ES2265962T3 - Utilizacion y procedimiento de peinado para la identificacion de los origenes de replicacion del adn. - Google Patents
Utilizacion y procedimiento de peinado para la identificacion de los origenes de replicacion del adn. Download PDFInfo
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Abstract
Soporte de representación visual de carteles (1) destinado a ser colocado en un dispositivo desarrollador cuyos orillos son aptos para ser guiados lateralmente en el interior de dicho dispositivo desarrollador, caracterizado porque está compuesto por varias porciones adyacentes (2, 3, 4) solidarizadas de forma reversible unas a las otras por sus orillos horizontales enfrentados (10 a 13), comprendiendo cada porción una varilla lateral (7, 17, 27, 8, 18, 28) situada sobre cada uno de sus orillos laterales, y por unos medios (60) para asegurar la continuidad de las varillas laterales de las porciones adyacentes.
Description
Utilización del procedimiento de peinado para la
identificación de los orígenes de replicación del ADN.
La presente invención se refiere a
procedimientos para analizar la replicación del ADN, y más
particularmente a la utilización del peinado molecular para
facilitar la detección y la identificación (es decir, el mapaje) de
los orígenes de replicación y la medición de las relaciones
dinámicas y estructurales que regulan la replicación del ADN.
El control de la síntesis del ADN resulta
esencial para el mantenimiento de la estabilidad del genoma (1, 2,
3). En los eucariotas superiores, la inestabilidad genómica
asociada a la pérdida del control de la replicación y la síntesis
aberrante del ADN es una característica crucial de una diversidad
de neoplasmas y enfermedades genéticas (4, 5, 28). En las
levaduras, un patrón alterado de síntesis del ADN conduce a
anormalidades genómicas, incluyendo aneuploidías y traslocaciones
(6, 7). La replicación eficiente y exacta del genoma en los
eucariotas se consigue mediante la activación de múltiples orígenes
bidireccionales de replicación. El patrón temporal y espacial de
activación, o programa de replicación, varía según la etapa del
desarrollo (8). En X. laevis, por ejemplo, la duración del
periodo de replicación del ADN durante el ciclo celular depende del
tamaño del replicón, o de la distribución de los orígenes de
replicación (9). Sin embargo, la organización y distribución de los
orígenes de replicación en todo el genoma eucariótico no se conoce
con exactitud, y en consecuencia no se comprende por completo la
regulación del programa de replicación en estas células (10). Ello
se debe principalmente a una diversidad de obstáculos técnicos y
fundamentales que dificultan el estudio de la replicación del ADN a
nivel genómico (11). Aunque existen varias técnicas para estudiar la
replicación del ADN en eucariotas tanto superiores como inferiores,
se requieren procedimientos más rápidos para el análisis
cuantitativo de la dinámica de la duplicación del genoma (11).
Para investigar la cuestión de la organización
espacial y temporal de la replicación del ADN en un genoma, los
presentes inventores utilizaron el procedimiento de peinado
molecular (12, 13, 14). El procedimiento de peinado molecular se
describe en la patente US nº 5.840.862 (Bensimon et al.). El
peinado molecular permite el mapaje físico de alta resolución de
loci genéticos específicos. La técnica consiste en alinear y
extender uniformemente ADN genómico sobre un sustrato, tal como un
cubreobjetos de vidrio. La ventaja de este procedimiento es que
todas las moléculas se alinean en una sola dirección y se
encuentran igualmente estiradas. El resultado es una correlación
exacta entre la longitud medida de la molécula estirada y su tamaño
en kilobases. En consecuencia, este procedimiento altamente
reproducible y preciso proporciona una oportunidad única para
investigar cómo se coordina la replicación del ADN con otros sucesos
del ciclo celular.
La presente invención proporciona procedimientos
para localizar o identificar un origen de replicación en una
molécula de ADN. En este procedimiento, los intermediarios de
replicación correspondientes a secuencias de ADN en cualquiera y en
todas las regiones del genoma (o en unidades replicantes
episómicas/extracromosómicas, etc.) que experimentan síntesis de ADN
se marcan con nucleótidos marcados in vivo o in vitro.
In vivo, el ADN se marca mediante la incorporación durante
la síntesis de ADN del nucleótido marcado en todas las etapas del
ciclo celular. In vitro, los intermediarios de replicación se
marcan utilizando extractos libres de células de cualquier
organismo, incluyendo los extractos de células HeLa, las células
embriónicas de Xenopus laevis (extracto de óvulo),
Saccharomyces cerevisiae, S. pombe, Escherichia coli, etc.,
con el fin de incorporar los nucleótidos marcados en el ADN en
replica-
ción.
ción.
El genoma puede marcarse diferencialmente con el
fin de identificar regiones de replicación temprana y tardía
mediante el marcaje continuo del genoma completo con un nucleótido
marcado seguido de una caza en etapas posteriores de replicación con
un segundo nucleótido marcado.
A continuación, se peina el ADN apropiadamente
marcado sobre una superficie para el análisis in situ. Más
específicamente, tras la terminación de la replicación del ADN (una
ronda efectiva de duplicación del genoma o del ADN), se extrae el
ADN de acuerdo a procedimientos establecidos. El ADN purificado
seguidamente se introduce en un tampón, tal como tampón MES, al pH
que se desee para el peinado, que generalmente es de entre 5 y 8,
más particularmente de entre 5 y 6, y más preferentemente a un pH de
aproximadamente 5,5. A continuación, la muestra de ADN se estira y
se alinea mediante peinado molecular sobre una superficie, tal como
vidrio. A continuación, se hibridan sondas cósmido o de PCR al ADN
peinado y marcado utilizando protocolos desarrollados en el
laboratorio con el fin de identificar una región específica del
genoma. Ello resulta necesario para el mapaje o la localización de
los intermediarios de replicación en cualquier región dada del
genoma. El ADN hibridado seguidamente se lava y se prepara para la
detección.
El ADN marcado y las sondas hibridadas pueden
detectarse utilizando anticuerpos apropiados (específicos para los
nucleótidos diferencialmente marcados) conjugados a un marcaje, tal
como un fluoróforo, con el fin de permitir la visualización directa
del ADN marcado e hibridado en un microscopio de epifluorescencia.
La superficie que contiene las señales se limpia con el fin de
eliminar el fondo y las señales no específicas detectadas por los
anticuerpos. A continuación, la superficie se monta en un tampón
apropiado y se examina. Las señales detectadas (intermediarios de
replicación y sondas hibridadas) aparecen como señales
fluorescentes lineales. Las imágenes de las señales se capturan y
se analizan utilizando programas informáticos desarrollados en el
laboratorio (CartographiX©, Institut Pasteur, 1995; 1997 y CI
tool©, Institut Pasteur, 1999), permitiendo el mapaje de alta
resolución.
