CN108531649A

CN108531649A - 一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片及其应用

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Publication number: CN108531649A
Application number: CN201810322524.0A
Authority: CN
Inventors: 黄小波; 文心田; 曹三杰; 刘志鹏; 文翼平; 赵勤; 伍锐
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-04-11
Filing date: 2018-04-11
Publication date: 2018-09-14
Anticipated expiration: 2038-04-11
Also published as: CN108531649B

Abstract

本发明提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片，包含固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，分别用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪δ冠状病毒。本发明还提供了一种上述芯片的制备方法。本发明还提供了同步检测4种猪腹泻性病毒的试剂盒及检测方法。本发明将酶促反应和基因芯片技术相结合，能够快速检测和鉴别诊断四种猪腹泻病毒病，特异性好，准确度高，且检测结果肉眼可见，为猪病毒性腹泻的防控提供一种新的诊断技术；而且本发明芯片的制备方法简单、成本低，可应用于临床疫病的大量检测，为保障我国养猪业的健康发展提供技术支撑。

Description

一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片及其应用。

背景技术

近年来，猪传染性腹泻疾病的发生与流行日益严重，给广大养殖户造成了难以估量的经济损失。目前在我国猪传染性腹泻疾病的病毒原主要是猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus,TGEV)、猪A群轮状病毒(Group A rotavirus，GAR)。这三类病毒所引起的疫病发生后外观特征基本相似，均表现为呕吐、水样喷射腹泻和脱水等，特别是哺乳仔猪发病严重且死亡率高。猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)于2012年首次在香港被报道出有猪场发现该病毒，随后于2014年在美国俄亥俄州和伊利诺伊州报道出有猪场发现该种病毒，此后至少有19个州都有该种病毒的报道。PDCoV主要感染整段小肠，尤其是空肠和回肠，引起严重的肠炎病伴随有小猪的腹泻和呕吐。由于腹泻病毒常常出现混合感染的情况，且临床鉴别诊断较困难，开展四种猪腹泻病毒的同步鉴别诊断对防控具有重要意义。

目前，针对病毒性疾病的诊断方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法(免疫电镜法、免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(ELISA))以及分子生物学检测技术(原位杂交(ISH)、聚合酶链式反应(RT-PCR))等，这些方法虽然得到了一定的应用，但在诊断混合感染中仍然存在不足。例如病毒分离不易成功，血清学检测灵敏性低，检测过程中容易出现交叉反应，分子生物学检测的样本数量有限导致无法实现样品高通量的快速检测。而相比于传统检测方法，基因芯片技术作为一种新型的高通量检测技术，具有操作简单、准确性高、灵敏度强等常规方法无法比拟的优点，适合对多种病原的快速检测。

可视化基因芯片是在常规基因芯片的原理上，根据各病毒的保守基因序列，利用生物软件设计特异性探针，按照一定规律点样在玻璃片或者膜片上，水合之后形成可以长期保存的芯片。在PCR引物的5’端引入生物素，在辣根过氧化物酶上引入链霉亲和素，利用生物素-链霉亲和素反应使酶和二氨基联苯胺(DAB)特异性显色反应而放大信号，形成肉眼可见的结果。该检测平台特异性好，高通量，灵敏度高，能应用于临床样品，更加适用于基础实验室及临床检测。它不仅有普通生物芯片高通量的特性，又有操作简便、经济实惠的特点，这使它在科研和临床中有着广泛的应用并为高通量分子鉴别诊断提供了新的良好平台。

目前利用可视化基因芯片技术检测猪腹泻病毒的报道仅见本团队马锐前期研究等，猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用，农业生物技术学报，2016,24:1233-1242，该方法仅能检测三种特定的猪腹泻病毒；而且使用的可视化芯片是以玻片做固相载体，在制备时需要进行水合处理，该方法不仅成本高，且操作步骤复杂，耗时长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片及其应用。

本发明提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片，包含固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含：SEQ ID NO：1-2所示探针、SEQ ID NO：3-4所示探针、SEQ ID NO：5-6所示探针、SEQ ID NO：7-8所示探针，分别用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪δ冠状病毒。

其中，所述固相载体为尼龙膜。

本发明还提供了上述寡核苷酸芯片的制备方法，步骤如下：制备探针溶液，用喷点方式点样于固相载体上，即可。

其中，所述探针溶液的浓度为25μM；所述固相载体为尼龙膜。

本发明还提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的试剂盒，它包含权利要求1或2所述的寡核苷酸芯片和8个引物对，分别如SEQ ID NO：11-12所示、SEQ ID NO：13-14所示、SEQ ID NO：15-16所示、SEQ ID NO：17-18所示，SEQ ID NO：19-20所示、SEQ ID NO：21-22所示、SEQ ID NO：23-24所示、SEQ ID NO：25-26所示，分别用于扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪δ冠状病毒。

其中，它还包含显色试剂，为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及DAB显色底物；

其中，它还包含扩增阳性基因的引物对，序列如SEQ ID NO：27-28所示。

本发明还提供了上述寡核苷酸芯片、试剂盒在制备检测4种猪腹泻性病毒的试剂中的用途。

本发明还提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的方法，它包括如下步骤：

(1)病毒样品制备：取待检组织，提取RNA并反转录为cDNA；

(2)靶序列制备：用SEQ ID NO：11-12所示、SEQ ID NO：13-14所示、SEQ ID NO：15-16所示、SEQ ID NO：17-18所示，SEQ ID NO：19-20所示、SEQ ID NO：21-22所示、SEQ ID NO：23-24所示、SEQ ID NO：25-26所示的引物对扩增出靶序列，并进行生物素标记；

(3)杂交：取步骤(2)制备的靶序列，与上述寡核苷酸芯片进行杂交；

(4)结果检测：取步骤(3)杂交后的芯片，用酶显色法分析，即可。

其中，步骤(3)中，所述杂交的时间为1.5h，温度为50℃。

其中，步骤(4)中，酶显色法使用的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素为2000倍稀释液；显色的时间为5min。

本发明针对猪流行性腹泻病毒的S和M基因、猪传染性胃肠炎的S和N基因、猪轮状病毒A型的VP7和NSP4基因以及猪δ冠状病毒的N和M基因的正义链序列，分别设计各自特定的寡核苷酸探针，并以此构建可用于PEDV、TGEV、GAR与PDCoV同时检测的酶促可视化寡核苷酸芯片。

本发明芯片以尼龙膜为载体，将酶促反应和基因芯片技术相结合，能够快速检测和鉴别诊断四种猪腹泻病毒病，特异性好，准确度高，且检测结果肉眼可见，为猪病毒性腹泻的防控提供一种新的诊断技术；而且本发明芯片的制备方法简单、成本低，可应用于临床疫病的大量检测，为保障我国养猪业的健康发展提供技术支撑。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1靶基因琼脂糖电泳凝胶结果：1：PEDV-S 2：PEDV-M 3：TGEV-S 4：TGEV-N 5：GAR-VP7 6：GAR-NSP4 7：PDCoV-N 8：PDCoV-M 9：λ。

图2各目的基因不对称PCR优化结果：M-6：500bp DNA Marker；1,阳性对照；2，1:5；3，1:10；4，1:20；5，1:40；6，1:50。

图3探针浓度优化结果。

图4杂交时间优化结果。

图5杂交温度优化结果。

图6酶浓度优化结果。

图7显色时间优化结果。

图8芯片的特异性检测结果。

图9芯片的灵敏性检测结果，A:1.0ng/μl B:100pg/μl C:10pg/μl D:1.0pg/μl。

图10芯片的保存期测试结果。

图11部分临床样品检测结果。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1本发明PEDV-TGEV-GAR-PDCoV寡核苷酸共检芯片的构建

一、材料与方法

(一)材料

1病料

2014-2018年采自四川攀枝花、安岳、眉山、峨眉山、凉山、绵阳、名山等地疑似猪腹泻病毒疾病病料。

2仪器

高速冷冻离心机3K18型：德国产；

分子杂交仪：Thermo，美国产；

SmartArrayer^TM16，微阵列芯片点样系统：Capitalbio Corporation，北京博奥生物公司；

梯度PCR仪：Thermohybaid，美国产；

电泳仪：POWER Pac300，Bio-意大利；

凝胶电泳图像分析系统2000型，Bio-意大利；

SmartSpaceTM300核酸蛋白测定仪，Bio-意大利

3主要试剂及材料

(二)方法

1引物与探针的设计合成

目的片段引物使用DNAMAN软件对GenBank中收录的PEDV、TGEV、GAR、PDCoV基因序列比对分析，用Primer 5.0软件根据PEDV的S和M基因，TGEV的S和N基因，GAR的VP7和NSP4基因以及PDCoV的M基因和N基因的保守区设计出长度在200bp-800bp之间，Tm值在55℃±2℃之间的6对引物，并将其下游引物的5’端进行生物素修饰用于靶基因的掺入标记。分别在每段目的片段中选取两段长度为45bp左右的单链序列作为寡核苷酸探针，在每个寡核苷酸探针的5’端加15个T碱基摇臂并进行氨基化修饰，以增强探针与醛基芯片的结合。引物和探针均由上海宝生物公司合成(见表1和表2)。

