JP3512792B2 - Ｐｔ含有化合物、その合成方法及びこれらの化合物の応用 - Google Patents

Ｐｔ含有化合物、その合成方法及びこれらの化合物の応用

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Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） この種のPt含有化合物は、リーダイク、ヨット、スト
ルクトによる文献Bonding（ベルリン）、67巻53−62頁
に示されている。
（背景技術） 上記文献には（殊に）蛋白質およびDNA分子に高い親
和性を持つ抗癌化合物、シスPt（NH3）2Cl2が開示され
ており、特にこの化合物は巨大分子中の硫黄族とともに
プリン塩基であるグアニン及びアデニン中のN7窒素原子
に顕著な親和性を持つことが理解されよう。
二つの塩素リガンドの解離により二つの反応部位が出
現し、これらのPt（プラチナ）化合物はこれによって同
一あるいは反対側DNA鎖上の隣接する二つのグアニンま
たはアデニン塩基を架橋することが出来る。シスプラチ
ナを抗癌剤（サイトスタチカム）として応用することは
この機構に基づいている。
この他にも関連するカルボプラチナ化合物が上記の文
献に示されており、これらの化合物もまたシスプラチナ
化合物と同様の機構で殊に蛋白質及びDNA分子に高い親
和性を持つ。
これに対しPt（ジエン）Clの様な一塩化プラチナ化合
物は、DNAに対する親和性を保つことは明白であるが、
架橋を作らないため相補的DNA鎖の塩基対形成を殆んど
妨げず、従って、抗癌作用を持たない。
米国特許第4,711,955号明細書によれば、非放射性核
酸標識技術を利用できれば、現在の医学的−生物学的診
療、特に診断にDNA/RNA技術を応用することが望まれて
いる。現在応用されている既知のDNA及びRNAの非放射性
標識の方法は、一般的に二つのカテゴリーに分けられ
る。
1.酸素的あるいは有機合成的経路による標識；例えばビ
オチン、ブロモデオキシウリジン（BrdU）、ジゴキシゲ
ニン、フルオレセン及び過酸化水素。
2.フォトビオチン、AAF,水銀、ズルフオン族の様に直接
的な化学結合による標識。
これらの標識物の応用は特に標識過程の複雑さ、標識
すべき合成オリゴヌクレオチドの、時にして限定された
長さ、有害化合物の使用そして核酸に結合した時の標識
の安定性に関連した多くの問題点を含んでいる。
（発明の開示） 本発明はその応用時に上記の問題点を効果的に除去出
来るPt含有化合物を提供することを企図するものであ
る。
この目的のため本発明は添付の図に示す構造式（１）
または（２）の化学式｛PtII（ｗ）（ｘ）（ｙ）
（ｚ）｝あるいはPtIV｛（ｕ）（ｖ）（ｗ）（ｘ）
（ｙ）（ｚ）｝を持ち、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、ｚが同一
あるいは異なった且つ互いに結合または非結合のリガン
ドで、少なくとも一は遊離リガンドを表わし、残りのリ
ガンドのうち少なくとも一は検出可能なマーカー基であ
る化合物を提供する。
これらの化合物は本質的に新規であり、一方例えばハ
プテン、フルオレセンまたはローダミンといった直接あ
るいは間接的に検出可能なマーカー基を備え、且つ他方
で適切な遊離基を備える特に好適なDNA標識であり、一
般的な表示PtM（Ptはプラチナを表わし、Ｍはマーカー
基を意味する）で示され独特の性質を持つ。
既述のように、水溶性媒質中においてこれらの化合物
は自然にまた不可逆的にDNAに吸着する。この上このよ
うにして標識されたDNAは、構造式（１）または（２）
を持つ残余化合物とアルコール沈澱により分離すること
が出来る。重要な利点はこのようにして標識されたDNA