Las localizaciones de los orígenes de
replicación pueden maparse mediante la comparación de la
localización de los intermediarios de replicación marcados con
respecto a las sondas hibridadas. Más específicamente, se llevan a
cabo mediciones de las magnitudes de la señales fluorescentes de los
intermediarios de replicación y de sus distancias a las sondas
hibridadas en la región. Los orígenes se identifican realizando un
seguimiento de la evolución bidireccional de los intermediarios de
replicación marcados en un experimento de cinética que implica una
caza en varias etapas sucesivas diferentes de la replicación. Se
localizan orígenes en los puntos medios de las señales fluorescentes
(la resolución de mapaje es de aproximadamente 1 a 4 kb), seguido de
la clonación de la secuencia correspondiente utilizando un mapa
físico establecido de la región. Las secuencias clonadas se someten
a ensayo para su capacidad de proporcionar replicación autónoma a
elementos episómicos (por ejemplo plásmidos). Las secuencias
nucleótidas correspondientes seguidamente se analizan mediante
programas bioinformáticos estándar de análisis de secuencias con el
fin de identificar motivos de secuencia. Además, puede utilizarse
una CI tool para establecer la organización espaciotemporal
de las actividades relacionadas con el origen de replicación durante el ciclo celular (CI tool©, Institut Pasteur, 1999).
de las actividades relacionadas con el origen de replicación durante el ciclo celular (CI tool©, Institut Pasteur, 1999).
En particular, los procedimientos de la presente
invención para el mapaje de un origen de replicación en una
molécula de ADN incluyen las etapas siguientes:
- a)
- incubar el ADN que se está replicando en presencia de nucleótidos marcados, que se incorporan en el ADN en replicación;
- b)
- alinear el ADN de la etapa a) sobre un sustrato;
- c)
- hibridar el ADN alineado con una sonda nucleótida; y
- d)
- medir las distancias entre los nucleótidos marcados que se incorporaron en el ADN durante la replicación y la sonda nucleótida con el fin de determinar la localización del origen de replicación con respecto a la sonda nucleótida.
La presente invención se refiere asimismo a
procedimientos para la detección de orígenes de replicación en una
molécula de ADN, que incluye las etapas siguientes:
- a)
- incubar el ADN en replicación en presencia de nucleótidos marcados, que se incorporan en el ADN en replicación;
- b)
- alinear el ADN de la etapa a) sobre un sustrato; y
- c)
- detectar los nucleótidos marcados que se incorporaron en el ADN durante la replicación, en la que los nucleótidos marcados se encuentran localizados en una región que corresponde al origen de replicación.
Otro aspecto de la invención se refiere a la
medición de la relaciones dinámicas y estructurales que regulan la
replicación del ADN. En particular, este aspecto de la invención
implica un procedimiento para medir la velocidad de replicación del
ADN, que incluye las etapas siguientes:
- a)
- añadir un primer nucleótido marcado a una mezcla de reacción de ADN en replicación, en el que el primer nucleótido marcado se incorpora en el ADN en replicación;
- b)
- añadir un segundo nucleótido marcado a la mezcla de reacción en diferentes intervalos de tiempo tras la adición del primer nucleótido marcado, en la que el segundo nucleótido marcado se incorpora en el ADN en replicación;
- c)
- alinear el ADN de la mezcla de reacción sobre un sustrato;
- d)
- detectar el primer y segundo nucleótidos marcados, que se incorporan en el ADN durante la replicación; y
- e)
- medir la distribución del primer y segundo nucleótidos marcados en el ADN alineado con el fin de determinar la velocidad de replicación del ADN.
Para la puesta en práctica de la presente
invención, los nucleótidos marcados pueden detectarse con una sonda
marcada, tal como un anticuerpo conjugado con un marcaje, donde la
sonda reconoce y se une al marcaje en el nucleótido marcado. Entre
los ejemplos de nucleótidos marcados que resultan útiles en la
práctica de la presente invención se incluyen
biotina-dUTP y digoxigenina-dUTP
("dig-dUTP"). El término "nucleótidos
marcados" también incluye los nucleótidos modificados, tales como
bromodesoxiuridina, clorodesoxiuridina, yododesoxiuridina, etc. El
ADN puede incubarse con las sondas marcadas antes o después de que
se alinee el ADN sobre el sustrato en el procedimiento de peinado
molecular. El ADN también puede lavarse previamente a su alineación
sobre el sustrato, o tras la incubación con la sonda marcada con el
fin de eliminar los reactivos no específicos, tales como sonda
marcada no unida o nucleótidos marcados no incorporados.
Debe entenderse que tanto la descripción general
anterior como la descripción detallada siguiente son únicamente
ejemplares y explicativas, y que no son limitativas de la invención
según las reivindicaciones.
Los dibujos adjuntos, que se incorporan y
constituyen una parte de la presente memoria descriptiva, ilustran
varias formas de realización de la invención y conjuntamente con la
descripción sirven para explicar los principios de la misma.
La figura 1A representa el esquema experimental
de la presente invención. Se incubaron núcleos de esperma de
Xenopus en presencia de biotina-dUTP en t =
2' con el fin de marcar el genoma completo. En diferentes puntos
temporales tras el inicio de la etapa S, se añadieron
dig-dUTP además de biotina-dUTP para
marcar diferencialmente las secuencias de ADN de replicación
tardía. Las secuencias de replicación temprana (aquéllas que se han
replicado antes de la adición de dig-dUTP)
aparecerán como señales lineales rojas, mientras que las secuencias
de replicación tardía (aquéllas que se replican después de la
adición de dig-dUTP) incorporarán
dig-dUTP y biotina-dUTP
simultáneamente y, en consecuencia, aparecerán como señales lineales
de fluorescencia amarilla (fusión de verde + rojo). A continuación,
se permite la replicación completa del ADN (120 minutos tras la
adición del extracto) y se recolectan los núcleos. Seguidamente se
extrae el ADN genómico y se peina sobre cubreobjetos de vidrio. El
ADN peinado se detecta utilizando anticuerpos conjugados con
fluoróforos rojos (por ejemplo rojo de Texas) o verdes (por ejemplo
FITC). El ADN marcado se observan en un microscopio de
epifluorescencia (Axioskop, Zeiss, objetivo Plan Neofluar de 100X)
dotado de una cámara CCD fría. A continuación, se llevan a cabo
mediciones de cada molécula individual presente en una serie de
campos de visión seleccionados aleatoriamente. Se llevan a cabo
mediciones individuales en secuencias de replicación tanto temprana
como tardía (rojo para las secuencias de replicación temprana y
amarillo para las de replicación tardía). De la misma manera, se
llevan a cabo mediciones de la secuencias entre los puntos medios
de los segmentos marcados rojos contiguos. Conjuntamente, estas
mediciones proporcionan una evaluación del tamaño de las unidades de
replicación y del tamaño del ADN replicado a partir de regiones
aleatoriamente seleccionadas del genoma. Cada muestra contenía
aproximadamente 20.000 genomas haploides, y se analizaron más de 10
Mb de ADN en cada punto del tiempo.
