ES2289753T3 - Hibridacion in situ para detectar secuencias de acidos nucleicos especificas en muestras eucarioticas. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN METODOLOGIAS PARA LA DETERMINACION DE LA PRESENCIA DE SECUENCIAS ESPECIFICAS DE ACIDOS NUCLEICOS EN UNA MUESTRA DE ORIGEN EUCARIOTICO UTILIZANDO HIBRIDACION IN SITU. LA HIBRIDACION IN SITU SE REALIZA USANDO UNA SOLUCION DE HIBRIDACION QUE COMPRENDE AL MENOS UN COMPAÑERO DE HIBRIDACION CAPAZ DE HIBRIDARSE A LA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO ESPECIFICA QUE SE QUIERE DETERMINAR PARA ASI FORMAR HIBRIDOS Y UN AGENTE DESESTABILIZADOR DE HIBRIDOS EN UNA CANTIDAD EFECTIVA PARA DISMINUIR LA TEMPERATURA DE FUSION DE LOS HIBRIDOS FORMADOS ENTRE LOS DICHOS ACIDOS NUCLEICOS Y EL MENCIONADO COMPAÑERO DE UNION PARA ASI INCREMENTAR LA UNION ESPECIFICA Y DISMINUIR LA UNION NO ESPECIFICA. EL COMPAÑERO DE UNION USADO ES UNA BANDA POLIMERICA DE COMPONENTES POLIMERIZADOS QUE TIENEN UN ESQUELETO NO CICLICO, SIENDO LA BANDA POLIMERICA CAPAZ DE HIBRIDARSE CON LA SECUENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS QUE SE QUIERE DETERMINAR. EL METODO ES PARTICULARMENTE ADECUADO PARA EL DIAGNOSTICO DE DIFERENTES ENFERMEDADES HUMANAS COMO LAS INFECCIONES VIRALES Y BACTERIANAS, ENFERMEDADES GENETICAS Y TRASTORNOS NEOPLASICOS.
Description
Hibridación in situ para detectar
secuencias de ácidos nucleicos específicas en muestras
eucarióticas.
La presente invención se refiere a métodos para
determinar la presencia de secuencias de ácidos nucleicos
específicas en una muestra de origen eucariota usando hibridación
in situ. El presente método es particularmente adecuado para
diagnosticar diferentes enfermedades tales como infecciones
bacterianas y víricas, enfermedades genéticas y trastornos
neoplásticos. En otro aspecto de la presente invención, se
proporcionan juegos de diagnóstico de uso para realizar el método
según la invención.
La hibridación se ha usado tradicionalmente para
describir la técnica general por la que cadenas complementarias de
moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN), moléculas de ácido
ribonucleico (ARN) o combinaciones de ADN y ARN se separan en
cadenas sencillas y se las permite después renaturalizarse o
reasociarse y volver a formar hélices dobles de pares de bases. Las
técnicas de hibridación se clasifican generalmente en tres clases
principales: hibridación en solución por la que la célula principal
se rompe y el ácido nucleico interno se extrae en solución antes de
hibridar; esta técnica incluye diferentes niveles de purificación
del ácido nucleico antes de hibridar; hibridación en filtro o de
manchas, por la que ADN o ARN se unen a una matriz sólida
directamente o después de separar los fragmentos de ácido nucleico
individuales en, por ejemplo, un gel de agarosa o un gel de
poliacrilamida y la hibridación subsiguiente se realiza con una
sonda marcada para detectar híbridos; e hibridación in situ
(ISH) por la que se proporciona un método para detectar y localizar
secuencias de ácidos nucleicos específicas directamente en una
estructura específica, por ejemplo, dentro de una célula, un
tejido, un núcleo o un cromosoma. Aunque estas técnicas se basan en
la interacción específica entre el objetivo y una sonda capaz de
unirse específicamente a la secuencia a detectar, estas técnicas son
bastante diferentes y distinguibles entre sí.
La hibridación in situ permite la
detección de secuencias de ácidos nucleicos celulares o cromosómicas
específicas en el material celular, tal como en secciones de tejido
embebidas en parafina, biopsias recientes o congeladas, células o
cromosomas. Tradicionalmente, se han usado las sondas de ácidos
nucleicos que tienen una secuencia de bases que es suficientemente
complementaria con la secuencia objetivo a detectar. Para este tipo
de detección, se han usado extensamente sondas de ácidos nucleicos
marcadas con grupos detectables distintos de radioisótopos.
La demanda de métodos más sensibles es
creciente. Las formas de aumentar la sensibilidad son usar un
sistema de detección aumentador y/o incrementar el número de sondas
con diferentes secuencias que fijen como objetivo las secuencias de
ácidos nucleicos a detectar. Cuando han de distinguirse secuencias
estrechamente relacionadas, está limitado a menudo cuántas
variaciones de sondas pueden usarse para detectar un objetivo
dado.
Se ha descrito un aumento de la sensibilidad
para hibridación de ácidos nucleicos in situ en secciones de
tejidos o untes de células usando la denominada "PCR in
situ". El principio de la PCR in situ es combinar las
técnicas de PCR e ISH mediante la multiplicación de secuencias de
ácidos nucleicos específicas dentro de las células individuales,
produciendo un aumento de los números de copias hasta niveles
detectables por ISH. Los resultados reproducibles dependen de la
integridad de la muestra. Durante el pretratamiento de la muestra,
la membrana celular puede dañarse dando lugar a un riesgo de los
denominados "artefactos de difusión". Los productos de PCR
pueden escaparse de células y servir como plantillas para
multiplicación extracelular. Esto puede dar lugar a señales
positivas falsas. Un informe reciente resume los peligros de la
"PCR in situ" (Cell Vision, 3, 231-235
(1995)).
Según la presente invención, que se define por
las reivindicaciones adjuntas, se proporcionan compañeros de unión
y métodos para procedimientos de hibridación in situ para la
detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas en una
muestra de origen eucariota. En el presente método, la hibridación
se realiza usando un compañero de unión, que es una cadena polímera
de restos polimerizados que tienen una cadena principal no cíclica,
siendo capaz la cadena polímera de hibridarse con la secuencia de
ácido nucleico a determinar. Se dan ejemplos de tales cadenas
polímeras en el documento WO 92/20702.
En el documento WO 92/20702, se introdujo la
expresión ácido nucleico péptido (PNA) para describir algunos
compuestos que tienen una cadena principal no cíclica y propiedades
de unión de ácidos nucleicos.
En el documento WO 93/24652, se han postulado
sondas de PNA para ser factibles para hibridación in situ
realizada sin adición de un agente desnaturalizante, tal como
formamida, y además con hibridación realizada a baja temperatura.
La simplificación postulada del procedimiento de hibridación in
situ se basa en la suposición previa de que el PNA forma
estructuras triples con ADN de doble cadena. En el documento WO
93/24652, no hay datos experimentales que soporten esta
simplificación. Se ha mostrado ahora que la hipótesis de la
formación de triples propuesta en 1991 (Science, 254,
1497-1500 (1991)) sólo se aplica si un PNA de
homopirimidina se combina con un ADN de homopurina, por lo que se
forman triples de (PNA)_{2}/ADN, tales como
(PNA(T))_{2}(polidA) (TIBTECH, 11,
384-386 (1993)).
Egholm et al. (Nature, 365,
566-568, 1993) describen que ácido nucleico péptido
se hibrida con oligonucleótidos complementarios que obedecen a las
reglas de unión de hidrógeno de Watson-Crick.
El documento
WO-A-9 636 734, sólo relevante bajo
A.54(3) EPC, describe ensayos de hibridación in vitro
usando PNAs.
Pluskal et al. (The FASEB Journal, 1994,
poster 35) describen la unión estrecha de sondas de ácido nucleico
péptido con ácidos nucleicos que se han electromanchado sobre
membranas sintéticas. Antes de manchar, los ácidos nucleicos se
aíslan en condiciones de desnaturalización y, después de manchar,
los ácidos nucleicos se reticulan con UV a las membranas. La
estructura y el ambiente del ácido nucleico para el que se demuestra
hibridación en Pluskal et al. es así muy diferente de la
estructura de ácidos nucleicos en estructuras biológicas. Pluskal
et al. demuestran hibridación con una estructura de ácido
nucleico creada artificialmente y menos compleja que el ácido
nucleico en sistemas biológicos rodeados por estructuras celulares
que podrían dar lugar a reacciones cruzadas.
Según la presente invención, se proporcionan
métodos, definidos por las reivindicaciones 1ª-20ª, para determinar
la presencia de secuencias de ácidos nucleicos específicas en
muestras de origen eucariota usando hibridación in situ.
La presente invención proporciona así un método
para detectar una secuencia de ácido nucleico específica en una
muestra de origen humano usando hibridación in situ, que
comprende las etapas de (1) fijar la muestra, (2) poner en contacto
la muestra con una solución de hibridación que comprende: un
compañero de unión capaz de hibridarse con la secuencia de ácido
nucleico específica a detectar para formar un híbrido, comprendiendo
el compañero de unión una cadena polímera que contiene restos
polimerizados que tienen una cadena principal no cíclica y un
agente desestabilizante de híbrido en una cantidad eficaz para
disminuir la temperatura de fusión de híbridos formados entre dicho
ácido nucleico y dicho compañero de unión para aumentar la relación
entre la unión específica y la unión no específica, (3) separar
cualquier compañero de unión no unido y cualquiera unido no
específicamente y (4) detectar la presencia de compañero de unión
unido en la preparación, en el que la concentración de agente
desestabilizante de híbrido en la solución de hibridación es
superior al 10%.
En una realización de la presente invención, se
proporciona un método en el que la cadena polímera comprende restos
polimerizados de fórmula (I)
en la
que
Y designa O o S,
cada X designa independientemente O o S,
cada Q designa un ligando que es
independientemente una nucleobase de origen natural, una nucleobase
de origen no natural, un intercalador, un grupo de unión a
nucleobase, una marca o H,
u es un número entero de 1 a 5,
p y s designan independientemente 0 o 1,
q y r designan independientemente 0 o 1,
t designa 0 o 1,
R^{1} y R^{10} designan independientemente H
o alquilo C_{1-4},
R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6},
R^{7}, R^{8} y R^{9} designan independientemente H, la cadena
secundaria de un aminoácido de origen natural o la cadena secundaria
de un aminoácido de origen no natural.
El agente desestabilizante de híbrido está
presente en una cantidad eficaz para disminuir la temperatura de
fusión de los híbridos formados entre el ácido nucleico a determinar
y el compañero de unión usado para detectar dicho ácido nucleico,
para aumentar la relación entre la unión específica y la unión no
específica. En particular, la concentración del agente
desestabilizante de híbrido en la solución de hibridación es
superior al 10% v/v.
Son ejemplos de agentes destabilizantes de
híbridos formamida, etilenglicol y glicerol. Estos agentes pueden
estar presentes preferiblemente en una cantidad superior al 10% e
inferior al 70%. Puede estar presente formamida más preferiblemente
en una cantidad del 20% al 60%, aún más preferiblemente del 30% al
50%. Puede estar presente etilenglicol más preferiblemente en una
cantidad del 30% al 65%, aún más preferiblemente del 50% al 65%.
La presente invención proporciona un método para
determinar la presencia de secuencias de ácidos nucleicos
específicas en muestras de origen humano. Son ejemplos no
limitativos secciones de tejidos, untes de células, suspensiones de
células o partes de ellas y extensiones de cromosomas.
El compañero de unión puede estar
convenientemente marcado o no marcado. En un aspecto, el compañero
de unión lleva una o más marcas para detectar híbridos formados
durante la hibridación.
En una realización de la presente invención, un
tampón de lavado a pH alcalino puede usarse preferiblemente en la
etapa (3). El uso de un tampón de lavado que tiene un pH alcalino
puede proporcionar en algunos casos una relación aumentada entre
unión específica y unión no específica.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un juego de diagnóstico de uso en un método de detección
de una secuencia de ácido nucleico específica en una muestra de
origen humano por hibridación in situ, comprendiendo el
juego una solución de hibridación que comprende al menos un
compañero de unión capaz de hibridarse con la secuencia de ácido
nucleico específica para formar un híbrido, comprendiendo el
compañero de unión una cadena polímera que contiene restos
polimerizados que tienen una cadena principal no cíclica, y un
agente desestabilizante de híbrido en una cantidad eficaz para
disminuir la temperatura de fusión de híbridos formados entre el
ácido nucleico y el compañero de unión para aumentar la relación
entre unión específica y unión no específica, en el que la
concentración del agente desestabilizante de híbrido en la solución
de hibridación es superior al 10% v/v.
El juego de diagnóstico puede incluir
adicionalmente reactivos requeridos para preparación de la muestra,
fijación de la muestra, separación de compañero de unión no unido o
unido no específicamente y para detección de un híbrido
formado.
El método para determinar la presencia de
secuencias de ácidos nucleicos específicas en muestras de origen
eucariota usando hibridación in situ comprende las siguientes
cuatro etapas: (1) producción de una preparación de la muestra, (2)
hibridación, (3) lavado post-hibridación para
separar cualquier compañero de unión no unido y cualquiera unido no
específicamente y (4) determinación de la presencia de compañero de
unión específico unido en la preparación. Se describen después
realizaciones de estas etapas junto con ejemplos de material de
partida y los compañeros de unión a usar en la hibridación.
