KR101295659B1 - 사카로파구스 속 균주가 생산하는 베타-아가라제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고온에서 한천분해능을 갖는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp) 균주 유래 베타-아가라제 및 상기 베타-아가라제 유전자를 이용하여 제조한 재조합 생촉매에 관한 것으로서, 본 발명은 신규한 베타-아가라제 또는 상기 베타-아가라제 유전자를 제공함으로써 베타-아가라제가 응용되는 다향한 산업분야에 이용될 수 있다.

사카로파구스, 베타-아가라제, 내열성

Description

사카로파구스 속 균주가 생산하는 베타-아가라제{BETA-AGARASE FROM SACCHAROPHAGUS SP}

본 발명은 고온에서 한천분해능을 갖는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp) 균주 유래 베타-아가라제, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 베타-아가라제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 한천분해 활성을 갖는 생촉매에 관한 것이다.

한천(agar)은 홍조류의 세포벽에서 주로 발견되는 다당류로, 일종의 식이섬유원이다. 한천은 소화 효소에 의해 분해되기 어려운 다당류이므로 영양원으로 제공되진 않으나, 혈중 콜레스테롤을 억제하고, 쓸개즙 산의 형태로 흡착 및 배설됨으로써 체내 콜레스테롤의 절대량을 감소시킬 수 있다고 알려져, 다이어트 식품으로 널리 이용되고 있다. 또한, 한천은 주로 미생물 배양을 위한 고체 배지에 사용되고, 제과, 제육가공에서는 안정제로 사용되며, 화장품이나 음식물에서는 겔화제 로 사용되기도 한다.

한천은 약 70%의 아가로스(agarose)와 약 30%의 아가로펙틴(agaropectin)으로 구성되어 있다. 상기 아가로스는 중성 다당류로서, 상기 아가로스 내에는 갈락토스(galactose)간의 α-1,3 결합과 β-1,4결합이 번갈아 존재하고 있다. 한편, 아가로펙틴은 산성 다당류로서, 상기 아가로펙틴은 아가로스에 황산기, 구체적으로 황산염, 글루콘 산(gluconic acid)이나 파이루베이트(pyruvate)가 결합된 것이다.

상기 한천을 분해하는 효소인 아가라제는 결합을 분해하는 부위에 따라 알파-아가라제와 베타-아가라제로 구분될 수 있다. 상기 알파-아가라제는 아가로즈의 갈락토스 중합체 내의 α-1,3 결합을 분해하여, 아가로올리고당을 제조하며, 상기 아가로올리고당은 apoptosis 유도 활성, 항암활성(Kato, 2000), 항바이러스 활성, 항산화 활성(Chen et al., 2005; Kato, 2000), 면역조절 활성(Yoshizawa et al., 1995), 항알레르기 활성 및 항염증 활성 등을 가진다고 보고되어 있다. 또한, 상기 베타-아가라제는 아가로즈의 갈락토스 중합체 내의 β-1,4 결합을 분해하여 네오아가로올리고당을 제조하며, 상기 네오아가로올리고당은 세균성장 억제 (Kono et al., 1989), 항산화 활성, 전분노화 방지, 보습효과 (Kobayashi et al., 1997), 미백효과 (Kobayashi et al., 1997) 등의 효과를 가진다고 보고되어 있다.

상기 한천올리고당의 효과는 화장품, 제약 및 기능성 식품 등 다양한 산업에 적용이 가능하므로, 최근에는 아가라제를 이용하여 저부가가치의 한천을 고부가가치의 아가로올리고당으로 제조하는 것에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

이와 관련하여, 40℃ 이하의 온도에서는 겔상으로 존재하는 한천의 특성 상, 한천이 졸상으로 존재하는 온도 범위에서 활성을 나타낼 수 있는 내열성 아가라제의 개발에 대한 요구가 증대되고 있다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 베타-아가라제 활성을 가지고, 한천이 겔상에서 졸상으로 변화되는 온도인 40℃ 이상의 온도에서도 한천분해능이 유지되는 한천분해효소, 구체적으로 베타-아가라제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 베타-아가라제의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 베타-아가라제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 한천분해 활성을 갖는 생촉매를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베타-아가라제 활성을 가지고, 한천이 겔상에서 졸상으로 변화되는 온도인 40℃ 이상의 온도에서도 한천분해능이 유지되는 한천분해효소, 구체적으로 베타-아가라제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 베타-아가라제의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터 로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 베타-아가라제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 한천분해 활성을 갖는 생촉매를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 저부가가치의 한천을 고부가가치의 아가로올리고당으로 제조할 수 있는 아가레이즈를 연구하던 중, 한천이 졸상으로 존재하는 40℃ 이하의 온도에서 우수한 활성을 가지는 내열성 베타-아가라제의 유전자 서열을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 있어서, 한천이란 홍조류의 세포벽 구성성분인 점질성의 난소화성 복합다당류로서, 일종의 식이섬유원이다. 한천은 주로 미생물 고체 배지로 사용되며, 제과, 제육가공에서는 안정제로, 화장품이나 음식물에서는 겔화제로, 건강식품, 제약, 치과인상(dental impression)재료, 실험실 시약과 사진에멀젼의 콜로이드 방지제로 사용되고 있다. 상기 한천은 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)으로 구성되며, 주로 약 70%의 아가로스와 약 30%의 아가로펙틴으로 구성되어 있다.

본 발명에 있어서, 아가라제(agarase)란 아가로즈를 분해하는 효소를 의미한다. 상기 아가라제는 아가라제의 분해 패턴에 따라 두 그룹 즉, 아가로스의 알파-1,4 결합을 분해하는 알파-아가라제와 아가로스의 베타-1,4 결합을 분해하는 베타-아가라제(beta-agarase)로 나눌 수 있다.

본 발명에 있어서, 배양물이란 세포, 바람직하게는 미생물, 더욱 바람직하게는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp), 더더욱 바람직하게는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp) AG21 균주 유래 아가라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양한 배양배지를 의미하며, 상기 배양배지는 배양된 미생물을 포함하는 것이다.

본 발명에 있어서, 무세포(cell-free) 배양액이란 세포 또는 미생물을 배양한 배양배지에서 배양된 미생물을 제거한 것을 의미한다. 상기 배양배지는 동물세포나 식물세포 또는 세균 등을 포함하는 미생물을 배양하는데 필요한 영양소가 포함되어 있는 고체 조성물 또는 액체 조성물을 의미하며, 바람직하게는 액체 조성물일 수 있다. 본 발명에 있어서 농축액이란, 상기 배양물 또는 무세포 배양액을 농축한 것을 의미한다.

상기 베타-아가라제는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp) AG21 균주에서 PCR 기법 및 LA-PCR 기법을 이용하여 클로닝된 것이고, 상기 클로닝된 베타-아가라제는 총 1908 bp의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 것이고, 636개의 아미노산으로 번역되며, 약 69kDa의 크기를 갖는다.

상기 베타-아가라제는 최적 반응온도가 55℃이고, 최적 반응 pH가 pH 7.5이며, Fe^{2 +} 첨가에 의해 한천분해 활성이 현저하게 증가되는 특징을 가지고 있다. 또한, 상기 베타-아가라제는 한천 분해 활성을 통하여 한천을 네오테트라오스와 네오헥사오스가 주산물인 네오아가로올리고당을 생산할 수 있다.

