CN1657611A - 具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂及其核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂及其核苷酸序列，克隆了新的漆酶、木聚糖酶和过氧化物酶基因，构建了漆酶、木聚糖酶和过氧化物酶基因的表达载体，将表达载体导入酵母或丝状真菌中表达，并检测出重组酶的活性。将重组表达的漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶混合酶配制成制剂，可在造纸、环保、食品和饲料等工业中应用。

Description

具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂 及其核苷酸序列

技术领域

本发明涉及一种具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂及其核苷酸序列，另外，还涉及上述制剂的制作方法和用途。

背景技术

绿色植物占地球陆地生物量的95％，其化学物质组成主要是木质素、纤维素和半纤维素，它们占植物干重的比率分别为15％～20％、45％和20％。但是要充分、有效地利用这类资源却相当困难，这是由于非水溶性木质纤维素很难被酸和酶水解。木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使酶不易与纤维素分子接触，而木质素的非水溶性、化学结构的复杂性，导致了木质纤维素的难降解性。所以，要利用或彻底降解纤维素，必须首先解决木质素的降解问题，如木质素是造纸工业中有效利用纤维素的最大障碍，造纸工业传统降解木质素的方法造不仅成了严重的环境污染和大量的能耗，也会影响纸浆中纤维素的质量。因此，木质纤维素的降解涉及降解半纤维素木聚糖和木质素的酶，它们分别是木聚糖酶(xylanase)、漆酶(Laccase)、锰过氧化物酶(Maganese peroxidase，简称Mnp)等。

用木聚糖酶对纸浆进行预漂白，可以减少随后的化学漂白用氯量30％～40％。目前，酶法助漂新工艺在欧洲和北美得到应用。加拿大已有约10％的硫酸盐法纸浆厂采用了该新工艺。丹麦诺和诺德公司和美国山道斯化学公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于纸浆处理的木聚糖酶和纤维素酶新产品。木聚糖酶处理工艺是通过降解除去纸浆表面再沉积的半纤维素等方式来帮助化学漂剂漂白的。因此，木聚糖酶只能起到助漂的作用，不能真正替代化学漂剂。要从根本上消除有毒氯漂液的污染，需最终实现生物漂白，即利用木质素酶对木质素的直接作用来实现生物漂白，包括木素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和纤维二糖脱氢酶等。日本报道，利用漆酶进行生物漂白，可以去掉50％～60％的残余木质素，减少氯漂50％～60％，然而，木质素的结构非常复杂，并且在纸浆中木质素与木聚糖形成复合体紧密地附着在纤维上，难以除去。仅依赖于一种酶的作用远远不够，利用木聚糖酶与木质素酶两种酶的共同作用有望完全降解掉纸浆中残留的木质素，实现真正意义上的生物漂白。未来生物制浆和生物漂白的技术突破将使造纸工业摆脱污染，实现清洁生产。

饲料中一般含有较多的非淀粉多糖(Non-starchpolysaccharides，NSPs)，主要包括阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、α-半乳糖苷、果胶、纤维素等。其中前二者占NSPS的30％，因单胃动物不能利用NSPs，使阿拉伯木聚糖成为一种抗营养因子；NSPs还能结合大量的水，使消化道中的食糜体积增大，粘度增加，并形成凝胶，干扰消化酶的功能和吸收作用，影响食糜在小肠中滞留，而引起微生物异常繁殖，造成动物生长受阻、饲料转化率降低，从而使其表观代谢能(AME)受到抑制。饲料中如果添加木聚糖酶，就可显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，将其分解成较小聚合度的低聚木糖，改善饲料性能，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。由于饲料中一般含有多种抗营养成分，所以添加的酶一般含有多种酶成分的复合酶，如β-葡聚糖酶、纤维素酶、漆酶、过氧化物酶、半乳糖酶等，特别是β-葡聚糖酶，与木聚糖酶协同作用，效果非常显著。

木聚糖酶在食品行业中也有广泛的应用，主要体现在它能从棉壳、甘蔗渣、玉米皮蕊等天然食物半纤维中分解得到低聚木糖。低聚木糖是由2～7个木糖，以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖，具有保健特点与功能。低聚木糖具难消化性，低热量而不会导致肥胖；有很高的双歧菌增殖活性，是肠内双歧菌的活化增殖因子；难发酵性糖，不易造成龋齿。另外，用低聚木糖可制成不同甜度的食品，可代替葡萄糖作为糖尿病人的疗效食品。生产低聚木糖最有效、副作用最少的方法是利用木聚糖酶，因此，木聚糖酶在食品行业的应用有着巨大的潜力。造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被木聚糖酶转化为D-木糖单体。而D-木糖又可被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料。因全世界所面临的能源危机问题，一定会导致对生物资源的大量需求，故木聚糖酶在能源工业的应用存在着巨大的潜力。漆酶在食品工业如啤酒的生产中也有应用，可使用漆酶等进行沉淀和絮凝的脱除，使酒类得到澄清。

降解木质素的主要酶系是过氧化物酶系，它们作用于底物的机制是夺取电子和自由基的形成，这些特点决定了它们底物的非专一性，即它们的底物不是一种而是一类或几类有机化合物。以漆酶为例，它是含铜的多酚氧化酶，它的底物涵盖了多种芳胺、酚类、二茂铁及共衍生物。鉴于木质素降解菌和它们产生的相关酶类对多种有机化合物的降解能力，因此它们也是化工废水处理研究最为活跃的领域之一，这方面已不乏成功的范例。

以上提出的木质素降解过程仍是不够全面的，还需要深入研究和探明木素自由基存在种类及化学反应特性。针对木素降解缓慢的缺点，要强化木素降解酶系动力学分析，以便实现白腐菌及其酶系的工业应用。由于白腐菌对底物非特异性机制，使得该菌不仅可应用在木素-纤维素基质加工中，如制浆、饲料生产，环境保护中，如漂白废水处理、环境芳香物降解也日益受到重视。

利用现代生物技术从丝状真菌和细菌中克隆相关基因，构建基因工程菌，大规模生产木质素降解酶，很可能是解决这个难题的十分有效途径，故这个研究领域也成为分子生物学家竞相追逐的研究热点之一。随着灵芝、云芝等药用真菌研究的深入，对它们的认识，也不应仅局限于医疗、保健方面，也应该重视它们在资源利用、工业生产、生态、环保等方面上也有不可忽视的研究价值。

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属铜蓝氧化酶(blue copper oxidases)家族中的同一小族，在结构和功能上存在着许多相似之处。由于漆酶是一种氧化还原酶，其作用主要是催化氧化还原反应。在植物体内，它主要是催化木质素的聚合过程，使木质素沉积，而真菌产生的漆酶则进行相反的过程，使木质素发生降解。利用漆酶的催化氧化还原性能可以进行化学催化反应。对漆酶基因的克隆和序列分析，实现其高表达是一个重要目的，因此一直有人在研究该基因的异源表达。Coriolus hirsutus的木素降解酚氧化酶已被克隆并在酵母系统S.cerevisiae中的表达。编码白腐菌Phlebia radiata漆酶基因克隆于软腐菌Trichoderma reesei表达系统中，用纤维素酶的启动子来启动该酶基因的表达，表达量达到20mg/L。另外，A.oryzae TATA amylase和Pichia pasti系统也成功地表达了若干种不同来源的的漆酶。

锰过氧化物酶(简称Mnp)，是一种糖蛋白，分子量约46000。由一个血红素基和一个Mn²⁺构成了它的活性中心，另外还有两个起稳定结构作用的Ca²⁺。其分子中有十条长的蛋白质单链，一条短的单链。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂及其核苷酸序列，本发明的另一个目的在于上述制剂的制作方法和用途。