El presente método puede usarse para detectar
secuencias de ácidos nucleicos en muestras de origen eucariota. Se
considera que el presente método proporciona una herramienta valiosa
para analizar en tales muestras la presencia de secuencias de
ácidos nucleicos específicas, por ejemplo, para bacterias o virus
patógenos, proporcionando por ello información para establecer una
diagnosis. En patología humana o animal, la detección de
aberraciones cromosómicas puede proporcionar información importante
clínicamente para diagnosticar trastornos o enfermedades genéticas.
En biología de plantas, se considera adicionalmente que el presente
método puede ser una herramienta valiosa para comprobar la eficacia
de transferencia a una planta de, por ejemplo, genes de resistencia
a herbicidas o, como en tejidos humanos, establecer síntesis
específicas de proteínas (por detección de mARN) en una estructura
celular dada.
En el presente contexto, el término
"muestra" está limitado a secciones de tejidos, cultivos de
células o tejidos, suspensión de células humanas o partes aisladas
de ellas, biopsias humanas, muestras de sangre, saliva, orina,
fluido cerebroespinal, leche, excreciones, secreciones, algodones,
muestras fecales y aspirados, humanos.
Se prevé que en los híbridos formados entre los
presentes compañeros de unión y los ácidos nucleicos específicos a
determinar, el apareamiento de bases de Hoogsteen y/o
Watson-Crick ayuda a la formación de los híbridos.
En el presente contexto, el término "híbridos" se pretende que
incluya complejos de los presentes compañeros de unión y el ácido
nucleico específico a determinar que comprenden dos o más cadenas.
Son ejemplos no limitativos dobles de una cadena sencilla del
presente compañero de unión y una cadena sencilla del ácido
nucleico, y triples de, por ejemplo, dos cadenas del presente
compañero de unión y una cadena del ácido nucleico.
La muestra a examinar se
pre-trata antes de la etapa de hibridación, por lo
que se produce una preparación de la muestra. La persona experta en
la técnica reconocerá fácilmente que el pretratamiento apropiado
dependerá del tipo de muestra a examinar. Durante el
pretratamiento, la muestra se someterá a fijación.
Así, en una realización del método, la muestra
se deposita en un soporte sólido. Las técnicas para depositar una
muestra en el soporte sólido dependerán del tipo de muestra en
cuestión y pueden incluir, por ejemplo, seccionamiento de tejido
así como unte o citocentrifugación de suspensiones de células.
Pueden utilizarse muchos tipos de soportes sólidos para practicar
el presente método. El uso de tales soportes y los procedimientos
para depositar muestras en ellos son conocidos por los expertos en
la técnica. Son especialmente convenientes platinas de microscopio
de vidrio. Las platinas de microscopio de vidrio pueden tratarse
para retener mejor la muestra.
Antes de la hibridación, la muestra se
pre-trata convenientemente con diversos productos
químicos para facilitar las reacciones subsiguientes. El
pretratamiento real dependerá del tipo de muestra a analizar y de si
han de detectarse secuencias de ADN o ARN. Para localizar ARN tal
como mARN, es ventajoso que la muestra se trate lo antes posible
después de recoger la muestra para conservar buena parte del ARN
intacto. Si han de detectarse secuencias de ADN, esta etapa es
menos importante. El tratamiento preferido es uno que fije y
preserve la integridad morfológica de la matriz celular y de los
ácidos nucleicos dentro de la célula así como permita el grado más
eficaz de penetración de sonda. El término "sonda" y la
expresión "compañero de unión" se usan aquí
intercambiablemente y así la expresión "compañero de unión"
corresponde al término "sonda" que se usa tradicionalmente en
hibridación de ácidos nucleicos.
Para producir una preparación de una muestra de
tejido, pueden preservarse la integridad morfológica de un tejido y
la integridad de los ácidos nucleicos trayendo la muestra a un
estado fijo por medio de fijación química o congelación. Cuando se
usa congelación para preservación de, por ejemplo, una biopsia, la
biopsia se congela típicamente en nitrógeno líquido. Después de
congelar, la muestra puede guardarse apropiadamente a -80ºC. Antes
del análisis del ácido nucleico, la muestra congelada se corta en
secciones delgadas y se transfiere a, por ejemplo, platinas
pre-tratadas. Esto puede realizarse, por ejemplo, a
una temperatura de -20ºC en un criostato. La biopsia o secciones de
tejido pueden guardarse convenientemente a -80ºC hasta usar. Antes
de la hibridación, la sección de tejido puede tratarse con un
fijativo, preferiblemente un fijativo precipitante tal como
acetona, o la sección de tejido se incuba durante un período corto
en una solución de formaldehído tamponado. Alternativamente, la
biopsia o sección de tejido puede transferirse a un fijativo tal
como formaldehído tamponado durante 12 a 24 horas. Tras la
fijación, el tejido puede embeberse en parafina formando un bloque
del que pueden cortarse secciones delgadas. Muestras embebidas en
parafina bien preparadas pueden guardarse a temperatura ambiente
durante un período de años.
Antes de la hibridación, la sección de tejido se
desparafina y se rehidrata usando procedimientos estándares.
Puede ser necesaria una permeabilización
adicional con el fin de asegurar suficiente accesibilidad de las
secuencias de ácido nucleico objetivos al compañero de unión. El
tipo de tratamiento dependerá de varios factores, por ejemplo del
fijativo usado, de la extensión de la fijación, del tipo y tamaño de
la muestra usada y de la longitud del compañero de unión. El
tratamiento puede implicar exposición a proteasa tal como proteinasa
K, pronasa o pepsina, ácidos diluidos, detergentes o alcoholes o un
tratamiento térmico.
En algunos casos, podría ser útil una etapa de
prehibridación usando una mezcla de prehibridación muy similar a la
solución de hibridación pero sin el compañero de unión, con el fin
de disminuir la unión no específica del compañero de unión. Los
componentes de la mezcla de prehibridación deben seleccionarse para
obtener una saturación eficaz de lugares en el tejido que podrían
de otro modo unir al compañero de unión no específicamente.
Para analizar una preparación suspendida tal
como una suspensión de células, la muestra se trata para obtener
una permeabilización del material y una preservación de la
morfología. La fijación puede realizarse con un fijativo tal como
formaldehído, acetona o etanol.
En otro aspecto, el presente método permite la
detección de una secuencia de ácido nucleico específica en un
cromosoma. Talo detección puede realizarse, por ejemplo, usando
extensiones de cromosomas en metafase, en las que la secuencia
objetivo puede localizarse en cualquier región de los cromosomas,
por ejemplo, en la región centrómera o la región telómera de un
cromosoma. Un pretratamiento puede en este caso comprender la
adición de un agente tal como colcemida para detener los cromosomas
de células en división en la metafase de la mitosis. A
continuación, la muestra puede tratarse con un tampón hipotónico.
Tras centrifugación, los cromosomas se tratan con un fijativo y se
extienden en una platina. Inmediatamente antes o simultáneamente
con la etapa de hibridación, la preparación puede tratarse para
separar el objetivo de doble cadena. Esta separación puede
conseguirse calentando la preparación en presencia de un agente
desnaturalizante tal como formamida. La detección de una secuencia
de ácido nucleico específica en un cromosoma puede realizarse
también usando cromosomas en interfase, por ejemplo, en secciones
de tejido o en una suspensión de células. En tales casos, los
especímenes pueden tratarse como se ha descrito antes para secciones
de tejido o suspensiones de células.
Para todas las preparaciones de muestras, los
ácidos nucleicos se fijan en una estructura morfológica que permite
realizar la hibridación in situ. Así, los ácidos nucleicos no
se extraen del material celular y la hibridación no se realiza en
solución.
Si el objetivo para la detección son secuencias
de ARN, es importante evitar la degradación de los ácidos nucleicos
objetivos por ribonucleasas durante las etapas de prehibridación. Es
así importante que todo el equipo y las soluciones usadas para
pretratamiento así como para hibridación se traten apropiadamente
para separar nucleasas. Tales técnicas de inactivación son muy
conocidas en la bibliografía y pueden realizarse según
procedimientos estándares.
El compañero de unión usado en el presente
método es un a cadena polímera de restos polimerizados que tienen
una cadena principal no cíclica, siendo capaz la cadena polímera de
hibridarse con la secuencia de ácido nucleico a determinar.
En una realización del método, la cadena
polímera comprende restos polimerizados de fórmula (I)
en la
que
Y designa O o S,
cada X designa independientemente O o S,
cada Q designa un ligando que es
independientemente una nucleobase de origen natural, una nucleobase
de origen no natural, un intercalador, un grupo de unión a
nucleobase, una marca o H,
u es un número entero de 1 a 5,
p y s designan independientemente 0 o 1,
q y r designan independientemente 0 o 1,
t designa 0 o 1,
R^{1} y R^{10} designan independientemente H
o alquilo C_{1-4},
R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6},
R^{7}, R^{8} y R^{9} designan independientemente H, la cadena
secundaria de un aminoácido de origen natural o la cadena secundaria
de un aminoácido de origen no natural.
La expresión "nucleobases de origen
natural" incluye las cuatro bases de ADN principales (es decir,
timina (T), citosina (C), adenina (A) y guanina (G)), así como
otras nucleobases de origen natural (por ejemplo, uracilo (U) e
hipoxantina).
La expresión "nucleobases de origen no
natural" comprende, por ejemplo, nucleobases de origen natural en
las que una marca está asociada a la base opcionalmente a través de
un enlazador adecuado, y nucleobases de origen natural modificadas
tales como, por ejemplo, uracilo e hipoxantina modificados. Otros
ejemplos de nucleobases de origen no natural son
2,6-diaminopurina, propinilcitosina (propinil C),
isocitosina (iso-C), isoguanosina
5-metilisocitosina (iso^{Me}C) (véase, por
ejemplo, Tetrahedron Letters Vol. 36, Nº 12,
2033-2036 (1995) o Tetrahedron Letters Vol. 36, Nº
21, 3601-3604 (1995)).
Son ejemplos de intercaladores útiles, por
ejemplo, acridina, antraquinona, psoraleno y pireno.
Son ejemplos de grupos de unión a nucleobase
útiles, por ejemplo, 3-nitropirrol y
5-nitroindol.
En el presente contexto, "alquilo
C_{1-4}" se pretende que signifique grupos
alquilo ramificados o no ramificados que contienen de 1 a 4 átomos
de carbono. Son ejemplos no limitativos CH_{3}, CH_{2}CH_{3} y
CH(CH_{3})_{2}.
Dentro del presente contexto, la expresión
"aminoácido de origen natural" se pretende que comprenda formas
D y L de aminoácidos encontrados comúnmente en la naturaleza, por
ejemplo, formas D y L de Ala (alanina), Arg (arginina), Asn
(aspargina), Asp (ácido aspártico), Cys (cisteína), Gln (glutamina),
Glu (ácido glutámico), His (histidina), Ile (isoleucina), Leu
(leucina), Lys (lisina), Met (metionina), Phe (fenilalanina), Pro
(prolina), Ser (serina), Thr (treonina), Trp (triptófano), Tyr
(tirosina) y Val (valina).
\global\parskip0.900000\baselineskip
En el presente contexto, la expresión
"aminoácido de origen no natural" se pretende que comprenda
formas D y L de aminoácidos distintos de los encontrados comúnmente
en la naturaleza así como aminoácidos de origen natural
modificados. Son ejemplos de aminoácidos de origen no natural útiles
formas D y L de Cha (ciclohexilalanina), Cit (citrulina), Hci
(homocitrulina), HomoCys (homocisteína), Hse (homoserina), Nle
(norleucina), Nva (norvalina), Orn (ornitina), Sar (sarcosina) y
Thi (tienilalanina).
El compañero de unión a usar en el presente
método debe comprender un número suficiente de ligandos capaces de
interactuar con la secuencia de nucleótido a determinar para formar
híbridos suficientemente estables bajo el rigor usado en la
hibridación y en el lavado post-hibridación (etapas
(2) y (3)). La estrategia para seleccionar los ligandos del
compañero de unión a usar según el presente método puede basarse en
información de secuencias de nucleótidos objetivos disponible.
En los compañeros de unión indicados antes, la
cadena principal de los restos puede consistir preferiblemente en
seis átomos. Esto se ha demostrado que proporciona la afinidad por
ácidos nucleicos más fuerte observada actualmente. Puede ser
ventajoso en algunos casos cambiar la fuerza de la unión entre el
compañero de unión y la secuencia de ácido nucleico. Tal cambio de
la afinidad puede conseguirse separando los ligandos mediante menos
o mediante más átomos que seis átomos. Se considera que los
compañeros de unión preferidos a usar en el presente método
comprenden menos del 25% en peso (calculado excluyendo grupos X y Q
así como cualesquiera enlazadores y/o marcas) de restos que tengan
más o menos de seis átomos en la cadena principal.
La fuerza de la unión entre el compañero de
unión y la secuencia de ácido nucleico es influida por el ligando
Q. El apareamiento de bases de Hoogsten y/o
Watson-Crick ayuda a la formación de híbridos entre
un ácido nucleico y un compañero de unión, en el que Q designa una
nucleobase. Se considera que uno o más de los ligandos puede ser un
grupo que contribuya poco o nada a la unión del ácido nucleico, tal
como hidrógeno. Se considera que los compañeros de unión a usar en
el presente método comprenden menos del 25% en peso de restos en los
que Q designa H. Uno o más de los ligandos Q pueden ser grupos que
estabilizan la acumulación de nuclebases, tales como
intercaladores.
