ES2367232T3

ES2367232T3 - Sondas de fret mejoradas y su uso.

Info

Publication number: ES2367232T3
Application number: ES08851189T
Authority: ES
Inventors: Jacobus Johannes Maria Van Dongen; José Alberto Orfao de Matos Correia E Vale
Original assignee: Erasmus University Medical Center
Current assignee: Erasmus University Medical Center
Priority date: 2007-11-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2011-10-31
Anticipated expiration: 2028-11-21
Also published as: ZA201003394B; WO2009067009A1; DK2210100T3; EP2210100B1; BRPI0819739A2; EA201000836A1; AU2008326922B2; ATE511649T1; KR20100105605A; JP2011505549A; CA2706477C; EP2210100A1; AU2008326922A1; US20120003632A1; KR101623992B1; CA2706477A1; CN101868728A

Abstract

Un conjunto de al menos una primera y una segunda sondas moleculares, siendo capaz cada sonda de unirse específicamente a una molécula de interés a través de su dominio de unión, estando provista cada sonda de un colorante, en que dichos colorantes conjuntamente permiten una transferencia de energía, estando adicionalmente provista cada sonda de un grupo reactivo que permite yuxtaponer dichas como mínimo primera y segunda sondas, en que dicho grupo reactivo permanece disponible para modular la organización espacial de sondas yuxtapuestas después de que la sonda se une a una molécula de interés, en que dicho grupo reactivo comprende un oligonucleótido y en que el grupo reactivo de dicha primera sonda no es directamente reactivo con el grupo reactivo de dicha segunda sonda y requiere una sustancia formadora de puente capaz de establecer un puente de al menos dos grupos reactivos para mediar y/o mejorar una estrecha yuxtaposición de dichas sondas.

Description

Esta invención se refiere a la detección, entre otras, de proteínas de fusión específicas para tumores e interacciones de proteínas. Más específicamente, la invención se refiere a técnicas que indican la presencia de una proteína de 5 fusión y/o proteínas interactuantes al nivel de células únicas.

El diagnóstico y la clasificación de enfermedades malignas se pasa frecuentemente en la detección de moléculas de proteínas específicas o conjuntos de moléculas de proteínas, así como en la detección de aberraciones oncogenéticas, principalmente al nivel del ADN o el nivel del ARN [1]. Los actuales estudios genómicos y proteómicos en células normales y malignas están extendiendo drásticamente la información sobre la expresión

10 génica y las aberraciones genéticas. Esto conduce al descubrimiento de múltiples redes de proteínas nuevas, que regulan las interacciones de célula a célula, la activación de células, trayectorias señalizadoras, proliferación, diferenciación, apoptosis y muchas otras funciones celulares normales y anormales. El desenrollado de estas redes de proteínas requiere la detección específica de la verdadera co-localización de las moléculas de proteínas individuales.

15 La clasificación de enfermedades malignas está basada particularmente en las características de alineación y diferenciación celular y en la presencia de aberraciones de cromosomas específicos. Muchas de estas aberraciones de cromosomas dan lugar a genes de fusión, es decir, genes acoplados de forma aberrante con la parte en dirección ascendente de un gen acoplada a la parte en dirección descendente del otro gen o viceversa [2-5]. Estos genes de fusión son transcritos en forma de transcriptos de genes de fusión y traducidos en forma de proteínas de fusión

20 (figura 1) que se supone que desempeñan una fusión importante en el procedimiento oncogénico. Hasta ahora, se han descrito más de cien tipos diferentes de genes de fusión en leucemias, linfomas y tumores sólidos. Se citan ejemplos de proteínas de fusión en la Tabla 1.

Consecuentemente, la detección fiable de estas proteínas de fusión específicas para tumores al nivel de células únicas sería una etapa principal para el diagnóstico y clasificación de pacientes de cáncer, así como para la

25 comprobación de la desaparición de células malignas durante el tratamiento, como una medida de la eficacia del protocolo de terapia aplicada.

TABLA 1. Ejemplos de proteínas de fusión en enfermedades malignas3, que pueden ser detectadas a través de la tecnología FRET usando el sistema conector de nucleótidos para una yuxtaposición estrecha y estable de anticuerpos diferencialmente marcados

Enfermedad maligna: Aberración de cromosomas Proteína de fusión

Leucemia mieloide crónica: t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL

Linfoma: t(2;5)(p23;q35) NPM-ALK

Cáncer de próstata: t(21;21)(q22.3;q22.2) TMPRSS2-ERG

Sarcoma de Ewing: t(11;22)(q24;q12) EWSR1-FLI1

Carcinoma de células renales papilares: t(X;1)(p11;q23) PRCC-TFE3

Carcinoma de tiroides folicular: t(2;3)(q13;p25) PAX8-PPARG

Sarcoma de tejidos blandos fibromixoides: t(7;16)(q33;p11) FUS-CREB3L2

Carcinoma estromal endometrial: t(7;17)(p15;q11) JAZF1-SUZ12

Enfermedad maligna: Aberración de cromosomas Proteína de fusión

Condrosarcoma de tejidos blandos: t(9;22)(q31;q12) EWSR1-NR4A3

Tumor de células redondas pequeñas desmoplásticas: t(11;22)(p13;q12) EWSR1-WT1

Carcinoma escasamente diferenciado que afecta a estructuras de línea media: t(15;19)(q14;p13) BRD4-NUT

5

10

15

20

25

30

35

40

Inicialmente, los científicos intentaron generar anticuerpos específicos para proteínas de fusión, preparando anticuerpos contra los epitopos de fusión de las proteínas de fusión. Este intento ha sido escasamente satisfactorio y, si se obtenían anticuerpos específicos, generalmente no eran aplicables en una microscopía de fluorescencia o citometría de flujo [6-8]. Por ejemplo, el anticuerpo ER-FP1 contra la proteína de fusión BCR-ABL p190 funciona bastante bien en la transferencias Western, pero no fue satisfactorio en estudios microscópicos sobre leucemias positivas a BCR-ABL humanas [6,7].

A pesar de estos problemas iniciales, la detección específica de proteínas de fusión ha resultado posible a través de la aplicación de un anticuerpo captor contra una parte de la proteína de fusión y un anticuerpo de detección marcado contra la otra parte de la proteína. En estos sistemas, el anticuerpo captor se une a una capa sólida, como una varilla, una placa de ensayo ELISA o gránulos que pueden ser analizados mediante citometría de flujo [9]. Aunque son refinados y fáciles de realizar, estos sistemas usan lisados celulares y, consecuentemente, no permiten la detección de proteínas de fusión intracelulares al nivel de células únicas.

Una interacción estrecha entre dos proteínas de unión a membranas y/o intracelulares diferentes, o la presencia de proteínas de fusión, pueden ser investigadas mediante el uso de anticuerpos que estén conjugados o unidos a fluorocromos que sean adecuados para una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). La tecnología FRET está basada en la yuxtaposición de dos fluorocromos diferentes (con diferentes longitudes de onda de excitación) de los que un fluorocromo produce una luz de emisión que excita al otro fluorocromo (figura 2). Si la luz de emisión del segundo fluorocromo puede ser detectada mediante citometría de flujo, esto permite un análisis sencillo y rápido de las redes de proteínas y la detección de proteínas de fusión al nivel de células únicas. Usando, por ejemplo, una microscopía de exploración por láser con focal, resulta posible evaluar la posición subcelular precisa de la proteína interactuante y las proteínas de fusión.