为实现上述目的，本发明的具体技术方案为：

编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶重组酶的核苷酸序列，它的核苷酸序列如序列表中序列1、3、5序列所述；编码漆酶的核苷酸序列可以从灵芝(Ganodermalucidum)中获得或据此序列人工合成；编码木聚糖酶的核苷酸序列可以从短小芽孢杆菌菌株AS1菌株中获得或据此序列人工合成；编码过氧化物酶的核苷酸序列可以从杂色云芝(Coriolus versicolor)菌株中获得或据此序列人工合成。

编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶重组酶的氨基酸序列，它的氨基酸序列如序列表中序列2、4、6序列所述。

权利要求1的核苷酸序列表达载体，生产具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的重组蛋白，其特征是编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶的核苷酸序列受启动子以及终止子的调控，启动子是真菌或酵母的启动子和终止子；启动子为在丝状真菌或酵母中表达能力强的强启动子，有纤维素酶的cbh1、葡糖淀粉酶的glaA、3-磷酸甘油醛脱氢酶的gpdA或乙醇氧化酶基因(AOX1)等启动子；终止子为色氨酸合成酶基因终止子(TtrpC)或AOX1基因终止子；表达载体具有选择标记，选择标记可以是bar，hygB，pyrG，argB或Zeocin抗性基因。

制备漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶重组蛋白的方法，采用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，采用宿主细胞获得重组的漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶；漆酶重组蛋白在pH值为3-8和30-65℃的条件下都可以保持其活性，最适pH值为4-6，最适温度为40-55℃。木聚糖酶重组蛋白的特征是在pH值为4.5-9和30-80℃条件下都可以保持其活性，最适pH值为5-8，最适温度为60-70℃。过氧化物酶重组蛋白的特征是在pH值为3-8和30-65℃的条件下都可以保持其活性，最适pH值为6-8，最适温度为40-55℃。

根据权利要求4所述的方法，其特征是采用曲霉获得重组的漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶，其具体过程为含有3-磷酸甘油醛脱氢酶的gpdA启动子和色氨酸合成酶基因终止子(TtrpC)调控的编码漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶的核苷酸序列，编码漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶活性的核苷酸序列符合权利要求1和2中所述的特征，宿主可以是曲霉丝状真菌，能够在曲霉丝状真菌中表达具有功能的漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶重组蛋白，可在曲霉丝状真菌的细胞中表达，也可以分泌到胞外，从培养液中回收。

采用酵母获得重组的漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶，其具体过程为含有乙醇氧化酶基因(AOX1)的启动子和终止子调控的编码具有漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶活性多肽的核苷酸序列，编码漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶活性的核苷酸序列符合权利要求1和2中所述的特征，可用毕赤酵母作为生产重组漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶蛋白的宿主，重组漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶蛋白在宿主的细胞中表达，也可以分泌到胞外，从培养液中回收。

具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的复合酶制剂，其特征是编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶的基因在酵母或丝状真菌中表达，获得它们的重组酶，这些重组的漆酶或/和木聚糖酶或/和过氧化物酶进行混合配制成酶制剂。

具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的菌制剂，其特征是编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶的基因导入酵母或丝状真菌中后，酵母和/或丝状真菌混合制成菌制剂。

具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂的用途，所述的复合酶制剂或菌制剂用于脱木质素或漂白纸浆，其具体过程为使用复合酶制剂或菌制剂，在含有N-OH集团的芳香族反应介质、吐温或聚乙二醇烷酯非离子表面活性剂、金属离子Cu²⁺、Mn²⁺存在下，通入氧气，在30-65℃，pH值5-7的条件下，搅拌反应3-9小时，再加入EDTA或EPTA螯合除去金属离子，加入过氧化氢和亚硫酸钠漂白。

具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂的用途，所述的复合酶制剂或菌制剂用于降解苯胺、联苯胺、硝基苯、2，4-二硝基氯苯、黄曲霉毒素、五氯酚和木聚糖污染物，其具体过程为复合酶制剂或菌制剂，加入到含有污染物的废液中，在30-65℃、pH值5-8条件下，搅拌反应0.5-2小时，降解废液中污染物。

附图说明

图1灵芝漆酶和其它四种真菌漆酶的氨基酸相似性比较。四种真菌分别是：Pycnoporus coccineus；Trametes pubescens；Trametes versicolor；Polyporus ciliatus

图2 pBARGPE1

图3 A：pBARGPE-Lac漆酶表达载体转化曲霉的抗性平板B：pBARGPE1载体转化曲霉的抗性平板(阴性对照)；C：漆酶基因转化的Southern blot的鉴定结果(1#阴性对照野生型基因组总DNA；2#转化株的基因组总DNA；3#漆酶基因转化株基因组总DNA经EcoR I酶切；4#阳性对照pBARGPE-Lac质粒DNA经EcoR I酶切)

图4重组漆酶活性

图5 A：pBARGPE-mnp锰过氧化物酶基因表达载体转化曲霉的抗性平板；B：pBARMTE载体转化曲霉的抗性平板(阴性对照)；C：锰过氧化物酶基因基因转化的Southern blot的鉴定结果(1#阴性对照野生型基因组总DNA；2#锰过氧化物酶基因转化株的基因组总DNA；3#锰过氧化物酶基因转化株基因组总DNA经EcoR I酶切；4#阳性对照pBARGPE-mnp质粒DNA经EcoR和XhoI酶切)

图6重组锰过氧化物酶活性

图7载体pPICZα-CX构建图

图8转化子在含有0.4％RBB-xylan的MM平板上形成透明环及生长情况C：GS115/pPICZ/LacZ作为甲醇利用正常型(Mut+)及作为阴性对照其余为转化子包括菌株1-6

图9菌株1-6号发酵4天上清液蛋白SDS-PAGE图(泳道1-6：分别为菌株1-6发酵4天上清液蛋白电泳图；泳道7：为对照发酵4天上清液蛋白电泳图；泳道8：蛋白低分子量Marker)

具体实施方式

灵芝、云芝是漆酶的高产白腐真菌，为了分离完整的漆酶基因，首先构建灵芝或云芝的基因组文库，将灵芝或云芝基因组DNA进行部分酶切，回收9-23kb的片段，构建成λ噬菌体文库。筛选基因组文库，得到阳性克隆，进行亚克隆，并测序，测序结果见序列表中的序列1。得到的序列经DNA序列、氨基酸序列以及蛋白质保守功能区域的同源性比较，证实克隆的是一种新的漆酶。为了高效率的分离新漆酶的cDNA序列，构建了cDNA均一化文库，设计并合成了探针，从文库中得到10个阳性克隆，测序，将得到的序列与基因组序列比较，并翻译成氨基酸序列，见序列表中的序列2，通过NCBI Conserved Domain Search氨基酸保守序列的分析，证明得到的蛋白是一种新的multicopper oxidases，在组氨酸及其附近的序列高度保守。漆酶属于铜蓝氧化酶家族，由此可见我们克隆的基因可能是漆酶基因。为了进一步鉴定所克隆的基因，把氨基酸序列与已克隆漆酶基因的氨基酸序列，进行了相似性比较。从cDNA序列推出该漆酶由511个氨基酸组成，与四种真菌漆酶的相似性比较可以发现，在氨基酸序列的COOH端和NH2端有四个漆酶高度保守的序列(图1)，这些序列参与铜原子的的螯合，是形成氧化还原中心的重要序列。COOH端的保守氨基酸序列是：PHPFHLHGH和PWFLHCHIDFHL；在NH2端保守氨基酸序列是：SIHWHGLFQ和TFWYHSHLSTQYCDGLRGP。其中，组氨酸(His)与铜原子配位，构成具有氧化还原功能的立体结构。与漆酶LCC3-1(Polyporus ciliatus)的同源性为70％；与Laccase(Pycnoporuscoccineus)的同源性为68％，与Laccase 2(Trametes pubescens)的同源性为66％；与Laccase I(Trametes versicolor)的同源性为67％。