La figura 1B es una fotografía de ADN peinado
visualizado utilizando anticuerpos conjugados con FITC y con rojo
de Texas. Las secuencias teñidas de rojo corresponden a burbujas de
replicación o a moléculas que han terminado la replicación
previamente a la adición de dig-dUTP.
La figura 2A es un gráfico que representa la
distancia entre ojo y ojo frente al porcentaje replicado. Las
mediciones se realizaron en una población de moléculas individuales
en cada punto del tiempo. El tamaño de los ojos de replicación se
midió como señales lineales rojas. El grado en el que se había
replicado cada molécula (porcentaje replicado) se determinó sumando
los tamaños de los ojos en cada molécula y después dividiendo por
la longitud total de las moléculas (ver esquema). A continuación, se
analizaron las moléculas como histogramas de tamaño de ojo frente a
porcentaje replicado. Ello se realizó individualmente para cada
punto del tiempo (datos no mostrados) y para toda la muestra (todos
los puntos del tiempo). Se estimó la velocidad de la horquilla de
replicación midiendo la velocidad a la que se incrementaba el tamaño
de las señales lineales rojas (ojos de replicación) durante la
etapa S. Ello se llevó a cabo determinando el incremento de
pendiente de la curva para las moléculas que se habían replicado
entre el 0% y el 80%. De esta manera, se encontró que la velocidad
de la horquilla de replicación era de 300 pb/minuto. Esta es una
estimación mínima de la velocidad de horquilla debido que es una
media de toda la población de moléculas. No resulta posible medir
directamente el incremento del tamaño de los ojos de replicación
debido al hecho de que la síntesis del ADN se inicia asíncronamente
en la población de núcleos.
La figura 2B es un gráfico que representa la
densidad de horquillas de replicación frente al porcentaje
replicado. Las moléculas se agruparon en recipientes según su
estadio de replicación (% replicado) y la densidad de horquillas se
calculó a partir del número de ojos por recipiente dividido por la
longitud total de todas las moléculas en cada recipiente. A su vez,
esto proporciona el número de horquillas de replicación, que
simplemente es el doble del número de ojos de replicación (para la
replicación bidireccional). La densidad media de horquillas de
replicación se incrementa en más de 3 veces cuando el ADN se
encuentra replicado entre el 6% y el 60% y se reduce rápidamente
tras la replicación de más del 87% de las moléculas.
La figura 3A es una reconstrucción generada por
ordenador de todas las moléculas medidas durante el experimento.
Las moléculas se reconstruyeron directamente a partir de mediciones
realizadas sobre el ADN peinado. A continuación, las moléculas
reconstruidas se seleccionaron aleatoriamente y se alinearon extremo
a extremo de acuerdo a sus etapas respectivas de replicación. Los
ojos de replicación, o secuencias de replicación temprana, se
visualizan en rojo, mientras que las secuencias de replicación
tardía se visualizan en verde. Se midieron un total de 77 Mb de ADN
durante el experimento y se alinearon en columnas de 200 kb de
acuerdo a su porcentaje de replicación. De esta manera resulta
posible visualizar directamente las diferentes etapas de replicación
experimentadas por el ADN, correspondiendo cada etapa a un
porcentaje de replicación determinado.
La figura 3B representa la fracción de longitud
medida total (77 Mb) frente al porcentaje replicado. Las moléculas
se agruparon según el porcentaje de replicación experimentado y se
sumaron sus longitudes con el fin de determinar el porcentaje
respectivo de la longitud total que representaban. Con ello se
obtiene la distribución de la longitud total medida durante el
experimento en términos de porcentaje de replicación, que se
representa visualmente en la figura 2A. Nótese que la fracción más
reducida de la muestra se produce cuando las moléculas se
encuentran replicadas entre el 40% y el 50%. Ello indica que la
velocidad máxima de síntesis de ADN se produce cuando se ha
sintetizado entre el 40% y el 50% del ADN.
La figura 4 es un gráfico que representa la
distancia media ojo a ojo frente al porcentaje replicado. Se
midieron las distancias entre los puntos medios de ojos de
replicación contiguos. Las mediciones se realizaron sobre moléculas
individuales en cada muestra y se analizaron en términos del grado
de replicación experimentado. La distancia entre ojos frente al
porcentaje de ADN replicado por molécula proporciona una evaluación
de cómo se distribuyen los orígenes de replicación y cómo se activan
durante la etapa S. Según el histograma, se produce una
estabilización entre el 37% y el 87% de la replicación. Esta
estabilización corresponde a un tamaño medio de ojo a ojo de 14 a
16 Kpb en todo el genoma durante la etapa S. Por lo tanto, el tamaño
medio de replicón en el genoma de X. laevis en esta etapa de
desarrollo puede estimarse que es de aproximadamente 15 kb. La
curva roja muestra la evolución de las distancias ojo a ojo
suponiendo que los tamaños de ojo de entre 3 y 8 kb corresponden a
horquillas que parten de un único suceso de inicio. La distancia
entre ojos de ojo a ojo en este intervalo de tamaños indica que los
inicios se producen con un espacio medio mínimo de aproximadamente
6 kb.
La figura 5A es un gráfico que representa el
número de sucesos de nucleación (/100 kb) frente al tiempo. Se
definieron los sucesos de nucleación como horquillas de replicación
contiguas que se encontraban a una distancia inferior a 8 kb. Este
valor máximo corresponde a una mitad de la distancia media entre
ojos (14 a 16 kb), y sirve como estimación de aquellas horquillas
que es más probable que se hayan originado en un único suceso de
inicio. Se estableció un límite inferior de 3 kb mediante la
cuantificación del fondo observado en una muestra doblemente
sustituida de ADN genómico peinado (datos no mostrados). Estas
mediciones están de acuerdo con observaciones anteriores de la
resolución del peinado molecular, que es conocido que es de entre 1
y 4 kb. A partir del tamaño de ojo (segmentos rojos de la molécula
real medida) y de la velocidad de horquilla de replicación, puede
determinarse el tiempo en que se inicio la replicación de un ojo
dado (flecha). A continuación, se determina para cada molécula
reconstituida la fracción de la molécula que queda por replicar en
el tiempo de dicho suceso de nucleación. Ello proporciona la
fracción relativa de ADN no replicado por nucleación por molécula;
y el inverso de este valor a su vez proporciona la densidad de
nucleación (sucesos por kilobase). Ello se llevó a cabo para cada
molécula en una muestra dada y se representó en un gráfico la
densidad de nucleación correspondiente con respecto al tiempo. La
línea roja muestra la densidad media en intervalos sucesivos de
tres minutos.