La co-localización aproximada de dos anticuerpos conjugados a fluorocromos FRET no es suficiente para la transferencia de energía luminosa necesaria. Se necesita la verdadera co-localización de las proteínas detectadas es necesaria, por lo que se produce la yuxtaposición estrecha de los fluorocromos unidos a dos anticuerpos diferentes (generalmente < 80 Å, pero preferentemente, <50 Å, lo más preferentemente <10 Å), lo que es esencial para una eficaz transferencia de energía luminosa.

Se ha descrito previamente que la tecnología FRT es usada para detectar la presencia de una proteína de fusión (documento WO 2004/042398) o para detectar interacciones de proteínas (documento (WO 2004/042404) en una célula usando un conjunto de sondas específicamente diseñadas. Según los documentos WO 2004/042398 y WO 2004/042404, cada sonda está provista de un colorante, en que dichos colorantes conjuntamente permiten la FRET y al menos una sonda está provista de un grupo reactivo. La adición de un reactivo de “puente” capaz de unirse a los grupos reactivos permiten yuxtaponer la primera y segunda sondas, de forma que hay una probabilidad aumentada de transferencia de energía entre los colorantes FRET. El documento WO 2004/042398, por ejemplo, describe un conjunto de sondas A y B de anticuerpos dirigidas contra fragmentos A y B de una proteína de fusión A-B, en que A y B están marcados con diferentes colorantes FRET y en que A y B están provistos de grupos reactivos de biotina capaces de unirse a una sustancia formadora de puente de (estrept)avidina. Tras la adición de la sustancia formadora de puente a los grupos reactivos, la organización espacial de las sondas de anticuerpos es modulada a través de los grupos reactivos. Esto permite que los colorantes FRET individuales que están unidos a las sondas entren en una distancia de unos a otros que permita que se produzca la FRET, es decir, dentro de aproximadamente 80-100 Angstrom una de otra. Aunque las sondas y los métodos de los documentos WO 2004/042398 y WO 2004/0 42404 pueden producir generalmente resultados satisfactorios, los presentes inventores buscaron mejorar adicionalmente el concepto. En particular es un objetivo de la presente invención aumentar la sensibilidad de

métodos basados en FRET para detectar proteínas de fusión y proteínas interactuantes.

Este objetivo se cumplió mediante la realización de restos de oligonucleótidos que son altamente adecuados para portar los fluorocromos FRET en una yuxtaposición estrecha y estable, de forma que se pueda producir la FRET con una gran eficacia. El tamaño pequeño de los oligonucleótidos permite solamente una separación mínima entre los colorantes yuxtapuestos. Además de ello, pueden ser diseñadas secuencias de oligonucleótidos complementarias para conseguir interacciones intermoleculares altamente específicas y fuertes. Por tanto, los inventores identificaron oligonucleótidos (por ejemplo, moléculas de ADN o APN o LNA) como excelentes grupos reactivos y sustancias de puente para mediar y/o mejorar la yuxtaposición estrecha de sondas marcadas con colorantes.

La invención en su alcance más amplio se define en la reivindicación independiente 1:

Un conjunto de al menos una primera y una segunda sondas moleculares, siendo capaz cada sonda de unirse específicamente a una molécula de interés a través de su dominio de unión, estando provista cada sonda de un colorante en que dichos colorantes conjuntamente permiten una transferencia de energía estando adicionalmente provista cada sonda de un grupo reactivo que permite yuxtaponer dicha primera y segunda sondas, en que dicho primer grupo reactivo permanece disponible para modular la organización espacial de sondas yuxtapuestas después de que la sonda se une a una molécula de interés en que dicho grupo reactivo comprende un oligonucleótido y en que el grupo reactivo de dicha primera sonda no es directamente reactivo con el grupo reactivo de dicha segunda sonda y requiere una sustancia formadora de puente capaz de establecer un puente de al menos dos grupos reactivos para mediar y/o mejorar una estrecha yuxtaposición de dichas sondas.

El grupo reactivo de dicha primera sonda no es directamente reactivo con el grupo reactivo de dicha segunda sonda. Esto es necesario para evitar falsas señales positivas generadas por una auto-asociación no deseada entre las sondas.

Las reivindicaciones independientes 8, 10, 12, 17, y 19 se refieren todas nuevamente a la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas están definidas en las reivindicaciones dependientes 2-7, 9, 11, 13-16 y 18.

El principio que subyace en la presente invención se ilustra esquemáticamente en la figura 3. Una primera sonda molecular (anticuerpo A) está provista de colorante X FRET y con al menos un grupo reactivo, comprendiendo o consistiendo dicho grupo reactivo en un oligonucleótido (nucleótido A). El grupo reactivo es capaz de unirse específicamente a una sustancia formadora de puente (nucleótido C) que comprende o consiste en una secuencia de ácidos nucleicos, parte de la cual es complementaria respecto a la secuencia de al menos un fragmento del nucleótido A. El nucleótido C es también complementario respecto a al menos parte de la secuencia del grupo reactivo (nucleótido B) de una segunda sonda molecular (anticuerpo B) proporcionada con el colorante Y FRET. Los colorantes X e Y forman conjuntamente un par FRET. Solamente si la primera y segunda sondas están en una estrecha proximidad una de otra (por ejemplo, porque estén unidas a epitopos adyacentes de una proteína de fusión A-B como se muestra en la figura) o a epitopos en moléculas interactuantes), los grupos reactivos de oligonucleótidos (nucleótidos A y B) están suficientemente próximos conjuntamente para que la sustancia formadora de puente (nucleótido C) se una a los grupos reactivos tanto de la primera como de la segunda sonda. Esta interacción reducirá y estabilizará la distancia entre los dos colorantes de unión a sondas, de forma que puede ser detectada la señal FRET.

La eficacia de la transferencia de energía FRET es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el colorante donante y el colorante aceptor. El tamaño muy pequeño de los grupos reactivos de oligonucleótidos y la sustancia formadora de puente del sistema conector de oligonucleótido, como se describe en la presente memoria descriptiva, permite una proximidad muy estrecha de los colorantes (por ejemplo, de 10 Angstrom), dando lugar a una señal de fluorescencia mucho más fuerte en comparación con el uso de grupos reactivos proteináceos y una sustancia formadora de puente, como se describe en los documentos WO 2004/042398 o WO 2004/042404. Además de ello, el reconocimiento de pares de bases entre las secuencias complementarias del grupo reactivo y la sustancia formadora de puente, aunque no entre los propios grupos reactivos, proporciona un grado elevado de especificidad.