表1引物信息及基因片段长度

表2探针信息及基因片段长度

2靶基因质粒菌的构建与鉴定

2.1RNA的抽提及反转录

采用天根总RNA提取试剂盒抽提目的病毒总RNA，按照说明书进行操作，具体步骤如下：

(1)取200mg阳性病料于1.5mL EP管中，加入三倍体积(约600μl)的组织裂解液，充分混匀；

(2)将混匀的液体在室温静置5min；

(3)12000r/min，4℃离心5min，吸取上清转入新的1.5mL EP管中；

(4)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；

(5)12000r/min，4℃离心10min，液体分层，将最上层无色的液体转到新的EP管中；

(6)加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，转到吸附柱内，12000r/min，4℃离心30s；

(7)加入500μl去蛋白液，12000r/min，4℃离心30s；

(8)加入600μl漂洗液后静置2min，然后12000r/min，4℃离心30s；重复此步骤一次；

(9)12000r/min，4℃空离2min；

(10)将吸附柱转到RNase-Free离心管中，加50μl RNase-Free超纯水，室温静置2min，12000r/min，4℃离心2min。得到的病毒RNA，-70℃保存备用。

以抽提到的RNA为模板，以Random 6primers为引物合成cDNA，反应体系如下：

按下面程序进行RNA反转录：37℃，15min；85℃，5s；得到的cDNA在4℃保存。

2.2靶基因的鉴定

利用设计的引物对反转录获得的cDNA进行扩增，PCR反应体系如下：

反应程序为：95℃、5min；95℃、30s，56℃、30s，72℃、30s，34个循环；72℃延伸10min，16℃保存。然后取6μl用2.0％的琼脂糖凝胶电泳分析。

2.3靶基因的胶回收

取50ulPCR产物6V/cm,25min进行电泳，紫外灯下切胶，称重后，按照Omega GelExtraction Kit说明书进行靶基因胶回收。

2.4靶基因的连接

采用pMD19-T Simple克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，具体步骤按说明进行。连接体系如下：

16℃连接过夜，连接产物用于转化DH5α感受态细胞。

2.5靶基因的转化

将100μl感受态细胞放在冰上，加10μl连接产物，冰浴30min；42℃水浴90s，冰浴5min；加入600μl 37℃预热的LB液体培养基(无需冰上操作)，37℃，150r/min振荡培养1h；取150μl培养物均匀涂布于LB平板(含100mg/mL Amp)，晾干，于37℃培养约12h，挑取菌落进行鉴定。

2.6重组质粒的PCR鉴定

对提取的探针质粒菌分别进行PCR鉴定，同时以pMD19-T simple空白载体作阴性对照，PCR反应体系同2.2.

2.7靶基因质粒菌的保存

把序列测定正确的探针质粒菌(即靶基因质粒菌，所述靶基因的序列见如下)扩大培养，然后以20％脱脂奶粉作为保护剂冻干，-70℃保存。

基因来源：PEDV-S，基因片段大小及序列：474bp

CGCTAGGCTTGAGTCTGTTGAAGTTAACTCTATGCTTACTATTTCTGAAGAGGCTCTACAGTTAGCTACCATCAGTTCGTTTAATGGTGATGGATATAACTTTACTAATGTGCTGGGTGTTTCCGTGTACGACCCTGCAAGTGGCAGGGTGGTACAAAAAGGGTCTTTTATTGAAGACCTGCTTTTTAATAAAGTGGTTACTAATGGCCTTGGTACTGTTGATGAAGACTATAAGCGCTGTTCTAATGGTCGCTCTGTGGCAGATCTAGTCTGTGCGCAGTATTACTCTGGTGTCATGGTACTACCTGGCGTTGTTGACGCTGAGAAGCTTCAAATGTATAGTGCGTCTCTCATCGGTGGTATGGCGCTAGGAGGTCTTACTACTGCAGCGGCATTGCCTTTTAGCCATGCTGTTCAAGCGAGGCTCAATTATCTTGCTTTACAGACGGATGTTCTACAGCGGAACCAGCAATT

