CN100335651C - 一种荧光PCR定性检测含有Pat基因转基因作物探针序列及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种荧光PCR定性检测含有Pat基因转基因作物探针序列及试基盒，所述的探针序列包括：序列TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA向上游延伸5个碱基、向下游延伸5个碱基的区域内形成的序列。所述的试剂盒组成为：核酸提取试剂；核酸扩增试剂，所述的核酸扩增试剂包括：PatPCR反应液、18s-rRNAPCR反应液、Taq酶(5U/ul)、UNG(1U/ul)；对照品等。本试剂盒对于转入Pat基因转基因作物检测灵敏度可达0.1%，本试剂盒还具有良好的特异性。由于本试剂盒采用了植物内源基因18S-rRNA作为内标，避免了假阴性的产生，由于本方法对PCR产物实行了实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光PCR定性检测含有Pat基因转基因作物探针序列及试剂盒。
背景技术
据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA)统计，2001年全世界转基因作物种植面积为5260万公顷，十多个国家已种植转基因作物，其中99％的转基因作物种植在美国、阿根廷、加拿大和中国，已批准商品化转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等，已批准商业化种植的已近90种。据估计，用这些转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。
对转基因产品的安全性，特别是转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，自转基因技术出现以来，就一直是世界各国及联合国等国际组织关心的焦点问题，2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。2001年欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出只要不是有意污染，食品中含有不超过1％的转基因产品(阈值)则不用标识，这样转基因产品检测不但需要定性，还需要定量检测。不同国家阈值大小不一样，从1-5％不等。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法。目前全世界36个国家和地区出台了各种转基因产品有关的法律法规。总之，转基因产品的研究、生产、销售都要在政府有关部门的许可和监督下，在特定的环境和地点进行。
虽然联合国所属机构(FAO、WHO等)及一些地区性国际组织在召集建立世界统一的检测技术和方法标准，但由于对于转基因产品的安全性、风险管理措施及其它利益等方面的不一致，目前各国尚难达成一致的意见。综合世界各国转基因产品的检测技术，根据检测目标主要分成下面三个类型：检测插入的外源基因，检测外源基因表达物(RNA或蛋白质)，检测插入外源基因对受体生物基因表达的影响(主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对整个代谢产物的影响)。由于第三类型的检测成本高、所需时间长，并且被认为重要性较低，目前对这方面的检测在实际工作中较少涉及。在前两种类型的检测工作中所涉及的检测目标包括三种类型：DNA、RNA和蛋白质。对于蛋白质的检测主要用血清学方法，由于有些转基因产品不表达蛋白质或表达量不稳定，血清学检测方法仅在个别转基因产品检测中应用。对于DNA和RNA的检测主要采用PCR及直接核酸杂交等基因诊断技术。基因扩增诊断方法到目前为止已经历了以下几个方面的发展：PCR/电泳检测、传统杂交或测序；PCR-ELISA；实时荧光PCR。
在目前所见到的转基因作物中，转入的目的基因种类繁多，功能各异。为了转入的基因成功表达，均需要插入一定的外源性调控序列，统计表明，35S启动子，FMV启动子，nos终止子，nptII，cry3A，bar和pat这七种基因片段，用做筛查目的靶核苷酸序列时则可覆盖绝大多数的GMO品种(详见附录一：商品化的转基因作物品种含有的定性筛选基因)。Pat基因的英文名称为phosphinothricin acetyltransferase(简写为Pat)，PAT基因(或其人工改建序列)作为一种抗除草剂基因，不仅可以作为目的基因转入作物，而且可以作为转基因过程中的筛选基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光PCR定性检测含有Pat基因转基因作物探针序列及试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
荧光PCR定性检测含有Pat基因转基因作物探针序列包括：序列TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA向上游延伸5个碱基、向下游延伸5个碱基的区域内形成的序列。上游引物序列GTCGACATGTCTCCGGAGAG下游引物序列GCAACCAACCAAGGGTATC。
所述的试剂盒组成为：
核酸提取试剂
核酸扩增试剂
PatPCR反应液(定性)
