KR20080056314A

KR20080056314A - 포스페이트 모방체를 함유하는 폴리뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20080056314A
Application number: KR1020087012000A
Authority: KR
Inventors: 디터 하인들; 디르크 케슬러
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2005-11-23
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2008-06-20
Also published as: JP2009516715A; CA2627208C; US20090005550A1; AU2006317195B2; CN101312941A; JP2009516521A; KR101028980B1; BRPI0618833B1; DE502005008153D1; EP1801114A1; HK1126224A1; ATE443072T1; WO2007059816A1; US7795423B2; EP1954707A1; US7741472B2; CN101312941B; AU2006317195A1; ES2349129T3; CA2627216C

Abstract

본 발명은 구조 P = N - Acc (식 중, Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 치환기임) 를 1 개 이상 함유하는 변형 올리고뉴클레오티드 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

포스페이트 모방체를 함유하는 폴리뉴클레오티드 {POLYNUCLEOTIDE CONTAINING A PHOSPHATE MIMETIC}

본 발명은 뉴클레오티드 화학 분야에서의 신규 성분 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 성분은 히드록실기가 상응하는 모방체로 대체된, 소위 포스페이트 모방체라고 불리는 것이다.

특히 본 발명은 신규 계열의 변형 올리고뉴클레오티드 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

변형 포스페이트 잔기를 갖는 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 다양한 방법이 이미 이전에 기술되어 있다.

합성 (데옥시) 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 포스포라미디트 화학의 도움으로 고상에서 제조된다. 정의된 크기의 공극을 갖는 유리 비이드 (bead) 는 통상적으로 고상으로 사용된다 (이하 "CPG = controlled pore glass; 조절 공극 유리" 로서 약칭됨). 첫번째 단량체는 유리 올리고뉴클레오티드가 고상 합성 완료 후 분할될 수 있도록 분할가능 기에 의해 지지체에 연결된다. 또한 디메톡시트리틸 (DMT) 이 통상적으로 보호기로서 사용되는 경우에 첫번째 단량체는 보호된 히드록실기를 함유한다. 보호기는 산 처리에 의해 제거될 수 있다. 그 다음 5' 말단에서, DMT 보호기로도 제공되는 (데옥시) 리보뉴클레오시드의 3' 포스포라미디트 유도체는 시클릭 공정에서 DMT 보호기가 없는 각 경우 반응기에 연속적으로 커플링된다. 대안적으로는 3' 디메톡시트리틸-보호된 5' 포스포라미디트가 역 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용된다. H-포스포네이트 전략은 또한 특히 포스페이트 백본에 변형을 도입하기 위해, 예를 들어, 방사선 표지된 포스포로티오에이트를 제조하기 위해 사용된다. 또한 변형 또는 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 다양한 전략이 이미 공지되어 있다: 3작용기 (trifunctional) 지지체 물질은 3' 말단에 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 종래 기술에 따라 사용된다 (US 5,290,925, US 5,401,837). 표지기가 C3-12 연결자를 통해 포스포라미디트에 결합된 표지된 포스포라미디트는 통상적으로 5' 말단에 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 사용된다 (US 4,997,928, US 5,231,191). 추가 변형이 올리고뉴클레오티드 내, 개개의 염기 상에 도입되거나 (US 5,241,060, US 5,260,433, US 5,668,266) 또는 내부 비-뉴클레오시드 연결자를 도입하여 도입될 수 있다 (US 5,656,744, US 6,130,323).

대안적으로는 뉴클레오시드-내 (internucleoside) 포스페이트는 포스포로티오에이트의 합성후 표지화 (Hodges, R.R., et al. Biochemistry 28 (1989) 261-7) 또는 작용기화 포스포라미디트의 후-표지화 (Agrawal, S., Methods in Mol. Biology 26 (1993), Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Humana Press, Totowa, NJ, Chapter 3) 에 의해 표지될 수 있다. 그러나, 상기 방법은 포스포라미디트 및 인산 티오에스테르의 불안정성으로 인해 용인되지 않는다.

또한 종래 기술로부터 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드-내 포스페이트 잔기에 변형이 도입될 수 있다는 것이 이미 공지되어 있다. 가장 두드러진 경우, 이들은 포스포티오에이트 (Burgers, P.M., and Eckstein, F., Biochemistry 18, (1979) 592-6), 메틸포스포네이트 (Miller, P.S., et al., Biochemistry 18 (1979) 5134-43) 또는 보라노포스페이트 (WO 91/08213) 이다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 특이한 단량체를 합성해야만 한다. 반대로 통상의 포스포라미디트 또는 H-포스포네이트는, 보라노 또는 티오 변형이 3가 H-포스포네이트와 또는 포스폰산 트리에스테르와 반응하는 특이적 시약을 사용하여, 올리고뉴클레오티드 합성 동안 또는 그 후에 직접 도입될 수 있는 경우, 포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 모든 상기 방법이 변형 올리고뉴클레오티드를 야기함에도 불구하고, 이에 사용되는 합성 화학은 표지가 상기 방식으로 검출될 수 있도록 하거나 또는 작용기가 올리고뉴클레오티드 합성 동안 올리고뉴클레오티드 사슬의 포스페이트 백본 상에 직접 도입되도록 하는 것이 필요하지 않다.

[Baschang, G., and Kvita, V., Angewandte Chemie 85(1) (1973) 43-44] 에는 뉴클레오티드 인산 트리에스테르와 메틸술포닐 아자이드와 같은 아자이드와의 반응으로 트리-알킬(아릴)이미도포스페이트를 제조하나, 이것은 불안정하고 분해된다는 것이 기재되어 있다.

[Nielsen, J., and Caruthers, M.H., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 6275-6276] 에는 알킬 아자이드의 존재하에서, 2-시아노-1,1-디메틸에틸 보호기로 제공 되는 데옥시뉴클레오시드 포스파이트의 반응이 기재되어 있다. 게다가, 저자는 기재된 방법의 도움으로 제조된 변형의 유형이 특정 이점을 가질 수 있을 것이라는 것에 대한 설명 없이, 상기 원리가 포스페이트 잔기 상에 변형된 뉴클레오티드의 제조에 적합하다고 제시한다. 특히 저자는 알킬 잔기의 도입을 제시한다.

WO 89/091221 에는 N-알킬 포스포라미디트 또는 이보다 적합한 알킬아민의 존재하에서, 뉴클레오시드 포스파이트를 (보호기로 제공됨) 요오드로 산화시켜 제조된 하나 이상의 포스페이트 잔기 상에 N-알킬로 치환된 올리고뉴클레오티드가 기재되어 있다.

WO 03/02587 에는 H-포스페이트가 아민화에 의해 포스포라미데이트로 전환되는 변형 올리고뉴클레오티드의 제조가 기재되어 있다.

그러므로 모든 상기 공개에는 포스페이트 잔기 대신 포스포라미데이트를 함유하는 분자의 제조가 기재되어 있다. 그러나, 포스포라미데이트 함유 분자는 아민기가 산성 환경에서 양성자화되고, 그 다음 물로 치환되므로 가수분해되기 쉽다.

또한 WO 01/14401 은 포스페이트 잔기가 N―ClO₃, N―NO₂ 또는 N―SO₂R 로 치환되는 뉴클레오티드 빌딩 블록 또는 올리고뉴클레오티드를 제안한다. WO 01/14401 의 교시에 따르면, 이러한 성분은 피리딘의 존재하에서 데옥시 뉴클레오시드의 유리 히드록실기와 아미도포스포닐 클로라이드를 반응시켜 제조할 수 있다. 그러나, 상기 유형의 제조는 복잡하고, 시간 소모적이고, 뉴클레오티드 또는 올 리고뉴클레오티드의 일상적 합성에 부적합하다.

그러므로 본 발명의 기본을 이루는 기술적 목적은 개선된 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것 및 간단한 이의 제조 방법을 제공하는 것이었다.

발명의 요약

그러므로 본 발명은 바람직하게는 하기 구조를 1 개 이상 함유하는 올리고뉴클레오티드인 화학 화합물에 관한 것이다:

(식 중 A 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 5' 말단을 나타내거나, 고상에 결합된 연결자를 나타내고,

B 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단을 나타내거나, 연결자를 나타내고,

D 는 OH 또는 CH₃ 이고,

Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 치환기임).

전자 수용체 Acc 는 바람직하게는 하기를 포함하는 군으로부터 선택된다:

- -CN,

- -SO₂―R', 여기서 R' 는 하나 이상의 아미노-치환 알킬, 임의 치환 아릴 또는 임의 치환 헤테로사이클을 함유하고,

- 및 전자-결핍, 6-원 N⁺ 헤테로사이클, 여기서 하나 이상의 질소 원자는 알킬화되고 오르토 또는 파라 위치에 위치하며, 상기 헤테로사이클은 R 로 임의 치환될 수 있음.

