CN112442467A - 一株深海芽孢杆菌在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用 - Google Patents
一株深海芽孢杆菌在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株深海芽孢杆菌在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用，深海芽孢杆菌Bacillus sp.G213‑b的保藏号为CCTCC NO：M 2019805，芽孢杆菌形成的微生物被膜在诱导厚壳贻贝稚贝附着中应用；诱导的过程为：将深海芽孢杆菌分离、纯化得到纯种芽孢杆菌株；将纯种芽孢杆菌株接种培养、沉淀、洗涤得到悬浮菌液；向培养皿中加入悬浮菌液和灭菌海水培养，得到微生物被膜，将附有微生物被膜的载玻片和厚壳贻贝稚贝诱导培养；本发明的不同细菌初始密度微生物被膜对稚贝的诱导活性有所不同，深海芽孢杆菌在提高厚壳贻贝人工育苗技术、改善厚壳贻贝养殖产业问题和海洋牧场建设等生态修复方面的应用提供坚实的理论基础。
Description
技术领域
本发明属于海洋微生物技术领域，涉及一株深海芽孢杆菌在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用，具体涉及一株深海细菌芽孢杆菌(Bacillus sp.G213-b)的分离、纯化、鉴定和保藏，以及其在不同初始细菌密度条件下形成的微生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响作用。
背景技术
厚壳贻贝(Mytilus coruscus)，隶属于软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，贻贝目(Mytilodia)，贻贝科(Mytilidae)，是我国重要的海产贝类养殖品种，分布于黄海、渤海和东海沿岸。厚壳贻贝营养价值较高，具有开阔的养殖前景和市场开发潜力。在厚壳贻贝生活史中，浮游生活阶段的后期，眼点幼虫会附着变态成为稚贝，并最终发育为成贝。在稚贝生长为成贝的过程中，当环境发生变化，厚壳贻贝稚贝能够自行切断足丝，开始爬行并重新选择适宜的附着基进行再次附着。厚壳贻贝作为一种重要的海水贝类养殖品种，其苗种主要依靠天然苗种和半人工采苗获得。近年来，渔业资源的过度开发，天然苗种无法满足厚壳贻贝养殖产业的发展。因此，解决苗种问题、探索利用细菌形成微生物被膜诱导厚壳贻贝附着等生物工程技术显得尤为必要。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一株深海芽孢杆菌在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用。
本发明的第二个目的是提供上述深海芽孢杆菌形成的微生物被膜在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用。
为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：
一株深海芽孢杆菌在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用。
一株深海芽孢杆菌，其保藏号为CCTCC NO：M 2019805，该深海芽孢杆菌为：Bacillus sp.G213-b。
该深海芽孢杆菌的16S rRNA基因序列为：SEQ ID NO.1。
为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：
一株深海芽孢杆菌形成的微生物被膜在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用。
优选地，诱导的过程为：将深海芽孢杆菌分离、纯化得到纯种芽孢杆菌株；将纯种芽孢杆菌株接种培养、沉淀、洗涤得到悬浮菌液；向培养皿中加入悬浮菌液和灭菌海水培养，得到微生物被膜，将附有微生物被膜的载玻片和厚壳贻贝稚贝诱导培养。
优选地，悬浮菌液的初始密度为1.0×106-5×108cells/mL。
进一步优选地，悬浮菌液的初始密度选自1.0×106cells/mL、1.0×107cells/mL、1.0×108cells/mL和5×108cells/mL中的一种以上。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明的深海芽孢杆菌形成的微生物被膜具有诱导厚壳贻贝稚贝附着的活性，且不同细菌初始密度微生物被膜对稚贝的诱导活性也有所不同，故本发明对厚壳贻贝的人工养殖具有重要意义。同时也为深海芽孢杆菌在提高厚壳贻贝人工育苗技术、改善厚壳贻贝养殖产业问题和海洋牧场建设等生态修复方面的应用提供了坚实的理论基础。
附图说明
图1为本发明的实施例中不同初始细菌密度悬浮菌液形成的微生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的诱导作用示意图(横坐标Bacterial density为细菌密度，纵坐标Settlement为附着率)。
具体实施方式
本发明提供了一株深海芽孢杆菌在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用。
本发明涉及的深海芽孢杆菌Bacillus sp.G213-b来源于下北半岛附近海域大洋沉积物(142.20°E，41.18°N)，海拔为-1180米。利用ZoBell 2216E固体培养基分离、纯化得到纯种菌落，并通过16S rRNA基因测序与GENEBANK(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中核酸数据进行比对后上传至NCBI数据库。最终确定菌名为芽孢杆菌，获取序列号为KX989230.1，其保藏信息为：该细菌的保藏单位为武汉大学中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏日期为2019年10月11日，保藏号为CCTCC NO：M 2019805。