がハイブリダイゼーション後直ちに蛍光顕微鏡で、ある
いは周知の免疫組織化学染色法の一によって間接的に検
出され得ることにある。
本発明のプラチナ含有化合物の利点を簡単に要約すれ
ば、 1.酸素若しくは有機合成法を必要としない、直接−殆ん
ど瞬時での−巨大分子の標識 2.簡単な常套の手法による標識分子の一段階精製 3.殆んど全ての周知の（顕微鏡的）手法による直接的あ
るいは間接的な標識分子の検出 にある。
更に有利な点としては、本発明に開示の放射性（14C
または35S）Pt（プラチナ）含有化合物は、特殊な目的
（例えば超高感度なRNAのインサイチュウハイブリダイ
ゼーション）のためにプローブの簡単で迅速な（非酵素
的）標識法として応用され、引き続くオートラジオグラ
フィーによって直接検出され得ることにある。
この化合物によって標識されたプローブの別の重要な
新たな応用は、電子顕微鏡レベルでのインサイチュウハ
イブリダイゼーションであり、本発明に開示の化合物中
のPt（プラチナ）原子の大きな質量が電子密度の直接的
なプローブの特異的な局所上昇をもたらす。
また本発明によれば、遊離リガンドとして（CH3）2S
O、H2OあるいはClが特に適切であることが明かであろ
う。構造式（１）または（２）を持つ化合物中の遊離リ
ガンドとしては前記のリガンドが好ましいが、この他に
以下の基をもちいることが好適であることが判明してい
る。Br-、I-またはF-;SO4 2-、NO3 -、PO4 3-、CO3 2-及び
硝酸エチルの様な同族体；燐酸塩、蓚酸塩、クエン酸塩
及びそれらの誘導体;H2O、ROH及びRO-、（ここでＲは有
機残基であるが）。且つ置換スルフオキシドR1R2SO、こ
こでR1およびR2は互いに同一または異なる有機残基を表
わす。
構造式（１）または（２）を持つ化合物中の検出可能
なマーカー基としては、蛍光基が一般的に選択に値す
る。特にフルオレセンイソチオシアネート（FITC）また
はテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRIT
C）が選択に値する。
（発明を実施するための最良の形態） 本発明に開示の最適な化合物は、｛Pt（エチレンジア
ミン）（Me2SO）（フルオレセン−NH（CS）−NHCH3）｝
であり、以下においては単にPtFという。
本発明に開示の新規な化合物はウイルス診断の目的、
細菌診断の目的、遺伝子異常の検出あるいは遺伝子表現
の検出等に特に適している。
培養不可能あるいは培養が非常に困難なウイルス、血
清学的診断方法が極度に複雑なウイルス、あるいは体外
では非常に不安定なため感染試験に不適切なウイルスが
数多く知られている。
これらのウイルスのいくつかは、病気の急性期、保菌
状態あるいはヒトDNAへのウイルスゲノムの挿入との間
の分別の必要性によって診断がより妨げられる危惧があ
る。一方、これに対しDNAプローブを利用することによ
り進展が図られている。ある種のウイルスは一層重大な
病原作用を持ち、悪性腫瘍の進行と関連している。従っ
てこれらのウイルスおよび患者の臨床的追跡調査との関
連性を正確に把握することは重要な問題である。
原理的にウイルス株または亜型はDNA/RNAプローブに
よって互いに識別されよう。
標識されたDNAあるいはRNAプローブを用いた検出方法
により、上述の問題点が確実に解決され得る。DNAおよ
びRNAウイルスの双方の診断に大きな進展が見られてい
る。これらの方法の利点はウイルスDNA/RNAの存在を直
ちに患者の検体（塗末標本、疱疹試料、鼻あるいは他の
体液、組織片等）から検査できることにある。既にウイ
ルスに起因する死亡率などに関する重要な情報が提供さ
れている。
更に、類似化合物において本質的には周知の方法によ