상기 최적 반응온도가 한천이 겔상에서 졸상으로 변화되는 온도인 40℃ 보다 높으므로, 한천이 졸상태인 40℃ 이상의 온도에서 한천을 분해하여 한천 올리고당, 구체적으로 네오아가로올리고당을 생산할 수 있어, 종래 문제가 되었던 효소의 효율성이란 부분을 해결할 수 있으므로, 산업적으로 다양하게 응용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명은 피부 미백 효과 등의 생리활성이 우수한 것으로 알려진 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)와 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 주성분으로 하는 네오아가로올리고당을 생산할 수 있으므로, 값싼 한천으로부터 고가의 네오아가로올리고당을 생산할 수 있어, 그 경제적 효과가 매우 크다 할 것이다.

본 발명의 한천분해효소는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 베타-아가라제이다. 상기 베타-아가라제는 바람직하게는 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 베타-아가라제는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp) 균주 유래일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 베타-아가라제 유래 베타-아가라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 폴리뉴클로오타이드는 서열번호 4에 기재된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이다.

또한, 본 발명은 한천분해 활성을 갖는 생촉매에 관한 것이다. 상기 생촉매는 상기 뉴클레오타이드 서열, 구체적으로 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 상기 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 베타-아가라제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 한천분해 활성을 갖는 생촉매일 수 있다.

상기 베타-아가라제는 바람직하게는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 가진 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 아미노산을 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 베타-아가라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 뉴클레오타이드를 결실, 치환 또는 삽입 등으로 변형한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 효소 생촉매 개발을 위한 분리 및 정제 과정에 의한 비용의 증가 및 활성 손실 문제점을 해결하기 위하여, 상기 베타-아가라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 재조합 베타-아가라제 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 상기 벡터의 제조 및 형질전환체의 제조는 통상의 유전공학적 방법에 따라 제조된다.

상기 발현벡터는 사용하는 숙주에 따라 적절히 선택할 수 있고, 형질전환체 에서 단백질을 발현시킬 수 있는 통상의 발현벡터가 모두 적용 가능하며, 일 예로 상기 형질전환체에 의해 발현된 단백질을 정제할 수 있는 융합 파트너(fusion-tag)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터일 수 있다. 구체적으로는, 대장균의 경우에는 도입된 외래 유전자를 형질전환체에서 수용성 형태로 고효율로 발현시킬 수 있는 pET 11a, pET 16b, pET 21a(Novagen Co., Germany), pGEX 4T-1(GE Healthcare, USA) 또는 pHCE 19(BioLeaders Co., 대한민국)일 수 있고, 바람직하게는 pET 11a 또는 pET 16b, 더욱 바람직하게는 pET 16b일 수 있으며, 효모의 경우에는 갈락토스를 암호화하는 유전자인 GAL1의 프로모터를 외래 유전자의 발현에 이용할 수 있는 pYES2(Invitrogen Co., USA) 등을 사용할 수 있다.

상기 형질전환체는 상기 발현벡터를 이용하여 제조한 것으로 상기 형질전환체의 제조에 사용되는 숙주는 대장균, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주와 같은 원핵세포 또는 효모, 곰팡이 등의 진핵세포 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는 상기 발현벡터는 pET-16b 벡터에 서열번호 5의 베타-아가라제를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 서열번호 4의 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 삽입시킨 것이고, 상기 숙주는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 일 예로 E. coli DH5α 또는 E. coli BL21(DE3) 일 수 있다.

상기 형질전환체를 이용하여 베타-아가라제를 생산하는 방법은 상기 형질전환체를 배양배지를 이용하여 배양하고, 상기 배양배지에 포함된 베타-아가라제 또는 상기 형질전환체 내에 존재하는 베타-아가라제를 수득하는 단계를 포함하는 것 일 수 있다.

상기 배양배지, 배양조건 및 배양방법은 형질전환체의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 서열번호 4의 베타-아가라제를 암호화하는 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 pET-16b 에 삽입시켜 제조한 재조합 벡터를 E.coli DH5α 에 도입시켜 제조한 형질전환체를 배양배지에서 배양하여 제조한 재조합 벡터를 E. coli DH5α 도입시켜 제조한 형질전환체를 배양배지에서 배양한 후에, IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside)를 첨가하고 배양하여 제조할 수 있다. 상기 형질전환체에 의해 발현되는 방법으로 제조된 재조합 베타-아가라제는 종래 알려진 통상의 방법으로 정제할 수 있지만, 정제하지 않고 전세포 또는 이의 배양물이나 이의 무세포 배양액 형태로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 베타-아가라제에 관한 발명이다.

상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균일 수 있고, 일 예로 E. coli BL21(DE3) 또는 E. coli DE5α일 수 있다. 상기 발현벡터는 pET 11a 벡터 또는 pET 16b 벡터일 수 있다. 일 예로, 상기 서열번호 4의 유전자 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드를 삽입시킨 pET 16b DE5α벡터를 E. coli에 도입시켜 세포 내 발현을 유도하였다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체, 상기 형질전환체의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축액 및 상기 무세포 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 한천분해활성을 갖는 생촉매에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 베타-아가라제, 상기 재조합 베타-아가라제 및 상기 생촉매로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 함유하는 한천 분해용 조성물을 제공한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 신규한 베타-아가라제는 내열성이 우수하여 한천이 졸상태에 있는 40℃ 보다 높은 55℃에서 최적 활성을 가지고, 금속 이온을 이용하여 분해활성을 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 한천을 분해하여 미백효과 등의 생리활성이 인정되는 고가의 네오테트라오스 및 네오테트라헥사오스를 주성분으로 포함하는 네오아가로올리고당을 생성할 수 있으므로, 본 발명의 신규한 베타-아가라제 및 상기 아가라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 이용한 형질전환체 및 생촉매는 네오아가로올리고당이 사용되는 화장품 및 의료 등의 다양한 분야에서 사용될 수 있으므로, 그 산업적 가치가 매우 크다 할 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것을 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 한천분해효소 생산 미생물 탐색 및 분리

본 발명의 새로운 베타-아가라제를 클로닝하기 위하여, 제주연안의 해조류 지역을 중심으로 해조류, 해수 및 무척추 동물들을 채집하여 멸균 해수에 희석하는 방법으로 시료를 준비하였고, 그 원액을 100 ul씩 1차 선택배지(seawater agar 배지, SWA, 1.5% 한천/멸균해수)에 도말하여고, 30℃에서 3일간 배양하여 1차 스크리닝을 수행하여, 약 50종의 균주를 분리하였다. 상기 1차 스크리닝에서 한천분해활성을 나타내는 균주들을 다시 2차 선택배지(Marine agar, MA, Difco)에 도말하여 30℃에서 3일간 배양하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, 배양 시간이 경과함에 따라 한천이 분해된 주위에 검은색을 나타내어, 한천 분해 양상이 뛰어난 것으로 확인된 균주를 선별하였다.