R 또는 R' 가 단독 또는 전자 수용체와 조합으로 검출가능 단위 또는 작용기를 함유하는 올리고뉴클레오티드가 특히 바람직하다.

이들 올리고뉴클레오티드는, 하기 화학식의 3가 인 유도체를:

(식 중, E 는 메틸기 또는 보호된 히드록실기를 나타내고,

A 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 5' 말단을 나타내거나, 고상에 결합된 연결자를 나타내고,

B 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단을 나타내거나, 연결자를 나타냄),

하기 화학식의 아자이드와 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 본 발명에 따라 제조된다:

(식 중, Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 치환기임).

- -CN, -SO₂―R

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조를 위한 특별 구현예에서:

a) 먼저 3' 포스포라미디트를 초기의 (nascent) 올리고뉴클레오티드 사슬의 5' OH 말단과 반응시키고,

이어서

b) 하기 구조의 아자이드와 반응시킨다:

방법은 R 이 검출가능 단위 또는 작용기를 함유하는 것이 특히 바람직하다.

상기 방식으로 제조된 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 임의의 형태의 혼성화 파트너, 특히 유도된 또는 표지된 혼성화 파트너가 필요한 모든 적용에 사용될 수 있다.

특히 이들 올리고뉴클레오티드가 특정 표적 서열을 검출하기 위한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다.

또다른 잠재적인 용도는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 의 형태로 유전자 발현을 비활성화하기 위한 본 발명에 따라 변형된 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

발명의 기본 착상

본 발명의 목적은 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드를 변형 포스페이트 잔기를 함유하여, 바람직하게는 검출가능 표지를 함유할 수 있는 간단한 방식으로 제조하는 것이다.

본 발명의 중심적 착상은 이와 관련해, 3가 인 원자로부터 시작해서, 안정한 포스페이트 모방체가 형성되는 방식으로 시약과 반응시키는 것이다. 본 발명에 따르면 보호기로 제공되는 하나 이상의 히드록실 잔기를 함유하는 인 원자를 상기 목적을 위해 구조 N = N = N - Acc (식 중, Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 치환기임) 를 갖는 아자이드와 반응시킨다. 이것은 강한 전자-끌기 전자 수용체 기가 N 원자를 통해 공유 결합하는 5가 인 원자의 형성을 야기한다. 상기 기는 본 방식으로 제조된 화합물이, 종래 기술로부터 공지된 포스포라미데이트 화합물과 대조적으로, 공명-안정성이고 가수분해되기 쉽지 않다는 것을 확보한다.

본 발명에 놓인 상기 착상은 3가 인이 중간체로서 형성되는 모든 과정에 적용될 수 있다.

포스포라미디트를 사용하는 통상적인 올리고뉴클레오티드 합성 동안, 3가 인 원자를 갖는 포스폰산 트리에스테르가 중간체 생성물로서 형성된다. 제 1 및 제 2 에스테르 결합이 뉴클레오시드-내 연결을 나타낸다. 인 원자가 보호된 히드록실기, 예컨대 예를 들어 제 3 에스테르 결합을 통해 베타-시아노에틸옥시 기에 연결된다. 요오드와의 산화 대신에, 초기의 올리고뉴클레오티드는 그 다음 3가 인 원자가 질소가 분할하면서 -N-Acc 에 의해 인 원자에 대한 공유 연결에 의해 5가 원자에 산화되는 과정으로, 적합한 아자이드와 본 발명에 따라 반응할 수 있다.

그 다음 올리고뉴클레오티드 합성을 종래 기술로부터 공지된 바와 같이 이어서 계속할 수 있다. 안정한 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 뉴클레오티드-내 포스페이트 잔기 상에 대부분의 임의의 방식으로 변형된 최종 생성물로서 수득된다.

정의

본 발명의 범주 내에서, 사용된 일부 용어는 하기와 같이 정의된다:

반응기는 적합한 조건 하에서 공유 결합을 형성하면서 또다른 분자와 반응할 수 있는 분자의 기를 말한다. 반응기의 예는 히드록실기, 아미노기, 티올, 히드라지노, 히드록실아미노, 디엔, 알킨 및 카르복실산기이다.

보호기는 다단계 합성 반응의 일부로서, 오직 하나의 특정, 비-보호된 반응기가 바람직한 반응 파트너와 반응할 수 있는 식으로, 분자의 하나 이상의 반응기와 반응하는 분자를 표시한다. 히드록실기를 보호하기 위해 종종 사용되는 보호기의 예는 베타-시아노-에틸, 트리알킬실릴 및 알릴이다. 아미노기 보호를 위한 보호기는 트리플루오로아세틸 및 Fmoc 이다. 기타 가능한 보호기는 표준 지침서에 요약된다 (Greene, T.W., Protective groups in organic synthesis. Wiley Interscience Publications John Wiley&Sons (1981) New York, Chichester, Brisbane, Toronto; Souveaux, E., Methods in Mol. Biology, Vol. 26, Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Humana Press, Totowa, NJ, 1994, Chapter 1, ed. S. Agrawal).

연결자는 1 - 30 C 원자 길이의 탄소 사슬을 나타낸다. 이러한 연결자 사슬은 또한 부가적으로 하나 이상의 내부 질소, 산소, 황 및/또는 인 원자를 가질 수 있다. 연결자는 또한 분지, 예를 들어 또한 수지상일 수 있다. 연결자는 검출가능 단위 또는 보호기에 의해 임의로 보호되는 반응기를 갖는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 사슬과 서로 연결된다.

검출가능 단위는 분석적 방법의 도움으로 검출할 수 있는 성분을 표시하는 것으로 이해된다. 이들은 예를 들어 질량 분광계에 의해, 면역학적으로 또는 NMR 의 도움으로 검출될 수 있는 단위일 수 있다. 검출가능 단위는 특히 또한 광학적 방법, 예컨대 형광 및 UV/VIS 분광계에 의해 검출될 수 있는 성분, 예컨대 플루오레세인, 로다민 및 금 입자이다. 이들에는 또한 용해 거동에 영향을 줄 수 있고, 그의 형광이 혼성화에 의해 변형되는 인터칼레이터 (intercalator) 및 작은 홈 결합제가 포함된다.

포스포라미디트는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유도체의 5' 말단에 커플링될 수 있는 3가 인 원자를 함유하는 분자를 표시한다. 그러므로 포스포라미디트는 올리고뉴클레오티드 합성에 사용할 수 있다. 사슬 확장에 사용되는 (데옥시)리보뉴클레오티드 포스포라미디트 외에, 또한 올리고뉴클레오티드를 표지하기 위해 올리고뉴클레오티드 합성 동안 또는 종료시 유사한 방법에서 사용할 수 있는 표지로 유도된 포스포라미디트가 있다 (Beaucage, S.L., Methods in Molecular Biology 20 (1993) 33-61, ed. S. Agrawal; Wojczewski, C., et al., Synlett 10 (1999) 1667-1678).

본 발명과 관련해 용어 "올리고뉴클레오티드" 는 (데옥시) 올리고리보뉴클레오티드 뿐 아니라, 당 (예컨대 2'-O-알킬 유도체, 3' 및/또는 5' 아미노리보오스, LNA, HNA, TCA) 상에, 포스페이트 백본 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포티오에이트) 상에 변형을 갖는 또는 변형된 염기, 예컨대 7-데아자퓨린을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드도 포함된다. 본 발명과 관련해 또한 비-뉴클레오시드 유사체, 예컨대 PNA 또는 기타 생중합체, 예를 들어, 펩티드를 함유하는 컨쥬게이트 및 키메라를 포함한다. 게다가, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 비-뉴클레오시드 단위, 예컨대 각 위치에 스페이서, 예를 들어, 헥사에틸렌 글리콜 또는 Cn (n = 3.6) 스페이서를 함유할 수 있다.

용어 "전자 수용체" 는 유리 전자 쌍에 결합하는 경향을 갖는 원자 구조를 포함한다. 상기의 하나의 측정은 헤메트 (Hammett) 상수이다. 본 발명은 헤메트 (Hammett) 상수 σ_p 가 특정 값 0.30, 바람직하게는 0.45, 특히 바람직하게는 0.60 을 초과하는 특정 구현예에 관한 것이다.

전자 수용체는 부가적으로 올리고뉴클레오티드 합성 중의 모든 화학 반응에 상용성이어야만 한다, 즉,

- 이것은 요오드에 의해 산화되지 않아야만 한다

- 이것은 디클로로아세트산 및 트리클로로아세트산에 대해 비활성이어야만 한다

- 이것은 염기에 대해, 특히 암모니아에 대해 비활성이어야만 한다, 그리고

- 이것은 3가 포스포라미데이트와 반응하지 않아야만 한다.

