, 4H), 3.68 (s, 2H), 3.91 (br. s, 1H), 4.21 (br. s, 1H), 4.48 (d,J=2.64Hz, 1H), 4.58 (br. s, 1H), 6.57 (s, 1H), 7.11-7.54 (m, 10H), 8.25 (s, 1H), 8.92 (s, 1H).

　化合物7（160mg、0.28mmol）を乾燥ピリジンで共沸乾燥を行ない、ピリジン（1.5mL）に溶解させた。4,4’-ジメトキシトリチルクロリド（108mg、0.32mmol）を加え、室温で12時間攪拌を行なった。反応液に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10mL）を加えた後、水層を酢酸エチル（20mL）で抽出を行なった。得られた有機層は、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10mL）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させた後、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン-酢酸エチル）によって精製を行ない、化合物8を得た。（化合物8：176mg、0.20mmol）
¹H NMR (300MHz, CHLOROFORM-d) δ 2.49 (s, 3H), 2.72 (d,J=8.50Hz, 1H), 2.78 (s, 3H), 2.85 (d,J=11.90Hz, 1H), 3.04 (d,J=11.90Hz, 1H), 3.35 (s, 2H), 3.75 (m, 6H), 4.47 (br, 1H), 4.70 (d,J=2.83Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.80 (d,J=8.69Hz, 4H), 7.14-7.52 (m, 19H), 8.15 (s, 1H), 8.22 (s, 1H).

　化合物8（140mg、0.16mmol）を無水アセトニトリルで2度共沸乾燥を行ない、無水アセトニトリル（1mL）に溶解させた。N,N,N’,N’-テトライソプロピル-2-シアノエチルホスホロジアミダイト（76μL、0.24mmol）及び、4,5-ジシアノイミダゾール（21mg、0.18mmol）を順次加えた。室温で2時間の攪拌の後、さらにN,N,N’,N’-テトライソプロピル-2-シアノエチルホスホロジアミダイト（38μL、0.12mmol）及び、4,5-ジシアノイミダゾール（10mg、0.09mmol）を順次加えた。さらに室温で1時間の攪拌の後、反応液を酢酸エチル（10mL）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（5mL）を加えて反応を停止させた。有機層はさらに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10mL）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Diol-シリカゲル（富士シリシア社製、ヘキサン－アセトン）を用いて精製を行ない目的とするBNA^NC-グアノシンモノマーを得た。（化合物9：153mg、0.14mmol）
¹H NMR (300MHz, CHLOROFORM-d) δ 0.92-1.19 (m, 12H), 2.27-2.49 (m, 2H), 2.58 (s, 3H), 2.74, 2.77 (2s, 3H), 2.82-3.06 (m, 2H), 3.27-3.73 (m, 4H), 3.77-3.78 (m, 6H), 4.20-4.45 (m, 1H), 4.73 (m, 1H), 6.68 (2s, 1H), 6.77-6.87 (m, 4H), 7.20-7.51 (m, 19H), 7.98 (s, 1H), 8.27, 8.31 (2s, 1H).
³¹P NMR (121MHz) TM148.72, 149.41
　実施例１及び２のBNA合成スキームを化２に示す。

（実施例３）BNA^ＮＣオリゴヌクレオチドの合成
　図１（Ｄ）は、FGF21 mRNAの3’UTRに存在するAREの1つ、ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチド（「α-F21-B(BNA)」又は「TUP#001」と表記する）の塩基配列を示す。α-F21-B(BNA)は、ARE-Bの一部に相補的な塩基配列と、ARE-Bの5’側に連続する3’UTRの一部に相補的な塩基配列とからなる（配列番号：３参照）。
　配列番号：３で示される塩基配列からなるBNA^ＮＣオリゴヌクレオチドα-F21-B(BNA)（TUP#001）は、核酸自動合成機（日本テクノサービス社製、MODEL:NTS H-8-SE）を用い、0.2マイクロモルスケールで合成を行なった。合成に用いられる試薬類は、以下に示す市販のものを用いた：10% ジクロロ酢酸トルエン溶液、乾燥アセトニトリル（和光純薬）、0.35M ベンジルチオテトラゾールアセトニトリル溶液、CapA、CapB、酸化剤（グレンリサーチ）。BNA^ＮＣチミジン及び5-メチルシチジンのホスホロアミダイトは株式会社BNAより購入したものを用いた。BNA^ＮＣアデノシン及びグアノシンのホスホロアミダイトは、実施例１の化合物5と実施例２の化合物9を用いた。固相担体は、グレンリサーチ社製Unysupportを用いた。縮合反応は、50等量のアミダイトを用いて15分間の反応時間で行ない、標記の化合物を合成した。また、固相担体に対して1塩基目及び2塩基目の縮合反応は、2度行なうことによって、全長のオリゴヌクレオチドの合成収率を向上させた。