En esta aproximación FRET con tres moléculas de oligonucleótidos como sistema conector estabilizante, las células son sometidas normalmente a un marcado intracelular con las dos sondas como mínimo que portan cada una un grupo reactivo oligonucleótido, seguido de un lavado (enérgico) y una posterior incubación con el oligonucleótido de puente específicamente diseñado para obtener una unión estrecha y estable de los dos anticuerpos reactivos. En una realización preferida, cada una de las sondas está provista de una multiplicidad de grupos reactivos, como 2-6 oligonucleótidos, que son reactivos cada uno con un oligonucleótido de puente. Dichos grupos reactivos presentes en una única sonda pueden ser iguales o diferentes unos de otros.

Como se usan en la presente memoria descriptiva, “oligonucleótido del grupo reactivo” y “grupo reactivo oligonucleótido” se usan de forma intercambiable, salvo que se indique otra cosa. También, “oligonucleótido de

puente” y “sustancia formadora de puente de oligonucleótido” se refiere a la misma entidad.

El término “oligonucleótido”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una extensión de ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos unidos en una cadena larga. La longitud total del oligonucleótido puede variar, dependiendo, entre otras cosas, de la naturaleza del ácido nucleico o análogo de ácido nucleico. En una realización, un oligonucleótido consiste en una extensión de 5-50, preferentemente 10-30 ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos unidos en una cadena larga. Un ácido nucleico es, por ejemplo, un nucleótido que comprende una base nitrogenada (A, G, T o C en ADN; A, G, U o C en ARN), un resto de fosfato con carga y un resto de un azúcar (desoxirribosa en ADN y ribosa en ARN).

Las longitudes adecuadas para los oligonucleótidos unidos a sondas (es decir, los grupos reactivos) incluyen los que consisten en al menos 8 residuos de ácidos nucleicos, preferentemente 10-18 ácidos nucleicos o análogos. Las longitudes de los grupos reactivos de oligonucleótidos en las respectivas sondas pueden ser diferentes o iguales. En una realización, son de la misma longitud, como 10-15, preferentemente 10-12 ácidos nucleicos o análogos. El oligonucleótido de puente generalmente será más largo que los oligonucleótidos de los grupos reactivos. En una realización, el oligonucleótido de de puente o conector consiste en 15-40 ácidos nucleicos o análogos de los mismos, por ejemplo 18-30, como desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 25.

En una realización preferida, el oligonucleótido es un oligómero de ácido nucleico péptido (APN). El APN es análogo al ADN o ARN pero difiere en la composición de su “cadena principal”. EL ADN y el ARN tienen una cadena principal de azúcares de desoxirribosa y ribosa, respectivamente, mientras que la cadena principal del APN está compuesta por unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina unida mediante enlaces péptidos. Las diversas bases de purina y pirimidina están unidas a la cadena principal mediante enlaces de metileno-carbonilo. Los APN son expuestos normalmente como péptidos, con el N terminal en la primera posición (izquierda) y el C terminal a la derecha.

El análogo de ácido nucleico APN no se conoce que se produzca de forma natural en la vida existente en la tierra, pero puede ser sintetizado de forma artificial. Ha sido usado en diversos sectores de la investigación biológica y tratamientos médicos. Los oligómeros de ácidos nucleicos péptidos sintéticos han sido usados en los últimos años en procedimientos de biología molecular, ensayos de diagnósticos y terapias de anti-sentido. Como la cadena principal del APN no contiene grupos fosfatos con carga, la unión entre las cadenas APN/ADN es más fuerte que entre cadenas de ADN/ADN debido a la ausencia de una regulación electrostática. Los experimentos anteriores con cadenas de homopirimidina (cadenas que consisten solamente en una base de pirimidina repetida) han mostrado que la Tf (temperatura de “fusión”) de una hélice doble de timidina-APN/adenina-ADN de 6 bases era de 31ºC en comparación con un dúplex equivalente de ADN/ADN de 6 bases que se desnaturaliza a una temperatura de menos de 10ºC. Las moléculas de APN de bases mixtas son verdaderos emuladores de moléculas de ADN en términos de reconocimiento de pares de bases.

Los oligómeros de APN también muestran una mayor especificidad en la unión a ADN complementarios, siendo la coincidencia de bases de APN/ADN más desestabilizante que una falta de coincidencia similar en un dúplex de ADN/ADN. Esta resistencia del enlace y la especificidad se puede aplicar también a dúplex de APN/ARN. Los APN no son fácilmente reconocidos por nucleasas ni proteasas, lo que los hace resistentes a la degradación enzimática. Los APN son estables también en un amplio intervalo de pH. Finalmente, su naturaleza inalterada hace que sea más fácil la reticulación a través de membranas celulares, lo que puede mejorar adicionalmente su valor para la presente invención, que incluye la detección de una proteína de fusión en células intactas. En un aspecto, se usa un oligonucleótido de APN que consiste en aproximadamente 10 a 16, por ejemplo 12-15 unidades de APN como un oligonucleótido de grupo reactivo, opcionalmente en combinación con un oligonucleótido de puente que consiste en 20-30 unidades de APN. En un aspecto específico, las secuencias de APN unidas a la sonda, consisten cada una en 10-12 unidades de APN complementarias a un oligonucleótido de puente que consiste en 20-25, por ejemplo, 21 unidades de APN.

Todavía, en otra realización el oligonucleótido comprende ácidos nucleicos bloqueados (LNA®). El LNA es un nuevo tipo de análogo de ácido nucleico que contiene un puente de metileno 2’-O, 4’-C. Este bloqueo mediante puente en la conformación 3’-endo restringe la flexibilidad del anillo de ribofuranosa y bloquea la estructura en una formación bicíclica rígida, confiriendo un rendimiento de hibridación mejorado y una excepcional estabilidad biológica.

Como se entenderá por un experto en la técnica, para los grupos reactivos y sustancias de puente pueden ser usadas diversas combinaciones diferentes de tipos de oligómeros de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, LNA, APN). La interacción de afinidad específica y elevada entre un grupo reactivo y una sustancia formadora de puente se puede efectuar a través de la formación de un homodúplex (por ejemplo, ADN/ADN, APN/APN) o heterodúplex (por ejemplo, ADN/APN). En una realización, un conjunto de sondas de la invención comprende al menos una primera y una segunda sonda, estando provista cada sonda de un oligonucleótido distinto como grupo reactivo, en que dicho oligómero de ácido nucleico es un oligómero de desoxirribonucleótido (ADN). Estos grupos reactivos de ADN pueden ser agrupados en diferentes tipos de sustancias de puente, por ejemplo, una sustancia formadora de puente de ADN (homodúplex) o APN (heterodúplex). Alternativamente, los grupos reactivos comprenden una secuencia de oxirribonucleótido (ARN) que puede ser reorganizada y unida mediante una sustancia formadora de puente de RN (homodúplex) o APN (heterodúplex). Es posible también usar un homodúplex entre una sustancia formadora de puente y el grupo reactivo de al menos una primera sonda y un heterodúplex entre la sustancia de puente y al menos una segunda sonda, por ejemplo, la sonda A está provista de un grupo reactivo de APN y la sonda B con un grupo reactivo de ADN o ARN, siendo capaces ambos grupos de ser agrupados mediante una sustancia formadora de puente de APN.

