FI116848B - Bacillus-lajista saatu ksylanaasi, tällaisen ksylanaasin ja muiden proteiinien ekspressiovektori, niiden isäntäorganismit ja käyttö - Google Patents

Bacillus-lajista saatu ksylanaasi, tällaisen ksylanaasin ja muiden proteiinien ekspressiovektori, niiden isäntäorganismit ja käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI116848B
FI116848B FI943389A FI943389A FI116848B FI 116848 B FI116848 B FI 116848B FI 943389 A FI943389 A FI 943389A FI 943389 A FI943389 A FI 943389A FI 116848 B FI116848 B FI 116848B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
xylanase
seq
plasmid
sequence
bacillus
Prior art date
Application number
FI943389A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI943389A0 (fi
FI943389A (fi
Inventor
Antoine Amory
Roman Vetter
Pierre Ledoux
Buyl Eric De
Rene Detroz
Andree Lahaye
Christophe Andre
Original Assignee
Genencor Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genencor Int filed Critical Genencor Int
Publication of FI943389A0 publication Critical patent/FI943389A0/fi
Publication of FI943389A publication Critical patent/FI943389A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI116848B publication Critical patent/FI116848B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Bacillus-lajista saatu ksylanaasi, tällaisen ks; ja muiden proteiinien ekspressiovektori, niiden : ganismit ja käyttö 5 Tämä keksintö koskee heterologisia entsyym ta tuottavat Bacillus licheniformis -rekombinant ja erityisesti Bacillus pumilus PRL B12:sta perä: vaa ksylanaasia, joka on tehokasta käytettäväksi luloosapitoisen massan biologisessa valkaisussa, 10 mi s vektoreita ja Bacillus licheniformis -rekoin] isäntiä ksylanaasin ilmentämiseksi ja ksylanaasii lignoselluloosapitoisen massan biologisessa valkj Yhtenä yleisenä päämääränä valmistettaessa ta (kuten paperituotteita) lignoselluloosapitois. 15 soista on saada aikaan massa, josta valmistetu] teella on mahdollisimman hyvä lopullinen vaalc tärkeä mainitunlaista lopullista vaaleutta rajoi kijä on massassa läsnä olevan ligniinin määrä.
Ligniini on mainitunlaisissa lignosellulo< 20 sissa massoissa etupäässä sitoutuneena hemise. kanssa lignoselluloosakompleksiksi. Ligniinin ja luloosakompleksin muiden hiilihydraattien pääa:
4 I I
liitoksen muodostaa kompleksiin sitoutunut • * * .11 (1,4-6-ksylaani). Ligniinin poistamiseksi massas • > » I. 25 ensin katkaista nämä sidokset.
• · » : ·' Ligniiniä poistetaan lignoselluloosapitois # · · soista, kuten puumassasta, perinteisesti kemikaa * la. Vaikka kemikaalikeitto on äärimmäisen käyttö] tarkoituksiinsa (jopa 95 % läsnä olevasta ligniin : 30 daan poistaa tällaisella kemikaalikeitolla), sil :***♦ sinään pystytä saavuttamaan korkeampaa ligniinin! 1 ‘ 2 antaa ruskean värin massassa oleville selluloosak ja estää siten mahdollisimman hyvän lopullisen v aikaansaannin massasta valmistetussa tuotteessa.
Ligniinin poistamiseksi edelleen massasta 5 likeiton jälkeen käytetään erilaisia "valkaisupros Mainitunlaisiin valkaisuprosesseihin kuuluvat tavan ti "klassiset" (eli perinteiset) valkaisuprosessit kaisuprosessit, joissa ei käytetä alkuaineklooria tai Chlorine Free bleaching sequences) . Nämä valk 10 sessit sisältävät ligniininpoistovaiheen, jota seur valkaisuvaiheita. Ligniininpoistovaiheessa massalla tetaan ensin kloori- ja/tai klooridioksidikäsitte! seuraa tavallisesti emäsuutto.
Vaikka massan käsittely helpottaa tehokkaas 15 naisten ligniinimäärien poistamista kemiallisesta ("delignifikaatiota"), sillä on kuitenkin haittapuo kä ongelmallisin näistä haittapuolista (erityisesl sisten prosessien ollessa kyseessä) on, että tulo! klooriyhdistepäästöjä, jotka on yhdistetty absorb
20 orgaanisten halogenidien (AOX) muodostumiseen. AO
teisiin on liitetty myrkyllisyys ympäristölle. Ota ·.· : että jätevesien AOX-pitoisuus liittyy suoraan pro * * !e!e5 käytettävään kloori- ja klooridioksidiyhdistemäärää Γ·': pä AOX-pitoisuuksista on tullut teollisuudessa s • · ·***· 25 valkaisulaitoksen jätevesien sisältämien klooratti • # ,5. gaanisten yhdisteiden määrän määrittämiseksi. Niin] "··. lisuus, kuten puumassa- ja paperiteollisuus, joka v * * * tuotteita mainitunlaisesta massasta, on joutunut , , painostuksen ja säätelyn alaiseksi sekä AOX-tuotan: • * * · 30 valkaisun aikana käytettävien kloorin ja kloorid • · *·..· kulutuksen vähentämiseksi.
11 3 poistoa lignoselluloosapitoisesta massasta (pros jota kutsutaan yleisesti "biovalkaisuksi"). Massan lyyn on ehdotettu käytettäviksi erityisesti monia e ksylanaaseja, joita erittää joukko erilaisia sieniä 5 teereja, mukaan luettuina suvun Bacillus-bakteerit yritysten menestys on kuitenkin ollut vaihtelevaa punut niihin kulloinkin käytetyn ksylanaasin omir teistä. Jotta ksylanaasia voitaisiin menestykse käyttää kaupallisisssa biovalkaisusovellutuksissa, 10 lee olla tehokasta massan luonnollisella pH-aluee tettäessä ksylanaasia biologisen valkaisun aikana, ksylanaasin tulisi olla vapaa mahdollisesta jäänr laasiaktiivisuudesta.
Biovalkaisussa ksylanaasi voidaan lisätä 15 tämän tultua sellunkeitosta mutta ennen kemiallist telyä. Tässä vaiheessa massan pH on tyypillisesti leen alueella 7,0 - 9,5. Tällä emäksisellä pH-alue hokkaan ksylanaasin tunnistaminen ja käyttö vähents resti prosessiolosuhteiden tämän puolen jatkuvaa 20 lointia ja vähentäisi sellun kemialliseen käsittel vittavien kloorin ja reaktiivisten hapettimien määr l*« V· Joitakin vuosia on tiedetty lajin Bacillus « * ί.ν mikro-organismien erittävän ksylanaaseja solun ull· le. Itse asiassa jo vuonna 1960 on paljastettu, ett ·*·*· 25 miluksen kasvualusta sisältää ksylanaaseja, jotka • « tästä kasvatusliemestä käyttökelpoisen elintar\ valmistussovellutuksiin (katso CD-patentti julkaisu • * * 603 953 ja US-patenttijulkaisu Letters 2 821 501) . , tuissa patenttijulkaisuissa ei kuitenkaan missään • · · ···/ 30 esitetä, kuvata eikä ehdoteta entsyymien (ksylana * ·
*···* kaan luettuina! eristämistä ia/tai mihriistamista V
4
Tietojemme mukaan vain seuraavien kahden pumilus -kannan ksy lanaasi on milloinkaan eri s te t puhdistettu: Bacillus pumilus IPO ja Bacillus pui 6124. Mitään tietoja ei kuitenkaan esitetä siitä 5 B. pumilus PRL B12:sta saatava ksylanaasi potenti käyttökelpoinen biovalkaisusovellutuksissa.
Vain yhtä B. pumilus -kantojen ksylanaas milloinkaan ehdotettu käytettäväksi biovalkais tämä ksylanaasi oli peräisin erityisesti suunn 10 mutantista - B. pumilus DSM 6124: sta. B. puu 6124:n erittämän ksylanaasin eristäminen ja puhd samoin kuin sen käyttö biovalkaisussa on esitet* tenttijulkaisussa 91/02 839 ja W0-patenttiju 92/03 540. Kuten niissä raportoidaan, kannan DSM 15 lanaasin optimi-pH on vain 5 - 7 ja sillä näytti rajoitettu teho poistettaesa ligniiniä sellais^ soista, joiden pH on korkeintaan vain noin 8,5.
Bacillus pumilus PRL B12:n ja B. pumilus erittämien solun ulkopuolisten ksylanaasien läsn 20 vatusliemessä on myös ollut pitkään tunnettua; kuvattu jo vuonna 1954 (1). Mainitussa viitteesi säksi kuvattu, että B. pumilus PRL B12:n ksyli « ;y. kasvatusliemiympäristössä ollessaan stabiili pH- asti. Kyseisessä julkaisussa ei kuitenkaan missää • · 25 sa esitetä, kuvata eikä ehdoteta ksylanaasin er • · * ; ja/tai puhdistamista kasvatusliemestä, johon se ««· | ···* eikä viitteessä (1) ole myöskään minkäänlaisia m siitä, millaiset fysikaaliset ominaisuudet tä eristetyllä ja/tai puhdistetulla ksylanaasilla o • « U : 30 vatusliemiympäristön ulkopuolella. Mainittuja ksy #·« « · Ä J μ··Κ*1·ΙΙΙΙμ λ Ί __&_u f i_ 4 5 tämisestä ja puhdistamisesta vaikeaa ja kallista, erityisen merkityksellistä, koska viitteessä (1) < tä tietoja siitä, onko mainittuja ksylanaaseja mi: eristetty ja/tai puhdistettu tai olisiko se edes 1 5 sä, eikä myöskään siitä, miten vaikea tai menesty] tällaisen tehtävän voitaisiin odottaa olevan.
Lisäksi on tunnettua, että ksylanaasin koi tuminen kasvatusliemessä muilla entsyymeillä voi i ksylanaasin näennäisiin fysikaalisiin ominaisuuki 10 kaan luettuna sen teho erilaisilla pH-alueilla. T< on erityisen huomattava sen seikan valossa, että 1 selliä on laaj asti vaihtelevat ominaisuudet j o homologisten saman suvun mikro-organismien eritti Niinpä on nähtävissä, että edelleen on 15 tarve löytää ja tarjota käyttöön eristetty ja/ta: tetty ksylanaasi, joka on tehokasta ligniinin pois sa lignoselluloosapitoisesta massasta, jonka pH oi sellä alueella, 7 - 9,5, niin että se olisi käytti ta lignoselluloosapitoisen massan esikäsittelyssi 20 tamalla ligniinin poistamista lignoselluloosap: massasta ennen tämän valkaisemista. Tällä tavaili *·’· nön mukainen ksylanaasi antaa mahdollisuuden ] kloorin, klooridioksldin ja/tai muiden reaktlivd • · · pettimien määrää, joka tarvitaan lignoselluloosi • * !· !' 25 massan kemiallisen käsittelyn valksiuprosesseissi * I kuin vähentää AOX-yhdisteiden syntymistä antaen i lokseksi lignoselluloosapitoista massaa, jonka li< • * * ’·* * toisuus on hyväksyttävän alhainen (mitattuna massi luvulla).
• * : 30 Lisäksi on toivottavaa tarjota käyttöön is: ··· : : laisten entsyymien, kuten ksylanaasin, tuottamis 6
Vaikka B. pumilus -kantojen mainitaan use: ksylanaasin hyvin tehokkaita tuottajia, niist saannot ovat kuitenkin liian pieniä teollisen kä: dollistamiseksi.
5 B. pumilus -ksylanaasin saannon parantam: ehdotettu Bacillus pumilus IPO:sta peräisin olev: tai useamman ksylanaasigeenin kloonaamista sopiv: ti in ksylanaasin heterologisen ilmentymisen aik< seksi transformoiduissa isännissä suuremmilla sai 10 Bacillus pumilus lP0:n ksylaaninhajotusgeenien sa ilmentymään Escherichia coli. Bacillus subtilis j romyces cerevisiae -lajeissa on julkistettu. Emmi kaan ole tietoisia, että mainittujen transfo: isäntien käyttökelpoisuudesta teollisuussovelltuk 15 si annettu tietoja.
Edellä mainituista viitteistä huolimatta leen toivottavaa identifioida ja valmistaa sopi'' tiä, jotka ovat stabiileja, käyttökelpoisia kaup sovellutuksissa ja kykeneviä erittämään ksylanaa 20 tyisesti B. pumilus PRL B12 -peräistä ksylanaas: ulkopuolelle sopivilla saannoilla.
Bacillus licheniformis -kantoja käytetään : m :V. omaisesti isäntinä erilaisten neutraalien ja : •V. entsyymien (pääasiassa proteaasien ja alfa-am * * 25 heterologiseen tuottamiseen solun ulkopuolelle • * * * taisesti teollisuusolosuhteissa.
