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[technisches Gebiet]
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Sonden, die hergestellt werden, indem
von ansteckende Krankheiten verursachenden Bakterien Gebrauch gemacht
wird, welche zum Nachweisen und Identifizieren der verursachenden
Bakterien nützlich
sind.
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[Stand der Technik]
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In
der Pathologie wird eine Infektion als Invasion und Errichtung einer
Basis zum Wachstum in einem Organismus durch einen pathogenen Organismus
(nachstehend als „Bakterien" bezeichnet) definiert,
dann hängt
der Ausbruch der Krankheit von der Wechselbeziehung zwischen der
Resistenz des Wirtes und der Virulenz der Bakterien ab.
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Bei
den ansteckenden Krankheiten ist die Verbesserung der Behandlungsmethoden
von Bakteriämie als
wichtige Kernfrage erhoben worden. Das heißt, Bakteriämie ist keine Krankheit, die
durch ein bestimmtes Bakterium verursacht wird, sondern durch Auftreten
und Innewohnen der verschiedenen Bakterien im Blut verursacht wird,
dann wird der Beginn davon klinisch vermutet, wenn Fieber von etwa
40°C zwei
oder mehr Tage lang anhält.
Wenn ein Patient ein Baby ist oder an Krebs im Endstadium mit geschwächter Abwehr
leidet, kann der Patient innerhalb von ein oder zwei Tagen sterben,
weshalb die Bakteriämie
eine schwerwiegende und dringende Krankheit ist, und die Verbesserung
der Behandlungsmethoden davon erwartet worden ist.
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Bei
einer ansteckenden Krankheit arbeiten Phagozyten, einschließlich Neutrophile,
Monozyten und Makrophagen, hauptsächlich an der Immunabwehr des
Körpers.
Das Auftreten von Bakterien im Blut wird als Invasion von überwiegenden
Bakterien, welche aus dem Gewebe des Phagozyten hervorgegangen sind,
angesehen.
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Bakteriämie ist
ein Zustand, in welchem die Bakterien im Blut aufgetreten sind,
und eine große
Menge an Antibiotikum verabreicht wird, um sie zu behandeln, wobei
die verursachenden Bakterien gegen das Antibiotikum empfindlich
sind. Weil Antibiotika allgemein die Funktionen der inneren Organe,
wie der Leber, senken, ist es erforderlich, der Verringerung einer
Verabreichung eines unwirksamen Antibiotikums an den Patienten in einem
schwerwiegenden Zustand Beachtung zu schenken.
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Wenn
die Bakteriämie
als ein Fall definiert ist, in welchem die Phagozytose von Zellen
die Virulenz von Bakterien nicht überwinden kann, dann breiten
sich die Bakterien durch das Blut im Körper aus, Bakteriämie mit
schwerwiegenden Symptomen, die Toxinen zuzuschreiben sind, die durch
die Bakterien produziert werden, wird als Sepsis bezeichnet. Der
Nachweis von Sepsis, mit anderen Worten die Festsetzung der Diagnose
erfordert ein Überprüfen der
folgenden Punkte: 1) klinische Symptome, 2) Kultivieren einer Probe,
3) Gram-Färbung
der Bakterien, die in den Proben enthalten sind, und 4) Schockzustand,
dann wird bei Vervollständigen der Überprüfung dieser
Punkte das Behandlungsverfahren bestimmt. Dementsprechend ist die
schnelle und zuverlässige
Identifizierung der Bakterien in der Klinik abgewartet worden.
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Im
vorliegenden Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren der Bakterien
in einer Bakteriämieprobe
ist es ein gewöhnliches
Verfahren, eine Probe in selektivem Medium zu identifizieren, welches
ein positives Signal in einem routinemäßigen Verfahren in einer Kulturflasche
hat. Jedoch ist es ziemlich schwierig, Bakterien aus dieser Blutprobe
erfolgreich zu züchten,
dann werden, wenn eine hohe Dosis von Antibiotika verabreicht wird,
wenn Verdacht auf Bakteriämie
besteht, die Bakterien im Blut in vielen Fällen nicht gezüchtet und wachsen
nicht, weshalb die Rate positiver Fälle in der Kulturflasche extrem
niedrig wird.
