KR20160142191A - 레반슈크라제 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 레반 생산방법 - Google Patents

레반슈크라제 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 레반 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 레반슈크라제 (levansucrase)를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자 (Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 핵산을 포함하는 레반슈크라제 분비 발현 카세트, 상기 카세트를 포함하는 벡터, 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 형질전환 미생물, 및 상기 형질전환 미생물을 이용한 레반슈크라제 및 레반의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 형질전환 미생물은 단백질 분비 융합 인자를 이용하여 재조합 레반슈크라제를 우수한 효율로 분비 발현할 수 있으며, 상기 미생물로부터 생산된 레반슈크라제를 설탕과 반응시키거나, 또는 상기 미생물을 설탕을 포함한 배지에서 발효시켜 레반을 효과적으로 생산할 수 있다.

Description

레반슈크라제 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 레반 생산방법{A microorganism having enhanced levansucrase productivity and a method of producing levan using the microorganism}
본 발명은 레반슈크라제 (levansucrase)를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자 (Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 핵산을 포함하는 레반슈크라제 분비 발현 카세트, 상기 카세트를 포함하는 벡터, 상기 카세트 또는 벡터를 포함하는 형질전환 미생물, 및 상기 형질전환 미생물을 이용한 레반슈크라제 또는 레반의 제조방법에 관한 것이다.
과당 (fructose) 중합체로 알려진 레반 (levan)은 일부 식물체와 미생물에서 극소량으로 발견되는 천연 물질이며 이눌린 (inulin)과 달리 유일한 수용성 과당 중합체이기 때문에 식의약품 산업과 기능성 화장품, 농축산 산업, 공업용 재료 등 다양한 산업에서 수요가 확대되고 있는 기능성 물질이다.
레반은 용도가 다양하고 시장 잠재력이 큰 새로운 생물 소재임에도 불구하고 지금까지 레반 생산에 관한 연구는 주로 미생물을 이용한 발효법이나 정제된 효소를 이용한 소규모 생산 및 특성 분석 위주로 이루어져 왔다. 1990 년대 초까지는 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)나 바실러스 폴리믹사 (Bacillus polymyxa)와 같은 미생물을 이용한 직접 발효에 의한 레반 생산 연구가 주종을 이루었다. 그러나 미생물을 이용한 발효법의 경우 레반 생합성에 관여하는 레반슈크라제 (levansucrase)의 발현량이 낮고, 반응 생성물에 의한 생합성 저해로 인하여 레반 생성량은 이론 수율의 약 30 내지 50 % 정도에 지나지 않았다. 또한, 레반 생산 미생물은 대부분 레반 가수분해 활성 효소를 가지고 있어서 레반 생산 수율을 저하시키는 요인이 되고 있다.
따라서, 자이모모나스 모빌리스 유래의 레반슈크라제 유전자가 보고된 이후 최근까지는 재조합 레반슈크라제를 생산하고 이를 이용한 효소공정을 통해 레반을 생산하여 직접 발효공정을 대체하고 있다. 따라서 레반슈크라제의 효율적인 재조합 발현은 산업적으로 레반을 대량 생산하기 위한 필수적인 기술이다.
미생물을 이용하여 레반슈크라제와 같은 외래 단백질을 대량 발현하는 경우, 숙주세포나 목적 단백질의 특징에 따라서 단백질의 발현량, 수용성 여부, 발현 장소, 수식 (modification) 등이 각기 달라질 수 있으므로, 효율적인 생산 시스템을 구축하기 위해서는 목적 단백질에 가장 적합한 발현 시스템을 선택하는 것이 중요하다.
재조합 레반슈크라제 생산에 있어서 일반적으로 대장균을 숙주시스템으로 이용하고 있으나, 과발현이 되거나 발현 조건이 맞지 않는 경우 생산되는 레반슈크라제가 활성이 없는 불용성 (inclusion bodies) 형태로 축적되면서 전반적인 활성을 낮추는 경우가 자주 발생하고 있다. 또한, 대장균은 인체에 대한 안전성이 확보되지 않아 생산된 효소를 이용하여 만든 레반의 인체 사용에 대한 제한을 받고 있으므로 효모와 같은 인체에 무해한 GRAS (Generally Recognized As Safe) 미생물의 활용 필요성이 제기되고 있다. 효모 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)는 GRAS 미생물로서, 고등생물과 동일한 진핵세포이며 단백질 전사 및 번역 시스템이 고등생물과 유사하고 소포체 및 골지체 등의 단백질 분비기관을 갖추고 있어, 번역 후 수식 (post-translational modification)을 통해 활성형 단백질을 분비 생산할 수 있는 장점이 있다. 특히, 재조합 융합 단백질을 배양 배지로 분비 생산할 경우 여러 단계의 복잡한 정제과정을 거치지 않고도 쉽게 순수한 효소를 분리할 수 있는 장점이 있다. 그러한 이러한 효모시스템의 다양한 기술적인 장점에도 불구하고 현재까지 레반 생합성 효소 (levansucrase)를 효모에서 효율적으로 생산한 사례가 부재한데, 그 이유는 기존 효모 단백질 분비 발현시스템에서는 효소의 생산성이 낮아 경제성 확보가 어렵기 때문이었다 (PLoS One, Franken J etc., Biosynthesis of levan a bacterial extracellular polysaccharide in the yeast Saccharomyces cerevisiae, 2013, 8(10), e77499).
이에, 본 발명자들은 레반슈크라제를 고효율로 분비 생산할 수 있는 기술을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, GRAS 효모 단백질 분비 융합 인자 기술 (한국특허 제0975596호)을 사용하여 재조합 레반슈크라제의 분비 생산 효율이 우수한 형질전환 균주를 제작하여, 상기 균주가 재조합 레반슈크라제를 효율적으로 분비 생산할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 상기 균주로부터 생산된 재조합 레반슈크라제를 레반 제조 공정에 적용하거나, 상기 균주를 직접 이용한 발효 과정을 통해 레반을 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 레반슈크라제 (levansucrase)를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자 (Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 핵산을 포함하는, 레반슈크라제 분비 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 카세트를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레반슈크라제 (levansucrase)를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는, 레반슈크라제 발현 카세트를 포함하는, 형질전환 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 배양된 미생물 또는 이의 배양 상등액으로부터 레반슈크라제를 회수하는 단계를 포함하는, 레반슈크라제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 미생물 또는 상기 제조방법으로 제조된 레반슈크라제를 설탕과 반응시키는 단계를 포함하는, 레반의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 레반슈크라제 (levansucrase)를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자 (Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 핵산을 포함하는, 레반슈크라제 분비 발현 카세트를 제공한다.
본 발명에서는 미생물로부터 레반 (levan)을 고효율로 분비 생산하기 위해 단백질 분비 융합 인자를 이용하여 레반슈크라제 (levansucrase)를 생산하였으며, 이를 위해 레반슈크라제를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 레반슈크라제 분비 발현 카세트, 상기 카세트를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 미생물을 제조한 후, 이를 이용하여 레반 생산에 유용한 레반슈크라제를 생산하고자 하였다.
상기 "레반 (levan)"은 프럭토스 C6H12O6의 폴리머로 통상적으로 일컫는다. 상기 레반은 또한 레불로산, 폴리프럭토산, 플로프럭토스 및 폴리 에불란으로도 지칭된다. 상기 레반은 프럭토스 고리들 간에 베타-(2->6) 결합을 가진 다당류로서, 이때 번호는 연결되는 프럭토스 고리에서의 탄소 원자를 나타내며, 베타는 입체화학적인 관계를 나타낸다. 또한, 레반은 D-프럭토푸라노시드 단량체 단위들 간의 지배적인 글리코스 결합이 베타-(2->6)인 프럭탄으로 설명된다. 레반은 일반적으로 미생물에 의해 만들어지며, 식물에서는 고분자량 화합물로 생성되지 않으나, 분자량이 100,000 달톤 미만인 일부 저분자량 레반은 생성될 수 있다. 특히, 본 발명에서 레반은 레반슈크라제 (levansucrase)에 의해 생산된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "레반슈크라제 (levansucrase)"는 설탕을 기질로 하여 레반을 생산하는 효소를 말한다. 상기 레반슈크라제는 레반생성 미생물, 즉 라넬라 아쿠아틸리스 (Rhanella aquatilis), 지모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 슈도모나스 아우란티아카 (Pseudomonas aurantiaca), 슈도모나스 시린재 (Pseudomonas syringae), 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans), 아에로박터 레바니쿰 (Aerobacter levanicum), 바실러스 아밀로리퀴파엔시스 (Bacillus amyloliquifaciens), 바실러스 폴리믹사 (Bacillus polymixa), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 코리네박테리움 레바니포르만스 (Corynebacterium laevaniformans), 에르비니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 또는 스트렙토코커스 살리바리우스 (Streptococcus salivarius) 유래일 수 있고, 구체적으로 라넬라 아쿠아틸리스 (Rhanella aquatilis), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis) 또는 슈도모나스 시린재 (Pseudomonas syringae) 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 라넬라 아쿠아틸리스 유래, 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 자이모모나스 모빌리스 유래, 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 레반 생성능을 가지는 효소라면 그 유래나 서열에 관계 없이 모두 포함될 수 있다.
따라서 서열번호 12, 서열번호 13, 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열의 보존서열을 포함하고 하나 이상의 위치에서 1 개 또는 다수개 (단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 20 개, 보다 구체적으로는 2 내지 10 개, 보다 더 구체적으로는 2 내지 5 개)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위된 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 상기 레반슈크라제의 활성을 유지 또는 강화시킬 수 있는 한, 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열에 대하여, 80 % 이상, 구체적으로는 90 % 이상, 보다 구체적으로는 95 % 이상, 특히 구체적으로는 97 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 레반슈크라제의 활성을 함유하는 미생물에서 천연적으로 생기는 돌연변이 서열 또는 인위적인 변이 서열까지도 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "상동성"은 야생형 (wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기 서열과 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교 대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해주는 생물정보 알고리즘 (bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용 가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.
본 발명에서 용어 "단백질 분비 융합 인자 (translational fusion partner: TFP)"는 목적 단백질의 분비에 유용한 인자를 말한다. 상기 단백질 분비 융합 인자는 한국공개특허 제10-2008-0042823호에 개시된 것일 수 있고, 구체적으로 서열번호 15의 TFP 1, 서열번호 16의 TFP 2, 서열번호 17의 TFP 3, 서열번호 18의 TFP 4, 서열번호 19의 TFP 5, 서열번호 20의 TFP 6, 서열번호 21의 TFP 7, 서열번호 22의 TFP 8, 서열번호 23의 TFP 9, 서열번호 24의 TFP 10, 서열번호 25의 TFP 11, 서열번호 26의 TFP 12, 서열번호 27의 TFP 13, 서열번호 28의 TFP 14, 서열번호 29의 TFP 15, 서열번호 30의 TFP 16, 서열번호 31의 TFP 17, 서열번호 32의 TFP 18, 서열번호 33의 TFP 19, 서열번호 34의 TFP 20, 서열번호 35의 TFP 21, 서열번호 36의 TFP 22, 서열번호 37의 TFP 23, 또는 서열번호 38의 TFP 24일 수 있으나, 목적 단백질의 분비 발현을 향상시킬 수 있는 인자라면 제한 없이 포함될 수 있다.
따라서 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열의 보존서열을 포함하고 하나 이상의 위치에서 1 개 또는 다수개 (단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 20 개, 보다 구체적으로는 2 내지 10 개, 보다 더 구체적으로는 2 내지 5 개)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위된 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 상기 목적 단백질의 분비 발현을 향상시킬 수 있는 한, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열에 대하여, 80 % 이상, 구체적으로는 90 % 이상, 보다 구체적으로는 95 % 이상, 특히 구체적으로는 97 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 TFP의 활성을 함유하는 미생물에서 천연적으로 생기는 돌연변이 서열 또는 인위적인 변이 서열까지도 포함할 수 있다.
나아가, 상기 재조합 레반슈크라제가, 라넬라 아쿠아틸리스 유래인 경우 레반슈크라제와 서열번호 17의 TFP 3, 서열번호 18의 TFP 4, 서열번호 22의 TFP 8 또는 서열번호 30의 TFP 16이 연결된 것일 수 있고, 자이모모나스 모빌리스 유래인 경우 레반슈크라제와 서열번호 17의 TFP 3, 서열번호 20의 TFP 6, 서열번호 22의 TFP 8, 서열번호 23의 TFP 9, 서열번호 25의 TFP 11, 서열번호 30의 TFP 16, 서열번호 33의 TFP 19 또는 서열번호 36의 TFP 22와 연결된 것일 수 있으며, 바실러스 서브틸리스 유래인 경우 서열번호 15의 TFP 1, 서열번호 19의 TFP 5, 서열번호 20의 TFP 6, 서열번호 22의 TFP 8, 서열번호 23의 TFP 9, 서열번호 27의 TFP 13, 서열번호 30의 TFP 16 또는 서열번호 33의 TFP 19와 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 레반슈크라제 분비 발현 카세트에 있어서, 포함되는 레반슈크라제를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자를 코딩하는 핵산은 링커 (linker)로 서로 연결된 것일 수 있다.
상기 링커는 프로테아제 인식 서열 또는 친화성 태그 (affinity tag)를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 레반슈크라제를 코딩하는 핵산 서열은 본 발명의 선형 벡터와 세포 내에서 재조합 시키는데 사용되는 링커 DNA를 포함할 수 있다. 이러한 링커 서열을 레반슈크라제를 코딩하는 핵산 서열에 부가하는 것은 일반적인 DNA 기술, 예컨대 PCR 및/또는 제한효소 절단 및 연결로 수행할 수 있다.
