CN111876507A - 一种快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，包括上游外部引物f3，其序列如SEQ ID NO:1所示，下游外部引物b3，其序列如SEQ ID NO:2所示，上游内部引物fip，其序列如SEQ ID NO:3所示，下游内部引物bip，其序列如SEQ ID NO:4所示，上游环化引物lf，其序列如SEQ ID NO:5所示。本发明试剂盒中引物组是根据鲍曼不动杆菌的特异性基因16S rRNA、23S rRNA及其间隔序列（GenBank ID：KY659326.1）设计的，经验证具有良好的特异性。本发明试剂盒操作简便，反应速度快，灵敏度高（400拷贝数/ml），条件可控，适合在各级医疗机构推广。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种试剂盒，具体来说是一种快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒及使用方法。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是不动杆菌属中最常见的一种革兰氏阴性杆菌，能够感染包括呼吸系统、泌尿系统、伤口、腹腔及神经系统在内的多处部位，同时它具有较强的获得性耐药能力，给广谱抗生素的应用带来了难题，也是近三十年来所有国家医院内感染的主要原因之一。获得性肺炎是该病原体引起的主要感染，同时涉及中枢神经系统、皮肤和软组织的感染也已经出现，对医疗机构造成了严重威胁。
目前，鲍曼不动杆菌的鉴定方法有分离培养、以API 20NE系统为主的生化鉴定、扩增核糖体DNA限制酶切分析等，这些方法具有耗时长、价格昂贵等缺点，因此，开发新型快速检测鲍曼不动杆菌的方法具有重要的医学价值。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年开发的一种新型等温核酸扩增技术，具有简单、快速等特点，在灵敏度、特异性、检测范围等多个方面优于传统的PCR核酸扩增技术。同时，临床检测应用中，环介导等温扩增技术不需要昂贵的温度循环加热设备，普通的水浴锅或金属浴均能满足实验条件的需要，可根据具体的实验要求选择合适的结果判定方法。该技术凭借其优势，已成功地被应用于包括疟疾、锥虫病、泰勒尔梨浆虫病和巴贝虫病等在内的疾病病原体的检测。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒及使用方法，所述的这种快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒及使用方法要解决现有技术中分离鉴定鲍曼不动杆菌的方法耗时长、价格昂贵的技术问题。
本发明提供了一种用于快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，包括如下引物：
上游外部引物F3：GGATCACCTCCTTAACGAA(SEQ ID NO:1)；
下游外部引物B3：CAGCTTACATCATCAATCATGT(SEQ ID NO:2)；
上游内部引物FIP：
GCTACAGACCCTCAGATACATCTAGATTGACGATTGGTAAGAATCC(SEQ ID NO:3)；
下游内部引物BIP：CAGTTGGTTAGAGCACACGCTCAACCAGTCAAAGTCATGG(SEQ ID NO:4)；
上游环化引物LF：TGATAGCGTGGGGTCACA(SEQ ID NO:5)；
进一步的，还包括LAMP缓冲液、Bst DNA聚合酶、标准阳性模板及阴性对照质控标准品。
进一步的，所述的上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环化引物的终浓度分别为：0.3μmol/L、0.3μmol/L、2.4μmol/L、2.4μmol/L、1.2μmol/L。
进一步的，所述LAMP缓冲液由pH 8.8的Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、TritonX-100、甜菜碱、dNTPs和DMSO组成，在所述的缓冲液中，所述的Tris-HCl的浓度为20mM，所述的KCl浓度为50mM，所述的(NH4)2SO4的浓度为10mM，所述的MgSO4的浓度为2mM，所述的Triton X-100的质量百分比浓度为0.1％，所述的甜菜碱的浓度为0.8M，所述的dNTPs的浓度为1.0mM，所述的DMSO的质量百分比浓度为10％。
具体的，所述LAMP缓冲液的特征在于加入了DMSO，DMSO的加入可有效提高PCR反应的特异性。经过实验验证DMSO的有效浓度为1％-15％，10％为最佳。过高的DMSO浓度会对PCR反应起到抑制作用。
