CN108102924B - 一种利用噬菌蛭弧菌控制小球藻培养中细菌污染的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在小球藻培养中，通过加入噬菌蛭弧菌侵染杀灭其它污染的细菌，进而提高小球藻生长的方法，在小球藻培养过程中的细菌污染控制和提高小球藻生长方面具有重要的应用价值。

Description

一种利用噬菌蛭弧菌控制小球藻培养中细菌污染的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用噬菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus sp.)控制小球藻(Chlorella sp.)培养中其它细菌污染，进而促进小球藻生长的方法，
背景技术
作为最简单的光合作用有机体之一，小球藻是人类最早能够培养的微藻，其不仅生长快，而且富含蛋白质、多糖和维生素及小球藻生长因子等多种营养和生物活性成分，已受到国内外的普遍关注，在人类保健食品、生物能源和环境治理等方面均有广泛应用。
一般来说小球藻培养有光照自养、混养和无光照异养培养3种方式，但无论是实验室还是产业化大规模培养均不可避免地存在不同程度的细菌污染情况。因为细菌可通过与小球藻竞争营养、分泌抑藻物质和溶解藻细胞等方式抑制小球藻的生长，因此会对小球藻的培养生产造成巨大损失。目前，小球藻培养中控制杂菌的方法主要有物理法和化学法，物理法主要包括离心和过滤，化学法主要包括添加杀菌剂和抗生素。无论是物理还是化学方法均造成使用效果不明显、杀菌剂和抗生素污染环境且影响藻细胞蛋白质量等一系列问题，至今小球藻培养细菌污染尚未有一种很好的解决办法，是制约小球藻产业化生产的科研难题。
发明内容
本发明目的是针对制约小球藻产业化生产的难题，提供一种利用噬菌蛭弧菌控制小球藻培养中细菌污染的方法。该方法通过在小球藻培养过程中添加噬菌蛭弧菌来控制小球藻培养中其它细菌的数量，从而提高小球藻的生长。该方法性能稳定，能够应用于产业化。
为此，本发明提供了一种利用噬菌蛭弧菌控制小球藻培养中细菌污染的方法，其通过将噬菌蛭弧菌加入到小球藻培养体系中，以控制和/或减少其它细菌数量，进而促进小球藻的生长。
本发明中，所述噬菌蛭弧菌包括蛭弧菌属中所有具备侵染杀灭革兰氏阴性细菌和部分革兰氏阳性细菌的蛭弧菌中的一种或几种。
本发明中，所述小球藻包括小球藻属中所有小球藻中的一种或几种。
根据本发明的一些实施方式，所述方法包括将噬菌蛭弧菌细胞悬浊液加入到小球藻培养体系中进行培养的步骤，其中，所述噬菌蛭弧菌细胞悬浊液通过侵染革兰氏阴性杆菌的培养获得。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述噬菌蛭弧菌的相应的菌株为保藏编号为CGMCC NO.15141的噬菌蛭弧菌菌株或其他任何一种或几种噬菌蛭弧菌菌株。
在本发明的一些实施例中，以小球藻培养体系的量计，所述噬菌蛭弧菌细胞的初始浓度为10个/mL到104个/mL。
在本发明的另一些实施例中，所述噬菌蛭弧菌细胞悬浊液的细胞浓度为107-8个/mL。
根据本发明的一些实施方式，所述噬菌蛭弧菌细胞悬浊液在小球藻培养初始阶段加入，或者在小球藻培养过程中发现细菌污染的情况下加入。
本发明中，所述小球藻培养包括小球藻的光照自养培养、混养培养和无光照异养培养中一种或几种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述小球藻培养为小球藻的光照自养培养。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，小球藻光照自养培养的温度为20-35℃，进一步优选为25-30℃。
在本发明的另一些进一步优选的实施例中，用于小球藻培养光照的光源为日光灯/或太阳光；优选所述光照自养培养的光照强度为2000-8000Lx。
一般来说在小球藻培养过程中都会发生不同程度的细菌污染，目前一般采用离心过滤等物理方法和添加杀菌剂或抗生素等化学方法控制细菌的污染程度，但产生的效果不明显且造成藻细胞蛋白质量下降等一系列问题，至今围绕小球藻培养细菌污染问题尚未有一种很好的解决办法，是制约小球藻产业化培养的科研难题。
