JP2006507820A - 細胞におけるメチル化状態の修復 - Google Patents

Abstract

細胞の特徴または状態を変化させ、または細胞を再プログラミングする方法であって、細胞における特徴または状態を変化させ、または細胞を再プログラミングすることが可能な薬剤で第１の細胞型を処理する工程と、処理された細胞のゲノム内のメチル化シグネチャーを測定することによって処理された細胞の変化の程度を判定する工程とを含んで成り、所定のメチル化シグネチャーが処理された細胞の変化した特徴または状態を示す。第１の細胞を処理するための好ましい物質は、第２の細胞型からの細胞抽出物、溶解物、または成分であり、第２の細胞型は所望の特徴を有し、または第１の細胞型が再プログラミングされるべき所望の細胞型である。実施例は、免疫系Ｔ細胞のそれに再プログラミングされる線維芽細胞のメチル化状態を示す。

Description

技術分野
本発明は、概して、細胞の特徴を変化させ、ＤＮＡメチル化シグネチャーを評価することによって変化をモニタリングする方法に関する。

背景技術
動物（または植物）など生物のすべての遺伝子産物の構造をコード化するために必要なすべての情報は、そのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）における４つのデオキシヌクレオチドであるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）の配列に保存されている。しかし、一部のＣデオキシヌクレオチドの複製後のメチル化の結果として、ＤＮＡにおける第５のデオキシヌクレオチド（ｍＣ）が製造されている（ミラー（Ｍｉｌｌａｒ）、ＤＳ．、ホリデー（Ｈｏｌｉｄａｙ）、Ｒ．、およびグリッグ（Ｇｒｉｇｇ）、Ｗ．、２００３年、Ｔｈｅ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ、編集者、ベック（Ｂｅｃｋ）、Ｓおよびオレク（Ｏｌｅｋ）、Ａ、ワイリー（ＷＩＬＥＹ）−ＶＣＨフェアラーク（Ｖｅｒｌａｇ）ゲーエムべーハー（ＧｍｂＨ）＆コー（Ｃｏ）ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ））。ｍＣの機能の１つは、特定の遺伝子が活性で、遺伝子産物が産生されるように転写されるかどうかを判定する発生の信号として作用することである（リー（Ｌｉ）、Ｅ．、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２３、ｐｐ．５−７、コフィグニー（Ｃｏｆｆｉｇｎｙ）Ｈ．ら、１９９９年、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８７、ｐｐ．１７５−１８１）。一般に、異なる組織型の細胞において、遺伝子のメチル化状態は、遺伝子のサイレンシングを示し（ルンヤック（Ｌｕｎｙａｋ）、Ｖ Ｖ．、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８、ｐｐ．１７４７−１７５２）、非メチル化状態は遺伝子の活性化を示す（モロー（Ｍｏｒｅａｕ）Ｐ．ら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１００、ｐｐ．１１９１−１１９６）。メチル化は、受精卵からの全成体の発生における各種段階で遺伝学的に制御されたパターンに従い組織的に変化しうる（モンク（Ｍｏｎｋ）Ｍ．、１９９５年、Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｔ．、１７、ｐｐ．１８８−１９７）。これが起こる正確な様式、その原因、およびこれらの過程が制御される方法については未だ見出されていない。

異なる細胞型の分化した成体細胞におけるメチル化シグネチャーは互いに異なる。通常、これらの異なるメチル化のシグネチャーは、多くの細胞分裂において非常に安定しているが、特定の状況下では変更されうる。例えば、ＤＮＡメチル化は、動物のクローニングに関連するプロセスの一部と考えられており、クローニングでは、完全に分化した成体の細胞（上皮細胞など）からの核が、除核された胚性幹細胞の細胞質に挿入される。上皮細胞の核は、胚性幹細胞の細胞質の発生的可能性を担うように再プログラミングされる。このプロセスは、上皮核小体のゲノムのＤＮＡメチル化シグネチャーの再プログラミングを含むと考えられている。一般に、上皮細胞核における不完全または異常なエピジェネティック再プログラミングは、クローニングの成功率が低いことの原因であると考えられている（ペニシ（Ｐｅｎｎｉｓｉ）Ｅ、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３、ｐｐ．１０６４−１０６７、ディーン（Ｄｅａｎ）Ｗら、２００１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８、ｐｐ．１３７３４−１３７３８、ブルヒス（Ｂｏｕｒｃ’ｈｉｓ）、Ｄら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１、ｐｐ．１５４２−１５４６、ハンプレイス（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ）Ｄら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３、ｐｐ．９５−９７、カング（Ｋａｎｇ）Ｙ−Ｋ．、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２８、ｐｐ．１７３−１７７、マン（Ｍａｎｎ）ＭＲ Ｗ、およびバルトロメイ（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅｉ）Ｍ Ｓ．、２００２年、ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ、３、ｐｐ．１００３．１−１００３．４）。

ゲノムにおける正常なメチル化シグネチャーの修飾は、しばしば個体の健康に有害であり、ヒトにおいては、癌などの生命にかかわる疾患（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、ＰＡ．、１９９６年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５６、ｐｐ．２４６３−２４６７、パツ（Ｐａｚ）ら、２００３年、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｎｅｔｉｃｓ、１２、ｐｐ．２２０９−２２１９、ベイリン（Ｂａｙｌｉｎ）ら、２００１年、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０、ｐｐ．６８７−６９２、ワイ（Ｗｅｉ）ら、２００３年、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９８３、ｐｐ．２４３−２５０、トヨタ（Ｔｏｙｏｔａ）ら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００、ｐｐ．７８１８−７８２３）、および神経疾患、脆弱性Ｘ症候群等など多様な他の障害（クリアウシノニス（Ｋｒｉａｕｃｉｏｎｉｓ）とバード（Ｂｉｒｄ）、２００３年、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２、Ｒ２２１−Ｒ２２７、ローバーストン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）ＫＤ、およびウォルフェ（Ｗｏｌｆｆｅ）Ａｐ、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１、ｐｐ．１１−１９、エステラー（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ）Ｍ．ら、２００２年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０３、ｐｐ．２１３−２１６、ファインベルク（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）ＡＰら、２００２年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６２、ｐｐ．６７８４−６７８７）の原因となりうる。これは、メチル化酵素５−メチルトランスフェラーゼの機能を阻害し、さらに数回のＤＮＡ複製後に、ゲノムにおける多くの遺伝子の全体的な脱メチル化をもたらす５−アザシチジンまたは５−アザデオキシシチジンによる細胞の処理など、組織培養において細胞のメチル化を変更することが知られている一部の方法について、臨床的用法をもたらした（ピエトロボノ（Ｐｉｅｔｒｏｂｏｎｏ）Ｒら、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０、ｐｐ．３２７８−３２８５）。特定の型の癌の治療においては限定的な成功が得られたが、毒性の副作用も認められる。

これまでは、生細胞のゲノムにおける特定のＣｓを選択的かつ協調的に脱メチル化またはメチル化できることは確認されていない。協調的なやり方で加齢細胞または疾患細胞の再プログラミングを行って、正常または若いメチル化シグネチャーを保存するという目標は、現在まで夢でしかない。

個々の細胞が老化し、各種類の環境的動揺に暴露されると、それらのゲノムは損傷されうる（リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）Ｂ、２００３年、Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２、ｐｐ．２４５−２６１、ナカジマ（Ｎａｋａｊｉｍａ）Ｔ．ら、２００１年、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、９４、ｐｐ．２０８−２１１、イッサ（Ｉｓｓａ）Ｊ Ｐ、２００３年、Ｔｈｅ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ、編集者、ベック（Ｂｅｃｋ）、Ｓおよびオレク（Ｏｌｅｋ）、Ａ、ワイリー（ＷＩＬＥＹ）−ＶＣＨフェアラーク（Ｖｅｒｌａｇ）ゲーエムべーハー（ＧｍｂＨ）＆コー（Ｃｏ）ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ））。通常、かかる損傷は修復される。しかし、修復過程において誤りが発生し、これが細胞のＤＮＡにおける遺伝子コードの変化をもたらし、したがって、４つのコーディングヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣのうちの１つまたはその他における変化に変更が限定されている場合には突然変異の原因となる。しかし、変更が遺伝子の制御または調節領域における５’メチルシトシン（５ｍＣ）ヌクレオチドのシグネチャーの変化を含む場合、結果として特定の５ｍＣがＣによって置換された場合には遺伝子発現が活性化され、またはＣが５ｍＣによって置換されている場合には遺伝子発現がサイレント状態となりうる。一部の薬物などのＤＮＡ損傷薬剤またはイオン化放射線は、ゲノムにおけるメチルシトシン（ｍＣ）シグネチャーのかかる変更をもたらしうる（ニース（Ｎｙｃｅ）Ｊ Ｗ．、１９９７年、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３８６、ｐｐ．１５３−１６１）。さらに、時間の経過とともに、細胞はそのＤＮＡにおけるかかるメチル化／脱メチル化変化を蓄積するが、これらは正常な細胞機能を有害なやり方で変更する作用を有する。これは結果として、加齢個体の障害のレベル増大をもたらし、またはそのような損傷細胞を有する個体において各種類の癌などの疾患を生じやすくしうる。

本発明者は、細胞におけるｍＣシグネチャーの度重なる異常なメチル化変化の悪影響を克服または変化させるために、細胞におけるｍＣシグネチャーの広範囲であるが特異的方向性を有する再プログラミングの手段を考え出した。

発明の開示
第１の態様においては、本発明は、細胞の特徴または状態を変化させるための方法であって、
第１の細胞型を、細胞における特徴または状態を変化させることが可能な薬剤で処理する工程と、
処理された細胞型のゲノム内におけるＤＮＡメチル化シグネチャーを測定することによって処理された細胞型における変化の程度を判定する工程であって、所定のＤＮＡメチル化シグネチャーが処理された細胞の変化した特徴または状態を示す工程と、を含んで成る方法を提供する。

第２の態様においては、本発明は、細胞の特徴または状態を変化させるための方法であって、
好ましくない特徴または状態を有する第１の細胞型を、所望の特徴または状態を有する第２の細胞型からの抽出物、溶解物、または細胞成分で第１の細胞型の特徴または状態を変化させるために適切な条件下および期間、処理する工程と、
細胞のゲノム内のＤＮＡメチル化シグネチャーを測定することによって処理された細胞型における変化の程度を判定する工程であって、所定のメチル化シグネチャーが細胞の変化した特徴または状態を示す工程と、を含む方法を提供する。

