ES2216958T3 - Marcadores geneticos de la toxicidad, preparacion y utilizacion de los mismos. - Google Patents
Marcadores geneticos de la toxicidad, preparacion y utilizacion de los mismos.Info
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Abstract
Procedimiento de análisis del potencial tóxico de un compuesto de prueba, que comprende por lo menos una etapa de hibridación entre a) una muestra de ácidos nucleicos de células tratadas con este compuesto y b) un banco de ácidos nucleicos, comprendiendo dicho banco unos clones específicos de (porciones de) genes o transcritos característicos de situación de apoptosis, indicando el perfil de hibridación el potencial tóxico del compuesto de prueba.
Description
Marcadores genéticos de la toxicidad, preparación
y utilización de los mismos.
La presente invención se refiere a los campos
técnicos de la biotecnología, de la medicina, de la biología y de
la bioquímica. Sus aplicaciones se refieren a los campos de la
salud humana, animal y vegetal. Más particularmente, la invención
describe unos nuevos procedimientos que permiten determinar el
potencial tóxico de compuestos ensayados o predecir la sensibilidad
o la respuesta de pacientes a unos compuestos, así como unas
herramientas y estuches para la realización de estos procedimientos.
La invención describe también unos procedimientos para obtener unas
secuencias de ácidos nucleicos utilizables como marcadores
genéticos de la toxicidad. La invención es particularmente útil en
la industria farmacéutica, para el análisis del perfil tóxico de
moléculas que podrán entrar en desarrollo farmacéutico y/o en
composiciones farmacéuticas.
Los problemas de toxicidad constituyen la razón
principal de abandono de moléculas con objetivo terapéutico en el
curso del desarrollo preclínico y clínico. Según el conocimiento
del solicitante, no existe hasta el presente ninguna prueba que
permita diagnosticar rápidamente la toxicidad de moléculas en el
hombre. Las autoridades reglamentarias requieren sin embargo que
una nueva molécula candidato sea sometida a una serie de pruebas de
toxicidad, mutagenicidad, carcinogenicidad y teratogenicidad en
animales y a unos ensayos clínicos en el hombre. Estas pruebas son
largas, costosas, y sobre todo, parcialmente satisfactorias. Así,
la toxicidad en el animal está lejos de reflejar la toxicidad en el
hombre. Por otra parte, el número restringido de pacientes
enrolados en los ensayos clínicos no permite de forma sistemática
la identificación de problemas de toxicidad asociados a una
población pequeña y específica. La puesta a punto, el desarrollo y
la utilización de dichas pruebas permitirían identificar y eliminar
lo más corriente arriba posible las moléculas tóxicas. Unos nuevos
tratamientos podrían así ser puestos en el mercado más precozmente
y a un coste menor para las empresas farmacéuticas y, de rebote,
los organismos de salud y los consumidores. Además, dichas pruebas
podrían también permitir detectar ciertas toxicidades que son
solamente puestas en evidencia después de la puesta en el mercado
de compuestos.
Las pruebas actualmente disponibles no permiten
caracterizar suficientemente unos marcadores de toxicidad y el
potencial de toxicidad de moléculas. Algunas pruebas desarrolladas
en las bacterias (test de Ames) o en la levadura (como la descrita
por la patente US 4.997.757) determinan el poder mutágeno de
compuestos. Estas pruebas pueden detectar solamente unos insultos
realizados al nivel del ADN. Ahora bien, numerosas moléculas
ejercen efectos tóxicos sin en cambio ser mutágenas y no pueden por
tanto ser detectadas por dichas herramientas. Otras pruebas, tales
como las descritas en la solicitud WO 94/17208, utilizan un cierto
número de promotores de genes eucariotas conocidos o de elementos de
respuesta extraídos de estos promotores, inducidos en diferentes
situaciones de estrés, a fin de caracterizar el efecto tóxico de
moléculas. Sin embargo, el número restringido de estos marcadores
genéticos y el proceso medido (actividad de un promotor) no permiten
predecir el potencial tóxico de compuestos. Además, estas pruebas
son difíciles de realizar puesto que implican el cultivo de
progenies celulares transformadas, que comprenden una o varias
construcciones genéticas. El documento nº WO 99/42606 se refiere a
la utilización de algunos peces (teleósteos y teleóstomos) para la
evaluación de la toxicidad de compuestos.
La presente invención describe ahora unos
procedimientos eficaces y rápidos de determinación del potencial
tóxico de compuestos ensayados, así como las herramientas y equipos
para la realización de dichos procedimientos. El término
"toxicidad" designa en el sentido de la invención cualquier
efecto indeseable y/o secundario de un compuesto sobre el
metabolismo de una célula o de un tejido, tal como en particular su
potencial mutágeno, carcinógeno, teratógeno, etc., y más
generalmente cualquier alteración del metabolismo que pueda
conducir a un efecto nefasto del compuesto sobre la célula o el
tejido. La presente invención está más particularmente basada en la
genómica y en la puesta a punto de marcadores genéticos de la
toxicidad, utilizables para predecir el carácter tóxico de
cualquier tipo de compuesto sobre cualquier tipo de célula. La
presente invención describe también nuevos procedimientos para
obtener unas secuencias de ácidos nucleicos que permiten determinar
la toxicidad de moléculas (ej. unos marcadores genéticos de la
toxicidad), en particular de moléculas que entran en el desarrollo
farmacéutico y/o en unas composiciones farmacéuticas.
La presente invención descansa en parte sobre la
puesta en evidencia de que unos marcadores genéticos pueden ser
creados y utilizados para evaluar el carácter tóxico de compuestos
de ensayo. En particular, y de forma ventajosa, estos marcadores son
utilizables cualquiera que sea el compuesto tóxico a ensayar, y
cualquiera que sea el tipo celular sobre el cual este compuesto de
prueba es aplicado. Dichos marcadores, así como los soportes,
equipos y procedimientos de la invención permiten ventajosamente
generar de manera rápida unos perfiles de toxicidad particularmente
evolucionados y fiables. Además, estos marcadores, soportes,
equipos y procedimientos de la invención permiten también determinar
y atribuir a los compuestos de prueba unos índices de
toxicidad.
En particular, la presente invención muestra que
existen unos sucesos genéticos comunes entre unas situaciones de
toxicidad y unas vías metabólicas celulares inducidas en ausencia
de compuestos tóxicos. Dichos sucesos genéticos pueden por tanto ser
inducidos y después utilizados como marcadores de toxicidad. Como
se describirá en detalle en la presente descripción, dichos
marcadores pueden además ser seleccionados o modificados para
constituir unos bancos mejorados, que permitan un diagnóstico más
predictivo de la toxicidad de un compuesto. Más específicamente, la
presente invención muestra ahora que unos marcadores genéticos
inducidos en una célula en situación de desregulación de
vía(s) de señalización celular, en particular una célula en
la cual la viabilidad y/o la proliferación celular están
desreguladas (por ejemplo, en situación de apoptosis) pueden ser
utilizados para caracterizar de forma eficaz el perfil tóxico de
compuestos de prueba. De forma ventajosa, la invención muestra
también que estos marcadores pueden ser utilizados en unas pruebas
de toxicidad, independientemente del tipo de compuesto y del tipo
celular utilizado. La invención describe también la constitución de
bancos diferenciales de ácidos nucleicos, característicos de
desregulación(es) de vía(s) de señalización celular,
en particular de situaciones en las cuales la viabilidad y/o la
proliferación celular están desreguladas, y la puesta en evidencia
de que estos bancos son utilizables para evaluar con una fiabilidad
y una sensibilidad importantes el perfil tóxico de compuestos.
La invención permite también la identificación
y/o la caracterización de mutaciones o polimorfismos (en particular
de SNPs "Single Nucleotide Polymorphisms") característicos de
perfiles de sujetos, en particular del perfil que responde a un
compuesto o tratamiento, del perfil sensible a un efecto tóxico,
etc. Así, los bancos producidos representan una extracción de
secuencias que son movilizadas en el curso de desregulaciones de
señalización celular y en particular cuando tiene lugar estrés que
puede conducir a la apoptosis. La invención muestra que la
expresión de estas secuencias es modificada de forma específica en
respuesta a unos compuestos dados. Unas mutaciones o polimorfismos,
designados también SNPs (single nucleotide polymorphisms), pueden
afectar a los genes de los cuales derivan estas secuencias. Unos
individuos que presentan tales polimorfismos son, por tanto,
susceptibles de respuestas alteradas a los compuestos que movilizan
la expresión de estos genes. Uno de los aspectos de la invención
es, por tanto, permitir también una selección pertinente de los
genes implicados en los fenómenos tóxicos. Más precisamente, la
invención en el seno de esta selección permite realizar una
selección suplementaria de los genes implicados en la respuesta a
un compuesto dado. La invención proporciona una base para la
búsqueda de polimorfismos en un número restringido (10 a 50) de
genes cuyas modificaciones de expresión están ligadas al impacto
tóxico de un compuesto dado, pudiendo este pertenecer a cualquier
clase farmacológica y a cualquier familia química.
Un objeto de la invención reside por tanto más
particularmente en la utilización de marcadores genéticos
característicos de situación(es) de desregulación(es)
de vía(s) de señalización celular (situación(es) de
"desregulación") para caracterizar el perfil tóxico de
compuestos de ensayo. Más preferentemente, la invención tiene por
objeto la utilización de marcadores genéticos inducidos en
situación de desregulación para caracterizar el perfil tóxico de
compuestos de prueba. La invención se refiere más particularmente a
la utilización de clones de ácidos nucleicos que corresponden a
unos sucesos genéticos (por ejemplo transcripcionales y/o de
empalme característicos de situación(es) de desregulación)
como marcadores genéticos de toxicidad.
La invención tiene también por objeto unos
procedimientos de análisis del potencial tóxico de un compuesto de
prueba, que comprenden por lo menos una etapa de hibridación entre
a) una muestra de ácidos nucleicos de células tratadas por este
compuesto y b) una preparación (por ejemplo un banco) de ácidos
nucleicos que corresponden a unos sucesos genéticos característicos
de situación(es) de desregulación, indicando el perfil de
hibridación el potencial tóxico del compuesto de prueba.
La invención reside también en unos equipos o
kits para la realización de estos procedimientos, así como en unas
composiciones o bancos de ácidos nucleicos que comprenden unos
marcadores genéticos de desregulación(es) de la(s)
vía(s) de señalización celular o, también, en unos
procedimientos que permiten generar dichos marcadores.
La invención se refiere también a la utilización
de los clones o ácidos nucleicos descritos, para la identificación
de mutaciones o polimorfismos, en particular de SNPs,
correlacionados con la respuesta de sujetos a unos compuestos
farmacéuticos. La invención permite en efecto identificar un
conjunto de genes cuyas expresiones son modificadas en respuesta a
un compuesto dado. Estos genes pueden presentar en el seno de las
poblaciones humanas unas mutaciones o polimorfismos (de los cuales
los SNPs, single nucleotide polymorfphisms). La invención permite
seleccionar los genes y sus polimorfismos a estudiar a fin de
segregar unos pacientes en función de su genotipo para su capacidad
de responder de forma más o menos óptima a un compuesto y más
particularmente minimizando los riesgos de toxicidad.
A este respecto, la invención se refiere, más
generalmente, a la utilización de ácidos nucleicos representativos
de sucesos de empalmes, característicos de una situación
fisiopatológica dada, para la identificación o la caracterización de
SNPs correlacionados con dicha situación.
La invención se refiere también a un
procedimiento de identificación de SNPs u otras mutaciones o
polimorfismos que permite evaluar la respuesta de un sujeto a un
compuesto dado, que comprende (i) la identificación in vitro
de ácidos nucleicos característicos de sucesos de empalmes
inducidos en una célula tratada por dicho compuesto y (ii) la
identificación de SNPs u otras mutaciones o polimorfismos en el o
los genes que corresponden a unos ácidos nucleicos identificados en
(i). La invención proporciona así unos procedimientos y medios para
seleccionar unos genes para los cuales unos polimorfismos están
asociados a una toxicidad para un compuesto dado.
La invención se refiere también a una población
de ácidos nucleicos específicos de polimorfismos o SNPs así
identificados, en particular de iniciadores nucleotídicos para la
amplificación selectiva de polimorfismos o de sondas para la
hibridación selectiva con los polimorfismos considerados.
La invención se refiere también a unos
procedimientos para el análisis (por ejemplo la predicción, la
evaluación o la determinación) de la respuesta de un sujeto a un
compuesto de prueba, que comprende el estudio de polimorfismos, en
particular el análisis de SNPs, tales como los definidos
anteriormente.
La presente invención descansa por tanto en
particular sobre la definición y la puesta a punto de marcadores
genéticos de la toxicidad, utilizables en unos procedimientos de
predicción del carácter tóxico de compuestos de prueba, o como diana
para el estudio de los mecanismos de muerte celular y la búsqueda o
el desarrollo de productos terapéuticos.
La viabilidad y la diferenciación celulares son
reguladas por el balance que existe entre los fenómenos de mitosis
y de apoptosis. En el organismo, la homeostasia del tejido es
también regulada por este balance entre proliferación y muerte
celulares. Las alteraciones de este equilibrio constituyen la base
de las patologías, ya estén ligadas a un exceso (enfermedades
neurodegenerativas) o a un defecto de apoptosis (poliartritis
reumatoide, cánceres). La presente invención está fundada en
particular en la hipótesis de que las perturbaciones de este
equilibrio pueden también estar implicadas en unos fenómenos
tóxicos y que unos marcadores genéticos característicos de estos
sucesos de desregulación de las vías de señalización celular (en
particular de la viabilidad y/o de la proliferación celular)
podrían constituir unos marcadores eficaces de la toxicidad.