***| Vaikka on saavutettu menestystä näiden ed< # # · *·* * nittujen neutraalien ja happamien entsyymien hete ilmentymisen aikaansaannissa, esiintyy B. lich • · : 30 -kantojen käytössä entsyymien, kuten ksylanaasin ··* • i looiseen tuotantoon emäksisissä olosuhteissa 7 esteenä B. licheniformisin käytölle isäntänä ksi erittämiseksi. Vaikka on ehdotettu alkalista p] koodittavan geenin poistamista, ei menestys silti) si taattua, erityisesti WO-julkaisun 91/02 792 5 jossa on raportoitu, että jopa proteaasigeenin c näolo voi heikentää kannan kykyä tuottaa hete] entsyymejä. Niinpä tietojemme mukaan kukaan ei o' tanut Bacillus licheniformis -kantojen käyttöä ks] heterologiseen tuottamiseen.
10 Niinpä on nähtävissä, että edelleen on tarve saada aikaan stabiili isäntä, jolla on kyki mainitunlaista ksylanaasia suurilla Saanoilla.
Tämän keksinnön yhtenä päätavoitteena on : oida, puhdistaa ja tarjota käyttöön ksylanaasi, ; 15 pottaa tehokkaasti ligniinin poistamista lignose! pitoisesta massasta, erityisesti puumassasta, ja laaja emäksinen pH-alue, erityisesti edullinen 7,0 - 9,5.
Tämän keksinnön yhtenä toisena päätavoit 20 identifioida ja valmistaa sopivia isäntiä, jotka < biileja, helppoja käyttää kaupallisiin tarkoitu pystyvät tuottamaan solun ulkopuolisesti sopivi] noilla erilaisia entsyymejä, erityisesti ksylanaa ;v, tyisesti B. pumilus PRL B12 -peräistä ksylanaasia • « ·· · 25 sissä olosuhteissa.
• · · * Tämän keksinnön yhtenä lisätavoitteena or ··· ”” ja puhdistaa geeni (nukleotidisekvenssi), joka ] • · · tämän keksinnön mukaista ksylanaasia, samoin kuii sitä varten käyttöön asianmukainen vektori, joka : 30 tökelpoinen sopivan isännän transformointiin kä] ·...· niin että voidaan saada aikaan tämän keksinnön 8 nukleotidin, joka koodittaa Bacillus pumilus F ksylanaasia, ja menetelmiä niiden valmistamiseks: Tämän keksinnön yhden puolen mukaisesti y] sätavoitteena on vielä tarjota käyttöön ilmentäm: 5 tämän keksinnön mukaisen ksylanaasin samoin kud entsyymien, kuten alfa-amylaasin, pullulanaasin, siinin ja alkalisen proteaasin ilmentämisvektori ten.
Tämän keksinnön yhden puolen mukaisesti y] 10 sätavoitteena on vielä tarjota käyttöön entsyymikö jossa käytetään mainitunlaista ksylanaasia ja jok listaa biovalkaisun aikana ligniinin poistoon käy kloorin, klooridioksidin ja muiden reaktiivisten mien määrän pienentämisen samoin kuin AOX-yhdiste 15 tyrni sen vähentämisen mahdollistaen silti ligniini! tään hyväksyttävän pienen massan saannin.
Tämän keksinnön mukaisesti esitetään pui ksylanaasi, joka on peräisin B. pumilus PRL Bl2:s mutanteista ja varianteista. Tämä ksylanaasi koos 20 naisesti aminohapposekvenssistä, joka käsittää ] la ja Ib numeroilla 1 - 200 merkityt aminohapot, :T: aminohapposekvenssin mutanteista ja varianteis ;y; ksylanaasi helpottaa tehokkaasti ligniinin po: « * :\\ massasta, jonka pH on edullisesti alueella 7,0 - • * •V. 25 Vaihtoehtoisesti esitetään puhdistettu ks; * * * !' jonka moolimassa on noin 26 kD (kilodaltonia) mää: *::: tässä määriteltävällä SDS-PAGE-geelielektroforees * * * mällä, isoelektrinen piste noin 9,8 - 9,9 ilnu tässä määriteltävällä isoelektrlsellä fokusoint: : 30 mällä mitattuna arvona, optimi lämpötila noin 55 tuna tässä määriteltävällä ksylanaasin hydrolyys: 9
Yhden toisen vaihtoehdon mukaisesti esitet distettu ksylanaasi, jonka moolimassa on noin 26 k tettynä tässä määriteltävällä SDS-PAGE-geelielekt smenetelmällä ja noin 22,500 kilodaltonia (täsmäl 5 noin 22,534 kilodaltonia) pääteltynä valmiin ks^ aminohapposekvenssistä tässä määriteltävällä päätt telmällä.
Lopuksi mainittakoon, että tässä esitettä' distetun lignolyyttisen ksylanaasin optimaalinen 10 lyyttinen aktiivisuus on lignoselluloosapitöisen biovalkaisun ollessa kyseessä noin 7,5 - 8,5 mitatt sä määriteltävällä menetelmällä käsitellyn lignosel pitoisen massan kappaluvun kautta.
Termillä "tässä määriteltävä" tarkoitetaan 15 mää, joka määritellään jäljempänä esitettävissä esi sä.
Termillä "peräisin" käytettynä B. pumilus E ja tässä esitettävien ksylanaasin ja nukleotidise)< yhteydessä tarkoitetaan ksylanaasia ja nukleotidise 20 jä, jotka ovat luontaisia (tai samanlaisia kuin ka ja nukleotidisekvenssit, jotka ovat luontaisia) B.
V : PRL B12:lie.
* · ·,·,* Ksylanaasia tuottaa heterologisesti sella.
♦ · * * */ cillus-suvun mikro-organismi, jossa esiintyy lue ;*·*: 25 alkalista proteaasia koodittava geeni. Tällaiset ··· ovat edullisesti aerobisia. Lisäksi on edullista, e
MU
laiset isännät eivät ole termofiilisiä. Esimerkkei I « · laisista isännistä kuuluvat lajien Bacillus subtili * , ciilus lieheniformis mikro-organismit. Muihin esime *11/ 30 kuuluvat lajien Bacillus alkalophilus, Bacillus 1 * # "···* Band] lus amvloliaue f aniens mi krn-oraanismit. Lis 10 lähteenä on sellainen mikro-organismi, josta on f alkalista proteaasia koodittava geeni, kuten B. lie mis SE2 deläpi, B. lieheniformis SE2 delap3, B. lie mis SE2 delap6 ja B. subtilis SE3. Vielä lisäksi 5 lista, että ksylanaasia tuottavat heterologisesti lähteenä ovat sellaiset mikro-organismit, jotka o formoitu sisältämään B. pumilus PRL B12:n ksylanaa dittava sekvenssi {edullisesti koko ksylanaasigeen että ksylanaasia voidaan tuottaa sen ilmentymisen k 10 Tämän keksinnön mukaisesti tässä esitetä; lisäksi menetelmä ksylanaasin tuottamiseksi i lajissa. Menetelmä sisältää sopivan Bacillus-kanna formoinnin nukleotidisekvenssillä, joka koodittaa ksylanasin valmista osaa (SEQ ID NO:34). Tällä tava 15 dostetaan Bacillus, jossa on täydellinen ksylanaa ilmentymisyksikkö. Bacillusta viljellään sitten ί olosuhteissa ksylanaasin tuottamiseksi. Esitetyssä mässä otetaan lopuksi talteen ksylanaasi viljelmä dessä edullisessa suoritusmuodossa Bacillus on 20 lichenifoicnis. Lisäksi on edullista, että nul· sekvenssi on peräisin Bacillus pumilus PRL B12:sta.
V : Tämän keksinnön mukaisesti on vielä Iisak * · ·.·,* tetty B. pumilus PRL B12:sta ja puhdistettu ks^ 4 * Λ • koodittava geeni (DNA-molekyyli) . Tässä suhteessa € 25 B, pumilus PRL B12:n koko ksylanaasigeenin nul· ··· sekvenssi. Tämä nukleotidisekvenssi sisältää nuk] jotka koodittavat B. pumilus PRL Bl2:n valmis lanaasia, samoin kuin nukleotidit, jotka koodittava . ^ teksylanaasia (SEQ ID NO: 31), (SEQ ID NO: 32). Tämä * * * _ „ 30 tidisekvenssi sisältää lisäksi geenin promoottori J * *·· lenin Pfjpl Ί i5 ίλ ίρΊ ipasS n 1 t=>\r i A nnkl pnt irti opVvpnQQP-i 11 11 Tämän keksinnön mukaisesti tässä esitetä^ lisäksi sopivia ilmentämisvektoreita. Esitettävänä linen ilmentämisvektori, jonka yhtenä komponenttina mistä ksylanaasia koodittava nukleotidisekvenssi, 5 tusmenetelmiensä lisäksi. Tämä ilmentämisvektori v toehtoisesti sisältää nukleotidisekvenssit (SEQ ID jotka koodittavat esiasteksylanaasia. Mukana voi ha sa olla myös ksylanaasigeenin edellä ja/tai jäljess koodittavia sekvenssejä. Tämä ilmentämisvektori 10 edullisimmin koko ksylanaasigeenin (SEQ ID NO:3i esitetään kuvioissa la ja Ib. Tämä edullisin ilmeni tori on pUB-BPX12.
Muihin tässä esitettäviin ilmentämisvel· kuuluvat pUBDEBRAl, pKACl, pLIl, pL7SBT ja pL7AKÄ 15 kukin koodittaa erilaisia muita proteiineja niiden logisen ilmentymisen mahdollistamiseksi tässä esite ilmentämisisännissä.
Tämän keksinnön mukaisesti on vielä lisäksi fioitu sopivia isäntiä. Isännät ovat stabiileja, 20 toimimaan tehokkaasti vaihtelevissa prosessiolosuht kykeneviä entsyymien heterologiseen tuotantoon, mu • · · V· ettuina B. pumilus PRL B12:sta peräisin oleva ks^ • # V·* hyvillä saannoilla.
·* · • Näihin isäntiin kuuluu edullisesti Bacillu 25 niformis -kantoja (biologisesti puhtaita viljemiä), ··· sesti kanta, josta käytetään tässä merkintää B. lie • ·· * mis SE2 delapl, ja sen mutantteja ja variantteja kannat, joista käytetään tässä merkintää B. Hehe . . SE2 delap3, ja sen mutantteja ja variantteja, "··.* 30 lieheniformis SE2 delap6 ja sen mutantteja ja väriä: • » • · » 11 12 Tämän keksinnön mukaisesti tässä esitetä lisäksi tämän keksinnön mukaisen ksylanaasin käyt selluloosapitoisen massan, kuten kraftpuumassan, kaisussa. Ksylanaasia voidaan edullisesti käytti 5 sittelyssä perinteisten valkaisuprosessien yh
Tarkemmin määriteltynä ksylanaasin käyttö esitetä sittelynä tässä määriteltävän kaltaisille klassis kaisuprosesseille, jotka ovat tyyppiä CEDPD ja Tarkemmin määriteltynä ksylanaasin käyttö esitetä 10 sittelynä tässä määriteltävän kaltaisten, tyypj olevien prosessien yhteydessä, joissa ei käytetä klooria (Elemental Chlorine Free Sequences).
Tämän keksinnön mukaisesti tässä esitetä lisäksi tämän keksinnön mukaisen ksylanaasin käyt 15 selluloosapitoisen massan biovalkaisussa täysin k missä (Totally Chlorine Free) prosesseissa. Tarke riteltynä esitetään ksylanaasin käyttö tyyppiä Oi vissa täysin kloorittomissa prosesseissa. Ksylana tetään mainitunlaisissa prosesseissa erityisen ed 20 kompleksinmuodostus (Q) -vaiheen yhteydessä, joi daan OX/QPZP-prosessi.
Tätä ksylanaasia käytetään edellä kuvatu: «V. sesseissa erityisen edullisesti puumassan ja * * määriteltynä kraftpuumassan biovalkaisuun.
I. I 25 Tämän keksinnön mukaisesti tässä esitetä * · · : ·" lisäksi entsyymikäsittely, jossa käytetään ksy ••j Tällainen käsittely on edullisesti esikäsittely k : le valkaisuprosesseille ja valkaisuprosesseille, käytetä alkuaineklooria, tai sitä käytetään täyi 30 rittoman valkaisuprosessin yhden vaiheen yhteydei entsyymikäsittely antaa mahdollisuuden vähentää 13 säilöltään hyväksyttävän pienen massan saannin, tämä entsyymiesikäsittely (a) ei heikennä saavi lopputuotteen vaaleutta (klassisten prosess ECF-prosessien ollessa kyseessä tai (b) antaa 5 tulokseksi lopputuotteen tyydyttävän vaaleuden, kun käytetään hyväksyttäviä määriä reagoivia (TCF-prosessien ollessa kyseessä)· Tämän keksinnön mukaisen ksylanaasin käyt seiluloosapitoisen massan käsittelyssä (biovai: 10 toteutetaan tavallisesti erillisenä vaiheena. S< tehdä myös yhdistettynä kompleksinmuodostajien Siksi ksylanaasi ei ole pelkästään käyttökelpoii rin, klooridioksidin ja/tai muiden reaktiivisten mien, kuten hapen, otsonin tai peroksidin, aih 15 kemikaalikuormitusten vähentämisessä vaan se myös biovalkaisuprosessin kustannuksia.