り合成されることを特徴とする、構造式（１）または
（２）の化学式｛PtII（ｗ）（ｘ）（ｙ）（ｚ）｝ある
いはPtIV｝（ｕ）（ｖ）（ｗ）（ｘ）（ｙ）（ｚ）｝を
持つ本発明に開示のPt含有化合物の製法が本発明に含ま
れる。このときｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、ｚは上記の意味で
用いられる。
本発明による望ましいPt含有化合物は、水中でフルオ
レセン−Ｎ＝Ｃ＝ＳとCH3NH2とを転換し、pH2〜３に酸
性化してフルオレセン−NH（CS）−NHCH3を溶液から沈
澱させ、得られた沈澱物を水に懸濁し、塩基を加えて懸
濁液のpHを10〜11に調整して溶液を鮮黄色にし、この溶
液に｛Pt（エチレンジアミン）（Me2SO）Cl｝の水溶液
を加え、反応混合物を室温かつ暗所で撹拌し、酸性化に
より未反応のフルオレセン−NH（CS）−NHCH3を沈澱さ
せ、濾過し、最終的に濾過物を凍結乾燥して｛Pt（エチ
レンジアミン）Me2SO（フルオレセン−NH（CS）−NHC
H3）｝として得られる。
次いでウイルス、細菌、寄生虫、遺伝子異常、遺伝子
発現の検出に使用され得、本発明に開示のPt含有化合物
を含む診断用キットに本発明を採用することができる。
ここで以下に実施例を参照して本発明の明確化を図
る。
実施例Ｉ 標識目的のためのPtFの合成 まず100mgのフルオレセン−Ｎ＝Ｃ＝Ｓを100mlの水に
溶けた1mlのCH3NH3と反応させ、フルオレセン−NH（C
S）NHCH3を作成する。反応は室温、暗所で連続撹拌しな
がら約１時間行なった。塩酸（１モル／リッター
｛Ｍ｝）でpHを２〜３に酸性化し、得られた反応産物、
フルオレセン−NH（CS）−NHCH3を溶液内で沈澱させ
る。沈殿物を水で洗浄し回収する。
次にこの様にして得られたフルオレセン−NH（CS）NH
CH3100mg（0.237mmol）を95mlの水に溶かした懸濁液
に、NaOH（1M）を加えてpHを10〜11に上げ、鮮黄色を呈
する溶液を得た。この溶液に水5mlを溶かした72mg（0.1
78mmol）の［Pt（エチレンジアミン）（Me2SO）Cl］Cl
あるいは［Pt（エチレンジアミン）Cl2］Cl加え、反応
混合物を室温、暗所で５〜10分間ゆっくり撹拌した。続
いて、HCl（1M）でpH2〜３に酸性化して未反応のフルオ
レセン−NH（CS）NHCH3を沈澱させ、濾過によって除去
した。鮮黄色の濾過物を凍結乾燥し、PtFと略される安
定で乾燥した化合物｛Pt（エチレンジアミン）（Me2S
O）（フルオレセン−NH（CS）NHCH3）｝あるいは｛Pt
（エチレンジアミン）Cl（フルオレセン−NH（CS）NHCH
3）｝を得た。
一般原則として、反応は上記のものを出発材料として
用いて類似の方法で行いうる。ただしこの時、フルオレ
センを例えばローダミン、AMCA、ビオチン、ジゴキシゲ
ニンあるいは他のハプテンに置き換えるが、二重結合し
た硫黄（Ｓ）原子、−SR基,NR'R''基あるいは窒素環
（−Ｎ−）が存在するように変更してもよい。（Ｈもま
た可能である）。但し、R'R''は同一のあるいは互いに
異なった有機残基である。これらのＳ−またはＮ−原子
はプラチナ原子の結合リガンドとして作用する。
実施例II PtFによる核酸標識 乾燥したPtF化合物を蒸留水に1mg/mlの濃度に溶解
し、NaOHでpHを９〜10に上げた。
次に任意の濃度（例えば100μg/ml）のDNA（一本鎖あ
るいは二本鎖）またはRNAを、約pH8の低濃度塩緩衝液
（例えば10mMトリス塩酸）に入れ、出来る限り超音波で
断片化した。
この様にして得た核酸溶液に10倍モル量のPtF溶液を
加え、適当に混合した後室温、暗所で30〜60分間反応混
合物をインキュベートした。