优选地，所述标准阳性模板是含有鲍曼不动杆菌高度保守的16S rRNA、23S rRNA及其间隔序列(GenBank ID：KY659326.1)767个核苷酸片段构成的载体。
具体是含有鲍曼不动杆菌的高度保守基因序列(GenBank:ID：KY659326.1)中767个碱基对的核苷酸片段(序列如SEQ ID NO.6所示)构成的PUC18-659326.1载体，该载体可以在大肠杆菌TOP10中增殖。
进一步的，其中阴性对照质控标准品为无核苷酸酶的去离子水。
本发明还提供了上述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本DNA。样本是鼻咽拭子、痰液、关节液、感染分泌物脑脊液、脑脊液等。
(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μL的体系，该体系包括8U/μLBst聚合酶、LAMP缓冲液、引物组(各引物浓度如上所述)、样本DNA 5μL，加ddH2O补足至25μL。同时以试剂盒内标准阳性模板为阳性对照，以试剂盒内阴性对照质控标准品为阴性对照，设置对照组。
(3)设置LAMP反应条件：64℃恒温反应45min。
(4)结果分析，采用荧光定量PCR仪或者等温扩增仪，通过数值计算荧光强度，且实时以曲线方式显示，如果出现典型荧光信号曲线，说明该样品呈现阳性，若无明显变化，则为阴性。有关曲线特征如图1所示，在反应35min内出现起峰并形成典型S型反应曲线，即判断为阳性结果；在反应45min内不起峰为阴性；在35～45min起峰，建议复测。
本发明的优势在于：
(1)特异性强：试剂盒提供的引物组是根据鲍曼不动杆菌的高度特异性序列设计的(16S rRNA、23SrRNAji ITS序列均在序列6中显示出来了，因为这部分是该细菌特异性的序列)，保证了检测结果的高度特异性。经验证具有良好的特异性。
(2)反应速度快：仅需要45分钟便可以读出结果，避免了临床鉴定中长时间的消耗。
(3)反应灵敏度高：本发明的检测限可达到10拷贝数/反应(400拷贝数/ml)。因此，本发明具有很好的推广应用前景。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明试剂盒操作简便，反应速度快，灵敏度高(400拷贝数/ml)，条件可控，临床适用度广，适用于各类国产和进口的荧光定量PCR仪，也适用于各类国产等温扩增仪，适合在各级医疗机构推广。
附图说明
图1为本发明快速检测鲍曼不动杆菌阴、阳性质控品示意图。
图2为本发明快速检测鲍曼不动杆菌灵敏度荧光强度示意图。
图3为本发明鲍曼不动杆菌LAMP检测试剂盒检测特异性分析实时曲线示意图。
图4为本发明快速检测鲍曼不动杆菌临床样本示意图。
具体实施方式
以下是结合具体实例对本发明的进一步说明，但不应作为对本发明的限制。
实施例1引物设计
LAMP反应体系中引物设计的基本原则包括外部引物组的Tm值应该在55-63℃，碱基长度在15-25个；内部引物组5’端20个碱基左右的Tm值要高于其他引物组Tm值，控制在60-68℃，内部引物组3’端20个碱基左右的Tm值在55-63℃；所有引物的GC含量控制在30％-65％，需要保证引物的5’端和3’端稳定性，需要避免引物自身和引物之间形成二聚体。引物锚定在靶序列上的位置有着严格的要求，外部引物组之间的碱基长度控制在160-220，相对应的内部引物和外部引物之间的碱基控制在20个以内，内部引物组之间的碱基长度控制在120-180。
本发明根据上述LAMP反应引物设计原则，针对鲍曼不动杆菌基因特异性保守序列中一个片段(见其序列如SEQID NO.6所示)设计了5条特异引物，所述引物组由序列如SEQIDNO.1所示的上游外部引物F3、序列如SEQID NO.2所示的下游外部引物B3、序列如SEQIDNO.3所示的上游内部引物FIP和序列如SEQID NO.4所示的下游内部引物BIP组成。此外，还设计了一条环引物，加速茎环结构形成，加快反应。
本发明利用链置换Bst DNA聚合酶以及特殊发卡引物实现加速扩增反应。其中聚合酶需要有5’-3’聚合活性，不能有5’–3’外切酶活性，可以在60℃左右反应。
实施例2环介导等温扩增检测鲍曼不动杆菌试剂盒的灵敏度分析
(1)鲍曼不动杆菌基因组DNA的提取及检测
利用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)提取鲍曼不动杆菌(标准菌株ATCC 19606，源自自美国菌种保藏中心ATCC)的基因组DNA。并用ScanDrop100核酸分析仪检测鲍曼不动杆菌基因组DNA的浓度，通过分子量计算DNA模板的拷贝数，然后用双蒸水将DNA模板稀释成101～1010拷贝数/2μL。，并分别取2μL作为模板进行LAMP扩增。
(2)在PCR管中制备25μL的体系，该体系包括8U/μL Bst聚合酶，LAMP缓冲液、引物组(各引物浓度如权利要求3所述)、稀释后的模板DNA2μL，5×SYBR GreenⅠ5μL，加ddH2O补足至25μL。