为了大量生产漆酶，构建了漆酶基因的表达载体，将新漆酶的DNA序列或cDNA序列置于强启动子的调控下，优先采用真菌的启动子和适于在真菌中生产重组蛋白的表达载体。真菌表达载体pBARGPE质粒(图2)带有真菌启动子(Pgpd)和终止子(TtrpC)，并携带有分解PPT的bar基因，漆酶全长cDNA克隆进表达载体pBARGPE。构建好的pBARGPE-Lac(图3)漆酶表达载体，通过电激法或PEG法导入黑曲酶(Aspergillus niger)，pBARGPE-Lac漆酶表达载体含有bar基因，能使重组子产生PPT抗性，漆酶能氧化ABTS并生成蓝色环斑，从图4可看出，pBARGPE-Lac整合进黑曲酶的基因组中，在PPT平板上产生篮斑，Southemblot证实漆酶基因已导入宿主细胞。通过发酵方法生产重组漆酶，采用愈创木酚法测定了重组漆酶的活性(图5)，漆酶活性在培养第六天达到最大值(70.8U/ml)。

依据云芝(Coriolus versicolor)依赖锰过氧化物酶基因(manganeseperoxidase isozyme MP2)序列设计了两条引物Mnperox1和Mnperox2，通过RT-PCR的方法扩增出了1098bp的片段，与报道的基因有97％的相似性，如序列表序列5所示，根据克隆的序列翻译出的氨基酸序列与报道的依赖锰过氧化物酶(manganese peroxidase isozyme MP2)的氨基酸序列仅在第198位氨基酸有差别，氨基酸变化为：Ala198→Thr198，如序列表序列6所示。采用与生产漆酶重组蛋白的方法，生产依赖锰过氧化物酶。锰过氧化物酶基因全长cDNA克隆进表达载体pBARGPE1，通过PEG介导法导入黑曲酶(Aspergillus niger)，pBARGPE-mnp锰过氧化物酶基因表达载体含有bar基因，能使重组子产生PPT抗性，锰过氧化物酶基因能氧化ABTS并生成蓝色环斑，从图6可看出，在PPT平板上产生篮斑，Southern blot证实锰过氧化物酶基因已导入宿主细胞。

短小芽孢杆菌xylanase耐温耐碱，生化性质稳定，在工业上有广泛地用途。本专利克隆了短小芽孢杆菌菌株AS1，127的xylanaseB基因，并研究了其在毕赤酵母中的表达。采用PCR方法克隆到与短小芽孢杆菌xylanase基因(XYNA)序列同源的序列，DNA序列有约7％差异，氨基酸序列有约6％差异。由于克隆的XYNB是根据同源基因XYNA设计引物，而XYNB的5’端与3’端序列可能与XYNA不同，为了得到完整的基因序列，用反向PCR的方法扩增5’端与3’端序列。根据已确定的XYNB基因序列，在其基因内部设计一对反向PCR引物：引物1：5’TAATTCATAATCGATCCGCT 3’，引物2：5’CTATCTATGTGTCTATGGCT 3’，测序后与第一次PCR结果合并，得到完整的木聚糖酶基因，由于xylanaseB基因的5’端与3’端序列与其同源基因XYNA有差异，因此，再把此基因DNA序列和推测的氨基酸序列与XYNA进行序列同源性比较，比较结果表明此基因DNA序列与XYNA长度完全一样687bp(含终止密码子)，如序列表序列3所示，DNA序列有8％差异，推测的氨基酸序列有7％差异，如序列表序列4所示。选用酵母分泌表达表达载体pPICZα-C，克隆到的xylanaseB基因插入到酵母表达载体pPICZa-C的多克隆位点上，新质粒命名为pPICZα-CX(图7)，鉴定载体正确后。将构建好的载体pPICZα-CX利用电激法，将其转入培养好的酵母细胞中，电激后取100μl涂于含有100μg/mL Zeocin的YPDS平板中，筛选出基因拷贝数高的菌株。将转化子点种于含有0.4％与蓝色RBB偶连的木聚糖MM平板上，生长3天，转化子分泌地xylanase会将的蓝色RBB-xylan底物分解成无色物质(图8)。取发酵上清液SDS-PAGE分析，根据其氨基酸组成准确计算出的分子量为22.2kDa。从SDS-PAGE结果可以看出，转化子在约22kDa出现明显的蛋白泳带，而未转化的毕赤酵母未出现此带。因此，xylanaseB基因在转化的毕赤酵母中成功地分泌表达出了xylanaseB(图9)。对菌株1发酵上清液不同时间表达的蛋白和菌株1-6发酵4天发酵上清液蛋白分别用Bradford法和DNS法测定蛋白含量与酶活力，结果如表1、表2所示。随发酵时间增加，蛋白含量也增高，第4天蛋白含量最高，酶活力最高，SDS-PAGE电泳带也最亮。虽然第4天蛋白含量比第3天增高24％，但酶活力只增加14％，酶活力达到81.2U/ml，木聚糖酶重组蛋白含量达到67.8μg/ml。对此酶稳定性测定结果表明，在pH6.0，50℃下为此酶最适条件，此酶在pH6.0，50℃，16小时后，仍可保留42％的活性，在pH8.9，50℃，16小时后，仍可保留12％的活性。以上结果显示，此酶在工业上有很广泛地用途。

	发酵1天	发酵2天	发酵3天	发酵4天
					OD595	0.125	0.223	0.272	0.335
蛋白含量(μg/ml)	25.1	45.0	55.0	67.8
					OD540	0.584	1.122	1.406	1.615
酶活力(U)	30.6	57.0	70.9	81.2

    表1  菌株1发酵上清液不同时间表达的蛋白含量与酶活力

	菌株1	菌株2	菌株3	菌株4	菌株5	菌株6
							OD595	0.335	0.297	0.198	0.230	0.075	0.065
蛋白含量(μg/ml)	67.8	60.1	39.9	46.5	14.9	12.9
							OD540	1.615	1.462	1.053	1.234	0.333	0.308
酶活力(U)	81.2	73.7	53.6	62.5	18.2	17.0

      表2  菌株1-6发酵4天发酵上清液蛋白含量与酶活力

实施例1  漆酶基因的克隆

1.构建基因组文库

取菌丝生长旺盛的摇瓶，菌丝用4-6层纱布过滤，风干菌丝。在液氮中研成细粉，及时转入50mL的离心管中，加入10-20mL提取缓冲液(500mmol/LNaCl；100mmol/L tris-HCl pH8；50mmol/L EDTA pH8；10mmol/L β-巯基乙醇)，轻轻旋转混匀。加入1-3mL20％SDS(pH7.2)，混匀，65℃水浴保温20～30分钟，并经常轻轻混匀。加入5-10mL 5mol/L KAC，混匀后冰浴20～30分钟。10000rpm，4℃离心10分钟。取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，10000rpm，4℃离心10分钟。取水相，准确加入0.6-1倍体积的异丙醇，轻轻混匀，冰上放置10分钟，7000rpm，4℃离心10分钟，沉淀用70％乙醇洗涤，离心后溶于无菌双蒸水中。加入30μl DNase-free RNase(10mg/mL)，37℃温育30分钟。加入等体积的酚/氯仿，混匀，10000rpm，4℃离心10分钟。取水相，加入0.6倍体积异丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤，略风干，溶于TE中。用Sau3AI部分酶切基因组总DNA，回收9～23Kb的片断。0.4-0.6％低熔点琼脂糖(1×TAE Buffer)电泳分离DNA片段，回收9～23Kb片段，称量胶的重量，加入1/10体积的10×Agarase buffer，65℃下30分钟，熔解胶，再转入37℃保温，加入Agarase消化1小时，加入1/10体积的3M醋酸钠，冰上放置30分钟，1,3000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清转入另一支干净的1.5ml的离心管，加入2倍体积的乙醇，-20℃沉淀DNA30分钟，1,3000rpm离心10分钟，70％乙醇洗涤，略干燥，溶于30μl水中。DNA酶切片段与载体在T4 DNA ligase的作用下，置于4-16℃下连接4-24小时。置于冰上溶解包装提取物，加入4μl连接产物，22～24℃下包装3-4小时。加phage buffer至250μl，并加入10～12μl氯仿，混匀，4℃下可保存4星期。