　目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を25% アンモニア水、55℃で処理することによって、オリゴマーを固相担体からの切り出し及び、リン原子上と核酸塩基部位の脱保護を行なった。固相担体を濾去したのち残った溶媒を留去した。残渣をイオン交換HPLC（GEヘルスケア社製 AKTA explore 10s、カラム：SOURCE15Q 4.6/100PE、溶離液A：10mM NaClO₄ 1mM Tris，溶離液B：1M NaClO₄ 1mM Trisグラジエント：B=0%-100%（17min linear gradient）、室温、流速1.5mL/min）で精製し、合成オリゴヌクレオチドの5’-末端にジメトキシトリチル基を有するピークを集めた。目的物の画分は集めて濃縮を行ない、残渣に対して80% 酢酸水溶液（300μL）を加え20分間静置することによって、ジメトキシトリチル基を除去した。反応混合液に水（300μL）、3M 酢酸ナトリウム水溶液（120μL）を加え濃縮した。濃縮後の残渣を水で1mLにメスアップを行なった後、GEヘルスケア社製NAP-10カラムで2度脱塩を行ない、目的のオリゴヌクレオチドを得た。得られた化合物はイオン交換HPLC（GEヘルスケア社製 AKTA explore 10s、カラム：SOURCE15Q 4.6/100PE、溶離液A：10mM NaClO₄ 1mM Tris，溶離液B：1M NaClO₄ 1mM Trisグラジエント：B=0%-100%（17min linear gradient）、室温、流速1.5mL/min）で分析すると保持時間6.5分で溶出された。MALDI-TOF質量分析によって得られた化合物の質量を同定した（計算値：4379.1(M-1)、測定値:4379.20）。

（試験例１）FGF21の発現制御実験
　FGF21を標的遺伝子として、本発明に係るオリゴヌクレオチドを用い、遺伝子発現量の制御を行った。

（１－１）ポリヌクレオチド類似体の設計
　NCBIデータベースに登録されたFGF21 mRNAの塩基配列を参照し、mRNAの3’UTRに存在する2つのAREを同定した。これら2つのARE（「ARE-A」及び「ARE-B」と表記する）は、ヒト、アカゲザル、マウス、ラット、イヌ、ウマ等の生物種間で保存されたコンセンサス配列「UAUUUAUU」として同定された。
　ARE-Aは、配列番号：１に示すヒトFGF21 mRNA（GenBank Accession No. NM_019113）のうち、5’末端から814～821番目の塩基の領域に対応する。また、ARE-Bは、5’末端から835～842番目の塩基の領域に対応する。
　ARE-A及びARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチドを設計した。図１に、ARE-A及びARE-B周辺のFGF21 mRNA 3’-UTRの部分塩基配列と、設計したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
　図１（Ａ）は、FGF21 mRNA（配列番号：１参照）の全長940塩基うち、ARE-A及びARE-Bを含む部分（5’側末端から791～860番目の塩基）の塩基配列（配列番号：２６）を示す。塩基配列中の下線部は「AUUUAペンタマー」を示す。
　図１（Ｂ）は、ARE-Aの一部に相補的なオリゴヌクレオチド（「α-F21-A(LNA)」と表記する）の塩基配列を示す。α-F21-A(LNA)は、ARE-Aの一部に相補的な塩基配列（cARE）と、ARE-Aの3’側に連続する3’UTRの一部に相補的な塩基配列（cUTR）とからなる（配列番号：２参照）。α-F21-A(LNA)の長さは12merである。
　図１（Ｃ）は、ARE-Bの一部に相補的なオリゴヌクレオチド（「α-F21-B(LNA)」又は（TUP#002）と表記する）の塩基配列を示す。α-F21-B(LNA)（TUP#002）は、ARE-Bの一部に相補的な塩基配列と、ARE-Bの5’側に連続する3’UTRの一部に相補的な塩基配列とからなる（配列番号：３参照）。
　α-F21-B(LNA)の長さは12merである。α-F21-A(LNA)及びα-F21-B(LNA)は、LNAからなる合成オリゴヌクレオチドである。α-F21-A(LNA)及びα-F21-B(LNA)は、委託合成（株式会社ジーンデザイン）により得た。
　α-F21-A(LNA)及びα-F21-B(LNA)の合成は自体公知の方法に準じて行なった。すなわち、一般的なホスホロアミダイト法（例、Tetrahedron Letters, vol.22(1981)1859-1862やChmical Reviews, vol.90(1990)543-584に記載の方法）による固相合成を行なった後に、アンモニアを用いた脱保護を行なうことにより合成した。得られたオリゴヌクレオチドは、逆相HPLCもしくは、イオン交換HPLCを用いて精製した。上記精製後、得られたオリゴヌクレオチドを逆相HPLCに供し純度を測定するとともに、MALDI-TOF質量分析計に供することにより分子量の測定を行なった。

　α-F21-B(LNA)の分子量は4029.6であった(計算値　4031.7（M+1）)。

（１－２）オリゴヌクレオチドの導入
　ヒト肝細胞HepG2細胞を、12-wellプレートに2.0×10⁵cells/wellで播種し、10% FBS含有DMEM培地を用いて培養した。培養24時間後、オリゴヌクレオチド（α-F21-B(LNA)又はコントロールオリゴヌクレオチド）をリポフェクション（DharmaFECT 4, Thermo Fisher Scientific）によって細胞に導入した。コントロールには、FGF21 mRNAに対して相補性を有しない塩基配列（5’-AGATGAATAAA-3’；配列番号：４）のLNAからなるオリゴヌクレオチドを使用した。
　オリゴヌクレオチドは40pmolを50μLのOpti-MEM（ライフテクノロジーズジャパン）で希釈して用いた。また、DharmaFECT 4は1.6μLを50μLのOpti-MEMで希釈した。希釈後室温にて5分間静置し、オリゴヌクレオチド希釈液とDharmaFECT 4希釈液を混合し、さらに20分静置後、全量を12-wellプレートの各ウェルに加えた。