この方法はさらに、
細胞に高分子に対する透過性を与えるために第１の細胞型を前処理する工程を含む。

この方法はさらに、
処理された細胞を培養または成長させ、処理された細胞の複数のコピーを得る工程をも含む。

第１の細胞型は、ヒト造血系統の任意の既存の細胞型、（生後すぐから死後約４８時間までの細胞、および臍帯、胎盤由来の細胞、または上記細胞型由来のセルラインからの細胞を含む）、またはヒト体内のいずれかの部分から採取され、造血系統へ再プログラミングされる他の細胞でありうる。

細胞のゲノムにおけるＤＮＡメチル化シグネチャーなる用語は、特定の細胞型に対応する特徴的なメチル化シグネチャーを有するヒトゲノムの領域内のシトシンの群として定義される。シグネチャーは、ゲノムＤＮＡの１つもしくはそれ以上の領域と関係している１つもしくはそれ以上のシトシンの特定のメチル化プロファイルまたはパターンを測定することによって、所定の細胞型または細胞亜型（サブタイプ）において測定されうる。例えば、シグネチャーは、ＤＮＡにおける１つもしくは複数のコード領域と関係しているシトシンメチル化パターンでありうる。かかるシグネチャーは、例えば、ＣＤ１４＋単球、もしくはＣＤ３４＋幹細胞、または老若の幹細胞など細胞型内の軌道の診断用となる。修飾シトシンのこのシグネチャーは、細胞表面分子、細胞内のタンパク質の組合せ、ｍＲＮＡ発現、代謝産物濃度、細胞封入体、各種の顕微鏡的レベル（光学または電子顕微鏡）で測定される形態的特徴、または上記の組合せなど細胞型の特徴に頼ることない細胞型の指標である。

好ましくは、第１の細胞型は、年齢関連の障害、または癌などの疾患、または自己免疫疾患、（バン ラール（ｖａｎ Ｌａａｒ）、Ｊ Ｍおよびチンダル（Ｔｙｎｄａｌｌ）、Ｒ、２００３年、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ、１０、５７−）、または心筋梗塞もしくは虚血などの心血管障害、（ペリン（Ｐｅｒｉｎ）Ｅ Ｃら、２００３年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０７、ｐｐ．２２９４−２３０２）の患者由来の細胞である。より好ましくは、第１の細胞型は幹細胞である。しかし、免疫および造血器系のＴ細胞または単球など他の細胞型、（アバス（Ａｂｂａｓ）Ａ Ｋ．、２０００年、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗ Ｂサンダース アンド カンパニー（Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、フォン アドリアン（ｖｏｎ Ａｄｒｉａｎ）Ｕ Ｈら、２０００年、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ、３４３、ｐｐ．１０２０−１０３４）、特に疾患細胞型が処理されうることが理解されるであろう。

薬剤は、化学物質、薬物、核酸、アプタマー、抗体、抗原、Intercalating Nucleic Acid （ＩＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Locked Nucleic Acid （ＬＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、その組合せ、またはそのキメラ型変形でありうる。

好ましい形態においては、薬剤は、所望の特徴または状態を有する第２の細胞型からの抽出物、溶解物、または細胞成分である。

第２の細胞型は、細胞のＤＮＡメチル化プロファイルが第１の細胞型の再プログラミングのための所望のエンドポイントである種または種の組合せ由来でありうる。好ましくは、第２の細胞型は、第１の細胞型と同類の細胞型の正常または健康な個体由来の細胞である。より好ましくは、第２の細胞型は幹細胞である（オルキン（Ｏｒｋｉｎ）、ＳＨ．、ゾン（Ｚｏｎ）、ＬＩ．２００２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３、ｐｐ．３２３−３２８、ゲージ（Ｇａｇｅ）、Ｆ Ｈ．、およびベルマ（Ｖｅｒｍａ）、ＩＭ．、２００３年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００、ｐｐ．１１８１７−１１８１８、プロコップ（Ｐｒｏｃｋｏｐ）ＤＪ．ら、２００３年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００、ｐｐ．１１９１７−１１９２３）。第２の細胞型は、第１の細胞型の望ましくない特徴によってひき起こされる病気または状態を患っていない亜成体または個体由来でありうる。骨髄幹細胞、他の幹細胞、および上皮細胞など他の細胞型も第２の細胞型として使用されうることが理解されるであろう。

１つの好ましい形態においては、第１の細胞型および第２の細胞型は、同じ種からの同じ細胞型である。別の好ましい形態においては、第１の細胞型および第２の細胞型は、同じ細胞型ではなく、または同じ種ではない。第２の細胞型の例としては、ヒトまたは他の哺乳動物の第１の型の細胞で使用するための両生動物の卵細胞または生殖細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

幹細胞の語によって、すべての成体幹細胞および特に骨髄系統のものを含むものが意味される（フェルファイリエ（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ）、ＣＭ．、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３、ｐｐ．３１４−３１７、オルキン（Ｏｒｋｉｎ）、ＳＨ．、ゾン（Ｚｏｎ）、ＬＩ．２００２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３、ｐｐ．３２３−３２８、ゲージ（Ｇａｇｅ）、Ｆ Ｈ．、およびベルマ（Ｖｅｒｍａ）、ＩＭ．、２００３年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００、ｐｐ．１１８１７−１１８１８、プロコップ（Ｐｒｏｃｋｏｐ）ＤＪ．ら、２００３年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００、ｐｐ．１１９１７−１１９２３）。

必要に応じて、第１の細胞型は適切な手段によって処理され、高分子の通過に対する透過性を与えることができる。処理としては、エレクトロポレーション、低温熱ショック、またはストレプトリジンＯなど各種の酵素が挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、処理は細胞に一時的な透過性を与える。

抽出物、溶解物、または細胞成分は、当技術分野で周知の適切な手段によって獲得されうる。例としては、ハッケリエン（Ｈａｋｅｌｉｅｎ）ら（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０、ｐｐ．４６０−４６６によって記載されているものが挙げられるが、これに限定されない。細胞を含有しない抽出物は、さらに処理または断片化し、第１の細胞型における場合、該第１の細胞型のゲノム内のＤＮＡメチル化シグネチャーを変化させる第２の細胞型からの成分または高分子を得ることができる。

暴露時間は、細胞型、抽出物、または細胞成分、および処理の条件によって、数分から数時間でありうる。処理は、生理的温度、または細胞の死がもたらされない他の温度下に行うことができる。

処理または再プログラミングされた細胞は、当技術分野で周知の適切な培地または宿主において、細胞の成長および分裂に適切である条件下で培養されうる。本発明は、そのゲノムＤＮＡにおけるそのメチル化シグネチャーによって確認される所望の特徴を有する適切な処理または再プログラミングされた細胞の製造または選択を可能にする。

宿主は、脊椎動物または無脊椎動物のいずれかの動物でありうる。細胞が宿主において適切に培養されている場合、それらは、その細胞を無傷のままにしておくために、周知の手段によって宿主から除去されうる。１つの好ましい形態においては、宿主はウシ、ヒツジ、ウマ、家禽、またはブタから選択される家畜である。

好ましくは、細胞のゲノム内のメチル化シグネチャーは宿主内に存在する拡散性因子によって測定される。

メチル化シグネチャーは、好ましくは、当技術分野で周知の、または本出願者によって開発されたbisulphite処理アッセイによって測定される。

好ましい形態、例えば、加齢細胞における、より若い状態への再プログラミングにおいては、処理の有効性の確認は、ＤＮＡメチル化シグネチャーがゲノムの少なくとも一部または全部において「正常な」若いシグネチャーに戻っていることである。ゲノムＤＮＡの一部のみのメチル化も起こりうることも理解されるであろう。

本発明の方法を用いて、第１の細胞型において所望の特徴または状態を提供し、１つの細胞亜型のＤＮＡメチル化シグネチャーの特徴が別の亜型の特徴に変化するようになりうる。例えば、１つのリンパ球のＴ細胞亜型から別のリンパ球のＴ細胞の亜型へ、または老造血幹細胞がより若い造血幹細胞へ変更されうる。

あるいは、本発明の方法を用いて、混合集団内の細胞の選択された集団において所望の特徴または状態を適用することができる。例えば、細胞の混合集団がある場合、それらが例えば癌性および正常である場合は、細胞の混合集団は本発明の方法によって処理またはターゲティングされ、正常な細胞のみが変化し、反応し、分裂するようになりうる。処理された細胞のＤＮＡメチル化シグネチャーを測定することによって、正常な細胞が適切に変化し、所望の効果を有することを確認されうる。癌細胞を正常に変化させることはないが、この方法を用いて一方の所望の細胞型の割合を他方よりも増大させることができる。

また、正常および癌性など細胞の混合集団においては、癌細胞は処理または再プログラミングされ、休眠もしくはアポトーシス、または自殺状態に入ることができる。２つの細胞型もしくは２つの細胞亜型、または多数の細胞型もしくは多数の細胞亜型の一般的な場合、任意の型または亜型を処理または再プログラミングし、他の細胞型に対する競合的利点を提供することができる。

本方法は、結果として、単一の細胞型の変更されたメチル化シグネチャーを、同じ細胞型の対応する正常な細胞のシグネチャーへ再プログラミングすることになる（細胞型内再プログラミング）。

この方法を用いて、老細胞のメチル化シグネチャーを、より若い細胞のものに再プログラミングすることができる（ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）、Ｈおよびザント（Ｚａｎｔ）、ＧＶ．、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３、ｐｐ．３２９−３３３）。例えば、老成体幹細胞のメチル化シグネチャーは、より若い幹細胞のシグネチャーに再プログラミングされうる。疾患幹細胞のゲノムのメチル化シグネチャーは、正常幹細胞のものに変化させ、免疫系のＴ細胞など他の疾患細胞のゲノムのメチル化シグネチャーは、非疾患Ｔ細胞のものに変化させることができる。

幹細胞は、そのＤＮＡが化学療法薬、もしくは一般の薬剤などの薬剤への暴露、または電磁照射による損傷、または妊娠中における葉酸などの正常な化学物質の不十分な供給によって崩壊されている細胞でありうる。（ウォーターランド（Ｗａｔｅｒｌａｎｄ）ＲＡおよびジルトル（Ｊｉｒｔｌｅ）、ＲＬ、２００３年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２３、ｐｐ．５２９３−５３００、フェネッヒ（Ｆｅｎｅｃｈ）Ｍ．、２００３年、Ｔｈｅ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ、編集者、ベック（Ｂｅｃｋ）、Ｓおよびオレク（Ｏｌｅｋ）、Ａ、ワイリー（ＷＩＬＥＹ）−ＶＣＨフェアラーク（Ｖｅｒｌａｇ）ゲーエムべーハー（ＧｍｂＨ）＆コー（Ｃｏ）ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ））。

