CN117736878A - 一种白腐菌菌种及其在降解林木废弃物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白腐菌菌种及其在降解林木废弃物中的应用，本发明筛选的白腐菌能够分泌多种酶类，对林木废弃物中难分解的木质素进行作用，更加高效地促进林木废弃物的分解；本发明提供的白腐菌，还可制成菌剂，生产成本低，工艺简单，操作方便，对林木废弃物的降解过程没有污染性物质释放到空气中，绿色环保的降解林废弃物，降低生产和使用成本，在林木废弃物的降解方面具有很高的经济价值和良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种白腐菌菌种及其在降解林木废弃物中的应用。
背景技术
林木废弃物大多采用焚烧、填埋以及粉碎粗回收等非资源化的处理方式，这种传统处理方式造成了林木资源严重浪费，且对环境也造成严重的污染。因此如何处理和高效利用林木废弃物是目前我国面对的严峻问题。
木腐菌(Wood-decay fungi)分解木材时可引起木材的糟烂和解体，根据腐朽类型，木腐真菌主要分为白腐菌(White rot fungi)、褐腐菌(Brown rot fungi)和软腐菌(Soft rot fungi)。其中，白腐真菌为最主要的木材腐朽菌，约占已知种类的90％左右。
发明内容
本部分目的在于概述本发明实施例的基本情况以及一些较佳实施例的简要介绍。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
本发明的主要目的是克服现有的不足，提供一株能够分泌木质素降解酶和纤维素降解酶的白腐菌菌株，该菌株能更高效地对现有林木废弃物的木质纤维素进行降解。
本发明提供一种白腐菌菌株Phlebia formosana SMF410-5-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20231538，保藏日期为：2023年08月25日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
白腐菌菌株(Phlebia formosana)SMF410-5-1的来源：该菌分离自2020年4月10日从中国江苏省南京市南京林业大学(E118°48′34″，N32°4′41″)校内采集的松木腐朽茎干，经鉴定该菌株为白腐菌Phlebia formosana。
白腐菌的筛选过程如下：
(1)漆酶初筛：将采集自南京林业大学(E118°48′34″，N32°4′41″)校内松木腐朽茎干，通过分离、纯化得到该木腐菌菌株。将该菌转接于PDA固体培养基上活化，待菌丝长至平板三分之二时，用6mm的打孔器将菌落制成菌饼，将菌饼接入PDA-愈创木酚培养基上，培养六天，观察其在培养基上红棕色变色圈大小；
(2)木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶初筛：将步骤(1)中已活化菌株接种于PDA-苯胺蓝培养基上，培养六天，观察其在培养基上产生的褪色圈大小；
(3)纤维素酶初筛：将步骤(1)中已活化菌株接种于羧甲基纤维素钠培养基上，培养六天，用刚果红溶液染色，氯化钠溶液固定后，观察其在培养基上产生的透明圈大小；
(4)经步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)初筛后，将菌株SMF410-5-1保藏。
(5)酶活测定：用6mm的打孔器将活化后的菌株制成菌饼，将菌饼接于500mL锥形瓶装入200mL的PD液体培养基中，每个锥形瓶均接入6个菌饼，放于标准振荡培养箱28℃，160r/min培养16d。
(6)菌株鉴定：采用真菌核糖体基因组内转录间隔区(ITS)和核糖体大亚基(LSU)基因对菌株进行鉴定，鉴定菌株为白腐菌Phlebia formosana，菌株编号为SMF410-5-1。
步骤(1)中所述PDA-愈创木酚培养基是在PDA培养基中加入终浓度0.5g/L愈创木酚制成。步骤(2)中所述的PDA-苯胺蓝培养基是在PDA培养基中加入终浓度0.1g/L苯胺蓝制成。步骤(3)中所述羧甲基纤维素钠培养基包括有0.25g/L磷酸氢二钾，0.1g/L七水合硫酸镁，5g/L羧甲基纤维素钠，0.5g/L硫酸铵，15g/L琼脂粉或20g/L琼脂条。