< 실시예 2> 한천 분해 미생물의 유전학적 동정

한천분해능을 나타내는 상기 균주의 동정은 유전학적 동정법으로 수행하였다. 한천분해능을 나타내는 상기 균주로부터 genomic DNA를 추출하였으며, 하기 표 1의 프라이머쌍을 이용하여, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 16s rRNA 염기서열을 증폭하였고, 증폭된 산물을 PCR purification kit(bioneer, 대한민국)을 이용하여 정제하였으며, ㈜솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 상기 염기서열 분석결과 서열번호 3의 염기서열이 분석되어졌고, 총 염기서열을 1384bp이었다. 상기 염기서열에 대해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Blast N program과 DNassist program을 이용하여 유사 염기서열을 분석한 결과, Saccharophagus degradans의 16s rRNA 서열과 99.0%의 유사성을 나타내어 사카로파구스 속(Saccharophagus sp)으로 동정되었으며, 상기 균주를 사카로파구스 속 AG21 로 명명하였다.

Primers	서열 (5′→3′)	서열번호
27F	AGAGTTTGATCCTGG CTCAG	1
1492R	GGTTACCTTGTTACGACTT	2

< 실시예 3> 아가레이즈 활성 측정

이하의 베타-아가레이즈, 재조합 단백질 및 생촉매의 아가레이즈의 활성의 측정은 3,5-dinitrosalicyclic acid assay(DNS assay)법을 이용하여 측정하였으며, D-갈락토스를 이용하여 검량선을 작성하였다. 보다 상세하게는, 상기 활성 측정은 10ul의 아가레이즈 용액과 190ul의 1% 식용 한천(Cambrex, USA)을 전체 용량 200ul 되도록 혼합한 후, 특정 조건에서 반응시킨 뒤, 1 ml의 DNS 시약을 첨가하고 100℃ 이상에서 10분간 가열반응한 후 실온에서 식히고 575nm에서 흡광도를 측정하였으며, 상기 측정된 흡광도 값을 검량선에 적용하여 활성 값을 계산하였다. 상기 DNS 시약은 3,5-dinitrosalicyclic acid 0.25g과 sodium potassium titrate 7.5g을 50 ml의 2M NaOH 용액에 녹인 후, dH₂O를 이용하여 전체 부피를 250 ml로 맞추는 방법으로 제조하였다. 활성단위는 1umole의 갈락토스가 1분 동안 생성되는 양을 1 unit으로 하였다.

< 실시예 4> 사카로파구스 속 AG21 의 아가레이즈의 유전자 서열 분석

먼저, 사카로파구스 속 AG21 균주의 genomic DNA를 분리하였다.

상기 사카로파구스 속 AG21 균주를 Marine broth에 0.3%의 한천을 첨가한 배지 4 ㎖에 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 진탕(shaking)하면서 36 시간 배양하여, 첨가된 한천이 완전히 분해될 때까지 배양하였다. 상기 배양액을 E-tube에 넣어 4000 rpm에서 10분간 원심분리하여 펠렛(pellet)을 수집하고 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, 독일)을 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 상기 분리된 genomic DNA의 농도는 Spectrophotometer(Bio-RAD, 영국)를 이용하여 260 nm에서 optical density를 측정하였다.

상기 사카로파구스 속 AG21 균주의 아가레이즈 부분 염기서열을 분석하기 위해, 상기 사카로파구스 속 AG21 균주와 가장 높은 유사도를 보인 Saccharophagus degradans 2-40의 아가라제 서열 중에서, AgaB agarase(accession No : CP000282) 서열을 이용하여, 하기 표 2의 4개의 프라이머를 제작하였으며, 상기 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하였다.

Primers	서열 (5′→3′)	서열번호
agaY1-d-F	ATG AAA ACC ACC AAA TGC G	6
agaY1-d-R	TTA GTT GCT AAG CGT GAA N	7
agaY1-I-F	ATG GTG CCT ACG TAA CTG CTG TCT	8
agaY1-I-R	ACC GCT CAA CAG AAA CGT GGT TTG	9

보다 상세하게는, 10X Ex Taq polymerase buffer 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 4 ㎕, 서열번호 6의 정방향 프라이머 1 ㎕ 및 서열번호 7의 역방향 프라이머 1 ㎕, genomic DNA 1 ㎕, Ex Taq DNA polymerase 0.25 ㎕를 혼합하고, nuclease free water 37.75 ㎕를 첨가하여, 전체 반응액 50 ㎕를 제조하였으며, 반응조건은 94℃ 에서 5분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 4분 30초간 30회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다. 상기 PCR 산물은 정제 후 pGEM easy T vector로 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

상기 염기서열 분석 결과, 분석되지 아니한 내부 서열을 분석하기 위하여, 상기 서열번호 8 및 서열번호 9의 내부 sequencing 프라이머를 이용하여 분석을 수행하였다. 상기 분석은 10X Ex Taq polymerase buffer 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 4 ㎕, 서열번호 8의 정방향 프라이머 1 ㎕ 및 서열번호 9의 역방향 프라이머 1 ㎕, genomic DNA 1 ㎕, Ex Taq DNA polymerase 0.25 ㎕를 혼합하고, nuclease free water 37.75 ㎕를 첨가하여, 전체 반응액 50 ㎕를 제조하였으며, 반응조건은 94℃ 에서 5분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 4분 30초간 30회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다. 상기 PCR 산물은 정제 후 pGEM easy T vector로 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

상기 분석결과를 바탕으로, 아가라제를 암호화하는 유전자의 5' 말단과 3'말단의 서열을 확인하기 위하여, long and accurate(LA) PCR을 수행하였다.

보다 상세하게는, genomic DNA 30㎕에 10X BamH I buffer 5 ㎕ 및 각각의 제한 효소 BamH I 또는 EcoR I의 3㎕를 첨가하고 증류수로 전체 부피를 50㎕를 맞춘 후, 37℃에서 3시간 반응시켜 각각 절단하였다. 각각의 반응 산물에 3 M sodium acetate(pH 5.2) 5㎕를 첨가 후, 137.5㎕의 4℃ 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 60분 동안 방치한 후, 4℃ 및 13,000rpm의 조건에서 10분간 원심 분리한 후, 70% 에탄올을 처리하고 원심분리한 후 건조시킨 후에, 20%의 증류수로 희석시켰다. 상기 제한효소로 처리된 AG21의 genomic DNA에 하기 표 3의 Sau3 1A cassette(LA PCR kit, Takara)와 하기 표 3의 EcoR I cassette(LA PCR kit, Takara)을 부착하기 위하여 절단된 genomic DNA 7.5 ㎕에 하기 표 3의 각각의 cassette 2.5 ㎕, ligation mixture 10 ㎕(Takara, 대한민국)을 첨가하여 20℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 산물에 3M sodium acetate(pH 5.2) 2 ㎕를 첨가 후, 50 ㎕의 차가운 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 60분 동안 유지한 후, 4℃ 및 13,000rpm의 조건으로 10분간 원심분리하고, 다시 4℃의 70% 에탄올을 처리하고 원심분리한 후 건조시켰으며, 5 ㎕의 증류수에 희석시켰다.