Huomautettakoon, että tämän keksinnön m ksylanaasilla ei ole käyttöä yksinomaan lignosell toisen massan biovalkaisussa (mitä käsitellään 20 jäljempänä) vaan se on käyttökelpoinen myös ksy sakkaridien valmistuksessa kasvimateriaaleista· Kuviot la ja Ib esittävät tämän keksinnön • * « ,7, ksylanaasia koodittavan geenin nukleotidisekve • · · .11 tämän keksinnön mukaisen esiasteksylanaasin amino *. * 25 venssiä, joka sisältää esisekvenssin ja valmiin e • · · : ·* jota kyseinen nukleotidisekvenssi koodittaa· • * · ···* Kuvio 2 on käyrä, joka valaisee tämän ··♦ : mukaisen ksylanaasin moolimassan määrittämiseks SDS-PAGE-analyysin tuloksia ja jossa moolimassa lii 30 toneina (kD) on y-akselilla ja liikkumisetäisyys i ·*'*· reinä (mm) x-akselilla.
14 x-akselilla ja Xyl on tämän keksinnön mukaiselle 1 sille saatu pl.
Kuvio 4 on plasmidin pUB-BPX!2 restriktio] Kuvio 5 on plasmidin pUBDEBRAl restriktio] 5 Kuvio 6 on plasmidin pKACl restriktiokart
Kuvio 7 on plasmidin pLll restriktiokartt. Kuvio 8 on plasmidin pL7SBT restriktiokar Kuvio 9 on plasmidin pL7TAKA restriktioka: Kuvio 10 valaisee Bacillus licheniformii 10 deleetioplasmideilla pLDl, pLD3 ja pLD6 in vivc kromosomideleetioita.
Kuvio 11 on plasmidin pLDl restriktiokart Kuvio 12 on plasmidin pLD3 restriktiokart Kuvio 13 on plasmidin pLD6 restriktiokart 15 Tämän keksinnön mukaista ksylanaasia tuo ta! useampi Bacillus pumilus PRL B12 -peräinen ge sintö koskee myös tämän ksylanaasin mutantteja ja te ja.
Tässä käytettynä termi "tämän ksylanaasin 20 ja variantit" ja vastaavat sanonnat tarkoittavat seja, joita saadaan muuntamalla tämän keksinnön ksylanaasia tai sen jotakin johdannaista koodit^ kennegeenin DNA-nukleotidisekvenssiä. Tämän keks •V, kaisen ksylanaasin tällaisia variantteja tai m 25 voi ilmentyä ja syntyä, kun niitä koodittavat DN, * l tidisekvenssi insertoidaan sopivaan vektoriin ja/ *»· *;;; vaan isäntäorganismiin. Tämän määritelmän piiriin * * * *·* * mainitunlaiset ksylanaasit, joita ilmentävät jok organismit heterologisesti tai niiden luonnoinse • * * 30 solut homologisesti.
: : Tämän keksinnön mukainen ksylanaasi on 15 venssistä (SEQ ID NO:24). Tämän keksinnön mukaisc naasln aminohapposekvenssi, mukaan luettuna sen venssi, esitetään kuvoissa la ja Ib.
Tässä käytettyinä termi "esiasteproteiini" 5 te-entsyymi" tai "esimasteksylanaasi" tarkoittaa 1 teiinia, entsyymiä tai ksylanaasia mukaan luettuii kopioiduiksi ja luetuiksi tulleet "pre" (ja/ta -sekvenssit ennen mahdollisia luentaa seuraavia mi Tässä käytettyinä termit "valmis proteiini 10 mis entsyymi" ja/tai "valmis ksylanaasi" tarkoitti teiinin, entsyymin tai ksylanaasin sitä osaa, joki seuraavien muutosten jälkeen erittyy kasvatusli esiintyy siinä.
Tässä käytettynä termi "esisekvenssi" ti 15 proteiinin, entsyymin tai ksylanaasin sitä osaa, erity solun ulkopuolelle vaan irtoaa (entsymaatt: kaisun kautta tai muulla tavalla) "valmiista" seto ennen "valmiin" osan erittymistä solun ulkopuoleJ Tämän keksinnön mukainen eristetty ja pui 20 ksylanaasi on karakterisoitu tässä perusteellisc syymiksi, jossa on 200 aminohaposta koostuva "va: ;T: venssi", mitä käsitellään jäljempänä perusteen .V. Määritettynä aminohapposekvenssinsä perusteella * * päätelty sitä koodittavan rakennegeenin nukleotidi iv. 25 sistä) ksylanaasin moolimassa on 22,53455 kil< • (kD) (SDS-PAGE:lla määritetty moolimassa on 26 h 9,56 (isoelektrisellä fokusoinnilla määritetty • * Λ *** * 9,8-9,9). Tämän keksinnön mukaisella ksylanaa tehokas ksylanolyyttinen aktiivisuus laajalla li i 30 alueella, alle 40 eC:sta yli 65 °C:n, optimin 441 • ί oIIaam RR °Γ. TAllo Irovlanaao^llo ιιϊΜΜγϊ t'v.Qnlni 16
Kuten Jäljempänä käsitellään perusteel! huolimatta alhaisesta pH-optimistaan määritysoloi tämän keksinnön mukainen ksylanaasi yllättävästi tehokkaasti ligniinin poistoa massoista, joilla o 5 nen pH, koko pH-alueella 7,0 - 9,5.
Tästä ksylanaasista puuttuu kokonaan jääni laasiaktiivisuus.
Bacillus pumilus PRL B12 pystyy ilmentämää gisesti ja erittämään solun ulkopuolelle kasvat^ 10 tämän keksinnön mukaista ksylanaasia. Tätä ks; voivat ilmentää heterologieesti ja erittää solun lelle kasvatus liemeen myös muut Bacillus-isännät, licheniformis-, B. suJbtilis-, B. alkalophilus-, B ja B. amyloliguefaciens-kannat, jotka on transfo: 15 pumilus PRL B12:sta peräisin olevilla yhdellä t< maila asianmukaisella ksylanaasigeenillä käyttäi distelmä-DNA-menetelmiä. Riippumatta siitä, mikä mistäpä omaksutaan, näistä kahdesta erilaisesta saatavilla ksylanaaseilla on identtiset tai 20 identtiset immuunikeraialliset ominaisuudet, kutei määrittää immunologisesti erilaisin hyvin tunnetu **·*; reaktioidenttisyystestein. (Katso Axelsen, N. H., i of lmmunoprecipitation-in-Gel Techniques, Blackwe tific Publications 1983, luvut 5 ja 14. ) • * 25 Tämän keksinnön mukaista ksylanaasia void • · * l taa viljelemällä Bacillus pumilus PRL B12:a ja se ·;;; teja ja variantteja.
* * Tässä käytettynä termi "mutantit ja varian koittaa Bacillus pumilus PRL B12:een viitattaessa a * : 30 joita saadaan muuntamalla sen ksylanaasia koodit : kennegeenin DNA-nukleotidisekvenssiä.
17 kanssa. Alustan koostumus voidaan suunnitella ala tunnettujen periaatteiden mukaisesti. Huomauteta säksi, että Bacillus pumilus PRL B12 ei ole termo Xsäntäsolut erittävät ksylanaasia viljely 5 solun ulkopuolelle. Tämä mahdollistaa ksylanaasi] inisen ja puhdistamisen (talteenoton) aikaansaanni kiksi erottamalla solumassa kasvatusliemestä (es; suodattamalla tai sentrifugoimalla) välttäen soJ joamista. Tuloksena olevaa solutonta kasvatuslic 10 daan käyttää sellaisenaan tai se voidaan haluttae konsentroida (esimerkiksi haihduttamalla tai uit: tamalla). Ksylaani voidaan sitten haluttaessa en luttomasta liemestä ja puhdistaa halutunasteises omaisin menetelmin, esimerkiksi pylväskromatog 15 tai jopa kiteyttää.
Tämän keksinnön mukainen ksylanaasi erisi puhdistetaan kasvatusliemestä, johon se erittyy, sesti (1) konsentroimalla isäntäviljelmän super: (2) johtamalla konsentroitu supernatantti ionin 20 lonnin läpi; (3) johtamalla konsentroitu supe: hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvan koloni Ksylanaasia voidaan valmistaa myös käyttäi mattimiesten hyvin tuntemia yhdistelmä-DNA-mei Ψ 9 kuten eristämällä ksylanaasia koodittava DNA-fr i » •V. 25 yhdistämällä DNA-fragmentti asianmukaiseen ilmen • · * | naaliin sopivassa plasmidivektorissa; viemällä 1 1 18 Tämän keksinnön mukaista ksylanaasia voide tää täydentämään erilaisia lignoselluloosapitoisc valkaisuprosesseja. Tällaisia valkaisusekvenssej tään massan kemikaalikeiton jälkeen ligniinin pc 5 valkaisun jatkamiseen halutun lopullisen vaaleudei saamiseksi. Tällaisissa valkaisuprosesseissa on sesti ensimmäinen ligniininpoistovaihe, jossa toi kemikaalikäsittely ja sen jälkeen emäsuutto. Täti ninpoistovaihetta seuraa sitten sarja valkaisuvai 10 Klassisissa (eli perinteisissä) valkaisuprc sa käytetään alkuaineklooria (Cl2) yksinään tai kl< sidin (C102) lisäksi keitetyn massan kemialliseen lyyn (kloorauksen kautta) (jota seuraa emäsuutto; ninpoistovaiheessa. Valkaisuprosesseissa, joissa < 15 tä alkuaineklooria [EOF (Elemental Chlorine Free) suprosesseissa], käytetään C102:a Cl2:n sijasta li poistovaiheessa.
Vaikka AOX-tasot ovat alentuneita tä: ECF-prosesseissa, ne johtavat silti edelleen jon) 20 seen AOX-tuotantoon. Lisäksi C102 on kalliimpaa !
Klooridioksidi ei myöskään ole yhtä tehokasta ku] :T: keitetyn massan kemiallisessa käsittelyssä. Niin •V. tarvitaan suurempia määriä (Cl2:iin verrattuna) • * tulosten saavuttamiseksi. Tällaisten suurempien 25 toisuuksien käyttö lisää siihen liittyvien A0X-yh< • · ’ syntymistä samoin kuin koko prosessin kustannuksd lisuussovellutuksissa tällaiseen valkaisuun ti J · ♦ C102-määrä voi itse asiassa pakottaa melkoisiin lai tointeihin, kuten "on-site"-C102-generaattorin hai ;·: : 30 Täysin kloorittomissa valkaisuprosesseis ··.
(Totally Chlorine Free) -valkaisuprosesseissa] 1 19 selliä saavutetaan haluttuja AOX-tasojen alei niillä ei ehkä saavuteta halutun korkeata ligniin tasoa. Lisäksi tällaiset reaktiiviset hapettime aiheuttaa massan hajoamista. Lopuksi mainittako 5 tällaisissa TCF-prosesseissa käytettävät käytettä tiiviset hapettimet voivat olla sangen kalliita, sää edelleen tällaisiin biovalkaisuprosesseihin kustannuksia.
Kuten jäljempänä kuvataan yksityiskoti 10 olemme havainneet, että käytettynä ECF- ja klassi sessien yhteydessä massan käsittely tämän keksinn sella ksylanaasllla mahdollistaa yllättävästi my ligniininpoistovaiheessa tarvittavan kloori- ja/ ridioksidipanostuksen olennaisen vähentämisen. 15 suorana seurauksena laitoksen jätevesien AOX-pi pieneneminen, mistä on etua ympäristölle. Olemnu havainneet, että ksylanaasiesikäsittely auttaa klassisissa prosesseissa samoin kuin TCF-pro saavuttamaan mahdollisimman hyvän vaaleuden (i 20 esimerkiksi massan iSO-vaaleusarvolla).
Keksintö suuntautuu erityisesti massoihii on tehty kemikaalikeitto. Ksylaani (menetettyään • * * ,7, junsa) saostuu keiton jälkeen massan kuiturake • * · jossa se suojaa kuituihin jäänyttä ligniiniä. 0 ; 25 että tämän keksinnön mukainen ksylanaasi poistaa • · * * ·* seisestä takaisinsaostuneesta ksylaanista ja M» ·*·· siten ligniinin ja helpottaa sen myöhempää poisto *.* : suprosessin ligniininpoistovaiheessa. Kaikentyypp noselluloosapitoiset materiaalit, kuten puu, joi • * I 30 tään kemiallisten massojen tuotannossa, soveltuva täviksi tämän keksinnön mukaisen menetelmän yh 20 kuin muut lignoselluloosapitoiSten materiaalien kuten pellava ja juutti.