El alcance o grado de complementaridad entre el oligonucleótido de puente y uno cualquier de los grupos activos de oligonucleótidos puede variar, en la medida en que permita un puente específico y estable, en una realización, hay una complementaridad, (es decir, emparejamiento de bases) entre un grupo reactivo y una sustancia formadora de puente sobre una extensión de al menos 5, preferentemente al menos 7 ácidos nucleicos o análogos consecutivos. Como se entenderá, el grupo reactivo de oligonucleótido de la primera sonda no es directamente reactivo con el grupo reactivo de oligonucleótido de la segunda sonda, con el fin de evitar la asociación en la corteza de las sondas y que se produzca una transferencia prematura de energía entre los colorantes unidos. Esto es importante para asegurar que una señal FRET refleja verdaderamente sondas yuxtapuestas.

En una realización, la sustancia formadora de puente comprende una primera secuencia que es complementaria respecto al menos parte de un primer grupo reactivo de oligonucleótido y una segunda secuencia que es complementaria respecto al menos parte de un segundo grupo reactivo de oligonucleótido, en que la primera y segunda secuencias están separadas por al menos un ácido nucleico o análogo. Por ejemplo, están separadas por unos pocos, por ejemplo 1-10, tal como 2, 3, 4 ó 5 ácidos nucleicos. Es preferida una separación de 1-3. En otra realización, las secuencias complementarias están separadas por 1 o más residuos de aminoácidos, preferentemente 1-2 residuos aminos pequeños como residuos de glicina.

Sin embargo, también es posible que la complementaridad de la secuencia respecto al menos parte de un grupo reactivo de oligonucleótido de una primera sonda esté directamente flanqueada, sin separación, por la secuencia complementaria respecto al menos parte de un grupo reactivo de oligonucleótido de una segunda sonda. Es preferido que las dos terminaciones del oligonucleótido de puente estén diseñadas para participar en la unión de los grupos reactivos de oligonucleótidos, de forma que no haya “terminaciones libres” de cadena única.

Además, las secuencias de oligonucleótidos deben ser seleccionadas de forma que no estén reticuladas con secuencias de nucleótidos endógenas de la célula en la que va a ser detectada la proteína de fusión. Por tanto, cuando se diseña cualquiera de las secuencias usadas para la práctica de la invención, la complementaridad con secuencias de ADN y/o ARN endógenos (por ejemplo, humanos) debe ser minimizada o incluso completamente evitada con el fin de evitar un bloqueo o depuración no deseados de los oligonucleótidos.

En una realización se proporciona una primera sonda, por ejemplo, a través de un conector con un oligonucleótido de grupo reactivo que consiste en la secuencia 5’-CGA TTC TAT G-3’ pudiendo ser proporcionada una segunda sonda, por ejemplo, también, a través de un conector, con un oligonucleótido de grupo reactivo que comprende la secuencia 5’-TGT ACC TTG A-3’. Este conjunto de sondas se usa ventajosamente en combinación con un oligonucleótido de puente que comprende o consiste en la secuencia 5’-TGA DGG TAC A Gly Gly CAT AGA ATC G3’. Sin embargo, el experto en la técnica comprenderá que la presente invención se puede poner en práctica usando cualquier conjunto de secuencias, ADN, ARN, APN o cualquier combinación de los mismos, y permita una suficiente resistencia de la unión y una especifidad de la unión entre la sustancia formadora de puente y las respectivas sondas.

Una sonda molecular es capaz de unirse específicamente a una molécula biológica de interés a través del denominado dominio de enlace. A continuación de la unión de al menos una primera y una segunda sonda a una molécula de interés a través del dominio de unión, se usa un grupo reactivo para modular la yuxtaposición. Un grupo reactivo de oligonucleótido permanece disponible para modular la organización espacial de las sondas yuxtapuestas después de que la sonda se une a una molécula de interés. En una realización, dicha molécula de interés es una proteína, preferentemente una proteína de fusión, más preferentemente de una proteína de fusión oncogénica. Es particularmente preferido un conjunto de una primera y una segunda sondas moleculares en que cada sonda es capaz de reconocer y unirse a un sitio de unión (epitopo) ubicado en los lados opuestos de la región de fusión de dicha proteína de fusión. Naturalmente, cuando se usa un conjunto de sondas en el que cada sonda se une a un epitopo diferente de una molécula de interés (por ejemplo, epitopos en el lado terminal de C y N de la región de fusión de una proteína de fusión), dichos epitopos diferentes no deben interaccionar unos con otros de una forma inter-o intra-molecular, porque obviamente esto interferiría con la unión de la sonda. Por lo tanto, diferentes sondas dentro de un conjunto de sondas son capaces de unirse a epitopos diferentes que no interaccionan esencialmente. Siempre que las sondas reconozcan los sitios de unión (epitopos) dentro de una distancia pequeña de una respecto a la otra, la mera unión de las sondas a una proteína de fusión o a moléculas interactuantes, en teoría podría dar lugar a una transferencia de energía entre los colorantes. Sin embargo, mediante “agrupamiento” de grupos reactivos yuxtapuestos mediante una sustancia formadora de puente, puede ser modulada la organización espacial de los colorantes, de forma que aumente enormemente la probabilidad de transferencia de energía.

La presente invención proporciona también un estuche de diagnóstico que comprende un conjunto de sondas según la invención. En una realización preferida, el estuche de ensayo comprende adicionalmente una sustancia formadora de puente de oligonucleótido que tiene una secuencia que es complementaria respecto al menos parte del grupo reactivo de oligonucleótido de la primera sonda, y que es complementaria respecto al menos parte del oligonucleótido de la segunda sonda. Por ejemplo, este estuche de ensayo puede ser usado para verificar y cuantificar células malignas, células leucémicas, a través de la detección de células positivas para proteínas de fusión específicas de tumores. El estuche de ensayo de diagnóstico proporcionado en la presente invención es útil en el momento del diagnóstico, así como durante y después del tratamiento, para evaluar la eficacia del protocolo de tratamiento de cáncer aplicado.

Un aspecto adicional se refiere a un método para usar un conjunto de sondas para detectar la presencia de una proteína de fusión o moléculas interactuantes (proteináceas) El diagnóstico y/o clasificación de una enfermedad, así como antes, durante y después del tratamiento de una enfermedad para evaluar la eficacia de dicha tratamiento.

Se proporciona también un método para producir un conjunto de sondas según la invención, que comprende poner en contacto cada sonda con un grupo reactivo de oligonucleótido para formar un conjugado entre dicha sonda y dicho grupo reactivo y purificar dicho conjugado. El oligonucleótido del grupo reactivo puede esta unido a la sonda directamente o indirectamente, por ejemplo, a través de un resto separador o conector. También, el colorante FRET puede estar unido a la sonda directamente o indirectamente, por ejemplo, a través del grupo reactivo. En una realización preferida, una sonda comprende al menos un grupo reactivo de oligonucleótido, en que el grupo reactivo está provisto de un colorante FRET (véase la Fig. 3B). El grupo reactivo de oligonucleótido puede estar acoplado directamente o indirectamente a la sonda. El grupo reactivo puede estar provisto de un colorante FRET antes o después de su conjugación a una sonda.