2基因组文库的筛选和阳性克隆的鉴定

用接种环挑取E.coli KW251或L325，在LB平板上划线，置37℃倒置过夜培养。从E.coli KW251LB或L325平板上挑取单菌落，培养过夜。在10ml的玻璃管中加入30μl 1M MgSO4和2.8ml熔化的上层琼脂，混匀，置47℃至少温育30分钟。分别取各稀释度的噬菌体0.1ml与0.1ml新鲜培养的E.coli KW251或L325混匀，37℃培养30分钟，使噬菌体吸附细菌。噬菌体和细菌的混合物转入上层琼脂中，轻轻混匀，避免产生气泡，迅速均匀铺到下层琼脂上，室温下放置，使上层琼脂硬化。转入37℃培养箱，培养16小时。平板置于4℃下1.5小时。平板转入室温，小心慢慢地把硝酸纤维素膜铺到噬菌体平板，，保持3-5分钟，使DNA转移到膜上。膜置于变形液湿润的Whatman滤纸上4分钟。转到另一张被中性液湿润的Whatman滤纸上4分钟。在空气中干燥膜，用两张Whatman滤纸夹住膜，置于120℃，烤膜40分钟。室温用5×SSC浸泡5分钟，平衡膜。

1μg模板DNA(线性或超螺旋)用无菌双蒸水调节终体积为16μl，沸水浴10分钟，在冰浴中快速冷却。充分混合DIG-High引物标记溶液，并加4μl到盛有模板DNA的反应管中，混匀并且短暂离心。然后37℃温育1小时或过夜。加2μl0.2MEDTA(pH8.0)终止反应，并且/或65℃加热10分钟终止反应。预热一个适当体积的DIG Easy Hyb杂交液(10mL/100cm2尼龙膜)到杂交温度(37～42℃)，然后用它预杂交膜30分钟；煮沸5分钟以变性DIG标记的DNA探针(约25ng/mL)，然后迅速在冰浴中冷却；加变性的DIG标记的DNA探针到另一份预加热到杂交温度的DIG Easy Hyb杂交液(3.5ml/100cm2尼龙膜)中，充分混匀，避免气泡；倒出预杂交液，然后加探针/杂交液混合物到膜上，杂交4小时或过夜。杂交后，先用2×SSC，0.1％SDS在15-25℃，持续摇动下，洗2×5分钟。6.再用0.5×SSC，0.1％SDS(预热到洗涤温度)在65-68℃，持续摇动下，洗2×15分钟。

用洗液短暂地冲洗膜1～5分钟；在100mL封闭液中放置30分钟；在20mL抗体溶液中放置30分钟；在100mL洗液中洗2×15分钟；在20mL检测缓冲液中平衡2～5分钟；在暗室中用一个合适的容器盛10mL新制备的颜色底物溶液，将膜放入其中显色。在颜色发展期间不要摇动。反应通常在16小时后完成。当所需点或带的明暗度合适时，用50mL无菌双蒸水或TE缓冲液洗膜5分钟以停止反应。结果可通过照相方式记录下来。

根据带有阳性信号的杂交膜，用牙签切下平板上相对应的阳性噬菌斑(第一轮筛库可能不能分离到单噬菌斑)，转入1.5ml的离心管中，并加入1ml的phage elution buffer，在室温下放置4小时，使噬菌体颗粒释放，间或摇动。转移上清至另一新管中，加入20μl氯仿，可在4～5℃存放4～5星期。按照第一轮筛库的方法，测定滴度，重新铺板，进行第二轮的筛库，直至板上的噬菌斑全是阳性克隆。取10μl滴度为1×10⁵噬菌体加入240μl phage buffer，250μl新鲜培养的E.coli KW251混匀，37℃培养30分钟，使噬菌体吸附细菌；把上述混合物加到50ml的新鲜制备的LB细菌培养基中，添加500μl 20％麦芽糖和500μl 1M MgSO₄；37℃，250rpm培养，直至裂解发生，培养物变澄清。收集的培养物9000×g，4℃下离心10分钟，弃去沉淀，把上清转入另一支管中，并加入20～40μl氯仿，可在4℃存放5星期；上清中加入2～4μg/mlRNase A和DNase I，37℃下消化30～60分钟。；加入与裂解液等体积的phage precipitationbuffer(30％PEG 8000/2M NaCl)，在冰上放置一小时；12000×g，4℃下离心15分钟，弃去上清，在室温下干燥沉淀5～10分钟；每10ml最初的噬菌体裂解液加入1mlphage release buffer，悬浮噬菌体颗粒，振荡，混匀；5000×g，4℃下离心4分钟，小心转移上清至另一支新管，弃去沉淀；加入等体积的TE饱和的酚/氯仿，振荡一分钟，10000×g，4℃下离心10分钟，转移水相至另一支新管中；重复上一步；转移上层水相至另一支新管中，并加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡一分钟，10000×g，4℃下离心10分钟，转移水相至另一支新管中；加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，在-20℃沉淀2小时；室温下10000rpm离心15分钟，弃上清，用70％乙醇漂洗沉淀，待乙醇挥发完，溶于50μl的TE或灭菌的ddH₂O中。纯化的重组噬菌体DNA经SalI酶切，电泳，用QIAGEN GelRecovery Kit回收片段，测序。得到漆酶的序列，如序列表序列1所示。