本发明所提供的利用噬菌蛭弧菌控制小球藻培养中细菌污染的方法，通过在小球藻培养过程中添加噬菌蛭弧菌，成功控制了小球藻培养中其它细菌的数量，大幅度提高了小球藻的生长，具有重要的应用价值。通过一系列不同的研究实验，证明这一技术性能稳定，能够应用于产业化。
附图说明
为使本发明容易理解，下面结合附图来说明本发明。
图1为本发明的小球藻培养物中噬菌蛭弧菌-YQ、细菌和椭圆小球藻细胞分布的流式细胞仪散点图。
图2显示了噬菌蛭弧菌-YQ通过侵染裂解大肠杆菌BL21细胞的生长曲线。
图3显示了通过添加不同初始浓度的噬菌蛭弧菌-YQ促进椭圆小球藻生长的效果。
图4显示了通过添加不同初始浓度的噬菌蛭弧菌-YQ控制椭圆小球藻培养体系中其它细菌数量的效果
图5显示了通过添加不同初始浓度的噬菌蛭弧菌-YQ在椭圆小球藻培养体系中噬菌蛭弧菌-YQ生长的情况。
菌种保藏
噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)，由广东绿百多生物开发有限公司分离、鉴定，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)保藏，保藏日期：2018年1月2日，保藏编号：CGMCC NO.15141。本发明中该菌株在被命名为噬菌蛭弧菌-YQ株(Bdellovibriobacteriovorus-YQ)。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
如前所述，在小球藻培养过程中都会发生不同程度的细菌污染，无论是采用物理方法还是化学方法控制小球藻培养中的杂菌均造成使用效果不明显、杀菌剂和抗生素污染环境且影响藻细胞蛋白质量等一系列问题，因此至今小球藻培养中细菌污染问题尚未有一种很好的解决办法，其成为制约小球藻产业化生产的科研难题。
为寻求高效去除小球藻培养中细菌污染的新途径，本发明人对小球藻培养过程中的细菌污染问题进行了大量的研究。本发明人经过不懈的研究探索，终于从对虾养殖池底泥中成功筛选出了一株对小球藻培养中的污染细菌具备高效杀灭能力的微生物菌种，经分离鉴定为噬菌蛭弧菌-YQ株(Bdellovibrio bacteriovorus-YQ)，检测结果表明，该菌株对小球藻培养细菌培养中的污染细菌具备高效杀灭能力；本发明人进一步研究发现，向小球藻培养体系添加噬菌蛭弧菌可以杀灭污染的细菌，有效控制小球藻培养体系中除噬菌蛭弧菌-YQ以外细菌的数量，进而提高了小球藻的生长。本发明正是基于上述发现做出的。
因此，本发明第一方面所涉及的利用噬菌蛭弧菌控制小球藻培养中细菌污染的方法，是通过将噬菌蛭弧菌加入到小球藻培养体系中，来控制和/或减少其它污染细菌数量，进而促进小球藻的生长。
本发明中，所述噬菌蛭弧菌包括蛭弧菌属中所有具备侵染杀灭革兰氏阴性细菌和部分革兰氏阳性细菌的蛭弧菌中的一种或几种。
本发明中，所述小球藻包括小球藻属中所有小球藻中的一种或几种；优选小球藻为椭圆小球藻。例如，本发明中所使用的椭圆小球藻(Chlorella ellipsoide，编号FACHB-41)购买于中国科学院水生生物研究所。使用的大肠杆菌种系普遍在基因工程操作中使用且无致病性的大肠杆菌BL21(E.coli BL21)。
噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus sp.)是一类能够捕食其它所有革兰氏阴性杆菌和部分革兰氏阳性细菌的革兰氏阴性细菌，1962年国外学者从假单胞菌中首次发现蛭弧菌，此后在土壤、水体和动物体及人肠道中均发现有蛭弧菌的存在。蛭弧菌是根据其基本特性命名的，Bdeollvibrio一词来源于拉丁语，bdella为“水蛭”的意思，vibrio为“弧状”的意思，连在一起即为寄生的弧状细菌。
噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus sp.)主要通过侵染革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌进行繁殖，且至今尚未发现噬菌蛭弧菌侵染小球藻等真核生物的报道，因此，可以认为其对小球藻的生长不产生任何危害。而且，发明人经过实验也证实了噬菌蛭弧菌不会侵染小球藻，对小球藻的生长不产生任何危害。而且让人意想不到的是，发明人经过实验发现，噬菌蛭弧菌通过裂解其它细菌细胞后释放的营养物质也可以作为小球藻生长的营养物质，进而更加促进了小球藻的生长，在小球藻产业化培养中具有重要的应用价值。