基因来源：PEDV-M，基因片段大小及序列：421bp

CTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTATTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACATTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACTGACGCGCTTCTCACTACTTCTGTGATGGGCCGACAGGTCTGCATTCCAGTGCTTGGAGCACCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGTTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTGCCTGATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTATGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTCCGGTCAAAACACGGCGACTACTCAGCTGTGAGTAATCCGAGTGCGGTTCTCACAGATAGCGAGAAAGTGC

基因来源：TGEV-S，基因片段大小及序列：274bp

AGGCTTGACGAATTGAGTGCTGATGCACAAGTTGACAGGCTGATCACAGGAAGACTTACAGCACTTAATGCATTTGTGTCTCAGACTCTAACCAGACAAGCGGAGGTTAGGGCTAGTAGACAACTTGCCAAAGACAAGGTTAATGAATGCGTTAGGTCTCAGTCTCAGAGATTCGGATTCTGTGGTAATGGTACACATTTGTTTTCACTCGCAAATGCAGCACCAAATGGCATGATTTTCTTTCACACAGTGCTATTACCAACGGCTTATGAAACT

基因来源：TGEV-N，基因片段大小及序列：362bp

TTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAATTTAAAGATAAATTAGATGGAGTTGTCTGGGTTGCCAAGGATGGTGCCATGAACAAACCAACCACGCTTGGTAGTCGTGGTGCTAATAATGAATCCAAAGCTTTGAAATTCGATGGTAAAGTGCCAGGCGAATTTCAACTTGAAGTTAATCAATCAAGAGACAATTCAAGGTCACGCTCTCAATCTAGATCTCGGTCTAGAAATAGATCTCAATCTAGAGGCAGGCAACAATTCAATAACAAGAAGGATGACAGTGTAGAACAAGCTGTTCTTGCCGCACTTAAAAAGTTAGGTGTTGACACAGAA

基因来源：GAR-VP7，基因片段大小及序列：381bp

TTGAATGAATGGCTATGTAATCCAaTGgATATAATGCTATATTATTATCAGCAAACAGATGAAGCTAATAAATGGATATCAATGGGTACATCATGTACGATTAAAGTATGTCCTCTAAATACGCAGACTCTCGGGATAGGATGTTCGACTACAGACATAAATTCATTTGAAACAGTGGCCAATGCAGAGAAATTAGCTATAACTGATGTTGTCGATGGAGTCAATCATAAATTAGACGTAACAACGAGTACATGTACTATAAGAAATTGTAAAAAACTTGGACCAAGAGAAAATGTCGCTGTAATTCAGGTAGGAGGTCCAAACATACTCGACATAACAGCTGATCCAACAACTGCACCACAAACTGAAAGAATGATGCGT

基因来源：GAR-NSP4，基因片段大小及序列：270bp

GAACAGGTTACTACTAAGGATGAAATTGAACAACAGATGGACAGAATTGTTAAGGAGATGAGGCGTCAACTGGAAATGATTGACAAATTGACAACTCGTGAAATTGAACAAGTTGAATTACTTAAGCGTATACATGACAAATTAGCTGCTAGACCAGTTGATGCTATAGATATGTCGAAGGAATTTAATCAGAAAAATATTCGAACGCTAGATGAATGGGAAAGTGGAAAAAATCCATATGAACCGTCGGAAGTAACTGCGTCTATGTGA