La presente invención muestra ahora que existen
unos sucesos genéticos comunes entre estas situaciones de
desregulación de las vías de señalizaciones celulares y de las
situaciones de toxicidad inducida por unos compuestos. La presente
invención proporciona también unos procedimientos para identificar,
caracterizar, seleccionar y aislar unos clones de ácidos nucleicos
que corresponden a estos sucesos genéticos, y muestra que pueden ser
utilizados eficazmente como marcadores genéticos de la toxicidad.
La invención describe también la constitución de bancos de dichos
clones, en particular, sobre soportes sólidos, y su utilización en
unos procedimientos de diagnóstico de la toxicidad de compuestos de
prueba.
En el contexto de la presente invención, el
término situación de desregulación o "desregulación" designa
cualquier situación de desregulación o alteración de una o varias
vías de señalización celular y, en particular, cualquier situación
de desregulación del crecimiento y/o de la viabilidad celular. Se
trata por tanto de cualquier célula en la cual una o varias vías de
señalización celulares han sido alteradas (es decir, en particular
inducida o reprimida), por ejemplo una situación de apoptosis, como
será descrito más en detalle en la continuación del texto.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "suceso genético característico de una situación de
desregulación" designa más particularmente cualquier
modificación de la actividad genética, en particular de la expresión
de genes (aumento o represión, supresión o inducción, etc.), de la
regulación postranscripcional (en particular del empalmado), de la
réplica, la aparición de deleciones, etc., característica de una
desregulación, es decir, inducida en una célula en situación de
desregulación. Queda entendido que cada suceso genético individual
característico de desregulación no es necesariamente específico de
esta situación, en la medida en que algunas vías de señalización
celular participan en unos procesos celulares múltiples. Sin
embargo, los bancos de ácidos nucleicos de la invención agrupan
diferentes clones y representan, por tanto, efectivamente, unas
signaturas genéticas características de dichas situaciones.
Los clones de la invención corresponden más
preferentemente a unos sucesos genéticos de transcripción y/o de
empalme característicos de desregulación(es). En el contexto
de la invención, el término "sucesos de transcripción" engloba
más particularmente cualquier actividad de expresión de genes, es
decir, la producción de transcritos primarios, premensajeros o
mensajeros a partir de regiones codificantes. La expresión
"sucesos de empalmado" designa más particularmente cualquier
suceso de empalmado ligado a una situación de desregulación, es
decir la aparición de formas particulares de empalmado, la
desaparición de formas particulares de empalmado, o eventualmente
la modulación de la cantidad de formas de empalmado, etc.
La invención describe por tanto la producción de
clones de ácidos nucleicos, que corresponden a dichos sucesos
genéticos característicos de situaciones en las que una o varias
vías de señalización celulares son alteradas, y su utilización como
marcadores genéticos de la toxicidad. Un clon de ácido nucleico
correspondiente a dicho suceso genético designa en el sentido de la
invención cualquier ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico
que comprende por lo menos una región cuya secuencia es específica
de este suceso. Así, se puede tratar de cualquier ácido nucleico
que comprenda una secuencia específica de una forma de empalmado o
de un delecionante característico de una situación de desregulación
o también de un gen expresado o regulado específicamente en
situación de desregulación. Dichos clones son por tanto unos ácidos
nucleicos susceptibles de hibridar, en el seno de una muestra de
ácido nucleico de prueba, con las formas de empalmado
características de la situación de desregulación o con los genes
expresados preferentemente o específicamente cuando tiene lugar la
situación de desregulación. Estos clones permiten así revelar, por
hibridación, la presencia de los sucesos genéticos apuntados en una
población de ácidos nucleicos de prueba.
Como se ha indicado anteriormente, la presente
invención muestra que unos marcadores genéticos característicos de
situaciones de desregulación pueden utilizarse como marcadores de
la toxicidad, y describe a este respecto la puesta a punto de
técnicas que permiten generar y aislar dichos marcadores.
Un objeto de la invención reside por tanto en
unos procedimientos que permiten generar unos marcadores genéticos
de la toxicidad. Los procedimientos de la invención comprenden más
particularmente la constitución de clones y de bancos de ácidos
nucleicos característicos de desregulación(es) de
vía(s) de señalización celular(es). Estos clones y
bancos pueden ser generados de diferentes maneras, como será
descrito en detalle a continuación. Por otra parte, los bancos de
la invención pueden comprender unas cantidades variables de clones
de ácidos nucleicos. Además, estos bancos son ventajosamente
depositados sobre unos soportes que facilitan la etapa de
hibridación y de análisis del perfil de hibridación.
El material de partida utilizado para la
producción de los clones y bancos comprende esencialmente unas
poblaciones de ácidos nucleicos derivadas de células en situación
de desregulación y unas poblaciones de ácidos nucleicos derivadas de
células en situación de control. En un modo más particular de
realización, el procedimiento de producción de marcadores genéticos
de la toxicidad según la invención comprende ventajosamente una
etapa de hibridación entre una muestra de ácidos nucleicos derivada
de una célula en situación de desregulación y una muestra de ácidos
nucleicos derivada de una célula en situación de control. Esta
etapa de hibridación permite generar unos (bancos de) clones de
ácidos nucleicos característicos de la célula en situación de
desregulación con respecto a la situación control.
Las poblaciones de ácidos nucleicos utilizadas
son por ejemplo unos ARN totales o unos ARN mensajeros de las
células en situación de desregulación y de control, o unos ácidos
nucleicos derivados de estos ARN totales o mensajeros (por
transcripción inversa, amplificación, clonado en unos vectores,
etc.). Estas poblaciones pueden ser preparadas por unas técnicas
convencionales conocidas por el experto en la materia
(transcripción inversa, amplificación, etc.).
La elección de la o de las situaciones de
desregulación, de la o de las situaciones de control, así como de
las técnicas de producción y de aislamiento de los marcadores son
importantes puesto que determinan la pertinencia de los marcadores
generados y, por tanto, de los bancos, así como para su facilidad
de utilización.
Como se ha indicado anteriormente, los marcadores
genéticos de la toxicidad según la invención se preparan
generalmente inicialmente a partir de preparaciones de ácidos
nucleicos que provienen de células en situación de desregulación.
Queda entendido que estos marcadores, una vez aislados y
caracterizados, pueden ser reproducidos o amplificados por unos
procedimientos artificiales, tales como la PCR, la síntesis
artificial (cuando las secuencias están disponibles), la
amplificación por cultivo bacteriano, la réplica de bancos, etc.,
como se ilustrará más adelante.
Como se ha indicado anteriormente, se entiende,
en el marco de la presente invención, por "situación de
desregulación", cualquier situación de desregulación del
crecimiento y/o de la viabilidad celular, por ejemplo cualquier
célula en la cual una vía de señalización celular por lo menos ha
sido alterada.
Según una variante particular de la invención, la
célula en situación de desregulación es una célula en la cual la
expresión de la totalidad o parte de un gen implicado en el
crecimiento o la viabilidad celular ha sido modificada.
Según otra variante particular de la invención,
la célula en situación de desregulación es una célula en la cual la
expresión de la totalidad o parte de un oncogeno o de un
antioncogeno implicado ha sido modificada.
Según otra variante particular de la invención,
la célula en situación de desregulación es una célula en la cual la
expresión de la totalidad o parte de un gen implicado en la
apoptosis celular ha sido modificada.
La apoptosis celular es un término conocido por
el experto en la materia, que designa el proceso de muerte celular
programada. La apoptosis engloba un conjunto de mecanismos, de
genes o de vías metabólicas celulares que conducen a la muerte de la
célula. Algunos de los sistemas iniciadores y ejecutores de la
apoptosis son, por ejemplo, los antioncógenos, los receptores Fas y
TNF, unos adaptadores (con "death domain" en particular), unos
miembros de la familia bcl2 o también unas caspasas, que están
implicados en la morfogénesis ontogénica, en las desregulaciones
patológicas y cuando tiene lugar la muerte celular.
En el marco de la invención, una situación de
apoptosis puede ser cualquier situación de iniciación, de ejecución
o de terminación de la apoptosis, es decir, una situación de
apoptosis en cualquier fase de avance del proceso de muerte celular,
comprendidas unas fases muy precoces en las cuales solamente
algunas vías metabólicas (o vías de señalización celulares) han
sido alteradas (por ejemplo, activadas, reprimidas, estimuladas,
etc.). Los clones de la invención pueden por tanto ser producidos a
partir de cualquier célula en la cual por lo menos una vía de
señalización celular ha sido alterada, en la cual, en particular,
una vía apoptósica ha sido por lo menos iniciada. Puede así
tratarse de células en las cuales una vía metabólica que participa
en el proceso de apoptosis ha sido inducida o estimulada, incluso si
esta inducción o estimulación es realizada en unas condiciones
subletales (es decir, que no conducen a la muerte de la célula). A
este respecto, puede tratarse de células en situación natural de
apoptosis (como por ejemplo una población de células en unos
tumores, algunas células nerviosas en situaciones patológicas,
etc.), o bien células en las cuales la situación de apoptosis ha
sido artificialmente inducida. En este último caso, la situación de
apoptosis puede ser inducida por diferentes tipos de tratamientos,
y en particular por la modulación de la actividad, preferentemente
de la expresión de genes iniciadores o ejecutores de la
apoptosis.
En un modo particular, los marcadores genéticos
de la invención son producidos inicialmente a partir de una
población de células en la cual una situación de apoptosis ha sido
inducida artificialmente, por inducción o represión de la actividad,
preferentemente de la expresión de la totalidad o parte de un gen
iniciador o ejecutor de la apoptosis.
Según una variante preferida de la invención, la
célula en situación de desregulación es una célula en la cual la
activación, preferentemente la expresión de la totalidad o parte de
un gen antioncógeno (o gen supresor de tumor) ha sido inducida o
aumentada, por ejemplo por sobreexpresión, modificación(es)
postraduccional(es) (fosforilación, glicosilación, etc.),
localización intracelular desregulada, asociación con unos
compañeros funcionales diferentes, etc.
En un modo particularmente preferido de
realización de la presente invención, los sucesos genéticos
característicos de una situación de desregulación son los sucesos
genéticos inducidos por modificación de la expresión de uno o varios
genes iniciadores o ejecutores de la apoptosis, en particular de
uno o varios genes supresores de tumores (o de una variante
funcional de dichos genes).
Puede tratarse en particular de cualquier célula
en la cual se ha inducido una sobreexpresión de un antioncógeno. En
particular, puede tratar se de una célula en la cual una
construcción genética ha sido introducida, permitiendo inducir o
aumentar la cantidad de antioncógeno en esta célula. Unos ejemplos
particulares de genes antioncógenos (designados también genes
supresores de tumores) son en particular p53 (Eliyahu et al.,
Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:8763-7; Finlay
et al., Cell (1989) 57, 1083-93), Rb (Lee
et al., Science (1987) 235, 1394-9), p73
(Kaghad et al., Cell (1997) 90, 809-19),
TUPRO-2 (US5, 849, 899), NHTS (US5,892,016), p15
(Hannon et al., Nature 371 (1994) 257), p16 (Ivison et
al., Nature Genet. 371 (1994) 180), etc., pero no están
limitados a solamente estos ejemplos.
Un ejemplo típico de situación de desregulación
según la invención es generado por inducción o aumento de la
actividad, preferentemente de la expresión de p53. En el cruce
entre vida y muerte celular, se sitúa p53, gen supresor de tumor (o
antioncógeno), que regula negativamente el crecimiento celular
provocando un paro al final de la fase G1. Este paro del ciclo
celular está caracterizado por una represión de la expresión de los
genes implicados en la progresión de la fase G1 a la fase S y la
inducción de genes específicos. La abolición de estas funciones de
p53 es uno de los mecanismos en juego en la formación de un gran
número de tumores en los que se han observado la deleción o unas
mutaciones en el gen p53. Una sobreexpresión de p53 puede inducir
la apoptosis en diferentes tipos celulares. Esta sobreexpresión,
inducida por infección con la ayuda de virus que permiten la
expresión de la forma salvaje de p53, es la base de tratamientos de
cánceres por terapia génica. La inducción de la expresión p53 puede
también ser observada en fisiología y ha sido descrita en
particular cuando tiene lugar la reestructuración de la glándula
mamaria unida al paro de la lactancia. Una inducción de apoptosis
por retirada de suero, situación que afecta a un gran número de
vías metabólicas, ha sido también descrita implicando una
estabilización p53.
La inducción de p53 inicia, en las células, un
programa de muerte celular cuando las roturas del ADN desbordan los
sistemas de reparación de la célula. Esta inducción de apoptosis
pone a contribución en particular el sistema Fas y las caspasas
cuyos mensajeros deben ser empalmados de manera que sean expresadas
las isoformas competentes para la muerte celular.
Además, p53 es conocido para regular la expresión
de genes implicados en otros procesos celulares variados como la
regulación del ciclo celular, la angiogénesis, la respuesta al
estrés oxidativo, la alteración del ADN o el crecimiento celular.