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Obwohl
verfügbare
Subroutineverfahren die instrumentelle Analyse von Bestandteilen
und metabolischen Produkten von Bakterien (Yoshimi Benno, „Quick
identification of bacteria with gas chromatography", Rinsho Kensa, Bd.
29, Nr. 12, November 1985, Igaku Shoin Hrsg.) einschließen, sind
ein Verfahren, das einen spezifischen Antikörper verwendet (vorläufige Japanische
Patentschrift Nr. 60-224068), und ein Hybridisierungsverfahren,
das die Spezifität
von DNA verwendet (vorläufige
Japanische Patentschrift Nr. 61-502376), von denen jedes erfordert,
die Bakterien zu trennen und sie zu züchten, entwickelt worden. Auf
der anderen Seite gibt es, weil ein Verfahren eingeführt wurde,
das auf der Funktion der Phagozyten bei ansteckenden Krankheiten
beruht, ein Verfahren unter einem optischen Mikroskop zum Überprüfen eines
gefärbten
Abstrichs von Buffy coat, worin Leukozyten der Blutprobe konzentriert
sind. Allgemein gesagt, wurde, obwohl die Rate des Nachweises von
Bakterien in Buffy coat-Proben von erwachsenen Bakteriämiepatienten
höchstens
30% beträgt,
welches dem in Ohrläppchenproben ähnlich ist,
berichtet, dass Bakterien in sieben Fällen von zehn Fällen (70%)
bei neugeborenen Patienten nachgewiesen wurden, weshalb eine Information
hinsichtlich des Vorhandenseins von Bakterien im peripheren Blut,
die durch Mikroskopuntersuchung eines Abstrichs zu erhalten ist,
wichtig für
die Behandlung ist.
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Weil
die herkömmlichen
Verfahren die Vorbehandlung notwendig machen, welche insgesamt mindestens
drei bis vier Tage erfordert, wobei ein oder zwei Tage zur selektiven
Isolierung von Bakterien aus einer Probe, einen Tag zur Kultivierung
und einen oder mehrere Tage zur Fixierung enthalten sind, und das
Züchten davon
bei der Ausübung
fortgesetzt wird, bis die Bakterien wachsen, erfordert das Züchten eine
Woche oder mehr sogar für
C.B.-positive Fälle,
weshalb dieses ein Faktor bei der hohen Sterblichkeit von C.B.-positiven Patienten
war, die mit den herkömmlichen
Verfahren behandelt wurden. Zum Beispiel betrug gemäß eines
Berichts, der in „The
Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases", Bd. 58, Nr. 2,
S. 122, 1984, veröffentlicht
wurde, obwohl die Rate positiver Blutkulturen 28,6% (163 Fälle/569
Fällen)
betrug, die Sterblichkeit mindestens 84,6% (138 Fälle/163
Fällen).
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Ferner
kann es unmöglich
sein, bei der Züchtung
eine Kontamination durch indigene Bakterien zu erkennen. Zum Beispiel
hält sich
Staphylococcus epidermidis, welches eines der Staphylokokken ist
und das verursachende Bakterium von Bakteriämie ist, auf der Haut normaler
Personen auf, dann gibt es ein Kontaminationsrisiko einer Probe
mit diesem Bakterium, wenn eine Nadel in die Haut eingeführt wird.
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Als
wichtige Tatsache unter solchen vorstehenden Umständen ist,
weil viele Bakterien in einer zu züchtenden Probe in die Phagozyten
eingebracht worden sind und tot oder stationär immobilisiert sind, die Anzahl an
züchtbaren
Bakterien selbst unter geeigneten Züchtungsbedingungen klein, wodurch
die tatsächliche Nachweisrate
von Bakterien durch Züchten
einer Probe höchstens
etwa 10% beträgt.
Mit anderen Worten, zu diesem Zeitpunkt können 90% des überprüften Bluts,
welches weitere ein oder mehrere Tage gezüchtet worden ist, des Patienten,
bei dem klinisch der Verdacht besteht, dass er an einer Bakteriämie leidet,
das Vorhandensein von Bakterien nicht erklären.