Una realización preferida de la invención, un conjunto de sondas comprende un conjunto de al menos dos anticuerpos conjugados a oligonucleótidos de colorantes siendo capaz cada anticuerpo de reconocer un sitio de unión ubicado en lados opuestos de la región de fusión de una proteína de fusión o en moléculas interactuantes distintas, por ejemplo, proteínas, en un complejo proteico. Un anticuerpo adecuado comprende un anticuerpo convencional (poli-o mono-clonal) o sintético o un fragmento de unión funcionalmente equivalente al mismo, como un Fab’, Fab, un fragmento FV de cadena única, un diacuerpo (un dímero Fv de cadena única) y similares. Por ejemplo, una proteína de fusión quimérica A-B puede ser detectada a través de FRET usando un conjunto de sondas conjugadas a colorantes, por ejemplo, un anticuerpo anti A y un anticuerpo anti B. En una realización preferida se pone en contacto una muestra con dos anticuerpos, una contra el dominio A y la otra el dominio B de una proteína de fusión, para detectar la presencia de una proteína de fusión A-B en una muestra de células. Un anticuerpo es marcado (preferentemente a través de su grupo reactivo) a través de un colorante donante de FRET y el otro con un colorante aceptor de FRET. Solamente cuando el dominio A está en estrecha proximidad al dominio B, por ejemplo, cuando ambos son parte de la misma molécula de proteína, los dos anticuerpos resultan suficientemente próximos conjuntamente (“yuxtapuestos”), lo que permite lo que el par donante/aceptor induzca una señal de florescencia de FRET detectable.

En el presente contexto, la expresión “grupo reactivo” se refiere a un resto que permite modular la organización espacial de colorantes FRET, de forma que hay un aumento en la probabilidad de que se produzca una transferencia de energía yo un aumento en la eficacia de la transferencia de energía. La organización espacial se refiere tanto a la distancia entre los colorantes como a su orientación relativa. La modulación de la organización espacial incluye ajustar y estabilizar la organización espacial de los colorantes. Una de las condiciones principales para que se produzca la transferencia de energía es que las moléculas donantes y aceptoras deben estar en una estrecha proximidad, normalmente 10-100 Å. En una realización preferida, un grupo reactivo permite yuxtaponer dichos colorantes en una distancia de 50 Å uno de otro, más preferentemente en 20 Å uno de otro, pero, lo más preferentemente, en una distancia de 10 Å uno de otro.

En el presente contexto, el término “colorante” se refiere a un sustituyente que, de forma concertada con otro colorante, puede ser usado para un análisis de transferencia de energía, como un análisis FRET. Como se mencionó anteriormente, el FRET está basado habitualmente en la interacción entre colorantes donantes y aceptores que son ambos fluorescentes. En una realización, la invención usa un conjunto de sondas, en el que al menos uno de dichos colorantes es un fluorocromo. Sin embargo, puede ser usado también un aceptor no fluorescente y la FRET es detectable inactivando la fluorescencia donante. Como se ha dicho, la detección de la FRET verificando una disminución en la fluorescencia del donante como una consecuencia de sondas yuxtapuestas a menudo no es tan sensible como detecta un aumento en la fluorescencia del aceptor. Por tanto, en una primera realización, se usan al menos dos sondas marcadas por fluorescencia para detecta una proteína de fusión, como se ilustra en la descripción detallada. Ejemplos de fluorocromos preferidos son los adecuados para un análisis mediante citometría de flujo convencional e incluyen marcadores de fluoresceína, por ejemplo, 5-( y 6)-carboxifluoresceína, 5

o 6-carboxifluoresceína, ácido 6-(fluoresceína)-5-(y 6)-carboxamida-hexanoico e isotiocianato de fluoresceína, colorantes AlexaFluor® como AlexaFluor 488® o AlexaFluor 594®, colorantes de cianina como Dy2, Cy3, Cy5, Cy7, cumarina opcionalmente sustituida, R-ficoeritrina, aloficoeritrina, Texas Red y Princeston Red, así como conjugados de R-ficoeritrina y, por ejemplo, Cy5 o Texas Red y miembros de las ficoliproteínas. Otros colorantes de interés son colorantes de puntos cuánticos, que entran en una gama casi ilimitada de colores. Una información intensiva sobre

5

15

25

35

45

pares de donantes/aceptores adecuados para una detección de transferencia de energía mediante citometría de flujo se puede encontrar en la publicación Szollosi et al18. Las combinaciones referidas de fluorocromos comprenden los colorantes usados en los conjugados tándem clásicos, también denominados duocromos19. En una realización preferida se proporcionan sondas con un conjunto de colorantes que son usados en la tecnología LightCycler, como fluoresceína en combinación con LCRed640® o LCRed705®.

También se proporciona en la presente invención un método para detectar la presencia de una proteína de fusión en una célula usando un conjunto de al menos una primera y una segunda sondas moleculares, siendo capaz cada sonda de reconocer un sitio de un sitio de unión (a través de su dominio de unión) colocado en lados opuestos de la región de fusión de dicha proteína de fusión, estando adicionalmente provista cada sonda de un colorante, en que dichos colorantes permiten conjuntamente una transferencia de energía, estando provista al menos una sonda al menos de un grupo reactivo de oligonucleótido que permite modular la yuxtaposición de dichas al menos primera y dicha segunda sonda, de forma que haya una probabilidad aumentada de transferencia de energía entre dichos colorantes, que comprende proporcionar un conjunto de sondas, proporcionar una muestra que comprende una célula, poner en contacto dicha muestra con dichas sondas bajos condiciones que permitan yuxtaponer dichas sondas en dicha proteína de fusión, suprimir cualquier sonda no unida y no específicamente unida y detectar la yuxtaposición de dichas sondas a través de FRET para determinar la presencia de dicha proteína de fusión.

En una realización, Se proporciona una sonda con más de un grupo reactivo de oligonucleótido, que hace posible que dicha sonda interaccione con más de una sustancia formadora de puente. La provisión de una sonda con más de un grupo reactivo aumentará teóricamente la probabilidad de una interacción entre dicha sonda y una sustancia formadora de puente.

Seguidamente, la invención proporciona un método para detectar una proteína de fusión al nivel de una célula única usando un conjunto de sondas según la invención, siendo capaz cada sonda de unirse a un sitio de unión colocado en lados opuestos de una región de fusión de dicha proteína de fusión a través del dominio de unión de la sonda, es decir, una sonda es dirigida contra un fragmento de proteína que comprende el fragmento N-terminal de una proteína de fusión y otra sonda es dirigida contra un fragmento de proteína que comprende el fragmento C-terminal de la misma proteína de fusión. Una proteína de fusión comprende cualquier clase de sustancia proteinácea que se forme después de la transcripción y traducción de un gen de fisión. Un gen de fusión comprende una parte de uno o más genes combinados con otro gen o una parte derivada del mismo. Una proteína de fusión puede ser el resultado de una translocación, inversión o deleción cromosomal. En una realización preferida, se usa un método proporcionado para detectar una proteína de fusión específica de un tumor. Una proteína de fusión puede ser una proteína endógenamente expresada o puede ser el resultado de un tratamiento de ingeniería genética. Las proteínas de fusión en enfermedades malignas que pueden ser fácilmente detectadas usando un método según la invención incluyen, pero sin limitación las citadas en la tabla 1.