基因来源：pPDCoV-N，基因片段大小及序列：775bp

TCCATCCTATGCCTTTTATACTGGCACAGGTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATGGTGAACTCCCTCCTAATGATACCCCAGCAACCACTCGTGTTACTTGGGTTAAGGGTTCGGGAGCTGACACTTCTATTAAACCTCATGTTGCCAAACGCAACCCCAACAATCCTAAACATCAGCTGCTACCTCTCCGATTCCCAACCGGAGATGGCCCAGCTCAAGGTTTCAGAGTTGACCCCTTCAACGCTAGAGGAAGACCTCAGGAGCGTGGAAGTGGCCCAAGATCTCAATCTGTTAACTCCAGAGGCACAGGCAATCAGCCCAGGAAACGCGACCAATCTGCACCCGCTGCGGTACGTCGTAAGACCCAACATCAAGCTCCCAAGCGGACTTTACCCAAGGGTAAAACCATTTCTCAGGTATTTGGCAACCGGTCTCGTACTGGTGCCAATGTCGGCTCTGCAGACACTGAGAAGACGGGTATGGCTGATCCTCGCATCATGGCTCTAGCCAGACATGTGCCTGGTGTTCAGGAAATGCTTTTCGCTGGCCACCTTGAGAGCAACTTTCAGGCAGGGGCAATTACCCTTACCTTCTCTTACTCAATCACAGTCAAGGAGGGTTCTCCTGACTATGAGAGACTTAAGGATGCGCTCAATACGGTCGTTAACCAGACCTATGAGCCACCCACCAAACCAACTAAGGACAAGAAGCCTGACAAACAAGACCAGTCTGCTAAACCCAAACAGCAGAAGAA

基因来源：pPDCoV-M，基因片段大小及序列：485bp

GCGTAACCGTGTGATCTATGTTATTAAACTTATTCTGCTTTGGCTGCTCCAACCCTTCACCCTAGTGGTGACCATTTGGACCGCAGTTGACAGATCATCTAAGAAGGACGCAGTTTTCATTGTGTCCATAATTTTTGCCGTACTGACCTTCATATCCTGGGCCAAGTACTGGTATGACTCAATTCGCTTATTAATGAAAACCAGATCTGCATGGGCACTCTCACCTGAGAGTAGACTCCTTGCAGGGATTATGGATCCAATGGGTACATGGAGGTGCATTCCCATCGACCACATGGCTCCAATTCTCACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCTCAAGCTACATGGGCAAGAGCTGGCCAATGGCATATCAGTTAGAAATCCGCCACAGGATATGGTGATAGTGTCACCAAGTGACACCTTTCACTACACTTTTAAGAAACCTGTGGAATCAAACAGCGATCCAGAATTCGCTGTTCTGATATACCA

基因来源：λ基因，基因片段大小及序列：500bp

GTCCTATGACGACAGCTATCTCGATGATGAAGATGCAGACTGGACTGCGACCGGGCAGGGGCAGAAATCTGCCGGAGATACCAGCTTCACGCTGGCGTGGATGCCCGGAGAGCAGGGGCAGCAGGCGCTGCTGGCGTGGTTTAATGAAGGCGATACCCGTGCCTATAAAATCCGCTTCCCGAACGGCACCGCTGGCGTGGATGCCCGGAGAGCAGGGGCAGCAGGCGCTGCTGGCGTGGTTTAATGAAGGCGATACCCGTGCCTATAAAATCCGCTTCCCGAACGGCACCACGGTAACAGCGGCAACCGGCATGACCGTGACGCCTGCCAGCACCTCGGTGGTGAAAGGGCAGAGCACCACGCTGACCGTGGCCTTCCAGCCGGAGGGCGTAACCGACAAGAGCTTTCGTGCGGTGTCTGCGGATAAAACAAAAGCCACCGTGTCGGTCAGTGGTATGACCATCACCGTGAACGGCGTTGCTGCAGGCAAGGTCAACATT

3不对称PCR扩增标记体系的建立

3.1不对称PCR扩增体系的条件优化

用10X质粒进行不对称PCR条件的优化。引物稀释比例为：上游：下游

稀释后浓度比例为上游引物：下游引物＝1:5、1:10、1:20、1:40和1:50

然后按照以下扩增体系进行PCR扩增,PCR扩增体系如下:

反应程序为：94℃、5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。然后取6μl用3.0％的琼脂糖凝胶电泳分析。

3.2不对称PCR扩增标记

在各病毒靶基因的上游引物的5`端标记生物素，利用3建立的体系，进行不对称PCR扩增的同时进行标记。

4PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片的制备

用SmartArrayer^TM16，微阵列芯片点样系统在尼龙膜上喷点芯片。点样前将尼龙膜在超纯水中浸泡30min，然后烘干。将制备的探针稀释到500ng/ul，95℃变性10min，置冰中5min，加入等量的2×Bio-RAD○RDNA微阵列点样缓冲液，将探针浓度调整至一定浓度，按芯片设计阵列加入96孔载样板孔内点样，按照设计好的检测阵列的排布和性能参数。紫外交联30min后干燥、密封4℃保存。

5PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片的杂交检测

5.1杂交

将扩增标记的靶基因15μl 95℃变性10min，置冰中5min，与400μl杂交缓冲液混匀，将混合液移至芯片反应槽中，置于湿盒内杂交一定时间，分别用洗液Ⅰ、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ、洗液Ⅳ依次洗涤，每次3min。

(洗液Ⅰ：2×SSC+0.1％SDS；洗液Ⅱ：0.5×SSC+0.05％SDS；洗液Ⅲ：0.2×SSC；洗液Ⅳ：双蒸水)

用15ml封闭液，37℃封闭30min.

5.2酶联

吸除封闭液，加15ml含有3U/ml Streptavidin-HRP的酶联液，在一定浓度下酶联30min.用酶联缓冲液洗涤3次，每次3min.

5.3显色

加含有DAB的底物液15ml，常温避光显色。超纯水洗，终止显色。

5.4芯片杂交结果的检测分析

用Bio-RAD○R凝胶成像分析系统2000型扫描图像，信号的判定标准可以在根据试验实际情况制定，或直接用肉眼进行观察试验结果。

二、结果

1靶基因扩增结果

依照上述的PCR体系及程序对九个基因的阳性质粒进行普通PCR扩增，鉴定其扩增产物。如图1所示，扩增产物大小与预期相符。

2阳性质粒浓度测定

利用核酸蛋白仪测定各质粒的OD 260/OD 280，换算成浓度，其浓度分别为PEDV-S(268ng·μL-1)、PEDV-M(273ng·μL-1)、TGEV-S(223ng·μL-1)、TGEV-N(275ng·μL-1)、GAR-VP7(305ng·μL-1)、GAR-NSP4(285ng·μL-1)、PDCoV-N(220ng·μL-1)、PDCoV-M(230ng·μL-1)以及λ(195ng·μL-1)。

3不对称PCR扩增体系的条件优化结果

结果见图2。

通过对各目的基因的不对称PCR条件进行优化，最终确定各目的基因上下游引物浓度配比为：上游：下游：PEDV-S:1:10；PEDV-M:1:20；TGEV-S:1:20；TGEV-N:1:20；GAR-VP7:1:20；GAR-NSP4:1:20；PDCoV-M:1:10；PDCoV-N:1:20。

4、PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片探针浓度的选择

将探针浓度分别稀释至5μM，10μM，25μM，50μM后进行杂交检测，挑选适宜的探针浓度。

将各寡核苷酸探针用点样缓冲液将浓度分别调整为50μM，25μM,10μM，5μM，杂交结果见图3。由图3可见，随着探针基因浓度的加大，斑点的深度依次加强，但相应的试验成本也增加，综合考虑，选择探针浓度为25μM为最优条件。

5、PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片杂交时间和杂交温度的选择

杂交时间选择：在45℃条件下与芯片杂交，将制备好的芯片与不对称PCR产物在杂交仪中分别杂交30min,1h,1.5h和2h，分析后确定最佳杂交时间。结果见图4。

杂交时间直接影响探针与靶基因的结合数量，随着杂交时间的延长，信号值和背景值都增强。对杂交温度进行灰度分析，在30min时，部分探针相应的位置信号值低，不易被识别出来；芯片杂交1h能看到斑点但是较1.5h及2h时信号值要低；2h时的背景值较1.5h时大。杂交1.5h时信号值与背景值的差值最大。因此选择杂交1.5h为最佳杂交时间。

杂交温度选择：使杂交盒中靶基因产物在42℃，45℃，50℃和60℃温度条件下进行杂交2h，分析后确定最佳杂交温度。

将芯片分别在42℃，45℃，50℃和60℃下进行杂交相同的时间，结果如图5,。杂交温度是影响芯片杂交的主要因素，温度太低，特异性差。温度太高，无法支持杂交时双链的结合，信号值降低。对杂交温度进行灰度分析，在42-45℃时，部分探针相应的位置斑点不易被识别。而在60℃时探针信号值较50℃时信号值较低。在50℃时信号值与背景值的灰度值差值最大，因此选择50℃为最佳杂交温度。

6、PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片酶浓度的选择

酶浓度选择：在杂交清洗后，将芯片与1000，2000,5000,10000倍稀释的Streptavidin-HRP在暗室中反应30min.进行显色反应后观察结果。结果见图6。