P53 ejerce, por otra parte, una función directa sobre las
respuestas celulares a la alteración del ADN, la hipoxia, el
potencial redox de las células o la adhesión celular. Por otra
parte, se ha demostrado que p53 podía emigrar desde el núcleo
celular hasta las mitocondrias, donde es capaz de interactuar con
la proteína hsp70, pudiendo esta dirección mitocondrial causar la
muerte celular. Las signaturas obtenidas según la presente
invención después de inducción de p53 permiten, por tanto, estudiar
el conjunto de estas vías de señalización y proporcionar una
respuesta completa y predictiva del potencial tóxico de
compuestos.
La invención describe más particularmente la
utilización de marcadores genéticos inducidos por la activación,
preferentemente la expresión de p53 (en particular p53 salvaje)
para caracterizar el perfil tóxico de compuestos de pruebas. La
invención se refiere más preferentemente a la utilización de clones
de ácidos nucleicos que corresponden a unos sucesos genéticos (por
ejemplo transcripcionales y/o de empalmado) inducidos por la
activación, preferentemente la expresión de p53 (en particular p53
salvaje) como marcadores genéticos de toxicidad.
La invención describe más particularmente la
obtención y la utilización de clones de ADNc que corresponden a
unos sucesos genéticos cualitativos y/o cuantitativos diferenciales
entre unas células controles (por ejemplo en proliferación) y unas
células comprometidas en un proceso de apoptosis por inducción de
la forma salvaje de p53.
Queda entendido que existen otras posibilidades
de someter unas células a un estrés susceptible de ponerlas en la
vía de la muerte celular programada (apoptosis) o de alterar unas
vías de señalización celular. La invención se refiere por tanto
también a la utilización de otros modelos celulares tales como los
basados en la expresión inducible (o constitutiva) de la totalidad
o parte de genes de antioncógenos, de promotores, de iniciadores y
ejecutores de apoptosis.
Entre estos genes pueden elegirse ventajosamente
RB, el producto del gen del retinoblastoma, p73, proteína homóloga a
p53, myc o cualquier otra proteína o fragmento de proteína capaz de
interferir con el crecimiento y la viabilidad celular. Como se ha
indicado anteriormente, también puede tratarse, por ejemplo, de una
célula tumoral o de una célula nerviosa en degenerescencia.
Otros tipos de material de partida están
constituidos, por ejemplo, por muestras que contienen células en
las cuales la proliferación está desregulada por activación de
cascadas oncogénicas (tales como la vía de señalización ras),
inactivación de genes supresores de tumores, inhibición de cascadas
apoptósicas, inhibición o activación de vías mediadas por unas
quinasas (por ejemplo la quinasa pl3, que estimula la proteína Akt),
inhibición de la expresión de genes por medio de ARN o de
oligonucleótidos antisentido, etc. Un ejemplo particular de células
es proporcionado por unas células tumorales obtenidas a partir de
biopsias de tumores (en este caso, los marcadores genéticos según la
invención son los característicos de la célula tumoral con respecto
a una muestra de tejido control, en particular sano, extraído por
biopsia).
Además, la situación de desregulación puede
también ser inducida por uno o varios compuestos tóxicos
seleccionados, que actúan sobre la viabilidad celular según unos
procesos que afectan la integridad del genoma (genotoxicidad), el
potencial redox de la célula, la respuesta iniciada por algunos
receptores de superficie, la conformación de las proteínas o el
estatuto energético de la célula, por ejemplo. Dichos compuestos
pueden en particular ser utilizados en combinación con las
aproximaciones de inducción descritas anteriormente, basadas en
unas modificaciones de la expresión de genes.
La población celular utilizada para inducir una
situación de desregulación puede ser de origen y de naturaleza
diversos, tales como unas células epiteliales, hepáticas,
pulmonares, nerviosas, musculares, fibroblásticas, etc. Se trata de
manera preferida de células humanas. Puede tratarse de cultivos
primarios o de progenies establecidas, en las cuales la
desregulación es inducida en las condiciones descritas
anteriormente. Puede también tratarse de muestras tumorales que
comprenderán unas células en situación de desregulación o de
células privadas de suero, por ejemplo. Como se indica más adelante,
unos marcadores genéticos de desregulación utilizables como
marcadores de la toxicidad según la invención pueden ser producidos
a partir de diferentes tipos de células.
La situación de control utilizada es generalmente
una población de células del mismo tipo que la célula utilizada
para la situación de desregulación, incluso pueden ser utilizados
unos tipos celulares diferentes. La situación de control puede ser
una situación normal quiescente, proliferativa o incluso de
desregulación, pero con un grado o una fase menos avanzado que la
situación de desregulación de referencia.
Típicamente, la situación de desregulación es una
situación de inducción de la activación, preferentemente la
expresión de un gen supresor de tumor, tal como p53 o Rb, y la
situación de control es una situación de ausencia de inducción de
esta activación, preferentemente expresión, o de inducción a un
nivel más bajo. En otro ejemplo, la situación de desregulación es
una población de células cancerosas y la situación control es una
población de las mismas células en estado sano. Unos ejemplos
específicos de células se dan en la sección experimental.
Como se ha indicado anteriormente, el
procedimiento de producción de marcadores genéticos de la toxicidad
según la presente invención, comprende ventajosamente una etapa de
hibridación entre una muestra de ácidos nucleicos derivada de una
célula en situación de desregulación y una muestra de ácidos
nucleicos derivada de una célula en situación de control. Esta
etapa de hibridación permite generar unos clones de ácidos nucleicos
característicos de la célula en situación de desregulación con
respecto a la situación de control.
Las poblaciones de ácidos nucleicos son por
ejemplo unos ARN totales o unos ARN mensajeros de las células en
situación de desregulación y de control, o unos ácidos nucleicos
derivados de estos ARN totales o mensajeros (por transcripción
inversa, amplificación, clonado en unos vectores, etc.). Estos
ácidos nucleicos pueden ser preparados según las técnicas conocidas
por el experto en la materia. Brevemente, estas técnicas comprenden
generalmente una lisis de las células, tejido o muestra y el
aislamiento de los ARNs por unas técnicas de extracción. Puede
tratarse en particular de un tratamiento por medio de agentes
caotrópicos tales como el tiocianato de guanidinio (que destruye las
células y protege los ARN) seguido de una extracción de los ARN por
medio de solventes (fenol, cloroformo por ejemplo). Dichos
procedimientos son bien conocidos por el experto en la materia (ver
Maniatis et al., Chomczynski et al., Anal. Biochem.
162 (1987) 156), y pueden ser fácilmente practicados utilizando
unos kits disponibles en el comercio tales como por ejemplo el kit
US73750 (Amersham) para los ARN totales. No es necesario que los ARN
utilizados sean perfectamente puros y, en particular, no es molesto
que unas trazas de ADN genómico u otros componentes celulares
(proteína, etc.) subsistan en las preparaciones, puesto que no
afectan significativamente a la estabilidad de los ARNs. Además, de
manera facultativa, es posible utilizar no unas preparaciones de
ARN totales sino unas preparaciones de ARN mensajeros. Estos pueden
ser aislados, o bien directamente a partir de la muestra biológica,
o bien a partir de los ARN totales, por medio de secuencias polyT,
según los procedimientos clásicos. La obtención de ARN mensajeros
puede a este respecto ser realizada por medio de kits comerciales
tales como por ejemplo el kit US72700 (Amersham). Los ARN pueden
también ser obtenidos directamente a partir de bancos u otras
muestras preparadas de antemano y/o accesibles en unas colecciones,
conservadas en unas condiciones apropiadas.
La hibridación puede ser realizada en diferentes
condiciones, que pueden ser ajustadas por el experto en la materia.
Preferentemente, se utiliza para la hibridación un exceso de la
población de ácidos nucleicos derivados de la situación de
desregulación con respecto a la población de ácidos nucleicos
derivados de la situación de control.
A partir del producto de la reacción de
hibridación, pueden ser utilizados dos tipos principales de
aproximaciones para aislar los clones característicos de
desregulación según la invención. La primera, puramente
cuantitativa, permite generar una preparación de ácidos nucleicos
que reagrupan el conjunto (o una parte significativa) de los clones
que resultan de una diferencia de nivel de expresión entra las dos
situaciones. Dichos clones (y bancos) se obtienen según las
técnicas conocidas de hibridación substractiva, que consisten
esencialmente en eliminar los híbridos formados cuando tiene lugar
la etapa de hibridación para conservar solamente los clones no
hibridados, característicos de la situación de desregulación con
respecto a la situación de control elegida.
En un modo preferido de realización, se utiliza
sin embargo un procedimiento cualitativo, que permite generar una
preparación de ácidos nucleicos que agrupan el conjunto (o una
parte importante) de los clones que resultan de alteraciones
genéticas funcionales características de la situación de
desregulación con respecto a la situación de control elegida. Más
particularmente, un banco cualitativo de este tipo comprende no el
conjunto de los clones cuya expresión está modificada sino por
ejemplo los clones que corresponden a unos empalmes o a unas
deleciones diferenciales entre las dos situaciones. Teniendo en
cuenta la función de los empalmes alternativos en las vías de
regulación y de transformación celulares, dichas preparaciones (y
bancos) comprenden ventajosamente unos clones que tienen un valor
funcional importante y, por tanto, susceptibles de reflejar unas
modificaciones genéticas implicadas en la situación de
desregulación. Dichos clones permiten por tanto constituir unos
bancos más predictivos y generar unos marcadores genéticos más
representativos.
La constitución de dichos bancos cualitativos
puede ser realizada por aislamiento, a partir de los híbridos
formados cuando tiene lugar la etapa de hibridación, de las
regiones de ácidos nucleicos que corresponden a unos empalmados
diferenciales o a unas deleciones. Según los procedimientos
empleados, estas regiones corresponden, o bien a las regiones no
emparejadas, o bien a las regiones emparejadas.
Estas dos aproximaciones se describen más en
detalle a continuación.
En un primer modo de realización, se utilizan por
tanto en la presente invención un banco diferencial cuantitativo,
es decir, un banco que comprende unos clones de ácidos nucleicos
que corresponden a unos genes cuyo nivel de expresión está
modificado en unas células en situación de desregulación con
respecto a una situación de control. Dichos bancos pueden salir por
ejemplo de análisis diferenciales cuantitativos y agrupar las
secuencias cuya expresión es aumentada o disminuida cuando tienen
lugar fenómenos de desregulación celular. Las metodologías para
establecer este tipo de banco son conocidas por el experto en la
materia y pueden ser agrupadas en las siguientes categorías:
Este procedimiento está basado en el secuenciado
aleatorio de un cierto número de cDNAs. Un motor de búsqueda
informática puede, a continuación, ser utilizado para efectuar una
sustracción entre dos situaciones analizadas.
Este procedimiento está basado en el
reconocimiento de una signatura asociada a cada cDNA utilizando unas
enzimas de restricción y unos oligonucleótidos adaptadores. Esta
etiqueta corresponde a una parte de la secuencia del cDNA (larga de
10 nucleótidos a fin de identificar de forma no ambigua el cDNA
correspondiente). Estas etiquetas son a continuación reunidas para
ser secuenciadas y después analizadas (Velculescu et coll.,
Science, 1995, 270:484-487). Esta aproximación
representa por tanto un acortamiento con respecto al secuenciado
sistemático.
Este procedimiento descansa sobre el depósito de
ácidos nucleicos (oligonucleótidos, fragmentos PCR, cDNAs) sobre
soportes sólidos (membranas, placas de vidrio, biochips) con mayor
o menor densidad. Unas sondas que provienen de ARN mensajeros de
muestras sanas o patológicas son a continuación utilizadas para
hibridación a fin de identificar los mensajeros que están o bien
sobreexpresados o bien reprimidos.
Esta técnica utiliza un iniciador
oligo-dT y unos iniciadores aleatorios para
realizar unas reacciones PCR sobre unas poblaciones de ADNc. Los
productos de PCR son entonces comparados sobre unos geles muy
resolutivos. Los fragmentos expresados de forma diferencial son a
continuación aislados y su presencia es confirmada por
Northern-blots antes del secuenciado.
Se han desarrollado varias variantes de esta
tecnología (Prashar y Weissman, PNAS, 1996,
93:659-663). Estas variantes difieren por sus
iniciadores y por la elección de las enzimas de restricción y de
los adaptadores utilizados. Como la tecnología SAGE, las mismas se
dirigen a los extremos 3' de los cDNAs. Varios kits están también
disponibles en el mercado a fin de hacer accesible esta
aproximación.
Esta técnica está basada en la eliminación de
cDNAs comunes a dos muestras que se desea comparar. Así, se han
propuesto diferentes kits de sustracción en los cuales el cDNA
"tester" está hibridado con exceso de cDNA "driver"
(Clontech). El producto final está constituido por un pool de
fragmentos amplificados por PCR derivado de los cDNAs expresados de
forma diferencial, que puede ser clonado en un vector apropiado
para análisis ulterior. La tecnología RDA (Representational
Difference Analysis) está también basada en este principio de
sustracción (Lisitsyn et coll., Science, 1993,
259:946-951).
La utilización de estas técnicas de análisis
diferenciales permite por tanto generar unos clones y unos bancos
cuantitativos, es decir, que agrupan el conjunto de las secuencias
cuya expresión es aumentada o disminuida cuando tienen lugar
fenómenos de desregulación(es) celular(es).
En otro modo de realización, se utiliza
ventajosamente en la presente invención un banco diferencial
cualitativo, es decir, un banco que comprende unos clones de ácidos
nucleicos de los que una parte por lo menos de la secuencia
corresponde a la secuencia de genes empalmados de forma diferencial
en unas células en situación de desregulación. Este tipo de banco
agrupa por tanto las secuencias empalmadas de forma diferencial
cuando tienen lugar procesos de desregulación.