本发明还提供一种如前所述的木腐菌菌株在降解林木废弃物中的应用。
本发明还提供一种用于降解林木废弃物的菌剂，包含如前所述的木腐菌菌株。
本发明的有益效果：本发明筛选的白腐菌能够分泌多种酶类，对林木废弃物中难分解的木质素进行分解，更加高效地促进林木废弃物的降解；本发明提供的白腐菌，还可制成菌剂，生产成本低，工艺简单，操作方便；对林木废弃物的降解过程没有污染性物质释放，是降解林废弃物绿色环保的有效方法。这些优点使得该木腐菌在林木废弃物的降解方面具有很高的经济价值和良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明菌株初筛结果图；
图2为本发明菌株酶活随时间的变化图；
图3为该菌株对三种木材试样的质量降解情况图；
图4为该菌株对三种木材试样的木质纤维素降解情况图；
图5为SMF410-5-1基于ITS和LSU序列构建的系统发育树。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明所使用的试剂包括葡萄糖、无水乙醇、琼脂粉、三氯甲烷、维生素B1、磷酸氢二钾、苯胺蓝、愈创木酚、羧甲基纤维素钠、硫酸铵、氯化钠、刚果红，氢氧化钠、浓盐酸和七水硫酸镁等。漆酶试剂盒、锰过氧化物酶试剂盒、木质素过氧化物酶试剂盒均购自苏州科铭生物技术有限公司。木质素、纤维素、半纤维素的含量检测在江苏省南京市卡思文检测技术有限公司。
所述PDA培养基包括：20g/L葡萄糖，200g/L土豆，15g/L琼脂粉或20g/L琼脂条；所述PD培养基为：不添加琼脂的PDA培养基；所述苯胺蓝培养基：在基础PDA培养基中加入0.1g/L苯胺蓝制成苯胺蓝培养基；所述PDA-愈创木酚培养基：在基础PDA培养基中加入0.5g/L愈创木酚制成愈创木酚培养基；所述羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基：0.25g/L磷酸氢二钾，0.1g/L七水合硫酸镁，5g/L羧甲基纤维素钠，0.5g/L硫酸铵，15g/L琼脂粉或20g/L琼脂条；刚果红溶液：1000mL蒸馏水中加入0.1g刚果红；氯化钠溶液：1000mL蒸馏水中加入5.89g氢氧化钠。
所用实验仪器与设备为HH-4型数显恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司)、MIR-553型恒温培养箱(日本SANYO Electric Co.，ltd)、DGG-9070型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)、SCB-1360JS型超级洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、标准振荡培养箱(伊孚森生物技术(中国)有限公司)、MTI-201B型多室多温度梯度恒温培养箱(上海技舟化工科技有限公司)、MDF-U333型冰箱(日本SANYO ElectricCo.ltd)、全波长酶标仪(Thermo electron corporation)和温流稳压电泳仪(北京市六一仪器厂)。
菌株鉴定：采用真菌核糖体基因组内转录间隔区(ITS)和核糖体大亚基(LSU)序列通用引物对其进行PCR扩增，而后在NCBI上进行BLAST同源比对分析，并下载相似菌株的序列以及其他近缘种序列作为参考；用BioEdit进行多序列比，之后使用PhyloSuite1.2.1软件的Concatenate Sequence程序将ITS和LSU序列串联，并用ModelFinder程序建立最佳建树模型，用IQ-TREE构建最大似然法系统发育树，结果如图5所示。
由图5结果可知，鉴定菌株与Phlebia formosana聚为同一分枝，亲缘关系最为接近，结合形态学鉴定，将菌株鉴定为Phlebia formosana，菌株命名为SMF410-5-1。
实施例1：
菌株活化：将实验室前期采集、分离、纯化并在4℃冰箱保存的菌株SMF410-5-1接种于固体PDA培养基中，然后放入25℃的恒温培养箱中黑暗培养，待菌落直径生长至2/3皿时，得到活化菌株。
实施例2：