본 발명의 링커 DNA는 충분한 길이여야 하고, 숙주 세포 내로 도입되어 세포 내에서 레반슈크라제를 코딩하는 핵산 서열이 TFP를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 선형 벡터안에 재조합을 일으킬 수 있도록 선형 벡터의 핵산 서열 일부와 충분한 상동성을 가지는 것일 수 있다. 구체적으로, 링커 DNA는 20 bp 이상의 길이, 예컨대 30 또는 40 bp 이상의 길이를 갖는다. 보다 구체적으로, 링커 DNA는 선형 벡터와 최소 80 % 정도 상동성을 가지며, 85 %, 90 %, 95 % 또는 99 %의 상동성을 가질 수 있다.
일례로서, 링커 DNA는 프로테아제 인식 서열을 코딩하여 TFP와 목적 단백질 간의 접합 부위에서 절단을 일으킬 수 있다. 예컨대, 링커 DNA는 효모 kex2p 프로테아제 인식 서열 (Lys-Arg를 포함하는 아미노산 서열), 포유동물 퓨린 인식 서열 (Arg-X-X-Arg를 포함하는 아미노산 서열), Factor-Xa 인식 서열 (Ile-Glu-Gly-Arg를 포함하는 아미노산 서열), 엔테로키나제-인식 서열 (Asp-Asp-Lys를 포함하는 아미노산 서열), 서브틸리신 인식 서열 (Ala-Ala-His-Tyr를 포함하는 아미노산 서열), 담배식각바이러스 인식 서열 (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly를 포함하는 아미노산 서열), 유비퀴틴 가수분해효소 인식 서열 (Arg-Gly-Gly를 포함하는 아미노산 서열) 또는 트롬빈 인식 서열 (Arg-Gly-Pro-Arg를 포함하는 아미노산 서열)을 코딩할 수 있다.
본 발명에서 용어 "친화성 태그"는 재조합 융합 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산에 도입될 수 있는 펩타이드 또는 핵산 서열로서 다양한 목적으로 사용될 수 있으며, 예를 들어 목적 단백질의 정제 효율을 높이기 위한 것일 수 있다. 상기 친화성 태그는 GST, MBP, NusA, 티오레독신(thioredoxin), 유비퀴틴, FLAG, BAP, His, STREP, CBP, CBD, 또는 S-태그일 수 있고, 구체적으로는 His-tag일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 친화성 태그는 레반슈크라제의 카르복시 말단 또는 아미노 말단에 연결된 것일 수 있고, 특히 카르복시 말단에 연결된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "핵산"은, DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명에서는 레반슈크라제를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 레반슈크라제 분비 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 용어, "발현 카세트"는 세포 내에서 구조 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 핵산 요소를 지닌다. 자연적으로 발생되거나 합성된 핵산구조로서 일반적으로 발현 카세트는 전사되는 핵산과 프로모터를 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 발현 카세트는 단백질 분비 융합 인자를 코딩하는 핵산 및 레반슈크라제를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있으며, 특히 레반슈크라제의 분비를 유도하는 "레반슈크라제 분비 발현 카세트"로서, 레반슈크라제를 발현하여 분비시킬 수 있다.
일례로, 본 발명의 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제는 서열번호 1의 핵산 서열로 코딩되는 것일 수 있고, 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제는 서열번호 6의 핵산 서열로 코딩되는 것일 수 있으며, 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제는 서열번호 9의 핵산 서열로 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 일례로 본 발명의 단백질 분비 융합 인자로서, TFP 1은 서열번호 39, TFP 2는 서열번호 40, TFP 3은 서열번호 41, TFP 4는 서열번호 42, TFP 5는 서열번호 43, TFP 6은 서열번호 44, TFP 7은 서열번호 45, TFP 8은 서열번호 46, TFP 9는 서열번호 47, TFP 10은 서열번호 48, TFP 11은 서열번호 49, TFP 12는 서열번호 50, TFP 13은 서열번호 51, TFP 14는 서열번호 52, TFP 15는 서열번호 53, TFP 16은 서열번호 54, TFP 17은 서열번호 55, TFP 18은 서열번호 56, TFP 19는 서열번호 57, TFP 20은 서열번호 58, TFP 21은 서열번호 59, TFP 22는 서열번호 60, TFP 23은 서열번호 61, 또는 TFP 24는 서열번호 62의 핵산 서열로 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다.
카세트에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "벡터"는, 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현 시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 염기서열을 함유하는 DNA 생산물을 의미하며, 특히 본 발명에서 상기 목적 단백질은 레반슈크라제 및 단백질 분비 융합 인자를 포함하는 재조합 융합 단백질을 의미한다.
상기 벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현 조절용 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성 유전자, 난발현성 단백질의 분비 발현에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 상기 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합 인자로서, 상기 단백질 분비 융합 인자를 사용함이 바람직할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제를 고분비 생산하는 발현 벡터로, TFP 16 및 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제 유전자를 포함하는 YGaST16-lsrA-6H를 제작하였다 (도 16).
본 발명의 다른 구체적인 일실시예에서는 자이모모나스 모빌리스 유래의 레반슈크라제를 고분비 생산하는 발현 벡터로, TFP 8 및 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제 유전자를 포함하는 YGaST8-levU-6H를 제작하였다 (도 17).
본 발명의 또 다른 구체적인 일실시예에서는 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제를 고분비 생산하는 발현 벡터로, TFP 8 및 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제 유전자를 포함하는 YGaST8-BsSacB-6H를 제작하였다 (도 18).
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 레반슈크라제 (levansucrase)를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는, 레반슈크라제 분비 발현 카세트를 포함하는, 형질전환 미생물을 제공한다.
레반슈크라제, 단백질 분비 융합 인자, 핵산, 및 레반슈크라제 분비 발현 카세트에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주 세포라면 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 레반슈크라제 유전자의 도입효율과 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 형질전환 미생물은 효모일 수 있고, 더 구체적으로 상기 효모는 캔디다 (Candida), 디베리오마이세스 (Debaryomyces), 한세눌라 (Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 야로이야 (Yarrowia), 사카로마이시스 (Saccharomyces), 슈완니오마이세스 (Schwanniomyces) 또는 아르술라 (Arxula) 속에 속하는 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 캔디다 유틸리스 (Candida utilis), 캔디다 보이디니 (Candida boidinii), 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 피키아 스티피티스 (Pichia stipitis), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이시스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 야로이야 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) 또는 아르술라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 라넬라 아쿠아틸리스 (Rhanella aquatilis), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래 레반슈크라제 (levansucrase) 유전자를 분비 발현할 수 있는 최적의 효모 분비 융합인자를 선별하고, 이로부터 제작된 각각의 발현 벡터 및 각각의 벡터로 형질전환된 효모를 이용하여 재조합 레반슈크라제 생산을 확인하였다 (도 2 내지 도 26).
본 발명에서 일례로, 레반슈크라제 발현에 사용한 GAL10 프로모터는 갈락토스에 의하여 전사가 유도되는 프로모터이지만, GAL80 유전자가 불활성화된 균주에서는 갈락토스 존재 여부와 관계없이 높은 유전자 발현을 유지할 수 있다. 또한, SUC2 유전자의 산물인 인버타제 (Invertase)는 설탕을 포도당과 과당으로 분해하는 효소이므로 인버타제가 존재하는 균주를 이용하여 레반슈크라제를 발현하면 일부 설탕은 레반으로 전환되지 않고 포도당과 과당으로 분해되어 레반 생산능이 감소한다. 상기와 같은 이유로 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 GAL80 유전자와 SUC2 유전자가 동시에 불활성화된 균주를 이용하여 레반슈크라제를 발현하였다.
상기 형질전환 미생물을 제작하기 위한 구체적인 일실시예로서, LNK39 (서열번호 4)와 HisGT50R 프라이머 (서열번호 5)로 증폭한 PCR 산물은 벡터의 링커 (linker) 말단과 40 염기, GAL7 전사종결자 말단과 50 염기가 동일하기 때문에, 선형화된 벡터와 함께 효모 세포로 도입하면 세포 내에서 교차가 일어나서 레반슈크라제 유전자와 단백질 분비 융합 인자 벡터가 일정한 방향으로 연결될 수 있다. 나아가, 상기 PCR 산물 및 벡터가 도입된 효모를 우라실 (uracil)이 없는 선택 배지인 SD-Ura 배지 (0.67 % 아미노산이 결여된 효모 기질, 0.77 % 우라실이 결핍된 영양 보충물, 2 % 포도당)에서 선별하면 대장균을 이용한 벡터 제작 과정 없이 곧바로 각각의 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제작할 수 있다 (도 1).
또한, 상기 형질전환된 효모를 유가식 배양하여 레반슈크라제를 정제한 뒤 정제한 효소를 이용하여 레반을 생산하거나 (도 27, 도 28, 및 표 4 내지 표 9), 또는 상기 형질전환된 효모를 발효하여 레반을 생산할 수 있음을 확인하였다 (표 10).
구체적으로, 분비 생산된 레반슈크라제의 레반 생산능을 분석한 결과, 전형적으로 레반 생산시에 나타나는 탁도가 증가하는 현상이 나타났으며, HPLC 분석에서도 대조군으로 사용한 대장균 유래의 표품 레반슈크라제를 이용하여 생산된 레반과 동일한 분자량을 갖는 레반이 생산되었음을 확인되었다. 또한 상기 형질전환된 재조합 효모를 설탕 (sucrose)을 함유하는 배지에서 배양한 경우 배양과정에서 세포 밖으로 분비된 레반슈크라제에 의하여 설탕으로부터 레반이 생산되는 것을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 (i) 상기 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 이의 배양 상등액으로부터 레반슈크라제를 회수하는 단계를 포함하는, 레반슈크라제의 제조방법을 제공한다.
형질전환 미생물 및 레반슈크라제에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.
상기 형질전환 미생물을 배양하기 위한 배지 및 배양 조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택 이용할 수 있다. 구체적으로는 탄소원으로 포도당이 포함된 YEPD 액체배지 (2 % 포도당, 4 % 효모 추출물, 1 % 펩톤)에서 배양하며, 포도당 소모에 따라 공급 배지 (30 % 포도당, 15 % 효모 추출물)를 추가하면서 50 시간 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는, 상기 형질전환 미생물을 이용해 유가식 배양을 수행하여, 레반슈크라제를 확보하였다.
본 발명의 용어, "유가식 배양"은 생산물의 높은 최종 농도와 생산성을 가지는 배양 방법으로서, 고농도 세포 배양에 매우 자주 이용되며, 초기에 한 번 배지를 채운 후, 새로운 배양액이나 성장 제한 기질 용액 또는 생산물의 전구체 등을 추가로 공급하지만 반응 생성물은 발효조에 남아있게 하는 방법일 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 유가식 배양의 바람직한 방법은 50 ㎖의 최소 액체 배지 (0.67 % 아미노산이 결여된 효모 질소원 기질, 0.5 % 카사미노산, 2 % 포도당)에 1 단계 종균 배양한 후, 다시 200 ㎖의 YEPD 액체배지에서 배양하여 활성화시킨 후, 본 배양액에 접종하여 30 ℃에서 48 시간 동안 배양하면서 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지 (15 % 효모 추출물, 30 % 포도당)를 추가 공급하는 것이다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 형질전환 미생물 또는 상기 제조방법으로 제조된 레반슈크라제를 설탕과 반응시키는 단계를 포함하는, 레반의 제조방법을 제공한다.
형질전환 미생물, 레반슈크라제의 제조방법, 및 레반에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.
상기 반응은 pH 4.5 내지 pH 7.5에서 수행되는 것일 수 있고, 상기 반응은 1 ℃ 내지 45 ℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
레반슈크라제를 설탕과 반응시키는 것과 관련하여, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 제조된 레반슈크라제를 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였고 (도 26), 정제된 레반슈크라제의 활성 최적조건을 분석하였으며 (표 3, 도 27 및 도 28), 레반슈크라제로부터 레반이 우수한 수율로 생산될 수 있음을 확인하였다 (표 4 내지 표 9).
한편, 상기 형질전환 미생물을 설탕과 반응시키는 단계는 형질전환 미생물을 설탕을 포함하는 배지에서 발효시키거나, 당밀을 포함하는 배지에서 발효시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
레반슈크라제를 생산한 후 설탕과 반응하여 레반을 생산하는 효소 공정에 비하여 형질전환 균주를 설탕을 포함하는 배지에서 직접 발효하여 레반을 생산함으로써, 효소 생산 및 정제 비용이 들지 않고, 레반슈크라제의 작용으로 생성되는 과당, 포도당, 및 설탕 잔량을 형질전환 균주가 탄소원으로 사용 가능하기 때문에 고순도의 레반 생산이 가능할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 라넬라 아쿠아틸리스 유래 및 바실러스 서브틸리스 유래 재조합 효모를 5 % 설탕이 첨가되어있는 배지에서 2 일 동안 배양하여 레반이 고수율로 생산되는 것을 확인하였고 (표 10), 다른 구체적인 일 실시예에서는 라넬라 아쿠아틸리스 유래 및 바실러스 서브틸리스 유래 재조합 효모를 당밀을 함유하는 배지에서 72 시간 동안 배양하여 레반이 고수율로 생산되는 것을 확인하였다 (표 11).
본 발명의 형질전환 미생물은 단백질 분비 융합 인자에 의하여 재조합 레반슈크라제를 우수한 효율로 분비 발현할 수 있으며, 상기 미생물로부터 생산된 레반슈크라제를 설탕과 반응시키거나, 또는 상기 미생물을 설탕을 포함한 배지에서 발효시켜 레반을 효과적으로 생산할 수 있다.
도 1은 3 종의 레반슈크라제 유전자(lsrA, levU, BsSacB)를 24 종의 효모 단백질 분비 융합 인자 (TFP)를 포함하는 GAL10 프로모터 벡터에 연결하여 사카로마이세스 세레비지에 균주에 도입하는 생체 내 재조합 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 사카로마이세스 세레비지에 균주 24 종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3은 사카로마이세스 세레비지에 균주 24 종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 웨스턴블랏으로 분석한 결과이다.