La utilización de este tipo de banco es
particularmente ventajosa. En efecto, diferentes estrés celulares
que conducen a la muerte celular o a otras desregulaciones utilizan
unos iniciadores y unos ejecutores de las vías de señalización y
regulan los elementos claves del ciclo celular, tal como p53. La
regulación del nivel de expresión de esta proteína se realiza
principalmente por su estabilización y por aumento de transcripción.
Si el receptor Fas, los miembros de la familia bcl2 y las caspasas
son regulados al nivel de su transcripción, son además controlados
a nivel de la maduración, del empalmado, de su ARN premensajero.
Este nivel de regulación postranscripción es crítico puesto que
determina, a partir de un mismo suceso de transcripción, la génesis
de una forma pro o antiapoptósica de cada uno de los miembros de
las familias proteínicas interesadas. Estas modificaciones de la
transcripción y del empalmado son reguladas por el metabolismo y la
señalización celulares. Los factores de regulación de la
transcripción y del empalmado que regulan en "trans" estas
etapas clave de la expresión génica son unas proteínas cuya
actividad está regulada, por fosforilación en particular, según el
estado de proliferación, de diferenciación o de viabilidad de la
célula. El programa de empalmado que es iniciado cuando tienen lugar
las desregulaciones celulares y que moviliza los diferentes
iniciadores y ejecutores de la muerte celular, traduce, por tanto,
las modificaciones de señalización celular debidas a las diferentes
agresiones. Afectando a las maquinarias de la transcripción y del
empalmado, estas modificaciones desempeñan sobre la expresión de
numerosos genes que no están limitados a los genes descritos para
desempeñar una función de iniciadores o de ejecutores de
desregulación pero que intervienen a diferentes niveles de las
cascadas de señalización. Así mismo, las cascadas alteradas cuando
tiene lugar la oncogénesis, en particular por expresión de variantes
de empalmados, movilizan unos marcadores cuya expresión no está
restringida a los tumores.
Para tener en cuenta estos fenómenos y esta
complejidad y proporcionar así una respuesta más predictiva sobre el
potencial tóxico de un compuesto de prueba, el procedimiento de la
invención utiliza por tanto ventajosamente como marcadores
genéticos de la toxicidad, unos sucesos de empalmado característicos
de situaciones de desregulación.
Para ello, la presente invención utiliza por
ejemplo unos bancos de ácidos nucleicos cualitativos diferenciales
producidos según la metodología "DATAS" descrita en la
solicitud de patente internacional nº WO99/46403. En particular,
dichos bancos pueden ser preparados por hibridación entre la
población de ácidos nucleicos derivadas de las células en situación
de desregulación y la población de ácidos nucleicos derivada de las
células en situación de control, y aislamiento, a partir de los
híbridos formados, de los ácidos nucleicos que corresponden a unos
empalmados diferenciales.
En esta aproximación, la hibridación es
preferentemente realizada en fase líquida. Además, la misma puede
ser efectuada en cualquier dispositivo apropiado, tal como por
ejemplo unos tubos (Eppendorff, por ejemplo), unas placas, o
cualquier otro soporte adecuado y corrientemente utilizado en
Biología Molecular. La hibridación se realiza ventajosamente en
unos volúmenes comprendidos entre 10 y 1.000 \mul, por ejemplo
entre 10 y 500 \mul. Queda entendido que el dispositivo utilizado
y los volúmenes utilizados pueden ser fácilmente adaptados por el
experto en la materia. Las cantidades de ácidos nucleicos
utilizadas para la hibridación son también conocidas por el experto
en la materia. En general, es suficiente utilizar unos microgramos
de ácidos nucleicos, por ejemplo del orden de 0,1 a 100 \mug. Por
otra parte, es posible utilizar los ácidos nucleicos en una
relación driver/tester que varia de 50 a 0,02 aproximadamente,
preferentemente de 40 a 0,1. De forma más particularmente
ventajosa, se prefiere que esta relación sea próxima o superior a
1, ventajosamente entre 1 aproximadamente y 10 aproximadamente.
Queda entendido que esta relación puede ser adaptada por el experto
en la materia según las condiciones del procedimiento (cantidades
de ácidos nucleicos disponibles, situaciones fisiológicas, objetivo
perseguido, etc.). Los otros parámetros de la hibridación (tiempo,
temperatura, fuerza iónica) son también adaptables por el experto
en la materia. De manera general después de la desnaturalización de
"tester" y "driver" (por calentamiento, por ejemplo), la
hibridación se realiza durante aproximadamente de 2 a 24 horas, a
una temperatura de 37ºC aproximadamente (eventualmente sometida a
unos saltos de temperatura), y en unas condiciones estándar de
fuerza iónica (que pueden variar de 0,1 a 5M NaCI por ejemplo). Es
conocido que la fuerza iónica es uno de los factores que determina
la astringencia de una hibridación, en particular en el caso de
hibridación sobre soporte sólido.
Según un modo de realización particular de la
invención, la hibridación se realiza en emulsión fenólica, por
ejemplo según la técnica PERT ("Phenol Emulsion DNA Reassociation
Technique") descrita por Kohne D.E. et al. (Biochemistry,
Vol. 16, Nº 24, pp 5329-5341, 1977).
Ventajosamente, la hibridación se realiza en emulsión fenólica
mantenida por termociclos (saltos de temperatura de 37ºC
aproximadamente a 60/65ºC aproximadamente) y no por agitación, según
la técnica descrita por Miller y Riblet (NAR 23(1995)
2339).
Cualquier otra técnica de hibridación en fase
líquida, preferentemente en emulsión, puede ser utilizada en el
marco de la presente invención. Por otra parte, la hibridación
puede realizarse también con uno de los participantes inmovilizado
sobre un soporte. Ventajosamente, es el driver el que está
inmovilizado. Esto puede ser realizado en particular gracias a unos
iniciadores biotinilados o por cualquier otra técnica de
inmovilización conocida por el experto en la materia.
A partir de las poblaciones de ácidos nucleicos
generadas por hibridación, los marcadores genéticos de la invención
(los clones característicos de las alteraciones genómicas
cualitativas) pueden ser identificados por cualquier técnica
conocida por el experto en la materia. En el caso de los
heteroduplex ARN/ADN, estas regiones se presentan esencialmente en
forma de regiones de ARN no emparejadas (bucles de ARN), y pueden
ser identificadas y clonadas por separación de los heteroduplex y de
los ácidos nucleicos de simple rama (exceso de ácido nucleico que
no ha reaccionado), digestión selectiva de los ARN de doble rama
(campos acoplados en los heteroduplex), y después separación de los
ARN de rama simple que resultan y de los ADN de rama simple. En el
caso de los heterotriplex, estas regiones de empalmados
diferenciales se presentan esencialmente en forma de regiones de
ADN de doble rama y pueden ser identificadas y clonadas por
tratamiento en presencia de enzimas apropiadas tales como una enzima
que permite digerir los ARN y, después, una enzima que permita
digerir los ADN de rama simple. Los ácidos nucleicos así obtenidos
están directamente en forma de ADN de doble rama y pueden ser
clonados en cualquier vector apropiado.
Queda entendido que otras variantes y condiciones
precisas para el aislamiento de los ácidos nucleicos, las
hibridaciones y la obtención de los clones cualitativos están
indicadas en la solicitud nº WO99/46403.
Estas metodologías permiten generar unos clones y
unos bancos de ácidos nucleicos que corresponden a unos marcadores
genéticos cualitativos de situación(es) de desregulación.
Como se ha indicado en la sección experimental, estas preparaciones
de ácidos nucleicos representan unos marcadores particularmente
útiles para caracterizar el perfil tóxico de los compuestos.
Las metodologías descritas anteriormente permiten
por tanto generar unos conjuntos de clones de ácidos nucleicos
característicos de situaciones de desregulación. Cada técnica de
preparación genera numerosos clones, que constituyen unos bancos.
Estos bancos pueden ser utilizados tal cual, depositados sobre unos
soportes o modificados por adición o supresión de clones, agrupado
entre diferentes bancos, adición de clones testigos, etc.
Los bancos de la invención pueden comprender, por
ejemplo, de 10 a 50.000 clones, más generalmente de 10 a 10.000
clones, incluso más preferentemente de 50 a 5000 clones. Los clones
están generalmente depositados, de forma ordenada, sobre uno o
varios soportes, de manera que faciliten el análisis de los
resultados de hibridación. El soporte puede ser de vidrio, nylon,
plástico, fibra, etc., de manera general cualquier soporte sólido
adaptado para la extensión de ácidos nucleicos. El depósito de los
bancos sobre los soportes puede ser realizado por unas técnicas
convencionales conocidas por el experto en la materia, que se
describen, por ejemplo, en la solicitud internacional WO
99/46403.
Los bancos utilizados pueden comprender a la vez
unos clones de ácidos nucleicos que corresponden a unos genes cuyo
nivel de expresión está modificado en unas células en situación de
desregulación (marcadores genéticos cuantitativos) y unos clones de
ácidos nucleicos de los que una parte por lo menos de la secuencia
corresponde a la secuencia de genes empalmados de forma diferencial
en unas células en situación de desregulación (marcadores genéticos
cualitativos). Así, los marcadores genéticos pueden ser generados
según unas aproximaciones diferentes y después mezclados para
obtener una respuesta tan predictiva como sea posible.
A este respecto, es también posible utilizar unos
bancos que comprenden unos clones generados a partir de diferentes
situaciones de desregulación. Así, como se ha indicado
anteriormente, las situaciones de desregulación pueden ser inducidas
de diferentes maneras (aumento de la expresión del gen p53, aumento
de la expresión del gen Rb, utilización de poblaciones celulares
diferentes, utilización de una célula tumoral, etc.). Estas
diferentes situaciones de desregulación no inducen siempre
exactamente los mismos sucesos genéticos y, por tanto, no siempre
exactamente los mismos bancos de ácidos nucleicos según la
invención. Si bien cada uno de los bancos puede ser utilizado
individualmente en el marco de la presente invención, es también
posible combinarlos entre sí sobre un mismo soporte (o sobre unos
soportes separados), de manera que aumente aún el número de
marcadores genéticos de la toxicidad y así mejorar la
predictibilidad de los procedimientos de la invención.
Un objeto de la presente invención reside por
tanto también en una preparación de ácidos nucleicos que comprende
unos marcadores genéticos cualitativos y cuantitativos
característicos de desregulación(es) celular(es). Un
objeto particular reside en un banco que comprende unos marcadores
genéticos característicos de diferentes situaciones de
desregulación. La invención tiene también por objeto cualquier
soporte sólido sobre el cual por lo menos dos bancos de ácidos
nucleicos característicos de dos situaciones de desregulación han
sido depositados. A este respecto, la invención se refiere también
a un procedimiento de preparación de un chip con ADN utilizable para
el diagnóstico del potencial tóxico de un compuesto de prueba, que
comprende el depósito, sobre un soporte sólido, de una o varias
preparaciones de ácidos nucleicos característicos de
situación(es) de desregulación.
Por otra parte, según un modo preferido de
realización, se utilizan unos bancos de ácidos nucleicos afinados
por selección de los clones a medida que tiene lugar la
utilización, en función de su implicación efectiva en los fenómenos
de toxicidad. Los bancos iniciales pueden en efecto comprender, por
ejemplo, el conjunto de clones característicos de los sucesos
genéticos de una situación de desregulación. Después, la utilización
del procedimiento de diagnóstico de la invención permite observar
que ciertos clones no hibridan nunca o muy raramente con las
muestras de ácidos nucleicos ensayados. Dichos clones pueden
eventualmente ser eliminados del banco, permitiendo generar unos
bancos más específicos, y, por tanto, más universales y
predictivos.
Otro objeto ventajoso de la invención reside por
tanto en un banco de ácidos nucleicos que comprende unos clones de
ácidos nucleicos que corresponden a unos sucesos genéticos comunes
a una situación de desregulación y a una situación de toxicidad.
Otro objetivo reside en un procedimiento de
preparación de bancos de marcadores genéticos de la toxicidad, que
comprende la hibridación entre una población de ácidos nucleicos
derivados de células en situación de desregulación y una población
de ácidos nucleicos derivados de células en situación de control,
el aislamiento, a partir del producto de la reacción de
hibridación, de clones característicos de la situación de
desregulación y la hibridación de los clones obtenidos con una
muestra de ácidos nucleicos derivados de células en situación de
toxicidad. Ventajosamente, el procedimiento anterior comprende
además una etapa de selección, que comprende la hibridación del
banco con diferentes muestras de ácidos nucleicos derivados de
células en situación de toxicidad inducida por compuestos
diferentes y la identificación de los clones del banco que hibridan
más a menudo con dichas muestras.
De manera más específica, la presente invención
describe ahora la identificación y la caracterización de dichos
clones, utilizables como marcadores genéticos de la toxicidad.
A este respecto, la invención describe en
particular la identificación, la preparación, el clonado y la
caracterización de clones particulares, cuyas secuencias están
representadas por los identificadores SEC ID Nos: 1 a 37. Estos
clones son utilizables como marcadores genéticos de la toxicidad en
el sentido de la presente invención. Estos clones han sido aislados
por unos procedimientos cualitativos y comprenden unas secuencias
que corresponden a unas alteraciones genéticas cualitativas
características de sucesos de desregulación que afectan a unos
genes celulares variados, tales como unos genes que codifican para
unas proteínas, enzimas, genes mitocondriales, factores de
transcripción, genes patológicos, genes de respuesta al estrés,
genes implicados en la transducción de señales, etc. Dichos clones,
las preparaciones y bancos que los contienen, así como sus
utilizaciones, constituyen unos objetos particulares de la
invención.