（１－３）FGF21発現量の評価
　オリゴヌクレオチド導入24時間後の細胞を回収し、以下によりmRNA抽出を行い、抽出したmRNAを用いてリアルタイムPCR法により、FGF21 mRNAの定量を行った。
　精製した1μgのTotal RNAについて、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor（Applied biosystems）を用いてcDNAを合成し、ミリQを用いて計100μlに希釈、β-アクチンに関しては上記cDNAを 1μl/reaction (15μl)、FGF21に関しては3μl/reaction (15μl)用い、n=3以上でFast SYBRR Green Master Mix（Applied biosystems）、Applied Biosystems StepOnePlusによる定量を行った。定量値はコントロールにおけるFGF21 mRNA量/β-アクチン mRNA量の平均を1として計算した。上記の量以外については Applied biosystems社のプロトコル (下記参照) に従った。また用いたプライマーの配列を以下に示した。
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitorプロトコル：
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042557.pdf

Fast SYBRR Green Master Mixプロトコル：
http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/PDFOUT/127225

ヒトβ-アクチン用プライマー:
Forward:5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’（配列番号：１０）
Reverse:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’（配列番号：１１）

ヒトFGF21用プライマー:
Forward:5’-TGAAGCCGGGAGTTATTCAAA-3’（配列番号：１２）
Reverse:5’-GCCGCTGGCACAGGAA-3’（配列番号：１３）

マウスβ-アクチン用プライマー:
Forward:5’-CCAGTTCGCCATGGATGAC-3’（配列番号：１４）
Reverse:5’-ATGCCGGAGCCGTTGTC-3’（配列番号：１５）

マウスFGF21用プライマー:
Forward:5’-GTACCTCTACACAGATGACGACCAA-3’（配列番号：１６）
Reverse:5’-CGCCTACCACTGTTCCATCCT-3’（配列番号：１７）

（１－４）結果
　ヒト肝細胞HepG2細胞におけるリアルタイムPCRの結果を図２に示す。FGF21 mRNA量は、β-アクチン mRNA量で標準化を行った値として示す。オリゴヌクレオチドの導入を行わなかった細胞及びコントロールオリゴヌクレオチドを導入した細胞に比べ、α-F21-B(LNA)をトランスフェクトした細胞では、FGF21 mRNA量の増加が確認された。
　図３には、マウス肝細胞H2.35細胞を用いて同様の実験を行った結果を示す。ヒト細胞（HepG2）と同様に、オリゴヌクレオチドの導入を行わなかった細胞及びコントロールオリゴヌクレオチドを導入した細胞に比べ、α-F21-B(LNA)を導入した細胞では、FGF21 mRNA量の増加が確認された。
　この結果から、α-F21-B(LNA)によって、標的遺伝子としたFGF21の発現量をヒト、マウス由来の各肝細胞において特異的に増強し得ることが示された。

（試験例２）BNA^NCオリゴヌクレオチドによるFGF21の発現変動
　実施例３で得られたオリゴヌクレオチドα-F21-B(BNA)は、配列番号：３で表される塩基配列を有し、かつ構成モノマーがすべてBNA^NCモノマーに置換されたものである。そこで、配列番号：３で表される塩基配列を有し、かつ構成モノマーがすべてLNAモノマーに置換されたα-F21-B(LNA)を評価した試験例１と同様に、培養肝細胞株において該オリゴヌクレオチドがFGF21 mRNA量へ与える効果について調べた。
　使用した培養細胞のうち、ヒト肝細胞株HepG2については、試験例１の方法に準拠してα-F21-B(BNA)を細胞に導入し（最終濃度40nM、対照物質としてα-F21-B（LNA））、導入24時間後の細胞から全mRNAを抽出、定法に従いリアルタイムPCRにより含有FGF21 mRNAを定量した。
　また、マウス肝細胞株H2.35については、試験例１の方法を以下のように改変した。即ち、公知文献上Peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)-αアゴニストが肝細胞でのFGF21 mRNAの発現亢進を誘導することが知られている（Cell Metab 2007 5(6): 415-425、Cell Metab 2007 5(6): 426-437、Biochem Biophys Res Commun 2007 360(2): 437-440）ので、PPAR-αアゴニストの1つであるWY-14643（Sigma社製）(200μM) をオリゴヌクレオチド導入と同時に培地に共存させ、FGF21 mRNAの細胞内転写量が増幅した状態で該オリゴヌクレオチドの効果を調べた。WY-14643についてはDMSOに溶かし、終濃度200μMで用いた。図４で示すように、WY-14643によるH2.35細胞中のFGF21 mRNA量の増大と共に、RNA合成阻害薬であるアクチノマイシンD （Calbiochem社製）の共存下（5μg/ml、0分、45分、90分の3群）で転写が遮断された条件で該mRNA量が減弱することが確認された。アクチノマイシンDはDMSOに溶かし、終濃度5μg/mlで用いた。このことからPPAR-αアゴニストにより増幅されたFGF21 mRNAが、細胞内で転写と分解の制御下で不安定に存在していることが強く示唆された。