18s-rRNA PCR反应液
Taq酶(5U/ul)
UNG(1U/ul)
纯化水
对照品
Pat阳性对照品
18s-rRNA阳性对照品
基因组全序列见附录二
本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物、一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。同时结合荧光探针检测技术，该探针能与引物扩增区域中间的一段模板发生特异性结合，随着PCR过程的进行，荧光信号发生相应的变化，使用在线监测的荧光PCR检测仪，即可同时实现对靶核苷酸序列的扩增及自动检测，根据收集记录的荧光信号，判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。为排除假阴性的出现，本试剂盒系列还包括植物共有的18s-rRNA基因检测系统，用于检测样本DNA的提取和PCR反应过程。
附图说明
图1：一种荧光PCR定性检测含有Pat基因转基因作物扩增图
图1中，阳性样品为油菜种子1，阴性样品为：0.1％Fluka大豆标准品，阿根廷大豆，0％大豆，Mon810大豆，0％玉米马铃薯，番茄，棉花。
具体实施方式
引物、探针设计：
对GMO中选用的多种Pat基因序列(包括Pat基因的天然序列以及人工改建序列)进行比较，选择其中缺乏二级结构且保守的基因区设计多对引物。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。根据上述原则设计出的引物、探针如下：
上游：PAT 1u，PAT 14，PAT 43，PAT 161，PAT 173，PAT 189，PAT 202，PAT 353，PAT 358，PAT 413，Patn33u
下游：PAT 173r，PAT 216，PAT 239，PAT 243，PAT 277，PAT 461，PAT 463，PAT 510，PAT512
探针：PAT65tdB，81-433FB，218FB
最优引物、探针序列如下：
引物：上游引物：PAT 1u：GTCGACATGTCTCCGGAGAG
下游引物：PAT 173r：GCAACCAACCAAGGGTATC
探针序列：PAT65tdB：Fam-TGGCCGCGGTtTGTGATATCGttaa-TAMRA
反应体系的建立及优化：
反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：用已确证的转入该基因的转基因油菜籽为材料，以Promega Purification kit提取基因组核酸，再分别用上述检测序列区域中的最长的扩增片段的引物进行PCR扩增。扩增产物用1×TE进行10倍梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共5个稀释度为系列阳性模板，并取其中Ct值23至27之间者作为以后反应体系优化时的模板。
引物、探针的筛选：
引物筛选实验中将上述上游引物和下游引物结合特异的探针，任意配对进行实验。荧光PCR仪采用PE7700荧光PCR仪。所采用的PCR反应体系如下表所示。
PCR反应体系
组分 终浓度
10×PCR反应液 1×
dNTP(含dUTP) 0.2mmol/L
Taq酶 2Unit
Mg2+浓度 2.5mmol/L
引物(上游) 0.2umol/L
引物(下游) 0.2umol/L
探针 0.1umol/L
模板DNA 2ul
补DEPC水至 40ul
PCR条件的选择：依据本公司以往的经验，PCR条件的选择如下：
在同样的模板量、同样的反应条件下，以Pat基因序列的特异荧光探针信号所获得的Ct值和Rn值为指标(这两者能反映扩增片断的量和质)，比较不同引物对组合的扩增情况。选择Ct值和Rn值高者，做为待选的DNA/PCR检测的引物对。
从多次重复实验中选定下述最佳引物/探针组合为最佳组合：上游引物：PAT 1u；下游引物：PAT 173r；探针：PAT65tdB。
用选出的最佳上下游引物对进行PCR反应体系的优化。
引物和探针浓度的优化
实验中将引物浓度从0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L递增，探针浓度从0.025umol/L至0.2umol/L以0.025mol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较。最佳引物和探针终浓度结果如下：：
| 待检序列 | 引物名称 | 最佳终浓度(μM) |
| PAT基因 | 上游引物PAT 1u | 0.2 |
| 下游引物PAT 173r | 0.2 |
探针名称：PAT65tdB 最佳终浓度：0.1μM。
镁离子浓度的优化
实验中将镁离子浓度从1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增。
从多次重复实验中选定2.5mmol/L MgCl2为试剂盒反应体系镁离子浓度。
Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化
Taq酶用量(以单位U计)的优化实验结果，选定2U Taq酶作为试剂盒中使用Taq酶量。
dNTPs浓度的优化
dNTPs浓度的优化实验中选定0.2mmol/L作为试剂盒dNTPs的终浓度。