Se podrían concebir muchas aplicaciones diferentes usando el método FRET basado en oligonucleótidos propuesto descrito en la presente memoria descriptiva, por ejemplo:

-Detección de proteínas de fusión naturales y oncogénicas:

-proteínas de fusión oncogénicas que se producen en varias leucemias y tumores sólidos

-proteínas receptoras de células T o receptoras de células B formadas mediante fusiones de segmentos de genes

-Detección de asociación de cadenas receptoras de células T específicas (por ejemplo, una Vδ2+ con una cadena de Vγ9+);

-Investigación de complejos de proteínas: ¿son todos componentes de un complejo de proteínas presentes AML1/CBFβ como de cerca están los componentes conectados?

-Investigación de la regulación de genes mediante complejos de transcripción (por ejemplo, el complejo de transcripción del factor de unión del núcleo de AML1/CBFβ, que es un regulador crítico de la hematopoyesis normal);

-Investigación de la activación de la transcripción por complejos de proteínas (por ejemplo, la unión de β-catenina a Tcf-1 induce la transcripción de genes dianas Wnt;

-Detección de interacciones de proteína-ADN o proteína-ARN, para la investigación de proteínas involucradas en una transcripción o traducción;

-Evaluación de interacciones célula-célula a través de anticuerpos dirigidos contra diferentes tipos de células involucradas en el mismo procedimiento de interacción;

El método descrito en la presente memoria descriptiva tiene varias ventajas para su aplicación en secciones y frotes de tejido:

-aplicación en paralelo a otras tinciones inmunohistoquímicas

-combinación con FISH de señal partida: detección de acontecimientos oncogénicos a nivel de ADN (gen de fusión) y al nivel de proteína (proteína de fusión).

Es de gran relevancia indicar que el presente método no requiere la rotura de la integridad de la célula, por ejemplo, la preparación de un lisado celular, para detectar la presencia de una proteína de fusión intracelular o complejo molecular. La conservación de la integridad de la morfología de una célula permite el análisis al nivel de la célula única, por ejemplo, mediante citometría de flujo o microscopía de fluorescencia. La detección de una señal de FRET mediante citometría de flujo ofrece la capacidad de realizar un análisis rápido de múltiples parámetros de células individuales específicas en una población heterogénea. La principal ventaja de la citometría de flujo es que proporciona directamente datos cuantitativos y que es muy rápida (pueden ser obtenidos resultados en unas pocas horas).

El método proporcionado en la presente invención permite la detección de una proteína de fusión o moléculas interactuantes al nivel de una célula única. Una muestra que comprende una célula puede ser tratada con el fin de obtener una permeabilización del material y una conservación de la morfología. El tratamiento preferido es uno que fija y conserva la integridad morfológica de la matriz celular y de las proteínas en la célula, haciendo posible también el grado más eficaz de penetración de una sonda, por ejemplo, un anticuerpo.

Al contrario que, por ejemplo, un método de anticuerpos de “captura/detección”, que puede ser aplicado esencialmente tan solo para detectar la presencia de una proteína de fusión o proteínas interactuantes en la superficie celular o en un lisado celular, el presente método permite acceder a un subconjunto de células que están presentes en una mezcla de células a través de características inmunofenotípicas. Consecuentemente, el método proporcionado en la presente invención permite la detección en una población rara de células malignas en un fondo grande células normales. Esto es especialmente ventajoso para detectar frecuencias bajas de proteínas positivas de fusión, como en el caso de la detección de una enfermedad residual mínima (MRD) durante o después del tratamiento para una evaluación de la eficacia del tratamiento. En una realización preferida, el método proporcionado incluye una citometría de flujo de parámetros múltiples para identificar y/o aislar células únicas para detectar la presencia de una proteína de fusión al nivel de una célula única. Todo lo que es necesario para poner en práctica el método proporcionado es una instalación de citometría de flujo. De forma importante, el procedimiento se puede realizar en laboratorios rutinarios por personal con conocimientos ordinarios.

Han sido descritos más de cien genes de fusión y proteínas de fusión diferentes en diversos tipos de cáncer. Como se ha dicho, el método proporcionado permite discriminar entre la presencia de proteínas normales y una proteína de fusión aberrante al nivel de una célula única. Teóricamente, dos anticuerpos que reconocen dos dominios diferentes de una proteína de fusión pueden provocar una tinción de fondo uniéndose a los dominios de las proteínas normales que son derivadas de los genes normales en lugar del gen de fusión. Sin embargo, en ciertos casos, solamente una de las dos proteínas normales alcanza el nivel de expresión detectable en una población de células dianas, como se define por los marcadores de superficies celulares o intracelulares. Además de ello, las proteínas normales y la proteína de fusión difieren a menudo en su modelo de expresión intracelular, dando lugar frecuentemente a una localización subcelular diferente. Esto supone que la co-localización coincidente de las dos proteínas normales es improbable que se produzca a un nivel significativo. En particular, las sondas de yuxtaposición coincidentes suficientes para una señal de FRET serán raras en células normales si es que se producen en absoluto.

El método proporcionado comprende proporcionar una muestra que comprende una célula, en que dicha célula es opcionalmente sometida a una fijación y permeabilización. Una muestra puede comprender una célula primaria que es obtenida a partir de una muestra biológica. Una muestra biológica puede ser una muestra de fluido corporal que incluye sangre, suero, orina, médula ósea, fluido cerebroespinal (CSF) o saliva. Puede ser también una muestra de tejido o un homogenato de tejido. Una muestra comprende una célula cultivada que puede ser una célula primaria cultivada, por ejemplo, células tumorales obtenidas a partir de una biopsia de nódulo linfático. Además de ello, una muestra puede comprender una célula cultivada de una línea celular de laboratorio establecida como una línea celular K562, KASUMI-1, REH o CEM, que puede ser obtenida a partir de un cierto número de fuentes como la entidad American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org para un catálogo on line) o la colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ; www.dsmz.de para un catalogo on line). El método proporcionado es adecuado para detectar la presencia de una proteína de fusión endógena, así como una proteína de fusión recombinante en una célula. El método proporcionado es capaz también de detectar interacciones de proteínas recombinantes y/o moléculas endógenas en una célula.

Para analizar una muestra que comprende una suspensión de células, es preferido que la muestra sea tratada con el fin de obtener una conservación de la morfología del material y una permeabilización con el fin de asegurar una accesibilidad suficiente de una molécula de interés para una sonda. El tipo de tratamiento dependerá de diversos factores, por ejemplo, del fijador usado, del alcance de la fijación y del tipo y propiedades de la molécula de interés. La fijación se puede llevar a cabo con un fijador como formaldehído.