상기 조건을 이행하는 전자 수용체의 예는 하기와 같다:

-NO₂, SO₂-R, -CN, -CO-R, 피리니디닐, 피리디닐, 피리다지닐, 헥사플루오로페닐, 벤조트리아졸릴 (Hansch, C., et al., Chem. Reviews 91 (1991) 165-195). 상기 외에도 수용체는 또한 비닐 또는 페닐 방식으로 질소 원자에 결합될 수 있다.

용어 "치환된" 은 치환되는 것으로 언급되는 구조가 임의의 위치 (단 상기 위치는 더욱 상세히 정의되지 않음) 에서 또다른 잔기를 함유하는 것을 의미한다. 용어 "임의로 치환된" 은 상기 방식으로 언급된 구조가 부가적인 잔기 유무인 구현예를 포함하는 것을 표시한다.

용어 "아미노-치환 알킬" 은 아미노기가 보호되거나 연결자를 통해 검출가능 단위에 결합된, 하나 이상의 아미노기를 함유하는 C₁-C₃₀ 선형 또는 분지형 알킬을 포함한다.

용어 "6-원 N⁺-헤테로사이클" 은 헤테로사이클의 전체 전하가 양성인 식으로, sp2 질소 상에서 알킬화된 N-헤테로사이클을 포함한다. 이의 예는 피리디늄, 피리미디늄 및 퀴놀리늄이다. 이러한 헤테로사이클은 전자 결핍인 것으로 당업계에 공지된다.

용어 "뉴클레오티드 사슬" 은 포스페이트 부분에 의해 5'-3' 내부-연결된 2 개 이상의 뉴클레오시드 잔기를 함유하는 분자 또는 분자의 일부로서 이해된다.

본 발명에 따른 화학 화합물

본 발명은 하기 구조를 1 회 이상 함유하는 임의의 화학 화합물을 포함한다:

(식 중,

B 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단을 나타내거나, 연결자를 나타내고, Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 치환기임). 상기 잔기는 부가적으로 올리고뉴클레오티드 합성 중의 모든 화학 반응에 상용성이어야만 한다, 즉,

- 이것은 요오드에 의해 산화되지 않아야만 한다

- 이것은 3가 포스포라미데이트와 반응하지 않아야만 한다.

초기에 단독으로 비사용성인 잔기는 그러나, 당업자에게 공지된 보호기를 사용하여 올리고뉴클레오티드 합성의 화학적 조건 하에서 비활성으로 거동하는 유도체로 전환될 수 있다.

또한 탈양성자화된 상태에서 올리고뉴클레오티드의 -OH 기가 통상 존재한다는 것으로 당업자에 의해 이해된다.

게다가, 본 발명은 또한 하기 구조의 메틸 포스포네이트를 포함한다:

(상기 제시된 정의를 가짐).

첫번째, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 화학 화합물은 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드에서, A 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 5' 말단을 나타내고/내거나 B 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단을 나타낸다. 그러므로, A 및 B 는 함께 2 개 이상의 뉴클레오티드 잔기를 포함한다.

올리고뉴클레오티드의 의도된 용도에 따라, 상기 기재된 구조는 1 회, 2 회, 수 회 또는 심지어 올리고뉴클레오티드에 존재하는 모든 포스페이트 잔기에 발생할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내의 포스페이트 잔기는,

A 는 첫번째 뉴클레오시드의 5' 말단을 나타내고,

B 는 뉴클레오시드 사슬 내의 두번째 뉴클레오시드의 3' 말단을 나타내는 식으로,

소위 뉴클레오시드-내 포스페이트라고 불린다.

게다가 본 발명에 따른 구조는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 위치할 수 있다. 이들이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 존재하는 경우,

A 는 뉴클레오티드 사슬의 5' 말단을 나타내고,

B 는 임의로 보호된 히드록실기 또는 검출가능 기 또는 또다른 반응기를 임의로 함유할 수 있는 연결자이고, 올리고뉴클레오티드 상에 검출가능 기를 도입하기 위해 사용될 수 있다.

전자 수용체가 또한 검출가능 단위를 나타내는 치환기를 함유하는 경우, 본 발명에 따라 존재하는 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에서 이중 표지를 가질 수 있다.

본 발명에 따른 구조가 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단에 있는 경우,

B 는 상기 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 나타내고,

A 는 히드록실 또는 고상이 바람직하게는 조절 공극 유리 입자, 예컨대, 정규적 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 출발 물질로서 사용되는 것들인, 고상에 결합된 연결자이다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 내의 개별 뉴클레오시드는 임의의 유형의 뉴클레오시드 또는 변형 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유도체를 함유할 수 있다. 당 단위는 통상적으로 DNA 올리고뉴클레오티드에 대한 데옥시리보오스 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 대한 리보오스이다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 함유된 핵염기 (nucleobase) 는 자연 발생적 염기, 예컨대, 아데닌, 구아닌, 티미딘, 시티딘, 우리딘, 그의 유도체 또는 소위 보편적 염기라 불리는 것들, 예컨대 니트로인돌일 수 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 각 포스페이트에 대한 아미드 결합을 통해 연결된 임의의 전자 수용체 기를 함유할 수 있다. 특히, 하기 전자 수용체 기가 사용될 수 있다:

a) -CN,

b) -SO₂―R', 여기서 R' 는 아미노-치환 알킬, 임의 치환 아릴 또는 임의 치환 헤테로사이클 중 하나 이상을 함유함,

c) 전자-결핍, 6-원 N⁺-헤테로사이클, 여기서 하나 이상의 질소 원자는 알킬화되고 오르토 또는 파라 위치에 위치하며, 상기 헤테로사이클은 R 로 임의 치환될 수 있음.

본 발명은 명백하게 또한 R' 가 아미노-치환 알킬, 임의 치환 아릴 또는 임의 치환 헤테로사이클인 것으로, SO₂―R' 의 구현예를 포함한다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 내의 모든 상기 전자 수용체의 존재는 다양한 적용에 사용될 수 있는 변형 올리고뉴클레오티드를 산출한다. 그러나, 임의의 유기 잔기 R 을 함유할 수 있는 모든 전자 수용체가, 임의의 유기 잔기를 함유하는 변형 올리고뉴클레오티드를 본 명세서에 기재된 합성 방법의 범주 내에서 단순한 방식으로 제조할 수 있게 하기 때문에 특히 관심의 대상이다.

그러므로, 본 발명은 특히 또한 잔기 R 로 치환된 전자 수용체가 R 로서 검출가능 단위를 함유하거나, 또는 대안적으로는 R 로서 작용기를 함유하고, 검출가능 단위가 후-표지에 의해 올리고뉴클레오티드 합성 후 그곳에 커플링 될 수 있는, 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 대안적으로는 본 발명은 또한 전자 수용체가 검출가능 단위의 성분인 구현예를 포함한다. 대안적으로는 잔기 R 은 그 자체가 검출가능 단위 또는 작용기일 수 있다.

이러한 표지된 올리고뉴클레오티드는 실시간 PCR 과 같은 분자 생물학에서의 수 많은 상이한 적용에 대해 유리하게 사용될 수 있다. 검출가능 표지는 바람직하게는 형광 염료 또는 형광 소광제 (quencher) 분자이다. 올리고뉴클레오티드에 대한 검출가능 단위로서 담당할 수 있는 해당하는 염료 및 분자는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 본 발명의 보호 범주를 제한하지 않는 이들의 예는: 플루오레세인, 로다민, 시아닌, 메로시아닌, 카르보시아닌 및 아조 및 폴리-아조 화합물이다.

본 발명은 또한 하나 이상의 형광 표지가 아미드/전자 수용체 기에 의해 올리고뉴클레오티드 사슬의 포스페이트 원자에 결합된 상기 기재된 구조를 갖는 실시간 PCR 프로브에 관한 것이다. 이러한 프로브의 예는 FRET 혼성화 프로브 (WO 97/46707), 또는 소위 단일-표지된 프로브 (WO 02/14555) 라고 불리는 것이다. 이와 관련해, 본 발명에 따른 내부 변형이 뉴클레오시드-내 포스페이트 잔기 상에 있는 올리고뉴클레오티드 프로브가 특히 바람직하다.

이와 관련해, 본 발명은 또한 특히 2 개의 검출가능 단위를 갖는 이중 표지된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 프로브의 예는 TaqMan 프로브 (US 5,804,375) 분자 비콘 (beacon) (US 5,118,801) 이다. 이와 관련해, 본 발명은 첫번째 형광 표지가 아미드/전자 수용체 기에 의해 올리고뉴클레오티드 사슬의 뉴클레오시드-내 포스페이트 원자에 결합하고 두번째 검출가능 단위가 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에서 종결적으로 존재하는 이중 표지된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

이러한 표지를 갖는 분자 및 그의 제조 방법은 당업계의 전문가에게 잘 알려져 있다.