在本发明的一些实施例中，向小球藻培养体系添加噬菌蛭弧菌可以杀灭污染的细菌，有效控制小球藻培养体系中除噬菌蛭弧菌以外的其它细菌数量，进而大幅度提高了小球藻的生长。
根据本发明的一些实施方式，所述方法包括将噬菌蛭弧菌细胞悬浊液加入到小球藻培养体系中进行培养的步骤，其中，所述噬菌蛭弧菌细胞悬浊液通过侵染革兰氏阴性杆菌的培养获得。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述噬菌蛭弧菌的相应的菌株为保藏编号为CGMCC NO.15141的噬菌蛭弧菌-YQ菌株或其他任何一种或几种噬菌蛭弧菌菌株。
在本发明的另一些实施例中，所述噬菌蛭弧菌细胞悬浊液的细胞浓度为107-8个/mL。
本发明人首先采用了流式细胞仪(CY-S-3001，德国Partec；主要参数设置为：FSC155，SSC 290，FL1 248，FL2 361.5，选用激发光为355nm的蓝激光)，依据细胞大小的显著差异，首次成功地对小球藻培养物中的噬菌蛭弧菌、细菌和小球藻细胞的分布和数量进行了识别和计数，例如，小球藻培养物中噬菌蛭弧菌、细菌和小球藻细胞分布的流式细胞仪散点图如图1所示。
本发明中，所用噬菌蛭弧菌-YQ采用以下方式获得：
在洁净工作台内无菌条件下，利用500毫升三角瓶在灭菌的生理食盐水配制细胞浓度107个/mL的大肠杆菌BL21细胞悬浮液100毫升，接种初始细胞浓度2.6×103个/mL的噬菌蛭弧菌-YQ后，在30℃摇床转速200转/分条件下培养5天，通过流式细胞仪对大肠杆菌BL21细胞和噬菌蛭弧菌-YQ细胞浓度变化的曲线显示(如图2所示)，培养5天后噬菌蛭弧菌-YQ的细胞浓度增加到6.3×107个/mL。将噬菌蛭弧菌-YQ(含大肠杆菌BL21细胞)培养物过0.45μm滤膜后，可以截留大小为1μm以上的大肠杆菌BL21细胞，而滤液中只含有大小为0.2μm左右的噬菌蛭弧菌-YQ细胞，这样就获得了用于小球藻培养中控制细菌污染所用的噬菌蛭弧菌-YQ细胞悬浮液，其细胞浓度达到了107-8个/mL之间。
在本发明的一些具体实施例中，所述噬菌蛭弧菌细胞悬浊液的制备方法包括：
(1)配制灭菌LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000mL,pH7.2)，接种大肠杆菌BL21(E.coli BL21)后进行摇床振荡培养，转速200转/分钟，温度37℃。培养1天后离心(10000转/分，10分钟)收获大肠杆菌细胞，利用经121℃10分钟灭菌的生理食盐水(0.9％的氯化钠)，悬浮大肠杆菌细胞后再次离心，重复清洗3次后获得大肠杆菌细胞悬浮液，用于培养噬菌蛭弧菌。
(2)在大肠杆菌细胞悬浮液中接种噬菌蛭弧菌后，在30℃摇床转速200转/分钟下进行培养，通过流式细胞仪测定大肠杆菌细胞和噬菌蛭弧菌细胞浓度的变化，图2显示接种噬菌蛭弧菌-YQ培养后，大肠杆菌细胞浓度持续下降，而噬菌蛭弧菌细胞浓度持续上升，说明噬菌蛭弧菌具备侵染典型的革兰氏阴性杆菌大肠杆菌的能力。将噬菌蛭弧菌(含大肠杆菌细胞)培养物过0.45μm滤膜后，可以截留大小为1μm以上的大肠杆菌细胞，而滤液中只含有大小为0.2μm左右的噬菌蛭弧菌细胞，这样就获得了用于小球藻培养中控制细菌污染所用的噬菌蛭弧菌细胞悬浮液，其细胞浓度达到了107-8个/mL。
本发明中对小球藻的培养方式没有特别的限制，例如，可以采用以下方法培养小球藻：按照表1配制灭菌小球藻培养基，接种椭圆小球藻(Chlorella ellipsoide，编号FACHB-41)后在光照强度为6000lx，光照/黑暗时间为16h/8h，温度为27℃下进行光照自养培养。一般来说在小球藻培养过程中都会存在不同程度的细菌污染，如果不加以控制，必然导致细菌数量增加而影响小球藻的生长。
表1小球藻培养基配方
Figure BDA0001546313810000061
本发明中，所述噬菌蛭弧菌细胞悬浊液在小球藻培养初始阶段加入，或者在小球藻培养过程中发现细菌污染的情况下加入。例如：在本发明的一些实施例中，在小球藻培养过程中，在接种小球藻的同时接种用于侵染裂解细菌的噬菌蛭弧菌，这样可以成功控制小球藻培养体系中其他细菌的生长，进而促进了小球藻的生长。在小球藻培养过程中的小球藻细胞，细菌细胞和噬菌蛭弧菌细胞浓度变化均采用流式细胞仪进行识别和测定。