En los compañeros de unión indicados antes, uno
o más de los grupos Q pueden designar una marca. Se dan después
ejemplos de marcas adecuadas. Los restos en los que Q indica una
marca pueden situarse preferiblemente en uno o ambos de los restos
de terminación de la cadena polímera. Los restos en los que Q indica
una marca también pueden situarse internamente.
Los compañeros de unión adecuados a usar en el
presente método son compañeros de unión que comprenden restos
polimerizados de fórmula (I) en la que u, p, q, r, s, Y, X y Q son
como se ha definido antes, t es 0, R^{1} designa H o CH_{3},
R^{3}, R^{4}, R^{6} y R^{9} designan H, y R^{2}, R^{5},
R^{7} y R^{8} designan independientemente H o la cadena
secundaria de un aminoácido de origen natural o la cadena secundaria
de un aminoácido de origen no natural.
Otra realización se refiere a un método, en el
que la cadena polímera comprende restos polimerizados de fórmula
(II), que son restos de fórmula general (I) en la que r es 0 y q y s
son 1
en la
que
Y, X, Q, p, t y u son como se ha definido
antes,
R^{2}, R^{5} y R^{7} designan
independientemente H, la cadena secundaria de un aminoácido de
origen natural o la cadena secundaria de un aminoácido de origen no
natural, y R^{1} y R^{10} designan independientemente H o
CH_{3}.
Otra realización todavía se refiere a un método,
en el que la cadena polímera comprende restos polimerizados de
fórmula (III), que son restos de fórmula general (I) en la que p, r
y t son 0 y q y s son 1
en la
que
Y, X, Q y u son como se ha definido antes,
R^{2}, R^{5} y R^{7} designan
independientemente H, la cadena secundaria de un aminoácido de
origen natural o la cadena secundaria de un aminoácido de origen no
natural.
La cadena polímera comprende restos
polimerizados como se ha descrito antes. Se entiende por la fórmula
que la cadena polímera puede comprender restos polimerizados cuya
estructura puede ser mutuamente diferente o idéntica.
La cadena principal de la cadena polímera puede
formar convenientemente una poliamida que comprende restos
polimerizados, en los que todos los grupos X son O, o formar una
politioamida que comprende restos polimerizados, en los que todos
los grupos X son S. Los restos que forman la poliamida y la
politioamida pueden enlazarse para formas cadenas polímeras que
comprenden restos que forman poliamida y politioamida o formar
cadenas polímeras que comprenden restos que forman poliamida o
restos que forman politioamida sólo. Son de particular interés
cadenas polímeras que tienen una cadena principal de poliamida
(todos los grupos X designan O).
Son compañeros de unión de gran interés aquellos
en los que la cadena polímera comprende restos polimerizados de
fórmulas (IV)-(VI), que son restos de fórmula general (I) en la que
p, r y t son 0 y u, s y q son 1:
en las que R^{2}, R^{5} y
R^{7} designan independientemente H, la cadena secundaria de un
aminoácido de origen natural o la cadena secundaria de un
aminoácido de origen no natural, y cada Q designa independientemente
una nucleobase de origen natural, una nucleobase de origen no
natural, un intercalador o un grupo de unión a
nucleobase.
En las fórmulas (IV)-(VI), los sustituyentes
R^{2}, R^{5} y R^{7} pueden escogerse convenientemente para
designar H o la cadena secundaria de Ala, Asp, Cys, Glu, His,
HomoCys, Lys, Orn, Ser o Thr, y Q para designar timina, adenina,
citosina, guanina, uracilo o hipoxantina.
Son compañeros de unión particularmente
interesantes aquellos en los que la cadena polímera comprende restos
polimerizados de fórmula (VII) que son restos de fórmula general
(I) en la que p, r y t son 0 y u, s y q son 1.
en la que Q designa timina,
adenina, citosina, guanina, uracilo o
hipoxantina.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La longitud preferida del compañero de unión
dependerá del material objetivo y de si se usan compañeros de unión
marcados. Se considera que los compañeros de unión particularmente
interesantes comprenden de 8 a 30 restos polimerizados como se han
definido antes. Pueden ser de particular interés compañeros de unión
que comprendan de 12 a 20 restos polimerizados, y son de más
interés compañeros de unión que comprendan de 14 a 20 restos.
Como se ha mencionado antes, los restos
polimerizados del compañero de unión pueden ser mutuamente
diferentes o idénticos. En algunas realizaciones, los restos
polimerizados de fórmulas (IV)-(VII) constituyen al menos el 75% en
peso (calculado como se ha definido antes), preferiblemente al menos
el 80% en peso y más preferiblemente al menos el 90% en peso de la
cadena polímera.
Los extremos de los restos que terminan la
cadena polímera pueden sustituirse con sustituyentes convenientes.
Los sustituyentes pueden escogerse para formar la forma libre o
acilada del resto terminante. Los sustituyentes pueden escogerse
además para formar un éster, una amida o una amina dependiendo de la
naturaleza química del resto terminante. Un extremo de terminación
puede sustituirse además con una o más marcas, cuyas marcas pueden
incorporarse de extremo a extremo, es decir, para formar un extremo
marcado no ramificado, o pueden incorporarse para formar un extremo
marcado ramificado ("cremallera"). Un extremo de terminación
puede sustituirse además con una o más unidades enlazadoras. Tales
unidades enlazadoras pueden incorporarse directamente a un extremo
de terminación, pueden incorporarse a una marca o entre marcas en un
extremo de terminación, o pueden incorporarse a un extremo de
terminación antes de incorporar una marca a un extremo de
terminación. Debe entenderse que dos extremos de terminación pueden
llevar sustituyentes diferentes o idénticos, unidades enlazadoras
y/o marcas. Debe entenderse además que la expresión "una
marca" se pretende que comprenda una o más marcas.
La expresión "marca péptido" se pretende
que signifique una marca que comprende de 1 a 20 aminoácidos de
origen natural o de origen no natural, preferiblemente de 1 a 10
aminoácidos de origen natural o de origen no natural, más
preferiblemente de 1 a 8 aminoácidos de origen natural o de origen
no natural, aún más preferiblemente de 1 a 4 aminoácidos de origen
natural o de origen no natural, enlazados entre sí de extremo a
extremo de una manera no ramificada o ramificada
("cremallera") en una realización preferida, tal extremo no
ramificado o ramificado comprende una o más, preferiblemente de 1 a
8 marcas, más preferiblemente de 1 a 4, marcas adicionales
distintas de una marca péptido. Tales marcas adicionales pueden
terminar convenientemente un extremo no ramificado o un extremo
ramificado. Pueden incorporarse convenientemente una o más unidades
enlazadoras al extremo de terminación antes de incorporar una marca
péptido y/o una marca adicional. Tales unidades enlazadoras pueden
incorporarse también entre una marca péptido y una marca
adicional.
La cadena polímera tal cual puede comprender
también una o más marcas tal como de 1 a 8 marcas, preferiblemente
de 1 a 4 marcas, y/o una o más unidades enlazadoras, que pueden
incorporarse internamente, es decir, a la cadena principal de la
cadena polímera. Las unidades enlazadoras y las marcas pueden
incorporarse mutuamente como se ha descrito antes.
En el presente contexto, el término "marca"
se refiere a un sustituyente que es útil para detectar híbridos
formados entre un compañero de unión y un ácido nucleico. Según la
presente invención, las marcas adecuadas comprenden fluoróforos,
biotina, ácido dinitrobenzoico, digoxigenina, marcas radioisótopos,
marcas péptidos o enzimas, marcas de quimioluminiscencia, hepteno,
marcas de antígenos o anticuerpos. Son ejemplos de marcas
interesantes particulares biotina, marcas fluorescentes, tales como
marcas de fluoresceína, por ejemplo, 5-(y
6-)-carboxifluoresceína, 5- o
6-carboxifluoresceína, ácido
6-(fluorescein)-5(y
6)-carboxamidohexanoico e isotiocianto de
fluoresceína, marcas péptidos, ácido dinitrobenzoico, rodamina,
tetrametilrodamina, colorantes de cianina tales como Cy2, Cy3 y
Cy5, cumarina, R-ficoeritrina, aloficoeritrina, Rojo
Texas y Rojo Princeston, así como conjugados de
R-ficoeritrina y, por ejemplo, Cy5 o Rojo Texas.
Son ejemplos de marcas preferidas biotina,
marcas fluorescentes, marcas péptidos y ácido dinitrobenzoico. Las
marcas péptidos pueden estar compuestas preferiblemente por 1 a 10,
más preferiblemente por 1 a 8 y aún más preferiblemente por 1 a 4
aminoácidos de origen natural o de origen no natural. Puede ser
particularmente ventajoso incorporar una o más marcas distintas así
como una marca péptido, tal como de 1 a 8 o de 1 a 4 marcas
distintas. Dos de tales marcas distintas pueden incorporarse, por
ejemplo, en cada extremo de terminación.
Las marcas péptidos convenientes pueden estar
compuestas preferiblemente por cisteína, glicina, lisina u
ornitina.
Un enlazador puede formarse de unidades
enlazadoras seleccionadas entre unidades de fórmulas
-NH-(CH_{2}CH_{2}
O)_{n}CH_{2}C(O)-, -NH(CHOH)_{n}C(O)-, -(O)C(CH_{2}OCH_{2})_{n}C(O)- y -NH(CH_{2})_{n}C(O)-, en las que n es un número entero de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 3. Una unidad enlazadora puede tener un grupo amino libre o un grupo ácido libre, es decir, NH_{2}(CH_{2}CHO)_{n}CH_{2}C(O)-, -NH_{2}(CHOH)_{n}C(O)-, HO(O)C(CH_{2}OCH_{2})_{n}C(O)-, NH_{2}(CH_{2})_{n}C(O)-, -NH(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}C(O)OH, -NH(CHOH)_{n}C(O)OH, -(O)C(CH_{2}OCH_{2})_{n}C(O)OH y -NH(CH_{2})_{n}C(O)OH. Un enlazador puede consistir en hasta 3 de tales unidades enlazadoras. Son ejemplos de unidades enlazadoras muy interesantes -NH(CH_{2}C(O)-, -NHCH_{2}CH_{2}C(O)-, -NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-, HO(O)CCH_{2}C(O)(NH-(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}
C(O))_{2}-.
O)_{n}CH_{2}C(O)-, -NH(CHOH)_{n}C(O)-, -(O)C(CH_{2}OCH_{2})_{n}C(O)- y -NH(CH_{2})_{n}C(O)-, en las que n es un número entero de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 3. Una unidad enlazadora puede tener un grupo amino libre o un grupo ácido libre, es decir, NH_{2}(CH_{2}CHO)_{n}CH_{2}C(O)-, -NH_{2}(CHOH)_{n}C(O)-, HO(O)C(CH_{2}OCH_{2})_{n}C(O)-, NH_{2}(CH_{2})_{n}C(O)-, -NH(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}C(O)OH, -NH(CHOH)_{n}C(O)OH, -(O)C(CH_{2}OCH_{2})_{n}C(O)OH y -NH(CH_{2})_{n}C(O)OH. Un enlazador puede consistir en hasta 3 de tales unidades enlazadoras. Son ejemplos de unidades enlazadoras muy interesantes -NH(CH_{2}C(O)-, -NHCH_{2}CH_{2}C(O)-, -NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-, HO(O)CCH_{2}C(O)(NH-(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}
C(O))_{2}-.
En una realización adicional, el ligando Q como
se ha definido antes puede estar marcado. Las marcas convenientes
son como se ha definido antes. Entre tal marca, puede incorporarse
un enlazador seleccionado entre alquilo C_{1-15},
alquenilo C_{1-15} y alquinilo
C_{1-15}. En el presente contexto, "alquilo
C_{1-15}, alquenilo C_{1-15} y
alquinilo C_{1-15}" se pretende que signifiquen
grupos alquilo, alquenilo y alquinilo ramificados o no ramificados
que contienen de 1 a 15 átomos de carbono. Se prefiere que tales
ligandos Q marcados se seleccionen entre timina y uracilo marcados
en posición 5.
En una realización preferida, las cadenas
polímeras usadas son compañeros de unión que comprenden restos
N-(2-aminoetil)glicina polimerizados de
fórmula (VII) en los que el nitrógeno de glicina está conectado a
nucleobases de origen natural por un enlazador metilencarbonilo.
Los compañeros de unión a usar como sondas de detección pueden
comprender convenientemente de 8 a 30 de tales restos
polimerizados, comprenden preferiblemente de 12 a 20 restos, y más
preferiblemente de 14 a 20 restos.
En una realización, el compañero de unión más
preferido actualmente es una cadena polímera que comprende restos
polimerizados de fórmula (VII). La síntesis de compuestos de esta
estructura se describe en el documento WO 92/20702, y estos
compuestos se han denominado PNA.
Los compañeros de unión usados en los ejemplos
se sintetizaron según los procedimientos descritos en "PNA
Information Package" obtenido de Millipore Corporation (Bedford,
MA, EE.UU.) o los compañeros de unión se obtuvieron de PerSeptive
Biosystems (Framingham, MA, EE.UU.).
Si se usaba la estrategia Fmoc para alargamiento
del compañero de unión con enlazadores o aminoácidos, era posible
tener grupos amino de la cadena secundaria protegidos con grupos de
protección sensibles a ácidos tales como el grupo Boc. Este método
permite la introducción de un enlazador que contiene varios grupos
amino protegidos con Boc que pueden todos dividirse y marcarse en
el mismo ciclo de síntesis.