추가 양상에서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 화학 화합물에 관한 것이다:

(식 중 A 는 고상에 결합된 연결자를 나타내고,

B 는 바람직하게는 보호된 반응기 또는 검출가능 단위를 갖는 연결자를 나타내고,

E 는 메틸 또는 보호된 히드록실이고,

B 와 관련해서, 바람직한 보호된 반응기는 디메톡시트리틸 (DMT) 보호된 히드록실기이다. E 와 관련해서, 바람직한 보호기는 베타-시아노에틸 기이다.

이러한 화합물은 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있고, 여기서 다음 포스포라미데이트는 상기 화합물의 남은 히드록실기과 반응하ㄷ다. 게다가, A 가 여분의 분지를 갖는 3 작용기 연결자를 나타내는 경우, 하나의 표지는 Acc 치환기를 통해 도입되고, 두번째 표지는 연결자에게 연결된 추가 부분을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는, 3' 말단에 이중 표지를 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조

본 발명은 또한 변형 올리고뉴클레오티드의 제조 방법, 특히 상기 기재된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다.

일반적으로 본 발명은 하기 화학식의 3가 인 유도체를:

(식 중, E 는 메틸기 또는 보호된 히드록실기를 나타내고, 이것은 바람직하게는 베타-시아노에틸 기에 의해 보호되고,

하기 화학식의 아자이드와 반응시키는 것을 특징으로 하는, 변형 올리고뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다:

베타-시아노에틸, 메틸, 알릴 또는 실릴이 보호기로서 특히 바람직하다. 대안적으로는 E 가 CH₃ 인 메틸-포스포네이트는 본 발명에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 따르면, 아자이드는 임의의 전자 수용체 기를 함유할 수 있다. 이들 기는 그 다음 각각의 인 원자에 연결된다. 특히, 하기 전자 수용체 기가 사용될 수 있다:

- -CN,

- -SO₂―R

- 전자-결핍, 6-원 N⁺-헤테로사이클, 여기서 하나 이상의 질소 원자는 알킬화되고 오르토 또는 파라 위치에 위치하며, 상기 헤테로사이클은 R 로 임의 치환될 수 있음.

본 발명에 따른 방법은 또한 특히 통상적인 올리고뉴클레오티드 합성에서 정규적으로 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:

a) 3' 포스포라미디트와 초기의 올리고뉴클레오티드 사슬의 5' OH 말단과의 반응 단계

b) 하기 화학식의 아자이드와의 반응 단계

이 경우, 초기의 올리고뉴클레오티드 사슬의 5' OH 말단은 5' 종결 뉴클레오티드의 5' 말단 또는 CPG 에 부착된 연결자의 유리 OH 기일 수 있다.

통상적인 올리고뉴클레오티드 화학은 반응성 고상 지지체 물질로부터 시작한다. 고상 지지체 물질은 추가 분자가 고정될 수 있는 반응기를 함유하는 고상을 형성하는 중합체성 성분을 말한다. 올리고뉴클레오티드 합성의 경우, 지지체 물질은 통상적으로 소위 조절 공극 유리 입자 (CPG) 라 불리는, 제한된 공극 크기의 다공성 유리 비이드이다. 대안적으로는 폴리스티렌 잔기 및 다른 유기 중합체 및 공중합체를 사용하는 것이 또한 가능하다 (Ghosh, P. K., et al., J. Indian. Chem. Soc. 75 (1998) 206-218). 올리고뉴클레오티드가 합성 후 기질 상에 고정된 채로 남아 있어야만 하는 경우, 유리 및 또한 반도체 칩은 고상 지지체 물질로서 사용될 수 있다. 이러한 고상 지지체 물질은 시판된다.

지지체는 DMT (디메톡시트리틸) 과 같은 보호기에 의해 보호된 종결 반응성 히드록실 잔기에 대한 분할가능 결합을 함유하는 소위 연결자 기에 의해 결합될 수 있다. 분할가능 결합이 있는 연결자 기는 3작용기 스페이서와 고상 지지체 물질 사이에 있고, 간단한 화학 반응에 의해 분할될 수 있는 기들을 표시한다. 이들은 숙시닐 또는 옥살릴 또는 분할가능 에스테르 결합을 함유하는 다른 연결자 기일 수 있다. 기타 연결자 기는 당업자에게 공지되어 있다 (Ghosh, P. K., et al., J. Indian. Chem. Soc. 75 (1998) 206-218).

이러한 연결자 기는 합성 완료 후 수용액에 존재하는 것으로 의도되는 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 지지체 물질의 사용에 필수적이다. 반대로, 올리고뉴클레오티드가 핵산 어레이의 제조에 대해, 합성 후 지지체 물질의 표면 상에 남아있어야만 하는 경우 (US 5,624,711, Shchepinov, M.S., et al., Nucl. Acids. Res. 25 (1997) 1155-1161), 분할가능 연결자 기가 불필요한 것이 아니라, 비-분할가능 연결자 기가 바람직하다.

본 발명에 따른 구조의 혼입을 위한 올리고뉴클레오티드 합성의 세부 사항은 하기와 같다:

3' - 5' 방향으로 사슬 확장이 일어날 수 있는 반응성 히드록실기가 산 처리에 의해 DMT 보호기를 제거한 후 형성된다. 그 다음 DMT 보호기 및 당업계에 잘 알려진 부가적인 염기 보호기로 또한 제공된 (데옥시) 리보뉴클레오시드의 3' 포스포라미디트 유도체가 테트라졸의 존재하에 DMT 보호기가 없는 각 반응기에 대한 5' 말단에 연속적으로 커플링된다. 3가 인 원자를 함유하는 중간체는 반응에 의해 서로 연결된 각각의 뉴클레오시드와의 에스테르 결합 및 사용되는 포스포라미디트에 이미 존재하는 보호된 히드록실기를 갖는 제 3 에스테르 결합을 형성하는 중간체 생성물로서 본 방법에서 형성된다. 예를 들어 베타-시아노에틸, 메틸, 알릴 또는 실릴에 의해 형성될 수 있는 상기 보호기는 염기 보호기 및 CPG 에 대한 연결자가 또한 분할되는 방법에서 올리고뉴클레오티드 합성 완료 후 암모니아로 연속적으로 분할된다.

요오드로의 산화 대신에, 초기의 올리고뉴클레오티드는 포스페이트 모방체가 뉴클레오티드 사슬 내에 도입되도록 하는 위치에서 하기 화학식의 아자이드와 반응한다:

(식 중, Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 잔기임). 기술된 합성 화학은 근본적으로 임의의 잔기 R 의 혼입 및 특히 임의의 유형의 형광 염료의 혼입을 가능하게 한다.

Acc 아자이드, 예컨대 아실 아자이드 및 술포닐 아자이드의 제조는 간단하고 오랫동안 공지되어 있다 (검토논문: Brase, S., et al., Angewandte Chemie 117 (2205) 5320-5374, 3.4 및 3.5.2). 이들은 바람직하게는 나트륨 아자이드를 사용하여 아실 클로라이드 또는 술포닐 클로라이드로부터, 또는 아질산을 사용하여 히드라지드로부터 제조된다.

염료 술포닐 아자이드는 예를 들어 또한 염색 방법 (예, DE 19650252) 에 사용된다. 시아노겐 아자이드는 나트륨 아자이드를 아세토니트릴 중에서 브로모시아노겐과 반응시켜 간단히 제조할 수 있다 (McMurry, J. E., et al., J. Organic Chemistry 38(16) (1973) 2821-7). 헤테로아릴 아자이드는 아자이드로의 할로겐의 친핵 치환에 의해 또는 헤테로아릴 히드라진으로부터 제조될 수 있다. 전자-끌기 질소가 아지도 기에 대해 파라 또는 오르토 위치에 있는 것이, 그래야만 공명-안정화된 포스페이트 모방체가 형성되므로, 필요조건이다. 이와 관련해 오르토 및 파라 N-알킬 피리디늄 아자이드가 특히 적합하다. 일부 아실, 술포닐 및 피리딜 아자이드는 또한 시판된다.

본 발명은 부가적으로 잔기 R 이 검출가능 단위인 상기 기재된 바와 같은 방법에 관한 것이다. R 은 바람직하게는 형광 염료 또는 형광 소광제 분자이다.

본 발명의 특정 구현예는 하나의 표지가 바람직하게는 본 발명의 방법에 따른 올리고뉴클레오티드 내에 내부적으로 도입되고, 또다른 표지가 바람직하게는 당업계에 공지된 방법에 따라 5' 또는 3' 말단에서 올리고뉴클레오티드 내에 도입되는, 이중 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 제조에 관한 것이다.

5'-종결 뉴클레오티드의 리보오스의 5' 위치에서 5' 표지의 경우, 혼입은 올리고뉴클레오티드 합성의 마지막에 염료-표지된 포스포라미디트를 사용하는 통상적인 방법에 의해 수행된다 (Beaucage, S. L., Methods in Molecular Biology 20 (1993) 33-61, S. Agrawal Publishers).