Tässä käytettynä nkappalukuM viittaa pui läsnä olevan ligniinin määrän mittaamiseen. Kapi 5 luku, joka edustaa sitä kaliumpermanganaatti -liuoksen (0,1 ekv/1) tilavuutta (millilitroina kuluttaa yksi gramma kuivaa massa olosuhteissa, j< ritellään TAPPI (Technical Committee of the Assoc the Pulp and Paper Industry) -standardissa nro ' 10 (1985), noudatettaessa kyseisessä standardissa 1 menettelyjä.
Tässä käytettynä "ISO-vaaleus" viittaa tuotetun paperin vaaleuden mittaamiseen. Tämä arv sasta valmistetun paperin heijastavuus olosuhteis 15 määritellään ISO (the International Organization dardization) -standardissa nro 2469, joka on standardilla nro 2470 täydennettynä viitteessä 2470 - 1977(F), noudatettaessa kyseisessä standar vattuja menettelyjä.
20 Tässä käytettynä termi "kerroin", "kloor: ja/tai "aktiivinen kloori -kerroin" edustaa kl .···, klooridioksidin hapetuskykyä ilmaistuna klooriek • * « l ^ teinä ja laskettuna seuraavasti: [Cl2 + C102 (2,63 « · · ; kuivasta massasta (o.d.p. )]/ valkaisemattoman mai * · * I. I 25 paluku.
• ·* Tässä käytettynä "XU" tarkoittaa ksylanai ...Γ köä, johon päästään jäljempänä esimerkissä 2 kuv.
V : tavalla.
Ksylanaasi voidaan lisätä eri vaiheissa k< : 30 erilaisissa valkaisuprosesseissa. Ksylanaasi lisä ***** saan edullisesti sen kemikaalikeiton jälkeen mul 11 21 reaktiivisten hapettomien määriä, j oita täytyy valkaisuprosessin ligniininpoistovaiheen kemi< käsittelyssä. Ksylanaasi voidaan lisätä joko puhd: muodossaan, tai se voi olla konsentroidussa tad 5 troimattomassa kasvatusliemessä.
Klassisissa massanvalkaisuprosesseissa 1 alkuaineklooria (Cl2) mahdollisesti yhdessä kloorit (C102) kanssa ligniininpoistovaiheessa. Yleisiä et klassisista valkaisprosesseista ovat CEDPD (kloor: 10 likäsittely, emäuutto, dioksidi, peroksidi ja dio C/DEDPD (kloori-/dioksidikemikaalikäsittely, ei dioksidi, peroksidi ja dioksidi). Kussakin näisti sista prosesseista ligniininpoisto tapahtuu ole; osiltaan kahdessa ensimmäisessä toimenpiteessä, j 15 sutaan tässä valkaisuprosessin "ligniininpoistova
Valkaisu tapahtuu olennaisilta osiltaan jäljellä toimenpiteissä, joita kutsutaan tässä valkaisu; "valkaisuvaiheeksi".
Tämän keksinnön mukaista ksylanaasia (X) I 20 klassisissa valkaisuprosesseissa edullisesti mass sittelyyn erillisessä toimenpiteessä välittömäs ligniininpoistovaiheen kemikaalikäsittelytoimenpl ,V. voidaan tehdä ilman välipesua. Tällä tavalla käyt » · f •I,*, pumilus PRL B12 -ksylanaasi antaa mahdollisuuden I. I 25 olennaisesti, suunnilleen 15 % (lehtipuu) - 40 : ** puu), kloorin määrää, jota tarvitsee käyttää 1 *· * ·«·· poistovaiheessa. Tämä kloorin vähennys saavuteta» • · * V * edelleen massa, jonka lignlininpoistotaso on hyvi (mitattuna sellaisen massan kappaluvulla, jonka p ·.· · 30 rätty ksylanaasi käsittelyn aikana).
··· : : ECF-massanvalkaisuprosesseissa käytetään 11 ( 22 olennaisesti kahdessa ensimmäisessä toimenpiteesi kutsutaan tässä valkaisuprosessin "ligniininpä heeksi". Valkaisu tapahtuu olennaisilta osiltaan olevissa toimenpiteissä, joita kutsutaan tässä ' 5 prosessin "valkaisuvaiheeksi".
Tämän keksinnön mukaista ksylanaasia (X) ] mainitunlaisissa ECF-valkaisuprosesseissa edullis san esikäsittelyyn erillisessä toimenpiteessä väl ennen ligniininpoistovaiheen kemikaalikäsittely 10 dettä ja ilman välipesua. Tällä tavalla käytetty] milus PRL B12 -ksylanaasi antaa mahdollisuuden olennaisesti klooridioksidin määrää, jota tarvit tää ligniininpoistovaiheessa. Tämä vähennys sa parantaen itse asiassa ligniininpoistovaiheessa a 15 tavaa ligniinin poistoa.
TCF-massanvalkaisuprosesseissa käytetään vista hapetinta Cl2:n ja/tai C102:n poissa olless ninpoisto- ja valkaisuvaiheissa. Yksi yleinen i TCF-prosessista on OQPZP (happi, kompleksinmu 20 peroksidi, otsoni ja peroksidl). Tällaisissa pro on tavoitteena vähentää mahdollisimman paljon ots ·*!*. muun reaktiivisen hapettimen) määrää neljännessä .V* teessä saaden samalla aikaan puumassan mahdolllsl « · « kea lopullinen vaaleus (mitattuna massan ISO-vaal • a !. I 25 Tämä otsonin vähentäminen on tärkeää, koska o1 • * * * * hajottaa massaa.
• aa •jj* Tämän keksinnön mukaista ksylanaasia (X) '** * mainitunlaisissa TCF-valkaisuprosesseissa ed kompleksinmuodostustoimenpiteen yhteydessä (niin · 30 sessi on OX/QPZP). Tällä tavalla käytettynä B. pu : B12 -ksylanaasi antaa mahdollisuuden vähentää ots 23 Tämän keksinnön yhden toisen puolen muka: eristetty ja puhdistettu tämän keksinnön mukaisl naasia koodittava geeni tässä kuvattavalla tavaJ lanaasia koodittava nukleotidisekvenssi voidaan 5 Bacillus pumilus PRL B12:n kromosomi-DNA:sta tav< kloonausmenetelmin. Ksylanaasia koodittava sekv saatavissa Sau3Al-osittaispilkonta-DNA- fragment!s koko on 1022 emäsparia (ep). Tämän fragmentin nul sekvenssi on määritetty, kuten nähdään kuvioista 10 (SEQ ID N0:1), joissa "N" edustaa identifioimat leotidia. Tämä 1022 ep:n fragmentti sisältää tämä: nön mukaisen ksylanaasigeenin valmista ksylanaasi tavan nukleotidisekvenssin (SEQ ID NO:26) ja/tai 1 siesisekvenssiä koodittavan nukleotidisekvenssin 15 NO:33) ja/tai edellä olevia koodittavia sekvensi ID NO:28) ja/tai jäljessä olevia koodittavia se] (SEQ ID NO:29).
Vielä yhden toisen puolensa mukaisesti täm tö sisältää ilmentämisvektoreita, jotka sisältä' 20 tai useampia nukleotidisekvenssejä (rakennegeenii koodittavat yhtä tai useampaa määrättyä proteiin: ;1·1: ksylanaaseja, α-amylaaseja, pullulanaaseja ja i * .V. proteaaseja, ja joita ilmentämisvektoreita voidaa sopivien isäntäsolujen transformointiin niiden ] • » •V. 25 mien yhden tai useamman proteiinin ilmentymisen a * · * miseksi.
··· *lll Tässä käytettynä termi "ilmentämi s vektori" * 1 1 taa mitä tahansa erillistä DNA-sekvenssiä, joka replikonin samin kuin muita DNA-alueita (nukle< * 1 i.i : 30 venssejä), niin että se toimii isäntäsolussa itsi ! täydellisenä aeeninilmentämisyksikkönä.
24
Termillä "promoottorialue" tarkoitetaan mi sa rakennegeenin edellä olevaa aluetta, joka mah< RNA-polymeraasin sitoutumisen ja koodittavan s< transkription ja/tai translaation tapahtumisen.
5 Termillä "säätelyalue" tarkoitetaan mitä aluetta, joka säätelee rakennegeenin transkriptio translaatiota.
Termillä "rakennegeeni" tarkoitetaan ken sekvenssiä, joka toimii templaattina RNA-syntee 10 mahdollistaa kiinnostuksen kohteena olevan protei teesin isännässään.
Tapauksen erityispiirteiden mukaan ilmentäi reiden yksi tai useampi nukleotidisekvenssi voi yhden tai useamman nukleotidisekvenssin, joka ] 15 joko yhtä tai useampaa esiasteproteiinia tai useampaa valmista proteiinia.
Edellä käsiteltyjen yhden tai useamman s< lisäksi tämän keksinnön mukaiset ilmentämisvektor sisältää muita nukleotidisekvenssejä, jotka ov 20 ilmentämisvektorin ylläpidossa ja/tai yhden tai protiinia koodittavan sekvenssin tuottaman y] useamman proteiinin ilmentämisessä ja/tai eritti » i *1 m Tällaiset lisäsekvenssit voivat olla joko riippi a a a [·*·* yhdestä tai useammasta proteiinia koodattavasta ϊ V 25 sistä tai olla toiminnallisesti kytkeytyneinä ni: • a a :V Termillä "riippumaton yhdestä tai useammas „1** iinia koodittavasta sekvenssistä" tarkoitetaan, • aa : mentämisvektorin yhden tai useamman proteiinia ko< sekvenssin koodittaman yhden tai useamman protei: : 30 teesi, ilmentyminen ja/tai erittyminen ei sääteli a·· i ,·*·, eikä muulla tavoin kontrolloi mainittuja yhtä tai 11 25 nia koodittavan sekvenssin koodittaman yhden tai proteiinin synteesi, ilmentyminen ja/tai erittyrni telee, edistää ja/tai kontrolloi muulla tavoin me siten liittyneitä (toiminnallisesti kytkeytynei 5 tai useampaa lisäsekvessiä tai vaikuttaa niihin.
Tämän keksinnön mukaisia ilmentämivektorc daan konstruoida yhdestä tai useammasta nukleotid: sistä, jotka ovat joko heterologisia tai homologi! täsoluille, joiden transformointiin niitä käytel 10 on tarkoitus käyttää).
Termillä "homologinen isäntäsoluille" tarke että ilmentämisvektorin yksi tai useampi nuklee venssi ovat joko peräisin isäntäkannasta tai san kannasta (joka on tarkoitus transformoida nii 15 muunnettuja tai synteettisesti muodostettuja sii: la, että ne toimivat samalla tavalla kuin isäi (iImentymisisärmän) nukleotidit.
Termillä "heterologinen isäntäsoluille" 1 taan, että ilmentämisvektorin yksi tai useampi nul 20 sekvenssi ovat peräisin kannasta, joka on eri kuii kanta (joka on tarkoitus transformoida niillä), e: ·"·’· ole muunnettu eikä muodostettu synteettisesti sll.
9 la, että ne toimisivat samalla tavalla kuin isäi * « · * · (i Imentymi s isännän) nukleotidit.
• * •·β*β 25 Tämän keksinnön mukaisia ilmentymi s vektori I daan konstruoida yhdestä tai useammasta nukleotid: · + * ”” sistä, jotka ovat keskenään joko homologisia tai 1 : gisia.
Termillä "yksi tai useampi homologinen nul 2.: : 30 sekvenssi" tarkoitetaan (i Imen tämi s vek tore iden) ··· %ββ· useampaa nukleotidi sekvenssiä, jotka ovat joko 26 11 e
Termillä "yksi tai useampi heterologinen i disekvenssi" tarkoitetaan (ilmentämisvektoreiden) useampaa nukleotidisekvenssiä, jotka ovat joko eri lähdeorganismeista j a/tai muunnettuja tai s; 5 sesti muodostettuja sillä tavalla, että ne ei\ samalla tavalla kuin saman lähdeorganismin nuklet Termillä "eristetty” tarkoitetaan, että i dit, joihin viitataan (kuten ilmentämisvektorin i dit), eivät ole luonnollisessa ympäristössään.
10 Tämän keksinnön mukaisten ilmentämisve] yksi tai useampi nukleotidisekvenssi valmistetaai maila restriktioentsyymeillä DNA:ta DNA-fragment mistamiseksi ja ligatoimalla tällaisia DNA-frai yhdistelmämolekyylien valmistamiseksi.
15 Termillä "yksi tai useampi DNA-fragmentti tetaan yhtä tai useampaa DNA-nukleotidia, jotka yhteen restriktioentsyymille tehdyn pilkkomisen Tällaisten fragmenttien nukleotidit voivat olla j rologisia tai homologisia keskenään.
20 Termillä "yksi tai useampi yhdistelmäin tarkoitetaan vähintään kahta DNA-nukleotidia, jo tyvät yhteen ligaasilla (esimerkiksi T4-DNA-li< .V. tehdyn ligaation jälkeen. Tällaisten yhdistelmämo 1 1 .11' nukleotidit voivat olla joko heterologisia tai hoi 25 keskenään.