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In
Anbetracht der vorstehend beschriebenen Sachlage hängt die
gegenwärtige
Praxis von einer zu beginnenden Behandlung ab, wenn klinisch der
Verdacht auf Bakteriämie
besteht, ohne die Nachweisergebnisse abzuwarten, das heißt ein empirischer
Versuch (Trial and Error-Verfahren), bei welchem zuerst ein Breitband-Antibiotikum
verabreicht wird, und wenn das Antibiotikum nach einem oder zwei
Tagen nicht wirksam ist, ein anderes Antibiotikum versucht wird.
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Gemäß dem Verfahren
zum Färben
von Bakterien in der Probe werden auch die Bestandteile des lebenden
Körpers
zusammen mit den Bakterien gefärbt,
weshalb Erfahrung erforderlich ist, um die Bakterien gemäß ihres
Bildes durch das Mikroskop schnell zu identifizieren, dann kann
es Fälle
geben, die als Bakteriämie kaum
diagnostiziert werden können.
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Obwohl
die Bakteriämie
eine Krankheit ist, bei welcher eine schnelle und genaue Diagnose
erforderlich ist, kann das herkömmliche
Diagnoseverfahren nicht auf derartige Erfordernisse reagieren.
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[Offenbarung der Erfindung]
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Die
vorliegende Erfindung wurde hinsichtlich der Probleme auf dem Fachgebiet
eingeführt
und betrifft eine Sonde wie in den Ansprüchen definiert.
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Durch
die erfindungsgemäße Sonde
werden zum Beispiel ansteckende Krankheiten verursachende Bakterien
ohne Züchtung/Vermehrung
der Bakterien schnell und genau durch Nachweis von DNA, die in den verursachenden
Bakterien enthalten ist, die gespalten und mit dem Phagozyten nach
und nach eingebracht wird, nachgewiesen. Dann können, wenn Primer entworfen
werden, die sich auf die Information über die Basensequenz dieser
Sonden beziehen, die verursachenden Bakterien ohne Hybridisierung
durch Amplifikation der DNA mit PCR-Technik identifiziert werden.
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Wenn
eine nicht-radioaktive Sonde, zum Beispiel eine biotinylierte Sonde,
zur Hybridisierung verwendet wird, weil eine derartige Sonde mit
einem optischen Mikroskop in einem herkömmlichen Labor ohne Einrichtungen
zum Umgang mit Radioisotopen nachgewiesen werden kann, wäre das Nachweisverfahren
schnell und einfach.
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[Kurze Beschreibung der
Zeichnungen]
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1 ist
eine Restriktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments einer Sonde
zum Nachweisen von Staphylococcus aureus.
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2 ist
eine Restriktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments einer Sonde
zum Nachweisen von Staphylococcus epidermidis.
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3 ist
eine Restriktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments einer Sonde
zum Nachweisen von Enterococcus faecalis.
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4 ist
eine Restriktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments einer Sonde
zum Nachweisen von Pseudomonas aeruginosa.
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5 ist
eine Restriktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments einer Sonde
zum Nachweisen von Escherichia coli.
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6 ist
eine Restriktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments einer Sonde
zum Nachweisen von Enterobacter cloacae und Klebsiella pneumonia.
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[Beste Art und Weise zum
Durchführen
der Erfindung]
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Beispiele
von Sonden, die aus Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae beziehungsweise Enterobacter cloacae (J. Infection,
Bd. 26, S. 159–170
(1993), J. Clin. Microbiol., Bd. 31, S. 552–557 (1993)) hergestellt werden,
die als verhältnismäßig weitverbreitete
ansteckende Krankheiten verursachende Bakterien, insbesondere von
Bakteriämie,
aufgeführt
werden, wurden wie folgt beschrieben.
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Beispiel 1: Herstellung
einer DNA-Sonde aus ansteckende Krankheiten verursachenden Bakterien
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(1) Isolierung von ansteckende
Krankheiten verursachenden Bakterien
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Das
Blut, das vom Patienten gesammelt wurde, der an zielgerichteten
Krankheiten leidet, wurde für das
Blutkulturverfahren (BBC-System: Blutkultursystem (Blood Culture
System); Roche) und für
einen herkömmlichen
Identifizierungskit (Api 20, Apistaf, Apistlep 20: Bio-Meryu) verwendet,
und das jeweilige verursachende Bakterium wurde gemäß dem Handbuch
des Kits isoliert und identifiziert.