도 4는 24 종의 TFP 균주 중에서 1 차로 선별된 5 종의 균주에서 3 개씩의 단일 균주를 배양하여 분비된 레반슈크라제 단백질 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 5는 24 종의 TFP 균주 중에서 1 차로 선별된 5 종의 균주에서 3 개씩의 단일 균주를 배양하여 분비된 레반슈크라제 단백질 상등액을 웨스턴블랏으로 분석한 결과이다.
도 6은 사카로마이세스 세레비지에 균주 24 종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 7은 사카로마이세스 세레비지에 균주 24 종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.
도 8은 사카로마이세스 세레비지에 균주 24 종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액으로부터 효소 활성을 분석한 결과이다.
도 9는 24 종의 TFP 균주 중에서 1 차로 선별된 8 종의 균주에서 3 개씩 단일 균주를 배양하여 분비된 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 10은 24 종의 TFP 균주 중에서 1 차로 선별된 8 종의 균주에서 3 개씩 단일 균주를 배양하여 분비된 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 웨스턴블랏으로 분석한 결과이다.
도 11은 24 종의 TFP 균주 중에서 1 차로 선별된 8 종의 균주에서 3 개씩 단일 균주를 배양하여 분비된 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액으로부터 효소 활성을 분석한 결과이다.
도 12는 사카로마이세스 세레비지에 균주 24 종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 13은 사카로마이세스 세레비지에 균주 24 종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 DNS 분석방법으로 활성을 측정한 결과이다.
도 14는 24종의 TFP 균주 중에서 1 차로 선별된 8 종의 균주에서 3 개씩 단일 균주를 배양하여 세포 밖으로 분비된 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 15는 24종의 TFP 균주 중에서 1 차로 선별된 8 종의 균주에서 3 개씩 단일 균주를 배양하여 세포 밖으로 분비된 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제 단백질 상등액을 DNS 분석방법으로 활성을 측정한 결과이다.
도 16은 분비 융합 인자 TFP 16번과 lsrA 유전자를 포함하고 있는 YGa-ST16-lsrA-6H 발현 및 분비 벡터의 모식도이다.
도 17은 분비 융합 인자 TFP 8번과 levU 유전자를 포함하고 있는 YGa-ST8-levU-6H 발현 및 분비 벡터의 모식도이다.
도 18는 분비 융합 인자 TFP 8번과 BsSacB 유전자를 포함하고 있는 YGa-ST8-BsSacB-6H 발현 및 분비 벡터의 모식도이다.
도 19는 재조합 벡터인 YGa-ST16-lsrA-6H를 함유한 효모 사카로마이세스 세레비지에 균주를 5L 발효조에서 유가식 발효했을 때 세포의 성장을 나타낸 것이다.
도 20은 재조합 벡터인 YGa-ST16-lsrA-6H를 함유한 효모 사카로마이세스 세레비지에 균주를 5 L 발효조에서 유가식 발효하면서 시간별로 취한 배지 20 ㎕와 세포 파쇄액 1 ㎕를 SDS-PAGE 분석한 결과이다.
도 21은 발효 시간별로 취한 배지 및 세포 파쇄액을 가지고 효소 활성을 측정하여 세포성장 시간별 세포 내외의 효소분비량에 대한 변화과정을 보여주는 도이다.
도 22는 재조합 벡터인 YGa-ST16-lsrA-6H를 함유한 효모 사카로마이세스 세레비지에 Y2805GS 균주를 5 L 발효조에서 유가식 발효하여 세포의 성장 시간별로 취한 배지 20 ㎕를 SDS-PAGE 및 웨스턴블랏으로 분석한 결과이다.
도 23은 재조합 벡터인 YGa-ST8-levU-6H를 함유한 효모 사카로마이세스 세레비지에 Y2805GS 균주를 5 L 발효조에서 유가식 발효하여 세포의 성장 시간별로 취한 배지 20 ㎕를 SDS-PAGE 및 웨스턴블랏으로 분석한 결과이다.
도 24는 재조합 벡터인 YGa-ST8-BsSacB-6H를 함유한 효모 사카로마이세스 세레비지에 균주를 5 L 발효조에서 유가식 발효했을 때 세포의 성장을 나타낸 것이다.
도 25는 재조합 벡터인 YGa-ST8-BsSacB-6H를 함유한 효모 사카로마이세스 세레비지에 Y2805GS 균주를 5 L 발효조에서 유가식 발효하여 세포의 성장 시간별로 취한 배지 20 ㎕를 SDS-PAGE 한 후 웨스턴블랏으로 분석한 결과이다
도 26은 정제된 2 종의 레반슈크라제의 최종 정제분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 27은 정제된 2 종의 레반슈크라제의 최적 pH를 분석한 결과이다.
도 28은 정제된 2 종의 레반슈크라제의 최적 온도를 분석한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 라넬라 아쿠아틸리스( Rhanella aquatilis ) 유래 레반슈크라제 (levansucrase) 발현을 위한 효모 단백질분비 융합인자 (TFP) 선별
라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제 유전자 (lsrA, 서열번호 1) 분비 발현 벡터를 제작하기 위하여, pRL1CP (Seo et al., Journal of Biotechnology 81, 63(2000))를 주형으로 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머를 이용한 1 차 PCR (94 ℃ 5분 1회; 94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분 사이클 25 회; 72 ℃ 7분 1회) 반응으로 lsrA 유전자를 증폭 하였다. 상기 1 차 PCR로 증폭된 유전자는 다시 LNK39 (서열번호 4)와 HisGT50R (서열번호 5) 프라이머로 2 차 증폭하여, 단백질 분비 융합 인자를 함유한 벡터로 세포 내 재조합 (in vivo recombination)에 필요한 서열이 도입되고, 카르복시 말단에는 단백질 정제시 사용될 히스티딘 태그 (Histidine tag)가 도입된 재조합 유전자를 확보하였다.
상기 증폭된 유전자는 단백질 분비 발현을 도와주는 24 종의 단백질 분비 융합 인자 (한국특허 제0975596호)를 함유한 선형의 벡터와 함께 효모 균주 Y2805GS (Mat a pep4::HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52, gal80, suc2)에 도입하여 세포 내 재조합을 통하여 형질전환체가 형성되도록 하였다 (도 1). 본 발명에 사용된 단백질 분비 융합 인자의 아미노산 서열 (표 1) 및 뉴클레오티드 서열 (표 2)은 하기와 같다.
단백질 분비 융합 인자의 아미노산 서열
단백질 분비 융합 인자 아미노산 서열
TFP 1 MFNRFNKFQAAVALALLSRGALGDSYTNSTSSADLSSITSVSSASASATASDSLSSSDGTVYLPSTTISGDLTVTGKVIATEAVEVAAGGKLTLLDGEKYVFSSEAASASAGLALDKR (서열번호 15)
TFP 2 MTPYAVAITVALLIVTVSALQVNNSCVAFPPSNLRGKNGDGTNEQYATALLSIPWNGPPESSRDINLIELEPQVALYLLENYINHYYNTTRDNKCPNNHYLMGGQLGSSSDNRSLNEAASASAGLALDKR (서열번호 16)
TFP 3 MQFKNVALAASVAALSATASAEGYTPGEPWSTLTPTGSISCGAAEYTTTFGIAVQAITSSKAKRDVISQIGDGQVQATSAATAQATDSQAQATTTATPTSSEKMAASASAGLALDKR (서열번호 17)
TFP 4 MRFAEFLVVFATLGGGMAAPVESLAGTQRYLVQMKERFTTEKLCALDDKAASASAGLALDKR (서열번호 18)
TFP 5 MFNRFNKFQAAVALALLSRGALGAPVNTTTEDETALIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVAASASAGLALDKR (서열번호 19)
TFP 6 MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVAASASAGLALDKR (서열번호 20)
TFP 7 MVFGQLYALFIFTLSCCISKTVQADSSKESSSFISFDKESNWDTISTISSTADVISSVDSAIAVFEFDNFSLLDSLMIDEEYPFFNRFFANDVSLTVHDDSPLNISQSLSPIMEQFTVDELPESASDLLYEYSLDDKSIVLFKFTSDAYDLKKLDEFIDSCLSFLEDKSGDNLTVVINSLGWAFEDEDGDDEYATEETLSHHDNNKGKEGDDLAASASAGLALDKR (서열번호 21)
TFP 8 MLQSVVFFALLTFASSVSAIYSNNTVSTTTTLAPSYSLVPQETTISYADDLAASASAGLALDKR (서열번호 22)
TFP 9 MKFSTAVTTLISSGAIVSALPHVDVHQEDAHQHKRAVAYKYVYETVVVDSDGHTVTPAASEVATAATSAIITTSVLAPTSSAAAADSSASIAVSSAALAKNEKISDAAASATASTSQGASSSSYLAASASAGLALDKR (서열번호 23)
TFP 10 MNWLFLVSLVFFCGVSTHPALAMSSNRLLKLANKSPKKIIPLKDSSFENILAPPHENAYIVALFTATAPEIGCSLCLELESEYDTIVASWFDDHPDAKSSNSDTSIFFTKVNLEDPSKTIPKAFQFFQLNNVPRLFIFKLNSPSILDHSVISISTDTGSERMKQIIQAIKQFSQVNDFSLHLPVGLAASASAGLALDKR (서열번호 24)
TFP 11 MKFSSVTAITLATVATVATAKKGEHDFTTTLTLSSDGSLTTTTSTHTTHKYGKFNKTSKSKTPLAASASAGLALDKR (서열번호 25)
TFP 12 MASFATKFVIACFLFFSASAHNVLLPAYGRRCFFEDLSKGDELSISFQFGDRNPQSSSQLTGDFIIYGPERHEVLKTVRELAASASAGLALDKR (서열번호 26)
TFP 13 MQYKKTLVASALAATTLAAYAPSEPWSTLTPTATYSGGVTDYASTFGIAVQPISTTSSASSAATTASSKAKRAASQIGDGQVQAATTTASVSTKSTAAAVSQIGDGQIQATTKTTAAAVSQIGDGQIQATTKTTSAKTTAAAVSQISDGQIQATTTTLAPLAASASAGLALDKR (서열번호 27)
TFP 14 MQFKNALTATAILSASALAANSTTSIPSSCSIGTSATATAQATDSQAQATTTAPLAASASAGLALDKR (서열번호 28)
TFP 15 MVSKTWICGFISIITVVQALSCEKHDVLKKYQVGKFSSLTSTERDTPPSTTIEKWWINVCEEHNVEPPEECKKNDMLCGLTDVILPGKDAITTQIIDFDKNIGFNVEETESALTLTLNGATWGANSFDAKLEFQCNDNMKQDELAASASAGLALDKR (서열번호 29)
TFP 16 MKLSALLALSASTAVLAAPAVHHSDNHHHNDKRAVVTVTQYVNADGAVVIPAATTATSAAADGKVESVAAATTTLSSTAAAATTLAASASAGLALDKR (서열번호 30)
TFP 17 MKLSTVLLSAGLASTTLAQFSNSTSASSTDVTSSSSISTSSGSVTITSSEAPESDNGTSTAAPTETSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTALPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTGLPTNGTTSAFPPTTSLPPSNTTTTPPYNPSTDYTTDYTVVTEYTTYCPERAASASAGLALDKR (서열번호 31)
TFP 18 MRFSTTLATAATALFFTASQVSAIGELAFNLGVKNNDGTCKSTSDYETELQALKSYTSTVKVYAASDCNTLQNLGPAAEAEGFTIFVGVWPLAASASAGLALDKR (서열번호 32)
TFP 19 MRLSNLIASASLLSAATLAAPANHEHKDKRAVVTTTVQKQTTIIVNGAASTPVAALEENAVVNSAPAAATSTTSSAASVATAASSSENNSQVSAAASPASSSAATSTQSSLAASASAGLALDKR (서열번호 33)
TFP 20 MQFSTVASIAAVAAVASAAANVTTATVSQESTTLVTITSCEDHVCSETVSPALVSTATVTVDDVITQYTTWCPLTTEAPKNGTSTAAPVTSTEAPKNTTSAAPTHSVTSYTGAAAKALPAAGALLAASASAGLALDKR (서열번호 34)
TFP 21 MKFSSALVLSAVAATALAESITTTITATKNGHVYTKTVTQDATFVWGGEDSYASSTSAAESSAAETSAAETSAAATTSAAATTSAAETSSAAETSSADEGSGSSITTTITATKNGHVYTKTVTQDATFVWTGEGSSNTWSPSSTSTSSEAATSSASTTATTLLAASASAGLALDKR (서열번호 35)
TFP 22 MKFQVVLSALLACSSAVVASPIENLFKYRAVKASHSKNINSTLPAWNGSNSSNVTYANGTNSTTNTTTAESSQLQIIVTGGQVPITNSSLTHTNYTRLFNSSSALNITELYNVARVVNETIQDNLAASASAGLALDKR (서열번호 36)
TFP 23 MRAITLLSSVVSLALLSKEVLATPPACLLACVAQVGKSSSTCDSLNQVTCYCEHENSAVKKCLDSICPNNDADAAYSAFKSSCSEQNASLGDSSGSASSSVLAASASAGLALDKR (서열번호 37)
TFP 24 MKLSTVLLSAGLASTTLAQFSNSTSASSTDVTSSSSISTSSGSVTITSSEAPESDNGTSTAAPTETSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTTAIPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTALPTNGTSTEAPTDTTTEAPTTGLPTNGTTSAFPPTTSLPPSNTTTTLAASASAGLALDKR (서열번호 38)
단백질 분비 융합 인자의 뉴클레오티드 서열
단백질 분비 융합 인자 뉴클레오티드 서열
TFP 1 ATGTTCAATCGTTTTAACAAATTCCAAGCTGCTGTCGCTTTGGCCCTACTCTCTCGCGGCGCTCTCGGTGACTCTTACACCAATAGCACCTCCTCCGCAGACTTGAGTTCTATCACTTCCGTCTCGTCAGCTAGTGCAAGTGCCACCGCTTCCGACTCACTTTCTTCCAGTGACGGTACCGTTTATTTGCCATCCACAACAATTAGCGGTGATCTCACAGTTACTGGTAAAGTAATTGCAACCGAGGCCGTGGAAGTCGCTGCCGGTGGTAAGTTGACTTTACTTGACGGTGAAAAATACGTCTTCTCATCTGAGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 39)
TFP 2 ATGACGCCCTATGCAGTAGCAATTACCGTGGCCTTACTAATTGTAACAGTGAGCGCACTCCAGGTCAACAATTCATGTGTCGCTTTTCCGCCATCAAATCTCAGGGGCAAGAATGGAGACGGTACTAATGAACAGTATGCAACTGCACTACTTTCTATTCCCTGGAATGGGCCTCCTGAGTCATCGAGGGATATTAATCTTATCGAACTCGAACCGCAAGTTGCACTCTATTTGCTCGAAAATTATATTAACCATTACTACAACACCACAAGAGACAATAAGTGCCCTAATAACCACTACCTAATGGGAGGGCAGTTGGGTAGCTCATCGGATAATAGGAGTTTGAACGAGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 40)
TFP 3 ATGCAATTCAAAAACGTCGCCCTAGCTGCCTCCGTTGCTGCTCTATCCGCCACTGCTTCTGCTGAAGGTTACACTCCAGGTGAACCATGGTCCACCTTAACCCCAACCGGCTCCATCTCTTGTGGTGCAGCCGAATACACTACCACCTTTGGTATTGCTGTTCAAGCTATTACCTCTTCAAAAGCTAAGAGAGACGTTATCTCTCAAATTGGTGACGGTCAAGTCCAAGCCACTTCTGCTGCTACTGCTCAAGCCACCGATAGTCAAGCCCAAGCTACTACTACCGCTACCCCAACCAGCTCCGAAAAGATGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 41)
TFP 4 ATGAGATTTGCAGAATTCTTGGTGGTATTTGCCACGTTAGGCGGGGGGATGGCTGCACCGGTTGAGTCTCTGGCCGGGACCCAACGGTATCTGGTGCAAATGAAGGAGCGGTTCACCACAGAGAAGCTGTGTGCTTTGGACGACAAGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 42)