« 1 ·
Ellei toisin mainita, DNA:n mainitunlaine; • « •••| minen restriktioentsyymeillä keksinnön yhteydess : tävien DNA-fragmenttien valmistamiseksi, mainit fragmenttien ligatointi tämän keksinnön yhteydess :.! : 30 tävien yhdistelmämolekyylien valmistamiseksi sai DNA:n vieminen isäntämikro-oraanismeihin tehdääi 1 ; 27 daan yleisesti ottaen siten, että se pysyy m alueella, ja lämpötila pidetään yleensä alempana 60 °C. Restriktio tehdään edullisesti suunnilleen lassa 37 *C joitakin termofHiisistä bakteereista 5 olevia entsyymejä lukuun ottamatta.
Tämän keksinnön toteuttamisessa käytettä triktioentsyymit ja ligaasit ovat kaupallisesti i ja niitä tulisi käyttää niiden mukana tulevien va ohjeiden mukaisesti.
10 Erilaisia fragmentteja ja valmiita rakenne daan liittää yhteen tavanomaisin menetelmin. Moi pauksissa geenit on eristetty ja niille on tehty tiokartoitus samoin kuin sekventointi. Tässä kiinnostuksen kohteen oleva sekvenssi, kuten kiin: 15 kohteena olevaa proteiinia koodittava sekvenssi, ; valitsemaan pilkkomalla geeni restiktioentsyyme: säksi voidaan tarvittaessa käyttää lisämanipuloii ten in vitro -mutageneesia, jossa käytetään syn oligonukleotideja) DNA-sekvenssin muuntamiseks 20 määrätyn kokoisen fragmentin aikaansaamiseksi, jo tää halutun sekvenssin ja jolla on sopivat päät. ja sovitusjaksoja voidaan käyttää sekvenssien lii * ,V. samoin kuin hävinneiden tai deletoitujen sekvens < · « ··l vaamiseen, kun restriktiokohta on kiinnostuksen * * * !. ’ 25 oleva alueen sisällä. Erilaisia eristettäviä fra< • · * : i voidaan haluttaessa puhdistaa elektroforeettises * * •••| troeluoida, ligatoida muihin DNA-fragmentteihin, : V * eristää uudelleen ja manipuloida edelleen.
Tämän keksinnön mukaiset ilmentämisvektor * · : 30 olla itsenäisesti replikoivia vektoreita. Tämä ta: f'*: että vietyinä isäntäorganismiin nämä vektorit 28 rit voivat vaihtoehtoisesti olla tyyppiä, jossa misjärjestelmä integroituu isännän kromosomiin.
Tämän keksinnön toteuttamisessa käytettävin ilmentämi s vektoreita ovat yleisesti ottaen vektor; 5 ovat yhteensopivia organismin kanssa, joka transf< vektorilla. Tässä suhteessa niillä on esimerkiks: sopivia säätelysekvenssejä ja replikaatiolähteitä lisäksi edullisesti monikopioisia ja sisältävät i useamman valikointimarkkerigeenin (esimerkiksi 5 10 useamman antibioottiresistenssiä koodittavan geen merkkeihin tällaisista soveltuvista ilmentämi svel kuuluvat faagit, plasmidit, kosmidit, transposoni mosomiin integroituvat vektorit. Tämän keksinnön ilmentämisvektoria voidaan lisäksi käyttää ilmeni 15 menttien ja heterologisten geenielementtien inte< isännän kromosomiin tavanomaisin menetelmin, ; kuvataan julkaisussa Saunders et ai., J. Bactex (1984) 718 - 726,
Yksi edullinen tämän keksinnön mukainen ili 20 vektori sisältää nukleotidisekvenssin (SEQ ID NO:: koodittaa B. pumilus PRL B12:n valmista ksylanaa; :T: iImentyrnisvektorit voivat sisältää lisäksi B. pm i B12:n ksylanaasin esisekvenssiä koodittavan nukle< venssin (SEQ ID NO:27). Nämä ilmentämisvektori 25 vielä lisäksi sisältää B. pumilus PRL Bl2:n erila: # * * lanaasin promoottori- ja säätelyalueita (sekvenssi *::: ID N0:28 ja SEQ ID NO:29), jotka vaikuttavat main: * · · *·’ * lanaasin ilmentymiseen ja/tai ohjaavat sitä. Ili vektori pUB-BPX12 on tällainen ilmentämisvektori.
* f : 30 Tässä yhteydessä mainittakoon, että muita • · * sekvenssejä (homologisia tai heterologisia) void* 29 likaatiotoiminnot Bacillusta varten; (b) B. pm B12:sta peräisin oleva ksylanaasia koodittava s< Tässä suhteessa huomautettakoon, että B. pumilus } ksylanaasigeeni eristettiin kloonammalla 5 pUBl31teen, mitä käsitellään yksityiskohtaisesti ; nä esimerkeissä.
Vektori pUB131 on itsenäisesti replikoiva pioinen plasmidi, joka on konstruoitu hyvin ti plasmidista pUBHO (on tämä johdannainen). Plasmi< 10 on karakterisoitu perusteellisesti, sen koko DNA-! tunnetaan, ja sen geenit määritellään julkaisussa et ai., Plasmid 15 (1986) 93 - 103.
pUBl31 konstruoidaan deletoimalla ensin p! DNA-sekvenssi, joka koodittaa polypeptidiä, jonk< 15 taan olevan mukana mobi li saati toiminnoissa. Tämä ] sekvenssi korvataan sitten synteettisellä polykyi venssillä, jolloin saadaan plasmldi pUB131. (plasmidin) pUB131 konstruointia ja sekvenssiä yksityiskohtaisesti viitteessä (2).
20 Ksylanaasia koodlttava sekvenssi, joka on sella Sau3Al-pilkonnalla saadussa 1022 ep:n fragi allkloonattlin vektoriin oUB131, jolloin saatiin misvektori pUB-BPX12. pUB-BPX12 sisältää edullisii • « · raavat elementit: • m 25 1. pUB131:stä peräisin oleva sekvenssi, ' * vastuussa plasmidin itsenäisestä replikaatiosta ii
(Tämä piirre antaa mahdollisuuden käyttää pUB-BPX
• 9 · kossa Bacillus-isäntälajeja, kuten B. subtilis-, lus-, B. licheniformis-, B. alkalophilus-, B. lt • * : 30 B. amyIoiiguefaciens-kannoissa jne·); 1 : 2. pUBl31:stä peräisin oleva geeni, jo ,η 11 30 4. Β. pumilus PRL B12:sta peräisin oleva ] siä koodittava geeni.
Plasmidin pUB-BPXl2 restriktiokartta esiti viossa 4.
5 Muihin tässä käyttöön tarjottaviin ilmentäi reihin kuuluvat nukleotidisekvenssi, joka kooditt lus deramifleans T 89.117D:n pullululanaasia (pui nukleotidisekvenssi, joka koodittaa B. lichen!fo 9789:n a-amylaasia (pL7TAKA), ja nukleotidisel 10 jotka koodittavat B. llchenlformls SE2:n alkali teaasia (pLll) tai Bacillus svbtllis 168:n subt (alkalista proteaasia) (PKAC1 ja pL7SBT). Tämän 1 mukaiset ilmentämisisännät ovat suvun Bacillus jotka ovat yhteensopivia ilmennettäväksi halutun 15 nin ilmentämisvektorin kanssa. Nämä kannat ovat e ti aerobisia. Lisäksi on edullista, että nämä kan ole termofiilisiä. Tällaisiin kantoihin kuuluvat lis, B. pumilus, B. llchenlformls, B. alkalop1 lentus ja B. amylollquefaciens. Näistä ilmenty 20 reistä on edullisesti poistettu niiden yksi tad alkalista proteaasia koodittava geeni.
·*··; Edullisia tämän keksinnön mukaisia isäni * ;y. keksinnön mukaisen ksylanaasin ilmentämiseksi ova !V, heniformlslsta johdetut yhdistelmäkannat (niiden J.e.\ 25 sesti puhtaat viljelmät). Lajina, jota käytetään • · * * omaisesti solunulkoisten entsyymien, pääasiassa ··” sien ja alfa-amylaasien, laajamittaiseen teollii . · * *·' * tantoon, se on kiintoisa isäntä kloonattujen gee den ilmentämiseksi teollisessa mitassa.
m m · 30 Se nimenomainen B. llchenlformls -yhdiste : : jota käytetään tässä yhteydessä keksinnön mukaist 11 31 B. lichenlformls SE2:n tuottama alkalinen i syntetisoidaan ensin solun sisällä inaktiivisena « na, jota kutsutaan "preproentsyymiksi". "Pre" -sekvenssit eliminoituvat polypeptidin siirtyes 5 ulkopuoliseen kasvatusalustaan, jolloin syntyy < aktiivinen alkalinen proteaasi.
Deleetion sisältävien SE2-kantojen (delap] ja delap6) saamiseksi poistettiin geenin DNA-koo< venssi, joka koodittaa ainakin valmista alkalista 10 siä (mitä käsitellään yksityiskohtaisesti jäi; bakteerin kromosomista, jolloin syntyi deleetion j kanta, joka on kyvytön tuottamaan toimivaa alkali teaasia.
Tässä käytettynä "valmis alkalinen protea< 15 koittaa aktiivista alkalista proteaasi, ts. er: alkalinen proteaasi -polypeptidiä, jota esiintyy 1 liemessä.
Näiden isäntien ollessa kyseessä B. liciu SE2 on käsitelty yhdistelmä-DNA-menetelmin seura; 20 män keksinnön mukaisten deleetion sisältävien (biologisesti puhtaiden viljelmien) saamiseksi: 1 niformls SE2 delapl, SE2 delap3 ja SE2 delap6, jc •V. kään ei tuota aikalisiä proteaaseja, jotka voival • · lisesti hajottaa niiden tuottamaa heterologista ··.·. 25 nia, ennen kuin tällainen heterologinen proteiini • 1 ottamaan talteen. Lisäksi kyseinen B. llchenifc 111 delap -yhdistelmäkanta voidaan transformoida ede] * · » tulla pUB-BPX12:lla, joka sisältää B. pumilus PR] peräisin olevan ksylanaasia koodittavan sekvenssi • · : 30 kuin kanamysiini- ja neomysiiniresistenssiä koe geenit.
32 reunustavien 51- ja 3’-alueiden kanssa ja vietiii ten pUB131:een, B. subtllisissa replikoivaan plaa 2) konstruoitiin deleetioplasmideja, jois letoitu valmista alkalista proteaasia koodittava ; 5 disekvenssi; 3) sitten transformoitiin B. licheniformi loksena olevalla deleetioplasmidilla; 4) Br licheniformis SE2 -kannan kromos* proteaasigeeni korvattiin sitten plasmidin de li 10 sekvenssillä homologisen rekombinaation kautta, saatiin määrätty deleetion sisältävä B. lichenif* -kanta; 5) deleetioon käytetty plasmidi elii SE2-deleetlon sisältävistä kannoista kypsyttämän 15 Tuloksena olevat deleetion sisältävät B.
formis SE2 delap -kannat eroavat siten kanta-SE2 vain siinä suhteessa, että kromosomista on deleto lista proteaasia vastaava DNA-sekvenssi, mukaan valmista proteaasia koodittava DNA-sekvenssi. Di 20 kuvataan kaavion avulla kuviossa 10.
Vaikka kuvaus on tehty edellä B. llcL· SE2:n suhteen, on ymmärrettävä, että samaa strate daan tarvittaessa ja haluttaessa käyttää muiden < • · :v. sisältävien Bacillus-kantojen (B. subtills, B. a.
:v. 25 lus, B. lentus ja B. amyloliguefaciens) valmistu] • * ! Materiaalit ja menetelmät ··· *::: Materiaalit 9 9 * v * Ellei seuraavissa esimerkeissä (ja joissa! tävistä esimerkeistä) toisin mainita, käytettiin ; : 30 materiaaleja: *« · :...s Luria-Bertani-alusta ("L-B" kutsutaan täs 33 alusta. Kiinteä L-B-alusta on viitteessä (3) si\ kuvattava alusta.
Proteeasindetektointimaljat valmistettiin ] tästä, jota oli täydennetty 1 %;lla (paino/tilavi 5 vatonta maitoa.
Tässä käytettävien tris-asetaatti (TAE) ji raatti (TBE) -puskurien koostumusta ja valmistus taan viitteessä (3) sivulla 6.7.
Tässä käytettävien TE-puskurien koostumust 10 mistusta kuvataan viitteessä (3) sivulla B.20.
AZCL-pullulaani ja AZCL-ksylääni ostettiin Pty. Ltd:Itä.
Polyakryyliamidisekventointigeelit valmd noudattamalla menettelyä, jota kuvataan viitte 15 sivuilla 13.45 - 13.53, käyttämällä 6 % (paino/1 akryyliamidia gradientin sijasta.
Akryyliamidi ostettiin Biozymiltä.
DM3-alusta valmistettiin noudattamalla mei jota kuvataan viitteessä (4) sivuilla 150 - 151.