En especial, un objeto particular de la invención
reside en una preparación o un banco de ácidos nucleicos que
comprende una pluralidad de clones de ácidos nucleicos marcadores
genéticos de la toxicidad, comprendiendo dicha preparación o banco
por lo menos un clon de secuencia elegido entre SEC ID Nos: 1 a
37.
Un objeto particular de la invención reside, más
generalmente, en cualquier banco de ácidos nucleicos que comprenda
por lo menos un clon de secuencia elegida entre SEC ID Nos: 1 a
37.
Un clon de secuencia SEC ID NO:X designa en el
sentido de la invención (i) cualquier clon que comprenda dicha
secuencia SEC ID NO:X completa (o una secuencia complementaria de
ésta), en caso necesario bordeada por secuencias suplementarias,
preferentemente un clon que consiste en dicha secuencia SEC ID NO:X
completa (o una secuencia complementaria de ésta); así como (ii)
cualquier clon que comprenda una parte solamente de la secuencia
SEC ID NO:X (o de una secuencia complementaria de ésta),
eventualmente bordeada en un extremo por secuencia(s)
suplementaria(s) (en particular que provienen de la
secuencia del gen o mensajero correspondiente), siendo la parte de
la secuencia suficiente para permitir una hibridación específica
(por ejemplo por lo menos 10 bases); o incluso (iii) cualquier otra
secuencia nucleica, específica del gen o de un suceso genético de
desregulaicón del gen puesto en evidencia por la secuencia SEC ID
NO:X, sin necesariemente cabalgar con la secuencia SEC ID NO:X. Las
secuencias (iii) son por ejemplo unas secuencias de otra región del
gen interesado, que permiten su puesta en evidencia en unas
condiciones similares. Los clones (i) a (iii) según la invención
comprenden típicamente entre 10 y 1.000 bases, más generalmente
entre 20 y 500 bases, de las que una parte por lo menos es
específica del suceso genético considerado.
Las preparaciones o bancos de la invención
comprenden, más preferentemente, por lo menos 5, preferentemente por
lo menos 10, más preferentemente por lo menos 15 y aún más
preferentemente por lo menos 20 clones de secuencia elegida entre
SEC ID Nos: 1 a 37. Como se ha indicado anteriormente, se trata
típicamente de bancos que comprenden entre 10 y 50.000 clones, más
generalmente entre 10 y 5.000 clones, en particular entre 50 y
1.000 clones, de los que un aparte por lo menos está representada
por uno o varios clones de secuencia elegidos entre SEC ID Nos: 1 a
37.
Los bancos y preparaciones según la invención
pueden ser depositados sobre unos soportes y utilizados como se
describe en la continuación del texto.
Una de las aplicaciones principales de la
identificación y del clonado de estos marcadores genéticos se
refiere a la evaluación del potencial tóxico de un compuesto de
prueba. Esta evaluación puede efectuarse hibridando una sonda que
representa los ARN mensajeros de un cultivo celular tratada por
este producto con uno o varios bancos de signaturas características
de situación(es) de desregulación, tales como las descritas
anteriormente. Otra aplicación reside en la identificación de
alteraciones genómicas (en particular de SNPs) correlacionadas con
una respuesta de un sujeto a un compuesto dado, por ejemplo la
respuesta a un tratamiento, la sensibilidad a un compuesto, etc.
Estas aplicaciones se describen más en detalle a continuación.
La invención tiene por tanto también por objeto
un procedimiento para el análisis del potencial tóxico de
compuestos de prueba, que utiliza los marcadores genéticos
descritos anteriormente. En particular, la invención permite
determinar el potencial tóxico de cualquier compuesto por
hibridación de una muestra de ácidos nucleicos de células tratadas
por este compuesto con los marcadores genéticos definidos
anteriormente, indicando el perfil de hibridación observado el
potencial tóxico del compuesto. A este fin, los marcadores
genéticos utilizados son preferentemente agrupados en forma de
bancos, a fin de proporcionar una respuesta tan predictiva como sea
posible. Una de las ventajas de la presente invención reside
también en el número importante de marcadores utilizados, que hace
la información generada tanto más predictiva. El carácter
predictivo de la información está además consolidado por la
naturaleza de los marcadores utilizados y preparados.
Un objeto particular de la invención reside en un
método de análisis del potencial tóxico de un compuesto de prueba,
que comprende por lo menos una etapa de hibridación entre a) una
muestra de ácidos nucleicos de células tratadas por este compuesto
y b) un banco de ácidos nucleicos que corresponden a unos fenómenos
genéticos característicos de situación(es) de
desregulación(es) de vía(s) de señalización celular,
indicando el perfil de hibridación el potencial tóxico del
compuesto de prueba. En particular, cuanto más elevado es el
número de clones positivos en la hibridación, es considerado como
potencialmente tóxico el compuesto de prueba.
El análisis del perfil tóxico del compuesto es
más generalmente realizado comparando el perfil de hibridación,
sobre el banco, de una muestra de ácidos nucleicos de células
tratadas con este compuesto con el de una muestra de ácidos
nucleicos de células no tratadas con este compuesto. Esta
comparación permite poner en evidencia una diferencia entre el
número de clones hibridados en la situación tóxica y en la situación
de control, permitiendo esta diferencia de número de clones
atribuir un índice de toxicidad al compuesto de prueba.
Más particularmente, la invención reside por
tanto en un procedimiento de análisis del potencial tóxico de un
compuesto de prueba, que comprende por lo menos:
- -
- una etapa de hibridación entre a) una muestra de ácidos nucleicos de células tratadas con este compuesto y b) un banco de ácidos nucleicos correspondientes a unos sucesos genéticos característicos de situación(es) de desregulación(es) de vía(s) de señalización celular(es),
- -
- una etapa de hibridación entre c) una muestra de ácidos nucleicos de células no tratadas con este compuesto y b) un banco de ácidos nucleicos correspondiente a unos sucesos genéticos característicos de situación(es) de desregulación(es) de vía(s) de señalización celular,
- -
- la comparación de los perfiles de hibridación obtenidos que indican el potencial tóxico del compuesto de prueba.
La puesta en evidencia del perfil de hibridación
puede ser realizada por cualquier técnica conocida por el experto
en la materia y, en particular, por marcado de muestras de ácidos
nucleicos de prueba y detección del marcado presente en el banco.
Así, la invención reside más particularmente en un procedimiento de
análisis del potencial tóxico de un compuesto de prueba que
comprende por lo menos la hibridación separada entre a) unas sondas
nucleicas marcadas que corresponden a los ARN de células no tratadas
y de células tratadas con dicho compuesto de prueba, y b) un banco
de ácidos nucleicos que corresponden a unos sucesos genéticos (en
particular transcripcionales y/o de empalmado) característicos de
desregulación(es), indicando el perfil de hibridación el
potencial tóxico del compuesto de prueba.
El marcado de los ácidos nucleicos puede ser
realizado por cualquier técnica conocida por el experto en la
materia, tal como en particular el empleo de marcadores
radioactivos, fluorescentes, enzimáticos o colorimétricos, por
ejemplo. Generalmente, el marcado es radioactivo y la puesta en
evidencia de una hibridación comprende la detección de la
radioactividad presente en el soporte. El marcado puede desde luego
ser fluorescente y la puesta en evidencia de una hibridación
comprende en este caso la detección de la fluorescencia emitida en
el soporte.
Como se ha indicado anteriormente, en los
procedimientos de la invención, los bancos de ácidos nucleicos que
corresponden a unos sucesos genéticos característicos de
desregulación(es) pueden ser en particular unos bancos de
ácidos nucleicos característicos de situaciones de desregulación
del crecimiento y/o la viabilidad celular. Más particularmente, se
trata de bancos de ácidos nucleicos característicos de células en
situación de desregulación del crecimiento celular, en especial de
células transformadas, en particular de células tumorales.
Más preferentemente, en los procedimientos de la
invención tales como los descritos anteriormente, los bancos de
ácidos nucleicos son unos bancos de ácidos nucleicos que
corresponden a unos sucesos genéticos característicos de las
alteraciones de vías de señalización inducidas por la activación,
preferentemente la expresión de la totalidad o parte de un gen
supresor de tumor, preferentemente de p53. Se trata en particular de
bancos característicos de la apoptosis inducida por un gen supresor
de tumor, preferentemente por p53. Los resultados presentados en
los ejemplos muestran en particular que, gracias al empleo de la
estrategia específica del tamizado diferencial cualitativo, una
situación de apoptosis consecutiva a la inducción de la expresión de
la proteína p53 provoca numerosas modificaciones de empalmado,
además de modificaciones de orden cuantitativo ligadas a una
regulación de transcripción de diferentes genes. La invención
muestra que unas sondas salidas de células tratadas con diferentes
compuestos tóxicos hibridan con unos clones en los bancos salidos
de tamizados cuantitativos y cualitativos realizados a partir de
células de control por una parte y de células en las cuales la
expresión de la forma salvaje de p53 es inducida, por otra parte.
Esto indica que unos sucesos de transcripción y de empalmado están
repartidos entre unas situaciones tóxicas y unas situaciones en las
que la proteína p53 está expresada de manera forzada en su forma
salvaje.
Por otra parte, los resultados obtenidos muestran
también que, cuando las células tratadas son del mismo tipo celular
que aquellas en las cuales ha sido inducida la expresión de p53,
las sondas realizadas a partir de ARN mensajeros de células tratadas
con unas dosis crecientes de productos tóxicos hibridan tanto más
clones en el seno de los bancos de sucesos cuantitativos y
cualitativos cuanto más elevadas son las dosis y, por tanto,
importante la toxicidad. Esto muestra que existe una correlación
entre el nivel de toxicidad y el perfil de hibridación en los
bancos de la invención.
Está claro sin embargo que la aplicación de los
procedimientos, kits y bancos de la invención no está restringida a
un tipo particular de células. En particular, no está restringida a
las pruebas de productos realizadas sobre las mismas células que
aquellas de las que se derivan los clones y bancos de análisis
cuantitativo o cualitativo. En efecto, los resultados presentados
muestran que los clones de la invención permiten, de manera
ventajosa, un diagnóstico de la toxicidad independiente del
compuesto tóxico y del tipo celular probado.
En un modo específico de realización, el banco de
ácidos nucleicos es un banco que comprende por lo menos un clon de
secuencia elegida entre SEC ID Nos: 1 a 37, tal como la definida
anteriormente.
En un modo particular de realización de los
procedimientos de la invención, las células tratadas o no tratadas
con el compuesto de prueba y las células utilizadas para generar
los bancos son de tipo diferente.
Más particularmente, las células tratadas o no
tratadas con el compuesto de prueba pueden ser de origen y de tipo
variados. Se trata preferiblemente de células mamíferas, aún más
preferiblemente de células humanas. Puede tratarse de cultivos
primarios o de progenies celulares. El tipo de células utilizado y
su concentración, densidad y estado fisiológico (en reposo,
estimulado, etc.), pueden ser elegidos por el usuario de los
procedimientos de la invención en función de los compuestos de
prueba y de las aplicaciones previstas. Por otra parte, puede
también tratarse de células extraídas de órganos o de tejidos de
animales tratados o no tratados con el compuesto.
El compuesto de prueba puede también ser de
naturaleza muy variada. Así, puede tratarse de un compuesto aislado
o de una mezcla de sustancias. El compuesto puede ser de naturaleza
química o biológica. Puede tratarse en particular de un péptido,
polipéptido, ácido nucleico, lípido, glúcido, de una molécula
química, de extractos vegetales, de bancos combinatorios, etc. El
compuesto de prueba puede también ser un tratamiento aplicado a las
células (radiación, UV, etc.). Para la realización del procedimiento
de la invención, el compuesto de prueba puede ser aplicado a
diferentes concentraciones, elegidas por el usuario. Por otra
parte, la muestra de ácidos nucleicos derivada de las células
tratadas puede ser preparada en unos instantes variables después de
tratamiento con el compuesto. Así, pueden ser realizadas unas
cinéticas, en caso necesario.
Los ácidos nucleicos y las sondas
correspondientes se preparadan por las técnicas convencionales. La
hibridación puede ser a continuación realizada, también, en
condiciones que pueden ser adaptadas por el experto en la materia y
el usuario. A este respecto, la hibridación puede ser realizada en
condición de astringencia elevada, mediana o baja, según el grado
de sensibilidad buscado, la cantidad de material disponible, etc.
Además, según la presente invención, las hibridaciones entre el
banco y las sondas pueden ser homólogas (cuando el banco y las
sondas están constituidos a partir de ácidos nucleicos de la misma
especie, por ejemplo humana) o heterólogas (cuando el banco y las
sondas están constituidos a partir de ácidos nucleicos de una
especie diferente, por ejemplo un banco de origen humano y unas
sondas preparadas a partir de material de otro mamífero). Aunque
los bancos y sondas sean preferentemente construidos a partir de
material humano, es en efecto posible utilizar otras fuentes, en
particular para las sondas (por ejemplo un material murino). En el
caso de dichas hibridaciones heterólogas, las condiciones de
hibridación pueden ser adaptadas por el experto en la materia,
según las técnicas convencionales, en particular disminuyendo la
temperatura de hibridación y/o aumentando la salinidad de la
solución de hibridación.