3构建灵芝cDNA均一化文库

每50～100mg菌丝体中加1ml TRIZOL，使用玻璃匀浆器匀浆样品，样品体积不应超过TRIZOL的10％。放置均匀化的样品在15～30℃、5分钟，以便使核酸、蛋白复合物完全解离。每1ml TRIZOL中加0.2ml氯仿。盖上管盖，用手用力混匀样品15秒，15～30℃下放置2～3分钟。2～8℃、不超过12000×g离心样品15分钟。离心后分成三相：一个底层红色的苯酚、氯仿相，一个中间相，一个无色的上层水相。RNA全部存在于上层水相中，水相的体积大约占TRIZOL试剂的60％。转移水相到一个新的管子，如果还需分离DNA或蛋白质应保留有机相。水相中加入异丙醇以沉淀RNA。每1ml TRIZOL中加0.5ml异丙醇，15～30℃放置样品10分钟，2～8℃、不超过12000×g离心样品10分钟。RNA沉淀再离心前常不可见，离心后形成一个胶样的沉淀物。移去上清液，用75％乙醇洗RNA沉淀1次，每1ml TRIZOL中至少加1ml 75％乙醇，混匀，2～8℃、7500×g离心5分钟。短暂干燥一下RNA沉淀，溶于无RNase的水中。采用Oligo(dT)纤维素将Poly(A)+RNA从全RNA中分离出来。在微量离心管中准备反应液，全量50μl(模板RNA5μg，溶液5×1st Strand Synthesis Buffer10μl，dNTP Mixture5μl，RNase Inhibitor 5μl，反转录引物5μl，RTase(RAV-2)100U，加DEPC-H₂O至50μl)。轻柔搅拌混匀。室温放置10min后，移至42℃恒温水浴槽内。42℃反应1小时。反应结束后置于冰中冷却2分钟。在第一条链合成后的微量离心管中再加入下面反应液，全量202.5μl(5×2nd Strand Synthesis Buffer50μl，加DEPC-H₂O至202.5μl)。加入32.5μl E.coli DNA Polymerase I和5μlE.coli RNase H/E.coli DNA Ligase Mixture，轻轻搅拌。12℃反应1小时。22℃反应1小时。70℃加热10分钟。加入10μl T4 DNA Polymerase，轻轻搅拌。37℃反应10分钟。加入25μl 0.25 M EDTA(pH8.0)以及25μl 10％SDS溶液，混合使反应停止。第二链cDNA，加上lone接头，纯化；用sseA引物扩增cDNA。纯化；用50mg扩增后的cDNA在65℃做杂交至COt为5至50之间；羟基磷灰石柱层析分离单链，Centricon超滤，用sseA引物扩增cDNA，纯化。均一化进行三次。所得产物用Sse8387I/Not I消化，克隆至SK-的Pst I/Not I位点。挑取白色菌落至96孔板，-70℃保存。

根据克隆的漆酶基因的高度保守序列，设计了一条5’-端磷酸化的反转录引物RT1。反应按照5’-Full Core Set(Takara)的方法进行。1st Strand cDNA的合成反应体系为：AMV Reverse Transcriptase XL 1 l(5U/μl)，Total RNA5μg，10×RT Buffer 1.5μl，RNase Inhibitor 0.5μl(40U/μl)，5’端磷酸化引物RT1 1μl(1μg/μl)，加RNase Free dH₂O至15 l。反应条件为：30℃10min，50℃30min，80℃2min。在上述cDNA溶液中加入5×Hybrid RNA DegenerationBuffer 15μl，加dH₂O至75μl，再加入1μl RNase H，30℃反应1小时，降解RNA，反应结束后进行乙醇沉淀。在经乙醇沉淀的单链cDNA中加入5×RNA(ssDNA)Ligation Buffer 8μl，40％PEG6000 20μl，加dH2O至40μl，加入1μl T4 RNALigase，16℃反应15～18小时。在反转录引物的内侧设计了两对反向嵌套PCR引物LacA1\LacS1和LacA2\LacS2，扩增5’-末端的cDNA片段。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃1min，50℃30s，72℃60s，进行30cycle，72℃延伸7min。PCR产物回收测序。根据5’-RACE设计扩增全长cDNA的上游特异引物LSH1和下游特异引物LSH2，以均一化cDNA文库为模板，扩增全长cDNA序列。采用two-stepcycle程序进行PCR，条件是：7 cycle：94℃，25S；72℃，3min；32 cycle：94℃，25S；67℃，3min；循环完成后，67℃延伸10min。PCR产物电泳，从凝胶中回收DNA，取10ul纯化的PCR产物，进行末端加A的处理：反应体系如下：10ulDNA，5ul 10×tail-A buffer；2μl dATP；2unit Taq酶；加水至50μl。反应条件为：72℃10 min。用nucleotid removal Kit纯化DNA，并与pMD18-Tvector连接，转化，挑单菌落，鉴定阳性克隆，测序。测得的序列如序列表序列1所示。

实施例2漆酶基因的表达

以已克隆的灵芝漆酶全长cDNA克隆到丝状真菌表达载体上，构建成pBARGPE-Lac重组表达载。pBARGPE1质粒带有真菌启动子(Pgpd)和终止子(TtrpC)，并携带有分解PPT的bar基因，pBARGPE1经EcoR I和Xho I酶切后，酶切产物用凝胶电泳回收。并与制备的带有EcoR I和Xho I粘性末端的灵芝漆酶全长cDNA在16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，酶切鉴定。

制备曲霉原生质体的制备：取生长旺盛的孢子，然后以3000～5000转/分钟离心5～10min，去上清液，用0.5～0.8mol/L的渗透压稳定剂(1M山梨醇)溶液洗涤1～3次，加入用渗透压稳定剂配制的Novozyme，30℃酶解1.5～3.0小时；将上述酶解液用G3砂芯漏斗过滤，滤液经离心去上清液，再用渗透压稳定剂洗涤1～3次，得到纯化的原生质体。

用1M肌醇/50mM Tris.Cl(pH8.0)/50mM CaCl₂调制5mg/ml的肝素，配好的肝素用过滤器灭菌，1ug pBARGPE-Lac加入5μl亚精氨，20μl肝素，150μl曲霉原生质体，冰浴30分钟，每份样品加40％PEG4000//50mMTris·Cl(pH8.0)/50mM CaCl₂到1.5ml，室温下放置20分钟，同时底层培养基趁热加过滤灭菌的FIGS，每个平板倾倒15ml底层培养基，将DNA从eppendorf管转移到无菌的50ml离心管，与添加了FIGS的上层培养基(45℃下保温)混合，倒在凝固的底层培养基上。

漆酶活力测定的程序如下：10.0ml反应混合液中含50mmol/L琥珀酸钠缓冲液(pH4.5)，0.4mmol愈创木酚和0.5ml粗酶液30℃反应30min后于465nm处测定吸光度酶活单位定义为以酶液事先灭活后的反应混合液为对照以1min内催化氧化1nmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位(u)已知465nm处愈创木酚摩尔消光系数λ465＝1.21×104M-1.cm-1。酶活力为75u/ml。

实施例3  木聚糖酶基因的克隆

以已知的短小芽孢杆菌木聚糖酶同源基因(P00694)设计简并引物。设计一对引物：引物1：5’GATGAATTCAEGAATTTGAGAAAATTAAG 3’，引物2：5’GATGGATCCTTAGTTGCCAATAAACATCT 3’，用PCR扩出其序列，并进行测序，所得序列见序列表。用DNASIS分析此木聚糖酶基因的酶切位点。选一种此木聚糖酶基因无酶切位点四碱基酶，用此酶切消化基因组DNA。5μgDNA用限制性内切酶消化完全后，苯酚、氯仿各抽提一次，无水乙醇沉淀，溶于20μl。无菌的去离子水中。测定OD260及OD280，确定DNA的纯度及含量。取大约200ng消化了的总DNA进行自身环化连接反应。体系中总DNA浓度约为20ng/μl；T₄DNAligase浓度为1U/μl。连接反应在10℃-12℃下进行24-48小时。取1μ用来做PCR，并进行测序，获得全长的木聚糖酶序列，序列如序列表序列3所示。

实施例4  木聚糖酶基因表达

准备线形化DNA(含有所克隆的木聚糖酶基因的pICZαC重组质粒)：(1)DNA用Sac1切DNA 1小时以上。(2)取酶切线形化DNA补水至300ul，加300ul酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)颠倒混匀。(3)离心12000rpm，5分。(4)取上清，加750ml乙醇，30ul NaAc，-20℃，30分钟。(5)离心，12000rpm，10分。(6)80％乙醇清洗。(7)吹干。(8)加入10ul水。