TFP 5 ATGTTCAATCGTTTTAACAAATTCCAAGCTGCTGTCGCTTTGGCCCTACTCTCTCGCGGCGCTCTCGGTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACTAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTTAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 43)
TFP 6 ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTTAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 44)
TFP 7 ATGGTGTTCGGTCAGCTGTATGCCCTTTTCATCTTCACGTTATCATGTTGTATTTCCAAAACTGTGCAAGCAGATTCATCCAAGGAAAGCTCTTCCTTTATTTCGTTCGACAAAGAGAGTAACTGGGATACCATCAGCACTATATCTTCAACGGCAGATGTTATATCATCCGTTGACAGTGCTATCGCTGTTTTTGAATTTGACAATTTCTCATTATTGGACAGCTTGATGATTGACGAAGAATACCCATTCTTCAATAGATTCTTTGCCAATGATGTCAGTTTAACTGTTCATGACGATTCGCCTTTGAACATCTCTCAATCATTATCTCCCATTATGGAACAATTTACTGTGGATGAATTACCTGAAAGTGCCTCTGACTTACTATATGAATACTCCTTAGATGATAAAAGCATCGTTTTGTTCAAGTTTACCTCGGATGCCTACGATTTGAAAAAATTAGATGAATTTATTGATTCTTGCTTATCGTTTTTGGAAGATAAATCTGGCGACAATTTGACTGTGGTTATTAACTCTCTTGGTTGGGCTTTTGAAGATGAAGATGGTGACGATGAATATGCAACAGAAGAGACTTTGAGCCATCATGATAACAACAAGGGTAAAGAAGGCGACGATCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 45)
TFP 8 ATGCTTCAATCCGTTGTCTTTTTCGCTCTTTTAACCTTCGCAAGTTCTGTGTCAGCGATTTATTCAAACAATACTGTTTCTACAACTACCACTTTAGCGCCCAGCTACTCCTTGGTGCCCCAAGAGACTACCATATCGTACGCCGACGACCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 46)
TFP 9 ATGAAATTCTCAACTGCCGTTACTACGTTGATTAGTTCTGGTGCCATCGTGTCTGCTTTACCACACGTGGATGTTCACCAAGAAGATGCCCACCAACATAAGAGGGCCGTTGCGTACAAATACGTTTACGAAACTGTTGTTGTCGATTCTGATGGCCACACTGTAACTCCTGCTGCTTCAGAAGTCGCTACTGCTGCTACCTCTGCTATCATTACAACATCTGTGTTGGCTCCAACCTCCTCCGCAGCCGCTGCGGATAGCTCCGCTTCCATTGCTGTTTCATCTGCTGCCTTAGCCAAGAATGAGAAAATCTCTGATGCCGCTGCATCTGCCACTGCCTCAACATCTCAAGGGGCATCCTCCTCATCCTACCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 47)
TFP 10 ATGAATTGGCTGTTTTTGGTCTCGCTGGTTTTCTTCTGCGGCGTGTCAACCCATCCTGCCCTGGCAATGTCCAGCAACAGACTACTAAAGCTGGCTAATAAATCTCCCAAGAAAATTATACCTCTGAAGGACTCAAGTTTTGAAAACATCTTGGCACCACCTCACGAAAATGCCTATATAGTTGCTCTGTTTACTGCCACAGCGCCCGAAATTGGCTGTTCTCTGTGTCTCGAGCTAGAATCCGAATACGACACCATAGTGGCCTCCTGGTTTGATGATCATCCGGATGCAAAATCGTCCAATTCCGATACATCTATTTTCTTCACAAAGGTCAATTTGGAGGACCCTTCTAAGACCATTCCTAAAGCGTTCCAGTTTTTCCAACTAAACAATGTTCCTAGATTGTTCATCTTCAAACTAAACTCTCCCTCTATTCTGGACCACAGCGTGATCAGTATTTCCACTGATACTGGCTCAGAAAGAATGAAGCAAATCATACAAGCCATTAAGCAGTTCTCGCAAGTAAACGACTTCTCTTTACACTTACCTGTGGGTCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 48)
TFP 11 ATGAAGTTCTCTTCTGTTACTGCTATTACTCTAGCCACCGTTGCCACCGTTGCCACTGCTAAGAAGGGTGAACATGATTTCACTACCACTTTAACTTTGTCATCGGACGGTAGTTTAACTACTACCACCTCTACTCATACCACTCACAAGTATGGTAAGTTCAACAAGACTTCCAAGTCCAAGACCCCCCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 49)
TFP 12 ATGGCCTCATTTGCTACTAAGTTTGTCATTGCTTGCTTCCTGTTCTTCTCGGCGTCCGCCCATAATGTCCTTCTTCCAGCTTATGGCCGTAGATGCTTCTTCGAAGACTTGAGTAAGGGTGACGAGCTCTCCATTTCGTTCCAGTTCGGTGATAGAAACCCTCAATCCAGTAGCCAGCTGACTGGTGACTTTATCATCTACGGGCCGGAAAGACATGAAGTTTTGAAAACGGTTAGGGAACTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 50)
TFP 13 ATGCAATACAAAAAGACTTTGGTTGCCTCTGCTTTGGCCGCTACTACATTGGCCGCCTATGCTCCATCTGAGCCTTGGTCCACTTTGACTCCAACAGCCACTTACAGCGGTGGTGTTACCGACTACGCTTCCACCTTCGGTATTGCCGTTCAACCAATCTCCACTACATCCAGCGCATCATCTGCAGCCACCACAGCCTCATCTAAGGCCAAGAGAGCTGCTTCCCAAATTGGTGATGGTCAAGTCCAAGCTGCTACCACTACTGCTTCTGTCTCTACCAAGAGTACCGCTGCCGCCGTTTCTCAGATCGGTGATGGTCAAATCCAAGCTACTACCAAGACTACCGCTGCTGCTGTCTCTCAAATTGGTGATGGTCAAATTCAAGCTACCACCAAGACTACCTCTGCTAAGACTACCGCCGCTGCCGTTTCTCAAATCAGTGATGGTCAAATCCAAGCTACCACCACTACTTTAGCCCCTCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 51)
TFP 14 ATGCAATTCAAGAACGCTTTGACTGCTACTGCTATTCTAAGTGCCTCCGCTCTAGCTGCTAACTCAACTACTTCTATTCCATCTTCATGTAGTATTGGTACTTCTGCCACTGCTACTGCTCAAGCCACCGATAGTCAAGCCCAAGCTACTACTACCGCACCCCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 52)
TFP 15 ATGGTATCGAAGACTTGGATATGTGGCTTCATCAGTATAATTACAGTGGTACAGGCCTTGTCCTGCGAGAAGCATGATGTATTGAAAAAGTATCAGGTGGGAAAATTTAGCTCACTAACTTCTACGGAAAGGGATACTCCGCCAAGCACAACTATTGAAAAGTGGTGGATAAACGTTTGCGAAGAGCATAACGTAGAACCTCCTGAAGAATGTAAAAAAAATGACATGCTATGTGGTTTAACAGATGTCATCTTGCCCGGTAAGGATGCTATCACCACTCAAATTATAGATTTTGACAAAAACATTGGCTTCAATGTCGAGGAAACTGAGAGTGCGCTTACATTGACACTAAACGGCGCTACGTGGGGCGCCAATTCTTTTGACGCAAAACTAGAATTTCAGTGTAATGACAATATGAAACAAGACGAACTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 53)
TFP 16 ATGAAATTATCCGCTCTATTAGCTTTATCAGCCTCCACCGCCGTCTTGGCCGCTCCAGCTGTCCACCATAGTGACAACCACCACCACAACGACAAGCGTGCCGTTGTCACCGTTACTCAGTACGTCAACGCAGACGGCGCTGTTGTTATTCCAGCTGCCACCACCGCTACCTCGGCGGCTGCTGATGGAAAGGTCGAGTCTGTTGCTGCTGCCACCACTACTTTGTCCTCGACTGCCGCCGCCGCTACAACCCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 54)
TFP 17 ATGAAATTATCAACTGTCCTATTATCTGCCGGTTTAGCCTCGACTACTTTGGCCCAATTTTCCAACAGTACATCTGCTTCTTCCACCGATGTCACTTCCTCCTCTTCCATCTCCACTTCCTCTGGCTCAGTAACTATCACATCTTCTGAAGCTCCAGAATCCGACAACGGTACCAGCACAGCTGCACCAACTGAAACCTCAACAGAGGCTCCAACCACTGCTATCCCAACTAACGGTACCTCTACTGAAGCTCCAACCACTGCTATCCCAACTAACGGTACCTCTACTGAAGCTCCAACTGATACTACTACTGAAGCTCCAACCACCGCTCTTCCAACTAACGGTACTTCTACTGAAGCTCCAACTGATACTACTACTGAAGCTCCAACCACCGGTCTTCCAACCAACGGTACCACTTCAGCTTTCCCACCAACTACATCTTTGCCACCAAGCAACACTACCACCACTCCTCCTTACAACCCATCTACTGACTACACCACTGACTACACTGTAGTCACTGAATATACTACTTACTGTCCGGAACGGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 55)
TFP 18 ATGCGTTTCTCTACTACACTCGCTACTGCAGCTACTGCGCTATTTTTCACAGCCTCCCAAGTTTCAGCTATTGGTGAACTAGCCTTTAACTTGGGTGTCAAGAACAACGATGGTACTTGTAAGTCCACTTCCGACTATGAAACCGAATTACAAGCTTTGAAGAGCTACACTTCCACCGTCAAAGTTTACGCTGCCTCAGATTGTAACACTTTGCAAAACTTAGGTCCTGCTGCTGAAGCTGAGGGATTTACTATCTTTGTCGGTGTTTGGCCACTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 56)
TFP 19 ATGCGTCTCTCTAACCTAATTGCTTCTGCCTCTCTTTTATCTGCTGCTACTCTTGCTGCTCCCGCTAACCACGAACACAAGGACAAGCGTGCTGTGGTCACTACCACTGTTCAAAAACAAACCACTATCATTGTTAATGGTGCCGCTTCAACTCCAGTTGCTGCTTTGGAAGAAAATGCTGTTGTCAACTCCGCTCCAGCTGCCGCTACCAGTACAACATCGTCTGCTGCTTCTGTAGCTACCGCTGCTTCCTCTTCTGAGAACAACTCACAAGTTTCTGCTGCCGCATCTCCAGCCTCCAGCTCTGCTGCTACATCTACTCAATCTTCTCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 57)
TFP 20 ATGCAATTTTCTACTGTCGCTTCTATCGCCGCTGTCGCCGCTGTCGCTTCTGCCGCTGCTAACGTTACCACTGCTACTGTCAGCCAAGAATCTACCACTTTGGTCACCATCACTTCTTGTGAAGACCACGTCTGTTCTGAAACTGTCTCCCCAGCTTTGGTTTCCACCGCTACCGTCACCGTCGATGACGTTATCACTCAATACACCACCTGGTGCCCATTGACCACTGAAGCCCCAAAGAACGGTACTTCTACTGCTGCTCCAGTTACCTCTACTGAAGCTCCAAAGAACACCACCTCTGCTGCTCCAACTCACTCTGTCACCTCTTACACTGGTGCTGCTGCTAAGGCTTTGCCAGCTGCTGGTGCTTTGCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 58)
TFP 21 ATGAAATTCTCTTCCGCTTTGGTTCTATCTGCTGTTGCCGCTACTGCTCTTGCTGAGAGTATCACCACCACCATCACTGCCACCAAGAACGGTCATGTCTACACTAAGACTGTCACCCAAGATGCTACTTTTGTTTGGGGTGGTGAAGACTCTTACGCCAGCAGCACTTCTGCCGCTGAATCTTCTGCCGCCGAAACTTCTGCCGCCGAAACCTCTGCTGCCGCTACCACTTCTGCTGCCGCTACCACTTCTGCTGCTGAGACTTCTTCTGCTGCTGAGACTTCTTCTGCTGATGAAGGTTCTGGTTCTAGTATCACTACCACTATCACTGCCACCAAGAACGGTCACGTCTACACTAAGACTGTCACCCAAGATGCTACTTTTGTCTGGACTGGTGAAGGCAGCAGCAACACCTGGTCTCCAAGTAGTACCTCTACCAGCTCAGAAGCTGCTACCTCTTCTGCTTCAACCACTGCAACCACCCTGCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 59)
TFP 22 ATGAAGTTCCAAGTTGTTTTATCTGCCCTTTTGGCATGTTCATCTGCCGTCGTCGCAAGCCCAATCGAAAACCTATTCAAATACAGGGCAGTTAAGGCATCTCACAGTAAGAATATCAACTCCACTTTGCCGGCCTGGAATGGGTCTAACTCTAGCAATGTTACCTACGCTAATGGAACAAACAGTACTACCAATACTACTACTGCCGAAAGCAGTCAATTACAAATCATTGTAACAGGTGGTCAAGTACCAATCACCAACAGTTCTTTGACCCACACAAACTACACCAGATTATTCAACAGTTCTTCTGCTTTGAACATTACCGAATTGTACAATGTTGCCCGTGTTGTTAACGAAACGATCCAAGATAACCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 60)
TFP 23 ATGCGTGCCATCACTTTATTATCTTCAGTCGTTTCTTTGGCATTGTTGTCGAAGGAAGTCTTAGCAACACCTCCAGCTTGTTTATTGGCCTGTGTTGCGCAAGTCGGCAAATCCTCTTCCACATGTGACTCTTTGAATCAAGTCACCTGTTACTGTGAACACGAAAACTCCGCCGTCAAGAAATGTCTAGACTCCATCTGCCCAAACAATGACGCTGATGCTGCTTATTCTGCTTTCAAGAGTTCTTGTTCCGAACAAAATGCTTCATTGGGCGATTCCAGCGGCAGTGCCTCCTCATCCGTTCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 61)
TFP 24 ATGAAATTATCAACTGTCCTATTATCTGCCGGTTTGGCCTCGACTACTTTGGCCCAATTTTCCAACAGTACATCTGCTTCTTCCACCGATGTCACTTCCTCCTCTTCCATCTCCACTTCCTCTGGCTCAGTAACTATCACATCTTCTGAAGCTCCAGAATCCGACAACGGTACCAGCACAGCTGCACCAACTGAAACCTCAACAGAGGCTCCAACCACTGCTATCCCAACTAACGGTACCTCTACTGAAGCTCCAACCACTGCTATCCCAACTAACGGTACCTCTACTGAAGCTCCAACTGATACTACTACTGAAGCTCCAACCACCGCTCTTCCAACTAACGGTACTTCTACTGAAGCTCCAACTGATACTACTACTGAAGCTCCAACCACCGGTCTTCCAACCAACGGTACCACTTCAGCTTTCCCACCAACTACATCTTTGCCACCAAGCAACACTACCACCACTCTGGCCGCCTCGGCCTCTGCTGGCCTCGCCTTAGATAAAAGA (서열번호 62)
24 종의 형질전환체를 각각 YPDG 배지 (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 1 % 포도당, 1 % 갈락토스)에서 40 시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고, 배양 상등액 0.6 ㎖를 0.4 ㎖ 아세톤으로 침전시켜 SDS-PAGE 분석을 수행하고 (도 2), 항-His 항체를 이용한 웨스턴블랏으로 lsrA의 분비 발현 여부를 확인하였다 (도 3).