Una forma de marcar el compañero de unión es
usar una marca fluorescente, tal como 5-(y
6-)-carboxifluoresceína, 5-o
6-carboxifluoresceína, ácido
6-(fluorescein)-5(y
6)-carboxamidohexanoico e isotiocianto de
fluoresceína, El grupo ácido se activa con HATU (hexafluorofosfato
de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio)
o HBTU (hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio)
y se hace reaccionar con el grupo amino N-terminal.
Puede aplicarse la misma técnica a otros grupos marcadores que
contengan una función ácido. Alternativamente, puede usarse
directamente el éster de succinimidilo de las marcas mencionadas
antes.
Después de la síntesis, los compañeros de unión
se dividieron de la resina usando procedimientos estándares como se
describe por Millipore Corporation o PerSeptive Biosystems. Los
compañeros de unión se purificaron y analizaron usando técnicas de
HPLC de fase inversa a 50ºC y se caracterizaron mediante tiempo de
desorción/ionización ayudada por matriz de espectrometría de masas
de escape (MALDI-TOFMS), espectrometría de masas de
desorción de plasma (PDMS) o espectrometría de masas de
pulverización electrónica (ESMS).
Generalmente, los compañeros de unión tales como
compañeros de unión que comprenden restos polimerizados de fórmulas
(IV)-(VII) pueden prepararse también como se describe, por ejemplo,
en Tetrahedron Letters Vol. 35, Nº 29, 5173-5176
(1994) y Bioorganic & Medical Chemistry Letters, Vol. 4, Nº 8,
1077-1080 (1994). Las propiedades químicas de
algunos compañeros de unión se describen, por ejemplo, en Nature,
365, 566-568 (1993).
La hibridación puede realizarse usando
preparaciones fijas, inmovilizadas o suspendidas que se preparan
como se ha descrito antes. Si ha de detectarse un objetivo de
cadena doble, tal como secuencias cromosómicas o de ADN, puede ser
necesario un tratamiento para separar las dos cadenas. Esta
separación de las cadenas puede conseguirse calentando la muestra
en presencia de la mezcla de hibridación a una temperatura
suficientemente alta y durante un período de tiempo suficientemente
largo para disociar las cadenas. Típicamente, es conveniente un
calentamiento a una temperatura de 90ºC a 95ºC durante un período de
5 a 15 minutos.
El tampón de hibridación comprende un agente
desestabilizante de híbrido en una concentración superior al 10%
v/v, en una cantidad eficaz para disminuir la temperatura de fusión
de híbridos formados entre el ácido nucleico a determinar y el
compañero de unión para aumentar la relación entre unión específica
y unión no específica. Este agente permitirá que tenga lugar la
hibridación a una temperatura menor que sin el agente. En
hibridación de ácidos nucleicos tradicional, tal agente se denomina
un agente desnaturalizante.
La hibridación y la desnaturalización pueden
realizarse simultáneamente usando una cantidad adecuada de un
agente desestabilizante de híbrido en combinación con una
temperatura adecuada para el tratamiento.
La cantidad eficaz del agente desestabilizante
de híbrido dependerá del tipo de agente desestabilizante usado y
además del compañero de unión o combinación de compañeros de unión
usados. Se ha encontrado que, usando compañeros de unión de fórmula
(VII), se han obtenido resultados particulares buenos incluyendo un
agente desestabilizante de híbrido. Son ejemplos de agentes
desestabilizantes de híbridos formamida, etilenglicol y glicerol, y
estos agentes se usan en una concentración superior al 10% y
preferiblemente menor del 70%. La concentración de formamida puede
ser más preferiblemente del 20% al 60%, aún más preferiblemente del
30% al 50%. La concentración de etilenglicol puede ser más
preferiblemente del 30% al 60%, aún más preferiblemente del 50% al
65%. La concentración de glicerol puede ser más preferiblemente del
45% al 60%, aún más preferiblemente del 50%.
Es a menudo ventajoso incluir macromoléculas o
polímeros tales como sulfato de dextrano, polivinilpirrolidona y/o
ficoll. En presencia de tales macromoléculas o polímeros, la
concentración eficaz del compañero de unión en el objetivo se
supone aumentada. Puede añadirse sulfato de dextrano en una
concentración de hasta el 15%. A menudo son ventajosas
concentraciones de sulfato de dextrano del 2,5% al 12,5%.
En algunos casos, puede ser ventajoso añadir un
detergente tal como dodecilsulfato sódico, Tween 20® o Triton
X-100®.
Durante la hibridación, otros parámetros
importantes son la temperatura de hibridación, la concentración del
compañero de unión y el tiempo de hibridación. La persona experta en
la técnica reconocerá fácilmente que habrán de determinarse las
condiciones óptimas para diversos materiales de partida para cada
uno de los parámetros mencionados antes.
La hibridación entre compañeros de unión que
comprenden restos polimerizados de fórmulas (IV)-(VII) y una
secuencia de ácido nucleico objetivo parece ser insensible a
variaciones del pH y de la concentración de NaCl.
Tras la hibridación, la preparación se lava para
separar cualesquiera compañeros de unión no unidos y cualesquiera
unidos no específicamente. Las condiciones descritas después son
meramente a modo de ejemplo y pueden depender del tipo de
preparación a analizar. Durante la etapa de
post-hibridación, deben usarse condiciones de rigor
apropiadas con el fin de separar cualquier compañero de unión unido
no específicamente. El rigor se refiere al grado en el que las
condiciones de reacción favorecen la disociación de los híbridos
formados y puede aumentarse, por ejemplo incrementando la
temperatura de lavado y el tiempo de incubación. Para una
hibridación convencional con sondas de ácidos nucleicos, la
concentración de sal se usa a menudo como un factor adicional para
regular el rigor. Esto no se aplica a compañeros de unión que
comprenden restos polimerizados de fórmulas (IV)-(VII), porque la
unión de este tipo de sondas se ha demostrado ser virtualmente
independiente de la concentración de sal (Nature, 365,
566-568 (1993)).
Son ejemplos de sistemas de tampón útiles
solución salina Tris-tamponada (TBS), tampón de
citrato estándar (SSC) o tampones de fosfato. Un tampón TBS
conveniente es Tris/HCl 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,6. El tampón SSC
comprende cloruro sódico 0,15 M y citrato trisódico 0,015 M, pH
7,0.
Típicamente, pueden ser adecuados tiempos de
lavado de 25 a 30 minutos. También pueden dar buenos resultados
períodos de lavado de dos veces 10 minutos o 3 veces 5 minutos en un
tampón adecuado.
En algunos casos, particularmente cuando se usan
compañeros de unión que llevan al menos una marca fluorescente, se
ha mostrado ventajoso aumentar el pH del tampón de lavado. Se ha
observado un aumento en la relación señal a ruido usando un tampón
de lavado con un pH alcalino. Esto es debido aparentemente a una
reducción significativa de la unión no específica. En tales casos,
se prefiere que la solución de lavado de la etapa (3) tenga un
valor del pH de 8 a 10,5, preferiblemente de 9 a 10.
En aquellos casos en que la preparación se
deposita en platinas, los resultados de hibridación pueden
visualizarse usando métodos de coloración inmunohistoquímica muy
conocidos para detectar el marcado en el compañero de unión. Cuando
se usan compañeros de unión marcados fluorescentes, los híbridos
pueden detectarse usando un anticuerpo contra la marca
fluorescente, cuyo anticuerpo puede conjugarse con una enzima. La
marca fluorescente puede detectarse alternativamente directamente
usando un microscopio de fluorescencia, o los resultados pueden
analizarse automáticamente en un sistema de análisis de imagen de
base fluorescente.
Cuando se usan compañeros de unión marcados con
biotina, los híbridos pueden detectarse usando un anticuerpo contra
la marca de biotina, cuyo anticuerpo puede conjugarse con una
enzima. Si es necesario, puede generarse un aumento de la señal
usando sistemas de amplificación disponibles comercialmente tales
como el sistema de amplificación de señal catalizado para sondas
biotinadas (DAKO K 1500).
En el caso de una muestra suspendida tal como
una suspensión de células, pueden obtenerse resultados cuantitativos
usando compañeros de unión que comprendan una marca fluorescente y
un citómetro de flujo para registrar la intensidad de fluorescencia
por célula.
Los compañeros de unión usados en algunos
aspectos del presente método pueden formar híbridos de ácido
nucleico/compañero de unión que pueden reconocerse por un
anticuerpo descrito en el documento WO 95/17430. Los híbridos
formados entre el compañero de unión, el ácido nucleico y el
anticuerpo pueden detectarse en un método de coloración
inmunohistoquímica directa usando, por ejemplo, una forma conjugada
con enzima del anticuerpo, seguido por detección de la actividad de
la enzima o por aplicación de técnicas de coloración
inmunohistoquímica indirecta muy conocidas.
Para ilustrar más extensamente el presente
método, se describen los aspectos básicos de la hibridación in
situ realizada en secciones de tejido (A), en células en
suspensión (B) o en extensiones de cromosomas (C). Aunque los
procedimientos descritos se diseñan para un ensayo particular, la
persona experta en la técnica comprenderá que los principales
procedimientos de ensayo pueden realizarse fácilmente usando los
compañeros de unión apropiados para la detección de muchas otras
secuencias de ácidos nucleicos específicas en muestras de origen
humano.
La infección con papilomavirus se ha
diagnosticado tradicionalmente usando coloración histológica,
microscopía electrónica o inmunohistoquímica diseñadas para la
detección de antígenos víricos. Sin embargo, estos métodos son
todos relativamente insensibles. Se conocen varios tipos diferentes
de HPV, por ejemplo, los tipos de HPV 6, 11, 16, 18, 30, 31, 33,
35, 45, 51 y 52. De éstos, pueden seleccionarse secuencias
específicas como objetivo de detección. A modo de ejemplo, se
describe un método de hibridación in situ para la detección
de tejido cervical infectado con HPV 16 usando compañeros de unión
específicos tipo.
Etapa
(1)
Una biopsia que contiene células epiteliales
escamosas de tejido cervical uterino se trata para preservar la
integridad morfológica de la matriz celular y del ácido nucleico
dentro de la célula. La biopsia es llevada lo antes posible a una
fase fija por medio de una fijación química o por congelación. Un
tratamiento preferido es usar un fijativo tal como formaldehído,
preferiblemente como una solución al 4% v/v en tampón a pH neutro.
Tras la fijación durante típicamente de 12 a 14 horas, se embebe la
biopsia en parafina. La biopsia embebida en parafina puede usarse
inmediatamente o puede guardarse a temperatura ambiente durante un
período de años. De la biopsia embebida en parafina, se cortan
secciones delgadas que tienen un espesor de típicamente
3-6 \mum y se transfieren a platinas de
microscopio silanizadas o tratadas con adhesivo de otro modo.
Se seca después la platina, por ejemplo
incubando la platina durante 30 minutos a 60ºC en un horno.
Las platinas se desparafinan, por ejemplo
mediante inmersión en una solución de desparafinado tal como xileno,
y se rehidratan, por ejemplo, por inmersión en etanol del 99% o
etanol del 95%, se secan al aire y se sumergen en en, por ejemplo,
agua Milli Q. Para aumentar la accesibilidad de las secuencias
objetivo al compañero de unión, la sección de tejido puede tratarse
con un agente proteolítico tal como proteinasa K. Las platinas se
enjuagan en un tampón adecuado tal como un tampón TBS.
Etapa
(2)
Para detectar HPV 16, pueden usarse compañeros
de unión que comprenden restos polimerizados de fórmulas (I)-(VII).
La selección de nucleobases que serán específicas para la detección
del HPV 16 se basa en información de secuencias disponible pública
recogida de diferentes bases de datos. Una de las regiones más
variables entre los diferentes subtipos de HPV es el marco de
lectura abierto E6/E7 que codifica dos proteínas (E6 y E7)
implicadas en la transformación de células infectadas. Se
seleccionan y sintetizan compañeros de unión apropiados, capaces de
formar híbridos suficientemente estables con mARN que codifica estas
proteínas.
Se pone en contacto una cantidad apropiada de
compañero de unión no marcado o marcado con la sección de tejido
junto con una mezcla de hibridación apropiada que comprende un
agente desestabilizante de híbrido. En una realización preferida,
la mezcla de hibridación comprende del 30% al 50% de formamida. La
sección de tejido en la platina se incuba a una temperatura
apropiada durante un período apropiado de tiempo. Típicamente, se
usa una concentración de compañero de unión de 20 a 100 nM,
temperaturas de incubación de 40ºC a 60ºC y tiempos de hibridación
de 10 a 20 minutos.
Etapa
(3)
Las platinas se lavan para separar cualquier
compañero de unión no unido y cualquiera unido no específicamente.
Las platinas se lavan típicamente en un tampón TBS a una temperatura
de 40ºC a 65ºC durante 15 a 45 minutos. La unión no específica
puede reducirse significativamente usando un tampón de lavado
alcalino. Puede emplearse un tampón de lavado que tenga un valor
del pH de 8 a 10,5, preferiblemente de 9 a 10.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Etapa
(4)
Los resultados de hibridación pueden
visualizarse usando métodos de coloración inmunohistoquímica muy
conocidos para detectar el marcado en el compañero de unión. Cuando
se usan compañeros de unión marcados fluorescentes, los híbridos
pueden detectarse usando un anticuerpo contra las marca
fluorescente, cuyo anticuerpo puede conjugarse con una enzima. La
marca fluorescente puede detectarse alternativamente directamente
usando un microscopio de fluorescencia, o los resultados pueden
analizarse automáticamente en un sistema de análisis de imágenes
basado en fluorescencia.