Primers	서열 (5′→3′)	서열번호
Sau3 1A-F	GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGA	10
Sau3 1A-R	GATCTCTCCATAGTGAGTCGTATTACGCGTTCTAACGACAATATGTAC	11
EcoR I-F	GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAG	12
EcoR I-R	AATTCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGTTCTAACGACAATATGTAC	13

상기 cassete이 결합된 DNA를 이용하여 LA PCR을 수행하였다. 상기 LA PCR의 수행은 첫 번째 LA PCR과 두 번째 LA PCR로 수행하였다.

primer	sequence	object	서열번호
agaY1-5-1	5'-AAT CCA CCC AGC TCA ACC AGC ATA-3'	agaY1 5' GSP1	14
agaY1-5-2	5'-TGC CGA TTA CAC CAT TAC GGT TGC-3'	agaY1 5' GSP2	15
agaY1-3-1	5'-CAA ACC ACG TTT CTG TTG AGC GGT-3'	agaY1 3' GSP1	16
agaY1-3-2	5'-CAG GGC CAA GCC AAG CAT TGA TAA-3'	agaY1 3' GSP2	17
C1 primer	5'-GTA CAT ATT GTC GTT AGA ACG CGT AAT ACG ACT TCA-3'	cassette primer 1	18
C2 primer	5'-CGT TAG AAC GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3'	cassette primer 2	19

상기 LA PCR의 수행은 첫 번째 LA PCR과 두 번째 LA PCR로 수행하였다.

보다 상세하게는, 첫 번째 LA PCR은 각각의 cassette이 ligation된 DNA 1 ㎕를 증류수 33.5 ㎕에 희석하여 DNA solution을 만들어 이를 94°C에서 10분간 denaturation 시켰다. DNA solution에 10X LA buffer II (Mg^{2 +}plus)5㎕, dNT Pmixture (2.5mM) 8㎕, primer C1 1㎕, 상기 표 4의 GSP1 1㎕와 LA taq DNA polymerase(Takara, 일본) 0.5 ㎕를 첨가하였다. 반응 조건은 94 °C에서 1분 반응 후, 94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 4분 30초의 반응을 30회 반복하였고, 마지막으로 72°C에서 5 분간 반응을 수행하였다. PCR 반응 후 PCR product는 1 % agarose gel에 전기영동하여 확인하였다.

두 번째 LA PCR은 첫 번째 LA PCR의 결과물을 1 ㎕에 증류수 33.5 ㎕, 10X LA buffer II (Mg^{2 +}plus) 5 ㎕, dNTP mixture(2.5mM) 8 ㎕, C2 primer 1 ㎕, 상기 표 4의 GSP2 1 ㎕와 LA taq DNA polymerase(Takara, 일본) 0.5 ㎕를 첨가하여 전체 부피가 50 ㎕가 되도록 하였다. 반응 조건은 최초 94 °C 2분 1회 후, 94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 4분 30초의 반응을 30회 반복하였고, 마지막으로 72°C에서 5 분간 반응을 수행하였다. 상기 PCR 반응 후 PCR product는 1 % agarose gel에 전기영동하여 확인하였다.

상기 확인된 아가라제를 암호화하는 PCR 수행결과는 gel purification kit(Bioneet, Korea)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR product 3 ㎕, pGEM-T easy vector(Promega, USA) 1 ㎕에 ligation mix(Takara, 일본)을 첨가하여 4℃에서 12시간 반응시켜 ligation하였고, ligation 산물 10 ㎕와 E. coli DH5α competent cell 100 ㎕와 혼합하여 얼음에 30분 방치하고 42℃에서 1분 30초간 heat shock을 주어 형질 전환을 하였고, 1 ml의 LB broth에서 배양 후 배양액 70 ㎕를 Selection plate (IPTG, X-gal, ampicillin첨가)에 도말하고, white colony를 선별하였다. 선별된 white colony를 ampicillin이 첨가된 LB broth에 innoculation하고 37℃에서 12시간 배양 후 plasmid mini extract kit(bioneer, 대한민국)을 이용하여 정제하고 염기서열 분석을 의뢰하였다.

염기서열 분석 결과, 서열번호 5의 636개의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 4의 1908 bp의 아가레이즈 코딩서열을 확보하였다. 상기 염기서열은 도 3 및 도 4에 나타내었다.

상기 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 아가레이즈의 분자량은 약 69kDA으로, pH 4.2의 등전점을 가지고 있었고, 19번과 20번 아미노산(ala-ala) 사이에 절단부위를 가지는 19개 아미노산의 signal peptide를 가지고 있었다. NCBI의 conserved-domain database search program을 이용하여 agaY1의 아미노산 서열을 분석한 결과 glycosyl hydrolase family 16(GH 16) domain(53-321)을 가지고 있었고, 두 개의 carbohydrate binding module(382-488, 504-636)을 가지고 있었다.

또한, Saccharophagus degradans 2-40의 β-agarase I인 Aga16B (accession number : AAT67062)와 88%의 상동성을 보였고, Microbulbifer agarilyticus 의 agaA3(accession numuber: BAE06228)와 79 %, Pseudomonas sp. ND137의 agarase (accession numuber: BAD88713)과 52%의 유사성을 나타내었다.

< 실시예 5> 아가레이즈 유전자 클로닝 및 대장균에서의 단백질 발현 분석

사카로파구스 속 AG21 균주의 genomic DNA를 주형으로 Nde I 제한효소 절단 부위 서열을 포함하는 하기 표 5의 프라이머를 이용하여 코딩 서열을 PCR 증폭하였다.

Primers	서열 (5′→3′)	서열번호
agaY1-E-F	GAG AGA CAT ATG GCA GAT TGG GAT GGC ATT CC	20
agaY1-E-R	GAG AGA GGA TCC TTA GTT GCT AAG CGT GAA CTT ATC TAG G	21

보다 상세하게는, 상기 PCR은 1 ㎍의 genomic DNA를 template로 하여 20 pmole/㎕ 농도의 각각의 상기 프라이머를 각각 1 ㎕씩 첨가하고 2.5 mM의 dNTP 6 ㎕와 10X Ex Taq Buffer 5 ㎕, 0.25 ㎕ 의 Ex Taq DNA polymerase를 혼합하고 증류수를 이용하여 50 ㎕의 volume으로 PCR반응을 실시히였다. PCR 반응은 94℃에서 5분 반응 후, 94℃에서 30초, 45℃에서 30초 및 72℃에서 2분간을 30회 반복하고, 72℃에서 5분간 반응하였다. 상기 PCR product는 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하고 gel purification kit(bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다.