准备对数生长期酵母菌：(1)挑单菌落接种于5ml YPD液体培养基30℃培养过夜。(2)取过夜培养的菌液0.1-0.5ml接种于50ml新鲜YPD液体培养基，再30℃培养至OD600＝1.3-1.5。(3)在+4℃，1500Xg离心5分钟，用50ml0℃无菌水重悬菌体。(4)离心同上，再重悬于25ml0℃无菌水。(5)离心同上，重悬于20ml0℃1M山梨醇溶液。(6)离心同上，再重悬于1ml0℃1M山梨醇溶液，置于冰上(当天使用)。

电击：(1)将制备的细胞80μl和5-90μg线性化DNA注入0℃电击池，混匀，置冰上5分钟。(2)据酵母脉冲参数处理细胞。(电压：1500V；电容：25μF；电阻：400Ω；次数：1次；时间：8.9s)。后即加1ml0℃1M山梨醇溶液到电击池内，混匀。(3)再将池内液体转置1.5ml EP管，30℃培养1-2小时。(4)取100μl菌液涂布于含ZeocinTM 100μg/ml的YPDS平板，剩余菌液全涂布于另一含ZeocinTM 100μg/ml的YPDS平板，30℃培养3-4天。

重组酵母的发酵培养：(1)挑取酵母转化子单菌落接种于2.5mlBMGY中，置于50ml锥形瓶中，在28-30℃，250-300rpm摇瓶培养至OD600＝2-6(大约16-18个小时)，酵母细胞达到对数生长期。(2)3000rpm，室温下，离心菌体5分钟，去上清，菌体重悬于10-20mlBMMY中，至OD600＝1。置于100ml锥形瓶中盖两层纱布，继续摇瓶培养。(3)每隔24小时加入100％甲醇至终浓度0.5％，保持诱导。(4)每次加甲醇之前收集一次培养物(即在培养的不同时间段24，48，72，96小时，分别取样)，每次取培养物2ml，12000rpm离心3分钟，取上清贮于-20℃，等待分析。(5)SDS-PAGE。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达的重组蛋白。

取9支试管，分别稀释样品至9个稀释度，用空白管溶液调零点，测OD540值，每个样测三次，取平均值。以木糖浓度为横坐标，OD540值为纵坐标，绘制标准曲线。

在最适温度和pH值的酶活测定：取0.5ml 0.2M，pH6.0磷酸缓冲液，加入蒸馏水0.4ml和含4％燕麦木聚糖溶液0.05ml(即酶反应液为0.2％燕麦木聚糖pH6.0，0.1M磷酸缓冲液)，加入0.05ml用pH6.0磷酸缓冲液稀释10倍的酶液，以空质粒转化的酵母发酵液为空白对照，50℃反应5min，加入DNS试剂0.75ml，煮沸5min，立即用流动冷水冷却，加入1.75ml水，测定OD540，每个样测三次，取平均值，以每min生成1μmol还原糖作为1个酶活单位(IU)，测酶活力条件以下均同(除温度，酶反应缓冲液pH值做出相应变化，以及在测pH值对木聚糖酶活力的影响时，用相应pH值缓冲液稀释酶液，其他用pH6.0磷酸缓冲液稀释酶液)。

不同温度对木聚糖酶活力的影响：酶反应液在不同的温度(30℃，40℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃)的水浴中预热5min，而后在每管中同时加入0.05ml用pH6.0磷酸缓冲液稀释10倍的酶液，在不同的温度反应5min，测定酶活力。

不同温度对木聚糖酶稳定性的影响：取pH6.0磷酸缓冲液稀释10倍的酶液0.5ml，加入到9ml的pH6.0磷酸缓冲液中，分别取0.95ml在不同的温度(30℃，40℃，50℃，55℃，60℃，70℃，80℃)的水浴中各放置1h，而后在每管中同时加入含4％燕麦木聚糖溶液0.05ml，50℃反应5min，定义未保温酶在反应温度50℃的相对酶活力为100％，计算出各个温度的相对酶活。

不同pH值对木聚糖酶活力的影响：不同pH值(4.0，4.6，5.0，5.6，6.0，6.5，7.0，8.0，8.9，10)的酶反应液各0.95ml在50℃的水浴中预热5min，而后在每管中同时加入0.05ml用相应pH值缓冲液稀释10倍的酶液，50℃反应5min。

不同pH值对木聚糖酶稳定性的影响：不同pH值(4.0，4.6，5.0，5.6，6.0，6.5，7.0，8.0，8.9，10)的缓冲液各0.9ml，在每管中同时加入0.05ml用相应pH值缓冲液稀释10倍的酶液，在50℃的水浴中放置60min，而后在每管中同时加入含4％燕麦木聚糖溶液0.05ml，50℃反应5min，定义未保温酶的在pH6.0，反应温度50℃相对酶活为100％，计算出各个温度的相对酶活。

木聚糖酶在pH值为8.9，温度50℃下的稳定性：取用pH8.9Tris-HCl缓冲液稀释10倍的酶液0.5ml，加入到9ml pH8.9Tris-HCl缓冲液中，在50℃水浴中保温，在不同时间(0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，16h)取0.95ml，加入含4％燕麦木聚糖溶液0.05ml。50℃反应5min，定义未保温酶的反应温度为50℃的相对酶活为100％，计算出各个时间的相对酶活。

用SDS-PAGE检测到xynalaseB的表达，Bradford法和DNS法检测到六个转化子中表达量最高的为67.8μg/ml，酶活力为81.2U/ml。并且检测结果表明抗性越高，表达量越高，即整合到酵母基因组中XYNB拷贝数越高，表达量越高。对此酶稳定性测定结果表明，在pH6.0，50℃下为此酶最适条件，此酶在pH6.0，50℃，16小时后，仍可保留42％的活性，在pH8.9，50℃，16小时后，仍可保留12％的活性。

实施例5  依赖锰过氧化物酶基因的克隆

根据报道的云芝(Coriolus versicolor)的序列设计了两条引物，反应按照RT-PCR Kit(Takara)的方法进行。反应体系为：5μl 10×RT Buffer，10μlMgCl2，10μl dNTPmixture，1μl Mnperox1引物，1μl Mnperox2引物，AMV ReverseTranscriptase XL 1l(5U/l)，Total RNA 5g，TaqDNA聚合酶1l，加水至50l。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃2min，进行30cycle，72℃延伸10min。PCR产物用PCR purify Kit纯化，并与pMD18-T Vector连接，转化，挑取单克隆，鉴定阳性克隆，测序如序列表中序列5所示。

实施例6  依赖锰过氧化物酶基因的表达

pBARGPE-mnp丝状真菌表达载体的构建：pBARGPE1质粒带有真菌启动子(Pgpd)和终止子，并携带有分解PPT的bar基因，pBARGPE1经EcoR I和Xho I酶切后，酶切产物用凝胶电泳回收；并与制备的带有EcoR I和Xho I粘性末端的锰过氧化物酶基因全长cDNA在16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，酶切鉴定。

pBARGPE-mnp转化曲霉：曲霉原生质体的制备和转化方法方法同实施例2。

从转基因的曲霉中提取锰过氧化物酶，并采用愈创木酚法测定锰过氧化物酶的活力：反应液含0.4mmol/L愈创木酚，0.1mmol/L H2O2，0.2mmol/L MnSO₄和50mmol/L琥珀酸钠缓冲液，pH4.5。测定反应液在465nm处的吸光度在单位时间的增加数，这是由于愈创木酚被氧化引起的。一个活力单位定义为每分钟引起A_465nm一个单位变化所需的酶液量。酶活力为7.3u/ml。