第３の態様においては、本発明は、本発明の第１または第２の態様による方法から得られる単離され、変化または再プログラミングされた細胞を提供する。

好ましくは、処理または再プログラミングされた細胞は幹細胞である。処理または再プログラミングされた細胞は、その後の処理のための第２の細胞型として使用され、これによりそのつど処理が行われる個体から新鮮な第２の細胞型を得る必要を除去することができる。処理または再プログラミングされた細胞は、細胞療法または移植など研究または他の医学的な用途のための細胞系としても有用でありうる。

第４の態様においては、本発明は、望ましくない特徴または状態の細胞を有する結果もたらされる病気を患う個体を治療するための方法を提供し、この方法は、
個体から細胞を得る工程と、
細胞の少なくとも一部分で本発明の第１または第２の態様による方法を実施し、所望の特徴または状態を有する処理または再プログラミングされた細胞を得る工程と、
処理または再プログラミングされた細胞を、それらの細胞が病気を治療するために望ましくない特徴を有する少なくとも一部の細胞を増加させ、かつ置換する個体に戻す工程と
を含む。

細胞は異種の細胞集団または所定の細胞型でありうる。細胞は、癌性など望ましくない型または正常な細胞など所望の型でありうる。

好ましくは、個体は、加齢、もしくは癌または自己免疫疾患と関係がある障害などの病気を患っている。

好ましい形態においては、細胞は幹細胞である。次いで、処理または再プログラミングされた幹細胞は対象において分化し、治療を補助する。癌細胞など他の細胞型または他の疾患と関係がある細胞型も治療されうることが理解されるであろう。

本発明は、薬物、またはより偶発的な出来事への暴露によって、年齢関連の過程の結果として変更されているＤＮＡメチル化シグネチャーによる望ましくない特徴または状態を有する機能不全の細胞における特徴を取り戻すために特に有用である。

本発明の利点は、個体の細胞が、処理または再プログラミング後に個体に戻される（移植される）ことである。したがって、拒絶の問題または免疫抑制薬または薬物療法を使用する必要がなくなる。

この方法は、対象および状態によって、個体または個別の処理に有用でありうる。

一時的に高分子に対して透過性を与えられている細胞は、細胞を含有しない抽出物、溶解物、または同じ表現型の正常な細胞の細胞成分で処理することができる。かかる細胞は、処理された宿主個体由来、またはより好ましくは、問題をひき起こした同じ環境的動揺（年齢など）に暴露されている若い個体由来の細胞から抽出または得られた抽出物、溶解物、または細胞成分由来でありうる。

本発明は、第２の細胞型の抽出物、溶解物、または細胞成分が、ヒト細胞を１つの細胞型から別の細胞型へ正常な経路によって送りうる分子の特定の組合せを得る方法として使用される場合にも使用されうる。手短に言えば、癌性細胞はきわめて異数性であり、著しく再配列されたゲノムを有するため、一部の遺伝子はきわめて増幅されている。また、癌性細胞は、各癌性細胞がおそらく独自であるため既知の細胞型に対応することがない。したがって、それらは分子的に、例えば、高レベルの特定のタンパク質が抽出されうる抽出物の供給源を提供しうる。また、癌細胞はしばしば染色体転座を含有するため、新たなタンパク質産物を産生する融合遺伝子をしばしば有する。これらの新たなタンパク質産物を用いて、既存の従来の細胞型からの抽出物を用いるよりも良好な方法で細胞を処理または再プログラミングしうる。

同様に、多くの生物は、それらの細胞集団から新たなタンパク質またはＲＮＡを得るこれらの目的に使用されうるゲノムを再配列している。したがって、マウス、突然変異体マウス、トランスジェニックマウス、ウイルスに感染したマウスの系はすべて抽出物に独自に適切である細胞集団を有することになる。

同様に、非常に多くのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）突然変異体、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）突然変異体、酵母突然変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異体等およびそのトランスジェニック誘導体はすべて、ネオモルフなどの抽出物、融合遺伝子、機能突然変異の獲得における新たな遺伝子産物、小さなＲＮＡの新たな形態等を提供しうる。自然の展開スペクトルだけでなく、変異株の膨大な倉庫からのかかる新たなタンパク質およびＲＮＡの入手可能性は、本発明によって使用されうる。

第５の態様においては、本発明は、治療の方法における本発明の第３の態様により単離された変化細胞の使用を提供する。

好ましくは、この治療法は細胞療法である。

第６の態様においては、本発明は、療法のための薬品の製造における本発明の第３の態様による単離された変化細胞の使用を提供する。

この明細書の全体を通じて、文脈により別に要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」なる言葉、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、規定された要素の封入体、整数または工程、または要素、整数、または工程の群を暗示するが、他の要素、整数、もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程の群の排除は暗示しないと理解されるであろう。

本明細書に含まれている文書、法令、材料、デバイス、商品または同種のものの議論は、本発明の文脈を提供するためだけにある。これらの事柄のいずれかまたはすべてが従来技術の基礎の一部を形成し、または本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアにおいて存在していたように本発明に関連した分野における一般的な知識であったことを是認と考えるべきではない。

本発明がより明らかに理解されるために、以下の図面および実施例を参考にして好ましい形態を説明する。

本発明を実施するための形態
方法
細胞のメチル化シグネチャーの測定
ＤＮＡのbisulphite処理
必要に応じて適切な制限酵素であらかじめ消化してもよいＤＮＡ ２μｇに、３Ｍ ＮａＯＨ（新しく調製された水５０ｍｌ中６ｇ）２μｌ（１／１０容積）を、最終容積２０μｌとなるように添加した。混合物を３７℃に１５分間インキュベートした。室温超の温度でのインキュベーションによって、変性の効果を強化することができる。

インキュベーション後、２ＭのMetabisulphiteナトリウム２０８μｌ（１０Ｎ ＮａＯＨ ４１６ｍｌと水２０ｍｌ中に７．６ｇ、ＢＤＨ ＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄ、新しく調製）および１０ｍＭキノール（Ｑｕｉｎｏｌ）１２μｌ（水５０ｍｌ中０．０５５ｇ、ＢＤＨ ＡｎａｌＲ＃１０３１２２Ｅ、新しく調製）を連続して添加した。試料を鉱油２００μｌでオーバーレイした。次いで、試料を５５℃で一夜インキュベートした。あるいは、試料をサーマルサイクラー中で以下のように循環させることができる。すなわち、約４時間または一夜、以下のようにインキュベートする。すなわち、ステップ１、ＰＣＲマシン中で５５℃／２時間サイクル、ステップ２、９５℃／２分。ステップ１は、約３７℃〜約９０℃の任意の温度で実施され、時間の長さは５分〜８時間で変化させることができる。ステップ２は、約７０℃〜約９９℃の任意の温度で実施され、時間の長さは約１秒〜６０分、もしくはそれ以上で変化させることができる。

Metabisulphiteナトリウムによる処理後、油を除去し、ｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌまたはグリコーゲン２μｌを、ＤＮＡ濃度が低くなるまで添加した。これらの添加物は任意的であり、特にＤＮＡが低濃度で存在する場合に、ターゲットＤＮＡと共沈させることによって得るＤＮＡの収量を改善するために使用されうる。

イソプロパノール浄化処理を以下のように行った。すなわち、水８００μｌを試料に添加し、混合し、次いでイソプロパノール１ｍｌを添加した。試料を再び混合し、−２０℃に最低限５分間放置した。試料をマイクロフュージで１０−１５分間回転させ、ペレットを２回、８０％ＥＴＯＨで洗浄し、毎回ボルテックスで混合した。この洗浄処理により核酸とともに沈降した残留塩が除去される。

ペレットを乾燥させ、次いで、５０μｌ程度の適切な容積のＴ／Ｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）ｐＨ７．０−１２．５中に再懸濁した。ｐＨ１０．５のバッファーが特に有効であることが知られている。核酸を懸濁する必要に応じて、試料を３７℃〜９５℃で１分〜９６時間インキュベートした。

ＰＣＲ増幅を処理されたＤＮＡ １μｌで行った。ＰＣＲ増幅をbisulphite処理ゲノムＤＮＡ １μｌを含有する反応混合物２５μｌ中で、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲマスターミックス、６ｎｇ／μｌの各々のプライマーを用いて行った。第１回目の増幅産物１μｌをプライマーを含有する第２回目の増幅反応物に移した。ＰＣＲ産物の試料をテルモハイベイド（ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ）ＰＸ２サーマルサイクラー中でクラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９４年、８月、１１、２２（１５）、ｐｐ．２９９０−２９９７において記載された条件下で増幅した。

アガロースゲル（２％）を、アガロース５０ｍｌ当り臭化エチジウム（ＣＬＰ＃５４５０）１滴を含有する１％ＴＡＥ中で調製した。ＰＣＲ由来産物５μｌを５倍のアガロースローディングバッファー１μｌと混合し、潜水水平電気泳動タンクを用いてＸ１ＴＡＥ中１２５ｍＡで電気泳動した。マーカーは低１００−１０００ｂｐ型であった。コダック（Ｋｏｄａｋ）ＵＶＩｄｏｃ ＥＤＡＳ２９０システムを用いてＵＶ照射下にゲルを視覚化した。

処理または再プログラミング手順
抽出物を製造するための第２の細胞型、すなわちＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞系（１ｘローラーボトル１，７００ｃｍ^２）
処理または再プログラミングされる第１の細胞型、すなわち、２９３Ｔ線維芽細胞（２ｘＴ７５フラスコを再プログラミング前日に分割した）。
細胞用のＤＭＥＭ培地
トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％）
細胞溶解バッファー、すなわち、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ８．２の基礎液をアリコット５０ｍｌ中で冷凍保存することができる。バッファー用のその後の添加物は、
ＰＭＳＦ（ＥＴＯＨ中１００ｍＭのストック）、ＤＴＴ（１Ｍのストック）、およびプロテアーゼインヒビターカクテル、分割および凍結（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｐ８３４０）
であった。
ストレプトリジンＯ（ＳｉｇｍａＳ０１４９）、Ｈ_２Ｏ中６５単位／μｌで分割および凍結したストック（凍結ストックは１か月後に廃棄すべき）。
ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液、Ｃａ^２＋−フリー）
ＰＢＳの１ｘ５００ｍｌボトル（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋−フリー）
２００ｍＭ ＣａＣｌ_２
ＡＴＰ（水中２００ｍＭストック）
ＧＴＰ（水中１０ｍＭストック）
ホスホクレアチン（水中２Ｍストック）
クレアチンキナーゼ（水中５ｍｇ／ｍｌストック）
ヌクレオチド（ＮＴＰ）ミックス（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、各１００ｍＭ）
デキストラン、テキサスレッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｄ−１８３０）水中２５ｍｇ／ｍｌ。
３ｍｍチップ付きプローブソニケーター
細胞培養用マルチウェルプレート（４８穴）
使い捨て式５０ｍｌ、１５ｍｌ、１．５ｍｌ、および０．２ｍｌ試験管（滅菌）
４℃での遠心分離：
^＊１．５ｍｌ試験管用スイングアウトバケットで遠心分離
^＊１５０００ｇの回転で１．５ｍｌ試験管用に遠心分離
^＊８００ｇで１５ｍｌおよび５０ｍｌ試験管用に遠心分離
顕微鏡スライドおよびカバースリップ
細胞チャンバースライド
３７℃で水浴
標準共焦点顕微鏡
緑色フルオロフィルター付きエピ蛍光（Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡

抽出物の調製
Ｉ． 第２の細胞型Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞系細胞を採取し、５０ｍｌ試験管に移し、８００ｇ（約１，２００ｒｐｍ）で１０分間、４℃で回転する。
ＩＩ． 細胞を冷却した１ｘＰＢＳ中で２回洗浄し、８００ｇで１０分間、４℃で回転する。細胞を第１回目の洗浄中は目盛線付きの１５ｍｌ試験管１つにプールする。第２回目の洗浄中に細胞数を計算するために小さいアリコートに取出す。
ＩＩＩ． １Ｍ ＤＴＴ／ｍｌのバッファー１μｌおよび１００ｍＭ ＰＭＳＦ／ｍｌのバッファー１０μｌを添加し、氷冷した細胞溶解用バッファー１０ｍｌ中で、細胞ペレットを１回洗浄する。
ＩＶ． ８００ｇ、１０分間、４℃で回転する。溶解用バッファーの添加後は細胞を氷上に保持することが重要。
Ｖ． 細胞ペレットの容積を見積もり、ＤＴＴ、ＰＭＳＦ、およびプロテアーゼインヒビターカクテル（１０μｌカクテル／ｍｌバッファー）とともに、体積の１倍よりわずかに少ない溶解バッファー中にペレットを再懸濁する。
^＊注 細胞懸濁液はきわめて高粘度であり、気泡を取り込まないこと。
ピペットを使用し、最終容積が細胞ペレットの２倍であるかどうか確認し、２倍でない場合は、さらにバッファーを添加する。細胞ペレットは、最初のペレット容積の２倍超には希釈しないこと。
ＶＩ． 氷上に４５分間放置して細胞を増大させる。
ＶＩＩ． 細胞を１．５ｍｌ試験管に２００μｌずつに分割する。すべての細胞および核が溶解するまで超音波処理する（顕微鏡下で点検）。試験管当り３５％出力、０．４秒間隔で約１分１５秒。（超音波処理の条件は各細胞型で最適化されなければならない。）
ＶＩＩＩ． 溶解物を１．５ｍｌ試験管中にプールし、１５，０００ｇ、１５分間、４℃で回転する。
ＩＸ． 上清（抽出物）を取出し、抽出物の３ｘ２０μｌのアリコットをタンパク質濃度、ｐＨ、および毒性の試験用に取っておく。残りを２００μｌ−ＰＣＲ試験管に、１００μｌ抽出物／試験管に分割する。
Ｘ． 抽出物を直接使用し、または液体Ｎ_２またはドライアイスおよびＥＴＯＨ中に素早く凍結させ、−８０℃で保存する。

細胞の処理または再プログラミング
Ｉ． ターゲット２９３Ｔ線維芽細胞（第１の細胞型）を採取し、２回冷却１ｘＰＢＳ中で洗浄する。洗浄中、細胞は冷却しておく。２回目の洗浄中、数を数えるためにアリコートを取出す。細胞の数を測定する。
ＩＩ． 細胞を冷却ＨＢＳＳ中で１回洗浄する。
ＩＩＩ． 細胞を再懸濁し、１．５ｍｌ試験管中２０，０００細胞／１００μｌ ＨＢＳＳの各反応用に濃度を与える。細胞数が各反応設定において５回の各反応で低いと、最終プレートウェルに混合された場合、ウェル当りの細胞数が１００，０００となる。これは対照にも当てはまる。
ＩＶ． スイングアウトバケットロータで５分間、１２００ｒｐｍ、４℃で回転する。
Ｖ． 上清を除去する（細胞を除去しないように注意する）。
ＶＩ． １５．５μｌ ＨＢＳＳを各試験管に添加する。
ＶＩＩ． ＳＬＯ希釈標準溶液を調製する。すなわち、ストックのアリコット（６５．８単位／μｌ）を解凍し、氷上に保持する。氷冷ＨＢＳＳ中で１：１００に希釈する。常に氷上に保持する。
ＶＩＩＩ． 試験管を３７℃の水浴中に配置する。ＳＬＯを添加する前に数分間、試料をあらかじめ加熱する。
ＩＸ． ４．５μｌ ＳＬＯ／試験管を添加し（１：１００希釈、２．９単位最終ＳＬＯ濃度を与える）、試験管を静かに振とうし、ＳＬＯを細胞懸濁液と混合する。
Ｘ． ５０分間、３７℃でインキュベートする。
ＸＩ． 再プログラミング用の抽出物を調製する。
→ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンキナーゼ、ホスホクレアチンの各ストックを１：１：１：１の比で混合することによってＡＴＰ産生系を調製する（ストックは−２０℃で保存されうる）。１００ｍＭ ＮＴＰは１：１：１：１で混合され、２５ｍＭのストックが得られ、これは凍結されうるが、一旦解凍した後は氷上で保持する。
ＸＩＩ． 必要な抽出物の各１００μｌに、上記の新しく混合したＡＴＰ産生系５μｌおよびＮＴＰミックス４μｌを添加する。使用するまで抽出物を氷上で保持する。
ＸＩＩＩ． 試験管（ＳＬＯ中の細胞とともに）を氷上に配置し、氷冷ＨＢＳＳ ２００μｌを各試験管に添加する（ＳＬＯ反応を停止する）。スイングアウトバケットロータで５分間、４℃、１２００ｒｐｍで回転する。試験管を氷上に戻す。
ＸＩＶ． 上清を除去する。細胞を除去しないように注意する。
ＸＶ． 細胞の２０μｌ抽出物カクテル／試験管（または取込み対照用テキサスレッドデキストランとともにＨＢＳＳ ２０μｌ）を添加する。
ＸＶＩ． 試験管を静かに振って混合する。１時間、３７℃（水浴）にインキュベートする。試験管をラックに移し（室温）、２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む培地を添加する。
ＸＶＩＩ． 細胞をマルチウェル細胞培養プレートに移し、５つの反応物を１つのウェルにプールする。
ＸＶＩＩＩ． 細胞を２時間、ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートする。
ＸＩＸ． ＣａＣｌ_２培地を標準の培地と取替え、一夜放置する。

加齢個体の発現プロファイリング
マイクロアレイプロファイリング手順、幼若（ｙｏｕｎｇ）および加齢（ａｇｅｄ）個体からの幹細胞の発現プロファイリング
成体ＣＤ３４＋幹細胞を、世界的に使用されている（アンデルリーニ（Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ）Ｐら、１９９７年、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、３７、ｐｐ．５０７−５１２、カング（Ｋａｎｇ）、Ｅ．Ｍ．、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９、ｐｐ．８５０−８５５）標準のＧ−ＣＳＦプロトコルプロトコル（フィルグラスチム（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、デ アル ルビア（ｄｅ ａｌ Ｒｕｂｉａ）ら、２００２年、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４２、ｐｐ．４−９）を用いて末梢血流内へ動員し、ＣＤ３４＋細胞を標準の白血球成分採取法によって採集し、ＣＤ３４＋幹細胞（健康な第１の細胞型）を標準の磁気ビーズ法（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））によって単離した。細胞は使用するまで凍結し、ＲＮＡを標準の方法によって抽出した。ＲＮＡを適切に転換し、標識し、マイクロプラットフォームにハイブリダイズさせ、適切なレーザースキャニングまたは放射能検出法によってＲＮＡ発現レベルを推定した。結果として得られたデータのバイオインフォマティック分析は、ゲノム上の相対遺伝子活性のスナップショットを示し、アフィメトリクスアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）プラットフォーム、Ｕ１３３Ａでは、２０，０００を超える十分にアノテーションされたヒト遺伝子（または遺伝子の一部分）をプラットフォーム上に有した。

アトラスプラスチック（Ａｔｌａｓ Ｐｌａｓｔｉｃ）８Ｋアレイプロトコルプロトコルを用いるヒトＣＤ３４＋造血幹細胞のマイクロアレイ分析
４９歳の男性患者からのＣＤ３４＋造血幹細胞の精製
全血からのＣＤ３４＋細胞の精製
ロイヤルノースショア（Ｒｏｙａｌ Ｎｏｒｔｈ Ｓｈｏｒｅ）病院（シドニー）で白血球成分採取を受けた患者から試料を得た。試料は事前の倫理委員会の承認により得た。Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＃１７−１４４０−０３、ニュージャージー州（ＮＪ）、ピスカタウェイ）を用いて、メーカーの使用説明書に従い白血球を濃縮した。ＣＤ３４＋細胞を白血球集団ＣＤ３４前駆細胞選択システム（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）＃１１３．０１）からそれぞれメーカーの使用説明書に従い単離した。