상기 PCR 산물은 정제 후 pET-16b (Novagen, 독일)를 사용하여 클로닝을 수행하였다. 상기 정제된 agaY1 PCR product와 pET-16b vector(Novagen, 독일)를 각각 40 ㎍, BamH I buffer 5 ㎕와 3 ㎕의 BamH I, BSA(100X) 0.5 ㎕를 첨가 한 후, 전체 용량을 50 ㎕로 맞춰준 후 30℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 후 1% agarose gel에 전기영동하여 완전히 digestion이 되었는지 확인하고, PCR purification kit(Bioneer, 대한민국)을 이용하여 정제하였고, 50 ㎕의 nuclease free water에 elution 하였다. 잘려진 pET-16b와 agaY1 agarase coding 유전자 42 ㎕를 5 ㎕의 NEB buffer 4 와 3 ㎕의 Nde I을 혼합하여 37℃에서 3시간 동안 반응을 시킨 후 CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, NEB, 영국)를 처리하고 37℃에서 1시간 반응 시킨 후 절단된 DNA는 1% agarose gel에 전기영동하여 확인한 후 Gel Purification Kit(Bioneer, 대한민국)을 가지고 정제하였다. 절단된 pET-16b와 PCR 산물은 DNA ligation kit(Takara, 일본)를 사용하여 ligation하였다. pET-16b은 2 ㎕, insert DNA 3 ㎕씩을 넣고, ligation mixture 5 ㎕를 첨가하여 전체 반응 volume을 10 ㎕로 하여 24℃에서 1 시간동안 ligation 반응을 진행하였다. 반응이 끝난 후 1% agarose gel에 전기영동하여 완전히 digestion이 되었는지 확인하고 PCR purification kit(Bioneer, 대한민국)을 이용하여 정제하였고, 50 ㎕의 nuclease free water에 elution 하였다.

상기 ligation 산물은 E. coli DH5α에 transformation 하였으며 transformation 과정은 E. coli DH5α competent cell 55㎕에 ligation 산물 5㎕를 혼합하여 얼음에서 30분간 방치하고 42℃에서 90초간 heat shock를 주어 다시 얼음에 2분간 방치하는 방법으로 수행하였다. 상기 수행 결과에 LB 배지 1㎖를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양한 후 ampicillin이 들어있는 LB plate에 도말하고 12시간 배양하였다. 배양된 평판배지에서 집락를 선택하여 ampicillin이 들어 있는 LB broth에 배양하였다. 배양액을 1.5ml tube에 옮긴 후 Plasmid mini Extraction kit(bioneer, 대한민국)을 이용해 배양된 cell의 plasmid DNA를 분리하였고, 이를 다시 발현용 cell인 E. coli BL21 (Novagen, 독일) competent cell 안으로 형질전환시켜 37℃에서 밤새 배양 후 집락을 선택하여 ampicillin이 들어있는 LB broth 4㎖에 접종하고 12시간 배양하였다.

상기 형질전환된 것으로 확인된 E. coli BL21에 IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside)를 최종농도 0.3 mM이 되도록 첨가하고, 10℃에서 유지하여 재조합 agaY1의 과발현을 유도 하였다. 보다 상세하게는, 3 ml의 재조합 agaY1이 들어있는 E. coli BL21의 배양액을 100㎕의 ampicillin이 첨가된 Luria broth (LB)에 접종하여, 37℃에서 180 rpm으로 진탕하면서 optical density가 600nm파장에서 0.8이 되도록 배양 후, IPTG를 0.3mM이 되도록 첨가하고, 이를 다시 10℃에서 15시간 동안 배양하여 단백질 발현을 유도하였다.

상기 형질전환된 E. coli를 발현시킨 배양액을 4℃ 4000 rpm에서 20분간 원심분리 후 상등액을 제거하고, 5㎖의 His bind kit의 Binding buffer(Novagen, 독일)에 pellet을 재부유시켰고, 이를 -20℃에서 밤새 보관하였다. 발현된 재조합 agaY1은 Histidine taq과 fusion된 단백질로, 발현된 agaY1 agarase는 His·Bind kit을 이용하여 정제 하였다.

상기 정제된 단백질을 확인하기 위하여, AgaY1 의 재조합 단백질을 발현을 유도하기 전과 발현을 유도하고 난 후에 각각 200㎕의 세포를 모은 후, 10%의 polyacrylamide gel에서 SDS-PAGE를 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 도 5에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 분석결과 형질전환 후에 특이적 밴드가 강하게 발현된 것을 확인할 수 있었고, 정제 후에 강하게 발현된 특이적 단백질 밴드로부터 형질전환 여부를 확인할 수 있었다. 또한, 아미노산 서열 분석에 의하여 밝혀진 상기 아가레이즈의 분자량은 66 kDa로 pET-16b에 의하여 his taq(5 kDa)과 퓨전 단백질을 이루었으므로 71 kDa의 단백질이 발현된 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6> 재조합 아가레이즈의 최적 조건 및 분해 패턴 확인

본 발명의 아가레이즈의 최적 반응 조건을 확인하기 위하여, 온도, pH 및 금속이온 첨가의 조건을 각각 달리하면서, 상기 실시예 3의 방법으로 아가레이즈 활성을 측정하였다.

6-1 최적 온도 조건 측정

정제된 재조합 아가레이즈의 최적온도를 확인하기 위하여 40 내지 70℃의 범위에서 5℃ 간격으로 차이를 두어, 상기 실시예 5에서 제조한 재조합 아가레이즈를 10분 동안 배양 후, 남아있는 활성을 1% 한천과 반응시켜 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 아가레이즈는 55℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 최대 활성에 비하여 45℃와 50℃에서도 상대적으로 약 70% 와 약 90% 활성을 나타내었고, 60℃에서도 약 70%의 활성을 나타내었다. 상기한 결과로부터, 본 발명의 아가레이즈는 한천이 졸 상태에 있는 40℃ 이상에서도 우수한 활성을 유지하여, 산업적 가치가 매우 큼을 확인하였다.

6-2 최적 pH 측정

정제된 재조합 아가레이즈의 최적 pH를 확인하기 위하여 1% 한천이 용해된 pH 4.5, pH 5, pH 5.5, pH 6, pH 6.5, pH 7, pH 7.5, pH 8, pH 8.5 및 pH 9로 조정된 용액에 실시예 6에서 제조한 재조합 아가레이즈를 혼합하고, 45℃에서 30분간 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 아가레이즈는 pH 7.5에서 최대활성을 나타내었다.

6-3 금속이온 효과

정제된 재조합 아가레이즈의 활성에 금속이온이 미치는 효과를 확인하기 위하여, CaCl₂, CuSO₄, FeSO₄, KCl, MgSO₄, MnCl₂, NaCl, EDTA 및 ZnSO₄를 각각 2mM이 되도록 아가레이즈와 1% 한천 반응 용액에 각각 첨가 후 45℃에서 30분간 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

상기 도 8에 나타낸 바와 같이, Cu^{2 +}를 첨가하였을 때는 한천분해능이 전혀 관찰되지 아니였고, Mg^{2 +}와 Ca^{2 +} 를 첨가하였을 때, 활성에 있어서 거의 변화가 없었으며, NaCl, Na⁺ 및 K⁺ 의 경우, 34% 활성 증가를 나타내었으며, FeSO₄를 첨가한 경우에 가장 높은 활성을 나타내었다. 상기 결과로부터 Fe^{2 +}의 경우, 활성 증가에 효과가 있음이 확인되었고, 금속 이온을 이용하여 반응 정도를 용이하게 조절할 수 있음이 확인되었다. 효소 반응에서 반응의 조절의 용이성이 산업화에 밀접한 관련이 있으므로, 본 발명의 아가라제는 이러한 측면에서 산업적 가치가 매우 클 것으로 예상되었다.