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(2) Extraktion und Reinigung
von genomischer DNA aus einem isolierten Stamm
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Stämme, die
im vorstehenden (1) isoliert wurden, wurden über Nacht in BHI- (Brain Heart
Infusion-) Medium gezüchtet,
die gezüchteten
Bakterien gesammelt, dazu wurde Achromopeptidase anstelle von Lysozym
zugegeben, dann wurde genomische DNA gemäß dem Saito-Miura-Verfahren
(„Preparation
of Transforming Deoxyribonucleic Acid by Phenol Treatment", Biochem. Biophys.
Acta. Bd. 72, S. 619–629)
extrahiert, und die extrahierte DNA wurde mit dem Restriktionsenzym
HindIII gespalten, und wurde zufällig
in den Vektor pBR322 kloniert.
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(3) Auswahl der Sonde
mit Spezifität
zu Arten von ursprünglichen
Bakterien
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Escherichia
coli, das jeden Klon enthielt, der gemäß dem Handbuch von Maniatis
(T. Maniatis, et al., „Molecular
Cloning (A Laboratory Manual)",
Cold Spring Harbour Laboratory (1982)) hergestellt wurde, wurde mit
Kulturen im kleinen Maßstab
gezüchtet,
und es wurden Plasmide erhalten, die jeden Klon enthielten.
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Diese
Plasmide wurden mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten, wodurch
mit 1 % Agarose-Gel-Elektrophorese (Myupid: Cosmo-Bio) Insertionen
vollständig
von den Plasmiden getrennt wurden, dann mit Southern-Transferverfahren
(Paul Biodine A: Paul) auf Nylonmembran übertragen wurden und mit einer
Sonde kreuzhybridisiert wurden, die durch 32P-dCTP-Markierung
(Amersham) durch Nick-Translation von Chromosomen-DNA von jedem
der vorstehend aufgeführten
Bakterienarten hergestellt wurde.
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Bei
dieser Hybridisierung wurde eine Sonde, welche mit keiner Insertion
kreuzreagierte, außer
mit einer Sonde, die aus der ursprünglichen Spezies davon hergestellt
wurde, als Sonde ausgewählt,
die ein DNA-Fragment enthielt, welches zu ansteckende Krankheiten
verursachenden Bakterien spezifisch ist.
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Hinsichtlich
der Sonden, die aus Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter
cloacae, weil diese Bakterien zur selben Gruppe gehören (Darmbakterien;
Gram-negativer aerober Bacillus), als verursachende Bakterien der
Bakteriämie
(siehe J. Infection, Bd. 26, S. 159–170 (1993), J. Clin. Microbiol.,
Bd. 31., S. 552–557
(1993), vorstehend) hergestellt wurden und die Kreuzreaktion unter
den drei Bakterien in den vorhergehenden Reihenexperimenten auf
Spezifität
bestätigt
worden war, wurde jede Sonde, die aus einer der drei Bakterien hergestellt
wurde, als Sonde zum Nachweisen aller dieser Bakterien als relevante
Bakterien bezeichnet.
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Die
Sonden (Bezeichnung), die durch die vorhergehenden Verfahren aus
jeder Spezies ausgewählt wurden,
sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt.
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Restriktionsenzymkarten
jeder Sonde wurden jeweils in den 1–6 auch
veranschaulicht.
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Beispiel 2: Bewertung
auf Speziesspezifität
jeder DNA-Sonde
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Die
Reaktivität
zwischen jeder Sonde und DNA von ansteckende Krankheiten verursachenden
Bakterien wurde gemäß dem folgenden
Verfahren untersucht. Zuallererst wurden als Stämme des Gegenstands der Untersuchung
klinische Isolate von Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae und Enterobacter cloacae gemäß dem Verfahren
von vorstehendem Beispiel 1 (1) isoliert.
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Dann
wurde DNA von jedem klinischen Isolat gemäß dem Verfahren von Beispiel
1 (2) extrahiert, und Proben für
Dot-Blot-Hybridisierung wurden erhalten, indem eine bestimmte Menge
(z.B. 5 μl)
DNA auf Nylonfilter getüpfelt
wurde und die im Alkalischen denaturierten Isolate ausgewählt wurden.