　図５、図６には、それぞれHepG2（WY-14643非共存下）、H2.35（WY-14643共存下）における各FGF21 mRNA量に及ぼすオリゴヌクレオチド導入効果を調べた結果を示した。α-F21-B(BNA)はヒト（HepG2）、マウス（H2.35）何れの細胞においても各FGF21 mRNA量を増大させ、その効果は同濃度のα-F21-B(LNA)よりも強かった。また、H2.35については、オリゴヌクレオチド導入48時間後に培養上清を回収、1000×gで10分間遠心した後、上清を回収し、そのうちの50μl（/well）を用い、FGF21 タンパク質の定量をHuman FGF-21 ELISA Kit（millipore EZHFGF21-19K）を用いてELISA法で行った。操作はキット添付のプロトコルに従った。その結果、α-F21-B(BNA)やα-F21-B(LNA)を導入された細胞の培養上清ではFGF21タンパク質量の増大が認められ、その増加量はα-F21-B(LNA)よりもα-F21-B(BNA)の方がより高かった（図７）。試験例１でも対照物質として使用したFGF21 mRNAに非相補的な配列番号：４で表されるLNAオリゴヌクレオチド（Control）は、H2.35に対してFGF21 mRNA量、タンパク質量ともに影響しなかった。

　以上の結果から、BNA^NCオリゴヌクレオチドであるα－Ｆ２１－Ｂ（BNA）は、α－Ｆ２１－Ｂ（LNA）と同じく、ヒト、マウス双方においてFGF21の発現を亢進させ、その活性はα－Ｆ２１－Ｂ（BNA）が優位であることが明らかとなった。

（試験例３）ARE結合因子の同定
　試験例１、２の結果により、α-F21-B(LNA)、α-F21-B(BNA)が、FGF21遺伝子のARE-Bに結合してARE結合因子のARE-Bへの結合を阻害し、ARE結合因子の負の発現制御機能を阻害することで、FGF21 mRNAの発現量を選択的に増強していることが示唆された。そこで、次に、α-F21-B(LNA)、α-F21-B(BNA)によってARE-Bへの結合を阻害されるARE結合因子を同定し、その機能を解析することを試みた。初めに、ARE-Bに結合するARE結合因子を同定することを目的として、FGF21 mRNAをベイト（bait、おとり）とした免疫沈降とマススペクトロメーターを用いたプロテオーム解析により、FGF21 mRNAのARE-Bに結合するシスエレメント結合タンパク質について解析を行った。

（３－１）FGF21 mRNAベイトの合成
　FGF21 mRNAをin vitro translationにより合成した。5’末端にT7プロモーター配列を持つプライマーを用いてPCRによりFGF21 mRNA（配列番号：１）の5’側末端から778-876番目の塩基配列を増幅し、MEGAscript T7 キット（Ambion）を用い、添付プロトコルに従ってRNAの合成を行った。合成されたFGF21 mRNAの3’末端にFlag-hydrazideを共有結合させる反応を行い、FGF21 mRNAの3’末端を公知の手法（“Programmable ribozymes for mischarging tRNA with nonnatural amino acids and their applications to translation.” Methods, 2005, Vol,36, No.3, p.239-244参照）に従ってFlag標識した。該標識mRNAはQiagen社のRNeasy Mini Kitを用いて精製した。

（３－２）免疫沈降・タンパク同定
　精製後のFlag標識FGF21 mRNA 10pmolを抗Flag抗体ビーズ（Sigma）と混合、4℃で1時間反応を行った。その後、10% FBS含有DMEM培地で培養した293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク3mgを加え、さらに4℃で1時間反応を行った。非結合タンパク質を洗い流した後、RNA及びRNA結合タンパクをFlagペプチドで溶出させた。溶出させて得た試料を、リジルエンドペプチダーゼ処理し、公知の手法であるLC-MS/MS法（“A direct nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry system for interaction proteomics.” Analytical Chemistry, 2002, Vol.74, No.18, p.4725-4733参照）を用いて、解析を行った。マススペクトロメーターには、QSTAR XL（アプライドバイオシステム）を用いた。

（３－３）結果
　LC-MS/MSにより、FGF21 mRNAの3’末端領域に結合するタンパク質として「ZFP36L1」及び「ZFP36L2」が同定された（図８にMSスペクトルデータを示す（ZFP36L1について1ペプチド、ZFP36L2について3ペプチド）。ZFP36L1及びZFP36L2は、ZFP36（別名TTP）とともにARE結合因子の1ファミリー（以下、「ZFP36ファミリー」という）を形成している。ZFP36ファミリーは、AREに結合してmRNAを不安定化し、分解促進に機能していることが報告されている（“Tristetraprolin and its family members can promote the cell-free deadenylation of AU-rich element-containing mRNAs by poly(A) ribonuclease.” Molecular Cell Biology, 2003, Vol.23, No.11, p.3798-812参照）。
　この結果から、α-F21-B(LNA)、α-F21-B(BNA)によってARE-Bへの結合を阻害されるARE結合因子がZFP36L1及びZFP36L2である可能性が強く示唆された。