分别用稀释后的Strep-HRP在相同的条件下与芯片进行孵育，在酶联液稀释到1000X时，肉眼可见染色结果信号值和背景值颜色最深；当浓度为2000x时斑点信号清晰可见，且背景色浅；当稀释倍数达到5000x时，斑点颜色变浅，较模糊；当稀释浓度到10000x时，基本无法判定结果。链霉亲和素包被的HRP浓度太高时，信号值和背景值都较高，浓度太低，信号值太弱，无法判定结果。对其进行灰度分析发现，当浓度为2000倍时，信号值与背景值的差值最大。

7、PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片显色时间的选择

在相同条件下进行杂交和酶联，然后将新鲜配置的底物显色溶液DAB加入杂交区域进行显色，分别显色3min,5min,7min以及10min后进行结果判定。在3min时颜色较浅，无法判定结果；在显色5min时可见到清晰的信号斑点，在显色7min时信号值和背景值均加深，在显色10min时，信号斑点被背景值逐渐覆盖，无法准确判断。随着显色时间的增加，信号值和背景值都随着增强。进行灰度分析发现当显色5min时，信号值与背景值的灰度值差值最大。因此选择显色5min。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1本发明PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片的应用评价

1、PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片的特异性检测

用PEDV、TGEV、GAR、PDCoV、PRRSV、CSFV、JEV、PCV八种病毒阳性质粒pcr产物分别与芯片进行杂交，以检测其特异性。

分别以各质粒为模板，进行不对称PCR扩增标记，将标记产物与芯片杂交，酶联显色并观察结果，结果如图8所示。检测结果显示PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片的特异性良好，每种探针都不会发生非特异性反应。

2、PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片的灵敏性检测

将抽提的质粒用杂交缓冲液稀释成4个梯度(10倍系列梯度稀释，分别为1.0ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1.0pg/μl)，将每个梯度的液体与PEDV-TGEV-GAR-PDCoV寡核苷酸基因芯片按上述方法杂交进行灵敏性检测。

以不同浓度的质粒DNA为模板，扩增生物素标记的单链引物，后与芯片杂交，结果如图9。10倍系列梯度稀释后检测结果显示，当梯度为10pg/μl时，阳性斑点仍然可见，但是当梯度为1.0pg/μl时，斑点模糊不可见，故该芯片的灵敏度至少为10pg/μl。

3、PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片的保存期检测

将点制好的PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片密封避光保存1个月，3个月后拆封进行检测。

将点制好的PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片密封避光保存1个月，3个月后拆封进行检测,结果显示，在一个月，三个月保存期内，芯片均能有效检测出定位基因和相应的靶基因，并且检测信号点明显。证明芯片在4℃密封保存下至少可保存3个月。

4、PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片的临床样品检测结果

将从四川攀枝花、安岳、眉山、峨眉山、凉山、绵阳、名山等地区采集的50份疑似猪腹泻病毒疾病的样本按照2-3的方式进行处理，并用芯片进行检测.对PEDV-TGEV-GAR-PDCoV酶显色法可视化寡核苷酸共检基因芯片的临床初步应用进行系统评估。临床病料结果显示，可视化芯片技术与PCR/RT-PCR检测技术的检出率一致，两种检测方法的符合率为100％。结果如表3所示，图11为部分临床样品检测结果。

表3临床病料检测结果

综上，本发明酶促可视化寡核苷酸芯片和试剂盒可以有效检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪A群轮状病毒(GAR)以及猪δ冠状病毒(PDCoV)，特异性强、灵敏度高、稳定性好、结果肉眼可见，操作简便、成本低，可用于临床大规模检测，应用前景良好。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片及其应用

<130> GY151-18P1160

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> PEDV病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PM)

<400> 1

ttctgtgaga accgca 16

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> PEDV病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PS)

<400> 2

tgcttctcag cgtcaa 16

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> TGEV病毒( transmissible gastroenteritis virus，TN)

<400> 3

tcacgactac caagcg 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> TGEV病毒( transmissible gastroenteritis virus，TS)

<400> 4

tctaacctcc gcttgt 16

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> GAR病毒(Group A rotavirus，NSP4)

<400> 5

tgacgcctca tctcct 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> GAR病毒(Group A rotavirus，VP7)