La figura 5B es un gráfico que representa el
número de sucesos de nucleación frente al porcentaje replicado. Los
sucesos de nucleación se determinaron tal como se ha descrito para
la figura 5A. A continuación se representó en un gráfico el número
de sucesos por molécula frente al porcentaje en que cada molécula
se había replicado. La línea roja corresponde a la densidad media
respecto al porcentaje de replicación.
Se seleccionó el sistema in vitro de
replicación del ADN de Xenopus laevis como modelo para
investigar el potencial completo del peinado molecular para el
estudio de la replicación del ADN. Este sistema utiliza extractos
de óvulos para replicar ADN exógeno y proporciona soporte a una
ronda completa de replicación (15, 16). En este sistema
experimental, se marcó la cromatina de esperma de Xenopus
laevis con biotina-dUTP y
dig-dUTP. Se añadieron los
biotina-dUTP inmediatamente después del extracto (t
= 2') con el fin de marcar todo el genoma. En diferentes puntos del
tiempo (es decir, t = 25, 29, 32, 39 y 45 minutos) tras la adición
del extracto se añadieron dig-dUTP con el fin de
marcar diferencialmente el ADN de replicación tardía (16). A
continuación, se extrajo el ADN genómico y se peinó sobre la
superficie de vidrio.
Más específicamente, en el sistema experimental
utilizado en la presente invención, se marcaron continuamente
aproximadamente 20.000 núcleos utilizando 20 \mul de extracto de
óvulo en presencia de 20 \muM de biotina-dUTP. La
síntesis del ADN se inició dentro de los 15 minutos de la adición
del extracto a la cromatina de esperma, y el 90% de los núcleos
había terminado la síntesis del ADN 45 minutos después (datos no
mostrados). En sucesivos puntos del tiempo tras la adición del
extracto, se añadieron 50 \muM de dig-dUTP,
rindiendo una serie de cinco muestras con ADN diferencialmente
marcado. A continuación, se preparó cada muestra de acuerdo a
protocolos estándar, se tiñeron con YOYO-1 (un
pigmento dimérico de cianina que presenta fluorescencia al unirse a
ácidos nucleicos) y se peinaron sobre un sustrato, tal como vidrio
(13).
Se examinó el ADN peinado en un microscopio de
epifluorescencia con el fin de determinar el número y tamaño medio
de las moléculas peinadas por campo de visión (FOV). En este caso,
el número medio de moléculas por FOV era de 20 y el tamaño medio de
las moléculas era de 200 kb. Ello corresponde a aproximadamente 30
genomas haploides peinados por cubreobjetos de 22 mm x 22 mm.
A continuación, se detectaron regiones del
genoma que se replicaban temprana y tardíamente utilizando
anticuerpos conjugados con diferentes fluorocromos. Por ejemplo, se
utilizaron anticuerpos conjugados con rojo de Texas para detectar
las secuencias de replicación temprana marcadas con
biotina-dUTP, mientras que se utilizaron anticuerpos
conjugados con FITC para detectar las secuencias de replicación
tardía marcadas con dig-dUTP. Debe indicarse que
las secuencias de replicación tardía se encuentran marcadas con
tanto biotina-dUTP como dig-
dUTP.
dUTP.
A continuación, se analizaron la totalidad de
las cinco muestras en un microscopio de epifluorescencia. Se
obtuvieron imágenes de las moléculas peinadas utilizando una cámara
CCD. Seguidamente se realizaron mediciones en moléculas individuales
utilizando un programa informático desarrollado en el laboratorio.
De esta manera, se midieron aproximadamente 10 Mb de cada muestra, y
se determinaron con precisión los segmentos alternantes rojos y
verdes y se analizaron sus distribuciones en forma de
histograma.
No se observó ningún sesgo significativo
respecto a la incorporación de nucleótido marcado. La incorporación
era del 84,41% para los biotina-dUTP y la
incorporación de dig-dUTP era del 84,93%. Se
encontró que la velocidad de la horquilla de replicación era igual
en presencia o en ausencia de biotina-dUTP. Como
control, se marcó continuamente una muestra con tanto
biotina-dUTP como dig-dUTP de manera
que pudiese visualizarse el genoma completo utilizando los filtros
de fluorescencia roja o verde. Se utilizaron las mediciones
realizadas en esta muestra para determinar la eficiencia de
incorporación y de detección de nucleótidos.
De esta manera, se visualizaron las unidades de
replicación utilizando anticuerpos con fluorescencia roja (por
ejemplo rojo de Texas), mientras que en aquellas regiones que se
replicaban después (es decir, después de la adición de
dig-dUTP), en los diferentes puntos del tiempo se
encontraban doblemente marcadas y por lo tanto se visualizaron
utilizando tanto anticuerpos con fluorescencia verde (por ejemplo
FITC) como anticuerpos con fluorescencia roja (figura 1 B). Este
enfoque permite el mapaje y análisis cuantitativo directos de las
unidades de replicación alternantes roja y verde a lo largo de cada
molécula individual de ADN.
Una de las dificultades principales en el
estudio de la replicación del ADN en los genomas de metazoos es la
aparente falta de orígenes de replicación bien definidos (17, 18).
En estos sistemas celulares, aparentemente puede replicarse
cualquier secuencia de ADN con la condición de que sea
suficientemente grande (17, 18). Ello sugiere que el inicio de la
replicación del ADN es aleatorio con respecto a la secuencia. Esta
activación de la síntesis del ADN que es independiente de secuencia
plantea la cuestión de si el ADN se replica o no de acuerdo a un
proceso estocástico (19, 20) o de acuerdo a un mecanismo que impone
una organización temporal y espacial regular a la cromatina en
replicación (21). Debido a que los orígenes deben encontrarse
espaciados por una distancia reducida para completar la replicación
del ADN al ritmo del ciclo celular, se propuso un mecanismo de
acuerdo al cual el plegamiento periódico de la cromatina garantiza
el espacio y la activación regulares de los orígenes de replicación
en todo el genoma, una organización que de esta manera asegura la
duplicación completa del genoma antes de que entre en
mitosis (21).
mitosis (21).
Con el fin de investigar la distribución
espacial de las unidades de replicación teñidas de rojo y de verde,
se obtuvieron imágenes de las moléculas marcadas y alineadas, y se
llevaron a cabo mediciones de manera sistemática en cada punto del
tiempo del ADN marcado (figura 1B). Las mediciones se realizaron en
todas las moléculas en cada campo de visión seleccionado
aleatoriamente en cada punto del tiempo, y se analizó una longitud
total de muestra de más de 77 Mb. Por lo tanto, estas mediciones
proporcionan una evaluación estadística de las distribuciones de los
tamaños de las unidades de replicación, así como de las distancias
entre ellas. El tamaño de ojo es el término utilizado en la
presente memoria para referirse a las unidades de replicación
tempranas teñidas de rojo, mientras que el tamaño
inter-ojo es el término utilizado para referirse a
las unidades de replicación tardías teñidas de verde y de rojo.