漆酶初筛：将实施例1已活化菌株取出，移接入PDA培养基上，待菌丝长至平板三分之二时，用6mm的打孔器将活化后菌株制成菌饼，将菌饼接入PDA-愈创木酚培养基上，培养六天，观察培养基上红棕色变色圈情况，如图1所示，该菌株于PDA-愈创木酚培养基上产生红棕色变色圈，变色圈与菌落直径的比值为3.79±0.01mm，则供试菌株可分泌漆酶。
实施例3：
木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶检测：将实施例1培养所得的菌株，接种于PDA-苯胺蓝培养基上，培养六天，观察培养基上产生褪色圈情况，如图1所示，供试菌株于PDA-苯胺蓝培养基上出现褪色情况，透明圈直径与菌丝直径比值为0.52±0.02，则该菌株能够分泌木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。
实施例4：
纤维素酶检测：将实施例1活化的菌株取出，接种于羧甲基纤维素钠培养基上，培养六天，用刚果红染色，氯化钠固定后，观察在培养基上产生透明圈情况，如图1所示，该菌株于羧甲基纤维素钠培养基上产生透明圈，透明圈直径与菌丝直径比值为1.88±0.03，表明该菌株可分泌纤维素酶。
实施例5：
将实施例1得到的木腐菌菌株在PDA培养基25℃恒温培养，待菌落直径长到培养皿2/3时，用6mm的打孔器制成菌饼，选取菌落外缘菌饼接于500mL锥形瓶装入200mL的PD培养基中，每个锥形瓶均接入6个菌饼，每株菌3个重复，放于标准振荡培养箱28℃，160r/min培养16d，从开始培养的第4天开始在无菌条件下吸取培养液，此后每次取样时间间隔一天，取得的培养液经4层纱布过滤后在6000r/min，10min的条件下离心，离心所得的上清液即为粗酶液。
漆酶酶活测定：将上述所得到的粗酶液加入漆酶试剂盒中相应试剂，60℃水浴20min后冷却至室温，取200μL反应液于96孔板中测定420nm处吸光值，根据说明书计算漆酶酶活。
锰过氧化物酶酶活测定：在96孔板中加入上述的粗酶液及锰过氧化物酶试剂盒中的相应试剂，立即混匀并计时，记录在465nm处30s的吸光值和150s后的吸光值，根据说明书计算锰过氧化物酶酶活。
木质素过氧化物酶酶活测定：在96孔板中加入上述的粗酶液及木质素过氧化物酶试剂盒中的相应试剂充分混匀，立即测定651nm处10s和130s吸光值，根据说明书计算木质素过氧化物酶酶活。
实验结果如图2所示。
由图2-A可知，在菌株SMF410-5-1的生长过程中，漆酶的活性先缓慢增长，随后快速增长并在第12d达到漆酶酶活高峰(64.95U/mL)，之后酶活开始下降。由图2-B和2-C可知，木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的产酶酶活趋势同漆酶相同，其中锰过氧化物酶在第10d达到酶活高峰(12.81U/ml)，木质素过氧化物酶与漆酶产酶高峰时间相同，均在第12d(12.33U/ml)。
实施例6：
白腐菌菌株SM410-5-1在降解林木废弃物的应用：
将樟子松、毛白杨、杉木三种木材木屑放入65℃的电热恒温鼓风干燥箱内烘至恒重，然后分别称取三种木材的木屑各5g置于240mL的玻璃组培瓶中，每种木材试样使用电子天平称重精确至0.001g，每5g试样中加入20mL蒸馏水，搅拌均匀后放入高温蒸汽灭菌锅121℃，20min灭菌后备用；
将活化所得白腐菌菌株SMF410-5-1用6mm打孔器制成菌饼，在无菌条件下，在每瓶中均加入6个菌饼，每株菌重复三瓶。在不添加任何外源或内源营养物质的条件下放置于温度为28℃的恒温培养箱黑暗静置培养，使木屑在组培瓶内受木腐菌菌株侵染。以糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)作为阳性对照，编号为PO；以不接种菌株作为阴性对照，编号control。
在恒温培养箱中分别培养90d和180d后，取出木材试样，轻轻刮去表面菌丝，将去除菌丝后的木材试样放在65℃的烘箱中烘干至恒重，在电子天平中称重，计算接种木腐菌后木材试样的质量损失情况，所得结果如图3所示。
计算公式：木材试样质量损失率＝(W1-W2)/W1×100％(式中：W1是木材试样降解前的绝对干质量，W2是木材试样降解后的绝对干质量。)