Para la detección en células primarias, es especialmente ventajoso usar un marcador adicional para definir una población de células dianas de interés. UIn cierto número de aplicaciones biológicas importantes de enfermedades infecciosas, detección y verificación de DMRD y la terapia génica requieren normalmente el análisis y aislamiento de células raras (por ejemplo, células madre/progenitoras hematopoyéticas) de un “fondo” grande de otras células. En una realización de la invención, el método incluye teñir una muestra de al menos un marcador celular, como un marcador de superficie celular o un marcador intracelular, para definir una población de células dianas en una mezcla de células que comprende poner en contacto dicha muestra con un compuesto capaz de unirse selectivamente a dicho marcador. En una realización preferida, este compuesto es directamente etiquetado con un colorante fluorescente. Un compuesto adecuado comprende un anticuerpo marcado por fluorescencia o un fragmento de unión funcionalmente equivalente al mismo. También, se puede usar un compuesto capaz de unirse selectivamente a un marcador celular que pueda ser detectado usando un reactivo secundario conjugado al colorante (por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado por fluorescencia). Un marcador celular comprende cualquier tipo de marcador intracelular o unido a membrana que pueda ser usado para distinguir una subpoblación de células en una mezcla de células. Una mezcla de células comprende células vivas. También comprende células permeabilizadas y/o fijadas. Un marcador celular puede ser una agrupación de antígeno de diferenciación (CD). Los marcadores CD son moléculas de superficies celulares, entre otras de células hematopoyéticas que son distinguibles con anticuerpos monoclonales. Las células hematopoyéticas comprenden timocitos, células dendríticas, células de Langerhan, neutrófilos, eosinófilos, células B de centros germinales, células dendríticas foliculares, células de plasma y células de médula ósea. Por ejemplo, los marcadores celulares adecuados comprenden CD1, CD3, CD4, CD8, CD10, CD19, CD20, CD33, CD34 y CD117. Los marcadores monoclonales dirigidos contra un gran número de marcadores CD humanos pueden ser obtenidos a partir de diversos proveedores, como Biosciences o Ancell Immunology Research Products, Bayport, USA. A menudo, están disponibles anticuerpos que están directamente conjugados con una fluorocromo de elección, por ejemplo CD10-PE o CD19-FITC, que es obviamente una elección preferida para poner en práctica un método según la invención.

En una realización preferida, se proporciona un método para identificar y/o aislar células únicas raras usando técnicas de citometría de flujo de parámetros múltiples/clasificación de células y para caracterizar adicionalmente estas células por la presencia o ausencia de una proteína de fusión de interés o mediante la identificación de moléculas interactuantes. Este método es particularmente adecuado para una aplicación a un cierto número de problemas importantes en el desarrollo del sistema inmune, enfermedades infecciosas, cáncer y terapia génica. Normalmente, antes de teñir una muestra de células con un conjunto de sondas, las células son marcadas con al menos un anticuerpo conjugado a un colorante relevante según procedimientos estándar, con el fin de definir una población celular diana. La elección del colorante se debe elegir preferentemente, pero no exclusivamente, al uso de dos o tres colorantes para una inmunofenotipia además de los colorantes de FRET. Por ejemplo, un conjunto de sondas de FRET según la invención puede ser combinado con otro colorante para mediar el acceso a un subconjunto de leucocitos a través de características inmunofenotípicas, por ejemplo CD10, CD19 y CD20 para definir exactamente subconjunto de células B precursoras en médula ósea o CD1, CD4 y CD8 ara definir subconjuntos de timocitos o CD34 y/o CD117 para identificar poblaciones de células madre/precursoras. Como se muestra en la presente memoria descriptiva en la descripción detallada, la invención proporciona un método que permite la detección de una proteína de fusión intracelular en un subconjunto muy pequeño de células, es decir, la detección de MRD, que es esencial para evaluar la eficacia de un tratamiento de cáncer.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Diagrama esquemático de un gen de fusión que consiste en la parte en dirección ascendente (5’) de gen A y la parte en dirección descendente (3’) de gen B. Este gen de fusión A-B es transcrito en forma de mARN de A-B y traducido en una proteína de fusión A-B.

Figura 2. Diagrama esquemático del principio de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) con fluorocromo X como colorante donante y de Y como colorante aceptor. A. El colorante aceptor Y no será excitado por la emisión de luz del colorante donante X si la distancia entre X e Y es demasiado grande. B. Si la distancia entre el colorante donante y aceptor es suficientemente pequeña (<80 Angstrom, pero preferentemente < 50 Angstrom), la luz de emisión del colorante donante X excitará el colorante aceptor Y.

Figura 3. Diagrama esquemático que expone el uso de moléculas de oligonucleótidos (por ejemplo, ADN/APN) para conectar de forma estrecha y estable dos anticuerpos. Cuando los dos anticuerpos entran en una estrecha proximidad uno con otro porque están unidos a ambos asociados de una proteína de fusión A-B. La unión por un puente del oligonucleótido de la sustancia C, que es parte complementaria para el oligonucleótido tanto A como B, reducirá y estabilizará la distancia entre los dos fluorocromos X e Y y puede ser detectada una señal de FRET. A.

Los fluorocromos donante y aceptor están directamente conjugados a las sondas de anticuerpos. B. Los fluorocromos donante y aceptor están conjugados a los grupos reactivos de oligonucleótidos. Los grupos reactivos de oligonucleótidos están unidos a las sondas de anticuerpos a través de un resto conector.

Figura 4. Muestra los resultados de la fluorescencia detectada en el caso de un oligonucleótido A de grupo reactivo, oligonucleótido B de grupo reactivo, combinación de oligonucleótidos A y B de grupos reactivos o combinación de A y B y oligonucleótido C de puente. La flecha indica la señal de FRET inducida por la adición de oligonucleótido C de puente complementario. Para más detalles, véase el ejemplo siguiente.

Ejemplo

Los siguientes oligonucleótidos fueron sintetizados según procedimientos estándar: Oligonucleótido A de grupo reactivo: fluoresceína CCA TTC TAT G conectora Oligonucleótido B de grupo reactivo: conector A Alexa-TGT ACC TTG Oligonucleótido C de puente: TCA DGG TAC A Gly Gly CAT AGA ATC G Se mezclaron 10 pmol de APN de oligonucleótidos diferentes en 200 µl de tampón de fósfato, pH 7,2 y se midió su

fluorescencia. La hibridación estuvo completada en 5 minutos cuando se añadió oligonucleótido C de APN. Véase la figura 4 para los resultados. Instrumento: Perkin Elmer LS 55 Longitud de onda de excitación: fluoresceína: 485 nm, Alexa 546: 546 nm. Partición de excitación 5 nm, partición de emisión 10 nm.

Referencias

1.: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (eds), World Health Organization classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press, 2001.

2.: Van Dongen JJM, Macintyre EA, Gabert JA, et al, Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13: 1901-28.

3.: Mitelman F, Johansson B, Mertens F, The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer 2007; 7: 233-45

4.: Look AT, Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. Science 1997; 278: 1059-64.