6-4 한천패턴확인

정제된 제조합 단백질인 agaY1 agarase의 특성 분석을 위하여 thin layer chromatography (TLC)를 수행하였다. 1% agarose (Cambrex, USA), 10 mM Tris Cl buffer(pH 6.5)에 agaY1 agarase를 반응시켜 시간에 따른 분해 양상을 확인하였다. 상기 박막크로마토그래피의 용매는 n-butanol, acetic acid 및 증류수를 2:1:1(n-butanol : acetic acid : water)로 혼합한 혼합액을 사용하였으며, 반응산물은 2㎕ 씩 분주하였다. 플레이트는 Silica gel 60 plate (Merck, Germany)를 사용하였으며, 반응산물을 분주한 후, 위의 용매에서 plate를 전개시켰고, 건조 후 10% 황산 용액을 분사하여 열을 가해 생성된 당을 확인하였다. 컨토롤은 갈락토스와 갈락토스 이당체(NA2), 4당체(NA4), 6당체(NA6)를 사용하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

상기 도9에 나타낸 바와 같이, 본 아가레이즈는 식용 한천을 분해하여 주로 4당체(neoagarotetraose)와 6당체(neoagarohexaose)를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로파구스 속 AG21 균주의 한천부해능을 나타낸 사진이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로파구스 속 AG21 균주의 16s rRNA 염기서열을 나타낸 그림이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로파구스 속 AG21 균주의 아가레이즈 단백질의 1차원적 구조를 나타낸 그림이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 아가레이즈의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 염기서열을 나타낸 그림이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 E. coli에서 생산된 재조합 아가레이즈를 정제한 결과를 SDS-PAGE 상에 나타낸 사진으로, 상기 Lane M은 단백질 마커(size marker)이고, 상기 Lane 1은 발현 유도 전 세포 내 단백질이며, 상기 Lane 2는 발현 유도 후, 세포 내 용해된 단백질이고, 상기 Lane 3은 정제된 아가레이즈 단백질을 표시한다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 재조합 아가레이즈의 최적 온도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 재조합 아가레이즈의 최적 pH 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 재조합 아가레이즈의 활성에 미치는 금속 이온의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 식용한천을 재조합 아가레이즈에 의해 반응시간 별로 분해된 결과를 박층크로마토그래피를 이용해 나타낸 사진으로, 상기 D-gal은 D-갈락토스이고, 상기 NA4는 네오아가로테트로스(4당체)이고, 상기 NA6은 네오아가로헥소스(6당체)이며, 상기 Lane 4 내지 8은 1% 식용한천과 정제된 아가레이즈를 10분, 20분, 30분 및 60분간 반응시킨 결과물이고, 상기 Lane 12 내지 16은 네오아가로헥사니톨(neoagarohexanitol)과 정제된 아가레이즈를 10분, 20분, 30분 및 60분간 반응시킨 결과물이다.