在小球藻培养过程中通过接种不同的量可以获得不同初始细胞浓度的噬菌蛭弧菌-YQ。例如，在一些实施例中，分别在小球藻培养过程中添加了不同初始细胞浓度的噬菌蛭弧菌-YQ，通过连续检测椭圆小球藻，细菌和噬菌蛭弧菌-YQ细胞浓度的变化，证明了通过添加噬菌蛭弧菌可以成功控制其它污染细菌的数量，同时大幅度促进了椭圆小球藻的生长。通过一系列实验发现，此生物防控高技术性能稳定可靠，可以用于小球藻的高密度培养。
在本发明的一些优选的实施例中，以小球藻培养体系中的培养液计，所述噬菌蛭弧菌细胞的初始浓度为10个/mL到104个/mL。
本发明中，所述小球藻培养包括小球藻的光照自养培养、混养培养和无光照异养培养中一种或几种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述小球藻培养为小球藻的光照自养培养。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，小球藻光照自养培养的温度为20-35℃，进一步优选为25-30℃。
在本发明的另一些进一步优选的实施例中，用于小球藻培养光照的光源为日光灯/或太阳光；优选所述光照自养培养的光照强度为2000-8000Lx。
本发明用于稀释或培养基配制过程中的“水”，在没有特别指定的情况下，是超纯水。
本发明所述用语“小球藻培养体系”在加入噬菌蛭弧菌菌悬液之前包括小球藻培养基以及小球藻，任选的还包括其他污染细菌；再加入噬菌蛭弧菌菌悬液之后包括小球藻培养基以及小球藻，噬菌蛭弧菌菌悬液(生理食盐水+噬菌蛭弧菌)，任选的还包括其他污染细菌。
本发明所述用语“污染细菌”或“其他污染细菌”是指小球藻培养体系中影响小球藻生长的除噬菌蛭弧菌以外的细菌，其主要为革兰氏阴性菌。
本发明中所述用语“所述噬菌蛭弧菌细胞的初始浓度”是指以小球藻培养体系总量(体积)计的所述噬菌蛭弧菌细胞的个数，单位为“个/mL”。
本发明中噬菌蛭弧菌-YQ、细菌和椭圆小球藻细胞浓度采用以下方法测定：
在椭圆小球藻液体培养物中噬菌蛭弧菌-YQ、细菌和椭圆小球藻细胞浓度的测定，取液体培养物，经生理食盐水稀释一定倍数后，直接采用流式细胞仪(CY-S-3001，德国Partec；主要参数设置为：FSC 155，SSC 290，FL1 248，FL2 361.5，选用激发光为355nm的蓝激光)测定其中的不同细胞浓度。
实施例
实施例1：椭圆小球藻培养体系中不添加噬菌蛭弧菌-YQ
1.噬菌蛭弧菌-YQ的制备：
在500毫升三角瓶内配制100mL生理食盐水(0.9％氯化钠)，经高温高压121℃灭菌20分钟后放入洁净工作台内进行紫外线灭菌10分钟。在洁净工作台内无菌条件下，加入1mL细胞浓度为1011个/mL的大肠杆菌BL21细胞悬浊液，同时挑取接种在双层平板内生长的噬菌蛭弧菌-YQ，在温度30℃，摇床转速200转每分钟下进行培养5天。在洁净工作台内，取培养物过0.45μm滤膜后可以获得细胞浓度达到6.3×107个/mL噬菌蛭弧菌-YQ细胞悬浊液。
2.椭圆小球藻的培养：按照表1小球藻培养基配方配制培养基，在500毫升三角瓶内放人100毫升培养基，经高温高压121℃灭菌20分钟后放入洁净工作台内进行紫外线灭菌10分钟。在洁净工作台内无菌条件下，加入1mL椭圆小球藻培养物后初始藻细胞浓度为6.0×106个/mL。将接种椭圆小球藻的500毫升三角瓶放入光照培养箱内，在光照强度为6000lx，光照/黑暗时间为16h/8h，温度为27℃下进行光照自养培养。
3.小球藻和细菌的生长
在小球藻培养过程中未添加噬菌蛭弧菌-YQ条件下，培养5天后椭圆小球藻细胞浓度从6.0×106个/mL增加到2.3×107个/mL(图3)，与此同时椭圆小球藻培养物中污染细菌细胞浓度从初始的5.6×106个/mL增加到1.9×107个/mL(图4)。此结果说明在小球藻培养过程中，伴随着小球藻的生长，污染细菌也在进一步生长。
实施例2：椭圆小球藻培养体系中添加初始细胞浓度为103个/mL的噬菌蛭弧菌-YQ
实施例2中噬菌蛭弧菌-YQ和椭圆小球藻培养制备与实施例1相同
实施例2中除在椭圆小球藻培养中添加了初始细胞浓度为103个/mL的噬菌蛭弧菌-YQ外(初始100毫升小球藻培养物中添加了1.6μL噬菌蛭弧菌-YQ细胞悬浊液)，其他控制条件与实施例1相同。