综合以上反应体系优化实验结果，优化后的PCR反应体系见下表。
优化后的PCR反应体系
| 组分 | 终浓度 |
| 10×PCR反应缓冲液(pH＝8.9) | 1× |
| Mg2+浓度 | 2.5mmol/L |
| dNTPs(含dUTP) | 0.2mmol/L |
| Taq酶 | 2U |
| 引物(上游) | 0.2umol/L |
| 引物(下游) | 0.2umol/L |
| 探针 | 0.1umol/L |
| 模板 | 2ul |
| 补水至 | 40ul |
DNA提取方法的建立
推荐使用传统的植物DNA提取方法：CTAB法。也可根据样品特性选用方法。
18s-rRNA基因检测
18s-rRNA基因是存在于所有植物中的一种基因，所以本试剂盒选用它作为内标基因，用于监测DNA提取及荧光PCR整个过程，18s-rRNA体系的建立同上，引物、探针序列如下：
上游引物序列：18s-rRNA1403u：cctgagaaacggctaccat
下游引物序列：18s-rRNA1449r：cgtgtcaggattgggtaat
探针序列：18s-rRNA1423fb：FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA
核酸提取试剂与方法有关，可使用传统的植物DNA提取方法，例如CTAB法，也可采用Promega公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒(CatFF3750，200 tests)。
Pat试剂盒组成
| 组成成份(48tests/盒) | 体积 |
| CTAB法核酸提取试剂CTAB缓冲液CTAB沉淀缓冲液沉淀溶解液核酸扩增试剂PatPCR反应液(定性)18s-rRNA PCR反应液Taq酶(5U/ul)UNG(1U/ul)纯化水对照品Pat阳性对照品18s-rRNA阳性对照品 | 40ml×1管40ml×1管24ml×1管1ml×2管1ml×2管40ul×1管10ul×1管100ul×1管30ul×1管30ul×1管 |
试剂盒中各组分配方
PatpCR反应液：取合格25mmol/L MgCl2、100mmol/L dATP、100mmol/L dUTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dCTP、50umol/L Pat上游引物、50umol/L Pat下游引物、50umol/L Pat探针、10×PCR缓冲液、1U/ul UNG和纯化水，按以下配方配制PCR反应液。
| 试剂成份 | 终浓度 |
| 10×buffer | 1× |
| MgCl2 | 2.5mM |
| dNTPs(u) | 200uM |
| Taq酶(检测时另加) | (2U) |
| Pat上游引物 | 0.2uM |
| Pat下游引物 | 0.2uM |
| Pat探针 | 0.1uM |
| 模板(检测时另加) | (5ul) |
| 水 | |
| 终体积(ul) | 40ul |
CTAB法样本处理试剂配方：
| CTAB缓冲液CTAB沉淀缓冲液沉淀溶解液 | 20g CTAB/L，1.4M NaCl，0.1M Tris/HCl，20mMEDTA(ph＝8.0)5g CTAB/L，0.04M NaCl1.2M NaCl |
18s-rRNA PCR反应液：取合格25mmol/L MgCl2、100mmol/L dATP、100mmol/L dUTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dCTP、50umol/L18s-rRNA上游引物、50umol/L 18s-rRNA下游引物、50umol/L 18s-rRNA探针、10×PCR缓冲液、1U/ul UNG和纯化水，按以下配
方配制PCR反应液。
| 试剂成份 | 终浓度 |
| 10×bufferMgCl2dNTPs(u)Taq(检测时另加)18s-rRNA上游引物18s-rRNA下游引物18s-rRNA探针模板(检测时另加)水终体积(ul) | 1×2.5mM200uM(2U)0.2uM0.2uM0.1uM(5ul)40ul |
其中，UNG是UNG酶(尿嘧啶-N-糖苷酶)Uracil-N-glycosylase
纯化水的制备
用自来水一次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水，贮于无菌瓶中。
阳性对照品的制备
取相应的阳性样品，CTAB法样本处理试剂提取DNA，将上述制备好的DNA，用比检测反应扩增片段更长的引物扩增(用dTTP而非dUTP)，采用Promega公司的Wizard PCRPreps DNA Purification System试剂盒纯化上述PCR产物中的目的核酸片段，再用1.5％琼脂糖凝胶电泳的方法对纯化的扩增产物进行粗略定量，然后用Promega公司的PGEM-TEasy Vector System II试剂盒将目的片段与T载体相连接；再将连接产物转化入JM109感受态细胞，然后用X-Gal和IPTG琼脂平板筛选克隆目的菌落，PCR反应鉴定之。用LB液体培养基进行质粒的扩增。最后用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNAPurification System试剂盒进行质粒的提纯，仍以1.5％琼脂糖凝胶电泳的方法对提纯的质粒进行纯度检测，合格者为阳性对照品母液。用1X TE进行大量稀释。