次いで1/10体積容のpH5.6のNaアセテート溶液を反応
混合物に加えて混合し、引き続き２体積溶のエタノール
を加え完全に撹拌し、反応バイアルを−80℃で15分間、
あるいは−20℃で２時間インキュベートした。
その後、10.000gで７分間遠心してPtF標識核酸を沈澱
させた。得られた沈澱物を90％エタノールで洗浄し、Pt
Fで標識された核酸を望みとする濃度に任意の緩衝液
（例えば10mMトリス塩酸、pH7.5、0.3mMEDTA）で溶解し
た。
この様にしてPtF標識された核酸は使用可能な状態に
なった。
PtF標識核酸の使用例： 実施例III ヒト乳頭腫ウイルスは培養できないが、ある種の亜型
（HPV16/18）は殊に頸管および陰茎の悪性腫瘍の発生に
確実に関連している。
このような乳頭腫ウイルスの精製したDNAをPtFで標識
し、例えば頸管の細胞または組織に対してインサイチュ
ウハイブリダイゼーション法を実行することにより、危
険性を持つ型の乳頭腫ウイルスの存在が直接蛍光法ある
いは抗PtF抗体を用いた間接的な免疫組織化学法によっ
て極めて特異的に示されよう。
実施例IV ａ）ヒト乳頭腫ウイルスは培養できないが、ある種の亜
型（HPV16/18）は高い頻度で頸管あるいは陰茎における
悪性腫瘍の進行に確実に関連している。且つ、殊にDNA
ウイルス（ワクシニア、単純ヘルペス（HSV1/2）、エプ
スタインバール、アデノウイルス）あるいはRNAウイル
ス（ロタウイルス、インフルエンザＡ、コツクサキー
Ｂ）の検出のためにプローブが開発された。Ｂ型肝炎ウ
イルスはヒト細胞中では培養できないので、今まではこ
の急性感染の診断がチンパンジーへの接種（！）によっ
てのみ可能であった。
ｂ）帯状疱疹性小疱ウイルスもまた培養が非常に困難で
あり、培養を評価するまでに５〜14日もかかる。その上
このウイルスは不安定で移し変える間に不活化される危
惧がある。従ってネガチブ試験は病原体が存在しないこ
との証明とは一切ならない。且つまたVZV感染は単純ヘ
ルペスウイルス感染と形態的基盤では識別することがで
きない。市販されている抗血清でさえ免疫組織化学検査
では何の回答も与えない。
ｃ）サイトメガロウイルスの培養には非常に労力がかか
る。一週間程度の時間では診断が不可能であり、６週間
でも困難である。CMVは移植患者及び免疫不全の患者（A
IDS）における合併症の重大な原因となる。これらの患
者に対し優れた検査法は欠かすことができない。
上記ａ、ｂ、ｃのケースではウイルス診断例の多くの
可能性の中の僅かな一例しか開示してないが、PtM標識
されたプローブを用いたハイブリダイゼーションの手法
を応用する事により、これらのケースでの診断が大幅に
簡略化され、また迅速化されよう。
実施例Ｖ 細菌診断 DNAプローブを用いた細菌核酸の検出もまた近年可能
となったことは明らかであろう。これにより細菌毒素の
遺伝子が明らかになる。しかしながらこれらの遺伝子が
発現しているか否かを常に識別することは不可能であ
る。染色体およびプラスミドにコードされた病原性因子
（殊にリステリアモノサイトジーン、ガス菌腸毒素、コ
レラ腸毒素、大腸菌腸毒素そしてインバシビティー、シ
ゲラ及びエルシニアエンテロコルチチカ、エンテロイン
バシビチィー）の迅速な検出は、食中毒及び食品産業で
の品質管理（最終産物管理）の診断において重要であ
る。
胃炎患者の胃バイオプシーにPtMを用いてDNAインシチ
ュウハイブリダイゼーションを行ない、ヘリコバクター
（以前はカンピロバクター）ピロリを検出することは十
分に可能である。
クラミジアトラコーマティスDNAもまた例えばサンド
ウイッチ検定あるいはインサイチュウハイブリダイゼー
ションの手法により検出できよう。
実施例VI 寄生虫感染の診断 世界中で二百万人の人々がマラリヤで死んでいる。原