20 Bakteerikannat ja plasmidit saatiin alla taulukossa 1 esitetyistä lähteistä käyttämällä es ·*;·. luettelonumerolta.
* • · • · « il· • ft «· 4 • · · • · S · • ft · « · · • · • ft ft »ft· ft ft·*· • ft* • ft · ft ft ft ft ft ft » · I ft · · ··· · »· · • · • · ··· 34
Taulukko 1
Bakteerikantojen ja plasaidien lähteet Bakteerikanta Lähde Lu< E. coll MC1061 Clontech Laboratories1 5 E. coli JM109 Clontech Laboratories1 B. subtilis 168 B.G.S.C.2 B. subtilis BR151 B.G.S.C.2 B. subtilis PSL1 B.G.S.C.2 B. subtilis 512 PN- B.G.S.C.2 10 B. deramifleans T 89.117D B.C.C.M. (L.M.G.)3 B. licheniformis A.T.T.C.4
Bacillus pumilus PRL B12 A.T.T.C.4 15 pUBllO B.G.S.C.2 pBR322 Clontech Laboratories1 pBS- Stratagene5 pUC18 Clontech Laboratories1 PACYC184 Biolabs6 20 pMK4 B.G.S.C2
Clontech Laboratories (USA) 2B.G.S.C. on BACILLUS GENETIC STOCK CENTE1 State University), USA, kokoelma 3B.C.C.M. (L.M.G.) on the Belgian Co< • a 25 Collections of Microorganisms (Laboratorium voor 1 * 1 2 3 * ·' logie), University of Gent, Belgia
Mt ll\ 4A.T.C.C. on the American Type Culture Co.
2 * »1| 3
1 USA
5Stratagene, Inc. (USA) f 30 6Biolabs New England (USA).
a 1 nl -virani o 1 j. _ττηη ι ΛΛ i..___ 35 nisms, Laboratorium voor Microbiologie, K. L. L< straat 35. B-9000 Gent, Belgia, saantinumerc P-14034.
Bacillus suJbtills SE3 on talletettu Budapc 5 pirauksen ehtojen mukaisesti 21. kesäkuuta 1993 k< the Belgian Coordinated Collections of Microoi
Laboratorium voor Microbiologie, K. L. Ledegancks B-9000 Gent, Belgia, saantinumerolla LMG P-14035,
Bacillus pumilus PRL B12 [alunperin tallel 10 American Type Culture Collectioniin (ATCC) toi 1938 saantinumerolla 6631] on talletettu Budape pimuksen ehtojen mukaisesti 24. kesäkuuta 1993 tl can Type Culture Collectioniin (ATCC), Parklaw
Rockville, Maryland 20852, USA, saantinumerolla i 15 Menetelmät ja tekniikat
Ellei seuraavissa esimerkeissä toisin niissä käytettiin seuraavia menetelmiä ja tekniil· Käytettäessä termejä "kloonata", "ali! ja/tai "viedä" puhuttaessa DNA-fragmenteista tarl 20 luovuttaja- ja vastaanottaja-DNA-sekvenssien pii (restriktiota) tarvittaessa, niiden tarttuvien u.
·*·*· 3'- ja 5'-päiden käsittelyä (tarvittaessa ja/ta . V. taessa), mainitunlaisten fragmenttien erottelua • ·* SV. kaan ja/tai mainitunlaisten fragmenttien eristämi: »V, 25 vittaessa ja/tai haluttaessa), mainitunlaisten : • · l tien, linearisoidut vektorit mukaan luettuina ··· « ·*·· taessa ja/tai haluttaessa), defosforylaatiota ja i • * j ?· * laisten fragmenttien ligatointia toisiinsa yhdisti molekyylin muodostamiseksi. Tällaisen määritelmä] • · : 30 kuuluvat lisäksi isäntäsolujen transformointi mail ··· silla yhdistelmämolekyyleiliä, tällaisten transfo: 36
Plasmidien (luovuttajien ja vastaanottajia mosomi-DNA:n yms. pilkonnat ja restriktioentsyymi] tehtiin käyttämällä tarpeen mukaan yhtä tai muui striktioentyyraiä kiinnostuksen kohteena olevan l 5 mentin eristämiseksi. Tällaisiin pilkkomisiin kä; restriktioentsyymejä on saatavana kaupallisesti valmistajia. Restriktiopilkonnat tehtiin olosi jotka on määritelty, ja noudattamalla menettelyä kuvattu viitteessä (3) kohdissa 5.28 - 5.32, pa: 10 restriktioreaktlo toteutettiin kymmenkertaisessa i vassa riittävän DNA~määrän saamiseksi jatkopuhd heitä varten.
Fragmenttien tarttuvista ulkonevista 51 -pä tiin tylppiä käsittelemällä E. coli -DNA-polymei 15 Klenow-fragmentilla olosuhteissa, jotka on määri noudattamalla menettelyä, jota on kuvattu viltti sivuilla F.2 - F.3.
Fragmenttien tarttuvista ulkonevista 3'-pä tiin tylppiä käsittelemällä bakteriofagi T4 -DN, 20 raasilla olosuhteissa, jotka on määritelty, ja : maila menettelyä, jota on kuvattu viitteessä (3) F.4 - F.5.
.V. DNA-fragmenttien erottelut koon mukaan (re: rv, pilkkomisten looppuunsaattamisen jälkeen) tehtiii * t «V. 25 sigeelielektroforeesilla käyttämällä 0,5 % (pa 9 · ‘ l' vuus) agaroosia tris-asetaattipuskurissa olos ***· jotka on määritelty, ja noudattamalla menettelyä : kuvattu viitteessä (3) sivuilla 6.01 - 6.19. Pien menttien (<1000 ep) erottamiseksi käytetty agaro< • · : 30 suus nostettiin alueelle 1 - 1,2 % (paino/tilavui : Muut agaroosigeelielektroforeesikäsittelv 37 visiin geeleihin (DNA:n puhdistus) tai tris-boraa ria (TBE) analyysitarkoituksiin.
Koon mukaan tehdyn erottelun jälkeen kiini kohteina olevat DNA-fragmentit uutettiin agaroos.
5 ja, ellei toisin mainita, eristettiin ja puhd joko suodatusmenetelmällä, jollaista kuvataan ju Zhu et ai., Bio/Technology 3 (1985) 1014 - 1016, distusmenetelmällä, jossa käytetään lasi helmiä ja BiolOl kauppanimellä "Gene Clean”.
10 Kiinnostuksen kohteina olevat DNA-fragmei nearisoidut vektorit mukaan luettuina, defosfo olosuhteissa, jotka on määritelty, ja noudattamal telyjä, joita on kuvattu viitteessä (3) sivuii: 1.61.
15 DNA-fragmenttien ligatoinnit linear!soitu toreihin tai muihin sekvensseihin tehtiin olos jotka on määritelty, ja noudattamalla menettely; on kuvattu viitteessä (3) sivuilla 1.68 - 1.69. T telmää käytettiin riippumatta siitä, sisälsivätkö 20 tavat fragmentit tarttuvia vai tylppiä päitä. ΊΝ teessä huomautettakoon, että tässä yhteydessä ·*·*· ligaasi oli T4-DNA-ligaasi.
« ;y. Synteettiset oligonukleotidit konstruoitii tamalla menettelyä, jota kuvataan julkaisussa Bea * * !. I 25 L. et ai., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859 - * ; käyttämällä B-syanoetyylifosforamidiitteja ”” Cyclone Synthesizer!ssä.
* · · *** * Synteettiset oligonukleotidit leimattiin loimalla [γ-32Ρ]ΑΤΡ:llä käyttämällä bakteriofagi 1 * · : 30 nukleotidikinaasia olosuhteissa, jotka on määri 1 • *l ϊ : noudattamalla menettelyjä, joita on kuvattu viitt
Hill. ........in . -: ’ ' ' " 38 mentaarista synteettistä oligonukleotidia, Jotki tettiln fosforyloidussa muodossa. Kumpikin oligon sekoitettiin 1 x KGB -puskuriin, jota kuvataan v (3) sivulla 5.31, ja kuumennettiin lämpötilaa 5 10 min. Seoksen annettiin jäähtyä hitaasti ( 15 min:n aikana) huoneenlämpötilaan. Tällä tavall kaksisäikeislä synteettisiä kytkijöitä. Näitä kak siä synteettisiä kytkijöitä käytettiin sitten lu< DNA-fragmenttina joko suoraan ligaatioissa edellä 10 lyllä tavalla, tai niille tehtiin haluttaessa j< keissä määritellyllä tavalla restriktiopilkkomin käsitellyllä tavalla ennen mainitunlaista ligaat DNA:n konstruoinnit tehtiin käyttämällä -kantoja kloonausisäntänä. Vaihtoehtoisesti ja a 15 sessa kohdassa mainittaessa käytettiin Bacillus -kantoja kloonausisäntänä.
E. coli -isäntäsolujen transformoinnit käyttämällä CaCl2-menetelmää olosuhteissa, jotka telty, ja noudattamalla menettelyjä, joita ori 20 viitteessä (3) sivuilla 1.82 - 1.84.
Vaihtoehtoisia (ja määriteltyjä) E. coli - :T: lujen transformointeja tehtiin käyttämällä elek ;Vj tiota olosuhteissa, jotka on määritelty, ja noud • · •V. menettelyjä, joita on kuvattu viitteessä (3) •v\ 25 1.75-1.81.
• * ' 'j' Transformoinneissa käytetyt E. coli -solu *::: coli MC1061 -soluja.
• · « * B. subtilis -isäntäsolujen transformoinni käyttämällä komplementtisolumenetelmää olosuhtei : 30 ka on määritelty, ja noudattamalla menettelyjä, kuvattu viitteessä (5) sivuilla 9-11.
39 vuilla 150 - 151, seuraavin muutoksin: lysotsyym lisättiin pitoisuudeksi 5 mg/ml SMMPzhen viitte sivulla 151 kuvatun menettelyn vaiheessa 7 mä pitoisuuden 1 mg/ml sijasta (inkubointiaika, jok 5 tiin maksimaalisen hajotuksen aikaansaantiin lys lä, oli 60 min) ja regenerointi tehtiin DM3-a jota oli täydennetty kanamysiinillä (200 pg/ml).
Transformoinneissa käytetyt B. subtil is -s vat B. subtllis BR151 -soluja.
10 Bacillus licheniformis -solujen transf tehtiin käyttämällä protoplast!tekniikkaa olos jotka on määritelty, ja noudattamalla menettely on kuvattu viitteessä (6) sivuilla 150 - 151, muutoksin: lysotsyymijauhetta lisättiin pito 15 5 mg/ml SMMP:hen viitteessä (6) sivulla 151 kuvat telyn vaiheessa 7 määritellyn pitoisuuden 1 mg/ml Inkubointiaika, joka tarvittiin maksimaalisen h aikaansaantiin lysotsyymillä, oli 60 min.
E. coli -transformanttien valikointi teht 20 tämällä sopivaa antibioottia. Kaikille pB pUC18:sta, pUBC131:stä ja pMK4:stä peräisin olevi mideille käytettiin ampisilliinia (100 pg/ml k .V. taa). Kaikille pACYC184:stä peräisin oleville pla # f f yl' käytettiin tetrasykliiniä (12,5 pg/ml kasvualust l.I 25 B. subtllis -transformanttien valikointi • * * * ;* Lurian ja Bertanin alustalla, Jota oli täydenne •••f valla antibiootilla. Kaikille pUB110:stä, pUBi: *·* * pUBC131:stä peräisin oleville plasmideille käyte namysiiniä (250 pg/ml). Kaikille pMK4:stä peräisi :J * 30 le plasmideille käytettiin kloramfenikolia (10 μ< B. licheniformis -transformaattien välikö 40 antibioottia sisältäville L-B-maljoille jatkotyö: varten.
Plasmidien eristäminen valikoiduista trani tipesäkkeistä tehtiin kasvattamalla pesäkkeitä ] 5 täisissä viljelmissä ja käsittelemällä ne sitten < tusmenetelmällä olosuhteissa, jotka on määritelty dattamalla menettelyjä, joita on kuvattu viittc sivuilla 1.25 - 1.28. B. subtills -isäntäsolutran tipesäkkeiden ollessa kyseessä kyseistä menette] 10 nettiin seuraavissa kahdessa suhteessa: (a) viitt sivulla 1.25 kuvatun hajotuspuskuriliuoksen I korvattiin 20 %:lla (paino/tilavuus) sakkaro< lisättiin uutta lysotsyymiä (10 mg/ml); (b) lyys tiin edetä 30 min lämpötilassa 37 eC ennen lii 15 lisäämistä.
Pienimittaisille plasmidi-DNA-valraisteill restriktioanalyysit toteutettiin olosuhteissa, määritelty, ja noudattamalla menettelyjä, joita o viitteessä (3) sivulla 1.85 ja viitteessä (6) 20 374 - 379. Analyysin käytetyt restriktioentsyym: tään kutakin uutta plasmidirakennetta esittäviss ;·*·; vissa kuvioissa annetuissa restriktiokartoissa.