アトラスＲＮＡ抽出手順
Ｉ． トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）１ｍｌを直接、磁気ビーズ／細胞複合体に添加し、試料を−７０℃で保存した。
ＩＩ． 試料を−７０℃から取り出し、氷上で解凍した。
ＩＩＩ． 試料を十分に混合し、室温で５分間放置し、核タンパク質複合体を分離した。
ＩＶ． ０．５ｍｌのビーズ／細胞を除去し、清潔なＲＮａｓｅフリー１．５ｍｌ遠心分離用試験管内に入れ、試験管をマグネティック・セパレータへ６０秒間配置し、ビーズを含有しない上清を、清潔な試験管内に移した。
Ｖ． 次いで、試料を１２，０００Ｘｇで、１０分間、４℃で回転し、高分子量のＤＮＡおよび他の混入物質を除去した。
ＶＩ． 上清を清潔な試験管内に移し、１００％クロロホルム１００μｌを添加し、試料を手で１５秒間強く混合し、次いで室温で２−３分間インキュベートした。
ＶＩＩ． 次いで、試料を１２，０００Ｘｇで１０分間、４℃で回転し、相を分離した。
ＶＩＩＩ． 上部水相を清潔な試験管内に移し、ピペット先端を確実に界面から離し、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン１μｌを添加し、試料をボルテキシングした。
ＩＸ． １００％の同等量（０．２５ｍｌ）を添加し、試験管をボルテキシングし、次いで、室温で１０分間放置した。
Ｘ． 次いで、試料を１２，０００Ｘｇで１０分間、４℃で回転し、ＲＮＡをペレット化する。
ＸＩ． 上清を除去し、８０％エタノール０．７５ｍｌでペレットを洗浄し、ｃＤＮＡ合成反応のインヒビターを除去し、次いで、７，５００Ｘｇで５分間、４℃で簡単にボルテックスで振とうし、ＲＮＡをペレット化する。
ＸＩＩ． 工程１１をさらに１回繰り返す。
ＸＩＩＩ． 次いで、ペレットをマイクロフュージで１０秒間回転し、残留エタノールを除去し、ペレットを直ちにＲＮａｓｅフリーの水２５μｌ中に再懸濁した。
注 ペレットが乾燥した場合には、ＲＮＡを再懸濁することはきわめて困難であり、２６０／２８０比は１．６未満となる。
ＸＩＶ． 次いでＯＤ ２６０／２８０／３１０を記録する。

ｃＤＮＡ合成
Ｉ． 各ｃＤＮＡ合成用に、壁の薄い試験管中で、０．５ｍｌＲＮａｓｅフリーの以下の試薬を調製した。

ＩＩ． 内容物を混合し、マイクロフュージで簡単に回転した。
ＩＩＩ． 試料を７０℃で８分間インキュベートし、ＲＮＡを変性させた。
ＩＶ． ＲＮＡが変性している間に、以下のマスター混合物を調製した。

Ｖ． 試験管をＰＣＲマシンから取り出し、氷上で２分間冷却し、次いで短時間回転し、内容物を採集した。
ＶＩ． 次いで、試料を４２℃で２分間インキュベートした。
ＶＩＩ． パワースクリプト（Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素０．５μｌを反応毎に添加し（１．７５μｌ）、マスター混合物をピペットによって十分に混合した。
ＶＩＩＩ． 完全なマスター混合物４．５μｌを各試料および対照試験管に添加し、次いで試料を４２℃で６０分間インキュベートし、試料を氷に移した。
ＩＸ． １０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．６ ４０μｌを各試料に添加した。
Ｘ． 試験管を７２℃で７分間加熱し、次いで必要になるまで−７０℃で保存した。

ロングディスタンス（Ｌｏｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ）ＰＣＲによるアトラスｃＤＮＡ増幅
注 サイクルの数は各試料について、反応がプラトーに達しないように確実に決定されなければならない。増幅反応を各試料について３通り（２つの試験と１つの対照）設定し、対照の胎盤については２通り（１つの試験と１つの対照）設定した。
Ｉ． サーマルサイクラーを９５℃にあらかじめ加熱した。
ＩＩ． ０．５ｍｌの壁の薄い試験管中で、第１の鎖のｃＤＮＡ ５μｌを脱イオン水３７μｌと混合した。
ＩＩＩ． 以下のマスター混合物を調製した。

ＩＶ． マスター混合物をボルテックスで混合し、次いでマイクロフュージで短時間回転した。
Ｖ． マスター混合物８μｌを適切な試験管に添加し、試料をピペットによって十分に混合した。
ＶＩ． 試験管を鉱油５５μｌでオーバーレイした。
ＶＩＩ． サーマルサイクルを以下のように開始した。

ＶＩＩＩ． すべての試験管を上記のように１５サイクルのＰＣＲにかけ、次いで試験試料を除去し（すなわち、２つのＣＤ３４＋／２つのＴ細胞／１つの対照）、これらの試験管を氷上に配置した。
ＩＸ． 各対照試料１０μｌを清潔な試験管内へ移し、残りの混合物をさらに上記のように３サイクルのＰＣＲにかけた。
Ｘ． 工程９をさらに２回繰り返し、最終２４サイクルのＰＣＲとした。
ＸＩ． これらの試料を１ｋｂのＤＮＡサイズマーカーを用いて１．２％アガロースゲル上で分析した。

ＰＣＲ産物のアトラス（Ａｔｌａｓ）スピンカラム精製
注 Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎシステムを使用し、Ｃｈｒｏｍａ ｓｐｉｎシステムを使用しないこと。
Ｉ． ９５％エタノール２８ｍｌをバッファーＮＴ３に添加した。
ＩＩ． ＰＣＲ産物の量をＴＥバッファーｐＨ７．５ ５０μｌで１００μｌに調整し、試料をピペットによって十分に混合した。
ＩＩＩ． ＮＴ２バッファー４００μｌを試料に添加し、試料を十分に混合した。
ＩＶ． Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラムを２ｍｌ収集試験管に配置し、試料をピペットでフィルター上に取出した。次いで、試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集試験管を廃棄した。
Ｖ． カラムを新しい収集試験管内へ配置し、バッファーＮＴ３ ５００μｌを添加した。次いで試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集試験管を廃棄した。
ＶＩ． 工程５をさらに２回繰り返した。
ＶＩＩ． カラムを新しい収集試験管内へ配置し、次いで試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、残留エタノールを除去した。
ＶＩＩＩ． カラムを清潔な１．５ｍｌ遠心分離管内へ配置し、バッファーＮＥ ５０μｌをフィルター上に直接添加した（注 ピペットがフィルター表面に接触していないことを確認する）。
ＩＸ． 試料を２分間浸漬させ、次いで１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、精製ＰＣＲフラグメントを溶出した。
Ｘ． ＯＤ２６０／２８０／３１０を測定する。

Ｔ細胞ＰＣＲ産物＃２のアトラススピンカラム精製
注 精製を繰り返し、ＰＣＲ産物の収量を増大させた。
Ｉ． ＰＣＲ産物の量をＴＥバッファーｐＨ７．５ ５０μｌで１００μｌに調整し、試料をピペットによって十分に混合した。
ＩＩ． ＮＴ２バッファー４００μｌを試料に添加し、試料を十分に混合した。
ＩＩＩ． Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラムを２ｍｌ収集試験管内に配置し、試料をピペットでフィルターに取出した。次いで、試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集試験管を廃棄した。
ＩＶ． カラムを新しい収集試験管内へ配置し、バッファーＮＴ３ ５００μｌを添加した。次いで試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集試験管を廃棄した。
Ｖ． 工程ＩＶをさらに２回繰り返した。
ＶＩ． カラムを新しい収集試験管内へ配置し、次いで試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、残留エタノールを除去した。
ＶＩＩ． カラムを清潔な１．５ｍｌ遠心分離管内へ配置し、バッファーＮＥ ５０μｌをフィルター上に直接添加した（注 ピペットがフィルター表面に接触していないことを確認する）。
ＶＩＩＩ． 試料を２分間浸漬させ、次いで１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、精製ＰＣＲフラグメントを溶出した。
ＩＸ． ＯＤ２６０／２８０／３１０を測定する。

アトラススマート（Ａｔｌａｓ ＳＭＡＲＴ）ｃＤＮＡプローブ標識
Ｉ． 各試料の５００ｎｇを標識し、適切なプローブを得ることが必要とされる。注 プローブの最終特異的反応性は１０^７とすべきである。
ＩＩ． サーマルサイクラーを９７℃にあらかじめ加熱した。
ＩＩＩ． 別々の０．５ｍｌの壁の薄い試験管でランダムプライマー混合物１μｌを適切な量の精製ＰＣＲ産物および脱イオン水といっしょに添加した（下記参照）。

ＩＶ． 試料を８分間、９７℃で変性させた。
Ｖ． 試料を変性させている間に、以下のマスター混合物を調整した。

ＶＩ． 変性後、試料をピペットによって十分に混合し、試験管を短時間回転した。
ＶＩＩ． サーマルサイクラーの温度を５０℃に低下させ、試験管を５０℃で３分間インキュベートした。
ＶＩＩＩ． クレノウ酵素１μｌを反応毎にマスター混合物に添加し、ピペットによって十分に混合した。
ＩＸ． インキュベーション後、マスター混合物１６μｌを適切な試験管内に添加し、内容物を混合し、試料を直ちにサーマルサイクラーに戻した。
Ｘ． 試験管を５０℃で３０分間インキュベートし、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２μｌを添加することによって反応を停止した。

^３３Ｐ−ｄＡＴＰ ＰＣＲ産物のアトラススピンカラム精製
Ｉ． ＮＴ２バッファーを最終容積４００μｌ（バッファー３５０μｌ）まで試料に添加し、試料を十分に混合した。
ＩＩ． Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラムを２ｍｌ収集試験管に配置し、試料をピペットでフィルターに取出した。次いで、試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集試験管を廃棄した。
ＩＩＩ． カラムを新しい収集試験管内へ配置し、バッファーＮＴ３ ３５０μｌを添加した。次いで試料を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集試験管を廃棄した。
ＩＶ． 工程３をさらに２回繰り返した。
Ｖ． カラムを清潔な１．５ｍｌ遠心分離管内へ配置し、バッファーＮＥ １００μｌをフィルター上に直接添加した（注 ピペットがフィルター表面に接触しないことを確認する）。
ＶＩ． 試料を２分間浸漬させ、次いで１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、精製ＰＣＲフラグメントを溶出した。
ＶＩＩ． 精製プローブのＣＰＭを測定する。
ＶＩＩＩ． 精製材料２μｌをシンティヤン（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）５ｍｌに添加し、ＣＰＭを^３２Ｐチャネルで記録した。

アトラスアレイハイブリダイゼーション
Ｉ． ハイブリダイゼーションボトルに脱イオン水を８０％充填し、６０℃に加熱した。同時に、プラスチックハイブ（ｐｌａｓｔｉｃｈｙｂ）２５ｍｌｘ２を別々の５０ｍｌファルコン管で６０℃に加熱した。
ＩＩ． アレイをあらかじめ温めた水中に配置し、印刷側（非光沢）を内側に向けた。
ＩＩＩ．プラスチックハイブ（ｘ２）１０ｍｌを新しい容器に配置した。２０ｘＳＳＣ ５０μｌをスマート遮断試薬５０μｌと混合し、９５℃、５分間加熱し、次いで氷上で２分間素早く冷却した。次いで、この溶液をプラスチックハイブと混合した。
ＩＶ． アレイの水を切り、プラスチックハイブを添加し、アレイを３０分間、６０℃であらかじめハイブリダイズした。
Ｖ． ２０ｘＳＳＣ ５０μｌをスマートブロッキング試薬５０μｌと混合し、精製プローブに添加した。プローブを１０分間煮沸し、氷上で２分間冷却した。
ＶＩ． 上記溶液を残りのプラスチックハイブ２ｘ１５ｍｌと混合し、溶液を完全に混合し、プレハイブ（ｐｒｅｈｙｂ）を廃棄し、ハイブリダイゼーション溶液を適切なボトルに添加した。
ＶＩＩ． アレイを一夜、６０℃でハイブリダイズし、アレイがつねに平衡であることを確認した。