De manera similar, la distancia ojo a ojo se
define como la distancia (en kb) entre los puntos medios de dos
ojos contiguos (figura 1A). El grado con el que cada molécula
individual experimenta replicación previamente a la adición del
segundo nucleótido marcado se determinó como la suma de las
longitudes de los ojos de replicación (rojo) dividido por la
longitud total de la molécula lineal medida. De esta manera, pueden
analizarse las distancias ojo a ojo y los tamaños de ojo en términos
del grado de replicación de las moléculas. Ello resulta necesario
debido a que los genomas de los núcleos inician la replicación de
manera asíncrona en la población.
Las mediciones revelaron que los tamaños de ojo
se incrementan linealmente hasta que se ha replicado el 87% de la
muestra, momento en el que los ojos incrementan rápidamente su
tamaño debido a la fusión de horquillas de replicación contiguas
(figura 2A). De acuerdo con los datos presentados en la figura 2,
se estimó la velocidad de horquilla de replicación a partir del
incremento medio del tamaño de ojo y se encontró que era de
aproximadamente 300 pb/minuto. Este valor es consistente con valores
informados con anterioridad (9, 22). Sin embargo, es una estimación
inferior de la velocidad de horquilla debido a que la replicación
asíncrona de la población de núcleos resultará en un incremento más
lento del esperado en los tamaños observados de ojo. Esta asincronía
se ha informado de que conduce a una sobreestimación de 10 a 20
minutos en la duración de la etapa S (9, 23). Si el periodo durante
el que se produce la síntesis del ADN en toda la población
corresponde a 20-30 minutos, para un genoma
individual la etapa S media durará aproximadamente 10 a 15 minutos.
Por lo tanto, la velocidad real de las horquillas de replicación
corresponde a aproximadamente 600 pb/minuto (22).
A continuación, los presentes inventores
examinaron la densidad de las horquillas de replicación, que
simplemente es el doble del número de ojos/kb, observando que la
densidad de las horquillas se incrementaba en más de tres veces
durante la primera mitad del periodo de síntesis del ADN (es decir,
entre los 25 y los 32 minutos). La densidad de horquillas de
replicación seguidamente se reduce rápidamente a medida que empiezan
a fusionarse los ojos (figura 2B). Aunque ello sugiere que la
replicación se inicia principalmente durante la primera mitad de la
etapa S, las mediciones realizadas sobre las muestras de
replicación tardía también reveló que todavía se producen algunos
inicios residuales incluso tras haberse replicado el 96% del ADN en
la muestra. En efecto, para las moléculas que se encuentran
replicadas en más del 90%, hasta el 28% de los ojos de replicación
presenta un tamaño de entre 3 y 8 kb. Suponiendo que estas
horquillas proceden de un único suceso de inicio, esta observación
indica que se produce un número significativo de sucesos de inicio
tardíamente en la etapa S (Tabla 2).
La figura 3 es una reconstrucción por ordenador
de todas las moléculas medidas durante el experimento. Muestra la
evolución del programa de replicación a medida que avanza la
síntesis del ADN. Ello puede cuantificarse en forma de un histograma
que muestra la fracción (en términos de longitud) de la muestra
total en una etapa dada de la replicación (figura 3B).
Según las figuras 2B y 3B, la velocidad de
replicación del ADN depende de la densidad de horquillas de
replicación en cualquier etapa dada de la replicación. Las
horquillas se correlacionan con los orígenes, y cómo se espacian los
orígenes es un parámetro importante para determinar la duración de
la etapa S. Por lo tanto, resulta útil determinar las distancias
entre los puntos medios de segmentos contiguos de replicación
temprana debido a que estas mediciones proporcionan información
sobre la distribución espacial de los orígenes de replicación
(24).
Se midieron las distancias ojo a ojo y se
representaron gráficamente de manera separada frente al grado de
replicación de las moléculas respectivas (ver anteriormente). La
correlación entre la distancia media ojo a ojo y el grado de
replicación del ADN revela que se produce una estabilización entre
los 14 y los 16 kpb (figura 4). La estabilización se produce cuando
el ADN se ha replicado entre el 37% y el 87%. Ello corresponde al
intervalo de entre 32 y 39 minutos, respectivamente, e indica que la
mayor parte del ADN se está replicando dentro de una estrecha
ventana de aproximadamente 10 minutos. Ello contrasta con el
periodo observado de 20 a 30 minutos durante el que se sintetiza el
ADN, y es consistente con las evaluaciones anteriores de la
duración de la etapa S en esta etapa del desarrollo (ver
anteriormente; figura 4). Debe indicarse que el rápido incremento
de las distancias ojo a ojo que se produce tras replicarse el 87% es
consistente con el valor observado para el rápido incremento de los
tamaños de ojo indicado anteriormente. Ello demuestra que el
peinado molecular es exacto debido a que los tamaños de ojo y las
distancias ojo a ojo representan dos mediciones independientes del
mismo fenómeno biológico.
A continuación, los presentes inventores
examinaron los cambios en las distancias medias ojo a ojo para cada
muestra, y observaron que la distancia media se reducía rápidamente
entre los 25 y los 32 minutos y después se incrementaba a medida que
los ojos de replicación se expanden y las horquillas contiguas
empiezan a fusionarse. Se resumen estos resultados en la Tabla
1.
| Tiempo | Fracción | Tamaño de | Tamaño | Distancia | Densidad |
| replicada | ojo | inter-ojo | ojo a ojo | de horquillas | |
| (minutos) | (%) | (kb) | (kb) | (kb) | (/100 kb) |
| 25 | 5,14 \pm 3,7 | 2,5 \pm 1 | 29,7 \pm 21,3 | 32,2 \pm 21,2 | 4,9 \pm 2,3 |
| 29 | 17,79 \pm 14,1 | 5,4 \pm 4,7 | 18,8 \pm 17,3 | 24,9 \pm 17,7 | 7,9 \pm 4,1 |
| 32 | 47,27 \pm 24,6 | 8,9 \pm 8,8 | 8,7 \pm 9,6 | 17,7 \pm 11,5 | 11,9 \pm 4,7 |
| 39 | 89,49 \pm 10,9 | 13,5 \pm 13,8 | 2,8 \pm 3,3 | 16 \pm 10,6 | 13,4 \pm 6,7 |
| 45 | 96 \pm 5,1 | 20,6 \pm 22,3 | 2,5 \pm 2,1 | 18,7 \pm 10,3 | 8,4 \pm 5,6 |
En la Tabla 1, cada muestra corresponde a un
punto del tiempo determinado (es decir, t = 25', 29', 32', 39' y
45') en el que se añadieron dig-dUTP al ADN en
replicación. El ADN marcado diferencialmente
(biotina-dUTP y
biotina-dUTP/dig-dUTP) seguidamente
se dejó que completase la replicación (t = 120'). Las muestras se
prepararon individualmente y se peinaron sobre un cubreobjetos. A
continuación, se realizaron las mediciones en cada muestra
individual. Se analizó una media de 10 Mb por muestra, y en la Tabla
1 se muestran los valores medios para cada parámetro en la
muestra.