木材试样经木腐真菌降解后，将木材试样烘干至恒重，用于测定其纤维素(硫酸蒽酮比色法)、半纤维素(盐酸水解法)、木质素(浓硫酸法)含量。通过下列公式分别计算供试木腐真菌侵染林木废弃物后各组分的降解率。
计算公式：
式中，DR(％)：林木废弃物中某一组分的降解率；
m0(g)：降解前木材试样重量；
m1(g)：降解90d/180d木材试样的重量；
M1(％)：降解前某一组分含量；
M2(％)：降解90d/180d某一组分含量。
由图3可知，供试林木废弃物试样在接种菌株SMF410-5-1后，质量发生了显著变化，随降解时间的增长，质量损失率随之增大，近似呈线性增长。不同菌株、底物浓度、环境条件等的不同都会导致降解效果不同。接种该菌180d后，木材试样质量损失明显比接种该菌90d的高。供试菌株对三种木材均具有降解作用，其中3-A表明SMF410-5-1对杨木降解效果最显著，在180d时达到了35.5％；图3-B、3-C表明菌株SMF410-5-1对松木、杉木的降解效果最显著，分别是14.7％、19.7％。
木质素是木材废弃物中的主要成分，但难以有效降解。由图4可知，经本发明筛选菌株SMF410-5-1处理后的木材试样纤维素、半纤维素及木质素的含量均有不同程度的降解。同质量损失率一样，随着时间的增加，木质素、纤维素和半纤维素的损失率也逐渐增加。菌株SMF410-5-1接种杨树废弃物180d后，纤维素降解最显著，其降解率达到17.7％(图4-A)。菌株SMF410-5-1处理杉木和松木180d后，其木质素降解率分别为21.8％和37.7％(图4-D、4-G)。菌株SMF410-5-1处理的杉木和松木废弃物的木质纤维素降解率显著高于阳性对照PO和其他处理(图4-D～图4-I)。综合来看，白腐菌菌株SMF410-5-1对三种林木废弃物均具有较好的降解作用，在杉木、松木两种林木废弃物中降解效果尤为显著。
本发明中，图1为本发明菌株初筛结果图；图2为本发明菌株产降解酶酶活随时间的变化图；其中2-A为产漆酶酶活随时间的变化图，2-B为木质素过氧化物酶酶活随时间变化图，2-C为锰过氧化物酶酶活随时间的变化图；图3为该菌株对三种木材试样的质量降解情况图，其中3-A为杨木质量随时间的变化图，3-B为杉木质量随时间变化图，3-C为松木质量随时间的变化图；图4为该菌株对三种木材试样的木质纤维素降解情况图，其中4-A为杨木木质素随时间的变化图，4-B为杨木纤维素随时间变化图，4-C为杨木半纤维素随时间的变化图，其中4-D为杉木木质素随时间的变化图，4-E为杉木纤维素随时间变化图，4-F为杉木半纤维素随时间的变化图，其中4-G为松木木质素随时间的变化图，4-H为松木纤维素随时间变化图，4-I为松木半纤维素随时间的变化图；图5为SMF410-5-1基于ITS序列和LSU序列构建的系统发育树。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种白腐菌菌种，其特征在于：所述白腐菌菌种的保藏编号为：CCTCC M 20231538；其拉丁文分类名称为：Phlebia formosana。
2.权利要求1所述的白腐菌菌种在降解林木废弃物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述林木包括杨木、松木、杉木。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述白腐菌菌种能够分泌漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和纤维素酶。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述白腐菌菌种能够降解木质素、纤维素和半纤维素。
6.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：将所述白腐菌菌种接种于培养基中，恒温培养后得到活化后的白腐菌菌种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将4℃保存的所述白腐菌菌种接种于固体PDA培养基中，放入25℃的恒温培养箱中黑暗培养，得到活化后的白腐菌菌种。
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