Una ventaja de los procedimientos de la invención
reside en la posibilidad de determinar un índice de toxicidad de un
producto dado sobre cualquier tipo celular. Para esta aplicación,
los clones que corresponden a unos elementos identificados a partir
de las células que han servido para establecer los bancos
específicos de la viabilidad celular así como los específicos de la
desregulación inducida, son hibridados con una sonda derivada de las
células no tratadas a estudiar. Su hibridación constituye el motivo
de referencia de expresión del ARN común entre el modelo de
desregulación y el modelo celular estudiado. Una comparación de la
expresión de los ARN de la situación celular no tratada con los de
las situaciones tratadas con diferentes productos a diferentes
concentraciones y en diferentes tiempos de tratamiento se efectúa
fácilmente por comparación de los perfiles de hibridación de cada
sonda salida de cada situación estudiada. El índice de toxicidad de
una situación puede ser evaluado asignando un valor 1 a los clones
hibridados con la sonda no tratada y no hibridados con la situación
tratada de interés por una parte, y asignando también el valor 1 a
los clones no hibridados con la sonda no tratada pero hibridados
con la sonda tratada por otra parte. El índice es entonces la suma
de los valores 1 individuales expresado en porcentaje del número de
clones sometidos a la hibridación. Este índice es por tanto
susceptible de variar entre 0 y 100. Este ejemplo de cálculo de
índice no es limitativo. Otros procedimientos matemáticos,
algoritmos o procesos de cálculos, tales como unas redes neuronales
podrán también ser utilizados.
El interés de determinar dicho índice hibridando
unos clones derivados de un tamizado diferencial cualitativo entre
dos estados de un mismo tipo celular (en proliferación e inducido
en apoptosis) con unas sondas salidas de otros tipos celulares, es
probado por la posibilidad de determinar un índice tanto más
importante para un compuesto dado cuanto más fuerte es la dosis
aplicada a las células ensayadas.
El valor del índice es naturalmente dependiente
del umbral a partir del cual un clon es considerado como que debe
recibir el valor 1 ó 0. El índice es tanto más importante cuanto
más bajo es el factor de represión o de inducción que debe presentar
un clon para ser considerado. La robustez del procedimiento es sin
embargo atestiguada por el hecho de que existe una linealidad entre
el factor considerado y el índice de toxicidad calculado. Esta
linealidad es el reflejo del número de sucesos independientes que
constituyen el banco cualitativo que permite liberarse del peso
demasiado importante de un clon particular que tiene un diferencial
de expresión entre situación tratada o no tratada demasiado
importante.
La determinación del potencial tóxico de un
compuesto según el procedimiento descrito en 5 y en los ejemplos
permite identificar unas secuencias que derivan de genes implicados
en unos mecanismos de estrés y de muerte celular cuya expresión está
afectada por este compuesto.
Estos genes representan unos candidatos de
elección para buscar unos polimorfismos susceptibles de afectar la
respuesta al compuesto estudiado. Estos polimorfismos permiten
segregar los pacientes candidatos para la administración de este
compuesto en grupos más o menos susceptibles de desarrollar una
toxicidad exacerbada, hepática en particular.
Por ejemplo, puede fácilmente preverse que un
polimorfismo que afecta a un gen cuya expresión está reprimida por
un compuesto haga a un paciente más susceptible a la acción tóxica
de este compuesto.
Sin considerar este caso particular, la
importancia de los polimorfismos de esta selección de genes
realizada por medio de la invención es evaluada estableciendo las
correlaciones que existen entre estos polimorfismos y las
toxicidades observadas cuando tienen lugar unos ensayos clínicos
efectuados sobre el compuesto estudiado.
La invención tiene por tanto por objeto la
utilización de los clones o ácidos nucleicos descritos, para la
identificación de mutaciones o polimorfismos, en particular de
SNPs, correlacionados con la respuesta de sujetos a unos compuestos
farmacéuticos.
La invención se refiere, más generalmente, a la
utilización de ácidos nucleicos representativos de sucesos de
empalmados característicos de una situación fisiopatológica dada,
para la identificación o la caracterización de SNPs correlacionados
con dicha situación.
La identificación puede realizarse según
diferentes procedimientos o aproximaciones conocidos por el experto
en la materia. Así, la misma puede ser realizada por secuenciado, a
partir de muestras biológicas que provienen de sujetos respondedores
y no respondedores a un compuesto, unos genes que corresponden a
los clones o ácidos nucleicos seleccionados, y búsqueda de
polimorfismos en dichos genes. La identificación puede también
realizarse a partir de bancos de SNPs, por búsqueda de SNPs
presentes en dichos genes.
La invención se refiere también a un
procedimiento de identificación de SNPs u otras mutaciones o
polimorfismos que permiten evaluar la respuesta de un sujeto a un
compuesto dado, que comprende (i) la identificación in vitro
de ácidos nucleicos característicos de sucesos de empalmados
inducidos en una célula tratada por dicho compuesto y (ii) la
identificación de SNPs u otras mutaciones o polimorfismos en el o
los genes que corresponden a unos ácidos nucleicos identificados en
(i), permitiendo dichos SNPs u otras mutaciones o polimorfismos
evaluar la respuesta de un sujeto al compuesto dado. La invención
proporciona así unos procedimientos y medios para seleccionar unos
genes para los cuales unos polimorfismos están asociados a una
toxicidad para un compuesto dado.
La invención se refiere también a la población de
ácidos nucleicos específicos de polimorfismos o SNPs así
identificados, en particular de iniciadores nucleotídicos para la
amplificación selectiva de los polimorfismos, o de sondas para la
hibridación selectiva con los polimorfismos considerados.
La invención se refiere también a unos
procedimientos para el análisis (por ejemplo la predicción, la
evaluación o la determinación) de la respuesta de un sujeto a un
compuesto de prueba, que comprenden el estudio de polimorfismos, en
particular el análisis de SNPs, tales como los definidos
anteriormente. Un procedimiento particular se refiere al estudio de
la sensibilidad o de la respuesta de un sujeto a un compuesto, en
particular a la toxicidad de un compuesto, que comprende el
análisis, a partir de una muestra biológica de dicho sujeto que
comprende el ADN, de la presencia en el ADN del sujeto, de
polimorfismos, SNPs u otras alteraciones genómicas presentes en
unos genes cuyo empalmado es modificado en respuesta a dicho
compuesto. Como se ha indicado anteriormente, la presencia de
polimorfismos, SNPs u otras alteraciones genómicas en el ADN de un
sujeto puede ser determinada por diferentes técnicas conocidas por
el experto en la materia, como el secuenciado, la amplificación, la
hibridación, unos procedimientos separativos, cromatográficos, etc.
Una aproximación preferida consiste en amplificar el ADN del sujeto
por medio de un iniciador específico de la alteración (en particular
del SNP) buscada. Otra aproximación consiste en utilizar una sonda
nucleotídica cuya secuencia es específica de la alteración (en
particular del SNP) buscada. Queda entendido que la invención no
está limitada a unas técnicas particulares.
La presente solicitud tiene también por objeto
unos kits (o estuches) para la realización de un procedimiento de
análisis tal como el descrito anteriormente. Más particularmente,
la invención tiene por objeto unos kits para el estudio del
potencial tóxico de un compuesto de prueba, que comprenden por lo
menos:
- -
- un banco de ácidos nucleicos correspondiente a unos sucesos genéticos (de transcripción y/o de empalmado) característicos de alteración(es) de una o varias vías de señalización celular, en particular de situación(es) de desregulación del crecimiento y/o de la viabilidad celular.
Más generalmente, los kits de la invención
comprenden un banco de marcadores genéticos característicos de
desregulación(es), por ejemplo de la apoptosis, tal como la
definida en la invención, depositados sobre un soporte sólido.
Más preferentemente, los kits de la invención
comprenden un banco de ácidos nucleicos característicos de varias
situaciones de desregulación inducidas en unas condiciones
diferentes.
Según otro modo particular, los kits de la
invención comprenden por lo menos un banco de ácidos nucleicos que
comprende unos clones que corresponden a unos sucesos genéticos
comunes a unas células en situación de desregulación y en situación
de toxicidad.
Según un modo particular, la invención se refiere
a cualquier kit que comprenda un banco de ácidos nucleicos,
comprendiendo el banco por lo menos un clon de secuencia elegida
entre SEC ID Nos: 1 a 37, tal como el definido anteriormente. El
banco es ventajosamente depositado sobre un soporte,
preferentemente sólido, en particular de vidrio, sílice, filtro,
membrana, nylon, plástico, etc.
En los kits de la invención, los bancos
comprenden además ventajosamente unos clones testigos, que permiten
calibrar las señales detectadas. Estos testigos pueden estar más
particularmente constituidos por tres tipos de material:
- -
- unos clones de ADN genómico,
- -
- los ADNc que sirven para la confección de las sondas que hibridarán los bancos, y/o
- -
- unos ADNc que corresponden a unos ARNm que codifican para unas proteínas controles, como por ejemplo unas proteínas (en particular unas enzimas) disponibles, tales como la \beta-actina y la GAPDH (Gliceraldehído Fosfato DesHidrogenasa).
Los controles proporcionados por las enzimas
disponibles son utilizados clásicamente por el experto en la
materia cuando tiene lugar la experiencia de "cDNA display".
Sin embargo, cuando tienen lugar fenómenos de desregulación según la
invención, la cantidad de ARNm de estas enzimas puede variar.
También, con el fin de normalizar el poder hibridante (y por tanto
la señal) de cada sonda, la presente invención propone utilizar uno
o varios otros sistemas de testigo. A este respecto, la utilización
de ADN genómico y/o unos ADNc (no marcados) que corresponden a la
sonda (es decir a la población de ADN de la muestra biológica
tratada o no tratada) permite, según la invención, obtener unos
testigos de hibridación independientes de cualquier variación
cualitativa o cuantitativa de la expresión génica. Las mismas
cantidades de ADNc dotadas de la misma actividad específica después
de marcados (radioactivos) deben en principio generar unas señales
equivalentes hibridando por una parte con el ADN genómico y por
otra parte consigo mismas.
Además, los kits de la invención pueden
comprender:
- -
- unos oligonucleótidos para la preparación de las sondas, y/o
- -
- un protocolo para la reacción de hibridación, y/o
- -
- unos elementos e informaciones que permitan el establecimiento de un índice de toxicidad para cada producto ensayado, en particular una lógica de tratamiento de la señal.
Los oligonucleótidos son preferentemente del tipo
semialeatorio, como por ejemplo los oligonucleótidos de fórmula
X-N_{n}-AGGT, en la que X es una
secuencia estabilizadora tal como GAGAAGCGTTATG o
CCACGCTACAAG(C), N es una base, y n es un número entero
comprendido entre 3 y 8 incluidos.
La factibilidad, la realización y otras ventajas
de la invención están ilustradas más en detalle en los ejemplos que
siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no
limitativos.
Figura 1. Hibridación diferencial de sondas que
provienen de células HepG2 no tratadas (A), tratadas con etanol (B)
o tratadas con ciclosporina sobre unos filtros que comprenden unos
fragmentos PCR que corresponden a los clones salidos del tamizado
cualitativo de un sistema de apoptosis inducida por p53.
Figura 2. Índice de toxicidad calculado a partir
de diferentes compuestos tóxicos sobre el filtro apoptosis p53.
Figura 3. Hibridación diferencial de sondas que
provienen de células HepG2 no tratadas (A), tratadas con clenbuterol
(B), tratadas con R propranolol (C) o tratadas con DL propranolol
(D) sobre unos filtros que comprenden unos fragmentos PCR que
corresponden a los clones salidos del tamizado cualitativo a partir
de biopsias tumorales.
Un ejemplo de la aportación del tamizado
diferencial cualitativo en la identificación de marcadores
genéticos asociados a la toxicidad de moléculas, está ilustrado por
la aplicación de DATAS a un modelo de inducción de apoptosis por
inducción de la expresión de la forma salvaje de p53. Este modelo
celular ha sido establecido por transfección de un sistema de
expresión inducible para el gen supresor de tumor p53. De manera que
se identifiquen las diferencias cualitativas que están asociadas
específicamente a la apoptosis inducida por p53, se ha realizado un
tamizado cualitativo a partir de los ARN mensajeros extraídos de
células inducidas (ml) y no inducidas (mNI). Estos ARN mensajeros
son convertidos en ADN complementarios (cl) y (cNI) con la ayuda de
transcriptasa inversa (RT) y de oligonucleótidos iniciadores
biotinilados. Unos híbridos ml/cNI y cl/mNl son a continuación
realizados en fase líquida.
Las cantidades requeridas de ARN y de ADNc (en el
ejemplo 200 ng de cada uno) son combinadas y precipitadas con
etanol. Las muestras son tomadas de nuevo en un volumen de 30
\mul en un tampón de hibridación (Hepes (pH 7.2) 40 mM, NaCI 400
mM, EDTA 1 mM) suplementado con formamida desionizada (80% (v/v).
Después de desnaturalización 5 min a 70ºC, las muestras son
incubadas por la noche a 40ºC.