アトラスの洗浄および暴露
Ｉ． ハイブリダイゼーション溶液を５０ｍｌファルコン管内に廃棄し、ハイブリダイゼーションボトルをあらかじめ温めた（６０℃）高塩バッファー（２ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳ）で８０％充填し、試料を５８℃で５分間インキュベートし、残留放射線を除去した。
ＩＩ．洗浄バッファーを除去し、工程Ｉを繰り返した。
ＩＩＩ． 次いで、ボトルを低塩バッファー（０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）で８０％充填し、アレイを５８℃で５分間インキュベートした。
ＩＶ． 工程ＩＩＩをさらに１回繰り返した。
Ｖ． ハイブリダイゼーションオーブンの温度を３０℃に低下させ、ボトルを再び室温の低塩バッファーで８０％充填し、さらに５分間インキュベートした。
ＶＩ． 次いで、アレイをハイブリダイゼーションボトルから除去し、低塩洗浄バッファーで充填した５００ｍｌビーカーへ入れた。
ＶＩＩ． アレイをビーカーにおいて数回浸漬することによって洗浄し、次いで最後にきわめてゆっくり除去し、確実に大きな液滴がアレイ表面に付着しないようにした。
ＶＩＩＩ． アレイを完全に空気乾燥させ、蛍光カセット内部にテープで貼り、スクリーンをアレイと直接接触させて配置した。
アレイを１日目および７日目に暴露した。

各種年齢の個体からの幹細胞のアフィメトリクスアフィメトリックスマイクロアレイ分析
アフィメトリクスアフィメトリックスのジーンチップ（Ｇｅｎｅｃｈｉｐ）（登録商標）アレイによる遺伝子発現分析
本発明を裏付けるために得られたデータには、独立したマイクロアレイプラットフォームでの遺伝子発現分析からの結果が含まれる。遺伝子発現分析は、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（登録商標）ジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（登録商標）技術により行われた。詳細な情報については、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）のウェブページ（ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ）を参照。

工程のすべての工程ＲＮＡの単離および精製、ｃＲＮＡの合成および断片化、ハイブリダイゼーション、染色、アレイのスキャニング―は、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって推奨されている装置およびプロトコールにより行われている。データ分析のために使用されたソフトウェアは、マイクロアレイ適応バージョン（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎ）５．０（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（登録商標））である。使用された統計アルゴリズムに関する詳細な情報は、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）のウェブページ（ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ）を参照。

アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）試料処理
遺伝子発現分析をＲＮＡｌａｔｅｒに含まれる細胞試料から開始して行った。これらの試料の内部処理コードは以下の表Ｔａｂｌｅ１に示されている。

トータルＲＮＡをトリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でメーカーの使用説明書に従うことによって単離した。各試料をＲＮａｓｅフリー水２２μｌ中に再懸濁した。アガロース電気泳動によって画分を分析した（図１）。

両方の試料を精製前に混合し、混合物をＳＥ４８８と呼んだ。精製をＲＮｅａｓｙキット（Ｑ ｕｉａｇｅｎ）で行った。ＲＮＡをＲＮａｓｅフリー水３５μｌ中に溶出し、スピード・バック（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）で最終容積を１２μｌに濃縮した。精製ＲＮＡの量と質を分光光度法およびアガロースゲル電気泳動によって点検した（図２）。

ビオチン標識ｃＲＮＡのアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）合成
精製トータルＲＮＡから開始することにより、ｃＤＮＡをスーパースクリプトチョイスシステムキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ）（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）発現分析技術マニュアル（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ）プロトコールプロトコルに従うことによって合成した。

エンゾバイオアレイ高収量（Ｅｎｚｏ ＢｉｏＡｒｒａｙ ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ） ＲＮＡ転写標識（Ｔ７）キットに従うことによって、ｃＲＮＡをｃＤＮＡから合成した。ｃＲＮＡをアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）のジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）試料クリーンアップモデュークルキット（Ｓａｍｐｌｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｏｄｕｋｅ Ｋｉｔ）で精製し、ＲＮａｓｅフリー水２２μｌ中に溶出した（図３および表Ｔａｂｌｅ２）。

精製ｃＲＮＡの濃度および純度。高純度ＲＮＡは、ＯＤ値が１．９より大きいことが必要である。したがって、プール試料からのＲＮＡの純度は、その後の処理に十分であった。

精製ｃＲＮＡをアレイでのハイブリダイゼーション前に断片化した（図４）。

アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）Ｕ１３３Ａアレイのハイブリダイゼーションおよびスキャニング―対照の分析
ハイブリダイゼーション混合物の質を評価するための２つの基礎パラメータがある。すなわち、スパイク対照の存在、およびハウスキーピング遺伝子の３’／５’比である。

スパイク対照は、ハイブリダイゼーション混合物に含まれる対照オリゴヌクレオチドである。スキャニング時のこれらオリゴヌクレオチドの検出は、ハイブリダイゼーション、洗浄、染色、およびスキャニングの工程が適切に行われたことを示す。使用されたスパイク対照は、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＣ、ＢｉｏＤ、およびＣｒｅである。ＢｉｏＢは、混合物中、分子数が最も低いスパイク対照であり、これによりアッセイの感度を評価するために好ましい対照となっている。

ハウスキーピング対照は、すべての組織およびすべての環境下に構成的に発現される遺伝子のプローブである。アレイ上のプローブは、ハウスキーピング遺伝子の３’、中央、および５’領域にハイブリダイズするように考えられている。３’／５’比は合成ｃＲＮＡの完全性の指標であり、これは言い換えると、元のＲＮＡの完全性を反映する。したがって、１の３’／５’比は、開始ＲＮＡおよび合成ｃＲＮＡのトータルの完全性を意味する。この比は、起点の組織およびＲＮＡの処理状態によって変動する。アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）は、３’／５’比が３未満であるｃＲＮＡ ｐｒｅｐｓの使用を推奨している。

ハウスキーピング遺伝子の構成的発現は、文献に示されているように、組織によって、かつ実験条件の結果として変動する。アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）は、真のハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを強く推奨している。

代表的な遺伝子をメチル化分析のために選択した。注目すべきは、現在、全ヒトゲノムのゲノム規模のメチル化状態を直接測定するハイスループット技術は存在しないことであり（この方法はその初期段階にある、アドルジャン（Ａｄｏｒｊａｎ）ら、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０、ｅ２１、ヤン（Ｙａｎ）ＰＳら、２０００年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６、ｐｐ．１４３２−１４３８）、ジタン（Ｇｉｔａｎ）ＲＳら、２００１年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２、ｐｐ．１５８−１６４）、このために、本発明者は初期フィルターをＲＮＡ発現プロファイリングに基づき加齢ゲノムに適用した。

アトラス（Ａｔｌａｓ）およびアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）遺伝子発現プロファイリングからの複合データ分析
アトラス（Ａｔｌａｓ）およびアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）プラットフォームを用いるマイクロアレイ分析によって判定される、加齢細胞におけるアップレギュレーテッドトされた遺伝子およびダウンレギュレーテッドトされた遺伝子の例。これらの発現プロファイルは、若老幹細胞集団における活動のゲノム規模の分析を提供し、加齢過程における重要な遺伝子の考えがもたらされる。次いで、かかる遺伝子は、加齢細胞のより若い表現型への最適な再プログラミングを確認するためにメチル化分析において使用される（かかる分析の詳細および実施方法については図６を参照）。

その活動が加齢過程中に顕著に変化した一部の遺伝子が表Ｔａｂｌｅ４に示されている。

アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）およびアトラス（Ａｔｌａｓ）プラットフォームを用いるマイクロアレイ分析によって判定される加齢細胞におけるアップレギュレーテッドトされた遺伝子およびダウンレギュレーテッドトされた遺伝子の例が、表Ｔａｂｌｅ４に示されている。これらの発現プロファイルは、若老幹細胞集団におけるｍＲＮＡ活動のゲノム規模の分析を提供し、加齢過程中に変化する重要な遺伝子の尺度をもたらす。次いで、かかる遺伝子は、ＤＮＡメチル化分析のために選択され、その後に加齢細胞のより若い表現型への最適な再プログラミングを確認するために使用された。

結果
再プログラミング
一部の成体幹細胞の処理または再プログラミングおよびその後の移植には、厳格な倫理上の指針を満たすこと、および各国の広範囲なドキュメンテーションの十分な完了を必要とすることが当業者によって理解されるであろう。また、技術上の障害は、成体造血幹細胞がエクスビボｅｘ ｖｉｖｏでほとんど細胞分裂をし受けないことである。幹細胞は、骨髄の所在地であり、細胞分裂を受ける同じ個体にインビボｉｎ ｖｉｖｏで移植される必要がある。したがって、成人幹細胞の再プログラミングされたＤＮＡメチル化状態がインビボｉｎ ｖｉｖｏで多くの細胞分裂にわたって安定して遺伝性である原理を証明することは、倫理上および技術上の考慮から生じる現在克服できない多くの障壁を有する。したがって、本発明者は、線維芽細胞のメチル化状態が免疫系Ｔ細胞のものに再プログラミングされる細胞を用いる異なるヒト系における安定した遺伝性メチル化変化の原理を証明した。

加齢過程中に変化した遺伝子の選択
どの遺伝子が加齢過程中に変化したＤＮＡメチル化シグネチャーを有するかを判定するために、本発明者は発現プロファイリング（遺伝子のＲＮＡ発現レベル）における変性変化にもとづく初期分子フィルターを設定した。一般に、メチル化の増大は遺伝子活動の停止をもたらすが、脱メチル化は遺伝子活動の増大をもたらすため、本発明者は、その活動状態が加齢過程中に変化する遺伝子を見出そうとした。当業者のために、本発明者は、２０代前半から６０代後半までの範囲の異なる年齢の個体からの動員末梢血由来の成体ＣＤ３４＋幹細胞を使用した（デ ラ ルビア（ｄｅ ｌａ Ｒｕｂｉａ）ら、２００２年、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４２、ｐｐ．４−９））。本発明者は、若老個体間の変化したＲＮＡ発現プロファイルを測定するために、市販のアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）マイクロアレイ（ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ）、および他の市販のプラットフォーム、アトラス（Ａｔｌａｓ）を利用した。本発明者は、その発現レベルが加齢過程中にダウンレギュレートまたはアップレギュレートされた遺伝子を選択した。かかる選択の後に、適切な調節または遺伝子制御領域のメチル化状態を検査することができる。