<110> Cheju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> BETA-AGARASE FROM SACCHAROPHAGUS SP <130> KP2009045 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F Primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1429R Primer <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1384 <212> DNA <213> AG21 16S rRNA <400> 3 tgcaagtcga gcgagaaagc cttcgggtga gtatagcggc ggacgggtga gtaacgcgtg 60 ggaatctacc cagtagtggg ggacaacagt tggaaacgac tgctaatacc gcatacgtcc 120 tatgggagaa aggtggcctc tatttataag ctatcgctac tggatgagcc cgcgtcggat 180 tagctagtag gtggggtaat ggcccaccta ggcgacgatc cgtagctggt ctgagaggat 240 gatcagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 300 tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggctttcgg 360 gttgtaaagc actttcagta gggaggaaag gttagtagtt aatacctgct agctgtgacg 420 ttacctacag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg 480 caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gcggttagct aagctagatg 540 tgaaagccca gggcttaacc ttggaactgc atttagaact ggttgactag agtatggtag 600 aggggtgtgg aatttcaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctgaagg aacatcagtg 660 gcgaaggcga caccctggac caatactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca 720 ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtct actagccgtt ggggtccttg 780 aggccttagt ggcgcagcta acgcactaag tagaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt 840 taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900 agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catccagaga acttactaga aatagtttgg 960 tgccttcggg aactctgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020 ttgggttaag tcccgtaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttgctagcag gtaatgctga 1080 gaactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc 1140 atggccctta cgacctgggc tacacacgtg ctacaatggt cagtacaaag ggttgccaag 1200 ccgcgaggtg gagctaatcc cataaaactg atcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg 1260 actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tgaatcagaa tgtcacggtg aatacgttcc 1320 cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg ttgcaccaga agtagctagt 1380 ctaa 1384 <210> 4 <211> 1908 <212> DNA <213> Beta-agarase agaY1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1908) <400> 4 atg aaa acc acc aaa tgc gcc cta gct gcg ctc ttc ttc agt acc cct 48 Met Lys Thr Thr Lys Cys Ala Leu Ala Ala Leu Phe Phe Ser Thr Pro 1 5 10 15 ctt atg gcc gca gat tgg gat ggc att cct gtc cca gcg gac cca ggg 96 Leu Met Ala Ala Asp Trp Asp Gly Ile Pro Val Pro Ala Asp Pro Gly 20 25 30 aat ggc aac acc tgg gag cta cag tcc ctt tct gac gat ttt aat tat 144 Asn Gly Asn Thr Trp Glu Leu Gln Ser Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr 35 40 45 gta gcc cca gct aac ggc att cct gtc cca gcg gac cca ggg aat ggc 192 Val Ala Pro Ala Asn Gly Ile Pro Val Pro Ala Asp Pro Gly Asn Gly 50 55 60 aac acc tgg gag cta cag tcc ctt tct gac gat ttt aat tat gta gcc 240 Asn Thr Trp Glu Leu Gln Ser Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Val Ala 65 70 75 80 cca gct aac ggc aaa agc acc acg ttc tat agt cgc tgg agc gaa ggc 288 Pro Ala Asn Gly Lys Ser Thr Thr Phe Tyr Ser Arg Trp Ser Glu Gly 85 90 95 ttt atc aat gct tgg ctt ggc cct ggc caa acc gaa tac tac gcc ccc 336 Phe Ile Asn Ala Trp Leu Gly Pro Gly Gln Thr Glu Tyr Tyr Ala Pro 100 105 110 aac tcg tca gta gag ggt ggc aac tta gtg att aaa gcc act cgc aag 384 Asn Ser Ser Val Glu Gly Gly Asn Leu Val Ile Lys Ala Thr Arg Lys 115 120 125 ccc ggc aca acc caa atc tat gca ggt gca att cac tcc aaa gaa agt 432 Pro Gly Thr Thr Gln Ile Tyr Ala Gly Ala Ile His Ser Lys Glu Ser 130 135 140 gtt act tac cct ttg tat atg gaa gcg cgc acc aaa att act aac ctc 480 Val Thr Tyr Pro Leu Tyr Met Glu Ala Arg Thr Lys Ile Thr Asn Leu 145 150 155 160 acc ctc gcc aac gca ttt tgg cta cta agc tca gat tcc acc gaa gag 528 Thr Leu Ala Asn Ala Phe Trp Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr Glu Glu 165 170 175 att gat gtg ctg gag tct tac ggt agc gac cgc tca aca gaa acg tgg 576 Ile Asp Val Leu Glu Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Ser Thr Glu Thr Trp 180 185 190 ttt gac gag cgc cta cat tta agc cac cac gtt ttt atc cgc cag cct 624 Phe Asp Glu Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg Gln Pro 195 200 205 ttt caa gac tac caa cca aaa gat gca ggt agc tgg tac ccc aac ccc 672 Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Tyr Pro Asn Pro 210 215 220 gat ggc ggc act tgg cgc gac caa ttt ttc cgt ata ggt gtt tat tgg 720 Asp Gly Gly Thr Trp Arg Asp Gln Phe Phe Arg Ile Gly Val Tyr Trp 225 230 235 240 ata gac cca tgg aca ttg gag tat tac gtg aat ggc gaa tta gta cgc 768 Ile Asp Pro Trp Thr Leu Glu Tyr Tyr Val Asn Gly Glu Leu Val Arg 245 250 255 acc gta agc ggc cca gaa atg att gac ccg tac ggt tac acc aac ggc 816 Thr Val Ser Gly Pro Glu Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr Asn Gly 260 265 270 aca ggc cta agt aaa ccc atg cag gtt att ttt gat gca gag cat cag 864 Thr Gly Leu Ser Lys Pro Met Gln Val Ile Phe Asp Ala Glu His Gln 275 280 285 cct tgg cgc gac gag caa ggt act gcc cca ccc acc gac gct gag cta 912 Pro Trp Arg Asp Glu Gln Gly Thr Ala Pro Pro Thr Asp Ala Glu Leu 290 295 300 gcc gac tcg agt cgc aat caa ttc tta gtt gac tgg gta cga ttc tac 960 Ala Asp Ser Ser Arg Asn Gln Phe Leu Val Asp Trp Val Arg Phe Tyr 305 310 315 320 aaa ccc gtg gca aac aac aat ggt ggc ggc gac cct ggc aac ggt ggt 1008 Lys Pro Val Ala Asn Asn Asn Gly Gly Gly Asp Pro Gly Asn Gly Gly 325 330 335 aat cca gat aat ggc aat ggt ggc aac cct gat aat ggc agc agt ggc 1056 Asn Pro Asp Asn Gly Asn Gly Gly Asn Pro Asp Asn Gly Ser Ser Gly 340 345 350 gat aca gta gtg gta gaa atg gcc aac ttc tct tcc aca ggt aaa gaa 1104 Asp Thr Val Val Val Glu Met Ala Asn Phe Ser Ser Thr Gly Lys Glu 355 360 365 ggc tct gca gtt gca ggc gac act ttc aca ggc ttc aac ccc agc ggc 1152 Gly Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Phe Thr Gly Phe Asn Pro Ser Gly 370 375 380 gcc aac aac atc aac tac aac acc cta ggg gat tgg gca gac tac acg 1200 Ala Asn Asn Ile Asn Tyr Asn Thr Leu Gly Asp Trp Ala Asp Tyr Thr 385 390 395 400 gtg aac ttc ccc gct gcc ggt aat tac acc gta aac cta att gct gcc 1248 Val Asn Phe Pro Ala Ala Gly Asn Tyr Thr Val Asn Leu Ile Ala Ala 405 410 415 tcg ccg gtt aca tct ggg ctg ggt gca gat att ttg gta gac agc agt 1296 Ser Pro Val Thr Ser Gly Leu Gly Ala Asp Ile Leu Val Asp Ser Ser 420 425 430 tac gta ggc acc ata cct gtt agc agc acc gga gct tgg gag ata tac 1344 Tyr Val Gly Thr Ile Pro Val Ser Ser Thr Gly Ala Trp Glu Ile Tyr 435 440 445 aac acc ttt agt ttg ccc agc tcg att tat atc gca agc gca ggc aat 1392 Asn Thr Phe Ser Leu Pro Ser Ser Ile Tyr Ile Ala Ser Ala Gly Asn 450 455 460 cat act att cgc gta caa agc tcc ggc ggc agc gct tgg cag tgg aac 1440 His Thr Ile Arg Val Gln Ser Ser Gly Gly Ser Ala Trp Gln Trp Asn 465 470 475 480 ggc gac gaa ctt cgc ttt acc caa aca gat gcg gat aca ggc acc aat 1488 Gly Asp Glu Leu Arg Phe Thr Gln Thr Asp Ala Asp Thr Gly Thr Asn 485 490 495 cca ccc agc tca acc agc ata acg gtt gaa gca gaa agc ttt aac gcg 1536 Pro Pro Ser Ser Thr Ser Ile Thr Val Glu Ala Glu Ser Phe Asn Ala 500 505 510 gtg ggc ggc acc ttt agc gat gat caa gct caa cct gct agc gtt tac 1584 