Die Hybridisierung an DNA-Sonden, die aus jedem unterzogenen Bakterium
hergestellt und mit Biotin (Bio-dUTP; BRL) markiert wurden, wurde über Nacht
gemäß dem Handbuch
von Maniatis, vorstehend, unter der Bedingung von 45% Formamid,
5 × SSC,
42°C durchgeführt.
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Die
Proben, die durch Hybridisierung über Nacht erhalten wurden,
wurden 20 Minuten lang bei 55°C zweimal
mit 0,1 × SSC,
0,1% SDS gewaschen, dann wurde die Farbreaktion mit Streptavidin-ALP-Konjugaten (BRL)
nachgewiesen und die Hybridisierung bewertet.
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Die
experimentellen Ergebnisse an Reaktivität zwischen jeder Sonde und
DNA von jedem klinischen Isolat werden in der folgenden Tabelle
2 (i)–(vi)
veranschaulicht. Hinsichtlich einer Bezeichnung in den Tabellen,
bezieht sich die Bezeichnung von „+" auf das Vorhandensein eines Signals
an Hybridisierung, während sich
das von „–" auf das Fehlen eines
Signals an Hybridisierung bezieht.
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Wie
aus der vorstehenden Tabelle 2 ersichtlich ist, hat jede Sonde nur
mit der DNA reagiert, die aus dem Herkunftsstamm (oder verwandten
Stamm davon) erhalten wurde, und mit keiner DNA reagiert (hybridisiert),
die aus anderen Stämmen
als den Stämmen
aus dem Herkunftsstamm erhalten wurde, deshalb ist ihre Spezifität bestätigt worden.
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Beispiel 3: Analyse der
Basensequenz
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Die
Basensequenz der DNA-Sonden (insgesamt 23 Sonden), deren Spezifität zur Herkunftsspezies
in den Beispielen 1 und 2 bestätigt
worden ist, wurde gemäß dem folgenden
Verfahren sequenziert.
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(1) Präparation von Plasmid-DNA
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Escherichia
coli K-12, JM109 Transformanten, wobei die subklonierten Insertionsfragmente
(die sequenziert werden sollen) in pGem-3Z (Promega) enthalten sind,
wurden in 5 ml Luria-Bactani-Medium
(Bactotrypton, 10 g/l; Bactohefeextrakt, 5 g/l; NaCl, 10 g/l; pH-Wert
mit 5 N NaOH auf 7,0 eingestellt) geimpft und über Nacht gezüchtet.
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Die
Kulturflüssigkeit
wurde zentrifugiert (5.000 U/min, 5 min) und die Bakterien gesammelt.
100 μl Lösung aus
50 mM Glukose/50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/10 mM EDTA, die 2,5 mg/ml
Lysozym (Sigma) enthielt, wurde zum Ausfällen zugegeben und fünf Minuten
lang bei Raumtemperatur stehengelassen. 0,2 M NaOH-Lösung, die
1 % Natriumdodecylsulfat (Sigma) enthielt, wurde zu der so erhaltenen
Suspension zugegeben und damit gemischt. 150 μl 5 M Kaliumacetatlösung (pH
4,8) wurde ferner dazugegeben und damit gemischt, dann 15 Minuten
lang auf Eis gestellt.
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Der
durch Zentrifugation (15.000 U/min, 15 min) erhaltene Überstand
wurde mit Phenol/CHCl3 behandelt, und dazu
wurde das zweifache Volumen Ethanol gegeben, dann wurde ein Niederschlag
durch Zentrifugation (12.000 U/min, 5 min) erhalten. Dieser Niederschlag
wurde in 100 μl
Lösung
aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/0,1 mM EDTA gelöst, und 10 mg/ml RNase A-Lösung (Sigma)
wurde dazugegeben, dann wurde es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur
stehengelassen.
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300 μl 0,1 M Natriumacetatlösung (pH-Wert
4,8) wurde zu dieser Präparation
zugegeben und mit Phenol/CHCl3 behandelt,
dann wurde ein Niederschlag durch Zugeben von Ethanol zum Überstand
erhalten. Die DNA-Proben wurden erzeugt, indem dieser Niederschlag
getrocknet und in 10 μl
destilliertem Wasser gelöst wurde.
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(2) Vorbehandlung zum
Sequenzieren
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Die
Vorbehandlung zum Sequenzieren wurde mit einem AutoReadTM Sequencing
Kit (Pharmacia) durchgeführt.