La segunda columna representa la cantidad de
replicación de ADN producida previamente a la adición del segundo
nucleótido, y se determinó midiendo los segmentos marcados en rojo
de cada molécula y después dividiendo por la longitud total de la
molécula. Ello se llevó a cabo para cada molécula en la muestra con
el fin de determinar el porcentaje de replicación medio en toda la
muestra.
En la columna tres, se obtuvo el tamaño medio de
ojo para cada muestra a partir de mediciones directas del tamaño de
ojo para cada molécula analizada. Debido a que el ADN puede
fragmentarse durante su preparación, no se incluyeron los segmentos
marcados en los extremos de las moléculas para la evaluación del
tamaño medio de ojo, del tamaño inter-ojo o del
tamaño ojo a ojo.
En la columna cuatro, se midieron los segmentos
entre ojos, tal como se ha comentado anteriormente para el tamaño
medio de ojo. Estos segmentos corresponden a secuencias replicadas
tras la adición del segundo nucleótido y, por lo tanto, representan
secuencias no replicadas en el momento de añadir el segundo
nucleótido. En la quinta columna, se calcularon los tamaños ojo a
ojo como la distancia entre los puntos medios de dos ojos contiguos
flanqueantes de un segmento espaciador entre ojos.
Tal como se representa en la última columna, se
determinó la densidad media de horquillas como el doble del número
de ojos por unidad de longitud molecular. A medida que el número de
nuevas horquillas por unidad de longitud se incrementa, se reducen
las distancias ojo a ojo, y la frecuencia de inicio excede la
frecuencia de terminación (de fusión de horquillas). La densidad
relativa de horquillas se incrementa aproximadamente en 1,5 veces
de punto a punto del tiempo hasta t = 39', momento en el que empieza
a dominar la terminación.
Tal como se indica en la Tabla 1, la distancia
media ojo a ojo para cada muestra se redujo hasta en tres veces
hasta alcanzar el nivel de estabilización. Esta reducción es
consistente con el incremento medio de tres veces en la densidad de
horquillas de replicación observada en cada muestra sucesiva. De
manera similar, la velocidad media a la que se forman horquillas
por kb es consistente con la velocidad media a la que se reducen
las distancias ojo a ojo. En efecto, la densidad media de horquillas
en el nivel de estabilización (replicado entre el 40% y el 80%)
corresponde a 15 horquillas por 100 kb (figura 2B). Por lo tanto,
una media de 7 ojos de replicación (15 horquillas) cada 100 kb
proporcionaría una distancia media ojo a ojo de aproximadamente 15
kb, tal como se observa (figura 4).
Los análisis de los presentes inventores de
distancias ojo a ojo no revelan ningún patrón regular de la
replicación durante la síntesis del ADN, sugiriendo que el genoma en
efecto se duplica de acuerdo a un proceso aleatorio de replicación
(datos no mostrados). En un proceso aleatorio, algunas
replicaciones serán excesivamente grandes para que se repliquen por
completo en un intervalo de 10 a 15 minutos si la velocidad de las
horquillas de replicación es constante (19, 20). Por lo tanto, se
examinaron los tamaños de las secuencias de replicación tardía
(distancias entre ojos) en cada muestra en función del grado de
replicación de la molécula.
Suponiendo que no se forman nuevas horquillas de
replicación, una molécula que se ha replicado al 70% normalmente
requerirá 3 minutos (etapa S = 10 minutos) para completar su
duplicación a una velocidad de horquilla de 600 pb/minuto. Sin
embargo, se encontró que el 72% de las moléculas que se habían
replicado entre el 70% y el 99% contenían secuencias entre ojos
cuyos tamaños requerirían mas tiempo para replicarse que el
observado realmente (datos no mostrados). En la Tabla 2 se muestra
la fracción del genoma al final de la etapa S que se no se habría
replicado en ausencia de nuevos sucesos de inicio.
| Tiempo | Nuevas | F Etapa S = 10 | F Etapa S = 16 | Máximo, tiempo |
| horquillas | minutos | minutos | excedente de | |
| replicación | ||||
| (minutos) | (%) | (%) | (%) | (minutos) |
| 25 | 98 | 99 | 98 | 120 |
| 29 | 76 | 98 | 91 | 79 |
| 32 | 61 | 85 | 75 | 51 |
| 39 | 43 | 22 | 14 | 21 |
| 45 | 28 | 12,5 | 8,7 | 17 |
En la Tabla 2, las horquillas nuevas se definen
como aquellas horquillas que corresponden a ojos de replicación de
tamaño comprendido entre 3 y 8 kb. La fracción de nuevas horquillas
en cada muestra se calculó como el porcentaje de horquillas nuevas
respecto al número total de horquillas en la muestra.
Las columnas tres y cuatro indican la fracción
(F) de la longitud total de la secuencia en cada muestra que
contiene segmentos entre ojos (secuencias no replicadas en el
momento de añadir el segundo nucleótido) cuyo tiempo de replicación
excedería el tiempo restante para replicar la molécula respectiva
(mostrado en términos de % de longitud total de la muestra).
La última columna indica la secuencia no
replicada más grande observada en cada punto del tiempo respecto a
la cantidad excedente de tiempo que requeriría su replicación
respecto al de la molécula correspondiente. Aunque la mayoría de
moléculas replicadas entre el 70% y el 99% contienen secuencias que
son demasiado grandes para replicar en el intervalo de 10 a 15
minutos de la etapa S, sólo se consideran significativas un número
determinado de éstas. En la mayoría de casos, estas secuencias
requieren un tiempo de replicación superior en entre el 30% y el
40% de la duración de la etapa S.
Tal como se ha comentado anteriormente, las
fracciones (F) indicadas en la Tabla 2 corresponden a segmentos
entre ojos que requieren un tiempo de replicación que excede del
tiempo normalmente necesario para replicar la molécula respectiva.