（試験例４）ZFP36L1及びZFP36L2のFGF21 mRNAへの結合能及びα-F21-B(LNA)による結合阻害能評価
　ZFP36L1及びZFP36L2がFGF21 mRNAのARE-Bに結合し得るか、またα-F21-B(LNA)がZFPファミリーのARE-Bへの結合を阻害し得るかについて検討を行った。
　試験例３中「（３－１）FGF21 mRNAベイトの合成」で説明した方法に従い、ARE-A、-Bを含むFGF21 mRNAの3’UTRをin vitro translationにより合成し、Flagペプチドによる標識を行った。3’UTRには、FGF21 mRNA（配列番号：１参照）の5’側末端から778-876番目の塩基の領域を用いた。
　試験例３中「（３－２）免疫沈降」で説明した方法に従い、精製後のFlag標識ヒトFGF21 3’UTR-RNA（以下「FGF21 3’UTR-Flag」という）10pmolに、293T細胞から抽出した細胞抽出タンパク質（5mg/500μl）を加え、さらに、α-F21-A(LNA)、α-F21-B(LNA)又は上記コントロールオリゴヌクレオチドを、終濃度100μMになるように加えて混合し、Flag M2抗体ビーズを用い免疫沈降後、Flagペプチドを用い溶出させた試料について、抗ZFP36L1抗体（Cell signaling）を用いてウェスタンブロッティングを行った。

　ウェスタンブロットの結果を図９に示す。細胞抽出タンパク質をFGF21 3’UTR-Flagと混合し、抗ZFP36L1抗体で免疫沈降させて得た試料（レーン1）では、ZFP36L1が検出された。これは、ZFP36L1がFGF21 3’UTR-Flagに結合し得ることを示すものであり、ZFP36L1がFGF21の3’UTRに対する結合能を有することを示すものである。なお、ZFP36L2についても同様の結果が得られた（以下、試験例４について同じ）。
　FGF21 mRNAのARE-Bに相補的な塩基配列を含むα-F21-B(LNA)の存在下で、細胞抽出タンパクとFGF21 3’UTR-Flagとを反応させたレーン4では、ZFP36L1の検出シグナルは顕著に低下した。一方、α-F21-A(LNA)及びコントロールオリゴヌクレオチドを加えて反応を行ったレーン2，3では、ZFP36L1の検出シグナルの低下は認められなかった。
　この結果から、ZFP36L1及びZFP36L2がFGF21 mRNA 3’UTRのARE-Bに結合すること、そしてα-F21-B(LNA)がZFP36L1及びZFP36L2のARE-Bへの結合を顕著に阻害し得ることが明らかになった。

（試験例５）ZFP36L1及びZFP36L2の機能解析
　ZFP36L1及びZFP36L2のFGF21発現制御における機能を明らかにするため、RNAiを用いてZFP36L1及びZFP36L2の発現を抑制した場合のFGF21発現量の変化について検討を行った。
　細胞を、12-wellプレートに2.0×10⁵cells/wellで播種し、10% FBS含有DMEM培地を用いて培養した。培養24時間後、siRNAをリポフェクション（DharmaFECT 2,Thermo Scientific）によって細胞にトランスフェクトした。オリゴヌクレオチドは16pmolを50μLのOpti-MEM（ライフテクノロジーズジャパン）で希釈して用いた。また、DharmaFECT 2は1.6μLを50μLのOpti-MEMで希釈した。希釈後、室温にて5分間静置し、オリゴヌクレオチド希釈液とDharmaFECT 2希釈液を混合し、さらに20分静置後、全量を12-wellプレートの各ウェルに加えた。
　使用したsiRNAはInvitrogen社から購入した。ZFP36L1及びZFP36L2に対するsiRNAには、ZFP36L1/L2 RNAi #1（Cat. No. HSS101104, HSS101101）とZFP36L1/L2 RNAi #2（Cat. No. HSS101105, HSS101102）を用いた。また、コントロールのsiRNA（Cont. RNAi #1, #2）には、Stealth RNAi Negative Control（Cat. No. 12935-100）を使用した。
　オリゴヌクレオチド導入48時間後の細胞を回収し、抽出したmRNAを用いてリアルタイムPCRを行い、FGF21の発現量を評価した。

　リアルタイムPCRの結果を図１０に示す。FGF21 mRNA量は、β-アクチン mRNA量で標準化を行った値として示す。Cont.RNAi #1、#2をトランスフェクトした細胞に比べ、ZFP36L1/L2 RNAi #1、#2をトランスフェクトした細胞では、FGF21 mRNA量の増加が確認された。
　以上のように、ZFP36L1及びZFP36L2の発現を阻害するsiRNAの導入によってFGF21発現量が顕著に増強されたことは、ZFP36L1及びZFP36L2がFGF21 mRNAの不安定化、分解促進に機能し、FGF21発現を負に制御していることを示すものである。