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Die
Konzentration der DNA, um eine Matrize zu werden, wurde auf 5–10 μg in 32 μl eingestellt.
32 μl Matrizen-DNA
wurde in ein 1,5-ml-Miniröhrchen
(Eppendorf) überführt und
dazu 8 μl
2 M NaOH-Lösung
gegeben, dann leicht damit gemischt. Nach sofortiger Zentrifugation
wurde es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen.
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7 μl 3M Natriumacetat
(pH 4,8) und 4 μl
destilliertes Wasser, dann 120 μl
Ethanol wurden dazugegeben, dann damit gemischt, und 15 Minuten
lang auf Trockeneis stehengelassen. DNA, welche durch 15 Minuten
lange Zentrifugation gefällt
worden ist, wurde gesammelt, und der Überstand wurde vorsichtig entfernt.
Der so erhaltene Niederschlag wurde mit 70% Ethanol gewaschen und
10 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde der Überstand wieder vorsichtig
entfernt und der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet.
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Der
Niederschlag wurde in 10 μl
destilliertem Wasser gelöst,
dann wurden 2 μl
Fluoreszenzprimer (0,42 A260 Unit/10 ml,
4-6 pmol) {M13 Universalprimer; 5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT]-3' (1,6 pmol/μl; 0,42 A260 Unit/ml); M13-Gegenstrangprimer, 5'-Fluorescein-d[CAGGAAACAG CTATGAC]-3' (2,1 pmol/μl; 0,42 A260 Unit/ml)} und 2 μl Kochsalzlösung zum Anlagern dazugegeben
und leicht gemischt.
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Nach
sofortiger Zentrifugation wurden sie bei 65°C 5 Minuten lang wärmebehandelt
und schnell in eine 37°C
warme Umgebung überführt, und
die Temperatur wurde 10 Minuten lang gehalten. Nach dem Halten der Temperatur
wurde sie 10 Minuten lang oder länger
bei Raumtemperatur stehengelassen und sofort zentrifugiert. Dann
wurden Proben hergestellt, indem dazu 1 μl einer Verlängerungskochsalzlösung und
3 μl Dimethylsulfoxid
gegeben wurden.
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Vier
Miniröhrchen
sind mit einer der Markierungen „A", „C", „G" und „T" identifiziert worden,
und gemäß der Markierung
wurden 2,5 μl
A-Mischung (gelöstes
ddATP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP),
C-Mischung (gelöstes
ddCTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP),
G-Mischung (gelöstes ddGTP
mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP) oder T-Mischung
(gelöstes
ddTTP mit dATP, dCTP, c7dGTP und dTTP) wurden
in jeweils ein identifiziertes Röhrchen
gegossen. Jede Lösung
wurde in gefrorenem Zustand aufbewahrt, und die Lösung wurde zur
Verwendung eine Minute lang oder länger auf 37°C erwärmt.
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2 μl verdünnte T7DNA-Polymerase
(Pharmacia; 6–8
Units/2 μl)
wurde zur DNA-Probe zugegeben und durch leichtes Pipettieren oder
Mischen vollständig
gemischt. Sofort nach dem Beenden des Mischens wurde diese gemischte
Lösung
in jeweils 4,5 μl
Vierarten-Lösung gegossen,
welche bei der bestimmten Temperatur gehalten wurde. Frische Spitzen
wurden zum Zeitpunkt des Gießens
verwendet.
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Die
Lösung
ist fünf
Minuten lang bei 37°C
gehalten worden, dann wurden 5 μl
Stopplösung
in jede Reaktionslösung
gegossen. Frische Spitzen wurden zum Gießen verwendet. Sofort nach
2–3 Minuten
langem Halten der Lösung
bei 90°C
wurde sie auf Eis gekühlt.
4-6 μl/Spur
der Lösung
wurden auf die Elektrophorese aufgetragen.
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(3) Sequenzierung der
Basensequenz
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Sequenzieren
jeder Basensequenz der Sonden, die in den Beispielen 1 und 2 offenbart
sind, mit der Spezifität
gegen Staphylococcus aureus oder Staphylococcus epidermidis wurden
mit dem A.L.F.-DNA-Sequenziersystem (Pharmacia) unter einer Elektrophoresebedingung
von 45°C
6 Stunden lang durchgeführt.
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Dann
wurden die Basensequenzen der Sonden (SEQ ID NR.), die aus jedem
ansteckende Krankheiten verursachenden Bakterium hergestellt wurden
und in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt sind, in der hier angefügten Sequenzliste
offenbart.