第１の細胞型（線維芽細胞）および第２の細胞型（Ｔ細胞）
線維芽細胞に特定のＤＮＡメチル化シグネチャーをゲノム規模で取込み、細胞を一定の時間、健康な個体の細胞系のＴ細胞、または末梢血からのＴ細胞由来の抽出物に暴露する。細胞を新鮮培地に移し、細胞に多くの細胞分裂を受けさせる。その分子装飾が線維芽細胞のものからＴ細胞のものへ変化する再プログラミングされた細胞の表現型状態の変化をモニタリングする（細胞表面分子は表現型状態の１つの取っ掛かりを提供する）。ゲノムＤＮＡを再プログラミングされた細胞から単離し、ゲノムのメチル化シグネチャーを測定し、それを第１の細胞型および第２の細胞型のゲノムのものと比較する。

血液由来幹細胞
同様のプロトコールプロトコルは、適切な倫理上の承認後に幹細胞再プログラミングの場合に適用される。

加齢第１の細胞型またはＤＮＡ損傷薬剤で処理された第１の細胞型から血液由来骨髄息細胞を採取する。これらの幹細胞は、そのゲノムにおいて破損したメチルシトシン（ＭＣ）シグネチャーを有することがわかっている。細胞を一定期間（数分から数時間）、若い健康な第２の細胞型からの幹細胞の試料から得られた細胞を含まない抽出物に暴露し、次いで暴露された細胞を新鮮培地に移し、処理された幹細胞を損傷幹細胞を有する宿主内へ戻す前に一定期間、細胞をインキュベートする。

第１の細胞型は、再プログラミング処理前の細胞型を表す。第２の細胞型は、第１の細胞型が移動される必要がある目的地点を表す。「再プログラミングされた」は、第２の細胞型からの溶解物、抽出物、または複合物で処理され、かつどこかで第１の細胞型から第２の細胞型の特徴の軌道に沿っている細胞を示す。

細胞型。受精後のヒトには少なくとも３００の細胞型があり、典型的に光学顕微鏡下にその形態に基づき定義されている。したがって、好塩基球、好中球、好酸球、巨核球、および血小板などの造血系統のメンバーは、互いに、かつ内皮細胞、皮膚細胞、および神経細胞やグリア細胞など神経系の細胞と容易に区別可能である。細胞型の分子分類は、細胞表面タンパク質および／または細胞の内部タンパク質を認識する抗体が、細胞型間のより細かい区別を可能にすることを示した。マイクロアレイ型技術（細胞内のｍＲＮＡ分子の存在度および型を測定する）を用いる遺伝子発現プロファイリングは、細胞型間の区別をするためにも使用されうる。

１つの細胞型から別の細胞型への再プログラミング。細胞型は適切な方法を用いることにより相互転換可能である（第１の細胞型は第２の細胞型へ再プログラミングされうる）。従来技術におけるこれら再プログラミングのすべての点で不明なのは、利用可能な細胞マーカーが、再プログラミングされた細胞が第１の細胞型から第２の細胞型へ完全に移動したかどうか示すのに十分に強く、かつ十分に多いかどうか、それが単に部分的に再プログラミングされているかどうか、再プログラミングが安定しているかどうか、または再プログラミングのために使用された方法が、その新しい環境において正常に機能する再プログラミングされた細胞の能力を阻害する望ましくない変化を行ったかどうかである。再プログラミングされた細胞に関して正確な知識は、幹細胞が多くのその後の細胞型の前駆細胞であるため、幹細胞の再プログラミングの場合に特に重要である。また、ｍＲＮＡまたはタンパク質など、細胞型を描写するために従来技術において使用されているマーカーは、一時的にのみ発現されうる。対照的に、本発明者は、メチル化シグネチャーが、確実に考慮されている時間枠における変化の安定した指標であることを見出した。

異なる細胞型のゲノムのメチル化特徴。本発明では、本発明者が「細胞軌道」と称したものが扱われる。これらの軌道は、１つの細胞型から別の細胞型（第１の細胞型から第２の細胞型）へ誘導し、軌道に沿って再プログラミングされた細胞集団がどこまで位置しているかを測定する。本発明者は、再プログラミングされる細胞のゲノム領域からメチル化シグネチャーを使用し、軌道上の再プログラミングされた細胞の位置を判定する。例えば、ヒトゲノムにおける１０００のヌクレオチドの一連のＤＮＡは多くのシトシンを有することになるが、その各々はメチル化（Ｍ）または非メチル化（ｕ）状態のいずれかで存在しうる。第１の細胞型におけるこの一連のシトシンは、ＭＭＭＭＭでありうるが、第２の細胞型においては、ｕＭｕＭｕでありうる。これらの特徴的シグネチャーは各細胞型に固有であり、かつ安定しているため、第１の細胞型から第２の細胞型へ再プログラミングされている細胞が、所望の第２の細胞型に関する限り実際に再プログラミングされたかどうか、または軌道に沿って部分的のみであるかどうかを判定することができる。したがって、再プログラミングされた細胞がｕＭｕＭｕのメチル化シグネチャーを有する場合は、それは第２の細胞型の目的地点に達している。しかし、処理された細胞がｕＭＭＭｕである場合は、それは軌道に沿って部分的にのみである。しかし、それがｕｕｕＭｕである場合は、問題があるがり、それは第２の位置が第１の細胞型または第２の細胞型のいずれかには存在しない新たな状態に達したためである。

シグネチャーのレベル。軌道に沿って再プログラミングされた細胞が特定の時間に位置付けられることを示すために選択されるゲノムメチル化シグネチャーは、多くのレベルで記載されうる。例えば、ゲノムのコーディング領域または非コーディング領域にある隣接した一連のＤＮＡが使用されうる。あるいは、異なるゲノムの部分からの一連のＤＮＡ、すなわち、２３対の染色体の各々からの一続き、または単一の染色体からの複数の一続きが使用されうる。本発明者は、７つの遺伝子（ＡＢＣＢ１、ＩＲＦ７、ＥＳＲ１Ｂ、ＧＺＭＡ、ＣＤＸ１、ＭＡＧＥＡ２、およびＴＨＹ１と称される）の近くにある一連のＤＮＡ、およびグアニンに隣接しているシトシンのみを用いることによって、すなわちＣＧダブレットを使用することによって本発明のデータを示す。

ＤＮＡメチル化シグネチャーは、細胞軌道に沿った距離の他の指標よりはるかに優れている。従来技術は分子細胞型の特徴づけにおいて不明確であるが、それは抗体が細胞表面タンパク質に対して使用される場合は、例えば、Ｔ細胞受容体複合体が細胞の表面上に存在するが、免疫系の機能的Ｔ細胞としてその細胞を分類するために他のタンパク質クラスの存在が不十分であることが確認されうるためである。同様に、ｍＲＮＡ発現プロファイリングにより、遺伝子は各種のレベルで異なる細胞型において発現され、発現のレベルが、特定の型の細胞がきわめて困難であることを描写するのに十分に高いかどうかを判定することができる。また、最も重要なのは、ｍＲＮＡおよびタンパク質のプロファイリングが一時的でありうることであるが、それは各々が分解酵素、細胞内のマルチ−サブユニットにおける分画、および各ｍＲＮＡ転写にかけられ、かつタンパク質が異なる遺伝子背景において異なる半減期を有するためである。対照的に、本発明者は、メチル化シグネチャーが細胞分裂にわたって安定して遺伝性であることを見出した。

ＤＮＡメチル化シグネチャーの測定は、細胞型の識別決定の問題を克服し、再プログラミングから生じる不適切な変化を示すことにおいて有力である。まず、ＤＮＡメチル化自体は、特定の細胞型内で何が活性または不活性であるかの指標である。したがって、第１の細胞型から第２の細胞型への移動においては、特別に選択されたゲノム領域（遺伝子のプロモーターまたは調節領域）のメチル化シグネチャーは、遺伝子が処理または再プログラミングされた細胞において不適切にサイレンス状態であるかどうかを示すことになる。サイレンス状態である場合は、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物はその遺伝子座で製造されることになる。ｍＲＮＡまたはタンパク質産物が細胞に存在するかどうかを従来の方法によって測定することは、特にｍＲＮＡまたはタンパク質の存在度が低い場合に、きわめて困難である。ＤＮＡメチル化シグネチャーについては、それらは実質的に二元的、すなわち特定のシトシンがメチル化されているか、またはされていないかのいずれかであるため、かかる問題は存在しない。また、メチル化シグネチャーが新規であり、第１の細胞型または第２の細胞型のいずれにも属さない場合は、処理または再プログラミングされた細胞型は、例えば、臨床的使用に不適切であると考えられる。

実験
ＤＮＡ配列は、ヒトゲノムの７つの領域から選択された。それらの領域のメチル化状態は、ＤＮＡのbisulphite変更後のＤＮＡ塩基配列決定法によって測定された。第１の細胞型は、再プログラミング処理前の細胞型を表す。第２の細胞型は、第１の細胞型が移動される必要がある目的地点を表す。「再プログラミングされた」は、第２の細胞型からの抽出物で処理された細胞、およびそのＤＮＡ配列のメチル化状態を示し、シグネチャーは再プログラミング処理の結果としてＤＮＡレベルで生じた変化を示す。

図６は、再プログラミングされた細胞からのＤＮＡメチル化シグネチャーを分析することによって、再プログラミングされた細胞が所望の第２の細胞型へ移動されている程度の決定がなされうることを示す。再プログラミングされた細胞のメチル化シグネチャーを、処理されていない第１の細胞型および所望のエンドポイントの第２の細胞型のメチル化シグネチャーのものと比較することによって、再プログラミングされた細胞がどの程度まで第１の細胞型から所望の第２の細胞型への軌道を押し下げたか判定されうる。ＤＮＡメチル化プロファイルが細胞分裂中に安定して再現されるように、再プログラミングされた細胞はその新しい再プログラミングされたシグネチャーを継承し、その後に忠実に再現することになる。再プログラミングされた細胞のメチル化シグネチャーが第２の細胞型の所望のエンドポイントと異なる場合は、再プログラミングは不完全であり、再プログラミングされた細胞は所望のエンドポイントの細胞型と同じように作用しえない。したがって、再プログラミングされた細胞は移植目的または他の所望の用途に最適とはならない。再プログラミングされた細胞がエンドポイントの第２の細胞型のメチル化プロファイルをとる場合に限り、再プログラミングされた細胞は移植または他の目的に利用されうる。