3' 말단에서의 표지화는 트리틸화 히드록실기에 더해 검출가능 표지를 이미 함유하는 반응성 고상 지지체로서 시판되는 CPG 를 사용하여 수행된다. DMT 보호기의 분할 후, 표준 올리고뉴클레오티드 합성은 이제 유리된 히드록실기에서 출발할 수 있다.

대안적으로는 후-표지화에 대해 종래 기술로부터 공지된 방법을 부가적인 5' 또는 3' 표지에 대해 사용할 수 있다 (US 5,002,885, US 5,401,837).

본 발명은 또한 표준 올리고뉴클레오티드 합성 전에 제조될 수 있는 본 발명에 따른 합성의 중간체에 관한 것이다. 이 경우, 고상에 여전히 결합되어 있고, 아직 탈보호되지 않으며 염기성 스페이서 기를 함유할 수 있는 중간체가 바람직하다. 포스페이트 CPG 로서 당업자에게 친숙한 CPG 는 3' 인산화 올리고뉴클레오티드가 올리고합성 후 형성되므로, 바람직하게는 제조에 사용된다. 탈트리틸화 후, 이러한 포스페이트 CPG 는 활성제의 존재하에서 스페이서 포스포라미디트와 반응한다. 그 다음 형성되는 3가 인 중간체는 검출가능 단위를 함유하는 Acc 아자이드와 반응한다. 합성의 상기 중합체는 저장될 수 있고, 보편적인 3' 표지화에 대한 3작용기 CPG 와 같이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 N-Acc-포스포로티오에이트 또는 비스-N-Acc-포스페이트 모방체가 합성되도록 하기 위해, 예를 들어, 베타-시아노에틸-보호된 산소 대신에 보호된 N-Acc 기를 함유하는 포스포라미디트의 합성에 관한 것이다. 이러한 합성 전략은 예를 들어 P=N-CN 을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 개별 경우에 적합하다.

3가 인 중간체가 또한 아자이드와 반응할 수 있는 메틸 포스포네이트의 합성 동안 형성된다. 메틸 포스포라미디트는 또한 시판된다.

표준 올리고뉴클레오티드에 대해서 뿐 아니라, 특히 유사체에 대해서, 예를 들어, N3'→P5' 올리고뉴클레오티드의 합성에 대해서 사용되는 역 합성 전략 (EP 1 155 027) 에서, 3가 인을 함유하는 중간체가 또한 형성되고, 이는 본 발명에 따라 아자이드와 반응될 수 있다. 해당하는 포스포라미디트는 시판된다.

적용 범위:

본 발명에 따른 합성 전략은 포스페이트 백본 상에 변형된 다양한 올리고뉴클레오티드의 제조를 가능하게 한다. 변형의 정도, 변형의 다양성 및 담당은 의도되는 용도에 의해 결정된다.

예를 들어, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 포획 또는 검출을 위해 자연적인 DNA 및 RNA 와 혼성화하기 위해 사용할 수 있다. P-N=Acc 포스페이트 모방체를 단독으로 또는 정상 포스페이트와의 키메라로서 함유하는 올리고뉴클레오티드는 또한 증폭 반응에서 프라이머로서 성공적으로 사용될 수 있다.

이러한 올리고뉴클레오티드 프로브는 다양한 적용, 예를 들어 실시간 PCR, FISH, 블롯 (Blot) 기술, 서열분석에 대한 기초가 된다 (Jung, P.M., et al., Nucleic Acid Amplification Technologies BioTechniques Books, Div. Eaton Publishing (1997) Editors H. H. Lee, S.A. Morse, O. Olsvik; Bustin, Stephen A. and Nolan, Tania. Chemistries. IUL Biotechnology Series (2004), 5(A-Z of Quantitative PCR), 215-278).

본 발명에 따라 표지된 올리고뉴클레오티드는 특히 다양한 실시간 PCR 포멧에서 형광-표지된 프로브로서 적합하다.

이중 표지된 프로브는 분자 비콘 포멧 (US 5,118,801) 에 대해, 그리고 TaqMan 프로브 포멧 (US 5,210,015, US 5,538,848 및 US 5,487,972, US 5,804,375) 에 대해 통상적으로 사용되고, 여기서 표지는 바람직하게는 내부적으로 도입되고, 두번째 표지는 프로브의 5' 또는 3' 말단에 위치한다. 포스포라미디트 화학에 기초한 올리고뉴클레오티드 합성의 일부로서 본 발명에 따른 방법을 사용하여 프로브를 내부적으로 표지하는 것이 특히 유리하다. 프로브의 5' 또는 3' 말단에서의 두번째 검출가능 단위는 또한 기재된 본 발명의 방법 중 하나에 의해 또는 종래 기술로부터 공지된 방법의 도움으로 해당하는 프로브 내에 도입될 수 있다.

5'-종결 표지된 프로브 및 3'-종결 표지된 프로브는 통상적으로 FRET 혼성화 프로브 포멧에 대해 사용된다 (Matthews, J.A., and Kricka, LJ., Analytical Biochemistry 169 (1988) 1-25), (Bernard, P.S., et al., Analytical Biochemistry 255 (1998) 101-107). 이 경우, 포스포라미디트 화학에 기초한 올리고뉴클레오티드 합성의 일부로서 본 발명에 따른 방법을 사용하여 프로브의 5'-표지화를 수행하는 것이 특히 유리하다.

본 발명은 작용화된 올리고뉴클레오티드가, 전자 수용체 Acc 가 올리고합성을 위해 적합하게 보호된 작용기를 함유하는 잔기 R 로 변형된 간단한 방식으로 제조되도록 한다. 상기 잔기가 아미노 또는 히드록실아미노 기인 경우, 이들은 예를 들어 에폭시-변형된 표면 상에 점을 찍어 올리고뉴클레오티드 어레이를 제조하는데 사용될 수 있다 (Seliger, H., et al., Current Pharmaceutical Biotechnology 4 (2003) 379- 395). 반대로 티올 기는 금 표면 또는 금 입자 상에 고정화를 위해 사용될 수 있다. 이 경우, 여러 티올 기가 금 표면 상에 포획 프로브의 안정적인 결합을 수득하기 위해 간단한 방법으로 도입되는 경우, 본 발명에 따르면 특히 유리하다. 보호된 OH 기가 작용기로서 도입되는 경우, 분지형 또는 수지상 올리고뉴클레오티드가 또한 제조될 수 있다.

이러한 작용기 및 특히 아미노기는 또한 이들을 올리고합성 후 염료의 활성 에스테르와 반응시켜 표지된 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 따른 올리고뉴클레오티드 합성 동안 직접적으로 검출가능 단위를 도입하는 것이 더욱 유리하다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제에 저항성이므로, 이들은 또한 유전자 발현의 비활성화를 위해 전문가에게 공지된 다양한 세포 배양 실험에 사용하기에 적합하고, 즉, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 또는 siRNA 활성 성분의 성분으로서 사용한다. 이 경우, 세포 섭취를 용이하게 하고/하거나 표적 핵산에 대한 결합을 개선하는 식의 변형이 선택될 수 있다. 각 표적 유전자의 발현의 비활성화는 이어서 노던 블롯 (Northern Blot) 분석, 1-단계 또는 2-단계 실시간 (Real-Time) RT-PCR 에 의해 또는 적합한 마이크로어레이 상의 혼성화에 의해 모니터링될 수 있다.

게다가 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 검출가능 단위와 단백질 사이의 친수성 연결자로서 또는 정의된 질량의 표지로서 사용될 수 있다. 또한 상이한 술포닐 아자이드 및 아실 아자이드 또는 헤테로아릴 아자이드를 사용하여 합성 동안 포스페이트 상에 다양한 잔기 R 을 도입하는 것이 가능한 경우에 압타머 (aptamer) 성분 라이브러리를 설정할 수 있다. 그 다음 이러한 라이브러리로 단백질 또는 다른 생분자에 대한 결합을 시험할 수 있다. 종래 기술에 공지된 압타머에 비해 유리한 점은 본 발명에 따른 방법이 다수의 상이한 부가적인 변형을 간단한 방법으로 제조 및 시험할 수 있게 한다는 것이다.

본 발명은 하기 실시예, 공개 및 서열 프로토콜, 특허 청구항으로부터 유래된 보호 범위에 의해 더욱 상세히 명백해진다. 기재된 방법은 심지어 변형 후에도 여전히 발명의 목적을 기재하는 예시로서 이해되어야 한다.

하기 실시예 및 서열 목록은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되었으며, 이의 실제 범주는 청구의 범위에 언급된다. 본 발명의 취지에서 벗어남 없이 언급된 절차에서 변형이 이뤄질 수 있다는 것으로 이해된다.

실시예 1

변형된 dT(P(= NSO2PhNHAc )dT 의 합성

2량체 합성을 ABI 394 합성기에서 10 μmol 규모로 수행하였다. 시판되는 dT CPG 지지체를 고상으로 사용하였다. 표준 합성에 대한 모든 화학물질은 Glen Research 로부터 수득하였다.