그 결과, 레반슈크라제는 효모에서 분비 생산이 어려운 단백질로 알려져 있으나, 단백질 분비 융합인자를 이용하는 경우 도 3에서 보는 바와 같이 24 종의 단백질 분비 융합 인자 중 대부분이 lsrA를 분비 생산 할 수 있음을 확인하였다. 이 중 상대적으로 레반슈크라제 분비 발현능이 우수한 4 종 (TFP 3, TFP 4, TFP 8, TFP 16)의 TFP를 선별하였다.
상기와 같은 방법으로 선별된 균주는 단일 콜로니를 분석한 결과가 아니고 형질전환체를 혼합하여 분석한 결과이기 때문에, 정확한 분석을 위해 단일 콜로니로부터 균주를 배양하여 단백질 합성을 분석하였다. 각각의 균주로부터 단일 균주를 확보하기 위하여 각 TFP 별로 단일 콜로니를 3 개씩 골라서 동일하게 배양한 뒤, 수득한 배양 배지에 대하여 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석을 수행하고 (도 4), 항-His 항체를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다 (도 5). 이와 함께 각 TFP의 레반슈크라제 분비능을 비교하기 위하여 효모에서 분비 시그널로 가장 널리 사용되고 있는 MF 분비시그널을 이용하여 레반슈크라제를 분비 발현한 경우와 비교하였다.
확인 결과 상기 선별한 TFP는 모두 MF 분비시그널보다 레반슈크라제를 효과적으로 분비 발현 함을 확인하였으며 이 중 TFP 16이 레반슈크라제를 가장 효율적으로 분비 생산할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과에 따라 최종적으로 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제를 고분비 생산하는 발현벡터로, TFP 16 및 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제 유전자를 포함하는 YGaST16-lsrA-6H를 제작하였으며 (도 16), 상기 발현벡터로 형질전환된 균주는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2015년 6월 1일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC18393P를 부여받았다.
실시예 2. 자이모모나스 모빌리스 ( Zymomonas mobilis ) 유래 레반슈크라제 발현을 위한 효모 단백질분비 융합인자 (TFP) 선별
자이모모나스 모빌리스는 레반 생산 균주로 널리 활용되고 있는 균주로서, 동 균주 유래의 레반슈크라제는 대장균에서 재조합 생산이 가능하기 때문에 많은 연구가 진행되었고, 특히 저온에서 활성이 높은 것으로 알려져있다.
자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제 유전자 (levU, 서열번호 6) 분비 발현 벡터를 제작하기 위하여, pR24 (Song 등, Biochim Biophys Acta. 1173, 320(1993))를 주형으로 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용한 1 차 PCR (94 ℃ 5 분 1 회; 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분, 사이클 25 회; 72 ℃ 7 분 1회) 반응으로 levU 유전자를 증폭 하였다. 1 차 PCR로 증폭된 유전자는 다시 LNK39 (서열번호 4)와 HisGT50R (서열번호 5) 프라이머로 2 차 증폭하여 단백질 분비 융합 인자를 함유한 벡터로 세포 내 재조합 (in vivo recombination)에 필요한 서열이 도입되고, 카르복시 말단에는 히스티딘 태그가 도입된 재조합 유전자를 확보하였다.
그 다음 상기 실시예 1에서 사용한 방법과 동일한 방법을 이용하여 증폭된 levU 유전자는 단백질 분비 발현을 도와주는 24 종의 단백질 분비 융합 인자 (한국특허 제0975596호)를 함유한 선형의 벡터와 함께 효모 균주 Y2805GS에 도입하였으며, SDS-PAGE 분석을 수행하고 (도 6), 항-His 항체를 이용하여 웨스턴블랏을 수행함으로써 (도 7) levU의 분비 발현 여부를 확인하였다. 도 7에서 보는 바와 같이 24 종의 단백질 분비 융합 인자 중 대부분이 levU를 분비 생산할 수 있음을 확인하였다.
그 다음 분비 생산된 효소의 활성을 비교하기 위하여, 4 % 설탕 용액 0.2 ㎖를 각 균주의 배양액 5 L와 반응시켰을 때 생성되는 포도당의 양을 DNS를 이용하여 측정하였다 (도 8). 효소 활성과 상기 웨스턴블랏 결과는 서로 상응하였으며 이 중 상대적으로 레반슈크라제 분비 발현능이 우수한 8 종 (TFP 3, TFP 6, TFP 8, TFP 9, TFP 11, TFP 16, TFP 19, TFP 22)의 TFP를 선별하였다.
그 다음 각각의 균주로부터 단일균주를 확보하기 위하여 각 TFP 별로 단일 콜로니를 3 개씩 골라서 동일하게 배양한 뒤, 수득한 배양 배지에 대하여 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석을 수행하고 (도 9), 항-His 항체를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였으며 (도 10), 효소 활성을 비교하였다 (도 11). 그 결과, 이 중 TFP 8이 레반슈크라제를 가장 효율적으로 분비 생산할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과에 따라 최종적으로 자이모모나스 모빌리스 유래의 레반슈크라제를 고분비 생산하는 발현 벡터로, TFP 8 및 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제 유전자를 포함하는 YGaST8-levU-6H를 제작하였으며 (도 17), 상기 발현벡터로 형질전환된 균주에서 레반슈크라제가 성공적으로 분비되는 것을 확인하였다
실시예 3. 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis ) 유래 레반슈크라제 발현을 위한 효모 단백질분비 융합인자 (TFP) 선별
그람 양성균인 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제 유전자 (BsSacB, 서열번호 9) 분비 발현 벡터를 제작하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 10과 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 1 차 PCR (94 ℃ 5 분 1 회; 94 ℃ 30 초, 55 ℃ 30 초, 72 ℃ 1분, 사이클 25 회, 72 ℃ 7 분 1 회) 반응으로 BsSacB 유전자를 증폭 하였다. 1 차 PCR로 증폭된 유전자는 다시 LNK39 (서열번호 4)와 HisGT50R (서열번호 5) 프라이머로 2 차 증폭하여, 단백질 분비 융합 인자를 함유한 벡터와 세포 내 재조합 (in vivo recombination)에 필요한 서열이 도입되고, 카르복시 말단에는 히스티딘 태그가 도입된 재조합 유전자를 확보하였다.
그 다음 상기 실시예 1에서 사용한 방법과 동일한 방법을 이용하여 증폭된 BsSacB 유전자를 24 종의 단백질 분비 융합 인자를 함유한 선형의 벡터와 함께 효모 균주 Y2805GS에 도입하였으며, SDS-PAGE를 통하여 단백질의 분비 발현 여부를 확인하였다(도 12).
그 다음 효소 활성을 비교하기 위하여 4 % 설탕용액 0.2 ㎖을 각 균주의 배양액 5 L와 반응시켰을 때 생성되는 포도당의 양을 DNS를 이용하여 측정하였다 (도 13). 이 중 상대적으로 레반슈크라제 분비 발현능이 우수한 8 종 (TFP 1, TFP 5, TFP 6, TFP 8, TFP 9, TFP 13, TFP 16, TFP 19)의 TFP를 선별하였다. 각각의 균주로부터 단일 균주를 확보하기 위하여 각 TFP 별로 단일 콜로니를 3 개씩 골라서 동일하게 배양한 뒤, 수득한 배양 배지에 대하여 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석을 수행하고 (도 14), 효소의 활성을 비교하였다 (도 15).
그 결과, 이 중 TFP 8이 레반슈크라제를 가장 효율적으로 분비 생산할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과에 따라 최종적으로 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제를 고분비 생산하는 발현 벡터로, TFP 8 및 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제 유전자를 포함하는 YGaST8-BsSacB-6H (도 18)를 제작하였으며, 상기 발현벡터로 형질전환된 균주는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2015년 6월 1일자로 기탁하고, 수탁번호 KCTC18392P를 부여받았다.
실시예 4. 재조합 효모의 유가식 발효를 통한 레반슈크라제의 발효생산
실시예 4-1. 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제의 발효생산
라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제를 대량생산하기 위하여 상기한 YGaST16-lsrA-6H를 함유하는 재조합 효모 Y2805GS를 5 L 발효조를 이용하여 유가식 배양하였다.
구체적으로, 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖ SD-Ura 배지 (0.67 % 아미노산이 결여된 효모 기질, 0.77 % 우라실이 결핍된 영양 보충물, 2 % 포도당)에 초기 배양한 후 다시 200 ㎖의 YEPD 액체배지 (2 % 포도당, 4 % 효모 추출물, 1 % 펩톤)에서 배양하여 활성화하고 1.8 L의 본 배양액 (2 % 포도당, 4 % 효모 추출물, 1 % 펩톤)에 접종하여 30 ℃에서 발효하였다. 배양 중 포도당이 완전히 소모되면 공급 배지 (30 % 포도당, 15 % 효모 추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2 g/L에서 20 g/L로 점차로 추가하면서 50 시간 동안 발효하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양 중 세포의 성장 정도는 시간별로 시료를 취하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였고 (도 19), 배지에 분비 생산된 레반슈크라제는 농축하지 않은 배양 상등액 20 ㎕를 SDS-PAGE로 분석하여 확인하였다 (도 20). 그리고 배양 상등액으로 분비되지 못하고 세포 내에 존재하고 있는 레반슈크라제를 확인하기 위하여 1 ㎖ 배양액의 세포를 원심분리로 회수한 후 500 ㎕의 용해 완충액 (20 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.4), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 5 % SDS)으로 현탁하고, 0.5 mm 글래스 비드 (glass beads)를 넣어 10 분간 교반한 후 원심분리하여 회수한 상등액을 1 ㎕씩 SDS-PAGE 분석하였다 (도 22). 그리고 세포 성장 시간별 세포 내외의 효소 분비량에 대한 효소 활성 변화를 확인하였다 (도 21).
그 결과, 세포 내에서도 일부 레반슈크라제가 확인되었으나 대부분의 레반슈크라제는 세포 외로 분비되었으며, 세포 배양액의 효소 활성도 세포 내 활성보다 2 배 정도 높은 것을 확인하였다.
상기 SDS-PAGE 결과 (도 22)에서 확인한 바와 같이 발효 배양액에 포함된 단백질의 대부분은 재조합 레반슈크라제이기 때문에 기본적인 정제 공정이나 간단한 농축만으로도 고순도의 효소 농축액 제조가 가능할 것으로 판단된다.
실시예 4-2. 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제의 발효생산
자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제를 대량 생산하기 위하여 상기한 YGaST8-levU-6H를 함유하는 재조합 효모 Y2805GS를 5L 발효조를 이용하여 유가식 배양하였다.