　以上、試験例１～５の結果から、α-F21-B(BNA)（TUP#001）、α-F21-B(LNA)（TUP#002）が、FGF21 mRNAのARE-Bに結合してZFP36L1及びZFP36L2のARE-Bへの結合を阻害すること、そしてこの結合阻害によりZFP36L1及びZFP36L2の負の遺伝子発現制御機能を抑制し、FGF21 mRNAを安定化して翻訳を促進することで、FGF21 mRNAの発現を選択的に増強させることが示された（図１１参照）。

（実施例４）FGF21 mRNAのARE-B近傍配列に相補的なオリゴヌクレオチドの設計・合成
　α-F21-B(BNA)（TUP#001）、α-F21-B(LNA)（TUP#002）を用いた試験例１～４の結果を受け、これらが結合する標的配列の周辺配列に対しても、相補的なオリゴヌクレオチドを設計した(TUP#003～TUP#033)。具体的には
(1)(i) TUP#001及びTUP#002が結合するシスエレメント（ARE-B）周辺の配列であること、および
(ii)ヒト、アカゲザル、ラット、マウスの4種で保存された塩基配列であること、
の2つを基準に塩基配列を選択し、
(2)上記(1)にて選択した塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドとして、TUP#003～TUP#033を設計した。
　TUP#003～TUP#033とFGF21 mRNAとの関係を図１２に示す。これらのオリゴヌクレオチドは、12mer～18merであり、モノマーの全部もしくは一部がLNAであり、全てリン酸結合部がホスホロチオエート修飾を有している。TUP#001～TUP#033の塩基配列を表１に示す。

¹⁾表１において塩基配列に用いる略号の意味は以下の通りである。
　a, t, g ：天然型デオキシリボヌクレオチド
　A, T, G ： LNA修飾リボヌクレオチド
　A’, T’, G’： BNA^NC修飾リボヌクレオチド
表１においてA,T,Gで表されるLNA修飾リボヌクレオチドとは、化３で表されるリボヌクレオチドを意味する。

[式中、Ｂ’は核酸塩基を示す。]

また、表１においてA’、T’、G’で表されるBNA^NC修飾リボヌクレオチドとは、化４で表されるリボヌクレオチドを意味する。

[式中、Ｂ’は前記と同意義を示す。]

　上記の通り設計したオリゴヌクレオチドTUP#003～#033の合成は、株式会社ジーンデザイン（大阪）に委託して行った。

　TUP#003～#033の合成は前記α-F21-A(LNA)及びα-F21-B(LNA)の合成で用いた方法に準じて行なった。TUP#003～#033の質量測定結果を表２に示す。

（試験例６）ヒト肝臓由来細胞株Hep3BにおけるFGF21 mRNA発現上昇活性評価
　ヒト肝臓由来細胞株Hep3B（ATCCより購入）を培地A（1% ペニシリン-ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズジャパン）、非必須アミノ酸（ライフテクノロジーズジャパン）、10% FBS（ライフテクノロジーズジャパン）をMEM（ライフテクノロジーズジャパン）に溶解した培地）に懸濁し、3×10³ cells/wellの密度にて、96 well plate（ベクトンディッキンソン）に播種し、37℃にて培養した。
　24時間培養したHep3B細胞に、DharmaFECT 1（Thermo Fisher Scientific）を用いてオリゴヌクレオチドを導入した。具体的には、DharmaFECT 1をOpti-MEM（ライフテクノロジーズジャパン）にて100倍に希釈して5分間静置し、各オリゴヌクレオチド（TUP#003～TUP#033）はOpti-MEMにて希釈した。DharmaFECT 1とオリゴヌクレオチドの各希釈液を等量含む混合液を作製し、20分間静置した。Hep3Bの培養液に、培地Aに対し1/10量の上記混合液を添加することにより導入した。導入に用いるオリゴヌクレオチドは、添加後に30nMになるよう調整した。
　導入したHep3Bを48時間培養した後、Cells-to-Ct（ライフテクノロジーズジャパン）を用いて細胞からRNAを抽出した。抽出したRNAを用いてcDNAを合成し、定量的リアルタイムPCRによってFGF21 mRNAの発現量を定量した。

　本検討に使用した、プローブおよびプライマー配列を以下に記す。
ヒトβ-アクチン用プライマー:
Forward:5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’（配列番号：２７）
Reverse:5’-GCCGATCCACACGGAGTACT-3’（配列番号：２８）
ヒトβ-アクチン用プローブ:
5'-Fam-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-3'（配列番号：２９）

ヒトFGF21用プライマー:
Forward:5’-CAGCGGTACCTCTACACAGATGA-3’（配列番号：３０）
Reverse:5’-CGTCCCATCCTCCCTGATC-3’（配列番号：３１）
ヒトFGF21用プローブ:
5'-Fam-CCCAGCAGACAGAAG-3'（配列番号：３２）

　リアルタイムPCRの結果を図１３に示す。FGF21 mRNA量は、β-アクチン mRNA量で標準化を行った値として示す（平均＋標準誤差）。本試験により、検討に供した各オリゴヌクレオチドがHep3B細胞においてFGF21 mRNAを増加させることが明らかとなった。