其中，该深海芽孢杆菌的16S rRNA基因序列(SEQ ID NO.1)具体为：
GGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGGGATTGGCTCGACCTCGCGGTTTTGCTGCCCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACCTAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTTGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCGAGCAGTTACTCTCGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGACCCGAAGGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGCCCATCCTTAAGTGATAGCCGAAACCATCTTTCAACAAGGAACCAGGAGGTTCCTTATATTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTCAAGGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTACAAAAGCAAGCTTTTGTAAGTCCGCTC。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例：
本实施例的深海芽孢杆菌对厚壳贻贝稚贝附着的诱导实验：
主要步骤是将纯种的芽孢杆菌菌株接种到海水2216E液体培养基中扩大培养，离心后得到细菌沉淀，用灭菌海水洗涤并制成悬浮菌液，重复多次实验。最后将得到的菌液稀释后用吖啶橙染色并在荧光显微镜1000倍镜头下随机选取10个点进行计数，确定菌液总密度为2.6×109cells/mL。每个培养皿中放入一枚灭菌载玻片，向培养皿中加入灭菌海水及菌液，使细菌初始密度分别为1.0×106cells/mL、1.0×107cells/mL、1.0×108cells/mL和5×108cells/mL。在18℃下避光条件培养48h形成微生物被膜。最后将附有微生物被膜的载玻片及10只厚壳贻贝稚贝(壳长1.31±0.02mm；壳高0.89±0.02mm)放入含有灭菌过滤海水的培养皿中，在12h时记录稚贝的附着率，即载玻片上附着的稚贝个数占该培养皿中稚贝总个数的百分比。
研究发现该细菌形成的微生物被膜具有诱导厚壳贻贝稚贝附着的活性，实验结果如图1所示，不同初始密度条件下形成的微生物被膜对稚贝的诱导活性也有所不同，在初始密度为1.0×107cells/mL时，形成的微生物被膜对稚贝附着的诱导率为41.82％，初始密度为5×108cells/mL时形成的微生物被膜对稚贝的诱导率仅为23.64％。由此可得，深海细菌Bacillus sp.G213-b形成的微生物被膜具有诱导稚贝附着的作用，且不同细菌密度微生物被膜诱导活性有所不同，故本发明表明深海芽孢杆菌细菌生物量与厚壳贻贝稚贝附着的影响以及对厚壳贻贝的人工养殖均具有重要的意义。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一株深海芽孢杆菌在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用
<141> 2020-12-15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> 深海芽孢杆菌()
<400> 1
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ttgtaagtcc gctc 1394
Claims (7)
1.一株深海芽孢杆菌在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用。
2.一株深海芽孢杆菌，其保藏号为CCTCC NO：M 2019805，该深海芽孢杆菌为：Bacillussp.G213-b。
3.根据权利要求2所述的深海深海芽孢杆菌，其特征在于：所述深海芽孢杆菌的16SrRNA基因序列为：SEQ ID NO.1。
4.一株深海芽孢杆菌形成的微生物被膜在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述诱导的过程为：将深海芽孢杆菌分离、纯化得到纯种芽孢杆菌株；将所述纯种芽孢杆菌株接种培养、沉淀、洗涤得到悬浮菌液；向培养皿中加入所述悬浮菌液和灭菌海水培养，得到微生物被膜，将附有微生物被膜的载玻片和厚壳贻贝稚贝诱导培养。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述悬浮菌液的初始密度为1.0×106-5×108cells/mL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述悬浮菌液的初始密度选自1.0×106cells/mL、1.0×107cells/mL、1.0×108cells/mL和5×108cells/mL中的一种以上。
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| 杨金龙等: "微生物膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响", 水产学报 * |
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