この図は、処理または再プログラミングされた細胞からのメチル化シグネチャーを分析することによって、処理または再プログラミングされた細胞が所望の細胞型へ移動されている程度の決定がなされうることを示す。処理または再プログラミングされた細胞のメチル化シグネチャーを処理されていない第１の細胞型および所望のエンドポイントの第２の細胞型のメチル化シグネチャーのものと比較することによって、処理または再プログラミングされた細胞がどの程度まで第１の細胞型から所望の第２の細胞型への軌道を押し下げたか判定されうる。メチル化プロファイルが細胞分裂中に安定して再現されるように、処理または再プログラミングされた細胞はその新しい再プログラミングされたメチル化シグネチャーを継承し、その後に忠実に再現することになる。処理、再プログラミングされた細胞のメチル化シグネチャーが第２の細胞型の所望のエンドポイントと異なる場合は、処理または再プログラミングは不完全であり、処理または再プログラミングされた細胞は所望のエンドポイントの第２の細胞型と同じように作用しえない。したがって、処理または再プログラミングされた細胞はたとえば移植目的に最適とはならない。処理または再プログラミングされた細胞が第２の細胞型または他の所望の細胞型のメチル化シグネチャーまたはプロファイルをとる場合に限り、再プログラミングされた細胞は移植目的に利用されうる。

上記の結果から、第１の細胞型の処理または再プログラミング後に、試験された遺伝子の４つ（ＡＢＣＢ１、ＩＲＦ７、ＥＳＲ１ＢおよびＭＡＧＥＡ２）がメチル化レベルで忠実に再プログラミングされ、かつ１つの遺伝子、ＣＤＸ１が部分的な遺伝子外の再プログラミングを示したことが明らかに確認されうる。しかし、２つの遺伝子、ＴＨＹ１およびＧＺＭＡはうまく再プログラミングされなかった。ＧＺＭＡはＴ細胞およびナチュラルキラー細胞−特異的セリンプロテアーゼであり、したがって、不正確な再プログラミングは、これらの細胞が移植目的には最適ではないことを示す。

再プログラミングされた細胞におけるＧＺＭＡのメチル化シグネチャーは、遺伝子サイレンシングを示す。これは、遺伝子産物がもはや存在しないため、従来の遺伝子発現プロファイリングまたはプロテオーム試験を用いて検出することはきわめて困難となる。しかし、メチル化の結果は、再プログラミングされた細胞における潜在的な問題の明白な指標である。

このアプローチは、再プログラミングされた細胞型間を正確に区別するメチル化分析の潜在的可能性を示し、かつ移植法のための最適な細胞を選択する有力な手段を可能にする。この方法は、移植とは無関係に細胞の再プログラミングプロトコールプロトコルを最適化するためにも望ましい。

図６における結果から、第１の細胞型の再プログラミング後に、試験された領域の４つ（ＡＢＣＢ１、ＩＲＦ７、ＥＳＲ１ＢおよびＭＡＧＥＡ２）がメチル化レベルで忠実に再プログラミングされたが、１つの領域、ＣＤＸ１は部分的な再プログラミングを示したことが明らかに確認されうる。しかし、２つの遺伝子、ＴＨＹ１およびＧＺＭＡはうまく再プログラミングされなかった。ＧＺＭＡはＴ細胞およびナチュラルキラー細胞−特異的セリンプロテアーゼであり、したがって、不正確な再プログラミングは、これらの細胞が移植目的には最適ではないことを示す。

本発明者のアプローチは、再プログラミングされた細胞型間を正確に区別するＤＮＡメチル化分析の潜在的可能性を示し、かつ移植法のための最適な細胞を選択する有力な手段を提供する。この方法は、移植とは無関係に細胞の再プログラミングプロトコールプロトコルを最適化するためにも望ましい。

細胞型内のメチル化シグネチャーの変化。本発明のメチル化シグネチャープロトコールプロトコルの能力は、それが同じ細胞型である分析細胞集団に達し、かつ転写およびプロテオーム分析がきわめて困難である場合に実現されうる。好ましいケースは、老造血幹細胞をより若い幹細胞への、免疫系の老いたＴ細胞を免疫系のより若い細胞への再プログラミングである。これらのケースでは、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでの変化はわずかであると予想され、従来の方法が拡大解釈される。ヒトゲノムから選ばれた遺伝子座を用いるメチル化シグネチャーは、老から若への再プログラミングが有効であったかどうか、かつ最も重要なことは、不適切な変化が回避されたかどうかを検出することができる。

大まかに述べられた本発明の精神または範囲を逸脱することなく、特定の実施形態において示された本発明に多くの変型および／または改造がなされうることを当業者によって理解されるであろう。したがって、本実施形態は、すべての点で、例示的であって限定的ではないとみなされるべきである。

図面の簡単な説明
アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）マイクロアレイプラットフォームでの分析前にＲＮＡが高い品質であったことを測定するために成人末梢血幹細胞から単離されたトータルＲＮＡのアガロースゲル電気泳動分離を示す図である。レーンＭは、分子量マーカーを示す。レーンＳＥ４８８およびレーンＳＥ４８９は、２個体からのＲＮＡを示す。２つの目立ったバンドは、１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡを表す。 別の処理前のＲＮＡの品質を測定するＲＮｅａｓｙ精製試料のアガロースゲル電気泳動分離を示す図である。レーンＭは、分子量マーカーを示す。レーンＳＥ４８８は、両個体のプールからのＲＮＡを示す。２つの目立ったバンドは、１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡを表す。結果は高品質ＲＮＡと一致する。 精製ｃＲＮＡのアガロースゲル電気泳動分離を示す図である。レーンＭは、分子量マーカーを示す。レーンＳＥ４８８は、両個体（ＳＥ−４８８）からのプールのｃＲＮＡを示す。 アガロースゲル電気泳動によるｃＲＮＡ断片化の検証を示す図である。レーンＭは、分子量マーカーを示す。レーンＳＥ４８８は、両個体からのプールの断片化ｃＲＮＡを示す アトラス（Ａｔｌａｓ）８Ｋマイクロアレイを用いた若幹細胞対老幹細胞の発現プロファイルのマイクロアレイ分析を示す図である。アレイ上の各プローブは、ヒト遺伝子からの転写にハイブリダイゼーションするためであり、各プローブは２回スポットされたため、二重スポットである。細胞集団からの放射活性物質で標識したＲＮＡをアレイにハイブリダイゼーションしたが、二重スポットの信号強度は、この特定の細胞型における特定の遺伝子の発現レベルを示す。 ＡＢＣＢ１、ＩＲＦ７、ＥＳＲ１Ｂ、ＧＺＭＡ、ＣＤＸ１、ＭＡＧＥＡ２、およびＴＨＹ１と呼ばれる７つの選択遺伝子座をかくまうヒトゲノムの領域からのＤＮＡ配列、および再プログラミング前と再プログラミング後の細胞からのＤＮＡ抽出物のbisulphite修飾後のＤＮＡ塩基配列決定法によって測定されたそのメチル化状態を示す図である。第１の細胞型（処理または再プログラミングされる細胞）は、処理前の細胞型を表す。第２の細胞型は、第１の細胞型が移動されるべき所望のエンドポイントを表す。「再プログラミング（Ｒｅｐｒｏｇ）」は、第２の細胞型からの抽出物で処理されている細胞からのゲノムＤＮＡ配列のメチル化状態を示す。ＤＮＡレベルでの変化は、処理の結果である。

Claims (21)

1. 細胞の特徴または状態を変化させるための方法であって、
   細胞における特徴または状態を変化させることが可能な薬剤で第１の細胞型を処理する工程と、
   処理された細胞のゲノムにおけるメチル化シグネチャーを測定することによって処理された細胞における変化の程度を判定する工程であって、所定のメチル化シグネチャーが処理された細胞の変化した特徴または状態を示す工程と、を含む方法。
2. 前記第１の細胞型が、
   年齢関連の疾患、癌などの疾患、自己免疫疾患、心筋梗塞または虚血などの心血管障害を罹患する個体由来の細胞、
   免疫および造血器系の幹細胞、Ｔ細胞、または単球、
   正常細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 第１の細胞型が幹細胞である、請求項２に記載の方法。
4. 前記薬剤が、化学物質、薬物、核酸、アプタマー、抗体、抗原、Intercalting Nucleic Acid （ＩＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Locked Nucleic Acid （ＬＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、所望の特徴または状態を有する第２の細胞型からの抽出物、溶解物、または細胞成分、それらの組合せ、およびそのキメラ変形より成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記薬剤が、所望の特徴または状態を有する第２の細胞型からの抽出物、溶解物、または細胞成分である、請求項４に記載の方法。
6. 前記第２の細胞型が、任意の細胞型または細胞型の組合せである、請求項５に記載の方法。
7. 前記第１および第２の細胞型が、ヒト造血器系の細胞、他の幹細胞、および上皮細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記第２の細胞型が、正常または健康な個体由来の、前記第１の細胞型と同様の細胞型である、請求項７に記載の方法。
9. 前記第２の細胞型が幹細胞である、請求項８に記載の方法。
10. 前記第１の細胞型の細胞および前記第２の細胞型の細胞が、同じ種からの同じ細胞型である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第１の細胞型および前記第２の細胞型が同じ細胞型ではない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１の細胞型および前記第２の細胞型が同じ種のものではない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第２の細胞型が両生動物の細胞であり、前記第１の細胞型がヒトまたは他の哺乳動物の細胞である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第１の細胞型が、該細胞に高分子に対する透過性を与えるために前処理される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記細胞が、エレクトロポレーション、低温熱ショック、またはストレプトリジンＯなどの各種酵素によって前処理される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記前処理が、前記細胞に一時的に透過性を与える、請求項１５に記載の方法。
17. 前記処理された細胞を培養または成長させ、前記処理された細胞の複数のコピーを得る工程をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記処理された細胞が、細胞の成長および分裂に適した条件下で、適切な培地または宿主で培養される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記宿主が、ウシ、ヒツジ、ウマ、家禽、およびブタからなる群から選択される家畜である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記メチル化シグネチャーが、特定の細胞型に対応する特徴的なメチル化シグネチャーを有するゲノムの領域内のシトシンの群である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記メチル化シグネチャーが、bisulphite修飾およびその後のＤＮＡ配列解析によって決定される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。