（試験例７）マウス肝臓初代培養細胞におけるFGF21 mRNA発現上昇活性の評価
　C57BL/6Jマウス（雄性、日本クレア）の肝臓をLiver Perfusion Medium (ライフテクノロジーズジャパン)および0.04% コラゲナーゼ溶液（0.06g コラゲナーゼ（Sigma）及び0.11g CaCl₂・2H₂O（Wako）を150ml Hank’s solution（ライフテクノロジーズジャパン）に溶解した溶液）にて酵素消化した。上記酵素消化により分散した細胞を、Hepatocyte Wash Medium（ライフテクノロジーズジャパン）にて洗浄した。得られたマウス肝臓初代培養細胞を培地B（Williams’Medium E（ライフテクノロジーズジャパン）中に、1% ペニシリン-ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズジャパン）、1% L-グルタミン（ライフテクノロジーズジャパン）、10nM インスリン（Sigma）、10nM デキサメタゾン（Wako）、10% FBS（ライフテクノロジーズジャパン）を含む溶液）に懸濁し、6.25×10⁴cells/wellの密度にてBiocoat Collagen Ｉ Cellware 24 well plate（ベクトンディッキンソン）に播種し、24時間培養した。
　培養後、DharmaFECT 1を用いてオリゴヌクレオチドを細胞に導入した。具体的には、DharmaFECT 1をOpti-MEM（ライフテクノロジーズジャパン）にて50倍に希釈し5分間静置し、オリゴヌクレオチドはOpti-MEMで希釈した。DharmaFECT 1とオリゴヌクレオチドの各希釈液を等量含む混合液を作成し、20分間静置した。マウス肝臓初代培養細胞の培養液に、培地Bに対し1/10量の上記混合液を添加することにより導入した。導入に用いるオリゴヌクレオチドは、添加後に3、10、又は30nMになるよう調整した。
　導入したマウス肝臓初代培養細胞を48時間培養した後、SV96 total RNA isolation system（プロメガ）を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAを用いてcDNAを合成し、定量的リアルタイムPCRによってFGF21 mRNAの発現量を定量した。

　本検討に使用した、プローブおよびプライマー配列を以下に記す。
マウスβ-アクチン用プライマー:
Forward:5’-CACTATTGGCAACGAGCGG-3’（配列番号：３３）
Reverse:5’-TCCATACCCAAGAAGGAAGGC-3’（配列番号：３４）
マウスβ-アクチン用プローブ:
5'-Fam-TCCGATGCCCTGAGGCTCTTTTCC-3'（配列番号：３５）

マウスFGF21用プライマー:
Forward:5’-GTTTCTTTGCCAACAGCCAGAT-3’（配列番号：３６）
Reverse:5’-CCAGCAGCAGTTCTCTGAAGCT-3’（配列番号：３７）
マウスFGF21用プローブ:
5'-Fam-ACTTTGATCCTGAGGCCT-3'（配列番号：３８）

　定量的リアルタイムPCRの結果を図１４に示す。FGF21 mRNA量は、β-アクチン mRNA量で標準化を行った値として示す（平均＋標準誤差）。本試験により、検討に供した各オリゴヌクレオチドがマウス肝臓初代培養細胞においてFGF21 mRNAを増加させることが明らかとなった。

（試験例８）ヒト肝臓由来細胞株Hep3BにおけるFGF21タンパク質分泌促進活性評価
　試験例６と同様に、Hep3B細胞を3×10³cells/wellの密度にて、96-wellプレートplateに播種した。24時間培養後、DharmaFECT 1を用いてオリゴヌクレオチドを試験例６と同様の方法にて導入した。オリゴヌクレオチド濃度は、添加後に10又は30nMになるよう調整した。導入したHep3B細胞を48時間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清に含まれるFGF21タンパク質量をHuman FGF21 ELISA Kit（Millipore）によって測定した。
　結果を図１５に示す（平均＋標準誤差）。本試験により、検討に供した各オリゴヌクレオチドがHep3B細胞においてFGF21タンパク質分泌量を増加させることが明らかとなった。

（試験例９）マウス肝臓初代培養細胞におけるFGF21タンパク質分泌促進活性評価
　試験例７と同様の方法によりマウス肝臓初代培養細胞を調製し、得られた肝臓初代培養細胞をWilliams’Medium E（ライフテクノロジーズジャパン）に懸濁し、6.25×10⁴ cells/wellの密度にてBiocoat Collagen Ｉ Cellware 24 well plate（ベクトンディッキンソン）に播種し、24時間培養した。試験例７と同様の方法によりオリゴヌクレオチドを導入した。導入に用いるオリゴヌクレオチドは、添加後に30nMになるよう調整した。導入したマウス肝臓初代培養細胞を48時間培養した後、培養上清を回収した。
　培養上清中のFGF２１タンパク質量を、Rat/Mouse FGF21 ELISA Kit（Millipore）によって測定した。
　結果を図１６に示す（平均＋標準誤差）。本試験により、検討に供した各オリゴヌクレオチドがマウス肝臓初代培養細胞においてFGF21タンパク質分泌量を増加することが明らかとなった。