稀释的质粒，用合格试剂盒进行检测，取Ct值在28～30者，留置大量，用做配试剂盒，也用做暂定的企业标准品。
自备设备及试剂
水浴锅，离心机；氯仿、异丙醇(-20℃预冷)、70％乙醇(-20℃预冷)
适用仪器PE Gene Amp7700荧光PCR检测仪或其次她合适的荧光PCR仪
保存与有效期测试
样本处理试剂置室温保存，其他试剂置-20℃保存，避免反复冻融。自检定合格之日起有效期为12个月。连续生产的三批试剂盒检定合格之日起在试剂盒要求的储存温度下保存，每个月按成品检定规程检测一次，一直到14个月时，各项指标均合格，因此确定试剂盒有效期为12个月。
使用方法
样本核酸提取
1.1CTAB法提取DNA
1.1.1称取100mg充分粉碎后的植物样品放入2ml离心管中，加800ul CTAB缓冲液，混匀后于65℃温育30分钟；
1.1.2 15500g离心10分钟，转移上层液至含400ul氯仿的管中，混匀30秒，再以15500g离心10分钟直至液相分层，吸取上层液至干净离心管中；
1.1.3加入2V CTAB沉淀缓冲液，室温下温育60分钟；
1.1.4混合液以15500g离心5分钟，弃上清；
1.1.5加入500ul沉淀溶解液溶解沉淀，并加入500ul氯仿，混匀30秒后以15500g离心10分钟；
1.1.6转移上清至另一新管中，加入0.6倍体积异丙醇，充分混匀后15500g离心10分钟，弃上清液；
1.1.7加入70％乙醇500ul于含有沉淀的小管中，小心混匀洗涤管壁后离心10分钟(15500g)，弃上清；
1.1.8室温干燥，然后将DNA溶解在100ul无菌去离子水中(如果样本DNA当天不使用，请于-20℃保存)。
1.2Promega法提取DNA的步骤(备选)
原方法样本称取量为200mg。根据本公司的经验，此量极难混匀，故将样本称取量改为100mg，其后的试剂用量和操作步骤则完全按原方法进行。
2.试剂配制(PCR前准备区)
从试剂盒中取出各管试剂，室温融化，2000rpm离心5秒。
a)设Pat PCR所需要的管数为n(n＝样本数×2+1管空白对照+1管Pat阳性对照品)；
b)设18s-rRNA PCR所需要的管数为m(m＝样本数×2+1管空白对照+1管18s-rRNA阳性对照品)；
每个测试反应体系配制如下表：
Pat PCR反应体系 Pat PCR反应液34.6ul Taq酶0.4ul UNG 0.06ul
18s-rRNA反应体系 18s-rRNA PCR反应液34.6ul Taq酶0.4ul UNG 0.06ul
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反应管中分别加入Pat PCR反应液各35ul；向设定的m个PCR反应管中分别加入18s-rRNA PCR反应液反应液各35ul，一同转移至样本处理区。
2.1加样(样本处理区)
若样本DNA保存在-20℃，先置室温解冻。
在各设定的PCR反应管中，分别加入上述样本DNA溶液、纯化水(空白对照)和相应阳性对照品各5ul，盖好PCR反应管盖，转移至检测区，置于定量PCR检测仪上并记录样本摆放顺序。
2.2.PCR扩增(检测区)
2.2.1循环条件设置
37℃：5min；95℃：3min；
95℃：15sec，60℃：1min 40个循环。反应体系设为40ul。
(不同的荧光PCR仪循环条件可能略有调整)
2.2.2仪器检测通道选择
所有PCR反应管荧光信号收集设为Fam荧光通道。
具体设置方法请参照仪器使用说明书。
3.质控标准
Pat空白对照的检测结果应为阴性；
Pat阳性对照品的Ct值≤32.0；
18s-rRNA空白对照的检测结果应为阴性；
18s-rRNA阳性对照品的Ct值≤30.0；
上述指标有一项不符合者，应重做PCR扩增。
4.结果判断
4.1.阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，使阴性对照品成阴性结果为准。
4.2.待测样本18s-rRNA Ct值应该≤17.0，如果不在此范围，则需重新提取样本DNA，重做PCR扩增。
4.3.将同一样品两个平行管的Ct值取平均值，做为判断用的待测样品Ct值。
4.4.待测样本Pat测定Ct值等于40.0者，报Pat基因序列阴性(其他荧光PCR仪对阴性的表示也可能为0.0或空白无数值)。
4.5.待测样本Pat测定Ct值≤34.0，报Pat基因序列阳性。
4.6.如果34.0＜待测样本Pat基因测定Ct值＜40.0，需重新做PCR扩增。
如再次扩增结果Pat基因测定Ct值仍＜40.0，报Pat基因序列阳性。
如再次扩增结果Pat基因测定Ct值等于40.0，则报Pat基因序列阴性。
试剂盒使用注意事项
有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。
实施例1