Cuando se usan compañeros de unión marcados con
biotina, los híbridos pueden detectarse usando un anticuerpo contra
la marca de biotina, cuyo anticuerpo puede conjugarse con una
enzima. Si es necesario, puede generarse un aumento de la señal
usando sistemas de amplificación disponibles comercialmente tales
como el sistema de amplificación de señal catalizado para sondas
biotinadas (DAKO K 1500).
Los compañeros de unión usados en algunos
aspectos del presente método pueden formar híbridos de ácido
nucleico/compañero de unión que pueden reconocerse por un
anticuerpo descrito en el documento WO 95/17430. Los híbridos
formados entre el compañero de unión, el ácido nucleico y el
anticuerpo pueden detectarse en un método de coloración
inmunohistoquímica directa usando, por ejemplo, una forma conjugada
con enzima del anticuerpo, seguido por detección de la actividad de
la enzima o por aplicación de técnicas de coloración
inmunohistoquímica indirecta muy conocidas.
Etapa
(1)
Se recoge sangre venosa en un tubo de ensayo que
contiene un anticoagulante (por ejemplo, EDTA, citrato o heparina).
Las células mononucleares se aíslan por centrifugación en un medio
de separación o, alternativamente, se lisan los glóbulos rojos. Las
células mononucleares se lavan dos veces con un medio de cultivo
sintético, RPMI 1640 (Life Technologies) o solución salina
tamponada con fosfato (PBS). Un tampón PBS adecuado es fosfato 0,01
M, NaCl 0,14 M, pH 7,2. Las células se fijan en un fijativo tal como
etanol del 70% (v/v) durante 15 minutos a 4ºC. Una concentración
adecuada de células es 10^{7} células por ml del fijativo.
Etapa
(2)
Una suspensión de células
(10^{5}-10^{6} células) se añade a 50 \mul de
tampón de hibridación precalentado tal como Tris/HCl, pH 7,2, que
comprende cantidades adecuadas de cloruro sódico, dodecilsulfato
sódico (SDS) y un agente desestabilizante de híbrido, junto con una
cantidad adecuada de un compañero de unión apropiado, por ejemplo,
un compañero de unión marcado con una marca fluorescente, por
ejemplo, en una concentración de 20 a 100 nM. Se describen ejemplos
de compañeros de unión adecuados en el Ejemplo 1. El tubo de ensayo
se incuba a una temperatura adecuada, por ejemplo, a una
temperatura de 40ºC a 60ºC. Después de 10-30
minutos, se detiene la hibridación globulizando las células
mediante centrifugación, por ejemplo, a 8.000 g durante 2
minutos.
Etapa
(3)
Las células se lavan, por ejemplo, tres veces
durante 10 minutos cada vez a una temperatura de 40ºC a 65ºC, en un
tampón adecuado tal como PBS, y se resuspenden a continuación en una
solución de PBS (por ejemplo, 500 \mul, pH 8,4). Las células se
guardan refrigeradas, por ejemplo, a 4ºC, en la oscuridad hasta
analizar.
Etapa
(4)
Citometría de flujo: si se usa un compañero de
unión marcado con fluoresceína, las células pueden controlarse en
un citómetro de flujo (por ejemplo, un citómetro de flujo Becton
Dickinson FACScan) equipado con un dispositivo de láser iónico (por
ejemplo, un láser de ion argón). La longitud de onda de excitación
del láser del citómetro de flujo Becton Dickinson FACScan es 488 nm
a 15 mw. Los linfocitos se identifican y se desbloquean
periódicamente midiendo la fotodispersión del ángulo hacia adelante
y la fotodispersión del ángulo derecho. La fluorescencia verde de
la fluoresceína se recoge a través de un filtro de paso de banda de
530 nm. Estos parámetros se obtienen como señales de altura de
impulso (cuatro decenios en escala logarítmica) en modo de lista
para 10.000 sucesos con una velocidad de aproximadamente 200
células por segundo. Los datos se analizan usando software LYSYS
II.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Microscopía de fluorescencia: Se aplican
depósitos de un número apropiado de células a platinas de vidrio y
éstas se cierran con barniz de uñas y las platinas se observan bajo
un microscopio de fluorescencia. Las reacciones positivas se ven
como un precipitado fluorescente.
Etapa
(1)
Pueden prepararse extensiones de cromosomas en
metafase a partir de muestras de sangre periférica, médula ósea,
membrana amniótica, cordón umbilical o células de tumores. Si se
prepara a partir de sangre periférica, una muestra de sangre
completa recogida en un tubo de vidrio que contiene heparina u otro
anticoagulante se mezcla con medio de crecimiento adecuado. Como en
el Ejemplo, puede añadirse 1 ml de sangre completa a 8 ml de medio
RPMI 1640 suplementado con 20% (v/v) de suero de becerro fetal,
glutamina 2 mM, 100 U de penicilina/estreptomicina, 2% de
fitohemag-glutinina y 5 U/ml de heparina. La muestra
se incuba en un incubador con CO_{2}, por ejemplo, a 37ºC durante
72 h. Los cromosomas se detienen en la metafase de la mitosis, por
ejemplo, añadiendo colcemida (0,1 \mug/ml) al cultivo
aproximadamente 30 minutos antes de cosechar las células.
Las células se recogen por centrifugación y se
resuspenden en un tampón hipotónico, por ejemplo, KCl 60 mM, a
temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Se trata la
muestra con un fijativo adecuado tal como metanol:ácido acético
3:1. El tratamiento con fijativo puede repetirse varias veces. El
tratamiento puede realizarse a temperaturas de congelación tales
como a -20ºC durante hasta 20 minutos. Se preparan extensiones de
cromosomas manchando con una cantidad adecuada de la suspensión una
platina limpia y fría y secando la platina al
aire.
aire.
Etapa
(2)
Los compañeros de unión para detectar secuencias
centrómeras pueden ser compañeros de unión que comprenden restos
polimerizados de fórmulas (I)-(VII). La selección de nucleobases
específicas para secuencias centrómeras de los cromosomas se basa
en información de secuencias disponible pública.
Antes de la hibridación, se desnaturaliza el ADN
cromosómico. Tal desnaturalización puede realizarse poniendo la
platina en una solución de 2 x SSC y formamida del 70% a
aproximadamente 70ºC durante un período corto de tiempo tal como 2
minutos.
La hibridación puede realizarse como se ha
descrito antes para secciones de tejido (véase etapa (2) de la
descripción de la realización A). Puede estar presente durante la
hibridación sulfato de dextrano en concentraciones de hasta el 15%,
pero no se requiere.
Alternativamente, la desnaturalización y la
hibridación pueden realizarse simultáneamente. Si se realizan
simultáneamente, es ventajoso usar formamida en una concentración de
hasta el 60%.
Etapa
(3)
La platina puede sumergirse en TBS, pH 7,4,
típicamente entre 40ºC y 65ºC durante 15 a 45 minutos.
Alternativamente, la platina puede sumergirse en tampón SSC, pH
7,0, que contiene Triton X-100® tal como 0,1 x SSC
(NaCl 15 mm, citrato sódico 1,5 mM, pH 7,0) y 0,1% de Triton
X-100®, típicamente entre 40ºC y 65ºC durante 5 a
15
minutos.
minutos.
Etapa
(4)
La detección de híbridos formados puede
realizarse como se ha descrito antes para la detección de HPV en
secciones de tejidos (véase etapa (4) de la descripción de la
realización A).
En los siguientes ejemplos, se dan realizaciones
especiales de la invención.
Puede usarse la determinación de la expresión de
la cadena ligera de Kappa para detectar la clonalidad de lesiones
linfoproliferativas, por ejemplo, para clasificar pacientes con
mieloma múltiple o linfoma de células B.
Para comparar el uso de compañeros de unión de
fórmula (VII) como sondas de hibridación con el uso de sondas de
ADN equivalentes, pero más largas, se hizo el siguiente
experimento.
Se fijaron muestras de amígdalas humanas
normales durante 24 horas en formaldehído tamponado de pH neutro
del 4% v/v. Las muestras fijas se embebieron en parafina formando un
bloque, del que se cortaron secciones que tenían un espesor de 4 a
5 pm y se pusieron en platinas pre-revestidas
(SuperFrost Plus, Menzel-Gläser, Alemania, 041300).
Las platinas se incubaron a 65ºC durante 60 minutos.
Se realizó pretratamiento para descubrir
secuencias objetivo de mARN de tejido y permeabilizar las secciones
de tejido para compañeros de unión y reactivos de detección. Las
secciones se desparafinaron y deshidrataron a través de una serie
de tratamientos con xileno, etanol del 99%, etanol del 95% y agua
ultrapura tratada con dietilpirocarbonato
(DEPC-agua), respectivamente. Las secciones de
tejido se digirieron con Proteinasa K (DAKO, Dinamarca, S 3020;
1:10 en TBS) en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30
minutos. Tras la digestión, las platinas se lavaron dos veces en
DEPC-agua a temperatura ambiente durante 5 minutos
cada vez, se sumergieron en etanol del 96% v/v durante 10 segundos
y se secaron al aire.
Se sintetizaron compañeros de unión que
comprendían restos polimerizados de fórmula (VII) como se ha
descrito antes. Para la detección del mARN que codifica región
constante de cadena ligera de Kappa, se usaron tres compañeros de
unión (fórmulas (VIIa, VIIb, VIIc)) que comprendían cada uno 15
nucleobases complementarias con secuencias de la región constante
de la cadena ligera de Kappa. Se incorporó a cada compañero de unión
una marca de fluoresceína mediante unidades enlazadoras L como se
muestra después. Los compañeros de unión se escriben desde el
terminal N al C usando convenciones de péptidos normales, es decir,
H designa un grupo amino terminal libre y -NH_{2} designa un
grupo carboxamida terminal. Las secuencias de los compañeros de
unión sintetizados fueron como sigue:
en las que Flu indica una marca de
5-(y 6)-carboxifluoresceína o isotiocianato de
fluoresceína, y cada L designa una unidad enlazadora de fórmula
-NH(H_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-.
Para hibridación, los compañeros de unión se
usaron separadamente o en combinación. En cualquier caso, la
concentración de cada uno de los compañeros de unión fue 20 nM (0,1
ng/\mul).
Sondas de ADN: se seleccionaron oligonucleótidos
de ADN que comprendían de 25 a 30 nucleótidos para hibridarse con
las mismas regiones de la región constante de mARN de cadena ligera
de Kappa como los compañeros de unión mostrados antes
(VIIa)-(VIIc). Se sintetizaron oligonucleótidos de ADN usando un
sintetizador ABI, se purificaron y se marcaron. La incorporación de
Flu-12-dUTP mediante la enzima
transferasa terminal de desoxirribonucleótido (TdT, Boehringer
Mannheim) produjo un marcado medio de tres marcas fluorescentes por
sonda. En la etapa de hibridación, las sondas de ADN se usaron
separadamente o en combinación, en cualquier caso con una
concentración de 12 nM (0,1 ng/\mul).
Las secciones de tejido secadas al aire de las
platinas se cubrieron cada una con 15 \mul de solución de
hibridación. La solución de hibridación consistía en NaCl 10 mM
(NaCl 0,6 M para las sondas de ADN) (Merck, Alemania,
6404.5000), 10% de sulfato de dextrano p/v (Sigma EE.UU.,
D-8906), 30% de formamida v/v (Life Technologies,
EE.UU., 55150B), 0,1% de pirofosfato sódico, 2% de
polivinilpirrolidona (P.M. 40000), 0,2% de ficoll (P.M. 400000),
Na_{2} EDTA 5 mM, Tris/HCl 0,05 M, pH 7,5, y los respectivos
compañeros de unión en las concentraciones indicadas antes. Las
secciones se cubrieron con cubreplatinas con el fin de asegurar una
distribución uniforme de la solución de hibridación y se incubaron
en la oscuridad en una cámara húmeda a 37ºC durante 1,5 h.
Tras la hibridación, se retiraron el
cubreplatinas y la solución de hibridación, y las platinas se
transfirieron a un jarro que contenía TBS a pH 7,6 y se mantuvieron
a temperatura ambiente. Las platinas se lavaron 3 x 3 minutos y el
tampón se renovó entre cada lavado.
Tras el lavado post-hibridación,
las platinas se sumergieron en TBS a temperatura ambiente. Se usó
para detectar los híbridos formados un conjugado
anti-FITC de conejo (Fab)/Ap listo para usar (DAKO
K0076). Las platinas se incubaron durante 30 minutos con el
anticuerpo en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de
la incubación, se sacó el anticuerpo y las platinas se lavaron dos
veces en TBS, cada vez durante 3 minutos, seguido por dos lavados
en agua Milli-Q, cada vez durante 1 minuto. Se
comprobó la fosfatasa alcalina unida mediante el anticuerpo por
adición de sustrato BCIP/NBT 1:50 a pH 9,0 (DAKO K0046) y se
incubaron las platinas en una cámara húmeda a temperatura ambiente
durante 1 hora (BCIP es fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
y NBT es tetrazolio de nitroazul). Finalmente, las platinas se
lavaron en agua de grifo y se montaron usando Glycergel (DAKO, C
0563).