구체적으로, 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖ SD-Ura 배지(0.67 % 아미노산이 결여된 효모 기질, 0.77 % 우라실이 결핍된 영양 보충물, 2 % 포도당)에 초기 배양한 후 다시 200 ㎖의 YEPD 액체배지 (2 % 포도당, 4 % 효모 추출물, 1 % 펩톤)에서 배양하여 활성화하고 1.8 L의 본 배양액 (2 % 포도당, 4 % 효모 추출물, 1 % 펩톤)에 접종하여 30 ℃에서 발효하였다. 배양 중 포도당이 완전히 소모되면 공급 배지 (30 % 포도당, 15 % 효모 추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2 g/L에서 20 g/L로 점차로 추가하면서 50 시간 동안 발효하여 단백질 발현을 유도하였다. 배지에 분비 생산된 레반슈크라제는 농축하지 않은 배양 상등액 10 ㎕를 SDS-PAGE와 항-His 항체를 이용한 웨스턴블랏 분석을 수행하여 확인하였다 (도 23).
그 결과, 분비된 단백질의 양은 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제에는 미치지 못했으나, 분비 단백질의 대부분을 차지하는 단백질이 자이모모나스 모빌리스 유래 레반슈크라제임을 확인하였다
실시예 4-3. 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제의 발효생산
바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제를 대량 생산하기 위하여 상기한 YGaST8-BsSacB-6H를 함유하는 재조합 효모 Y2805GS를 5L 발효조를 이용하여 유가식 배양하였다.
구체적으로, 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖ SD-Ura 배지 (0.67 % 아미노산이 결여된 효모 기질, 0.77 % 우라실이 결핍된 영양 보충물, 2 % 포도당)에 초기 배양한 후 다시 200 ㎖의 YEPD 액체배지 (2 % 포도당, 4 % 효모 추출물, 1 % 펩톤)에서 배양하여 활성화하고 1.8L의 본 배양액 (2 % 포도당, 4 % 효모 추출물, 1 % 펩톤)에 접종하여 30 ℃에서 발효하였다. 배양 중 포도당이 완전히 소모되면 공급 배지 (30 % 포도당, 15 % 효모 추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2 g/L에서 20g/L로 점차로 추가하면서 50 시간 동안 발효하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양 중 세포의 성장 정도는 시간별로 시료를 취하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였고, 배지에 분비 생산된 레반슈크라제는 농축하지 않은 배양 상등액 20 ㎕를 항-His 항체를 이용한 웨스턴블랏 분석하여 확인하였다. 재조합 효모의 세포성장은 흡광도 600 nm에서 150 이상 수준으로 원활하게 진행되었지만 (도 24), 이에 따른 단백질 발현량은 상기 실시예에서 확인한 그람음성균 유래의 레반슈크라제의 발현보다는 발현량이 낮은것으로 확인되었다 (도 25).
실시예 5. 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography) 방법을 이용한 레반슈크라제의 정제
본 발명에서 발현한 레반슈크라제는 모두 카르복시 말단에 6X 히스티딘 태깅 (Histidine tagging)이 되어있어, Ni-NTA 레진을 이용한 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제가 가능하다.
발효 배지로 분비된 레반슈크라제를 정제하기 위하여, 우선 필터 (Sartoclear, Sartorious사)를 사용하여 1 차 정제 후 30,000 MWCO Quick-stand (GE healthcare)로 발효 배지를 10 배 농축하였다. 그 다음 100 ㎖의 발효 농축액을 HisPrep FF 컬럼에 적용하여 융합 단백질을 Ni-NTA 레진에 결합시킨 후 AKTA FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography, GE healthcare)를 이용하여 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 0.25 M 이미다졸 용액으로 단백질을 용출하였다. 그리고 최종 정제된 분획은 Hiprep Desalting 컬럼을 이용하여 탈염 과정을 거친 뒤 2 ㎍씩 SDS-PAGE로 확인하고 효소 활성 분석에 이용하였다.
SDS-PAGE 결과에서 확인할 수 있듯이 모든 레반슈크라제 분획에서 작은 단백질 밴드가 관찰되었으며 (도 26), 대부분의 단백질이 온전한 크기로 존재함을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 정제된 2 종(lsrA, levU)의 레반슈크라제의 활성 최적조건 분석
실시예 6-1. 최적 pH 확인
정제된 2 종(lsrA, levU)의 레반슈크라제의 최적 pH를 확인하기 위하여 다양한 pH의 완충액을 50 mM 사용하고 (표 3), 1 %의 설탕 기질 용액에 1 g/L의 정제된 효소액을 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 30 분 후 효소반응을 중단시키기 위해서 반응물을 65 ℃에서 15 분간 가열한 후, 설탕으로부터 생성된 포도당, 과당, 레반의 양을 확인하기 위해 Agilent 사의 HPLC (1100 series) 분석을 수행하였다. 분석은 Shodex 사의 KS-802 (8 x 300 mm) 컬럼을 사용하여 50 ℃에서 0.5 ㎖/분의 유속으로 시료를 흘려 분석하였다. 용매는 HPLC용 용액을 사용하였으며 Refractive Index Detector로 확인하였다. HPLC 결과는 표준곡선에 따른 정량계산법으로 산출되었다.
pH 3 4 5 6 7 8 9
완충액 glycine-
HCl		 Acetate Acetate Maleate Tris-
maleate		 Tris-
maleate		 Tris-
HCl
다양한 범위의 pH에서 재조합 효소의 레반 생성능을 비교한 결과 두 가지 효소 중 lsrA에서만 유의적인 레반 생성량을 확인할 수 있었다 (도 27). 다양한 범위의 pH 중 레반이 가장 잘 합성되는 조건은 pH 5.0 아세테이트 완충액을 사용한 경우와 pH 6.0 말레이트 완충액을 사용하는 조건으로 확인되었으며 levU의 경우 레반 생성능이 매우 미미하였다.
실시예 6-2. 최적 온도 확인
정제된 2 종(lsrA, levU)의 레반슈크라제의 최적 온도를 확인하기 위하여 1 %의 설탕 기질 용액, 50 mM 말레이트 완충액에 1 g/L의 정제된 효소액을 다양한 범위의 온도에서 (4, 20, 30, 37, 50 및 60 ℃) 30 분간 반응시켰다. 30 분 후 효소 반응을 중단시키기 위해서 반응물을 65 ℃에서 15 분간 가열한 후, 설탕으로부터 생성된 포도당, 과당, 레반의 양을 확인하기 위해 Agilent 사의 1100 series로 HPLC 분석을 하였다. 분석은 Shodex 사의 KS-802 (8 x 300 mm) 컬럼을 사용하여 50 ℃에서 0.5 ㎖/분의 유속으로 시료를 흘려 분석하였다. 용매는 HPLC용 용액을 사용하였으며 Refractive Index Detector로 확인하였다. HPLC 결과는 표준곡선에 따른 정량계산법으로 산출되었다.
다양한 범위의 온도에서 생성된 레반의 양을 표준곡선과 비교하여 산출한 결과, 두 가지 효소 중 lsrA에서만 유의적인 레반 생성량을 확인할 수 있었다(도 28). 특이적으로, lsrA의 설탕 분해능 최적온도는 50 ℃로 확인되었으나, 레반 생성의 최적온도는 30 내지 37 ℃로 확인되었다.
상기 결과로부터 lsrA는 모든 온도에서 다른 효소에 비해 월등한 레반 합성 활성을 가지고 있음을 알 수 있었고, 특히 30 내지 37 ℃에서 최적의 활성을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 6-3. 정제된 2 종(lsrA, levU)의 레반슈크라제의 레반 생산능 비교
Hisprep 컬럼을 이용하여 1 차 정제한 2 종의 레반슈크라제의 레반 전환율을 통해 효소 활성을 비교하였다.
구체적으로, 5 % 설탕 (50 mM 소듐 포스페이트 완충액 (pH 6.0)) 1 ㎖에 1 ㎍의 효소를 처리하여 24 시간 동안 4 ℃ (표 4)와 20 ℃(표 5)에서 반응하고 shodex KS-802 컬럼을 이용한 HPLC를 수행하여 당의 함량 변화를 비교하였다.
그 결과 하기 표 4와 표 5에서 보이는 것처럼 효모에서 발현된 레반슈크라제는 두 가지 크기의 레반을 형성함을 확인하였다.
레반 생성능 비교 (4 ℃)
레반슈크라제 고분자레반 저분자레반 설탕 포도당 과당
러넬라 아쿠아틸리스
(lsrA)		 10.5 4.2 13 18.4 6.3
자이모모나스 모빌리스 (levU) - 1.5 32.9 9.2 7.7
(단위: g/L)
레반 생성능 비교 (20 ℃)
레반슈크라제 고분자레반 저분자레반 설탕 포도당 과당
러넬라 아쿠아틸리스
(lsrA)		 13.7 5.8 3.9 22.4 10.3
자이모모나스 모빌리스 (levU) 1.1 1.3 20.7 13.8 15.8
(단위: g/L)
레반슈크라제는 레반생성효소 활성과 함께 설탕 분해효소 활성을 가지고 있는것으로 알려져 있으며 이러한 활성으로 인하여 반응 과정에서 일정량의 과당이 형성된다. 설탕 분해로 생성된 과당은 레반 합성의 기질로 사용되지 않기 때문에 레반 생산성을 개선하기 위해서는 고효율의 레반 합성능과 함께 낮은 효율로 설탕을 분해하는 효소가 바람직하다. 설탕에서 생성되는 포도당은 레반으로 전환되지 않고 축적되기 때문에 축적된 포도당의 양과 생성된 레반의 양은 비례함을 알 수 있었다. 라넬라 아쿠아틸리스 유래의 레반슈크라제가 두 가지 온도에서 모두 활성이 가장 강력한 것으로 확인되었으며 4 ℃ 보다는 20 ℃에서의 활성이 더 높았다. 또한 확인한 두 가지 온도에서 설탕 분해능도 가장 낮은 것으로 확인되었다.
실시예 6-4. 효모 재조합 레반 슈크라제와 대장균 재조합 레반 슈크라제의 레반 생성능 비교
대장균 발현을 통해 얻은 라넬라 아쿠아틸리스 유래의 표품 레반슈크라제 효소와 효모에서 생산된 라넬라 아쿠아틸리스 유래의 레반슈크라제 발효 농축액의 활성을 비교하기 위하여, HPLC 분석을 수행하여 시료 내 전환된 레반의 함량을 비교해본 결과, 하기 표 6에서 보는 바와 같이 동등한 수준 (21.8%의 전환율)의 활성을 나타내었다.
효소 종류 함 량(%) 반응시간(h)
레반 설탕 포도당 과당
기존효소(대장균)
(295.33 U/㎖)		 21.5 9.1 49.1 11.3 38
효모효소/농축
(505.49 U/㎖)		 21.8 2.6 51.4 18.4 65
따라서 효모에서 분비 생산된 레반슈크라제는 정제 과정 없이 발효 배양액의 농축만으로도 레반생산 공정에 적용이 가능함을 확인하였으며 이러한 특징은 효소 대량 생산시 효소 생산 비용 절감에 기여할 것으로 판단된다.
실시예 6-5. 기질 농도 및 효소농도에 따른 레반 생산 수율 확인
앞서 확립된 최적 버퍼 농도인 10 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 5.5)과 30 ℃의 반응 온도에서 기질인 설탕의 최적 조건을 확립하고자 하였다. 10 %, 15 %, 및 20 %의 설탕 농도에서 실험을 진행하였으며, 이때 설탕 농도 증가와 함께 효소 농도도 30 U 또는 40 U으로 증가시키면서 실험을 수행하였다. 하기 표 7에서 보는 바와 같이 설탕의 농도를 증가시켰을 때, 그리고 효소의 양을 증가시켰을 때 모두 더 높은 효율 향상을 유도하지는 못하였다. 따라서 최적 설탕 농도를 10 %로 확립하였다.
레반함량(%) 설탕농도(%)/효소농도(U)
반응시간(h) 10%/20U 15%/20U 15%/30U 20%/20U 20%/30U 20%/40U
20 22 19.1 20.6 16.6 17.8 18.5
40 22.5 20.6 20.9 18.6 18.3 18.4
50 23.9 20.6 20.5 18 17.9 18.5
그 다음, 상기의 확립된 최적 조건인, 10 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 5.5), 30 ℃ 반응온도, 및 10 % 설탕 농도에서 최적 효소 농도를 확립하고자 하였다. 앞선 실험에서 효소 농도를 증가시키는 것은 효과가 없었기 때문에 30 U 이하의 효소 농도에서의 레반 전환 수율을 확인하였다.
그 결과, 15, 20, 및 30 U의 효소를 사용한 경우, 초기 20 시간에서는 약간의 전환 속도 차이를 보였으나, 40 시간 이후에는 레반 전환 수율에 있어서 큰 차이를 나타내지 않았다 (표 8). 따라서 생산 단가를 고려하였을 때 15 U을 최적 조건으로 확립하였다.
레반함량(%) 효소농도(U)
반응시간(h) 2.5 5 10 15 20 30
20 6.4 10.9 16.1 20.9 22.6 23.9
40 9 15.7 23.6 23 27 26.2
50 9.8 17 23.3 24.4 23.9 23.8
70 13.7 19.8 24.6 24.2 23.9 23.6
실시예 7. 발효생산된 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제의 활성 검증
상기 실시예를 통하여 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제는 효모에서 고분비 발현이 가능하고 높은 레반 생성능을 보유하고 있음을 확인하였다. 그러나 상기 실시예 6-3에서 확인한 바와 같이 생성된 레반 농도의 50 % 수준에 해당하는 과당이 생성되었으며 이러한 설탕 분해능은 레반 생합성 효율을 저하시키는 이유가 된다.