요오드를 함유하는 통상적인 산화제 용액을 무수 아세토니트릴 중 p-NAc 페닐술포닐 아자이드 (Sigma Aldrich) 의 0.1 M 용액으로 대체하였다. 산화 시간을 16 분으로 늘렸다.

생성물을 33% 암모니아로 실온에서 2 시간 동안 지지체로부터 분할하고, Poros Oligo R3 4.6 x 50 mm 컬럼 상의 역상 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 크로마토그래피: 완충액 A: 물 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 (pH 6.8), 완충액 B: 물/아세토니트릴 1:1 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트, 45 분 내, 구배 2 분 0 % B → 100 % B. 용리액의 UV 흡수를 260 nm 에서 측정하였다. 원하는 생성물이 함유된 주 분획이 있었다. 용매를 진공 원심분리로 제거하였다. 잔류물을 재증류수에 취하고, 다시 진공에서 증발시켰다. 상기 절차를 3 번 반복하였다. 그 다음 잔류물을 재증류수에 용해하고 동결건조시켰다.

1H NMR: D2O 중 (Bruker DPX 300): 7.82 d[2H, 아릴], 7.56 d[2H 아릴], 7.47 s[1H, C6-H], 7.40[1H, C6-H], 6.21 m [1H, H1'], 6.21 m [1H, H1'], 6.07 m[1H, H1'], 4.38 m [1H, H3'], 4.10 [m, 4H, H4', H5'] 2.38-2.24 m [4H, H2'], 2.22 [3H, CH3], 2.16 [3H, CH3], 2.14 [3H, CH3]

31P NMR: D2O 중 (Bruker DPX 300): 2.14

질량 분석 (ESI-MS) 계산치 742.66 측정치 [M-H]: 741.73

실시예 2

T(P(= NSO2PhNHAc )T9 올리고뉴클레오티드의 합성

올리고뉴클레오티드 합성을 ABI 394 합성기에서 1 μmol 규모로 수행하였다. 시판되는 dT CPG 지지체를 고상으로 사용하였다. 표준 합성에 대한 모든 화학물질은 Glen Research 로부터 수득하였다.

첫번째 합성 사이클에서, 요오드를 함유하는 산화제를 무수 아세토니트릴 중 p-NAc 페닐술포닐 아자이드 (Sigma Aldrich) 의 0.1 M 용액으로 대체하였다. 산화 시간을 16 분으로 늘렸다. 남은 dT 포스포라미디트의 연결을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.

생성물을 33% 암모니아로 실온에서 2 시간 동안 지지체로부터 분할하고, Poros Oligo R3 4.6 x 50 mm 컬럼 상의 역상 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 크로마토그래피: 완충액 A: 물 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 (pH 6.8), 완충액 B: 물/아세토니트릴 1:1 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트, 45 분 내, 구배 2 분 0 % B → 100 % B. 용리액의 UV 흡수를 260 nm 에서 측정하였다. 원하는 생성물이 함유된 주 분획이 있었다. 용매를 진공 원심분리로 제거하였 다. 잔류물을 재증류수에 취하고, 다시 진공에서 증발시켰다. 상기 절차를 3 번 반복하였다. 그 다음 잔류물을 재증류수에 용해하고 동결건조시켰다.

질량 분석 (ESI-MS) 계산치: 3176.25 측정치 [M-H]: 3176.0

실시예 3

플루오레세인 - 표지된 올리고뉴클레오티드의 합성

각 P=O 가 P=N-pPh-NAc 로 대체된 5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC 플루오레세인-3' (SEQ. ID. NO:4)

올리고뉴클레오티드 합성을 ABI 394 합성기에서 1 μmol 규모로 수행하였다. 시판되는 LightCycler 플루오레세인 CPG (Roche Applied Science) 를 지지체 물질로 사용하였다. 표준 합성에 대한 모든 화학물질은 Glen Research 로부터 수득하였다. Proligo 로부터의 tert. 부틸페녹시-아세틸 보호기가 있는 포스포라미디트 ("tac" 또는 "Expedite" 단량체로 공지됨) 를 사용하였다.

표준 프로토콜을 합성에 사용하였고, 요오드를 함유하는 산화제를 무수 아세토니트릴 중 p-NAc 페닐술포닐 아자이드 (Sigma Aldrich) 의 0.1 M 용액으로 대체하고, 산화 시간을 16 분으로 늘렸다.

질량 분석 (ESI-MS) 계산치: 11839 측정치 [M-H]: 11839.9

실시예 4

특정 위치에서 P=O 가 P=N- Acc 로 대체된 키메라성 올리고뉴클레오티드의 합성

합성을 ABI 394 합성기에서 1 μmol 규모로 수행하였다. 합성 동안 산화제가 변형되지 않게 하기 위해서, N3-Acc 용액이 여분 염기 위치에 부착될 수 있는 식으로 합성 프로그램을 변형하였다. 프로그래밍의 제한으로 인해, 아자이드를 활성제와 함께 반응시켰다. 이것은 변형에 대한 효과가 없었다. 3가 인 중간체를 가진 N3 Acc 의 반응 시간은 5 분이었다.

표준 합성에 대한 모든 화학물질은 Glen Research 로부터 수득하였다. Proligo 로부터의 tert. 부틸페녹시-아세틸 보호기가 있는 포스포라미디트 ("tac" 또는 "Expedite" 단량체로 공지됨) 를 사용하였다. 상기 기재된 바와 같이 정제를 수행하였다.

지지체: 플루오레세인 CPG: N3-Acc: p-NAc 페닐술포닐 아자이드 (Sigma Aldrich).

각각 동일한 SEQ ID NO: 4 를 갖는 하기 프로브를 합성하고 이어서 질량 분석에 의해 분석하였다:

pl 은 P=N-pPh-NAc 모방체이다

실시예 5

본 발명에 따른 3'-종결 표지화

a) 답실 아자이드의 제조

0.71 g (2.19 mmol) 답실 클로라이드를 10 ml 아세톤에 용해하였다. 2 ml 물 중 142 mg (2.19 mmol) 나트륨 아자이드의 용액을 빙상에서 냉각 및 교반하면서 천천히 적가하였다. 0℃ 에서 2 시간 동안 교반한 다음, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 그 다음 500 μl 물 중 32 mg 나트륨 아자이드 (0.5 mmol) 의 용액을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 교반하였다 (TLC 실리카 겔 CH₂Cl₂). 그 다음 200 ml 메틸렌 클로라이드를 현탁액에 첨가하고 여과하였다. 여과액을 물로 2 회, 5% 탄산수소나트륨 용액으로 1 회, 그 다음 물로 2 회 섞었다. 분리된 유기상을 나트륨 술페이트로 건조시켰다. 용매를 20℃ 미만의 배쓰 온도에서 회전 증발기 상에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 2 ml 아세토니트릴에 현탁하고 여과하였다. 상기 잔류물을 에테르로 세척하였다.

미정제 생성물을 280 mg 산출하였다. 아자이드는 DNA 합성기에 직접적으로 또는 추가 정제 없이 지지체를 제조하기 위해 사용된다.

b) 올리고뉴클레오티드 합성에 대한 답실 지지체의 제조

1.2 g 포스포링크 CPG 적재량 49 μmol/g 을 Schlenk 프릿 (frit) 내에 채우고, 아르곤 하에서 무수 아세토니트릴로 세척하였다. 그 다음 이것을 여과액이 무색일 때까지 메틸렌 클로라이드 중 0.1 M 디클로로아세트산으로 세척하였다. 이어서 이것을 무수 아세토니트릴로 전체적으로 세척하였다. 그 후에 이것을 아세토니트릴 (활성제) 중 2 ml 0.25 M 디시아노이미다졸 및 2 ml 활성제로 세척하고, 즉시 스페이서 C3 포스포라미디트의 2 ml 0.1 M 용액을 첨가하였다. 그 다음 현탁액을 3 분 동안 방치하였다. 이것을 아르곤 압력 하에서 여과하였다. 그 다음 이것을 2 ml 활성제, 및 다시 2 ml 활성제로 세척하고, 즉시 스페이서 C3 포스포라미디트의 0.1 M 용액 2 ml 을 첨가하였다. 그 다음 제제를 12 분 동안 방치하였다. 아르곤 압력하에서 여과에 의해 용매를 제거하고, 메틸렌 클로라이드 중 답실 아자이드의 0.1 M 용액 2 ml 을 첨가하고, 혼합물을 15 분 동안 방치하였다. 변형 CPG 를 마지막으로 100 ml 메틸렌 클로라이드 및 그 다음 100 ml 무수 아세토니트릴로 세척하고, 진공에서 건조시켰다.

c) 답실 지지체를 사용하는 올리고뉴클레오티드 합성:

5' 플루오레세인-GCA CCA GAT CCA CGC CCT TGA TGA GC-O-CH₂-CH₂-CH₂-O(O₂)P(=N-SO₂-Ph-p-N=N-Ph-p-NMe₂)

올리고뉴클레오티드 합성을 ABI 394 합성기에서 1 μmol 규모로 수행하였다. 실시예 5a 로부터의 답실-CPG 를 지지체 물질로서 사용하였다. 6-카르복시플루오레세인 포스포라미디트 (Glen Research, Report No. 10 (GR10-1) (1997) 1-12) 를 5'-표지화를 위해 사용하였다.