(3)将装有反应体系的PCR管放入到ABI 7500型定量PCR仪中，设置反应条件为64℃45min。
(4)反应结束后，根据荧光强度变化即可以判断实验结果。结果如图2所示，模板拷贝数为1、10、102、103、104、105/25μL反应体系的反应组荧光强度曲线图，显示出本发明试剂盒检测灵敏度达到10拷贝/25μL反应体系。
实施例3环介导等温扩增检测鲍曼不动杆菌试剂盒的特异性检测
鲍曼不动杆菌(Aba)、流感嗜血杆菌(Hin)、肺炎克雷伯菌(Kpn)、铜绿假单胞菌(Pae)、金黄色葡萄球菌(Sau)、大肠埃希菌(Eco)、肺炎链球菌(Spn)、卡他莫拉菌(Mac)均为常见呼吸道感染细菌。在临床上，快速鉴别诊断细菌性肺炎的致病菌种具有重要意义。上述细菌标准菌株均源自美国菌种保藏中心ATCC。上述标准菌株按常规增菌后备用。
(1)样本DNA的提取，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)提取试剂盒说明书分别提取DNA。
(2)建立LAMP反应体系：将上述提取的8种细菌DNA、阴阳性对照分别作为模板，按照如下要求加入到反应体系中，反应体系为：8U/ul Bst聚合酶，LAMP缓冲液、引物组(各引物浓度如权利要求3所述)、5×SYBR GREENⅠ5μL，样本DNA2μL，ddH2O补足至25μL。
(3)LAMP反应条件为：64℃恒温反应45min。
(4)反应结果的鉴定：检测结果如图3所示，只有以鲍曼不动杆菌DNA为模板的体系出现典型阳性曲线，其它细菌及阴性对照的荧光强度都无明显变化。
实施例4环介导等温扩增检测鲍曼不动杆菌试剂盒检测临床样本
(1)样本来源
选经上海市东方医院检验科临床微生物室采用常规培养、鉴定出的鲍曼不动杆菌阳性和阴性的痰液样本各2例，标本置于PBS缓冲液中保存。阳性质控标准品为前面所述携带鲍曼不动杆菌DNA片段的PUC18-659326.1质粒，阴性质控品为PBS缓冲液。
(2)采用QIAamp DNA Mini Kit提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取上述样本DNA。
(3)LAMP检测：将上述提取的样本DNA、阴阳性对照分别作为模板，按照如下要求加入到反应体系中，反应体系为：8U/ul Bst聚合酶，LAMP缓冲液、引物组(各引物浓度如权利要求3所述)、5×SYBR GREENⅠ5μL，样本DNA2μL，ddH2O补足至25μL。
(4)LAMP反应条件为：64℃恒温反应45min。
(5)反应结果的鉴定：检测结果如图4所示，2例经临床传统方法确诊的阳性样本和阳性质控品出现阳性结果，其它样本及阴性对照的荧光强度都无明显变化。
序列表
<110> 上海市东方医院（同济大学附属东方医院）
<120> 一种快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒及使用方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatcacctc cttaacgaa 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcttacat catcaatcat gt 22
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctacagacc ctcagataca tctagattga cgattggtaa gaatcc 46
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagttggtta gagcacacgc tcaaccagtc aaagtcatgg 40
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgatagcgtg gggtcaca 18
<210> 6
<211> 767
<212> DNA
<213> 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)
<400> 6
ccaggtagcc gtaggggaac ctgcggctgg atcacctcct taacgaaaga ttgacgattg 60
gtaagaatcc acaacaagtt gttcttcata gatgtatctg agggtctgta gctcagttgg 120
ttagagcaca cgcttgataa gcgtggggtc acaagttcaa gtcttgtcag acccaccatg 180
actttgactg gttgaagtta tagataaaag atacatgatt gatgatgtaa gctggggact 240