이에, 고온성 그람양성균인 바실러스 서브틸리스 유래의 분비형 레반슈크라제가 상기 실시예에서 확인한 그람 음성균 유래의 비분비성 레반슈크라제와 다른 특성을 가지고 있을 것으로 보고, 이러한 특성을 비교하고자 하였다. 상기 실시예 5에서 발효 생산된 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제와 활성을 비교하기 위해 5 %의 설탕용액 5 ㎖에 발효상등액 50 ㎕를 30 ℃에서 48 시간까지 반응시켰다. 반응 이후 12 시간마다 시료를 채취하여 90 ℃에서 10 분간 안치하여 효소반응을 중지시킨 후, Shodex KS-802 컬럼을 이용하여 65 ℃, 1 ㎖/min의 유속의 조건에서 RID 분석법으로 소모한 설탕과 생산된 레반, 포도당, 과당의 정량분석을 실시하였다, 이동상은 HPLC 등급의 물을 사용하였다.
그 결과, 48 시간까지 반응시켰을 때, 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제 (BsSacB)가 합성한 레반의 양이 기존에 사용한 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제 (lsrA)와 유사한 수준의 레반을 합성하는 것이 확인되었다 (표 9). 또한 반응 산물 중 존재하는 포도당과 과당의 양이 lsrA보다 적은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 레반 생성속도는 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제가 월등히 앞서지만 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제가 설탕 분해능이 낮기 때문에 전체적으로는 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제가 레반 생산 효율이 높은 것을 확인할 수 있었다.
시료 설탕(g/L) 포도당(g/L) 과당(g/L) 레반(g/L) 반응시간(h)
lsrA 1.63 27.3 23.7 1.0 12
BsSacB 16.7 17.0 7.1 1.2 48
따라서 최종적으로 초기 반응 속도가 가장 좋은 lsrA와 반응효율이 가장 좋은 BsSacB를 분비 발현하는 두 가지 종의 재조합 효모를 레반 생산용 재조합효모로 선별하였다.
실시예 8. 재조합 효모 발효를 통한 레반의 직접 생산
미생물 발효를 이용하여 효소 정제 과정 없이 설탕으로부터 직접 레반을 생산하는 경우 레반슈크라제의 낮은 활성과 다수의 발효 부산물이 생성되기 때문에 아직까지 산업적으로 적용한 경우는 보고되지 않았다. 그러나 다른 미생물과달리 레반슈크라제를 생산하는 효모 균주를 설탕을 포함하는 배지에서 직접 발효하여 레반을 생산하면 발효 부산물이 생성되지 않으며 레반슈크라제의 작용으로 생성되는 과당, 포도당이나 설탕 잔량을 효모균주가 탄소원으로 사용 가능하기 때문에 고순도의 레반 생산이 가능한 장점이 있다.
상기 기술한 라넬라 아쿠아틸리스와 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제를 분비 발현하는 재조합 효모 Y2805GS를 이용하여 직접 발효를 통한 레반 생산이 가능한지 여부를 확인하였다. 5 % 설탕이 첨가되어있는 YP 배지에서 레반슈크라제를 분비 발현하는 두 종류의 재조합 효모 (YGaST16-lsrA-6H/Y2805GS, YGaST8-BsSacB-6H/Y2805GS)를 72 시간 동안 배양 후, 배양 상등액을 HPLC (shodex sugar KS-802 컬럼)로 분석한 결과, 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제를 분비 발현하는 재조합 효모는 세포성장이 더 잘 일어났으나, 결과적으로 7.0 g/L의 레반 만을 합성한 반면, 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제를 분비 발현하는 재조합 효모는 비교적 세포성장도가 적었으나, 10.4 g/L의 레반을 형성하는 것이 확인되었다. (표 10). 한편 레반 합성의 반응 속도는 효소 반응과 마찬가지로 초기에는 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제를 분비 발현하는 재조합 효모가 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제를 분비 발현하는 재조합 효모보다 빨랐지만, 36시간 이후부터 반응속도가 감소하였고, 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제를 분비 발현하는 재조합 효모의 경우는 그 속도가 72시간 까지도 계속 증가 하는 경향을 보였다.
YGaST16-lsrA-6H/Y2805GS YGaST8-BsSacB-6H/Y2805GS
세포성장도 (OD600) 31.0 22.5
레반 (g/L) 7.0 10.4
실시예 9. 당밀을 이용한 레반의 직접 생산
당밀은 설탕 제조시 생산되는 점액질의 부산물로 과자류 착색용도와 같은 식품산업에 응용될 뿐만 아니라 알코올, 아세톤, 부탄올, 구연산 등의 미생물 발효의 탄소원으로도 사용되고 있다. 당밀의 성분을 분석해본 결과 40 % 설탕, 14 % 과당, 10 %의 포도당을 함유하고 있기 때문에 레반 생산을 위한 기질로 사용이 가능할 것으로 판단되어 상기 실시예에서 확보한 레반생성 재조합 효모를 이용하여 당밀로부터 직접 레반 생산 가능 여부를 확인하였다.
이를 검증하기 위해 탄소원을 당밀(대명케미칼, 한국)로 함유한 YPM 배지 (1 % 효모추출물, 2 % 펩톤, 10 배 희석한 당밀원액 (4 % 설탕함유))에 상기 실시예에서 확보한 두 가지 재조합 효모 균주 (YGaST16-lsrA-6H/Y2805GS, YGaST8-BsSacB-6H/Y2805GS)를 72 시간 동안 배양 후, 배양 상등액을 HPLC (shodex sugar KS-802 컬럼)로 분석하였다.
그 결과, 설탕을 기질로 사용하였을 때와 마찬가지로 두 가지 재조합 효모에서 모두 레반이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 라넬라 아쿠아틸리스 유래 레반슈크라제를 분비 발현하는 재조합 효모에서는 72 시간 이후 3.7 g/L의 레반이 생성되었으며 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제를 분비 발현하는 재조합 효모에서는 배양 72 시간 이후 13.8 g/L의 레반이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 10 배 희석한 당밀에 포함된 설탕은 4 %임을 고려하면 레반 전환율이 34.5 %(이론적 최대전환율 50 %)에 이르며 설탕을 직접 사용한 경우보다 더 높은 효율로 레반이 생성되었다 (표 11). 현재 시장에서 판매하는 당밀의 가격은 일반적으로 설탕의 1/2 수준이기 때문에 당밀로부터 고효율로 레반을 생산할 수 있는 기술은 레반의 생산단가를 대폭 감소시킬 수 있다는 장점을 갖는다.
YGaST16-lsrA-6H/Y2805GS YGaST8-BsSacB-6H/Y2805GS
세포성장도 (OD600) 38 36
레반 (g/L) 3.7 13.8
결론적으로 본 발명에서는 상기 라넬라 아쿠아틸리스와 바실러스 서브틸리스 유래 레반슈크라제를 분비 발현하는 재조합 효모(YGaST16-lsrA-6H/Y2805GS, YGaST8-BsSacB-6H/Y2805GS)로부터 레반슈크라제를 생산 및 정제하여 분리된 레반슈크라제를 통해 레반을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 재조합 효모를 직접 발효하여 레반을 생산할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC18392P 20150601 한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC18393P 20150601
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A microorganism having enhanced levansucrase productivity and a method of producing levan using the microorganism <130> KPA150364-KR <160> 62 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1248 <212> DNA <213> Rhanella aquatilis-lsrA <400> 1 atgacaaatt taaattatac accgacaatc tggacacgtg ctgatgctct gaaggtcaac 60 gaaaacgacc cgaccaccac ccagcctatt gttgacgccg attttccggt tatgagtgat 120 gaagtattta tttgggatac tatgcccctg cggtcattag acggtacggt ggtttctgta 180 gacggatggt ccgttatttt cacgcttacc gctcagcgta ataacaataa ttcagagtat 240 ctcgacgcag aaggaaatta tgacatcacc agtgactgga ataatcgcca cgggcgcgca 300 agaatttgtt actggtattc ccgtacgggt aaagattgga tttttggcgg gcgtgtgatg 360 gcagaaggtg tctcccctac atcccgcgaa tgggcaggga ctcccatttt gcttaatgaa 420 gacggtgata ttgatcttta ttatacctgc gtcacgccgg gagcgactat tgcaaaagtg 480 agaggcaaag tgctgacctc agaagaaggt gtaacgctgg ccggtttcaa cgaggttaaa 540 tcattatttt cagctgacgg cgtgtactac caaactgaaa gtcaaaatcc gtactggaac 600 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tgataaagtg accgatctgt ttcaggcaga tggcctttat 540 tatgctgatt atgcagaaaa taatttctgg gatttccgcg atccgcatgt cttcattaac 600 cccgaagatg gcaaaacata tgccttgttt gaaggtaatg ttgccatgga gcgcggtacg 660 gtcgctgttg gcgaagagga aattggccct gttccaccaa aaaccgaaac gcctgatggc 720 gctcgctatt gtgctgctgc cattggtatt gcacaggccc ttaatgaagc ccgcaccgaa 780 tggaaattgt taccgccttt ggtaaccgcc tttggtgtca atgaccagac ggagcggcct 840 catgtcgttt tccagaatgg cttgacctat ctctttacga tcagtcatca ttcgacttat 900 gccgatggtt tgtcgggtcc tgatggggtt tatggctttg tttctgaaaa cggcattttt 960 ggcccttatg aaccgctgaa tggttccggt ttggttctcg gtaacccctc ttcacagcct 1020 tatcaggctt attcccatta tgtgatgaca aatgggctgg tgacctcctt cattgatacc 1080 attccgagtt ctgacccgaa tgtctatcgt tatggtggca ccttggcacc gaccatcaaa 1140 ttggaattgg ttggccatcg cagcttcgtt accgaagtga agggttatgg ctatattccg 1200 ccacagatcg agtggttggc agaagatgaa tcttctaatt ctgcggcagc cctgtcttta 1260 ttgaataaat aa 1272 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> levU primer-1 <400> 7 ctcgccttag ataaaagaat gttgaataaa gcaggcat 38 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> levU primer-2 <400> 8 gtgatggtga tggtgatgtt tattcaataa agacaggg 38 <210> 9 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus subtilis SacB <400> 9 atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60 gcaggaggcg caactcaagc gtttgcgaaa gaaacgaacc aaaagccata taaggaaaca 120 tacggcattt cccatattac acgccatgat atgctgcaaa tccctgaaca gcaaaaaaat 180 gaaaaatatc aagttcctga attcgattcg tccacaatta aaaatatctc ttctgcaaaa 240 ggcctggacg tttgggacag ctggccatta caaaacgctg acggcactgt cgcaaactat 300 cacggctacc acatcgtctt tgcattagcc ggagatccta aaaatgcgga tgacacatcg 360 atttacatgt tctatcaaaa agtcggcgaa acttctattg acagctggaa aaacgctggc 420 cgcgtcttta aagacagcga caaattcgat gcaaatgatt ctatcctaaa agaccaaaca 480 caagaatggt caggttcagc cacatttaca tctgacggaa aaatccgttt attctacact 540 gatttctccg gtaaacatta cggcaaacaa acactgacaa ctgcacaagt taacgtatca 600 gcatcagaca gctctttgaa catcaacggt gtagaggatt ataaatcaat ctttgacggt 660 gacggaaaaa cgtatcaaaa tgtacagcag ttcatcgatg aaggcaacta cagctcaggc 720 gacaaccata cgctgagaga tcctcactac gtagaagata aaggccacaa atacttagta 780 tttgaagcaa acactggaac tgaagatggc taccaaggcg aagaatcttt atttaacaaa 840 gcatactatg gcaaaagcac atcattcttc cgtcaagaaa gtcaaaaact tctgcaaagc 900 gataaaaaac gcacggctga gttagcaaac ggcgctctcg gtatgattga gctaaacgat 960 gattacacac tgaaaaaagt gatgaaaccg ctgattgcat ctaacacagt aacagatgaa 1020 attgaacgcg cgaacgtctt taaaatgaac ggcaaatggt acctgttcac tgactcccgc 1080 ggatcaaaaa tgacgattga cggcattacg tctaacgata tttacatgct tggttatgtt 1140 tctaattctt taactggccc atacaagccg ctgaacaaaa ctggccttgt gttaaaaatg 1200 gatcttgatc ctaacgatgt aacctttact tactcacact tcgctgtacc tcaagcgaaa 1260 ggaaacaatg tcgtgattac aagctatatg acaaacagag gattctacgc agacaaacaa 1320 tcaacgtttg cgccaagctt cctgctgaac atcaaaggca agaaaacatc tgttgtcaaa 1380 gacagcatcc ttgaacaagg acaattaaca gttaacaaat aa 1422 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Phe Glu Asp Glu Asp Gly Asp Asp Glu 180 185 190 Tyr Ala Thr Glu Glu Thr Leu Ser His His Asp Asn Asn Lys Gly Lys 195 200 205 Glu Gly Asp Asp Leu Ala Ala Ser Ala Ser Ala Gly Leu Ala Leu Asp 210 215 220 Lys Arg 225 <210> 22 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 8 a.a. <400> 22 Met Leu Gln Ser Val Val Phe Phe Ala Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ser 1 5 10 15 Val Ser Ala Ile Tyr Ser Asn Asn Thr Val Ser Thr Thr Thr Thr Leu 20 25 30 Ala Pro Ser Tyr Ser Leu Val Pro Gln Glu Thr Thr Ile Ser Tyr Ala 35 40 45 Asp Asp Leu Ala Ala Ser Ala Ser Ala Gly Leu Ala Leu Asp Lys Arg 50 55 60 <210> 23 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 9 a.a. <400> 23 Met Lys Phe Ser Thr Ala Val Thr Thr Leu Ile Ser Ser Gly Ala Ile 1 5 10 15 Val Ser Ala Leu Pro His Val Asp Val His Gln Glu Asp Ala His Gln 20 25 30 His Lys Arg Ala Val Ala Tyr Lys Tyr Val Tyr Glu Thr Val Val Val 35 40 45 Asp Ser Asp Gly His Thr Val Thr Pro Ala Ala Ser Glu Val Ala Thr 50 55 60 Ala Ala Thr Ser Ala Ile Ile Thr Thr Ser Val Leu Ala Pro Thr Ser 65 70 75 80 Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ser Ser Ala Ser Ile Ala Val Ser Ser Ala 85 90 95 Ala Leu Ala Lys Asn Glu Lys Ile Ser Asp Ala Ala Ala Ser Ala Thr 100 105 110 Ala Ser Thr Ser Gln Gly Ala Ser Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Ala Ser 115 120 125 Ala Ser Ala Gly Leu Ala Leu Asp Lys Arg 130 135 <210> 24 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 10 a.a. <400> 24 Met Asn Trp Leu Phe Leu Val Ser Leu Val Phe Phe Cys Gly Val Ser 1 5 10 15 Thr His Pro Ala Leu Ala Met Ser Ser Asn Arg Leu Leu Lys Leu Ala 20 25 30 Asn Lys Ser Pro Lys Lys Ile Ile Pro Leu Lys Asp Ser Ser Phe Glu 35 40 45 Asn Ile Leu Ala Pro Pro His Glu Asn Ala Tyr Ile Val Ala Leu Phe 50 55 60 Thr Ala Thr Ala Pro Glu Ile Gly Cys Ser Leu Cys Leu Glu Leu Glu 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Asp Thr Ile Val Ala Ser Trp Phe Asp Asp His Pro Asp 85 90 95 Ala Lys Ser Ser Asn Ser Asp Thr Ser Ile Phe Phe Thr Lys Val Asn 100 105 110 Leu Glu Asp Pro Ser Lys Thr Ile Pro Lys Ala Phe Gln Phe Phe Gln 115 120 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Lys