选取转基因及非转基因的农产品如大豆、玉米、油菜、番茄、土豆，以Promega磁珠法提取基因组DNA，具体为：称重100mg植物材料，置于2ml离心管中；加入500ul LysisBuffer A和5ul RNase A，与材料混匀；加入250ul Lysis Buffer B，混匀，室温放置10分钟；加入750ul沉淀缓冲液，混匀后高速离心(13000×g)10分钟；吸取上清于干净的2ml离心管中，加入50ul磁粉液，混匀；混合液中加入0.8体积异丙醇，混匀，室温放置5分钟；将离心管置于磁架上1分钟，去澄清液；取出离心管，再加入250ul Lysis Buffer B，混匀后置于磁架上1分钟，去澄清液；用1ml 70％乙醇清洗磁粉，置于磁架上1分钟，去澄清液；步骤重复2次；取出离心管，于65℃干浴锅中干燥5分钟或室温下干燥15-30分钟：离心管中加入100ul去离子水，混匀后于65℃干浴锅中孵育5分钟，再移至磁架上1分钟，吸取澄清液于0.5ml干净离心管中，做为DNA模板备用。
用该试剂盒做荧光PCR检测，具体为：40ul反应体系中，加入植物基因组DNA 5ul，进行荧光PCR检测，具体反应条件同前。经检测，上述转入Pat基因转基因作物均呈阳性扩增，其检测灵敏度均可达到0.1％；而非转基因的农产品如普通玉米、白玉米等均无扩增信号，提示该引物对具有良好的灵敏度和特异性(具体见图一)。
试剂盒灵敏度为：0.1％GMO，将0.1％的标准品做5倍稀释后，仍可检测到目标片段。
试剂盒精密性测试
公司中3位技术熟练的操作人员在3个不同时间，各做3次精密性检测实验(总计9次)，每次平行处理10份精密性参比品。对每10次所得的Ct值用Microsoft Excel分析软件进行统计学处理，得出平均值和10个Ct值的CV值，实验结果显示，Ct值的CV值在5.0％以下，表明该试剂盒有良好的精密性。
试剂盒特异性测试
该试剂盒对阴性大豆、玉米、油菜、马铃薯标本均无非特异性扩增，表明该试剂盒具有良好的特异性。
对于所有植物DNA均应该扩增。按本试剂盒的方法提取DNA，其Ct值在9至25之间。
发明效果：经过反复筛选，得到最佳组合为：上游引物：PAT1u；下游引物PAT173r；探针PAT65tdB。
以0.1％转基因油菜籽提取的DNA做模板，得到的Ct值在29.0-33.0之间，这是目前不同荧光测定仪器的可靠检测下限；而0.1％的检测灵敏度已经达到了目前国际同类产品的检测标准。
该试剂盒中的引物探针还可以用作杂交探针检测含有Pat基因转基因作物。
PCR-ELISA的方法学原理简介
该实验要设计一对PCR引物和一条探针，它们均与模板DNA链互补，且探针的结合部位在引物结合部位之间。将PCR的一条引物5’端标记上荧光素(Fluorescein)，进行PCR扩增，得到的扩增产物带有荧光素标记。同时将探针的5’端标记上生物素(Biotin)，酶联板上包被有亲和素(Avidin)，通过生物素与亲和素的亲和作用，将探针包被在酶联板上。检测时，将扩增产物变性成单链，在酶联板上与探针进行特异的结合，洗板，再加入辣根过氧化物酶偶联的荧光素抗体，通过显色剂显色，在酶标板上读取OD值，根据OD值判断样品的阴阳性。
实施例2
将上述探针PAT65tdB的5’端标记生物素，3’端不做标记；将引物PAT173r的5’端标记上荧光素。预先将探针包被在有亲和素的酶联板上。
按常规方法(CTAB法或磁珠法)提取样本中的DNA。由10×PCR缓冲液、dNTPs、Mg2+、Taq酶、上下游引物、H2O，以及DNA模板组成PCR反应体系，进行扩增。
扩增结束后，将扩增产物变性成单链，加到包被了探针的酶联板上，如果有特异性扩增，扩增产物中的一条链与探针杂交，洗板，加入酶联荧光素抗体，洗板，加入显色剂，显色10分钟，停止显色，在酶标仪上读取OD值，根据OD值判断样本的阴阳性。下表
| 样本 | 0.0％玉米 | 0.1％玉米 | Cry9c玉米 | GMO油菜 | 美国大豆 | 阿根廷大豆 | 0.1％Fluka大豆标 |
| OD值 | 0.128 | 0.122 | 0.168 | ＞3.000 | 0.174 | 0.123 | 0.138 |
| 结果判断 | - | - | - | + | - | - | - |
| 样本 | 空白对照 | Mon810大豆 | 0％大豆 | 马铃薯 | 番茄 | 棉花 |
| OD值 | 0.158 | 0.149 | 0.136 | 0.175 | 0.114 | 0.522 |
| 结果判断 | - | - | - | - | - | - |
实验结果表明：只要含有PAT基因序列的转基因作物经该系统检测结果均为阳性，而不含有PAT基因序列的作物经该系统检测均为阴性。
本发明的优点
1.本试剂盒对于转入Pat基因的转基因作物检测灵敏度可达0.1％，说明本试剂盒具有良好的灵敏度。
2.本试剂盒对于非转基因的农产品如大豆、玉米等均无扩增信号，说明本试剂盒具有良好的特异性。
3.由于本试剂盒采用了荧光PCR作为检测方法，整个反应均闭管进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性。
4.由于本试剂盒采用了植物内源基因18S-rRNA作为内标，避免了假阴性的产生。
5.由于本方法对PCR产物实行了实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力。
备注：
英文字母表示的引物探针的名称、引物探针的序列、基因的名称等大小写通用；
“Ct值”的英文全称为“Threshold Cycles”，意指荧光值超过阈值时所处的循环数。在不同荧光PCR仪上有不同的名称，但含义是一样的。
附录一
| 植物名称 | 品种名称 | 筛选基因名称 | ||||||