La hibridación, es decir, coloraciones
positivas, se reconoció en el microscopio como un color azul
oscuro/negro. Apareció que la señal obtenida con los compañeros de
unión separados o combinados (VIIa)-(VIIc) era más fuerte que la
señal obtenida con las sondas de ADN separadas o combinadas
equivalentes, incluso aunque se dispusiera de menos moléculas de
detección en los compañeros de unión (VIIa)-(VIIc) (sólo una marca
en cada uno de los compañeros de unión (VIIa)-(VIIc) en comparación
con una media de tres marcas en cada una de las sondas de ADN). Se
observó unión no específica cuando se usaron los compañeros de unión
(VIIa)-(VIIc), particularmente cuando se usaron en combinación los
tres compañeros de unión.
En contraste con la hibridación entre dos
cadenas de ácidos nucleicos, la hibridación entre compañeros de
unión que comprenden restos polimerizados de fórmula (VII) y un
ácido nucleico objetivo parece ser insensible a la concentración de
sal. No se observó diferencia en la relación entre unión específica
y no específica en el experimento usando NaCl 0,01 M, 0,1 M o 0,6 M
en las soluciones de hibridación. Además, no se vio diferencia
cuando el valor del pH de la solución de hibridación se cambió de
7,6 a 9,0 o 10,0.
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se usaron los tres compañeros de unión
mencionados en el Ejemplo 1 separadamente o en combinación. Los
compañeros de unión (VIIa)-(VIIc) se usaron en una solución de
hibridación como se ha descrito en el Ejemplo 1 con la excepción de
que la concentración de cada compañero de unión fue 20, 50 o 100 nM,
respectivamente. Se hicieron incubaciones durante 1½ horas a 37ºC,
45ºC, 50ºC, 55ºC o 60ºC, respectivamente.
Se realizaron lavados
post-hibridación en TBS a pH 7,6 durante 25 minutos
a la misma temperatura que para la hibridación, a saber 37ºC, 45ºC,
50ºC, 55ºC o 60ºC, respectivamente.
Como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados indicaron que no se obtuvo mejora
con respecto a la relación señal a ruido cuando se usaron
concentraciones de compañeros de unión (VIIa)-(VIIc) mayores de 20
nM. Esto fue debido a un aumento simultáneo de la unión no
específica. Una temperatura aumentada durante la hibridación y el
lavado post-hibridación disminuyó la unión no
específica sin reducir la unión específica. La disminución de la
unión no específica se observó más claramente cuando los compañeros
de unión (VIIa)-(VIIc) se usaron en combinación. La mayor relación
señal a ruido se obtuvo usando cada uno de los tres compañeros de
unión (VIIa)-(VIIc) separadamente en una concentración de 20 nM y
realizando hibridación y lavado a una temperatura de 55ºC. No se
observó diferencia significativa para los compañeros de unión
individuales.
Para investigar adicionalmente la naturaleza de
la unión de los tres compañeros de unión (VIIa)-(VIIc), se hizo una
variedad de soluciones de lavado
post-hibridación.
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Las condiciones de hibridación fueron idénticas
a las condiciones descritas en el Ejemplo 1 con la excepción de que
la temperatura de hibridación fue 55ºC. Se usó una combinación de
los tres compañeros de unión descritos en el Ejemplo 1, cada uno
con una concentración de 20 nM.
El lavado post-hibridación se
realizó usando las soluciones mostradas en la Tabla 1. El lavado se
efectuó durante 25 minutos a 55ºC con sacudidas suaves.
Como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Con respecto a la unión específica (coloración
específica), el sistema de puntuación usado para evaluar fue como
sigue: ++++; +++(+); +++; ++(+); ++; +(+), + y (+), en el que ++++ a
(+) designan una puntuación de células coloreadas específicas
intensas a pálidas o pocas células coloreadas específicas. Una
puntuación indicada como - designa no coloración.
Con respecto a la unión no específica
(coloración de fondo), el sistema de puntuación usado para evaluar
fue como sigue: ++; +(+), + y (+), en el que ++ a (+) designan una
puntuación de coloración homogénea de células y matriz
intercelular, lo que hace difícil la evaluación de células positivas
pálidas, a coloración homogénea pálida de células y matriz
intercelular. Una puntuación indicada como - designa no coloración
de fondo (sin unión no específica).
Los resultados muestran que el uso de soluciones
de lavado post-hibridación que contienen TBS con un
pH de aproximadamente 9 a 10 produce una disminución significativa
de la unión no específica sin comprometer significativamente a la
intensidad de la unión específica. Incluso usando alta concentración
de compañero de unión, por ejemplo, 50 nM, la unión no específica
descrita en el Ejemplo 1 disminuye significativamente cuando se usa
un tampón de lavado alcalino (véase Ejemplo 6).
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Las condiciones de hibridación fueron como se ha
descrito en el Ejemplo 1 con la excepción de que se varió el agente
desestabilizante de híbrido. Se usaron tres agentes
desestabilizantes de híbridos diferentes, a saber, formamida,
etilenglicol y glicerol. Se usó una combinación de los tres
compañeros de unión (VIIa)-(VIIc) del Ejemplo 1, y la hibridación
se realizó durante 60 minutos a 55ºC. La concentración de cada uno
de los compañeros de unión fue 20 nM.
Las platinas se lavaron en tampón TBS a pH 10 a
55ºC. El tiempo de lavado fue 25 minutos.
Como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos se dan en la Tabla 2.
El sistema de puntuación es como se ha descrito en el Ejemplo 3: nd
indica no determinado. En todos los experimentos sólo se observó
unión no específica insignificante.
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Las condiciones de hibridación son como se ha
descrito en el Ejemplo 4 con la excepción de que se usaron las
siguientes concentraciones del agente desestabilizante de híbrido:
formamida, 30%; etilenglicol, 65% y glicerol, 50%. Tiempos de
hibridación de 15, 30 y 60 minutos, respectivamente.
Las platinas se lavaron en tampón TBS a pH 10 a
55ºC. El tiempo de lavado fue 25 minutos.
Como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos se dan en la Tabla 3.
La definición del sistema de puntuación se da en el Ejemplo 3. En
todos los experimentos sólo se observó unión no específica
insignificante.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indican que son necesarios
tiempos de hibridación mayores cuando se usan etilenglicol o
glicerol como agente desestabilizante de híbrido en comparación con
los de formamida.
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se sintetizaron como se ha descrito antes
compañeros de unión de fórmulas (VIIa)-(VIIf) que comprenden restos
polimerizados de fórmula (VII). Los compañeros de unión comprendían
15 nucleobases complementarias con secuencias de la región
constante de la cadena ligera de Kappa. Las secuencias de los
compañeros de unión sintetizados fueron como sigue:
en las que Flu indica una marca de
5-(y 6)-carboxifluoresceína o isotiocianato de
fluoresceína, Lys designa una marca de lisina y cada L designa una
unidad enlazadora de fórmula
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-.
Las condiciones de hibridación fueron como se ha
descrito en el Ejemplo 1 con la excepción de que la temperatura de
hibridación fue 55ºC. Los compañeros de unión (VIIa), (VIIc),
(VIId), (VIIe) y (VIIf) se usaron separadamente o los compañeros de
unión (VIIa), (VIIb) y (VIIc) se usaron en combinación. La
concentración de cada compañero de unión fue 20 nM (Tabla 4A) y 50
nM (Tabla 4B), respectivamente.
El lavado post-hibridación se
realizó en un tampón TBS a pH 7,6, 9,0 o 10,0 durante 25 minutos a
55ºC.
Los resultados se dan en las Tablas 4A y 4B. El
sistema de puntuación usado es como se ha descrito en el Ejemplo
3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indican que la unión no
específica puede separarse usando una solución de lavado con pH
aumentado en comparación con un pH de 7,6 sin disminuir
significativamente la unión específica.
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Se usaron los siguientes compañeros de unión que
comprenden restos de fórmula (VII):
Flu-L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-NH_{2}
(VIIa) o Bio-
L-L-GAC-TTC-GCA-GGC-GTA-NH_{2}
(VIIg), en los que Flu indica una marca de 5-(y
6-)carboxifluoresceína o isotiocianato de fluoresceína, Bio indica
una marca de biotina y cada L indica una unidad enlazadora de
fórmula
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)..
La solución de hibridación era idéntica a la
solución descrita en el Ejemplo 1 con la excepción de que la
concentración de formamida se varió del 0 al 60% y que la
concentración del compañero de unión (VIIa) o (VIIg) fue 50 nM. Las
platinas se incubaron en una cámara húmeda en la oscuridad a 55ºC
durante 1,5 horas.
El lavado post-hibridación se
realizó en una solución de TBS a pH 10, durante 25 minutos a 55ºC
bajo sacudidas suaves.
La detección de híbridos formados con el
compañero de unión (VIIa) marcado con fluoresceína se realizó como
se describe en el Ejemplo 1. La detección de híbridos formados con
el compañero de unión (VIIg) marcado con biotina se realizó usando
estreptavidina/fosfatasa alcalina (DAKO D396 1:100). Tras incubación
durante 30 minutos a temperatura ambiente, se enjuagaron las
platinas y se comprobó la actividad de fosfatasa alcalina por
adición de sustrato BCIP/NBT como se describe en el Ejemplo 1. Los
resultados se muestran en la Tabla 5. La definición del sistema de
puntuación se da en el Ejemplo 3.
De los resultados puede concluirse que, para los
compañeros de unión usados en este experimento y las condiciones de
hibridación y lavado post-hibridación aplicadas, una
concentración de al menos 10-15% de formamida parece
ser necesaria con el fin de obtener unión específica. En este
experimento, una concentración del 30-50% de
formamida pareció dar la mejor relación señal a ruido.
Usando otros compañeros de unión que comprenden
restos polimerizados de fórmula (VII), por ejemplo, compañeros de
unión dirigidos contra los ARN's nucleares de EBER codificados por
EBV, se han obtenido resultados aceptables sin nada de formamida
en la solución de hibridación, pero los mejores resultados se
obtenían todavía con 30-40% de formamida en el
tampón de hibridación (resultados no mostrados).
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
La hibridación se realizó como se ha descrito en
el Ejemplo 1 con la excepción de que el tiempo de hibridación se
varió de 5 a 90 minutos y que la temperatura de hibridación se
mantuvo en 55ºC. Se usó una combinación de los tres compañeros de
unión (VIIa)-(VIIc) descrita en el Ejemplo 1. La concentración de
cada uno de los compañeros de unión fue 6, 12, 25 o 50 nM.
Las platinas se lavaron durante 25 minutos en un
tampón TBS a pH 10. La temperatura de lavado fue 55ºC.
Como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados se dan en las Tablas 6A y 6B. La
definición del sistema de puntuación se da en el Ejemplo 3.
Los resultados indican que si se efectuaba la
hibridación durante un período de 5 minutos a 30 minutos, no se
observaba unión no específica. Es muy destacable que se obtuvo una
alta puntuación para la unión específica incluso con el muy corto
tiempo de hibridación de 5 minutos. Parece que esta puntuación sólo
se reducía ligeramente cuando se redujo la concentración del
compañero de unión de 50 a 6 nM. Sin embargo, se obtuvo una unión no
específica homogénea pálida a células y matriz intercelular
(puntuación (+)) con tiempos de hibridación mayores de 45 minutos.
Los resultados mostrados en las Tablas 6A y 6B indican que el
presente método es muy flexible con respecto a varios parámetros,
lo que hace realmente al método muy adecuado para un examen rápido
así como para ser parte de un sistema de ensayos mayor en los que
pueden ser más convenientes tiempos de hibridación mayores.
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Las condiciones de hibridación fueron como se ha
descrito en el Ejemplo 1 con la excepción de que el tiempo de
hibridación fue 15 minutos y la temperatura de hibridación fue 55ºC.
Se usaron en combinación los tres compañeros de unión descritos en
el Ejemplo 1, (VIIa)-(VIIc). La concentración de cada uno de los
compañeros de unión fue 50 nM.
Las platinas se lavaron en un tampón TBS a pH 10
a 55ºC, y el lavado se realizó de las tres formas siguientes: 1 x
25 minutos, 2 x 10 minutos o 3 x 5 minutos, respectivamente.
Como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los resultados se dan en las Tabla 7. El sistema
de puntuación es como se ha definido en el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Los compañeros de unión de fórmulas (VIIa),
(VIIb), (VIIc) o (VIIm) que comprenden restos polimerizados de
fórmula (VII) se sintetizaron como se ha descrito antes. Los
compañeros de unión usados comprendían 15 nucleobases
complementarias con las secuencias de la cadena ligera de Kappa. Las
secuencias de los compañeros de unión fueron como sigue:
en las que Flu indica una marca de
5-(y 6-)-carboxifluoresceína o isotiocianato de
fluoresceína y cada L designa una unidad enlazadora de
fórmula
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}(O)-.
Los compañeros de unión (VIIa), (VIIb) y (VIIc)
se usaron en combinación, y el compañero de unión (VIIm) se usó
separadamente. La concentración de cada compañero de unión fue 50 nM
o 20 nM, respectivamente. La solución de hibridación usada fue como
se ha descrito en el Ejemplo 1 con la excepción de que contenía 0% o
10% de sulfato de dextrano. La hibridación se realizó a 55ºC
durante 90 minutos.