Thr Thr Ser Ala Lys Thr Thr Ala Ala Ala Val Ser 130 135 140 Gln Ile Ser Asp Gly Gln Ile Gln Ala Thr Thr Thr Thr Leu Ala Pro 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ser Ala Ser Ala Gly Leu Ala Leu Asp Lys Arg 165 170 <210> 28 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 14 a.a. <400> 28 Met Gln Phe Lys Asn Ala Leu Thr Ala Thr Ala Ile Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Asn Ser Thr Thr Ser Ile Pro Ser Ser Cys Ser Ile 20 25 30 Gly Thr Ser Ala Thr Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln 35 40 45 Ala Thr Thr Thr Ala Pro Leu Ala Ala Ser Ala Ser Ala Gly Leu Ala 50 55 60 Leu Asp Lys Arg 65 <210> 29 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 15 a.a. <400> 29 Met Val Ser Lys Thr Trp Ile Cys Gly Phe Ile Ser Ile Ile Thr Val 1 5 10 15 Val Gln Ala Leu Ser Cys Glu Lys His Asp Val Leu Lys Lys Tyr Gln 20 25 30 Val Gly Lys Phe Ser Ser Leu Thr Ser Thr Glu Arg Asp Thr Pro Pro 35 40 45 Ser Thr Thr Ile Glu Lys Trp Trp Ile Asn Val Cys Glu Glu His Asn 50 55 60 Val Glu Pro 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Thr Thr Thr Leu Ala Ala Ser 145 150 155 160 Ala Ser Ala Gly Leu Ala Leu Asp Lys Arg 165 170 <210> 39 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 1 nt <400> 39 atgttcaatc gttttaacaa attccaagct gctgtcgctt tggccctact ctctcgcggc 60 gctctcggtg actcttacac caatagcacc tcctccgcag acttgagttc tatcacttcc 120 gtctcgtcag ctagtgcaag tgccaccgct tccgactcac tttcttccag tgacggtacc 180 gtttatttgc catccacaac aattagcggt gatctcacag ttactggtaa agtaattgca 240 accgaggccg tggaagtcgc tgccggtggt aagttgactt tacttgacgg tgaaaaatac 300 gtcttctcat ctgaggccgc ctcggcctct gctggcctcg ccttagataa aaga 354 <210> 40 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 2 nt <400> 40 atgacgccct atgcagtagc aattaccgtg gccttactaa ttgtaacagt gagcgcactc 60 caggtcaaca attcatgtgt cgcttttccg ccatcaaatc tcaggggcaa gaatggagac 120 ggtactaatg aacagtatgc aactgcacta ctttctattc cctggaatgg gcctcctgag 180 tcatcgaggg atattaatct tatcgaactc gaaccgcaag ttgcactcta tttgctcgaa 240 aattatatta accattacta caacaccaca agagacaata agtgccctaa taaccactac 300 ctaatgggag ggcagttggg tagctcatcg gataatagga gtttgaacga ggccgcctcg 360 gcctctgctg gcctcgcctt agataaaaga 390 <210> 41 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 3 nt <400> 41 atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct 60 gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct 120 tgtggtgcag ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca 180 aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct 240 gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccaaccagc 300 tccgaaaaga tggccgcctc ggcctctgct ggcctcgcct tagataaaag a 351 <210> 42 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 4 nt <400> 42 atgagatttg cagaattctt ggtggtattt gccacgttag gcggggggat ggctgcaccg 60 gttgagtctc tggccgggac ccaacggtat ctggtgcaaa tgaaggagcg gttcaccaca 120 gagaagctgt gtgctttgga cgacaaggcc gcctcggcct ctgctggcct cgccttagat 180 aaaaga 186 <210> 43 <211> 291 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 5 nt <400> 43 atgttcaatc gttttaacaa attccaagct gctgtcgctt tggccctact ctctcgcggc 60 gctctcggtg ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcactaat tccggctgaa 120 gctgtcatcg gttacttaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc 180 aacagcacaa ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa 240 gaagaagggg tggccgcctc ggcctctgct ggcctcgcct tagataaaag a 291 <210> 44 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 6 nt <400> 44 atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tacttagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggtg 240 gccgcctcgg cctctgctgg cctcgcctta gataaaaga 279 <210> 45 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 7 nt <400> 45 atggtgttcg gtcagctgta tgcccttttc atcttcacgt tatcatgttg tatttccaaa 60 actgtgcaag cagattcatc caaggaaagc tcttccttta tttcgttcga caaagagagt 120 aactgggata ccatcagcac tatatcttca acggcagatg ttatatcatc cgttgacagt 180 gctatcgctg tttttgaatt tgacaatttc tcattattgg acagcttgat gattgacgaa 240 gaatacccat tcttcaatag attctttgcc aatgatgtca gtttaactgt tcatgacgat 300 tcgcctttga acatctctca atcattatct cccattatgg aacaatttac tgtggatgaa 360 ttacctgaaa gtgcctctga cttactatat gaatactcct tagatgataa aagcatcgtt 420 ttgttcaagt ttacctcgga tgcctacgat ttgaaaaaat tagatgaatt tattgattct 480 tgcttatcgt ttttggaaga taaatctggc gacaatttga ctgtggttat taactctctt 540 ggttgggctt ttgaagatga agatggtgac gatgaatatg caacagaaga gactttgagc 600 catcatgata acaacaaggg taaagaaggc gacgatctgg ccgcctcggc ctctgctggc 660 ctcgccttag ataaaaga 678 <210> 46 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 8 nt <400> 46 atgcttcaat ccgttgtctt tttcgctctt ttaaccttcg caagttctgt gtcagcgatt 60 tattcaaaca atactgtttc tacaactacc actttagcgc ccagctactc cttggtgccc 120 caagagacta ccatatcgta cgccgacgac ctggccgcct cggcctctgc tggcctcgcc 180 ttagataaaa ga 192 <210> 47 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 9 nt <400> 47 atgaaattct caactgccgt tactacgttg attagttctg gtgccatcgt gtctgcttta 60 ccacacgtgg atgttcacca agaagatgcc caccaacata agagggccgt tgcgtacaaa 120 tacgtttacg aaactgttgt tgtcgattct gatggccaca ctgtaactcc tgctgcttca 180 gaagtcgcta ctgctgctac ctctgctatc attacaacat ctgtgttggc tccaacctcc 240 tccgcagccg ctgcggatag ctccgcttcc attgctgttt catctgctgc cttagccaag 300 aatgagaaaa tctctgatgc cgctgcatct gccactgcct caacatctca aggggcatcc 360 tcctcatcct acctggccgc ctcggcctct gctggcctcg ccttagataa aaga 414 <210> 48 <211> 597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFP 10 nt <400> 48 atgaattggc tgtttttggt ctcgctggtt ttcttctgcg gcgtgtcaac ccatcctgcc 60 ctggcaatgt ccagcaacag actactaaag ctggctaata aatctcccaa gaaaattata 120 cctctgaagg actcaagttt tgaaaacatc ttggcaccac ctcacgaaaa tgcctatata 180 gttgctctgt ttactgccac agcgcccgaa attggctgtt ctctgtgtct cgagctagaa 240 tccgaatacg acaccatagt ggcctcctgg tttgatgatc atccggatgc aaaatcgtcc 300 aattccgata catctatttt cttcacaaag 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Claims (22)

  1. 레반슈크라제 (levansucrase)를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자 (Translational fusion partner, TFP)를 코딩하는 핵산을 포함하는, 레반슈크라제 분비 발현 카세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 레반슈크라제는 라넬라 아쿠아틸리스 (Rhanella aquatilis), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래인 것인, 분비 발현 카세트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 레반슈크라제는
    (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 라넬라 아쿠아틸리스 유래의 레반슈크라제;
    (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 자이모모나스 모빌리스 유래의 레반슈크라제; 또는
    (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제인,
    분비 발현 카세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분비 융합인자는,
    서열번호 15의 TFP 1, 서열번호 16의 TFP 2, 서열번호 17의 TFP 3, 서열번호 18의 TFP 4, 서열번호 19의 TFP 5, 서열번호 20의 TFP 6, 서열번호 21의 TFP 7, 서열번호 22의 TFP 8, 서열번호 23의 TFP 9, 서열번호 24의 TFP 10, 서열번호 25의 TFP 11, 서열번호 26의 TFP 12, 서열번호 27의 TFP 13, 서열번호 28의 TFP 14, 서열번호 29의 TFP 15, 서열번호 30의 TFP 16, 서열번호 31의 TFP 17, 서열번호 32의 TFP 18, 서열번호 33의 TFP 19, 서열번호 34의 TFP 20, 서열번호 35의 TFP 21, 서열번호 36의 TFP 22, 서열번호 37의 TFP 23, 및 서열번호 38의 TFP 24로 이루어진 군에서 선택되는, 분비 발현 카세트.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 라넬라 아쿠아틸리스 유래의 레반슈크라제는 서열번호 17의 TFP 3, 서열번호 18의 TFP 4, 서열번호 22의 TFP 8 또는 서열번호 30의 TFP 16과 연결된 것인, 분비 발현 카세트.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 자이모모나스 모빌리스 유래의 레반슈크라제는 서열번호 17의 TFP 3, 서열번호 20의 TFP 6, 서열번호 22의 TFP 8, 서열번호 23의 TFP 9, 서열번호 25의 TFP 11, 서열번호 30의 TFP 16, 서열번호 33의 TFP 19 또는 서열번호 36의 TFP 22와 연결된 것인, 분비 발현 카세트.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스 유래의 레반슈크라제는 서열번호 15의 TFP 1, 서열번호 19의 TFP 5, 서열번호 20의 TFP 6, 서열번호 22의 TFP 8, 서열번호 23의 TFP 9, 서열번호 27의 TFP 13, 서열번호 30의 TFP 16 또는 서열번호 33의 TFP 19와 연결된 것인, 분비 발현 카세트.
  8. 제1항에 있어서, 상기 레반슈크라제(levansucrase)를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자를 코딩하는 핵산은 링커 (linker)로 서로 연결된 것인, 분비 발현 카세트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커는 프로테아제 인식 서열 또는 친화성 태그를 포함하는 것인, 분비 발현 카세트.
  10. 제1항에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질은 친화성 태그를 추가로 포함하는 것인, 분비 발현 카세트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 친화성 태그는 GST, MBP, NusA, 티오레독신(thioredoxin), 유비퀴틴, FLAG, BAP, HIS, STREP, CBP, CBD, 및 S-태그로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 분비 발현 카세트.
  12. 제1항 내지 제11항의 레반슈크라제 분비 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
  13. 레반슈크라제 (levansucrase)를 코딩하는 핵산 및 단백질 분비 융합 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는, 레반슈크라제 분비 발현 카세트를 포함하는, 형질전환 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 형질전환 미생물은 효모인 것인, 미생물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 효모는 캔디다 (Candida), 디베리오마이세스 (Debaryomyces), 한세눌라 (Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 야로이야 (Yarrowia), 사카로마이시스 (Saccharomyces), 슈완니오마이세스 (Schwanniomyces) 및 아르술라 (Arxula) 속으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 미생물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 효모는 캔디다 유틸리스 (Candida utilis), 캔디다 보이디니 (Candida boidinii), 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 피키아 스티피티스 (Pichia stipitis), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이시스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 야로이야 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) 및 아르술라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans)로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 미생물.
  17. (i) 제13항의 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및
    (ii) 상기 배양된 미생물 또는 이의 배양 상등액으로부터 레반슈크라제를 회수하는 단계를 포함하는, 레반슈크라제 (levansucrase)의 제조방법.
  18. 제13항의 형질전환 미생물 또는 제18항의 방법으로 제조된 레반슈크라제를 설탕과 반응시키는 단계를 포함하는, 레반 (levan)의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 반응은 pH 4.5 내지 pH 7.5에서 수행되는 것인, 제조방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 반응은 1 ℃ 내지 45 ℃에서 수행되는 것인, 제조방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 단계는 형질전환 미생물을 설탕을 포함하는 배지에서 발효시키는 것을 포함하는 것인, 레반의 제조방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 단계는 형질전환 미생물을 당밀을 포함하는 배지에서 발효시키는 것을 포함하는 것인, 레반의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109055247A (zh) * 2018-07-13 2018-12-21 云南中茶茶业有限公司 一株酵母菌株及其加工熟普茶的方法

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