표준 합성에 대한 모든 화학물질은 Glen Research 로부터 수득하였다. 4) 에 기재된 바와 같이, Proligo 로부터의 tert. 부틸페녹시-아세틸 보호기가 있는 포스포라미디트 ("tac" 또는 "Expedite" 단량체로 공지됨) 를 사용하였다. 표준 프로토콜에 따라 합성을 수행하였다. 분할 및 정제를 또한 4 에 기재된 바와 같이 수행하였다.

질량 분석 (ESI-MS) 계산치: 8973 측정치 [M-H]: 8973.1

실시예 6

실시간 PCR 및 용융 곡선 분석

혼성화에 대한 포스페이트 모방체의 효과를 분석하기 위해, 인자 V DNA 의 정량적 실시간 PCR 과 연이은 용융 곡선 분석을 LightCycler 1.2^® 기구 (Roche Diagnostics GmbH) 에서 수행하였다. 프라이머를 플루오레세인/LightCycler Red 640 FRET 혼성화 프로브의 쌍과 조합으로 사용하였다. 프라이머 및 5' LightCycler Red 640 프로브를 일정하게 유지시켰다. 다양한 3' 플루오레세인 프로브를 실시예 4 로부터 포스페이트 상에 변형시키고, 미변형 플루오레세인 프로브를 참조로서 FRET 공여자 프로브로서 사용하였다. 증폭 효율에 대한 측정인 교차점에 대한 효과 및 용융점에 대한 효과를 평가하였다.

20 μl 의 PCR 반응 혼합물을 다음과 같이 인자 V DNA 분절의 증폭을 위해 제조하였다.

인자 V 야생형 유전자 및 돌연변이체를 함유하는 플라스미드 (Gene Bank Accession No. M_014335) 10⁶ 카피

MgCl2 13 mM

SEQ ID NO: 1 및 2 을 갖는 프라이머 각각 500 nM

SEQ ID NO: 3 및 4 을 갖는 FRET 혼성화 프로브 각각 200 nM

LightCycler DNA Master Hyb Probes Kit (Roche Applied Science, Cat. No. 2158825) 를 제조자의 지침에 따라 모든 다른 PCR 성분에 대해 사용하였다.

하기 서열을 프라이머 및 프로브로서 사용하였다:

SEQ ID NO:1

전방향 프라이머:

5' GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A

SEQ ID NO:2

역방향 프라이머:

5' TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA

SEQ ID NO:3

FRET 수용체 프로브

5' LC-Red 640 AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT

SEQ ID NO:4

FRET 공여자 프로브

5' AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-플루오레세인

하기 온도 프로그램을 LightCycler 1.2 (Roche Applied Science) 에서 증폭을 위해 사용하였다.

형광 신호가 LigthCycler Red 640 방출에 특이적인 검출 채널에서 (640 nm 에서) 측정되고, 초기 신호를 표준화하기 위해 산술 배경 정정 방식을 사용하는 2 차 유도체 역치 방법을 사용하여 45 사이클에 걸쳐 실시간 모니터링을 수행하였다.

증폭 후, 용융 곡선 분석을 LightCycler 설명서 (Roche Applied Sciences) 의 지침에 따라 수행하였다. 하기 온도 프로그램을 사용하였다:

절대 형광 신호를 640 nm 체널에서 상기와 같이 측정하고, 이어서 첫번째 유도체를 이로부터 계산하였다.

상이한 변형 공여자 프로브를 사용하여 증폭 효율에 대해 측정으로서 교차점이 하기 표에 제시된다. 표에는 또한 인자 V 야생형 서열 및 인자 V 돌연변이 서열에 대한 다양한 공여자 프로브의 측정된 용융 온도가 제시된다.

pl 은 P=N-pPh-NAc 모방체이다

표에서 제시되는 바와 같이, 교차점은 본 발명에 따른 변형의 도입에 의해 유의하게 영향을 받지 않는다, 즉, PCR 효율은 변화가 없다.

또한, 1회 또는 2회 변형된 프로브의 경우에서 측정된 용융 온도에 대한 영향이 발견되지 않는다. 게다가, 다수의 변형 프로브만이 4℃ 이하의 적당한 용융점 변화를 나타낼 뿐, 미스매치 구별에 대한 능력은 유지된다.

실시예 7

실시간 PCR + 용융 곡선 분석

a) 리사민 아자이드 (= 로다민 B) 의 제조

5 ml 물 중 195 mg (3.0 mmol) 나트륨 아자이드의 용액을 20 ml 아세톤 중 577 mg (1 mmol) 술포로다민 B 산 클로라이드의 용액에 0℃ 에서 적가하였다. 혼합물을 0℃ 에서 2 시간 동안, 그 다음 실온에서 6 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 분별 깔대기에 옮기고, 300 ml 물 및 300 ml 메틸렌 클로라이드를 첨가하였다. 유기상을 분리하고, 100 ml 물로 2 회 세척하였다. 유기상을 나트륨 술페이트로 건조시켰다.

용매를 회전 증발기에서 증류에 의해 제거하였다. 잔류물 (140 mg) 을 추가 정제 없이 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 사용하였다.

b) SEQ ID NO :3 FRET 수용체 프로브 Ap * GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT - p 의 합성

p* = P= NS (O)2- 로다민 -B

올리고뉴클레오티드 합성을 ABI 394 합성기에서 1 μmol 규모로 수행하였다. 시판되는 포스포링크 CPG (Glen Research) 를 지지체 물질로 사용하였다. 표준 합성에 대한 모든 화학물질은 Glen Research 로부터 수득하였다. Proligo 로부터의 tert. 부틸페녹시-아세틸 보호기가 있는 포스포라미디트 ("tac" 또는 "Expedite" 단량체로 공지됨) 를 사용하였다.

표준 프로토콜 (트리틸 제거) 을 마지막 사이클에서 산화제를 무수 아세토니트릴 중 리사민 아자이드의 0.1 M 용액으로 대체하고, 산화 시간을 16 분으로 늘려, 합성에 사용하였다.

생성물을 33% 암모니아로 실온에서 2 시간 동안 지지체로부터 분할하고, Poros Oligo R3 4.6 x 50 mm 컬럼 상의 역상 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 크로마토그래피: 완충액 A: 물 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 (pH 6.8), 완충액 B: 물/아세토니트릴 1:1 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트, 45 분 내, 구배 2 분 0 % B → 100 % B. 용리액의 UV 흡수를 260 nm 에서 측정하였다. 원하는 생성물이 함유된 주 분획이 있었다. 용매를 진공 원심분리로 제거하였다. 잔류물을 재증류수에 취하고, 다시 진공에서 증발시켰다. 상기 절차를 3 번 반복하였다. 그 다음 잔류물을 재증류수에 용해하고 동결건조시켰다. 질량 분석 (ESI-MS) 계산치: 11710 측정치 [M-H]: 11710.5.

c) 실시간 PCR

실시간 PCR 에서의 안정성을 입증하기 위해, 인자 V DNA 의 실시간 PCR 을 LightCycler 2.0 로 수행하였다. 프라이머를, 리사민 (로다민B) 이 FRET 수용 체로서 작용하는 플루오레세인/리사민 FRET 혼성화 프로브의 쌍과 조합으로 사용하였다. 정량 곡선을 기록하고, cp 값을 표적 핵산의 농도의 함수로서 측정하였다.

실시간 PCR 및 용융 곡선 분석을 인자 V DNA 분절 10⁴ 및 10⁶ 카피의 증폭을 위해 실시예 6 에 따라 수행하였다. 추가 변형되지 않은 실시예 6 에 따른 플루오레세인 공여자 프로브 (SEQ ID NO:4) 및 실시예 7b 에 따른 FRET 수용체 프로브 7b (SEQ ID NO:3) 를 이를 위해 사용한다.

형광 신호를 610 nm 검출 채널에서 측정하였다. 원 신호를 표준화하기 위해 610/530 배경 정정 방식을 사용하였다. 10⁶ 카피에 대해 cp 값은 22 로 측정되었고, 10⁴ 카피에 대해 cp 값이 26 으로 측정되었다.

야생형에 대한 용융점은 64.69℃ 로 측정되었고, 돌연변이에 대한 용융점은 56.24℃ 가 측정되었다 (10⁶ 카피).