tagcttagtt ggtagagcgc ctgctttgca cgcaggaggt caggagttcg actctcctag 300
tctccaccag aacttaagat aagttcggat tacagaaatt agtaaataaa gattgagatc 360
ttggtttatt aacttctgtg atttcattat cacggtaatt agtgtgatct gacgaagaca 420
cattaactca ttaacagatt ggcaaaattg agtctgaaat aaattgttca ctcaataaca 480
aagagaaagg aagtaattct gatcttagag ttaattgaga actagcaaat taactgaatc 540
aagcgttttg gtatgtgaat ttagattgaa gctgtacggt gcttaagtgc acagtgctct 600
aaactgaaat gttgaagttg ctaacttgta ggtaacatcg actgtttggg gttgtatagt 660
caagtaatta agtgcatgtg gtggatgcct tggcagtcag aggcgatgaa agacgtgata 720
gcctgcgaaa agctccgggg aggcggcaaa tatcctttga tccggag 767
Claims (7)
1.一种用于快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于包括如下引物：
上游外部引物f3，其序列如SEQ ID NO:1所示，
下游外部引物b3，其序列如SEQ ID NO:2所示，
上游内部引物fip，其序列如SEQ ID NO:3所示，
下游内部引物bip，其序列如SEQ ID NO:4所示，
上游环化引物lf，其序列如SEQ ID NO:5所示。
2.如权利要求1所述的一种用于快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：还包括LAMP缓冲液、Bst DNA聚合酶、标准阳性模板及阴性对照质控标准品。
3.如权利要求1所述的一种用于快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：所述的上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物、下游内部引物、上游环化引物的终浓度分别为：0.3 μmol/L、0.3 μmol/L、2.4 μmol/L、2.4 μmol/L、1.2 μmol/L。
4.如权利要求2所述的一种用于快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：所述LAMP缓冲液由pH 8.8的Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Triton X-100、甜菜碱、dNTPs和DMSO组成，在所述的缓冲液中，所述的Tris-HCl的浓度为20 mM，所述的KCl的浓度为50 mM，所述的(NH4)2SO4的浓度为10mM，所述的MgSO4的浓度为2 mM，所述的Triton X-100的质量百分比浓度为0.1％，所述的甜菜碱的浓度为0.8 M，所述的dNTPs的浓度为1.0 mM，所述的DMSO的质量百分比浓度为10%。
5.如权利要求2所述的一种用于快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：其中标准阳性模板为含有鲍曼不动杆菌高度保守的16S rRNA、23S rRNA及其间隔序列（GenBankID：KY659326.1）767个核苷酸片段构成的载体。
6.如权利要求2所述的一种用于快速检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：其中阴性对照质控标准品为无核苷酸酶的去离子水。
7.权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）提取待测样本DNA；
（2）建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25 μL的体系，该体系包括8 U/μL Bst聚合酶、LAMP缓冲液、引物组、样本DNA 5 μL，加ddH2O补足至25 μL；同时以试剂盒内标准阳性模板为阳性对照，以试剂盒内阴性对照质控标准品为阴性对照，设置对照组；
（3）设置LAMP反应条件：64℃ 恒温反应45 min；
（4）结果分析，采用荧光定量PCR仪或者等温扩增仪，通过数值计算荧光强度，且实时以曲线方式显示，如果出现典型荧光信号曲线，说明该样品呈现阳性，若无明显变化，则为阴性。
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