El lavado post-hibridación se
realizó en un tampón TBS a pH 10,0 durante 25 minutos.
La detección de híbridos formados se realizó
como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran
después en las posteriores Tablas 8A (resultados obtenidos con una
combinación de compañeros de unión (VIIa), (VIIb) y (VIIc)) y 8B
(resultados obtenidos con el compañero de unión (VIIm)). La
definición del sistema de puntuación se da en el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon secciones de amígdalas humanas
normales como se ha descrito en el Ejemplo 1.
\newpage
Los compañeros de unión de fórmulas (VIIa),
(VIIb) y (VIIm) que comprenden restos polimerizados de fórmula
(VII) se sintetizaron como se ha descrito antes. Los compañeros de
unión usados comprendían 15 nucleobases complementarias con
secuencias de la cadena ligera de Kappa. Las secuencias de los
compañeros de unión fueron como sigue:
en las que Flu indica una marca de
5-(y 6-)-carboxifluoresceína o isotiocianato de
fluoresceína y cada L designa una unidad enlazadora de
fórmula
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}(O)-.
Los compañeros de unión se usaron en
combinación, y la concentración de cada compañero de unión fue 20
nM. La solución de hibridación usada fue como se ha descrito en el
Ejemplo 1 con la excepción de que la solución de hibridación no
contenía sulfato de dextrano o 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5% o 15% de
sulfato de dextrano, respectivamente.
El lavado post-hibridación se
realizó en un tampón TBS a pH 7,6 o a pH 10 durante 25 minutos.
La detección de híbridos formados se realizó
como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran
después en las posteriores Tablas 9A (resultados obtenidos usando un
tampón TBS a pH 7,6 como tampón de lavado
post-hibridación) y 9B (resultados obtenidos usando
un tampón TBS a pH 10,0 como tampón de lavado
post-hibridación). La definición del sistema de
puntuación se da en el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
12
Se infectan a menudo muestras clínicas de origen
eucariota con diferentes bacterias o virus. Por ejemplo, pueden
infectarse muestras de la uretra o la cerviz con C.
trachomatis o Neisseria gonorrhoea. Se seleccionaron
compañeros de unión dirigidos contra ARN ribosómico 16S y 23S de C.
trachomatis y se sintetizaron. Los compañeros de unión se marcaron
con una marca de fluoresceína.
La infección del linaje celular de ratón L929
con la cepa L_{1} de C. trachomatis se realizó por técnicas
estándares. Las células que contenían "inclusiones de células
completas" se untaron sobre platinas de microscopio de vidrio.
La preparación de muestra se fijó en acetona durante 10 minutos, se
secó al aire y se usó para la hibridación in situ
subsiguiente. Se usaron platinas preparadas de manera similar, pero
que contenían untes de células infectadas con C. pneumoniae,
para ensayar la especificidad de los compañeros de unión.
Se sintetizaron compañeros de unión de los que
uno estaba dirigido contra ARN ribosómico 16S de C. trachomatis
(VIIh) y tres estaban dirigidos contra ARN ribosómico 23S ((VIIi),
(VIIj) y (VIIk)). Los compañeros de unión estaban todos marcados
con una marca de fluoresceína como se muestra debajo. Las secuencias
se dan a continuación:
en las que Flu indica una marca de
5-(y 6-)-carboxifluoresceína o isotiocianato de
fluoresceína y cada L designa una unidad enlazadora de
fórmula
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-.
Los compañeros de unión se usaron separadamente
o en combinación. La solución de hibridación usada se describe en
el Ejemplo 1, con la excepción de que se añadió 0,1% de Triton
X-100® y de que la concentración de cada uno de los
compañeros de unión fue 100 o 500 nM. La hibridación se realizó a
55ºC durante 90 minutos.
Las platinas se lavaron en tampón TBS a pH 7,6 a
55ºC durante 25 minutos.
Las platinas se montaron usando un medio de
montaje adaptado para detección fluorescente y se examinaron por
microscopía fluorescente.
Los resultados se dan en la Tabla 10. La
definición del sistema de puntuación se da en el Ejemplo 3.
Como puede verse de los resultados, los
compañeros de unión se hibridaron con C. trachomatis pero no
con C. pneumoniae. Puede verse también que aumenta la unión
específica cuando los compañeros de unión se usan en combinación
(VIIh)-(VIIk). Además, no se observó unión no específica.
Ejemplo de referencia
13
Se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo
12 untes de células que contenían "inclusiones de células
completas" de C. trachomatis.
Se usaron en combinación los cuatro compañeros
de unión (VIIh)-(VIIk), como se ha descrito en el Ejemplo 12.
La solución de hibridación usada fue como se ha
descrito en el Ejemplo 1 con la excepción de que contenía además
0,1% de Triton X-100®. Además, la solución de
hibridación contenía 0% o 10% de sulfato de dextrano. La
concentración de cada uno de los compañeros de unión fue 100 o 500
nM, respectivamente. La hibridación se realizó a 55ºC durante 90
minutos.
Las platinas se lavaron en tampón TBS a pH 7,6 a
55ºC durante 25 minutos.
Las platinas se montaron usando un medio de
montaje adaptado para detección fluorescente y se examinaron por
microscopía fluorescente.
Los resultados se dan en la siguiente Tabla
11.
Se tomaron algodones de la uretra o la cerviz de
ocho pacientes que padecían infección por N. gonorrhoea. Las
muestras se evaluaron como positivas sobre la base de coloración con
azul de metileno y/o Gram.
Se prepararon untes de las muestras sobre
platinas de microscopio de vidrio y se fijaron a continuación por
fijación con llama.
Se sintetizaron como se ha descrito antes
compañeros de unión de fórmulas (VIIn) y (VIIp) que comprendían
restos polimerizados de fórmula (VII). Los compañeros de unión
comprendían 15 nucleobases complementarias de ARN de Neisseria
gonorrhoea ribosómico 16S, y fueron como sigue:
en las que Flu indica una marca de
5-(y 6-)-carboxifluoresceína o isotiocianato de
fluoresceína y L designa una unidad enlazadora de fórmula
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-.
Los compañeros de unión se usaron en
combinación. La concentración de cada compañero de unión fue 500 nM.
La solución de hibridación usada fue como se describe en el Ejemplo
1, con la excepción de que la solución contenía además 0,1% de
Triton X-100®. La hibridación se realizó a 55ºC
durante 90 minutos.
El lavado post-hibridación se
realizó en un tampón TBS a pH 7,6 durante 25 minutos.
Las platinas se montaron usando un medio de
montaje adaptado para detección fluorescente y se examinaron por
microscopía fluorescente.
Siete de las ocho muestras eran claramente
positivas porque las células de N. gonorrhoea podían identificarse
fácilmente. Además, en seis de estas siete muestras, se observaron
claramente diplococos intracelularmente en los granulocitos. Una
muestra fue negativa cuando se ensayó por este método.
Se prepararon untes de muestras como se ha
descrito en el Ejemplo 14.
Se sintetizaron como se ha descrito antes
compañeros de unión de fórmulas (VIIn) (VIIo) y (VIIp) que
comprendían restos polimerizados de fórmula (VII). Los compañeros
de unión comprendían 15 nucleobases en una secuencia complementaria
de ARN ribosómico de Neisseria gonorrhoea 16S. Las secuencias de los
compañeros de unión fueron como sigue:
en las que Flu indica una marca de
5-(y 6-)-carboxifluoresceína o isotiocianato de
fluoresceína y L designa una unidad enlazadora de fórmula
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-.
Los compañeros de unión se usaron en
combinación. La concentración de cada compañero de unión fue 100 nM.
La solución de hibridación usada fue como se describe en el Ejemplo
1, con la excepción de que se añadió a la solución 0,1% de Triton
X-100® y el contenido de sulfato de dextrano fue 0%
o 10%. La hibridación se realizó a 55ºC durante 90 minutos.
El lavado post-hibridación se
realizó en un tampón TBS a pH 7,6 durante 25 minutos.
Las platinas se montaron usando un medio de
montaje adaptado para detección fluorescente y se examinaron por
microscopía fluorescente.
Los resultados obtenidos se muestran en la
siguiente Tabla 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fijaron células HS-Sultan
infectadas con EBV recién cosechadas (5 x 10^{7} células/ml) o
células CEM T no infectadas (testigo negativo, 5 x 10^{7}
células/ml) en paraformaldehído al 1% durante 15 minutos a
temperatura ambiente (TA). La suspensión de células se centrifugó a
340 x g durante 5 minutos. Se separó el sobrenadante y, para
bloquear la actividad de ARNasa endógena, el glóbulo de células se
resuspendió en 2,5 ml de etanol del 70% al que se habían añadido 10
\mul de pirocarbonato de dietilo (DEPC) al 10% (el DEPC al 10% se
preparó en etanol del 70%). La suspensión de células se incubó a TA
durante 15 minutos, seguido por centrifugación a 340 x g durante 5
minutos. Se separó el sobrenadante y el glóbulo de células se
resuspendió en etanol del 70%/DEPC. La preparación suspendida se
guardó a -20ºC si no se usó inmediatamente para hibridación in
situ.
Para hibridación in situ, se mezclaron
100 \mul de la preparación suspendida con 1 ml de TBS. La
suspensión se centrifugó a 340 x g durante 5 minutos, se separó el
sobrenadante y el glóbulo se resuspendió en 0,5 ml de TBS que
contenía 5 \mul de Proteinasa K (DAKO, S3020). La suspensión se
incubó durante 10 minutos a 37ºC. Se añadió 1 ml de TBS a la
suspensión de células, y la suspensión se centrifugó a 340 x g
durante 5 minutos. Se separó el sobrenadante, y el glóbulo de
células se resuspendió en 1 ml de TBS. Después de centrifugar a 340
x g durante 5 minutos, se separó el sobrenadante y el glóbulo de
células se resuspendió en 100 \mul de TBS. Esta suspensión de
células se sometió a un tratamiento de prehibridación con la
solución de hibridación pero sin compañero de unión (se mezclaron
100 \mul de suspensión con 0,5 ml de solución de hibridación que
contenía 30% de formamida, 1 x TBST, 5% de sulfato de dextrano (TBST
es TBS que contiene 0,1% de Triton X-100)). Se
separó el sobrenadante después de centrifugar a 700 x g durante 5
minutos, y se usó el glóbulo para hibridación.
Se usó para hibridación un compañero de unión de
fórmula (VIIs) que comprende restos polimerizados de fórmula (VII).
El compañero de unión comprendía 15 nucleobases complementarias de
una secuencia de ARN nuclear de EBER codificada por EBV. La
secuencia del compañero de unión fue la siguiente:
en la que Bio indica una marca de
biotina, Lys designa una marca péptido de lisina y cada L designa
una unidad enlazadora de fórmula
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-.
La hibridación se realizó resuspendiendo el
glóbulo obtenido antes en 65 \mul de una mezcla de 30% de
formamida, 1 x TBST, 5% de sulfato de dextrano y compañero de unión
(VIIs) 500 nM. La muestra se incubó durante 1,5 h a 55ºC (baño de
agua).
Tras la hibridación, se añadió 1 ml de TBST
calentado a 55ºC y la muestra se centrifugó a 700 x g. Se separó el
sobrenadante, se resuspendió el glóbulo en 1 ml de TBST calentado a
55ºC y la muestra se incubó durante 45 minutos a 55ºC. La muestra
se centrifugó a 700 x g durante 5 minutos, se separó el sobrenadante
y se usó el glóbulo en la etapa de detección.
El glóbulo obtenido antes se resuspendió en 100
\mul de Estreptavidina/FITC (DAKO, F0422) diluido 1:50 en BSA
(albúmina de suero de bovino) al 1% en TBST. Se incubó la muestra en
la oscuridad durante 30 minutos a TA. Tras la incubación, se
añadieron 2 ml de TBST y la muestra se centrifugó a 700 x g durante
5 minutos. Se separó el sobrenadante y el glóbulo se resuspendió en
0,5 ml de TBST y se analizó en un instrumento Becton Dickinson
FACSort.
Con el procedimiento descrito antes, se observó
una relación de fluorescencia de FITC de 5,79 en una escala
logarítmica de 4 decenios entre las células positivas en EBV y las
células CEM negativas en EBV.
La detección de secuencias específicas
centrómeras puede usarse para determinar aberraciones numéricas de
cromosomas en, por ejemplo, diagnosis prenatal o diagnosis de
tumores.
Se prepararon extensiones de cromosoma en
metafase a partir de sangre periférica. Se añadió 1 ml de sangre
completa de hembra a 8 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 20%
(v/v) de suero de becerro fetal, glutamina 2 mM, 100 U de
penicilina/estreptomocina, 2% de fito-hemaglutinina
y 5 U/ml de heparina en un tubo de vidrio. La muestra se incubó en
un incubador de CO_{2} a 37ºC durante 72 horas. Los cromosomas se
detuvieron en la metafase de la mitosis añadiendo al cultivo
colcemida (0,1 \mug/ml) aproximadamente 30 minutos antes de
cosechar las células.
Las células se recogieron por centrifugación y
se resuspendieron en un tampón hipotónico (KCl 60 mM) a temperatura
ambiente durante aproximadamente 30 minutos. La muestra se lavó tres
veces con la mezcla fijativa metanol:ácido acético 3:1 a
temperatura ambiente. Después del último lavado, se fijó la muestra
en el fijativo a -20ºC durante 20 minutos. Se prepararon extensiones
de cromosoma manchando con una cantidad adecuada de la suspensión
una platina limpia y fría y secando al aire la platina.