실시예 8

변형 프라이머로의 실시간 PCR

프라이머 연장에 대한 포스페이트 모방체의 효과를 분석하기 위해, 인간 인자 V DNA 의 정량적 실시간 PCR 을 LightCycler 1.2^® 기구 (Roche Diagnostics GmbH) 에서 수행하였다. 프라이머 쌍의 상이한 위치에 도입되었던 P=N-pPh-NAc 모방체가 인간 인자 V DNA 의 증폭에 사용되었다. 변형 프라이머를 실시예 4 에 따라 합성하였다. 트리틸 온 방식 (Trityl on mode) 으로 실시예 3 의 역상 크로마토그래피에 의해 정제를 수행하였다. 탈트리틸화를 20 분 동안 80% 아세트산으로 처리하여 수행하였다.

상기 프라이머는 실시예 6 에 따라 플루오레세인/LightCycler Red 640 FRET 혼성화 프로브의 쌍과 조합으로 사용되었다. 플루오레세인 프로브 및 5' LightCycler Red 640 프로브 (Seq. Id. No: 3 및 4) 를 일정하게 유지하였다. 변형 및 미변형 프라이머의 다양한 조합을 시험하였다. 참조로서 미변형 프라이머를 사용하였다. 증폭 효율에 대한 측정인 교차점에 대한 효과를 평가하였다.

절대 형광 신호를 640 nm 체널에서 상기와 같이 측정하고, 이어서 첫번째 유도체를 이로부터 계산하였다. 상이한 변형 공여자 프로브를 사용하여 증폭 효율에 대해 측정으로서 교차점이 하기 표에 제시된다.

pl 은 P=N-pPh-NAc 모방체이다

표에서 제시되는 바와 같이, 교차점은 프라이머 중에 본 발명에 따른 변형 도입에 의해 유의하게 영향을 받지 않았으며, 이는 PCR 효율이 거의 변하지 않았다는 것을 보여준다.

실시예 9

피리디늄 포스파트미메티쿰을 포함하는 플루오레세인 표지된 올리고뉴클레오 티드의 합성:

SEQ.ID. NO:4 에 따른 올리고뉴클레오티드의 합성을 ABI 394 합성기에서 1 μmol 규모로 수행하였다. 시판되는 LightCycler 플루오레세인 CPG (Roche Applied Science) 를 지지체 물질로 사용하였다. 표준 합성에 대한 모든 화학물질은 Glen Research 로부터 수득하였다. Proligo 로부터의 tert. 부틸페녹시-아세틸 보호기가 있는 포스포라미디트 ("tac" 또는 "Expedite" 단량체로 공지됨) 를 사용하였다.

실시예 4) 로부터의 프로토콜을 합성에 사용한 반면, 2 차 사이클 동안 산화제로서 무수 아세토니트릴 중 1,2,6 트리메틸 피리디늄 4-아지드 (RareChem AQ N6 1054) 의 0.1 M 용액을 사용하였고, 산화 시간을 16 분으로 늘렸다. 이것은 하기 구조를 포함하는 중간체를 산출한다:

질량 분석 (Maldi-MS Applied Biosystems Voyager System 6327) 계산치: 7641.32 측정치 [M-H]: 7639.59

실시예 10

상이한 온도 및 pH 에서 미변형 dAdT 와 비교한 dA(P(= NSO2PhNHAc )dT 디뉴클레오티드의 안정성

dA(P(=NSO2PhNHAc)dT 를 실시예 1) 에 따라 합성하고 정제하였다. dAdT 를 또한 실시예 1 에 따라 합성하였으나, 표준 산화제를 사용하였다 (THF 중 0.02 M 요오드).

2량체를 상이한 pH 값 7.0, 8.0 및 9.0 의 10 mM Tris 완충액에서 상이한 시간 및 온도에 노출시켰다. 샘플을 실온 (대략 24℃) 에 24 시간 동안 또는 95℃ 에서 60 분 동안 각각 16 시간 동안 방치하였다. 실험 전후에 150 μL 분취물을 제거하고, 100 μL 부피를 HPLC 에 주입하였다.

Waters 2690 분리 모듈의 분석 X-Bridge 컬럼 (2.5μm,. 4.6x50 mm i.d.) 상의 역상 HPLC 에 의해 분해를 모니터링하였다. Waters 2996 PAD Detector (260 nm) 로 검출을 수행하였다. 유속 1.0 ml/분으로 아세토니트릴의 95% 구배가 주 입된 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 (pH 6.8) 의 유동 상을 사용하였다. 2량체 신호의 보유 시간 rt 를 모니터링하여 2량체의 파괴 속도를 판단하였고 (Software Millenium, Waters), 뉴클레오티드 2량체의 것과 상이한 보유 시간이 발생하는 지의 여부를 측정하였다. 결과를 하기 표에 제시한다:

pH 7.0, 8.0 및 9.0, rt 에서 24 시간 동안, 95℃ 에서 1 시간 동안 안정한 미변형된 2량체가 있었고, pH 7.0 및 pH 8.0 에서 16 시간 후 분해가 시작되었다. 미변형된 2량체는 pH 7.0, 8.0 및 9.0, rt 에서 24 시간 동안, 95℃ 에서 1 시간 동안 안정하였고, pH 7.0, 95℃ 에서 16 시간 후 분해가 시작되었다.

<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> Polynucleotide containing a phosphate mimetic <130> 23428 WO <150> EP 05025499 <151> 2005-11-23 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gagagacatc gcctctgggc ta 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgttatcaca ctggtgctaa 20 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 agggatctgc tcttacagat tagaagtagt cctatt 36 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 aatacctgta ttcctcgcct gtc 23

Claims

하기 구조를 1 개 이상 함유하는 화학 화합물:

(식 중 A 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 5' 말단을 나타내거나, 고상에 결합된 연결자를 나타내고,

B 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단을 나타내거나, 연결자를 나타내고,

D 는 OH 또는 CH₃ 이고,

Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 치환기이고, Acc 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

(i) -CN,

(ii) -SO₂―R', 여기서 R' 는 하나 이상의 아미노-치환 알킬, 임의 치환 아릴 또는 임의 치환 헤테로사이클을 함유함,

(iii) 오르토 또는 파라 위치에 하나 이상의 알킬화 N-원자를 갖는 6-원 N⁺ 헤테로사이클, 상기 헤테로사이클은 피리디늄, 피리미디늄 및 퀴놀리늄으로 이루어 진 군으로부터 선택됨).
제 1 항에 있어서, R 또는 R' 가 단독 또는 전자 수용체와 조합으로 검출가능 단위 또는 작용기를 함유하는 것을 특징으로 하는 화학 화합물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, A 및 B 가 함께 2 개 이상의 뉴클레오티드 잔기를 함유하는 올리고뉴클레오티드.
하기 화학식의 3가 인 유도체를:

(식 중, E 는 메틸기 또는 보호된 히드록실기를 나타내고,

A 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 5' 말단을 나타내거나, 고상에 결합된 연결자를 나타내고,

B 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬의 3' 말단을 나타내거나, 연결자를 나타냄),

하기 화학식의 아자이드와 반응시키는 것을 특징으로 하는, 변형 올리고뉴클레오티드의 제조 방법:

(식 중, Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 치환기이고, Acc 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

(i) -CN,

(ii) -SO₂―R', 여기서 R' 는 하나 이상의 아미노-치환 알킬, 임의 치환 아릴 또는 임의 치환 헤테로사이클을 함유함,

(iii) 오르토 또는 파라 위치에 하나 이상의 알킬화 N-원자를 갖는 6-원 N⁺ 헤테로사이클, 상기 헤테로사이클은 피리디늄, 피리미디늄 및 퀴놀리늄으로 이루어진 군으로부터 선택됨).
제 4 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법:

a) 3' 포스포라미디트를 초기의 (nascent) 올리고뉴클레오티드 사슬의 5' OH 말단과 반응시키는 단계,

b) 하기 구조의 아자이드와 반응시키는 단계:

(식 중, Acc 는 전자 수용체 또는 잔기 R 로 치환된 전자 수용체이고, R 은 임의의 유기 치환기이고, Acc 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

(i) -CN,

(ii) -SO₂―R', 여기서 R' 는 하나 이상의 아미노-치환 알킬, 임의 치환 아릴 또는 임의 치환 헤테로사이클을 함유함,

(iii) 오르토 또는 파라 위치에 하나 이상의 알킬화 N-원자를 갖는 6-원 N⁺ 헤테로사이클, 상기 헤테로사이클은 피리디늄, 피리미디늄 및 퀴놀리늄으로 이루어진 군으로부터 선택됨).
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, R 또는 R' 가 검출가능 단위인 방법.
혼성화 파트너로서의 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 용도.
제 7 항에 있어서, 혼성화 프로브로서의 용도.
제 7 항에 있어서, 세포 배양 실험에서 유전자 발현을 비활성화하기 위한 용도.