上述实施例中具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂的用途，复合酶制剂或菌制剂可以用于脱木质素或漂白纸浆，其具体过程为使用复合酶制剂或菌制剂，在含有N-OH集团的芳香族反应介质、吐温或聚乙二醇烷酯非离子表面活性剂、金属离子Cu²⁺、Mn²⁺存在下，通入氧气，在30-65℃，pH值5-7的条件下，搅拌反应3-9小时，再加入EDTA或EPTA螯合除去金属离子，加入过氧化氢和亚硫酸钠漂白。

上述实施例中具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂的用途，复合酶制剂或菌制剂还可以用于降解苯胺、联苯胺、硝基苯、2，4-二硝基氯苯、黄曲霉毒素、五氯酚和木聚糖污染物，其具体过程为复合酶制剂或菌制剂，加入到含有污染物的废液中，在30-65℃、pH值5-8条件下，搅拌反应0.5-2小时，降解废液中污染物。

<110>李宝健  程度

<120>具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的重组酶制剂

<160>6

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>3573

<212>DNA

<213>灵芝(Ganoderma lucidum)

<400>1

cgtttttggc cagccactgc gtctttttgt tcgcagcgtt gactcgggac ttggactagc    60

ccccttcacc ttgactcccc tgcatgttgt ggtcgcagac gtggccagca cagctcaacc    120

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tacgtagatg atgaaatttc cctcgatgtt gggataccga ccgtcctttc acagttatcg    1740

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acctcacggt cattgaagcg gatggcgtcg agacccagcc cgtcaccgtc aacagcatca    1860

acatcttcgc cgcccagcgt tattcgtttg tggtgagtat ctttgtagtg agcattttgg    1920

gagcggggct gaaatggtat cgtgccttca gctcactgct aaccaaacaa tcgacaacta    1980

ctggattcga gccaacccct cccttggtgt catgggcttc gatgctggca tcaactccgc    2040

gatcctgcgc tacgacgggg ctgcaccagt cgagcctgtg acgtcgccgc agtcaacgca    2100

gatccttctc aacgagaccg acctccatcc ttacgtcccg aggaagacgg tatgcgatca    2160

ttcttctttc cccgtggtaa catgtcatgt taagcacatc ccctcatccg acgtgcagac    2220

tggaaagcct gagaagggtg gtgtcgacct gccgctcaac atggtaaacg gcttcgacgg    2280

cacggacttc ttcatcaaca acgccacctt cgtccctccc accgtccctg tcctccttca    2340

gatcctaagt ggcacgcagg ctgcccagga cctcttgccg gccggtagcg tctacacgct    2400

cccgaagaat gcgtctatcg agatcacgtt ccctgccaac gccaacgcgg ctggcagccc    2460

ccaccccttc cacctacacg gtgtaagtcc tcatcttctg ccttcccctt ccatgcataa    2520

ttcaacgctc acccgcactc ttcctcctta cctcaatagc ataccttcgc agtgatccgc    2580

agcgccggct cgaccgcgta caactacgac aaccccgtgt ggcgcgacac tgtctcaact    2640

gggctcgcct ccaacaacga caacgtcacg atccgcttcc agacggacaa cgccgggccg    2700

tggttcctcc actgccacat cgacttccac ctcaacgcgg gcttcgccgt cgttcttgcc    2760

gaggacgtgc cagacatcgc gcgcgcgaac ccagtgccgc aggcgtggaa gaacttgtgc    2820

ccgacgtacg acgcgctctc gcccaacgac cagtgagcgc tggatgttga atcggtgcgc    2880

cgaccttcgc gggccgaagt ttgcacaggg acattgatac ttaatttgga ttatacctta    2940

cgttcgttct ttagtccgaa tgcgctccat tgtatcttgc ctgaacagtc ctactcttgt    3000

aattaccata ttcttatttg tagttcgtag tctaagtcaa taccagtcga tggttatcgc    3060

ttcttctatc agctgggcga cgtctacgca gacaagaagt ccgccttcct ccaagcctct    3120

agccaagtcc gcgcccgctc ttcgtccagc tgcggtagcc gtgccaacga ctcggatacc    3180

cgcaccgcct tatccgttgc gatgaacacg aggcccatcg cctccctatc cggcgcgccc    3240

tcggtcgtct cgccctgcgc cttgtagaat gacagaaggc gaagcgcggg gttaaggcgc    3300

atcgcctcga cttcctccgc ggagcctcgc tcgacactgc cttcaagcgc ggagagccac    3360

tcggcgtacg gcacgagagg gatatcgagt tcctgtgcga gtggagcgag cagtgtggtc    3420

cacgatactg ggcgggggtg cacgagatgg acgatcggct cagacgagcg gacatctcca    3480

cgaacgcccg cgcggcctcg tacgccggga cccatgccac tctctaagaa tacagaaatt    3540

gattgagtcc gatagccttg gggggaaccg tat

<210>2

<211>512

<212>PRT

<213>灵芝(Ganoderma lucidum)

<400>2

MAGLQSFLPY FPLLFAASAY AAIGPVANLT ISDADIAPDG FTRAAVVVNG VSPGPLITGN

60

KGDNFQINVI NQMTNHTMNK TTSIHWHGLF QEGTNWADGP AFVTQCPIVS GNSFLYNFHV

120

PDQATFWYHS HLSTQYCDGL RGPLVVYDPH DPLAHMYDVD ADSTVITLTE

WYWTASHLGT     180

RFPLLADSTL INGLGRTTAT SNAELAVVNV TQGKRYVDDE ISLVSTSVID GHDLTVIEAD

240

GVETQPVTVN SINIFAAQRY SFVLTANQTI DNYWIRANPS LGVMGFDAGI NSAILRYDGA

300

APVEPVTSPQ STQILLNETD LHPYVPTGKP EKGGVDLPLN MVNGFDGTDF FINNATFVPP

360

TVPVLLQILS GTQAAQDLLP AGSVYTLPKN ASIEITFPAN ANAAGSPHPF HLHGHTFAVI

420

RSAGSTAYNY DNPVWRDTVS TGLASNNDNV TIRFQTDNAG PWFLHCHIDF HLNAGFAVVL

480

AEDVPDIARA NPVPQAWKNL CPTYDALSPN DQ                           512

<210>3

<211>685

<212>DNA

<213>短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)

<400>3

atgaatttga aaagattgag gcttttgttt gtggtgtgta ttggatttgt tgacactgac     60

ggctgtgcca gctgatgcga aaacgattta taataatgaa atgggtacac atagcggata     120

cgattatgaa ttatggaagg attatggaaa cacctcaatg acactcaata acggcggggc     180

atttactgca ggctggaaca gtatcggaaa tgctttattt cggaaaggaa agaagtttga     240

ttccactaaa actcatcatc agcttggcaa catctccatc aattacaacg caaactttaa     300

cccaggcggg aattcctatt tatgtgtcta tggctggaca caatctccat tagcagaata     360

ctacattgtt gattcatggg gcacatatcg tccaacagga gcgtataaag gatcattcta     420

tgcagatgga ggcacatatg acatttatga aacgacccgc gttaatcagc cttccattat     480

cgggatcgcg accttcaagc aatattggag tgtacgacaa acaaagcgta caagcggaac     540

ggtctccgtc agtgcgcatt ttaataaatg ggaaagctta ggcatgccaa tgggtaaaat     600

gtatgaaaca gcatttactg tagaaggcta ccagagcagc ggaagtgcga atgtgatgac     660

caaccagctg tttattggac gataa                                           685

<210>4

<211>228

<212>PRT

<213>短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)