Se sintetizó como se ha descrito antes un
compañero de unión de fórmula (VIIq) que comprende restos
polimerizados de fórmula (VII). El compañero de unión (VIIq)
comprendía 17 nucleobases complementarias con una secuencia de la
región centrómera HSSATX (obtenida de la base de datos Genebank) del
cromosoma X. La secuencia del compañero de unión fue la
siguiente:
en la que Bio indica una marca de
biotina y cada L designa
-NH(CH_{2}CH_{2}O)_{2}CH_{2}C(O)-. La
concentración del compañero de unión fue 100
nM.
Se cubrió cada una de las extensiones de
cromosoma secadas al aire (preparadas como se ha descrito antes)
con 15 \mul de solución de hibridación. La solución de hibridación
contenía 0,3 x SSC (NaCl 45 mM, citrato sódico 4,5 mM pH 7,0), 60%
de formamida v/v (Life Technologies, EE.UU., 55150B), 0,1% de Triton
X-100® y el respectivo compañero de unión. El
espécimen se cubrió con un cubreplatina con el fin de evitar la
evaporación y secado durante la incubación. Las platinas se
pusieron en una placa para calentar (Pactronic, Buch & Holm
A/S, Dinamarca) equilibrada a 60ºC y se incubaron durante 5 minutos
(la desnaturalización y la hibridación se realizan
simultáneamente).
Tras la desnaturalización e hibridación, se
quitaron los cubreplatinas, y se transfirieron las platinas a un
jarro con tampón de lavado de 0,1 x SSC (NaCl 15 mM, citrato sódico
1,5 mM pH 7,0) y 0,1% de Triton X-100®, y se
lavaron durante 5 minutos a 50ºC en un baño de agua con sacudidas
suaves.
Tras el lavado post-hibridación,
los híbridos formados se detectaron por incubación con
estreptavidina marcada con fluoresceína (DAKO F0422 diluido 1:50 en
tampón TBS pH 7,6) durante 10 minutos en una cámara húmeda a
temperatura ambiente. Después de la incubación, se sacó el conjugado
en exceso y las platinas se lavaron brevemente en agua desionizada
durante 1 minuto a temperatura ambiente.
Se montaron las platinas usando Vectashield
Mounting Medium (Vector H-1000) que contenía 0,5
\mug/ml de yoduro de propidio (Sigma). Se inspeccionaron las
platinas por microscopía fluorescente (Leica DM RB).
Se observaron dos manchas fluorescentes
verde/amarillas fuertes en cada extensión de cromosoma en el
espécimen correspondiente a los dos cromosomas X (los cromosomas se
reconocen fácilmente por fluorescencia roja) indicando unión
específica fuerte. No se observó unión no específica.
Se prepararon extensiones de cromosoma en
metafase como se ha descrito en el Ejemplo 17.
Se sintetizó como se ha descrito antes un
compañero de unión de fórmula (VIIr) que comprende restos
polimerizados de fórmula (VII). El compañero de unión (VIIr)
comprendía 17 nucleobases complementarias con una secuencia de la
región centrómera HSSATX (obtenida de la base de datos Genebank) del
cromosoma X. La secuencia del compañero de unión fue la
siguiente:
en la que cada Flu indica una marca
de 5-(y 6-)-carboxifluoresceína o isotiocianato de
fluoresceína. El compañero de unión de fórmula (VIIr) termina en un
extremo marcado ramificado ("cremallera") en el que la marca
está compuesta por una marca péptido (Ala y Lys) y una marca
fluorescente, a saber,
Flu-\betaAla-Lys-(Flu-
\betaAla)-.
La concentración del compañero de unión fue 100
nM.
Se cubrió cada una de las extensiones de
cromosoma secadas al aire (preparadas como se ha descrito antes)
con 15 \mul de solución de hibridación. La solución de hibridación
consistía en NaCl 10 mM (Merck, Alemania, 6404.5000), 10% de
sulfato de dextrano p/v (Sigma EE.UU., D-8906), 60%
de formamida v/v (Life Technologies, EE.UU., 55150B), 0,1% de
pirofosfato sódico, 0,2% de polivinilpirrolidona (P.M. 40000), 0,2%
de ficoll (P.M. 400000), Na_{2}EDTA 5 mM, Tris/HCl 0,05 M, pH 7,5
y el compañero de unión indicado antes.
El espécimen se cubrió con un cubreplatina con
el fin de evitar la evaporación y secado durante la incubación. Las
platinas se pusieron en una placa para calentar (Pactronic, Buch
& Holm A/S, Dinamarca) equilibrada a 60ºC y se incubaron
durante 5 minutos (la desnaturalización y la hibridación se
realizaron así simultáneamente).
Tras la desnaturalización e hibridación, se
quitaron los cubreplatinas, y se transfirieron las platinas a un
jarro con tampón de lavado de 0,1 x SSC (NaCl 15 mM, citrato sódico
1,5 mM pH 7,0) y 0,1% de Triton X-100®, y se
lavaron durante 5 minutos a 50ºC en un baño de agua con sacudidas
suaves.
Tras el lavado post-hibridación,
se lavaron las platinas durante 2 minutos en tampón TBS pH 7,6 a
temperatura ambiente seguido por un lavado breve en agua
desionizada durante 1 minuto a temperatura ambiente.
Se montaron las platinas usando Vectashield
Mounting Medium (Vector H-1000) que contenía 0,5
\mug/ml de yoduro de propidio (Sigma). Se inspeccionaron las
platinas por microscopía fluorescente (Leica DM RB).
Se observaron dos manchas fluorescentes
verde/amarillas fuertes en cada extensión de cromosoma en el
espécimen correspondiente a los dos cromosomas X (los cromosomas se
reconocen fácilmente por fluorescencia roja) indicando unión
específica fuerte. No se observó unión no específica.
Claims (22)
1. Un método para detectar una secuencia de
ácido nucleico específica en una muestra de origen humano usando
hibridación in situ, que comprende las etapas de:
(a) fijar la muestra,
(b) poner en contacto la muestra con una
solución de hibridación que comprende:
un compañero de unión capaz de hibridarse con la
secuencia de ácido nucleico específica a detectar para formar un
híbrido, comprendiendo el compañero de unión una cadena polímera que
contiene restos polimerizados que tienen una cadena principal no
cíclica y
un agente desestabilizante de híbrido en una
cantidad eficaz para disminuir la temperatura de fusión de híbridos
formados entre el ácido nucleico y el compañero de unión para
aumentar la relación entre la unión específica y la unión no
específica,
(c) separar cualquier compañero de unión no
unido y cualquiera no unido específicamente y
(d) detectar la presencia de compañero de unión
unido en la muestra,
en el que la concentración de agente
desestabilizante de híbrido en la solución de hibridación es
superior al 10% v/v.
2. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que la cadena polímera comprende restos polimerizados de fórmula
(I)
en la
que
Y designa O o S,
cada X designa independientemente O o S,
cada Q designa un ligando que es
independientemente una nucleobase de origen natural, una nucleobase
de origen no natural, un intercalador, un grupo de unión a
nucleobase, una marca o H,
u es un número entero de 1 a 5,
p y s designan independientemente 0 o 1,
q y r designan independientemente 0 o 1,
t designa 0 o 1,
R^{1} y R^{10} designan independientemente H
o alquilo C_{1-4},
R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6},
R^{7}, R^{8} y R^{9} designan independientemente H, la cadena
secundaria de un aminoácido de origen natural o la cadena secundaria
de un aminoácido de origen no natural.
\newpage
3. Un método según la reivindicación 2ª, en el
que u, p, q, r, s, Y, X y Q son como se ha definido en la
reivindicación 2ª, t es 0, R^{1} designa H o CH_{3}, R^{3},
R^{4}, R^{6} y R^{9} designan H, y R^{2}, R^{5}, R^{7}
y R^{8} designan independientemente H o la cadena secundaria de un
aminoácido de origen natural o la cadena secundaria de un
aminoácido de origen no natural.
4. Un método según la reivindicación 2ª, en el
que la cadena polímera comprende restos polimerizados de fórmula
(II), que son restos de fórmula general (I) en los que r es 0 y q y
s son 1,
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
Y, X, Q, p, t y u son como se ha definido en la
reivindicación 2ª,
R^{2}, R^{5} y R^{7} designan
independientemente H, la cadena secundaria de un aminoácido de
origen natural o la cadena secundaria de un aminoácido de origen no
natural, y R^{1} y R^{10} designan independientemente H o
CH_{3}.
5. Un método según la reivindicación 2ª, en el
que la cadena polímera comprende restos polimerizados de fórmula
(III), que son restos de fórmula general (I) en los que p, r y t son
0 y q y s son 1,
en la
que
Y, X, Q y u son como se ha definido en la
reivindicación 2ª,
R^{2}, R^{5} y R^{7} designan
independientemente H, la cadena secundaria de un aminoácido de
origen natural o la cadena secundaria de un aminoácido de origen no
natural.
6. Un método según la reivindicación 2ª, en el
que la cadena polímera comprende restos polimerizados de fórmulas
(IV)-(VI), que son restos de fórmula general (I) en la que p, r y t
son 0 y u, s y q son 1:
en las que R^{2}, R^{5} y
R^{7} designan H, la cadena secundaria de un aminoácido de origen
natural o la cadena secundaria de un aminoácido de origen no
natural, y cada Q designa independientemente una nucleobase de
origen natural, una nucleobase de origen no natural, un intercalador
o un grupo de unión a
nucleobase.
7. Un método según la reivindicación 6ª, en el
que R^{2}, R^{5} y R^{7} designan H o la cadena secundaria de
Ala, Asp, Cys, Glu, His, HomoCys, Lys, Orn, Ser o Thr, y Q designa
timina, adenina, citosina, guanina, uracilo o hipoxantina.
8. Un método según la reivindicación 2ª, en el
que la cadena polímera comprende restos polimerizados de fórmula
(VII) que son restos de fórmula (I) en la que p, r y t son 0 y u, s
y q son 1.
en la que Q designa timina,
adenina, citosina, guanina, uracilo o
hipoxantina.
9. Un método según alguna reivindicación
precedente, en el que la cadena polímera contiene de 8 a 30 restos
polimerizados.
10. Un método según alguna de las
reivindicaciones 6ª a 9ª, en el que los restos polimerizados de
fórmulas (IV)-(VII) constituyen al menos el 75% en peso de la
cadena polímera.
11. Un método según alguna reivindicación
precedente, en el que el agente desestabilizante de híbrido se
selecciona del grupo constituido por formamida, etilenglicol y
glicerol.
12. Un método según alguna reivindicación
precedente, en el que el agente desestabilizante de híbrido es
formamida con una concentración del 30% al 50%.
13. Un método según alguna de las
reivindicaciones 1ª a 11ª, en el que el agente desestabilizante de
híbrido es etilenglicol con una concentración del 50% al 65%.
14. Un método según alguna reivindicación
precedente, en el que la muestra de origen humano es una sección de
tejido, un unte de células, una suspensión de células o partes de
ellas o una extensión de cromosoma.
\newpage
15. Un método según alguna reivindicación
precedente, en el que el ácido nucleico a detectar comprende una
secuencia de ácido ribonucleico (ARN), preferiblemente ARN mensajero
(mARN).
16. Un método según alguna reivindicación
precedente, en el que el compañero de unión comprende además una o
más marcas que pueden ser idénticas o diferentes mutuamente.
17. Un método según la reivindicación 16ª, en el
que la marca se selecciona del grupo constituido por marcas
fluorescentes, biotina, digoxigenina, ácido dinitrobenzoico, marcas
péptidos, rodamina, R-ficoeritrina y colorantes de
cianina.
18. Un método según las reivindicaciones 16ª o
17ª, en el que al menos una marca es una marca fluorescente.
19. Un método según alguna reivindicación
precedente, en el que la etapa (c) comprende separar compañero de
unión no unido o unido no específicamente con un tampón de lavado a
pH alcalino.
20. Un método según la reivindicación 19ª, en el
que el tampón de lavado tiene un valor del pH de 8 a 10,5.
21. Un juego de diagnóstico de uso en un método
para detectar una secuencia de ácido nucleico específica en una
muestra de origen humano por hibridación in situ,
comprendiendo el juego
una solución de hibridación que comprende al
menos un compañero de unión capaz de hibridarse con una secuencia
de ácido nucleico específica a determinar para formar híbridos, y un
agente desestabilizante de híbrido en una cantidad eficaz para
disminuir la temperatura de fusión de híbridos formados entre dicho
ácido nucleico y dicho compañero de unión para aumentar la relación
entre unión específica y unión no específica, siendo dicho
compañero de unión una cadena polímera que contiene restos
polimerizados que tienen una cadena principal no cíclica, siendo la
cadena polímera capaz de hibridarse con la secuencia de ácido
nucleico a determinar, en el que la concentración del agente
desestabilizante de híbrido en la solución de hibridación es
superior al 10% v/v.
22. Un juego de diagnóstico según la
reivindicación 21ª, que comprende además uno o más de los
siguientes: un reactivo para preparación de muestra, un reactivo
para fijación de muestra, un reactivo para separar compañero de
unión no unido o unido no específicamente y un reactivo para
detectar un híbrido formado.
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