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Dadurch
ist genetische Information hinsichtlich der spezifischen Stelle
von jedem ansteckende Krankheiten verursachenden Bakterium (oder
verwandten Bakterien davon) geklärt
worden.
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Gewerbliche Anwendungsmöglichkeit
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Gemäß der Sonden,
die in den angehängten
Ansprüchen
definiert sind, können
zum Beispiel ansteckende Krankheiten verursachende Bakterien, welche
in den Phagozyten eingebracht worden sind, ohne Vermehrung der Bakterien
direkt nachgewiesen werden und schnell und genau identifiziert werden.
Das heißt, entsprechend
der Diagnose kann die Identifizierung der Bakterien unter Verwendung
der Sonde, die in den angehängten
Ansprüchen
definiert ist, mit einer einzelnen Probe verwirklicht werden, dann
kann die für
die Diagnose erforderliche Zeit auf etwa einen bis zwei Tage verringert
werden, während
das herkömmliche
Verfahren (mit niedriger Nachweisrate) 3–4 Tage erforderte, und die
Nachweisrate bemerkenswert verbessert werden. Deshalb kann diese
Erfindung objektive Faktoren zur Behandlung der Bakteriämie bereitstellen,
dann die wirksame Behandlung im frühen Stadium der ansteckenden
Krankheiten verwirklichen und es wird erwartet, dass sie die Sterblichkeit
verringern kann.
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Dann
können
diese Sonden künstlich
hergestellt werden, indem die Basensequenzen der Sonden geklärt werden,
welche spezifisch mit primären
Bakterien von ansteckenden Krankheiten reagieren. Ferner kann ein
Teil der Information über
die analysierten Basensequenzen zum schnellen Diagnostizieren der
verursachenden Bakterien verwendet werden, indem DNA von ansteckende
Krankheiten verursachenden Bakterien in der klinischen Probe mit
PCR-Verfahren und Primern, die durch Gebrauchmachen von der Information
hergestellt werden, amplifiziert wird.
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Ferner
kann durch Vergleichen der Basensequenzen der genomischen DNA in
der klinischen Probe mit der der vorliegenden Erfindung eine schnelle
Identifizierung der Spezies der ansteckende Krankheiten verursachenden
Bakterien verwirklicht werden.
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Wie
vorstehend angegeben, beschreiben die angehängten Ansprüche eine wünschenswerte Sonde zur Diagnose
ansteckender Krankheiten, erwartet dann Nützlichkeiten als Faktor, um
Primer für
die PCR und eine Standardsequenz für einen Vergleich mit genomischer
DNA in der klinischen Probe herzustellen, und erwartet ferner eine
Wirkung, um wertvolle Hinweise zum Herstellen und Entwickeln der
anderen Sonden bereitzustellen, welche spezifisch mit ansteckende
Krankheiten verursachenden Bakterien reagieren.
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Dann
sollten, weil die Basensequenzen, die in der vorliegenden Anmeldung
offenbart sind, durch zufälliges
Klonieren der genomischen DNA von klinischen Isolaten erhalten wurden,
Nützlichkeiten
der hier beschriebenen Basensequenzen auf die Komplementärstränge davon
erweitert werden.
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Ferner
würde,
obwohl angenommen wird, dass die DNA, die aus Wildtypstämmen erhalten
wird, den mutierten Teil enthält,
aus der vorstehenden Offenbarung der Beispiele ersichtlich, dass
der mutierte DNA-Teil die Nützlichkeiten,
die aus der vorliegenden Erfindung abzuleiten sind, die die Spezifität der erfindungsgemäßen Sonden
bei der Hybridisierung zur Diagnose von ansteckenden Krankheiten
umfassen, und einen Gebrauch von der Information über die
Basensequenzen, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart sind,
um die Primer für
das PCR-Verfahren zu entwerfen, um eine schnelle Diagnose der ansteckenden
Krankheiten zu verwirklichen, nicht beeinflusst. Sequenzverzeichnis