<400>4

LKRLRLLF VVCIGFVLTL TAVPADAKTI YNNEMGTHSG YDYELWKDYG NTSMTLNNGG

60

AFTAGWNSIG NALFRKGKKF DSTKTHHQLG NISINYNANF NPGGNSYLCV YGWTQSPLAE

120

YYIVDSWGTY RPTGAYKGSF YADGGTYDIY ETTRVNQPSI IGIATFKQYW SVRQTKRTSG

180

TVSVSAHFNK WESLGMPMGK MYETAFTVEG YQSSGSANVM TNQLFIGR

228

<210>5

<211>1038

<212>DNA

<213>云芝(Coriolus versicolor)

<400>5

atggctttca aaactctcgc ctctctcctc tcggttctgg tcaccatcca ggtcgcaggc     60

ggcgcgctca cccgccgtgt cgcttgccca gacggcgtga acaccgctac caacgcggcg     120

tgctgccagc tcttcgctgt ccgcgacgac atccagcaga acctgttcga tggcggcgag     180

tgtggcgagg aggtccacga gtccctccgt ctgaccttcc acgacgccat cggcatctct     240

ccttccatcg cctctcgcgg ccaattcgga ggcggaggtg ctgacggctc catcgccctt     300

tttgaggaca tcgagaccaa cttccacgcc aacctcggtg tcgacgagat catcgacgag     360

cagcggccgt tcatcgcccg ccacaacctc accaccgccg acttcatcca gttcgccggc    420

gccatcggtg tcagcaactg ccccggcgcg ccccagctgg acgtcttcat cggccgcccc    480

gacgcgacgc agcccgcgcc cgacctgacg gtgcccgagc cgttcgacac cgtcgacagc    540

atcatcgagc ggttctccga cgccggcggc ttcacgcccg ccgagatcgt cacgctcctc    600

gtgtcgcaca cgatcgccgc ggccgaccac gtcgacccga gcatccccgg aacgcccttc    660

gactccaccc cggaggagtt cgacacgcag ttcttcatcg agacccagct ccgcggcacg    720

ctcttccccg gcaccggcgg taaccagggc gaggtcgagt ctcctctccg cggcgagctg    780

cgcctccagt ccgactctga gctcgcgcgc gactcccgca ctgcttgcga gtggcagtcc    840

ttcgtcaaca accaggctaa gctccagtcc gcgttcaagg ctgccttccg caagatgacc    900

ccggcgacga gcgtcgcgca cttccccgct ggcctcagca acgccgacgt cgagcaagcg    960

tgtgccgaga cccccttccc gacgctcccc accgaccccg gacccgtcac caccgtcgcc    1020

cccgtccccc cgtcgtaa                                                  1038

<210>6

<211>370

<212>PRT

<213>云芝(Coriolus versicolor)

<400>6

MAFKTLASLL SVLVTIQVAG GALTRRVACP DGVNTATNAA CCQLFAVRDD IQQNLFDGGE

60

CGEEVHESLR LTFHDAIGIS PSIASRGQFG GGGADGSIAL FEDIETNFHA NLGVDEIIDE

120

QRPFIARHNL TTADFIQFAG AIGVSNCPGA PQLDVFIGRP DATQPAPDLT VPEPFDTVDS

180

IIERFSDAGG FTPAEIVTLL VSHTIAAADH VDPSIPGTPF DSTPEEFDTQ FFIETQLRGT

240

LFPGTGGNQG EVESPLRGEL RLQSDSELAR DSRTACEWQS FVNNQAKLQS AFKAAFRKMT

300

VLGHDESLLI ECSELVPTPP PATSVAHFPA GLSNADVEQA CAETPFPTLP TDPGPVTTVA

360

PVPPSPVPPS                                               370

Claims (10)

1.编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶重组酶的核苷酸序列，它的核苷酸序列如序列表中序列1、3、5序列所述；编码漆酶的核苷酸序列可以从灵芝(Ganoderma lucidum)中获得或据此序列人工合成；编码木聚糖酶的核苷酸序列可以从短小芽孢杆菌菌株AS1菌株中获得或据此序列人工合成；编码过氧化物酶的核苷酸序列可以从杂色云芝(Coriolus versicolor)菌株中获得或据此序列人工合成。

2.编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶重组酶的氨基酸序列，它的氨基酸序列如序列表中序列2、4、6序列所述。

3.权利要求1的核苷酸序列表达载体，生产具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的重组蛋白，其特征是编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶的核苷酸序列受启动子以及终止子的调控，启动子是真菌或酵母的启动子和终止子；启动子为在丝状真菌或酵母中表达能力强的强启动子，有纤维素酶的cbh1、葡糖淀粉酶的glaA、3-磷酸甘油醛脱氢酶的gpdA或乙醇氧化酶基因(AOX1)等启动子；终止子为色氨酸合成酶基因终止子(TtrpC)或AOX1基因终止子；表达载体具有选择标记，选择标记可以是bar，hygB，pyrG，argB或Zeocin抗性基因。

4.制备漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶重组蛋白的方法，采用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，采用宿主细胞获得重组的漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶；漆酶重组蛋白在pH值为3-8和30-65℃的条件下都可以保持其活性，最适pH值为4-6，最适温度为40-55℃。木聚糖酶重组蛋白的特征是在pH值为4.5-9和30-80℃条件下都可以保持其活性，最适pH值为5-8，最适温度为60-70℃。过氧化物酶重组蛋白的特征是在pH值为3-8和30-65℃的条件下都可以保持其活性，最适pH值为6-8，最适温度为40-55℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是采用曲霉获得重组的漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶，其具体过程为含有3-磷酸甘油醛脱氢酶的gpdA启动子和色氨酸合成酶基因终止子(TtrpC)调控的编码漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶的核苷酸序列，编码漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶活性的核苷酸序列符合权利要求1和2中所述的特征，宿主可以是曲霉丝状真菌，能够在曲霉丝状真菌中表达具有功能的漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶重组蛋白，可在曲霉丝状真菌的细胞中表达，也可以分泌到胞外，从培养液中回收。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征是采用酵母获得重组的漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶，其具体过程为含有乙醇氧化酶基因(AOX1)的启动子和终止子调控的编码具有漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶活性多肽的核苷酸序列，编码漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶活性的核苷酸序列符合权利要求1和2中所述的特征，可用毕赤酵母作为生产重组漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶蛋白的宿主，重组漆酶或木聚糖酶或过氧化物酶蛋白在宿主的细胞中表达，也可以分泌到胞外，从培养液中回收。

7.具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的复合酶制剂，其特征是编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶的基因在酵母或丝状真菌中表达，获得它们的重组酶，这些重组的漆酶或/和木聚糖酶或/和过氧化物酶进行混合配制成酶制剂。

8.具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的菌制剂，其特征是编码漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶的基因导入酵母或丝状真菌中后，酵母和/或丝状真菌混合制成菌制剂。

9.权利要求7或8所述的具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂的用途，所述的复合酶制剂或菌制剂用于脱木质素或漂白纸浆，其具体过程为使用复合酶制剂或菌制剂，在含有N-OH集团的芳香族反应介质、吐温或聚乙二醇烷酯非离子表面活性剂、金属离子Cu²⁺、Mn²⁺存在下，通入氧气，在30-65℃，pH值5-7的条件下，搅拌反应3-9小时，再加入EDTA或EPTA螯合除去金属离子，加入过氧化氢和亚硫酸钠漂白。

10.权利要求7或8所述的具有漆酶、木聚糖酶、过氧化物酶活性的制剂的用途，所述的复合酶制剂或菌制剂用于降解苯胺、联苯胺、硝基苯、2，4一二硝基氯苯、黄曲霉毒素、五氯酚和木聚糖污染物，其具体过程为复合酶制剂或菌制剂，加入到含有污染物的废液中，在30-65℃、pH值5-8条件下，搅拌反应0.5-2小时，降解废液中污染物。

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