Por ejemplo, tras un tiempo transcurrido de 10 minutos,
aproximadamente el 12% de la longitud total de la muestra que se ha
replicado al 96% (t = 45') quedaría sin replicar en ausencia de
nuevos inicios. En efecto, si únicamente se utilizasen dos
horquillas, el segmento de replicación tardía más grande (para una
molécula que ya se ha replicado al 82%) habría requerido un tiempo
de replicación 17 minutos más largo que el tiempo de duplicación
observado del genoma. Esta observación, junto con las grandes
desviaciones estándar observadas en los tamaños de ojo y las
distancias ojo a ojo sugieren que los orígenes se encuentran
dispersados aleatoriamente en todo el genoma de acuerdo a un
proceso estocástico. Sin embargo, debe indicarse que estas
observaciones no excluyen la posibilidad de un nivel de organización
no aleatorio más elevado de replicación del ADN, y se refieren a
segmentos del genoma que generalmente varían entre aproximadamente
10 y 300 kb de longitud (25).
La distribución aleatoria de tamaños de los ojos
de replicación y de las longitudes ojo a ojo en cada punto del
tiempo (datos no mostrados) indican que los orígenes se activan
durante la etapa S sin ninguna organización temporal o espacial
aparente. Debido a que cualquier segmento del genoma se replica una
y sólo una vez, la observación de que se forman nuevas horquillas
durante la totalidad de la etapa S sugiere que el número de
horquillas formadas nuevamente por kilobase potencialmente podría
incrementarse a medida que progresa la etapa S (figura 2B; Tabla
2). El factor crítico en este caso es la fracción de ADN que queda
por replicar en el momento en que se forman las horquillas. Esta
fracción corresponde a los segmentos teñidos de verde o a los
segmentos entre ojos de la molécula. Por lo tanto, suponiendo que
las dos nuevas horquillas corresponden a un único suceso de inicio,
resulta necesario calcular el número de sucesos de inicio que se
producen por fracción no replicada de cada molécula.
Lo anterior se lleva a cabo calculado hacia
atrás en el tiempo a partir de los tamaños de los ojos de
replicación y después determinando la fracción de ADN que queda por
replicar en este tiempo. Más específicamente, se calcula la
frecuencia de inicio clasificando los ojos de replicación de
acuerdo a sus tamaños y después determinando la densidad de ojos de
replicación de tamaño comprendido entre 3 y 8 kb. Este intervalo es
una estimación del número de ojos formados a partir de un único
suceso de inicio, dado que el tamaño medio de replicón es de 14 a
16 kb. A continuación, se mapean los sucesos de inicio para cada
molécula en el tiempo calculando hacia atrás a partir del tamaño de
ojo de replicación: t_{1} = L_{ojo}/(2 x velocidad de
horquilla). Seguidamente se determina el número de sucesos de
inicio por molécula con respecto a la fracción de la molécula que
queda por replicar en el momento del tiempo en que se produjeron los
sucesos. Después se compara el número de sucesos por segmento no
replicado, denominado en la presente
memoria "densidad de nucleación", con la cantidad de ADN ya replicado en ese tiempo para esa molécula particular.
memoria "densidad de nucleación", con la cantidad de ADN ya replicado en ese tiempo para esa molécula particular.
De esta manera, los presentes inventores han
encontrado que el número de sucesos de nucleación por fracción no
replicada de ADN se incrementa en el tiempo y con respecto al
porcentaje de ADN ya replicado en cada muestra (figuras 5A y 5B). Se
encontró que el incremento medio desde el inicio de la replicación
hasta la terminación de la síntesis del ADN era de por lo menos 3,5
veces. En algunos casos el incremento era de hasta 9 veces.
La frecuencia de inicio calculada utilizando
este enfoque proporciona un límite inferior del número de sucesos
por kilobase por minuto. De acuerdo con este procedimiento, todos
los ojos de replicación menores de 8 kb se supone que corresponden
a sucesos de inicio individuales, mientras que éste no es el caso si
los inicios se producen de acuerdo a un proceso estocástico. Sin
embargo, este sesgo no afecta significativamente a la medición del
incremento medio de la frecuencia de inicio durante la etapa S.
Resulta interesante la observación de que los
últimos puntos del tiempo (es decir, t = 39' y t = 45') presentaban
una densidad de nucleación global más alta en todas las etapas de
replicación (Tabla 2). Esta observación indica que, de media, los
tamaños de replicón de las regiones de ADN de replicación tardía
eran menores que aquellos de las regiones de replicación temprana.
El incremento de la densidad de nuevas horquillas conduce a una
reducción correspondiente de las distancias ojo a ojo. Se observó
una distancia ojo a ojo media de 6 kb para las moléculas que se
había replicado entre el 80% y el 95% (figura 4). Suponiendo una
etapa S de 10 minutos y una velocidad de horquilla de 600 pb/minuto,
estas secuencias se replican en aproximadamente 5 minutos. Esta
aceleración observada de la velocidad de síntesis del ADN puede
explicar adecuadamente la duplicación del genoma sin necesidad de
apelar a un mecanismo que organice el ADN en unidades de
replicación regularmente espaciadas.
El tiempo de replicación más largo excedente de
la etapa S era de 17 minutos para una molécula que se había
replicado aproximadamente al 82%. Suponiendo que no se producen
nuevos inicios, únicamente dos horquillas replicarán este segmento,
que es de 38,4 kb al iniciarse la etapa S. Para una molécula que se
ha replicado al 82%, se requieren por lo menos 2,7 minutos para
completar su replicación, nuevamente suponiendo sólo dos horquillas
en la molécula. El tamaño del segmento no replicado en esta etapa
es de 23,6 kb. Sin embargo, si la frecuencia de inicio se incrementa
hasta en 4 veces, se formarán 8 horquillas para replicar el
segmento (distancia media ojo a ojo = 6 kb). Si dos horquillas
requieren 19,7 minutos, con 8 horquillas el segmento se habrá
replicado en aproximadamente 4,9 minutos (23,6 kb/(8 x 600 pb por
minuto). Ello es razonablemente consistente con el tiempo requerido
para replicar la molécula misma (es decir, 2,7 minutos) durante una
etapa S que dura 15 minutos. En efecto, un incremento de 7 veces de
la frecuencia resultaría en la replicación del segmento en tan sólo
2,8 minutos.
Los presentes resultados amplían nuestra
comprensión de los mecanismos de replicación del ADN,
particularmente en eucariotas y más particularmente en embriones en
etapas iniciales de Xenopus laevis. Estos datos confirman
resultados informados anteriormente sobre la dinámica de la etapa S
y la organización espacial de los replicones en el embrión temprano
de X. laevis. Se ha informado de una organización espacial
aleatoria de las replicaciones para la región de ADNr en esta etapa
del desarrollo (27). Los resultados de los presentes inventores
extienden esta observación al genoma mismo e indican que los
orígenes de replicación se encuentran dispersos en todo el genoma a
intervalos regulares pero con un intervalo medio de 15 kb. Dado que
la velocidad de la horquilla de replicación es de 600 pb/minuto, la
duración media de la etapa S será de aproximadamente 12,5 minutos.