| 35S | nos | nptII | FMV | bar | pat | cry3A | ||
| 甜菜 | GTSB77 | ● | ● | |||||
| T120-7 | ● | ● | ● | |||||
| 油菜 | 23-18-17，23-198 | ● | ||||||
| GT200 | ● | |||||||
| GT73，RT73 | ● | |||||||
| HCN10 | ● | ● | ||||||
| HCN92 | ● | ● | ● | |||||
| MS1，RF1＝＞PGS1 | ● | ● | ● | |||||
| MS1，RF2＝＞PGS2 | ● | ● | ● | |||||
| MS8×RF3 | ● | ● | ||||||
| OXY-235 | ||||||||
| PHY14，PHY35 | ● | ● | ||||||
| PHY36 | ● | ● | ||||||
| T45(HCN28) | ● | ● | ||||||
| ZSR500/502 | ● | |||||||
| 番木瓜 | 55-1/63-1 | ● | ● | ● | ||||
| 菊苣 | RM3-3，RM3-4，RM3-6 | ● | ● | ● | ||||
| 西瓜 | A，B | ● | ||||||
| 甜椒 | 双丰R | ● | ● | |||||
| 矮牵牛 | ● | ● | ||||||
| 西葫芦 | CZW-3 | ● | ● | |||||
| ZW20 | ● | |||||||
| 康乃馨 | 4，11，15，16 | ● | ||||||
| 66 | ● | |||||||
| 959A，988A， 1226A，1351A，1363A，1400A | ● | |||||||
| 大豆 | A2704-12，A2704-21，A5547-35 | ● | ● | |||||
| A5547-127 | ● | ● | ||||||
| G94-1，G94-19，G168 | ● | ● | ||||||
| GTS 40-3-2 | ● | ● | ||||||
| GU262 | ● | ● | ||||||
| W62，W98 | ● | ● | ||||||
| 棉花 | 19-51A | |||||||
| 31807/31808 | ● | ● | ||||||
| BXN | ● | |||||||
| MON1445/1698 | ● | ● | ● | |||||
| MON531/757/1076 | ● | ● | ||||||
| 亚麻 | FP967 | ● | ||||||
| 番茄 | 1345-4 | ● | ● | ● | ||||
| 35 1 N | ● | |||||||
| 5345 | ● | ● | ● | |||||
| 8338 | ● | ● | ||||||
| B，Da，F | ● | ● | ● | |||||
| FLAVR SAVR | ● | ● | ||||||
| BiosCien(华番1号) | ● | ● | ● | |||||
| 8805R | ● | ● | ● | |||||
| 烟草 | C/F/93/08-02 | ● | ||||||
| 水稻 | LLRICE06，LLRICE62 | ● | ● | |||||
| 马铃薯 | ATBT04-6，ATBT04-27，ATBT04-30，ATBT04-31，ATBT04-36，SPBT02-5，SPBT02-7 | ● | ● | ● | ● | |||
| BT6，BT10，BT12，BT16，BT17，BT18，BT23 | ● | ● | ● | ● | ||||
| RBMT15-101，SEMT15-02，SEMT15-15 | ● | ● | ● | ● | ||||
| RBMT21-129，RBMT21-350，RBMT22-082 | ● | ● | ● | ● | ||||
| 玉米 | 176 | ● | ● | |||||
| 676，678，680 | ● | ● | ||||||
| B16(DLL25) | ● | ● | ||||||
| BT11(X4334CBR，X4734CBR) | ● | ● | ● | |||||
| CBH-351 | ● | ● | ● | |||||
| DBT418 | ● | ● | ||||||
| GA21 | ● | |||||||
| MON80100 | ● | ● | ● | |||||
| MON802 | ● | ● | ● | |||||
| MON809 | ● | ● | ||||||
| MON810 | ● | |||||||
| MON832 | ● | ● | ● | |||||
| MS3 | ● | ● | ● | |||||
| MS6 | ● | ● | ● | |||||
| NK603 | ● | ● | ||||||
| T14，T25 | ● | ● | ||||||
| TC1507 | ● | ● |
附录二
GTCGACATGTCTCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAGCAGCTGATATGGCCGCGGTT
PAT 1u PAT65tdB
TGTGATATCGTTAACCATTACATTGAGACGTCTACAGTGAACTTTAGGACAGAGCCACAAACACCACAA
GAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGTTGCAAGATA
GATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT
PAT 173r
GTGGCTGGTATTGCTTACGCTGGGCCCTGGAAGGCTAGGAACGCTTACGATTGGACAGTTGAGAGTACT
GTTTACGTGTCACATAGGCATCAAAGGTTGGGCCTAGGATCCACATTGTACACACATTTGCTTAAGTCT
ATGGAGGCGCAAGGTTTTAAGTCTGTGGTTGCTGTTATAGGCCTTCCAAACGATCCATCTGTTAGGTTG
CATGAGGCTTTGGGATACACAGCCCGGGGTACATTGCGCGCAGCTGGATACAAGCATGGTGGATGGCAT
GATGTTGGTTTTTGGCAAAGGGATTTTGAGTTGCCAGCTCCTCCAAGGCCAGTTAGGCCAGTTACCCAG
ATCTGA
序列表
<110>国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所深圳市匹基生物工程股份有限公司
<120>荧光PCR定性检测含有Pat基因转基因作物探针序列及试剂盒
<130>
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
tggccgcggt ttgtgatatc gttaa 25
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
gtcgacatgt ctccggagag 20
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
gcaaccaacc aagggtatc 19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
tgcgcgcctg ctgccttcct 20
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
cctgagaaac ggctaccat 19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
cgtgtcagga ttgggtaat 19
Claims (4)
1、一种荧光PCR定性检测含有Pat基因的转基因作物的探针，其特征在于：所述探针为Fam-TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA-AMTRA
2、一种根据权利要求1所述的探针做成的试剂盒，其组成为：
核酸提取试剂
核酸扩增试剂
Pat PCR反应液(定性)
18s-rRNA PCR反应液
Taq酶5U/ul
UNG 1U/ul
纯化水
对照品
Pat阳性对照品
18s-rRNA阳性对照品
用于检测Pat基因的探针Fam-TGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA-AMTRA，用于检测18s-rRNA的探针Fam-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-AMTRA，其中，PatPCR反应液中用于扩增Pat基因的上游引物，其序列为：GTCGACATGTCTCCGGAGAG，下游引物的序列为：GCAACCAACCAAGGGTATC；其中，18s-rRNA PCR反应液中用于扩增18s-rRNA的上游引物，其序列为：cctgagaaacggctaccat，下游引物的序列为：cgtgtcaggattgggtaat。
3、一种根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：其组成为：
组成成份(48tests/盒) 体积
CTAB法核酸提取试剂
CTAB缓冲液 40ml×1管
CTAB沉淀缓冲液 40ml×1管
沉淀溶解液 24ml×1管
核酸扩增试剂
PatPCR反应液(定性) 1ml×2管
18s-rRNA PCR反应液 1ml×2管
Taq酶5U/ul 40ul×1管
UNG 1U/ul 10ul×1管
纯化水 100ul×1管
对照品
Pat阳性对照品 30ul×1管
18s-rRNA阳性对照品 30ul×1管
试剂盒中各组分配方：
PatPCR反应液为：
10xbuffer 1x
MgCl2 2.5mM
dNTPs(u) 200uM
Taq酶(检测时另加) 2U
扩增Pat基因的上游引物 0.2uM
扩增Pat基因的下游引物 0.2uM
检测Pat基因的探针 0.1uM
模板(检测时另加) 5ul
水
终体积ul 40ul
18s-rRNAPCR反应液：
试剂成份 终浓度
10xbuffer 1x
MgCl2 2.5mM
dNTPs(u) 200uM
Taq酶(检测时另加) 2U
扩增18s-rRNA上游引物 0.2uM
扩增18s-rRNA下游引物 0.2uM