*
Joissakin kloonauskokeissa odotettiin lu * « * •V. DNA-fragmentin kahta orientaatiota suhteessa vas • · yl 25 japlasmidiin. Tällaisissa tapauksissa tehtiin f ra * l oikean orientaation valitsemiseksi pienimittaiste •••| di-DNA-valmis teiden tutkiminen restriktioanalyys • · · suhteissa, jotka on määritelty, ja noudattamalla lyjä, joita on kuvattu viitteessä (3) sivuili ·.: : 30 1.28. Analyysissä käytetyt restriktiokohdat esit takin uutta plasmidirakennetta esittävissä va noudattamalla menettelyjä, joita on kuvattu viitt sivuilla 1.38 - 1.39, minkä jälkeen tehtiin CsCl-; olosuhteissa, jotka on määritelty, ja noudattamal telyjä, joita on kuvattu viitteessä (3) sivuili 5 1.45.
E. coli -peräiset plasmidit valmistettiii distettiin käyttämällä emäshejotusmenetelmää olos jotka on määritelty, ja noudattamalla menettely; on kuvattu viitteessä (3) sivuilla 1.38 - 1.39, m 10 keen tehtiin CsCl-puhdistus olosuhteissa, jotka telty, ja noudattamalla menettelyjä, joita on viitteessä (3) sivuilla 1.42 - 1.45.
B. subtilis ja/tai B. licheniformis -peräi midit eristettiin, valmistettiin ja puhdistettu 15 mällä emäshajotusmenetelmää olosuhteissa, jotka telty, ja noudattamalla menettelyjä, joita on viitteessä (3) sivuilla 1.38 - 1.39, muunnettuin vien kahden seikan suhteen: (a) viitteessä (3] 1.38 kuvatun hajotuspuskuriliuoksen I glukoosi k 20 20 %:lla (paino/tilavuus) sakkaroosia, ja lisätt lysotsyymiä (10 mg/ml); (b) lyysin annettiin ede ····; lämpötilassa 37 °C ennen liuoksen II lisäämistä.
t •y. puhdistettiin sitten CsCl-menetelmällä olosuhtei ka on määritelty, ja noudattamalla menettelyjä, 25 kuvattu viitteessä (3) sivuilla 1.42 - 1.45.
* l DNA:t eristettiin bakteerilajeista, joita vatettu L-B-alustassa 16 tuntia lämpötilassa 37 '·" ‘ Kromosomi-DNA eristettiin ja puhdistettiin jelmistä sentrifugoimalla stationaarivaiheessa oi • · : 30 jelmiä kierrostaajuudella 5000 min’1 10 min. Tulok
«M
: : va pelletti suspendoitiin sitten 9 ml:aan Duskur 42 20 min 200 pl:lla RNAasi-liuosta (10 mg/ml) läm; 50 *C. Sen jälkeen lysaattlin lisättiin 1 ml (paino/tilavuus) SDS (natriumdodekyylisulfaatti) ja seosta inkuboitiin 30 min lämpötilassa 70 *C 5 lysaatti jäähdytettiin suunnilleen lämpötilaan 45 lisäämistään 0,5 ml:aan juuri valmistettua prot< -liuosta (20 mg/ml). Lysaattia inkuboitiin sitten lassa 45 °C sekoittaen ajoittain käsin, kunnes läpinäkyvä liuos. Sitten tälle läpinäkyvälle 1 10 tehtiin muutamia fenoliuuttoja olosuhteissa, jotk ritelty, ja noudattamalla menettelyjä, joita or viitteessä (3) sivulla E.3, kunnes saatiin selkeä ta (kyseisessä julkaisussa kuvatulla tavalla). Uu saostettiin sitten lisäämällä 20 ml etanolia. 15 otettiin uudelleen talteen sentrifugoimalla ki juudella 5000 min'1 5 min ja liuotettiin 2 ml:aan ria (pH 8,0).
E, coli, B. lichenlformis ja B. subttlls -kasvatettiin joko nestemäisessä tai kiinteässä 20 tässä.
"Siirostukset" tehtiin (a) levittämällä : laimennettua nestemäistä bakteeriviljelmää, ole: * ,V. olosuhteissa, jotka on määritelty, ja noudattamal ··,·. telyjä, joita on kuvattu viitteessä (6) sivulla • * 1*1 25 valle 15 % (paino/tilavuus) agaria sisältävälle » · * \ ja (b) inkuboimalla tuloksena olevaa maljaa 18 tu **· •••j pötilassa 37 °C mainitun bakteerin erillisten pe * · » *·* * saamiseksi.
Yksittäisten pesäkkeiden eristys tehtiir ·.· * 30 teissä, jotka on määritelty, ja noudattamalla men : joita on kuvattu viitteessä (6) sivuilla 58 - 60 1' 43 viitteessä (6) sivuilla 61 - 62 ja viitteessä (4) 5-6.
Termillä "siirtää" tarkoitetaan bakteeri] sirtämistä kasvualustasta (kuten petrimalJalta) 5 käyttämällä tavanomaisia inokulointimenetelmiä, j ammattimiesten hyvin tuntemia.
Suurimittaiset sentrifugoinnit (>100 ml) käyttämällä G2-21-roottorilla varustettua Beckmai fugia. Samaa sentrlfugia varustettuna JA-10-roi 10 käytettiin kaikkiin sentrifugointeihin, joissa oli 50 - 100 ml. Sentrifugoinnit, joissa tila 3 - 49 ml, tehtiin käyttämällä samaa sentrlfugia 1 tuna joko JA-20- tai JA-A-roottorilla. Mikrosent: nit (1 - 2 ml) tehtiin käyttämällä Sigma 2K15-sen 15 Kvantitatiiviset DNA-määritykset tehtiin s] tometrisellä määritysmenetelmällä viitteessä (3] E.5 kuvatulla tavalla.
Polymeraasiketjureaktiolla (PCR) tehdyt -DNA-amplifikaatiot toteutettiin olosuhteissa, 20 määritelty, ja noudattamalla menettelyjä, joita o viitteessä (3) sivuilla 14.18 - 14.19 samoin h labsilta ostettujen PCR-amplifikaatiovälineistöj * tyiskohtaisissa ohjeissa.
* * :*β·β DNA-fragmenttien siirrot agaroosigeeleist * * 1*1' 25 selluloosaksi voihin (Southern blotting -kokeita : l tehtiin olosuhteissa, Jotka on määritelty, ja ] **· ·;;; maila menettelyjä, joita on kuvattu viitteessä (3 I : la 9.38 - 9.39.
Southern blotting -menetelmät toteutettiii • · : 30 teissä, jotka on määritelty, ja noudattamalla meni ! » H n<tÄ nn Vuva-h-l-ii (Ί\ e^mlla Q Q1 44 telyjä, jolta on kuvattu viitteessä (3) sivuil] 9.55.
Nukleotidien sekventoinnit tehtiin kä; yleistä dideoksiketjunpäättämismenettelyä olosi 5 jotka on määritelty, ja noudattamalla menettely: ovat kuvanneet Sanger et ai. julkaisussa Proc. Na Sei. U.S.A. 74 (1977) 5463 - 5467, käyttämällä s; siä oligonukleotideja, jotka toimivat alukkeina : meraasireaktioita varten.
10 Dideoksivälitteiset reaktiot, joissa k T7-DNA-polymeraasia, toteutettiin olosuhteissa, määritelty, ja noudattamalla menettelyjä, joita
Pharmacia LKB Biotechnolyn T7-sekventointiväline sikirjassa. Reaktioihin käytetyt templaatit oliv 15 säikeisiä plasmideja, joita oli eristetty suuriini plasmidinvalmistuksella käyttämällä CsCl-gradient fugointia edellä kuvatulla tavalla. Sekventointi hin käytetyt templaatit denaturoitiin käsit
NaOH:lla T7-sekventointivälineistöissä kuvatulla 20 Sekventointistrategiat olivat suoria stra joissa käytettiin progressiivisia oligonukleotide la, jota kuvataan viitteessä (3) sivuilla 13.1 .V, (kuvio 13.3B).
• « * .I,.' Sekventointigeelien lataaminen ja ajamin* • · I. I 25 kuin niiden autoradiografia ja luenta toteutetl 1 « · : ; suhteissa, jotka on määritelty, ja noudattamalla lyjä, joita on kuvattu viitteessä (3) sivuilla : 13.58.
Kohdennetut mutageneesit tehtiin olosuhtei * · 30 ka on määritelty, ja noudattamalla menettelyjä, :***: kuvattu julkaisussa T. A. Kunkel, Proc. Natl. A< 45 geenisen synteettisen oligonukleotidin piden käyttämällä templaattina yksisäikeistä urasyloitu joka syntetisoidaan fagemidivektorlsta.
Määrättyjä entsyymejä vastaavien erittyne: 5 teiinien määrät määritettiin tekemällä viljelmän tantille polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PA< lyysi natriumdodekyylisulfaatin (SDS) läsnä oli polypeptidikomponenttien erottamiseksi seuraavast näyte viljelmän supernatanttia saostettiin lisää] 10 (paino/tilavuus) trikloorietikkahappoa (TCA) ja tiin 1 tunti lämpötilassa 0 eC. Seostetut proteiii tiin sitten talteen sentrifugoimalla 10 min kierr< della 15 000 min"1 ja pelletti liuotettiin 1 ml:ai puskuria, joka sisälsi 10 mmol/1 Tris-HCl:a ( 15 1 mmol/1 EDTAa, 2,5 % (paino/tilavuus) SDS:a, B-merkaptoetanolia ja 0,001 % (paino/tilavuus) b: lisinistä. Tuloksena oleva suspensio laimennetti: mukaisesti (katso jäljempänä) näytepuskurilla j« roitiin 15 min lämpötilassa 98 °C. Liukenemattor 20 riaalit poistettiin sitten sentrifugoimalla 5 min taajuudella 15 000 min'1. Tuloksena oleville n. tehtiin SDS-PAGE-analyysi käyttämällä Pharmacia technologylta ostettua PhastSy s terniä olosuhteiss • 1 2 •11' on määritelty, ja noudattamalla menettelyjä, joi- I. I 25 vattu Pharmacian Separation Technique File No.
* « · ·' käyttämällä polyakryyliamidigradienttia 10 - 15 »»» 2 ···1 no/tilavuus). Geelejä ajettiin 60 Vh maksimi j< 46 keessä määritettiin vertaamalla rinnalla ajettuu seerumialbumiini (BSA) -standardiin. Vyöhykkeitä oli seuraavat näennäiset moolimassat, pidettiin ei soituja entsyymejä vastaavina:
5 Ksylanaasi 26 kD
Pullulanaasi 110 kD
Subtilisiini 168 28 kD
Subtilisiini Carlsberg: 28 kD.
PAGE-/densitometria-analyysillä tutkittujc 10 natanttinäytteiden laimennusasteet säädettiin sil mitatuksi tuli suunnilleen sama piikin pinta-ala den ja BSA-standardin kohdalla. Kunkin näytteen vähennettiin tausta-arvo. Tausta-arvot arvioitiii lukokeiden perusteella, joissa analysoitiin rinr 15 pernatantti, joka oli peräisin vastaavasta isännän sisälsi vertailuvektorin pUB131 ilmentämisvektori ta.
Laimennukset, määrät jne-, jotka ilmoiteta prosentteina, tarkoittavat, ellei toisin mainita, 20 tilavuus-prosentteja. Tässä käytettyinä laimennus määrät jne., jotka ilmoitetaan tilavuusprosenttei koittavat tilavuus/tilavuus-prosentteja.
.y. Lämpötilat, joihin tässä viitataan, annet •V, ciusasteina (eC).
• · y '. 25 Restriktioentsyymikohdat, joita merkitään : f tioentsyymin nimellä, jota seuraa suluissa ([]) < »·* mero, tarkoittavat ensimmäistä nukleotidiasema.
*·’ ' mukaisen plasmidin (tai fragmentin) sekvenssiss kyseinen restriktioentsyymi tunnistaa.
: 30 Aminohappojakautuma, moolimassa ja pl pc kaikki käyttämällä IntelliGeneties, Inc.:n, USA, c I · 47
Kun täten on kuvattu eri laisia menetelir keksinnön mukaisen ksylanaasin tuottamiseksi ja s< erilaisista isännistä, menetelmiä ksylanaasigeeni: miseksi ja puhdistamiseksi, ilmentämisvektoreide 5 metymisisäntien konstruointia ksylaanasin ilmeni ja ksylanaasin käyttöä entsymaattisena esikäsittei massojen (erityisesti puumassojen) biovalkaisussa vat esimerkit esitetään pelkästään keksinnön vala: si, eikä niitä ole tarkoitettu eikä tulisi ymmäi 10 rajoittaviksi.
Esimerkki 1
Bacillus pumilus PRL12 -ksylanaasin tuotti
Bacillus pumilus PRL12 -viljelmä saatiin tl can Type Culture Collectionista, Rockville, Maryl< 15 saantinumerolla ATCC 55443.