Las bolas Streptavidine (Dynal) son lavadas y
después reacondicionadas en un tampón de fijación (2X =
Tris-HCI (pH 7,5) 10 mM, NaCI 2M, EDTA 1 mM). Las
muestras de hibridación son llevadas a un volumen de 200 \mul con
agua y después ajustadas a 200 \mul de bolas para una incubación
de 60 min a 30ºC. Después de captura sobre imán y lavado de las
bolas, estas son tomadas de nuevo en 150 \mul de tampón RnaseH y
después incubadas durante 20 min a 37ºC. Después de captura sobre
imán, las regiones no hibridadas han sido relargadas en el
sobrenadante que es tratado con la Dnasa y después extraído con
fenol ácido/cloroformo y después precipitado con etanol. Las
precipitaciones con etanol de pequeñas cantidades de ácidos
nucleicos se efectúan con la ayuda de un polímero comercial SeeDNA
(Amersham Pharmacia Biotech) que permite recuperar de forma
cuantitativa los ácidos nucleicos a partir de soluciones muy
diluidas (del orden del ng/ml).
La síntesis de ADNc a partir de las muestras de
ARNs que provienen de la acción de la RnaseH se efectúa a partir de
hexanucleótidos aleatorios con la ayuda de Superscript II Reverse
Transcriptase. El ARN, es a continuación, degradado con la ayuda de
una mezcla de RnaseH y de Rnase T1. El iniciador, los nucleótidos
no incorporados y las enzimas son separados del ADNc con la ayuda
de un cartucho "GlassMAX Spin". El ADNc correspondiente a los
bucles de empalmado es a continuación sometido a una reacción de PCR
utilizando unos oligonucleótidos de tipo semialeatorio de
estructura: (FS3)N7AGGT, donde (FS3) = CCACGCTACAAG.
La reacción de PCR se realiza con la ayuda de Taq
Polymérase sobre 30 ciclos:
- Desnaturalización inicial: 94ºC dur. 1 min.
- 94ºC dur. 30 s
- 55ºC dur. 30 s
- 72ºC pdt 30 s
- Extensión final: 72ºC dur. 5 min.
Los productos de PCR son clonados en el vector
pGEM-T (Proméga) que posee un T flotante en los
extremos 3' a fin de facilitar el clonado de fragmentos salidos de
la actividad de la Taq Polymérase. Después de transformación en las
bacterias JM109 competentes (Proméga), las colonias obtenidas son
almacenadas en unas placas de 96 cavidades. Unos productos de PCR
generados con la ayuda de oligonucleótidos T7 y Sp6 situados en el
plásmido de clonado y que encuadran las inserciones son depositados
sobre unos filtros de nitrocelulosa.
Unas células HepG2 son a continuación tratadas
individualmente con diferentes compuestos de potencial tóxico
variable. En este ejemplo, la dosis utilizada es calculada por una
prueba de viabilidad celular (MTT) y que corresponde a una IC80. Las
dosis de los diferentes compuestos así como las duraciones de los
tratamientos están resumidas en la tabla 1 siguiente:
| Compuesto | Concentración | Tiempo |
| Aspirina | 2mM | 18h |
| Paracetamol | 1mM | 18h |
| Ciclosporina | 2,5\muM | 18h |
| Diclofenac | 50\mug/ml | 18h |
| Beclometazona | 50nM | 18h |
| Metotrexato | 500nM | 18h |
| Eritromicina | 2,5\mug/ml | 18h |
| Vinblastina Sulfato | 30\muM | 18h |
| Clonidina | 150\muM | 18h |
| Valinomicina | 15nM | 18h |
| Etopósido | 50\mug/ml | 18h |
| Camptotecina | 1\mug/ml | 4h |
| PMA | 1\mug/ml | 18h |
| Etanol | 0,1M/0,5M | 4h |
| 5 FU | 10\muM | 24h |
| Cicloheximida | 5\mug/ml | 18h |
| FCCP | 5\muM | 18h |
| Estaurosporina | 50nM | 18h |
| Terbutalina Sulfato | 200ng/ml | 18h |
| Epinefirina Hidrato | 50\mug/ml | 18h |
| AZT | 50\mug/ml | 18h |
| H2O2 | 0,1mM | 18h |
| Actinomicina D | 0,02\mug/ml | 18h |
Unas sondas marcadas que corresponden a los ARN
se realizan a partir de estas situaciones. Para ello, el cDNA
primera rama obtenido a partir de ARN total según las técnicas
conocidas por el experto en la materia, sirve de matriz para una
reacción de PCR con la ayuda de los oligonucleótidos
(FS4)GN3AGGT y FS3CN3AGGT, en los cuales (FS4) =
GAGAAGCGTTAT, según el programa siguiente:
- Desnaturalización inicial: 95ºC, 5 min
- 5 ciclos con:
- -
- desnaturalización: 94ºC, 30 seg.
- -
- aparejado: 30ºC, 30 seg.
- -
- subida de temperatura de 30 a 72ºC en 30 seg.
- -
- alargamiento: 72ºC, 30 seg.
-35 ciclos con:
- -
- desnaturalización: 94ºC, 30 seg.
- -
- aparejado: 57ºC, 30 seg.
- -
- alargamiento: 72ºC, 30 seg.
- Alargamiento final: 72ºC, 7 min
Los productos PCR son marcados con la ayuda del
kit Redyprime (Amersham).
Los filtros son puestos a prehibridar en un
tampón de hibridación (Rapid Hybrid Buffer, Amersham) que contiene
esperma de salmón (100 \mug/ml) durante 30 min a 65ºC. La sonda
PCR es a continuación añadida sobre la membrana (0,5 x 10^{6} a 1
x 10^{6} cpm/ml) para incubación de 2 a 18 horas a 65ºC. Los
filtros son lavados en tampón 0,5X SSC, 0,1% SDS durante 30 min a
65ºC y después en tampón 0,2X SSC, 0,1% SDS. Los perfiles de
hibridaciones son analizados por medición de la radioactividad sobre
Instantlmager (Packard Instruments) (Figura 1). La cuantificación
de las intensidades individuales de hibridación permite el cálculo
de un índice según el procedimiento descrito anteriormente (Figura
2). Este resultado indica que es posible clasificar diferentes
productos según su capacidad para inducir la expresión de
marcadores empalmados de forma diferencial cuando tiene lugar una
toxicidad inducida por p53. Así, el diclofenac moviliza aún más
sucesos de empalmado, idénticos a los inducidos cuando tiene lugar
la toxicidad ligada a la expresión de p53 que la aspirina, en las
células HepG2. La utilización de bancos que agrupan unas secuencias
de ADN complementarias empalmadas de forma diferencial entre una
situación (sana) de referencia y una situación que moviliza una vía
principal de toxicidad, permite, por tanto, clasificar unos
productos cuyas acciones no son distinguibles por las pruebas
clásicas de toxicidad tales como el test MTT.
Un segundo ejemplo de utilización de la invención
en la identificación de marcadores genéticos de toxicidad consiste
en la generación de bancos de ácidos nucleicos diferenciales entre
tejidos sanos y tejidos tumorales. El interés de identificar las
secuencias específicamente expresadas en los tejidos de control
(sanos) por una parte y en los tejidos tumorales por otra parte, se
refiere al hecho de que en el seno de un tumor están presentes, en
diferentes células pero también en el seno de las mismas células,
unas informaciones características de crecimiento desregulado y de
muerte celular. Con respecto a un modelo de apoptosis inducida por
expresión desregulada de p53 o cualquier otra proteína que tiene un
impacto negativo sobre el crecimiento y la viabilidad celular, la
utilización de tumores permite por tanto disponer además, en unos
filtros con previsión de toxicología predictiva, de unas secuencias
cuya expresión es característica de la
hiper-proliferación o de carcinogenicidad.
Unas biopsias tumorales que provienen de 7
pacientes que han desarrollado un cáncer de cabeza y cuello, así
como unas biopsias de tejidos sanos que provienen de la úvula de
los mismos pacientes, han servido de material de trabajo. El mismo
procedimiento que el descrito en el ejemplo 9.1 ha sido utilizado
aunque con una adaptación cuantitativa que tiene en cuenta las
pequeñas cantidades de material disponibles en unas biopsias de
origen humano.
Los fragmentos de ácidos nucleicos generados por
la aplicación de la invención a los tejidos tumorales y normales
han sido dispuestos sobre filtros de nitrocelulosa. Estos filtros
han sido hibridados con las mismas sondas radioactivas que las
utilizadas en el ejemplo 8.1, es decir generadas a partir del
material genético de células HepG2 tratadas con diferentes
compuestos de potencial tóxico variable. Unos perfiles de
hibridación diferenciales han sido observados entre los diferentes
compuestos, demostrando así el interés de una utilización de estos
bancos de ácidos nucleicos para la evaluación de una toxicidad
asociada a un compuesto dado.
La figura 3 muestra las señales de hibridaciones
obtenidas con las sondas derivadas de las células HepG2 normales,
tratadas con clenbuterol, con el enantiómero inactivo del
propranolol o también con una mezcla racémica de enantiómeros activo
e inactivo del propranolol. Las dosis de compuestos están
indicadas en la tabla 1 anterior y la realización de sondas y los
protocolos seguidos para las hibridaciones son idénticos a los que
se han mencionado en el párrafo que describe la utilización de los
filtros que reúnen unas signaturas específicas del modelo de
apoptosis inducida por p53 (ejemplo 9.1).
Las señales de hibridación presentadas en la
figura 3 pueden ser cuantificadas y servir de base para la
determinación de un índice de toxicidad para cada uno de los
compuestos según el mismo modo operatorio que el que ha permitido
obtener los índices presentados en la figura 2. Así, las
hibridaciones presentadas en la figura 3 muestran que los efectos
de diferentes compuestos sobre células HepG2, que no son
discernibles por las técnicas clásicas empleadas en estudios
toxicológicos como la coloración con MTT, pueden ser clasificados
según su capacidad para movilizar unos sucesos de empalmado
específicos de las diferencias que existen entre células de tejido
sano y células tumorales.
La utilización de las técnicas descritas en los
ejemplos 9.1 y 9.2 ha permitido la constitución y la utilización de
bancos de clones, marcadores genéticos de la toxicidad. Los clones
que componen estos bancos han sido analizados y secuenciados, y la
secuencia de un parte de ellos está presentada en la lista de
secuencias incluida en la presente solicitud (SEC ID Nos:
1-37).
El análisis de estos clones muestra que
corresponden a unos sucesos genéticos cualitativos que afectan a
unos genes celulares muy variados, lo que confirma (i) la eficacia
de los procedimientos de la invención, (ii) la existencia de
marcadores genéticos "universales" en el sentido de la
invención y (iii) la importancia de la diversidad de los clones
para obtener una respuesta predictiva.
Así, las secuencias identificadas permiten poner
en evidencia, por hibridación, unas variaciones de expresión o unas
alteraciones de los genes celulares humanos siguientes: Aldolasa A
(exon 9)(SEC ID NO:1); Subunidad S4 del proteasoma 26S (SEC ID
NO:2); Alfa-tubulina (SEC ID NO:3); Glucosidasa II
(SEC ID NO:4); Homóloga del receptor de la Lamin B (SEC ID NO:5);
EF1-alfa (SEC ID NO:6);
Fra-1(SEC ID NO:7); Receptor de tirosina
quinasa AX1 (SEC ID NO:8); Proteína espliceosomial SAP62 (SEC ID
NO:9); TRAF-3 (SEC ID NO:10); EF2 (SEC ID NO:11);
TEF-5 (SEC ID NO:12); CDC25b (SEC ID NO:13); Quinasa
asociada al receptor de la interleucina-1
("IRAK")(SEC ID NO:14); WAF-1(SEC ID
NO:15); c-fos (exon 4) (SEC ID NO:16); ckshs1 (SEC
ID NO:17); PL16 (SEC ID NO:18); NFAR- 2(SEC ID NO:19),
fosfatidilinositol4-quinasa (SEC ID NO:20), ERF (SEC
ID NO:21), tirosina quinasa del receptor de tipo Eph (hEphB1b)(SEC
ID NO:22); proteína BAF60b del complejo SWI/SNF (SEC ID NO:23);
EB1(SEC ID NO:24); MSS1(SEC ID NO:25); receptor alfa
del ácido retinoico (RARa) (SEC ID NO:26); factor de iniciación de
la traducción eiF4A(SEC ID NO:27); quinasa de tipo
STE20(SEC ID NO:28); proteína HSP 90kda (SEC ID NO:29);
Lipocortina II(SEC ID NO:30); proteína TPT1
("translationally controlled tumor proteon") (SEC ID NO.31);
Hsc70 (SEC ID NO:32); Citoqueratina 18 (SEC ID NO:33);
2-oxoglutarato deshidrogenasa (SEC ID NO:34); gen
mitocondrial NADH6 (SEC ID NO:35); gen mitocondrial NADH
deshidrogenasa 4 (SEC ID NO:36); Subunidad alfa de la ATP sintasa
mitocondrial (SEC ID NO:37).
Un objeto particular de la invención reside
especialmente en la utilización de una sonda nucleica específica de
la totalidad o parte de un gen que codifica para una proteína o un
factor tal como los mencionados anteriormente, para la detección o
la evaluación del potencial de toxicidad de un compuesto, y para la
detección de una situación de toxicidad en una muestra biológica.
Preferiblemente, la sonda comprende menos de 1.000 bases, más
particularmente menos de 500 bases y comprende una secuencia
complementaria de una parte de un gen mencionado anteriormente. Más
preferiblemente, la sonda está marcada.