<400> 6

tgaacatcct atcccg 16

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> PDCoV病毒(Porcine deltacoronavirus，M)

<400> 7

tttattctgc tttggc 16

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> PDCoV病毒(Porcine deltacoronavirus，N)

<400> 8

tgctagtggc tgcgtta 17

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> PEDV病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PS上游引物)

<400> 9

cgctaggctt gagtctgttg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> PEDV病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PS下游引物)

<400> 10

aattgctggt tccgctgtag 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> PEDV病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PM上游引物)

<400> 11

cttatggctt gcatcact 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> PEDV病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PM下游引物)

<400> 12

gcactttctc gctatctg 18

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> TGEV病毒( transmissible gastroenteritis virus，TS上游引物)

<400> 13

aggcttgacg aattgagtgc tgatg 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> TGEV病毒( transmissible gastroenteritis virus，TS下游引物)

<400> 14

agtttcataa gccgttggta atagc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> TGEV病毒( transmissible gastroenteritis virus，TN上游引物)

<400> 15

ttcctgaaag gtggttcttc tacta 25

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> TGEV病毒( transmissible gastroenteritis virus，TN下游引物)

<400> 16

ttttctgtgt caacacctaa cttt 24

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> GAR病毒(Group A rotavirus，VP7上游引物)

<400> 17

ttgaatgaat ggctatgtaa tcc 23

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> GAR病毒(Group A rotavirus，VP7下游引物)

<400> 18

acgcatcatt ctttcagttt gt 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> GAR病毒(Group A rotavirus，NSP4上游引物)

<400> 19

gaacaggtta ctactaagga tg 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> GAR病毒(Group A rotavirus，NSP4下游引物)

<400> 20

tcacatagac gcagttactt cc 22

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> PDCoV病毒(Porcine deltacoronavirus，N上游引物)

<400> 21

tccatcctat gccttttatt atact 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> PDCoV病毒(Porcine deltacoronavirus，N下游引物)

<400> 22

gcagagttac ctttttaggt ttctt 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> PDCoV病毒(Porcine deltacoronavirus，M上游引物)

<400> 23

gcgtaatcgt gtgatctatg ttatt 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> PDCoV病毒(Porcine deltacoronavirus，M下游引物)

<400> 24

tggtatatca gaacagcaaa ttctg 25

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 阳性对照(Artificial sequence，上游引物)

<400> 25

aaagcgacgc aatgaggcac t 21

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 阳性对照(Artificial sequence，下游引物)

<400> 26

gttccacgac cgcaactgc 19

Claims

1.一种同步检测4种猪腹泻性病毒的酶促可视化寡核苷酸芯片，包含固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针包含：SEQ ID NO：1-2所示探针、SEQ ID NO：3-4所示探针、SEQ ID NO：5-6所示探针、SEQ ID NO：7-8所示探针，分别用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪δ冠状病毒。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于：所述固相载体为尼龙膜。

3.权利要求1或2所述寡核苷酸芯片的制备方法，其特征在于：步骤如下：制备探针溶液，用喷点方式点样于固相载体上，即可。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述探针溶液的浓度为25μM；所述固相载体为尼龙膜。

5.一种同步检测4种猪腹泻性病毒的试剂盒，其特征在于：它包含权利要求1或2所述的寡核苷酸芯片和8个引物对，分别如SEQ ID NO：11-12所示、SEQ ID NO：13-14所示、SEQ IDNO：15-16所示、SEQ ID NO：17-18所示，SEQ ID NO：19-20所示、SEQ ID NO：21-22所示、SEQID NO：23-24所示、SEQ ID NO：25-26所示，分别用于扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪δ冠状病毒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：它还包含显色试剂，为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及DAB显色底物；

它还包含扩增阳性基因的引物对，序列如SEQ ID NO：27-28所示。

7.权利要求1或2所述的寡核苷酸芯片、权利要求5-6所述的试剂盒在制备检测4种猪腹泻性病毒的试剂中的用途。

8.一种同步检测4种猪腹泻性病毒的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)病毒样品制备：取待检组织，提取RNA并反转录为cDNA；

(3)杂交：取步骤(2)制备的靶序列，与权利要求1或2所述的寡核苷酸芯片进行杂交；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述杂交的时间为1.5h，温度为50℃。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，酶显色法使用的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素为2000倍稀释液；显色的时间为5min。