（試験例１０）マウス肝臓におけるFGF21 mRNA発現上昇活性の評価
　C57BL/6Jマウス（雄性、8週齢、日本クレア）に生理食塩水、又はTUP#007を30mg/kgもしくは100mg/kgにて腹腔内投与し、48時間後、肝臓を採取した（各群n=9）。採取した肝臓から、TRIzol（ライフテクノロジーズジャパン）を用いてRNAを抽出した。得られたRNAを用いてcDNA合成し、定量的リアルタイムPCRによりFGF21 mRNA発現量を定量した。
　本検討には、前記試験例７に記載したプライマーおよびプローブを使用した。
　その結果を図１７に示す。FGF21 mRNA量は、β-アクチン mRNA量で標準化を行った値（平均＋標準誤差）として示す。図中の＊は、Shirley-Williams検定の結果、オリゴヌクレオチド非投与群に比べ、TUP#007投与群ではFGF21 mRNA発現量が有意（p<0.05）に増加したことを示す。
　本結果により、FGF21 mRNAシスエレメントに結合して、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害する物質を取得することにより、培養細胞レベルおよび個体レベルでFGF21 mRNAの発現量およびFGF21タンパク質の分泌量を制御できることが証明された。

　本発明の、FGF21 mRNAのシスエレメントに結合して該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害する物質は、該mRNAを安定化することによりFGF21タンパク質の翻訳レベルを増強しうるので、FGF21が予防・治療効果を示す種々の生活習慣病の予防・治療薬として有用である。

　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

　本発明は、2009年7月23日出願の日本国特許出願、特願2009-172584を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims

　FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る物質。
　FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、AUリッチエレメントへのAUリッチエレメント結合因子の結合を阻害し得る、請求項１記載の物質。
　FGF21のmRNAのシスエレメントが、ヒトFGF21のmRNA塩基配列の5’末端側から835～842番目の塩基配列である、請求項１記載の物質。
　FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る核酸類縁物質又はその塩である、請求項１記載の物質。
　FGF21のmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの5’側及び/又は3’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得るオリゴヌクレオチド又はその塩である、請求項１記載の物質。
　LNA（locked nucleic acid）を含むことを特徴とする、請求項５記載の物質。
　BNA（bridged nucleic acid）を含むことを特徴とする、請求項５記載の物質。
　配列番号：３、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３若しくは配列番号：２４で表される塩基配列又は該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド又はその塩である、請求項１記載の物質。
　配列番号：３で表される塩基配列又は該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド又はその塩である、請求項４～７のいずれか１項に記載の物質。
　配列番号：１９で表される塩基配列若しくは該塩基配列と実質的に同一の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド又はその塩である、請求項４～７のいずれか１項に記載の物質。
　TUP#001、TUP#002、TUP#003、TUP#004、TUP#005、TUP#006、TUP#007、TUP#008、TUP#009、TUP#010、TUP#011、TUP#012、TUP#013、TUP#014、TUP#015、TUP#016、TUP#017、TUP#018、TUP#019、TUP#020、TUP#021、TUP#022、TUP#023、TUP#024、TUP#025、TUP#026、TUP#027、TUP#028、TUP#029、TUP#030、TUP#031、TUP#032若しくはTUP#033で表されるオリゴヌクレオチド又はその塩である、請求項１記載の物質。
　請求項１記載の物質を含有してなる医薬。
　生活習慣病の予防・治療剤である、請求項１２記載の医薬。
　哺乳動物に対し請求項１記載の物質の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における生活習慣病の予防又は治療方法。
　生活習慣病の予防又は治療剤を製造するための請求項１記載の物質の使用。
　請求項５、８、９、１０、又は１１記載の物質を含有する担体。
　異なる2種以上の標的タンパク質をコードするそれぞれのmRNAのシスエレメントの少なくとも一部にそれぞれ結合し、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る2以上の物質を組み合わせてなる医薬。
　物質が、各標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に結合し、AUリッチエレメントへのAUリッチエレメント結合因子の結合を阻害し得る物質である、請求項１７記載の医薬。
　物質が、各標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの５’側及び／又は３’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得る核酸類縁物質又はその塩である、請求項１７記載の医薬。
　物質が、各標的タンパク質をコードするmRNAのシスエレメントの少なくとも一部に相補的な塩基配列と、該シスエレメントの５’側及び／又は３’側の非翻訳領域の一部に相補的な塩基配列とを有し、前記非翻訳領域に相補的な塩基配列が有する配列特異性に基づいて、前記シスエレメントの少なくとも一部に特異的に結合することにより、該シスエレメントへのシスエレメント結合因子の結合を阻害し得るオリゴヌクレオチド又はその塩である、請求項１７記載の医薬。
　物質がLNAを含むオリゴヌクレオチド又はその塩である、請求項２０記載の医薬。
　物質がBNAを含むオリゴヌクレオチド又はその塩である請求項２０記載の医薬。
　ZFP36L1又はZFP36L2の機能を阻害する物質を含有してなる生活習慣病の予防・治療剤。
　哺乳動物に対し請求項２３記載の物質の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における生活習慣病の予防又は治療方法。
　生活習慣病の予防又は治療剤を製造するための請求項２３記載の物質の使用。