理的には、時をえた正確な診断によってこれは防ぐ事が
できる。現在の（常例の）顕微鏡的手法は、第三世界の
国々には殆んど全てが複雑すぎる。西洋においても困難
な顕微鏡的手法は、PtMプローブを用いた常例の試料に
対するインサイチュウハイブリダイゼーションに置換さ
れよう。これによりマラリヤ種の鑑別診断が相当に簡素
化されまた最小限の訓練を受けた人によって行うことが
できた。第三世界ではPtMに基づいてディップスティッ
ク試験が迅速で簡単な診断のための適当な方法となる。
シストーマ、トリパノゾーマ、トキソプラズマ等によ
って引き起こされる感染症に対しても同様な例が有効で
ある。
実施例VII 遺伝子異常の検出 PtMプローブを用いたハイブリダイゼーションの手法
は、例えば羊水穿刺物や絨毛膜バイオプシーによる先天
性異常の胎仔期診断の可能性を提供する。HLA関連症診
断のためのHLA型の検出の増進と供に、異常（例えば悪
性腫瘍）の出生後の検出もまた可能である。
制限フラグメント多様性：全てのヒトゲノムは、制限
酵素で処理すると断片化され莫大な数の特異的なフラグ
メント、制限フラグメントになる。仮に突然変異によっ
て制限酵素が作用する部位の塩基配列が変化すれば、こ
れは異常なフラグメントの発達をもたらすものと考えら
れる。これらのフラグメントはDNAブロッティング法を
用いた適切な（PtM標識）プローブによって検出されよ
う（例えば鎌状赤血球貧血、デユシエン筋ジストロフィ
ー、嚢胞性線維症、ハンチングトン舞踏病において）。
DNA異常に属する塩基配列が既知であれば（β−地中
海貧血、抗トロンビン欠乏症、成長ホルモン欠乏症、Ｂ
型血友病、PKU等）、合成オリゴヌクレオチドプローブ
を用いた異常DNAの迅速な検出が行われよう。
ヒトカリオサイト中の転座、欠損、転位及び重複の様
な染色体異常の検出は、インサイチュウハイブリダイゼ
ーション及びこれに引き続く直接PtF蛍光法あるいは制
限フラグメントのサザンブロッティングによって行われ
よう。
実施例VIII 遺伝子発現の検出 免疫組織化学の手法を用いた細胞内抗原の存在の可視
化によっては、その時点で関連した遺伝子が発現してい
ることは証明されない。またその可視化された産物が細
胞内に起因するのか細胞外に起因するものであるかも示
されない。細胞内でのmRNAの検出が遺伝子発現の直接の
証拠を提供する。この情報は、細胞の機能性に関するデ
ーターを与えるばかりでなく、診断の手助けともなろ
う。
非放射性標識を用いたこのRNA ISH（RISH）の手法を
実施するための現在の問題点を鑑みると、特に十分に浸
透性のある免疫組織化学的検出システムを処置する必要
性から問題が派生しているので、まさに直接のPtM標識
の応用はそのような診断を実行する上で適切な方法であ
る。このことはPtMフルオレシンの応用については未解
決のままである。
遺伝性疾患の指標として異常mRNAを放射性cDNAプロー
ブを用いたブロッティングによって検出することは、多
くの先天性異常に対してすでに可能であることが証明さ
れている。その迅速さと応用性は、非放射性（あるいは
放射性）PtM標識により顕著に増大するであろう。
PtMプローブを用いたRISHあるいはブロッティング
は、特定の遺伝子転写産物（例えば甲状腺転移における
カルシトニンmRNA、悪性腫瘍におけるオンコジーンの発
現）あるいは胚線条（ヘテロ接合体の欠損）や遺伝子再
配列の欠如（リンパ腫）を検出することにより、癌の診
断に応用されよう。