Esta corta etapa S sugeriría que el programa de replicación se
encuentra controlado por un mecanismo no aleatorio que impone un
espaciado regular entre orígenes de replicación (21).
Sin embargo, una fracción significativa de las
moléculas analizadas en la presente memoria contienen un número de
secuencias no replicadas superior al esperado en una etapa S de 10
a 15 minutos de duración. Ello indica que incluso en etapas tardías
de la replicación, un número significativo de orígenes se
encuentran dispersos demasiado ampliamente para que puedan
replicarse las secuencias intermedias en el intervalo de tiempo
asignado. Sin embargo, la observación de los presentes inventores de
que la densidad de nucleación se incrementa a medida que transcurre
la etapa S sugiere que la velocidad relativa de síntesis de ADN se
acelera hacia el final de la etapa S. Esta observación podría
explicar cómo un programa de replicación aparentemente aleatorio
puede duplicar con éxito el genoma completo antes del inicio de la
mitosis.
Por lo tanto, estos resultados representan el
primer análisis a escala de genoma de la replicación del ADN en
X. laevis, y demuestran que una ventaja de la utilización del
peinado molecular para analizar la replicación del ADN es su
capacidad para obtener un número estadísticamente significativo de
mediciones con una muestra relativamente pequeña de ADN. Ello
permite realizar un análisis cuantitativo estadísticamente
significativo de la replicación del ADN. Los presentes inventores
han demostrado la fiabilidad de este enfoque utilizando el sistema
libre de células de Xenopus laevis como modelo. Sin embargo,
se entiende que puede utilizarse este enfoque para analizar
cualquier tipo de ADN genómico, incluyendo el ADN humano. Por lo
tanto, este enfoque resulta útil para un amplio abanico de estudios
que implican el control de la replicación del ADN, la estabilidad
del genoma y las relaciones dinámicas y estructurales que regulan la
replicación del ADN y la transcripción génica durante el
desarrollo.
Se listan en las páginas siguientes las
referencias citadas en la presente memoria.
Resultarán evidentes para los expertos en la
materia otras formas de realización de la invención a partir de la
consideración de la memoria descriptiva y de la práctica de la
invención que se da a conocer en la presente memoria. Se pretende
que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren únicamente
a título de ejemplos.
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Claims (28)
1. Procedimiento para la detección de un origen
de replicación en una molécula de ADN, que comprende:
a) incubar ADN en replicación en presencia de
nucleótidos marcados, en el que se incorporan los nucleótidos
marcados en el ADN en replicación;
b) alinear el ADN de la etapa a) sobre un
sustrato mediante peinado molecular; y
c) detectar los nucleótidos marcados que se
incorporaron en el ADN durante la replicación, en el que los
nucleótidos marcados se encuentran localizados en una región que
corresponde al origen de replicación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que los nucleótidos marcados se detectan con una sonda marcada
que se une a los nucleótidos marcados.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que la sonda marcada es un anticuerpo conjugado a un
marcaje.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el marcaje es fluorescente.
5. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el ADN se incuba con la sonda marcada antes de que el ADN se
alinee sobre el sustrato.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el ADN se incuba con una sonda marcada después de que el ADN
se alinee sobre el sustrato.
7. Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6,
que comprende además lavar el ADN tras la incubación con la sonda
marcada con el fin de eliminar los reactivos no específicos.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además lavar el ADN antes de alinearlo sobre el
sustrato.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el ADN es ADN genómico.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el sustrato es vidrio.
11. Procedimiento para la medición de la
velocidad de replicación del ADN, que comprende:
- a)
- añadir un primer nucleótido marcado a una mezcla de reacción, en el que la mezcla de reacción comprende ADN en replicación, y en el que el primer nucleótido marcado se incorpora en el ADN en replicación;
- b)
- añadir un segundo nucleótido marcado a la mezcla de reacción en diferentes intervalos de tiempo tras la adición del primer nucleótido marcado, en el que el segundo nucleótido marcado se incorpora en el ADN en replicación;
- c)
- alinear el ADN de la mezcla de reacción sobre un sustrato mediante peinado molecular;
- d)
- detectar el primer y segundo nucleótidos marcados, que se incorporaron en el ADN durante la replicación; y
- e)
- medir la distribución del primer y segundo nucleótidos marcados en el ADN alineado con el fin de determinar la velocidad de replicación del ADN.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el primer nucleótido marcado se detecta con una primera
sonda marcada que se une al primer nucleótido marcado, y el segundo
nucleótido marcado se detecta con una segunda sonda marcada que se
une al segundo nucleótido marcado.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la primera sonda marcada es un anticuerpo conjugado con un
primer marcaje, y la segunda sonda marcada es un anticuerpo
conjugado con un segundo marcaje, en el que el primer y segundo
marcajes son diferentes.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el primer y el segundo marcajes son fluorescentes.
15. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el ADN se incuba con la primera y segunda sondas marcadas
antes de alinear el ADN sobre el sustrato.
16. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el ADN se incuba con la primera y segunda sondas marcadas
después de que el ADN se alinee sobre el sustrato.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 o
16, que comprende además lavar el ADN tras la incubación con la
primera y segunda sondas con el fin de eliminar los reactivos no
específicos.
18. Procedimiento según la reivindicación 11,
que comprende además lavar el ADN antes de alinearlo sobre el
sustrato.
19. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el ADN es ADN genómico.
20. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el sustrato es vidrio.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que el primer nucleótido marcado es biotina-dUTP
y el segundo nucleótido marcado es
digoxigenina-dUTP.
22. Procedimiento de mapaje de un origen de
replicación en una molécula de ADN, que comprende:
- a)
- incubar el ADN en replicación en presencia de nucleótidos marcados, que se incorporan en el ADN en replicación;
- b)
- alinear el ADN de la etapa a) sobre un sustrato mediante peinado molecular;
- c)
- hibridar el ADN alineado con una sonda de nucleótidos;
- d)
- detectar los nucleótidos marcados y la sonda de nucleótidos; y
- e)
- medir las distancias entre los nucleótidos marcados que se incorporaron en el ADN durante la replicación y la sonda de nucleótidos con el fin de determinar la localización del origen de replicación con respecto a la sonda de nucleótidos.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que los nucleótidos marcados se detectan con un anticuerpo
conjugado con un marcaje.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que el marcaje es fluorescente.
25. Procedimiento según la reivindicación 23,
que comprende además lavar el ADN tras la incubación con el
anticuerpo con el fin de eliminar los reactivos no específicos.
26. Procedimiento según la reivindicación 23,
que comprende además lavar el ADN antes de alinearlo sobre el
sustrato.
27. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que el ADN es ADN genómico.
28. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que el sustrato es vidrio.
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