检测18s-rRNA的探针 0.1uM
模板(检测时另加) 5ul
水
终体积(ul) 40ul
CTAB法样本处理试剂
CTAB缓冲液 20gCTAB/L，1.4M NaCl，
0.1M Tris/HCl，20mM EDTA(ph＝8.0)
CTAB沉淀缓冲液 5gCTAB/L，0.04M NaCl
沉淀溶解液 1.2M NaCl
4、一种根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述的探针用作杂交探针检测含有Pat基因的转基因作物。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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2002
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 多重PCR方法检测食品中转基因成分 刘光明等，无锡轻工大学学报，第21卷第4期 2002 * |
| 荧光PCR同时检测转基因成分35S和NOS 刘光明等，检验检疫科学，第11卷第6期 2001 * |
Also Published As
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| GR01 | Patent grant | ||
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Owner name: KAJIEBIOLOGY ENGINEERING ( SHENZHEN ) CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: SHENZHEN PIJI BIOLOGY ENGINEERING CO., LTD. Owner name: SHENZHEN PIJI BIOLOGY ENGINEERING CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: PIJI BIOLOGY ENGINEERING CO., LTD., SHENZHEN CITY |
|
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Address after: R3-B, hi tech Industrial Village, Shennan Avenue, Guangdong, Shenzhen Province, China, 6F: 518057 Co-patentee after: National Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Animal and Plant Quarantine Institute Patentee after: QIAGEN (SHENZHEN) Co.,Ltd. Address before: R3-B, hi tech Industrial Village, Shennan Avenue, Guangdong, Shenzhen Province, China, 6F: 518057 Co-patentee before: National Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Animal and Plant Quarantine Institute Patentee before: Shenzhen PG Biotechnology Co.,Ltd. Address after: R3-B, hi tech Industrial Village, Shennan Avenue, Guangdong, Shenzhen Province, China, 6F: 518057 Co-patentee after: National Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Animal and Plant Quarantine Institute Patentee after: Shenzhen PG Biotechnology Co.,Ltd. Address before: R3-B, hi tech Industrial Village, Shennan Avenue, Guangdong, Shenzhen Province, China, 6F: 518057 Co-patentee before: National Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Animal and Plant Quarantine Institute Patentee before: Shenzhen PG Biotechnology Co.,Ltd. |
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| CX01 | Expiry of patent term |
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