5.: Crans HN, Sakamoto KM, Transcription factors and translocations in lymphoid and myeloid leukemia. Leukemia 2001; 15: 313-31.

6.: Van Denderen J, Hermans A, Meeuwsen T, et al, Antibody recognition of the tumor-specific bcr-abl joining region in chronic myeloid leukemia. J Exp Med 1989; 169: 87-98.

7.: Van Denderen J, ten Hacken P, Berendes P, et al, Antibody recognition of the tumor-specific b3-a2 junction of bcrabl chimeric proteins in Philadelphia-chromosome-positive leukemias. Leukemia 1992; 6: 1107-12.

8.: Sang BC, Shi L, Dias P, et al, Monoclonal antibodies specific to the acute lymphoblastic leukemia t(1;19)associated E2A/PBX1 chimeric protein: characterization and diagnostic utility. Blood 1997; 89: 2909-14.

9.: Berendes P, Recognition of tumor-specific proteins in human cancer, Ph.D. Thesis, Chapter 8. Rotterdam: Erasmus University Rotterdam, 1997: 111-27.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un conjunto de al menos una primera y una segunda sondas moleculares, siendo capaz cada sonda de unirse específicamente a una molécula de interés a través de su dominio de unión, estando provista cada sonda de un colorante, en que dichos colorantes conjuntamente permiten una transferencia de energía, estando adicionalmente provista cada sonda de un grupo reactivo que permite yuxtaponer dichas como mínimo primera y segunda sondas, en que dicho grupo reactivo permanece disponible para modular la organización espacial de sondas yuxtapuestas después de que la sonda se une a una molécula de interés, en que dicho grupo reactivo comprende un oligonucleótido y en que el grupo reactivo de dicha primera sonda no es directamente reactivo con el grupo reactivo de dicha segunda sonda y requiere una sustancia formadora de puente capaz de establecer un puente de al menos dos grupos reactivos para mediar y/o mejorar una estrecha yuxtaposición de dichas sondas.
2.

Un conjunto según la reivindicación 1, en que el grupo reactivo de oligonucleótido de dicha primera y segunda sondas se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en oligómero de desoxirribonucleótido (ADN), oligómero de oxirribonucleótido (ARN), ácido nucleico bloqueado (LNA®) y oligómero de ácido nucleico péptido (APN).
3.

Un subconjunto según la reivindicación 1 ó 2, en el que el colorante está conjugado al grupo reactivo.
4.

Un conjunto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada una de dichas sondas está provista de una multiplicidad de grupos reactivos.
5.

Un conjunto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que dicha sonda es un anticuerpo o un fragmento de unión funcionalmente equivalente al mismo.
6.

Un conjunto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que al menos uno de dichos colorantes es un fluorocromo.
7.

Un conjunto según la reivindicación 6, en el que dicho fluorocromo se selecciona entre el grupo que consiste en isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC), Texas Red (TR), R-ficoeritrina (RPE), aloficocianina (ATC), miembros de las ficobiliproteínas, colorantes de cianina como Cy3, Cy5, Cy 5.5 o Cy7, colorantes Alexa Fluor, fluoresceína, colorantes LightCycler como LCRed640 o LCRed705, conjugados tándem de estos fluorcromos y colorantes de puntos cuánticos.
8.

Un método para proporcionar un conjunto de sondas según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende poner en contacto cada sonda con un colorante adecuado y con un grupo reactivo que comprende un oligonucleótido para formar un conjugado entre dicha sonda, dicho colorante y dicho grupo reactivo.
9.

Método según la reivindicación 8, que comprende conjugar el colorante al grupo reactivo.
10.

Un método para detectar la presencia de una proteína de fusión en una célula, usando un conjunto de al menos una primera y una segunda sondas moleculares, siendo capaz cada sonda de reconocer un sitio de unión colocado en lados opuestos de la región de fusión de dicha proteína de fusión, que comprende las etapas de:

-proporcionar un conjunto de sondas según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7;

-proporcionar una muestra que comprende una célula;

-poner en contacto dicha muestra con dicho conjunto de sondas bajo condiciones que permiten yuxtapones dichas sondas sobre dicha proteína de fusión

-poner en contacto dichas sondas con una sustancia formadora de puente que comprende una secuencia de ácidos nucleicos capaz de unirse específicamente a al menos parte del grupo reactivo de dicha primera sonda y a al menos parte del grupo reactivo de dicha segunda sonda y

-detectar la yuxtaposición de dichas sondas a través de FRET para determinar la presencia de dicha proteína de fusión.
11.

Un método según la reivindicación 10, en que dicha proteína de fusión es una proteína de fusión específica de tumores.
12.

Un método para detectar al menos dos moléculas interactuantes en una célula usando un conjunto de al menos

una primera y una segunda sondas moleculares, comprendiendo cada sonda un dominio de unión capaz de unirse específicamente a una molécula interactuante diferente de interés, que comprende las etapas de:

-proporcionar un conjunto de sondas según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7;

-proporcionar una muestra que comprende una célula;

-poner en contacto dicha muestra con dicho conjunto de sondas bajo condiciones que permiten yuxtapones dichas sondas sobre dichas moléculas interactuantes;

-poner en contacto dichas sondas con una sustancia formadora de puente que comprende una secuencia de oligonucleótidos capaz de unirse específicamente a al menos parte del grupo reactivo de dicha primera sonda y a al menos parte del grupo reactivo de dicha segunda sonda, y

-detectar la yuxtaposición de dichas sondas a través de FRET para detectar dichas moléculas interactuantes.
13.

Un método según la reivindicación 12, en el que al menos una de dichas moléculas interactuantes es una sustancia proteinácea, un ácido nucleico, una molécula de lípido o un hidrato de carbono.
14.

Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que dicho grupo reactivo y sustancia formadora de puente comprenden una secuencia de ADN, ARN, LNA o APN.
15.

Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que incluye teñir dicha muestra para al menos un marcador celular para definir una población de células diana, que comprende poner en contacto dicha muestra con un compuesto capaz de unirse selectivamente a dicho marcador celular, en que dicho marcador celular es preferentemente una agrupación de antígeno de diferenciación (CD).
16.

Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, que comprende la detección FRET al nivel de una célula única, usando preferentemente citometría de flujo.
17.

Un estuche de ensayo de diagnóstico, que comprende un conjunto de sondas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende preferentemente además una sustancia formadora de puente que comprende una secuencia de oligonucleótidos capaz de unirse específicamente a al menos parte del grupo reactivo de dicha primera sonda y a al menos parte del grupo reactivo de dicha segunda sonda.
18.

Estuche de diagnóstico según la reivindicación 17, en que dicha sustancia formadora de puente es una secuencia de ADN, ARN, LNA o APN, en el que preferentemente tanto los grupos reactivos de oligonucleótidos como la sustancia formadora de puente son secuencias de LNA o APN.
19.

Uso de un conjunto de sondas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 o un estuche de ensayo según la reivindicación 17, con anterioridad, durante, o con posterioridad al tratamiento de una enfermedad, para evaluar la eficacia de dicho tratamiento o para diagnosticar y/o clasificar una enfermedad.