在椭圆小球藻培养过程中添加初始细胞浓度为103个/mL的噬菌蛭弧菌-YQ条件下，培养5天后椭圆小球藻细胞浓度从6.0×106个/mL增加到3.2×107个/mL(图3)，比不添加噬菌蛭弧菌-YQ时提高了39％的藻生物量。与此同时椭圆小球藻培养物中污染细菌浓度从初始的5.6×106个/mL减少到2.1×105个/mL(图4)，噬菌蛭弧菌-YQ细胞浓度从103个/mL增加到4.8×107个/mL(图5)。此结果说明在小球藻培养过程中，添加初始细胞浓度为103个/mL的噬菌蛭弧菌-YQ，不仅可以减少椭圆小球藻培养体系中的污染细菌数量，而且还可以促进椭圆小球藻的生长。
实施例3：椭圆小球藻培养体系中添加初始细胞浓度为104个/mL的噬菌蛭弧菌-YQ
实施例3中噬菌蛭弧菌-YQ和椭圆小球藻培养制备与实施例1相同。
实施例3中除在椭圆小球藻培养中添加了初始细胞浓度为104个/mL的噬菌蛭弧菌-YQ外(初始100毫升小球藻培养物中添加了3.2μL噬菌蛭弧菌-YQ细胞悬浊液)，其他控制条件与实施例1相同。
在椭圆小球藻培养过程中添加初始细胞浓度为104个/mL的噬菌蛭弧菌-YQ条件下，培养5天后椭圆小球藻细胞浓度从6.0×106个/mL增加到3.5×107个/mL(图3)，比不添加噬菌蛭弧菌-YQ时提高了52％的藻生物量。与此同时椭圆小球藻培养物中污染细菌浓度从初始的5.6×106个/mL减少到5.5×104个/mL(图4)，噬菌蛭弧菌-YQ细胞浓度从104个/mL增加到1.6×108个/mL(图5)。此结果说明在小球藻培养过程中，添加初始细胞浓度为104个/mL的噬菌蛭弧菌-YQ进一步减少了小球藻培养体系中的污染细菌数量，并进一步促进了椭圆小球藻的生长。
综上所述，利用噬菌蛭弧菌-YQ可以成功控制椭圆小球藻培养过程中的污染细菌数量，进而大幅度提高了椭圆小球藻的生长。
以上所述仅为本发明的利用噬菌蛭弧菌控制细菌污染促进小球藻生长的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种利用噬菌蛭弧菌控制小球藻培养中细菌污染的方法，其通过将噬菌蛭弧菌加入到小球藻培养体系中，以控制和/或减少其它污染细菌数量，进而促进小球藻的生长；
所述噬菌蛭弧菌的相应的菌株为保藏编号为CGMCC NO. 15141的噬菌蛭弧菌菌株，且以小球藻培养体系的量计，所述噬菌蛭弧菌细胞的初始浓度为103个/mL到104个/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小球藻为小球藻属中所有小球藻中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其包括将噬菌蛭弧菌细胞悬浊液加入到小球藻培养体系中进行培养的步骤，其中，所述噬菌蛭弧菌细胞悬浊液通过侵染革兰氏阴性杆菌的培养获得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述噬菌蛭弧菌细胞悬浊液的细胞浓度为107-8个/mL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，噬菌蛭弧菌细胞悬浊液在小球藻培养初始阶段加入，或者在小球藻培养过程中发现细菌污染的情况下加入。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述小球藻培养为小球藻的光照自养培养、混养培养或无光照异养培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述小球藻培养为小球藻的光照自养培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，小球藻光照自养培养的温度为20-35℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，小球藻光照自养培养的温度为25-30℃。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用于小球藻培养光照的光源为日光灯或太阳光。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述光照自养培养的光照强度为2000-8000Lx。
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