フロントページの続き (72)発明者 フアン デン ベルグ，フランシスカス ミシエル オランダ国 ホーフツドルプ ヨツトベ ー 2134，クラテルボス 75 (72)発明者 レンペルス，エドヴイン レオ マリオ オランダ国 ユリアナドルプ ゲーベー 1788，フオゲルツアンド 2231 (72)発明者 ブロエミンク，マリエケ ヨハンナ オランダ国 オエグストゲツスト エル エム 2341，ホフベロエケルラーン 31 (72)発明者 リーデーク，ヤン オランダ国 レイデン ツエーデー 2334，アントニエ デユイツクラーン ４ (56)参考文献 米国特許4490543（ＵＳ，Ａ) 欧州特許出願公開186363（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07F 15/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の構造式（１）または（２）で表わさ
    れ、化学式｛Pt（II）（ｗ）（ｘ）（ｙ）（ｚ）｝また
    は｛Pt（IV）（ｕ）（ｖ）（ｗ）（ｘ）（ｙ）（ｚ）｝
    を持つ、ハイブリダイゼーションに用いる核酸プローブ
    標識用のPt含有化合物であり、 【化１】 式中のｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、ｚはそれぞれ同一または異
    なった、結合または非結合のリガンドを表わし、その中
    の一つはCl-、（CH3）2SO、H2O、Br-、I-、F-、SO4 2-、
    NO3 -、PO4 3-、CO3 2-、硝酸エチル、燐酸塩、蓚酸塩、ク
    エン酸塩、および置換スルフオキシドでなる群から選ば
    れた遊離リガンドであり、残りのリガンドの中の少なく
    とも一つは蛍光基であって、この蛍光基がフルオレセン
    またはテトラメチルローダミンであるPt含有化合物。
  2. 【請求項２】｛Pt（エチレンジアミン）（Me2SO）（フ
    ルオレセン−NH（CS）−NHCH3）｝でなる請求項１に記
    載の化合物。
  3. 【請求項３】水中でフルオレセン−Ｎ＝Ｃ＝ＳをCH3NH2
    と共に転換し、pHを２〜３の範囲に酸性化して溶液から
    フルオレセン−NH（CS）−NHCH3を沈澱させ、得られた
    沈澱物を水に懸濁し塩基を加えて懸濁液のpH値を10〜11
    に調整して鮮黄色の溶液を得、この溶液にPt（エチレン
    ジアミン）（Me2SO）Clの水溶液を加えて反応混合物を
    室温の暗所で撹拌し、未反応のフルオレセン−NH（CS）
    −NHCH3を酸性化することによって沈澱させ、濾過し、
    最後に濾過物を凍結乾燥して｛Pt（エチレンジアミン）
    （Me2SO）（フルオレセン−NH（CS）−NHCH3）｝を産出
    するPt含有化合物の製法。
  4. 【請求項４】検出する固有序列を補足する核酸序列でな
    るハイブリダイゼーションによる固有序列検出用の核酸
    プローブ法であって、核酸プローブを請求項１ないし５
    の少なくとも一に記載のPt含有化合物によって標識する
    核酸プローブ法。
  5. 【請求項５】Pt含有化合物を｛Pt（エチレンジアミン）
    （Me2SO）（フルオレセン−NH（CS）−NHCH3）｝とする
    請求項４の核酸プローブ法。
  6. 【請求項６】ウイルス、細菌、寄生虫、遺伝偏差あるい
    は遺伝子表現のために用いる請求項４または５に記載の
    核酸プローブ法。
  7. 【請求項７】請求項１または２に記載のPt含有化合物を
    含むウイルス、細菌、寄生虫感染、遺伝学的偏差または
    遺伝子表現の検出用診断キット。
  8. 【請求項８】請求項４または５に記載の核酸プローブ法
    を含むウイルス、細菌、寄生虫感染、遺伝学的偏差また
    は遺伝子表現の検出用診断キット。
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