Ventajosamente, la invención se refiere a un
conjunto de sondas, en particular de 5 sondas o más,
preferentemente de 10 sondas o más, siendo cada una complementaria
de una parte de un gen elegido entre los genes mencionados
anteriormente. Aún más preferentemente, las sondas están
inmovilizadas sobre un soporte, como se ha descrito en la presente
solicitud.
Claims (33)
1. Procedimiento de análisis del potencial tóxico
de un compuesto de prueba, que comprende por lo menos una etapa de
hibridación entre a) una muestra de ácidos nucleicos de células
tratadas con este compuesto y b) un banco de ácidos nucleicos,
comprendiendo dicho banco unos clones específicos de (porciones de)
genes o transcritos característicos de situación de apoptosis,
indicando el perfil de hibridación el potencial tóxico del
compuesto de prueba.
2. Procedimiento de análisis del potencial tóxico
de un compuesto de prueba según la reivindicación 1, que comprende
por lo menos la hibridación separada entre a) unas sondas nucleicas
marcadas que corresponden a los ARN de células no tratadas y de
células tratadas con dicho compuesto de prueba y b) un banco de
ácidos nucleicos, comprendiendo dicho banco unos clones específicos
de (porciones de) genes o transcritos característicos de situación
de apoptosis, indicando el perfil de hibridación el potencial tóxico
del compuesto de prueba.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque las sondas nucleicas a) corresponden a
los ARN mensajeros de las células tratadas y no tratadas.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las sondas
nucleicas a) son unos ADNc o unos fragmentos de ADNc preparados a
partir de los ARNs de las células tratadas y no tratadas.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las sondas
nucleicas a) son unos productos de amplificación.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las sondas
nucleicas a) son marcadas con unos marcadores radioactivos,
fluorescentes, enzimáticos o colorimétricos.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el
compuesto de prueba es un compuesto de naturaleza química o
biológica.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el banco
b) comprende unos ácidos nucleicos que corresponden a unos genes
cuyo nivel de expresión es modificado en una situación de
apoptosis.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el banco b)
comprende unos ácidos nucleicos de los que una parte por lo menos de
la secuencia corresponde a la secuencia de genes empalmados de modo
diferencial cuando tiene lugar la situación de apoptosis.
10. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el banco b) comprende unos ácidos
nucleicos según la reivindicación 8 y unos ácidos nucleicos según
la reivindicación 9.
11. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque el banco b) se prepara por hibridación
entre una población de ácidos nucleicos de una célula en situación
de apoptosis celular y una población de ácidos nucleicos de una
célula en situación de control, y aislamiento, a partir de los
híbridos formados, de los ácidos nucleicos que corresponden a unos
empalmados diferenciales.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
situación de desregulación es inducida por modificación de la
activación, preferiblemente de la expresión de un gen iniciador o
ejecutor de la apoptosis.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la situación de desregulación es
provocada por inducción o aumento de la activación, preferiblemente
de la expresión de un gen antioncógeno.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque el gen antioncógeno se elige entre p53,
Rb, p73, myc, TUPRO-2 y NHTS.
15. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la situación de desregulación es
inducida por modificación de la activación, preferiblemente de la
expresión de un gen implicado en el crecimiento o la viabilidad
celular.
16. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la situación de desregulación es
inducida por activación, preferiblemente expresión constitutiva o
inducible de la totalidad o parte de un gen implicado en el
crecimiento celular, la viabilidad celular o la apoptosis.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el banco b)
comprende por lo menos un clon de secuencia elegida entre SEC ID
Nos: 1 a 37, más preferiblemente por lo menos 5.
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el banco b)
comprende un conjunto de sondas, en particular de 5 sondas o más,
preferiblemente 10 sondas o más, siendo cada una de las sondas
complementaria de una parte de un gen elegido entre los genes
Aldolasa A; Subunidad S4 del proteasoma 26S; Alfa tubulina;
Glucosidasa II; Homóloga del receptor de la Lamin B;
EF1-alfa; Fra-1; Receptor de
tirosina quinasa AX1; Proteína espliceosomial SAP62;
TRAF-3; EF2; TEF-5; CDC25b; Quinasa
asociada al receptor de la interleucina-1
("IRAK"); WAF-1; c-fos (exon
4); ckshs1; PL16; NFAR-2;
fosfatidilinositol4-quinasa, ERF, tirosina quinasa
del receptor de tipo Eph (hEphB1b); proteína BAF60b del complejo
SWI/SNF; EB1; MSS1; receptor alfa del ácido retinoico (RARa);
factor de iniciación de la traducción eiF4A; quinasa de tipo STE20;
proteína HSP 90kda; Lipocortina II; proteína TPT1
("translationally controlled tumor proteon"); Hsc70;
Citoqueratina 18; 2-oxoglutarato deshidrogenasa; gen
mitocondrial NADH6; gen mitocondrial NADH deshidrogenasa 4;
Subunidad alfa de la ATP sintasa mitocondrial.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
células tratadas o no tratadas a) y en situación de desregulación b)
son de tipo diferente.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
células tratadas o no tratadas son unas células de mamífero,
preferentemente humanas.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
células tratadas o no tratadas son unas progenies celulares.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
células tratadas o no tratadas son unos cultivos primarios.
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
células tratadas o no tratadas son unas células extraídas de tejidos
o de órganos de animales tratados o no tratados.
24. Procedimiento de diagnóstico del potencial
tóxico de un compuesto de prueba según la reivindicación1, que
comprende por lo menos la hibridación entre, por una parte, unas
sondas nucleicas marcadas que corresponden a los ARNm de células no
tratadas y un banco de ácidos nucleicos que comprende unos clones
específicos de (porciones de) genes o transcritos característicos
de situación de apoptosis y, por otra parte, unas sondas nucleicas
marcadas que corresponden a los ARNm de células tratadas con dicho
compuesto de prueba y dicho banco de ácidos nucleicos que
comprenden unos clones específicos de (porciones de) genes o
transcritos característicos de situación de apoptosis, indicando el
perfil de hibridación el potencial tóxico del compuesto de
prueba.
25. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque el banco comprende unos clones
específicos de (porciones de) genes o transcritos característicos
de desregulación de la vía p53.
26. Procedimiento según la reivindicación 24 ó
25, caracterizado porque el banco de ácidos nucleicos es un
banco de ácidos nucleicos característicos de células transformadas,
en particular de células tumorales.
27. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque el banco comprende por lo menos un clon
de secuencia elegida entre SEC ID Nos: 1 a 37, más preferiblemente
por lo menos 5.
28. Utilización de clones de ácidos nucleicos
específicos de (porciones de) genes o transcritos característicos
de situación de apoptosis como marcadores genéticos de toxicidad de
compuestos de prueba.
29. Utilización según la reivindicación 28, de un
clon de secuencia elegida entre SEC ID Nos: 1 a 37.
30. Kit para el estudio del potencial tóxico de
un compuesto de prueba, que comprende un banco de ácidos nucleicos
que comprende por lo menos cinco clones de secuencia elegida entre
SEC ID Nos: 1 a 37, más preferentemente por lo menos 10.
31. Kit según la reivindicación 30,
caracterizado porque el banco está depositado sobre un
soporte.
32. Procedimiento de producción de marcadores
genéticos de la toxicidad, que comprende la hibridación entre una
población de ácidos nucleicos derivados de células en situación de
apoptosis y una población de ácidos nucleicos derivados de células
en situación de control, el aislamiento, a partir del producto de la
reacción de hibridación, de clones característicos de la situación
de apoptosis, y la hibridación de los clones obtenidos con una
muestra de ácidos nucleicos derivados de células en situación de
toxicidad.
33. Procedimiento de preparación de un chip de
ADN utilizable para el diagnóstico del potencial tóxico del
compuesto de prueba, que comprende el depósito, sobre un soporte
sólido, de una o varias preparaciones de ácidos nucleicos que
comprenden por lo menos 5 clones de secuencia elegida entre SEC ID
Nos: 1 a 37.
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Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6881571B1 (en) * | 1998-03-11 | 2005-04-19 | Exonhit Therapeutics S.A. | Qualitative differential screening |
| FR2798673B1 (fr) * | 1999-09-16 | 2004-05-28 | Exonhit Therapeutics Sa | Methodes et compositions pour la detection d'evenements pathologiques |
| US7361488B2 (en) * | 2000-02-07 | 2008-04-22 | Illumina, Inc. | Nucleic acid detection methods using universal priming |
| WO2003018792A1 (fr) * | 2001-08-24 | 2003-03-06 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Procede de detection d'une substance toxique |
| GB0410105D0 (en) * | 2004-05-06 | 2004-06-09 | Amersham Biosciences Uk Ltd | Method for characterising compounds |
| EP1856283A2 (en) * | 2005-03-09 | 2007-11-21 | DSMIP Assets B.V. | Method for measuring and comparing the activity of biologically active compounds |
| KR20090093959A (ko) * | 2006-10-23 | 2009-09-02 | 더 유에이비 리서치 파운데이션 | 항암제에 대한 감수성을 나타내는 암에 대한 생체마커 및 이의 용도 |
| DE102010024898B4 (de) * | 2010-06-24 | 2012-10-25 | Merck Patent Gmbh | Genexpressionsanalysen zur Charakterisierung und Identifizierung genotoxischer Verbindungen |
Family Cites Families (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4965188A (en) * | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4888278A (en) * | 1985-10-22 | 1989-12-19 | University Of Massachusetts Medical Center | In-situ hybridization to detect nucleic acid sequences in morphologically intact cells |
| US5985549A (en) * | 1985-10-22 | 1999-11-16 | University Of Massachusetts | Non-isotopic in-situ hybridization method for detection of nucleic acids |
| US5057410A (en) * | 1988-08-05 | 1991-10-15 | Cetus Corporation | Chimeric messenger RNA detection methods |
| US6309822B1 (en) * | 1989-06-07 | 2001-10-30 | Affymetrix, Inc. | Method for comparing copy number of nucleic acid sequences |
| US5143854A (en) * | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
| US5674682A (en) * | 1992-10-29 | 1997-10-07 | Thomas Jefferson University | Nucleic acid primers for detecting micrometastasis of prostate cancer |
| US5521297A (en) * | 1993-06-04 | 1996-05-28 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates | Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors |
| US5837832A (en) * | 1993-06-25 | 1998-11-17 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
| US5529925A (en) * | 1993-12-03 | 1996-06-25 | St. Jude Children's Research Hospital | Nucleic acid sequences and fusion proteins present in human t(2;5) lymphoma |
| US5484702A (en) * | 1994-01-27 | 1996-01-16 | Research Foundation Of The State University Of New York At Buffalo | Method for preselecting recombinant clones containing a specific nucleic acid sequence and subsequent transformation with preselected clones |
| US5679541A (en) * | 1994-02-14 | 1997-10-21 | California Institute Of Technology | Programmed cell death antagonist protein |
| PH31414A (en) * | 1994-02-24 | 1998-10-29 | Boehringer Ingelheim Int | Method of diagnosing cancer precancerous state, orsusceptibility to other forms of diseases by anal ysis of irf-1 specific rna in biopsy samples. |
| US5767258A (en) * | 1995-05-12 | 1998-06-16 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Cell cycle regulatory gene |
| WO1997013877A1 (en) * | 1995-10-12 | 1997-04-17 | Lynx Therapeutics, Inc. | Measurement of gene expression profiles in toxicity determination |
| US5922535A (en) * | 1995-11-07 | 1999-07-13 | Huo; Li | Identifying sequence differences in nucleic acid populations |
| US6881571B1 (en) * | 1998-03-11 | 2005-04-19 | Exonhit Therapeutics S.A. | Qualitative differential screening |
| FR2775984B1 (fr) * | 1998-03-11 | 2006-09-15 | Bioscreen Therapeutics Sa | Criblage differentiel qualitatif |
| FR2755984B1 (fr) * | 1996-11-15 | 2002-12-27 | Bourachot Philippe | Borne escamotable |
| US6060240A (en) * | 1996-12-13 | 2000-05-09 | Arcaris, Inc. | Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom |
| CA2225187A1 (en) * | 1997-07-14 | 1999-01-14 | Universite D'ottawa/ University Of Ottawa | Xaf genes and polypeptides: methods and reagents for modulating apoptosis |
| US6849400B1 (en) * | 1997-07-23 | 2005-02-01 | Gen-Probe Incorporated | Methods for detecting and measuring spliced nucleic acids |
| GB9717766D0 (en) * | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Zeneca Ltd | Methods |
| WO1999014356A2 (en) * | 1997-09-17 | 1999-03-25 | The Johns Hopkins University | P53-induced apoptosis |
| ATE295899T1 (de) * | 1998-02-23 | 2005-06-15 | Phylonix Pharmaceuticals Inc | Screeningverfahren für die aktivität von agenzien unter verwendung von teleosten |
| JPH11262621A (ja) * | 1998-03-17 | 1999-09-28 | Ebara Corp | 除湿空調装置 |
| US6168920B1 (en) * | 1998-08-10 | 2001-01-02 | Incyte Genomics, Inc. | Extracellular adhesive proteins |
| AU6022299A (en) * | 1998-08-28 | 2000-03-21 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Toxicological response markers |
| US6160105A (en) * | 1998-10-13 | 2000-12-12 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Monitoring toxicological responses |
| FR2798673B1 (fr) * | 1999-09-16 | 2004-05-28 | Exonhit Therapeutics Sa | Methodes et compositions pour la detection d'evenements pathologiques |
| CA2450577A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-03 | Diversa Corporation | Methods for the manufacture of pure single enantiomer compounds and for selecting enantioselective enzymes |
-
1999
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