Val Gly Gly Thr Phe Ser Asp Asp Gln Ala Gln Pro Ala Ser Val Tyr 515 520 525 acc gtt agc ggc aac act gcc att aac tac gta aac caa ggc gat tat 1632 Thr Val Ser Gly Asn Thr Ala Ile Asn Tyr Val Asn Gln Gly Asp Tyr 530 535 540 gcc gac tac acc att acg gtt gcc caa gtg ggt acc tac acc att agc 1680 Ala Asp Tyr Thr Ile Thr Val Ala Gln Val Gly Thr Tyr Thr Ile Ser 545 550 555 560 tat caa gct ggc agt ggc gta aca ggt ggc agc att gag ttt tta gta 1728 Tyr Gln Ala Gly Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser Ile Glu Phe Leu Val 565 570 575 aat gaa aac ggc agc tgg agc agc aaa acc gtt acc gcc gta cca aac 1776 Asn Glu Asn Gly Ser Trp Ser Ser Lys Thr Val Thr Ala Val Pro Asn 580 585 590 caa ggt tgg gat aac ttc caa ccc cta aac gga ggc agc gtt tac cta 1824 Gln Gly Trp Asp Asn Phe Gln Pro Leu Asn Gly Gly Ser Val Tyr Leu 595 600 605 agc gca ggc acc cac caa gtt cgt tta cac ggc gcg ggc agt aac aac 1872 Ser Ala Gly Thr His Gln Val Arg Leu His Gly Ala Gly Ser Asn Asn 610 615 620 tgg cag tgg aac cta gat aag ttc acg ctt agc aac 1908 Trp Gln Trp Asn Leu Asp Lys Phe Thr Leu Ser Asn 625 630 635 <210> 5 <211> 636 <212> PRT <213> Beta-agarase agaY1 <400> 5 Met Lys Thr Thr Lys Cys Ala Leu Ala Ala Leu Phe Phe Ser Thr Pro 1 5 10 15 Leu Met Ala Ala Asp Trp Asp Gly Ile Pro Val Pro Ala Asp Pro Gly 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Trp Glu Leu Gln Ser Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr 35 40 45 Val Ala Pro Ala Asn Gly Ile Pro Val Pro Ala Asp Pro Gly Asn Gly 50 55 60 Asn Thr Trp Glu Leu Gln Ser Leu Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Val Ala 65 70 75 80 Pro Ala Asn Gly Lys Ser Thr Thr Phe Tyr Ser Arg Trp Ser Glu Gly 85 90 95 Phe Ile Asn Ala Trp Leu Gly Pro Gly Gln Thr Glu Tyr Tyr Ala Pro 100 105 110 Asn Ser Ser Val Glu Gly Gly Asn Leu Val Ile Lys Ala Thr Arg Lys 115 120 125 Pro Gly Thr Thr Gln Ile Tyr Ala Gly Ala Ile His Ser Lys Glu Ser 130 135 140 Val Thr Tyr Pro Leu Tyr Met Glu Ala Arg Thr Lys Ile Thr Asn Leu 145 150 155 160 Thr Leu Ala Asn Ala Phe Trp Leu Leu Ser Ser Asp Ser Thr Glu Glu 165 170 175 Ile Asp Val Leu Glu Ser Tyr Gly Ser Asp Arg Ser Thr Glu Thr Trp 180 185 190 Phe Asp Glu Arg Leu His Leu Ser His His Val Phe Ile Arg Gln Pro 195 200 205 Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Tyr Pro Asn Pro 210 215 220 Asp Gly Gly Thr Trp Arg Asp Gln Phe Phe Arg Ile Gly Val Tyr Trp 225 230 235 240 Ile Asp Pro Trp Thr Leu Glu Tyr Tyr Val Asn Gly Glu Leu Val Arg 245 250 255 Thr Val Ser Gly Pro Glu Met Ile Asp Pro Tyr Gly Tyr Thr Asn Gly 260 265 270 Thr Gly Leu Ser Lys Pro Met Gln Val Ile Phe Asp Ala Glu His Gln 275 280 285 Pro Trp Arg Asp Glu Gln Gly Thr Ala Pro Pro Thr Asp Ala Glu Leu 290 295 300 Ala Asp Ser Ser Arg Asn Gln Phe Leu Val Asp Trp Val Arg Phe Tyr 305 310 315 320 Lys Pro Val Ala Asn Asn Asn Gly Gly Gly Asp Pro Gly Asn Gly Gly 325 330 335 Asn Pro Asp Asn Gly Asn Gly Gly Asn Pro Asp Asn Gly Ser Ser Gly 340 345 350 Asp Thr Val Val Val Glu Met Ala Asn Phe Ser Ser Thr Gly Lys Glu 355 360 365 Gly Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Phe Thr Gly Phe Asn Pro Ser Gly 370 375 380 Ala Asn Asn Ile Asn Tyr Asn Thr Leu Gly Asp Trp Ala Asp Tyr Thr 385 390 395 400 Val Asn Phe Pro Ala Ala Gly Asn Tyr Thr Val Asn Leu Ile Ala Ala 405 410 415 Ser Pro Val Thr Ser Gly Leu Gly Ala Asp Ile Leu Val Asp Ser Ser 420 425 430 Tyr Val Gly Thr Ile Pro Val Ser Ser Thr Gly Ala Trp Glu Ile Tyr 435 440 445 Asn Thr Phe Ser Leu Pro Ser Ser Ile Tyr Ile Ala Ser Ala Gly Asn 450 455 460 His Thr Ile Arg Val Gln Ser Ser Gly Gly Ser Ala Trp Gln Trp Asn 465 470 475 480 Gly Asp Glu Leu Arg Phe Thr Gln Thr Asp Ala Asp Thr Gly Thr Asn 485 490 495 Pro Pro Ser Ser Thr Ser Ile Thr Val Glu Ala Glu Ser Phe Asn Ala 500 505 510 Val Gly Gly Thr Phe Ser Asp Asp Gln Ala Gln Pro Ala Ser Val Tyr 515 520 525 Thr Val Ser Gly Asn Thr Ala Ile Asn Tyr Val Asn Gln Gly Asp Tyr 530 535 540 Ala Asp Tyr Thr Ile Thr Val Ala Gln Val Gly Thr Tyr Thr Ile Ser 545 550 555 560 Tyr Gln Ala Gly Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser Ile Glu Phe Leu Val 565 570 575 Asn Glu Asn Gly Ser Trp Ser Ser Lys Thr Val Thr Ala Val Pro Asn 580 585 590 Gln Gly Trp Asp Asn Phe Gln Pro Leu Asn Gly Gly Ser Val Tyr Leu 595 600 605 Ser Ala Gly Thr His Gln Val Arg Leu His Gly Ala Gly Ser Asn Asn 610 615 620 Trp Gln Trp Asn Leu Asp Lys Phe Thr Leu Ser Asn 625 630 635 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> agaY1-d-F <400> 6 atgaaaacca ccaaatgcg 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agaY1-d-R <400> 7 ttagttgcta agcgtgaan 19 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agaY1-I-F <400> 8 atggtgccta cgtaactgct gtct 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agaY1-I-R <400> 9 accgctcaac agaaacgtgg tttg 24 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sau3 1A-F <400> 10 gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata ggga 44 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sau3 1A-R <400> 11 gatctctcca tagtgagtcg tattacgcgt tctaacgaca atatgtac 48 <210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoR I-F <400> 12 gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggagag 47 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoR I-R <400> 13 aattctctcc ctatagtgag tcgtattacg cgttctaacg acaatatgta c 51 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agaY1-5-1 <400> 14 aatccaccca gctcaaccag cata 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agaY1-5-2 <400> 15 tgccgattac accattacgg ttgc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agaY1-3-1 <400> 16 caaaccacgt ttctgttgag cggt 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agaY1-3-2 <400> 17 cagggccaag ccaagcattg ataa 24 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 primer <400> 18 gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg acttca 36 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 primer <400> 19 cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggag 34 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agaY1-E-F <400> 20 gagagacata tggcagattg ggatggcatt cc 32 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agaY1-E-R <400> 21 gagagaggat ccttagttgc taagcgtgaa cttatctagg 40

Claims (8)

1. 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고 사카로파구스 속(Saccharophagus sp.) 균주로부터 분리된 베타-아가라제.
2. 제1항에 있어서,

   상기 베타-아가라제는 서열번호 4에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 베타-아가라제.
3. 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖고 사카로파구스 속(Saccharophagus sp.) 균주로부터 분리된 베타-아가라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
4. 제3항에 있어서,

   상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4에 기재된 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
5. 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 벡터.
6. 제5항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
7. 제6항의 형질전환체, 이의 배양물, 이의 무세포 배양액, 상기 배양물의 농축 액, 상기 무세포 배양액의 농축액 및 제6항의 형질전환체에서 발현시켜 제조한 재조합 베타-아가라제로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 한천분해 활성을 갖는 생촉매.
8. 제7항에 따른 한천분해 활성을 갖는 생촉매를 55℃의 온도 조건, pH 7.5의 pH 조건 및 Fe²⁺의 존재 하에서 한천과 반응시켜 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 생산하는 단계를 포함하는 한천으로부터 네오아가로올리고당을 생산하는 방법.

Images