Bacillus licheniformis SE2 -viljelmä saa1 jempänä esimerkissä 28 kuvattavalla tavalla.
Valmistettiin agaralusta, joka käsitti 10< rian ja Bertanin alustaa ja 0,5 g AZCL-ksylanaasd 20 Lähtien kunkin viljelmän pakastetusta so] siosta inokuloitiin sivelytekniikalla kaksi steri.
kulointipulloa (pullo A ja pullo B), jotka s: ,y. agarkasvualustaa, kumpikin omalla suspensiollaa •Ve pullo A inokuloitiin Bacillus pumilus PRL12:lla, • · *. ! 25 pullo B inokuloitiin Bacillus lichenifon » « « r i e * * delapl:llä. Inokuloituja pulloja inkuboitiin s
•••| tuntia, pulloa A lämpötilassa 30 °C ja pulloa B
V * lassa 37 eC, niin että niihin saatiin vastaavat B
ja B. licheniformis -kantaviljelmät.
• * ; 30 Valmistettiin esikasvatusalusta, joka käs
Bacto-Peptonea? 5 g hiivauutetta; 5 g glukoosia - 48 vatusalustaa kumpaankin. Esiviljelypullo nro 1 : tiin sitten pullon A viljelmästä peräisin oleval! milus PRL B12:lla. Esiviljelypullo nro 2 inokuloi taavasti pullon B viljelmästä peräisin ole\ 5 llcheniformis SE2 delapl:llä. Näitä kahta esivilj< inkuboitiin sitten lämpötilassa 30 °C 16-2' (edullisesti 24 tuntia) sekoittaen (kiertoliike, rosta/min, amplitudi noin 2,54 cm). Inkuboinnir havaittiin visuaalisesti B. pumilus PRL B12 -kan 10 män läsnäolo esiviljelypullossa nro 1 ja B. lich< SE2 delapl -kantaviljelmän läsnäolo esiviljelypul 2. Näiden viljelmien identiteetti varmistettiin ti sin detektointimenetelmin.
B. llcheniformis SE2 delapl -kanta transf* 15 sitten ksylanaasin tuottamiseen tarkoitetulla pi ilmentämisvektorilla (joka oli konstruoitu jäljem merkissä 17 kuvattavalla tavalla), jolloin muoc llcheniformis SE2 delapl (pUB-BPX12), ja vai: eristettiin ja puhdistettiin vastaavat transforms 20 jempänä esimerkissä 29 kuvattavalla tavalla.
B. pumilus PRL B12 ja B. llcheniformis SI (pUB-BPXl2) kasvavat parhaiten omissa erilaissa ki /.*. töissään. Lisäksi kumpikaan näistä kannoista ei k dyttävästi kasvualustassa, jossa toinen kanta kai ft 4 i 25 haiten. Niinpä valmistettiin kaksi erilaista kas' ! f (joista käytetään tässä merkintöjä "Ml" ja "M2" ·«« ·«·· vasti: *·* (1) Ml-kasvualusta käsitti 60 g vehnänlese liukenevaa maissinalkiouutetta; 1 g natriumkin : 30 1 000 ml deionisoitua vettä.
» ft · ! f f O \ UO lraAttiiA 1 ^ ΟΛ m ^ -I a 4 ani* r- - - 1 49
Ml-kasvualusta on alusta, jossa B. pxmilui kasvaa hyvin. M2-kasvualusta on alusta, jossa eri; licheniformts SE2 delap -kannat kasvavat hyvin.
Sitten kasvatusliemet steriloitiin.
5 Kahteen steriloituun 1 litran sekoituspulli ka molemmat on varustettu neljällä väliseinällä (i ja pulloja kutsutaan jäljempänä viljelypulloksi viljelypulloksi nro 2), laitettiin sitten kas^ seuraavasti: viljelypulloon nro 1 laitettiin 1C 10 kasvualustaa; viljelypulloon nro 2 laitettiii M2-kasvualustaa.
Viljelypullo nro 1 inokuloitiin sitten es: pullon nro 1 B. pumilus PRL B12 -viljelmällä ja pullo nro 2 inokuloitiin sitten esiviljelypullon 15 licheniformis SE2 delapl (pUB-BPX12) -viljelmällä lypulloissa oleva kasvualusta inokuloitiin 1 til-%:lla esiviljelypulloissa olevaa viljelmäi lia. Tämä tarkoittaa, että viljelypullot, jotka s: 100 ml kasvualustaa, inokuloidaan 1 ml:11a esivi! 20 loista saatavaa viljelmämateriaalia.
Viljelmäpulloja, jotka sisälsivät Ml- je vualustoja, inkuboitiin sitten lämpötilassa 30 °< t ;V. taen (kiertoliike, 250 kierrosta/min, ampliti 2, 54 cm).
* * 25 Viljelmäpullojen inkubointi edellä kuvatul * i ’ * la johtaa mm. ksylanaasin solunulkoiseen tuotante '"I laista ksylanaasia erittyy viljelypulloissa nro 1 * · · v * oleviin kasvatusliemiin. Mainitunlaisen ksylanac näolo kasvatusliemissä testattiin sitten määr: * · : 30 kasvatusliemistä spesifisesti ksylanaasiantsyym: : « suuden läsnäolo seuraavassa esimerkissä 2 esite 50
Esimerkki 2
Ksylanaasiaktiivisuuden määrittäminen kas’ mestä
Ksylanaasiaktiivlsuus määritettiin kasvatu; 5 käyttämällä XU (ksylanaasiyksikkö) -menetelmää. 1 netelmässä ksylanaasien läsnäolo ja määrä kasvatus määritetään tutkimalla pelkistävät sokerit, joita ksylaanisubstraatista (kuten koivuksylaanista) sei ksylanaasien ksylanolyyttisestä aktiivisuudesta vi 10 sa kasvatusliemissä. Vapautuneiden pelkistävien s< pitoisuuden määrittäminen (mittaaminen) tehtiin i maila Somogyi-Nelson-menetelmiä, joita kuvataan suissa J. Biol. Chem. 153 (1944) 375 - 380 ja Chem. 160 (1945) 61 - 68.
15 Ellei toisin mainita, tässä esimerkissä puskurit valmistettiin noudattamalla menettelyj kuvaa Gomori julkaisussa Method. Enzymol. 1, l: Somogyin reagenssi ja Nelsonin reagenssi valmiste valla, jota kuvataan julkaisuissa J. Biol. C 20 (1944) 375 - 380 ja J. Biol. Chem. 160 (1945)
Substraatti valmistettiin liuottamalla 20 g 1 (Roth Atr. 7500) 1 l:aan glyserofosfaatt (50 mmol/1, pH 6,0). Tätä liuosta inkuboitii • * * •I'*' 10 min lämpötilassa 90 #C ja sekoitettiin käsin, « « * 25 saatiin homogeeninen ksyläänisuspensio.
• » · ' \ Määritykset tehtiin viljelypullossa nro 1 ···· vualustässä) olevasta B. pumilus PRL B12 -kasvatu: I ...
: ja viljelypullossa nro 2 (M2-kasvualustassa) ole llchenlformis SE2 delapl (pUB-BPX12) -kasvatu: ·.· · 30 käyttämällä 0,1 ml substraattia (esi-inkuboitu läi ! *· 50 eC). H oka oli kuumennettu 51 annettiin sitten edetä 15 min lämpötilassa 50 °C keskeytettiin sitten lisäämällä seokseen 0,3 liuosta (0,5 ekv/1).
Sokeat näytteet valmistettiin kutakin enti 5 mennosta varten lisäämällä 0,3 ml NaOH-liuosta (0 ennen substraattia.
Standardit valmistettiin korvaamalla 0,1 ] naasipitoista kasvatuslientä 0,1 ml :11a glukoosili sarjan liuoksia, joiden glukoosipitoisuudet oliva 10 la 0 - 5,555 pmol/ml.
Tässä ja kaikissa muissa esimerkeissä käyt (ksylanaasiyksikkö) määritellään ksylanaasimääräl määritysolosuhteissä katalysoi sellaisen pelkisti kereiden vapautumisen, joka vastaa pelkistyskyvyl 15 mikromoolia (pmol) glukoosia minuuttia kohden.
Edellä mainittujen määritysten tulokset ] vat, että B. licheniformis SE2 delapl (pUB-BPXl2) kasvatusliemeen (viljelypullo nro 2) ksylanaasiak den, joka oli vähintään 15-kertainen B. pumllus : 20 kasvatusliemeen (viljelypullo nro 1) vapauttamai naasiaktiivisuuteen nähden.
Esimerkki 3
Ksylanaasin eristäminen ja puhdistus kas1 .I · mestä • · * j. 1' 25 Ksylanaasi eristettiin ja puhdistettiin ] * l liemestä lähtien 100 ml:n näytteistä vastaavaa ···· seosta, jota saatiin viljelypulloissa nro 1 ; V : edellä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.
Noin 100 ml kummankin pulloista nro 1 ja i ·.· ; 30 sältämää fermentointilientä laitettiin vastaavi: :***; pulloihin nro 1 la nro 2. Kumpaankin pulloon 52
Kussakin suodatuksessa saatiin noin 38 ml (nes‘ suodosta samoin kuin suodatuskakku. Kutakin suoda-pestiin sitten deionisoidulla vedellä, kunnes 1< vuudeksi saatiin kussakin tapauksessa 100 ml suo< 5 Saadut suodokset konsentroitiin sitten Am: rasuodatuskennolla (sekoituksella varustettu Se -kenno, jossa on YMlO-kalvo, jonka moolimassi 10 kD). Sitten mitattiin konsentraatin aktiivisuu 1 ml kutakin konsentroitua näytettä laitet 10 ten vastaaville Sepharose Mono-Q HP 16/10 -anion: kolonneille, jotka oli tasapainotettu Tris-pi (20 mmol/1, pH 8,0). Eluointi tehtiin käyttämällä nopeudella 3 ml/min tris(hydroksimetyyli)amii (Tris) -puskuria (20 mmol/1, pH 8,0), jonka NaCl-] 15 kasvoi lineaarisesti arvosta 1 arvoon 1 mol/1. Tj ksylanaasiaktiivisuuden eluoitumiseen heti koloni leen tilavuuden jälkeen tilavuuteen 15 ml mennesi saatiin asianomaiset fraktiot.
1 ml kutakin fraktiota laitettiin sitten v< 20 le Phenyl Sepharose 16/10 -kolonneille, jotka oli notettu glysiinipuskurilla (20 mmol/1, pH 9,0), sälsi 1 mol/1 (NH4)2S04:a. Eluoinnit tehtiin samasi ,V, rissa olevalla ammoniumsulfaattigradlentilla, jc • * < • II 10 min:ssa arvosta 1 mol/1 arvoon 1 mol/1, minki : 25 eluoitiin isokraattisesti nopeudella 5 ml/min. Ks; • * « * ** aktiivisuus eluoitui kustakin kolonnista yhdessä : ·«· ···· sa 20 - 21 min: n kuluttua. Näiden puhdistettujen · neiden fraktioiden havaittiin olevat elektrofore* homogeenisia.
: 30 Esimerkki 4 • a* ·
Aminohapposekvenssi 53 sekventoitiin jäljempänä esimerkissä 17 yksltylski ti käsiteltävällä tavalla).
Oikean lukukehyksen määrittämiseksi mää: sekä B. pumilus että B. 1icheniformis -kannasta 5 esimerkissä 3 kuvatulla tavalla) saatujen fraktio sältämän ksylanaasin N-terminaalinen sekvenssi : maila ohjelmaa, jota kuvataan julkaisussa Vandei J. et ai., Eur. J. Biochemistry 152 (1985) 9 N-terminaalisten sekvenssien havaittiin olevan 1 10 ja vastaavan seuraavaa kaavaa; SEQ ID NO:2
Glu-Thr-Ile-Tyr-Asp-Asn-Arg-Ile-Gly-Thr-His-Ser-
Asp 15 Käyttämällä N-terminaalisiä sekvenssejä o kukehyksen määrittämiseksi havaittiin, että tämä: nön mukainen esiasteksylanaasi koostuu 227 amino mästä (katso kuviot la ja Ib) (SEQ ID N0:1). : 20 amxnohappoista on "pre"-sekvenssissä. Loput 2C aminohapoista on valmiissa proteiinissa. Tilanne lainen riippumatta siitä, ilmentääkö geenin homo B. pumilus PRL B12 vai heterologisesti sillä tran • « * yhdistelmäisäntä, kuten deleetion sisältävät B.
'1,1 25 formis SE2 delapl (pUB-BPX12) -kannat.
• · · * l Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasille *·’! aminohapposekvenssi (kuviot la ja Ib) on sangen < : kuin joko B. pumilus IPO:n tai B. pumilus DSM 61 lanaaseille päätellyt sekvenssit, f 30 Esimerkki 5 ·«·
! f Ami nAnannnifllranfiiM
> 54 "Valmiin” ksylanaasiproteiinin muodostaa aminohapon jakautuman tarkastelu paljastaa runsaan siinia, treoniinia ja aspragiinia sisältävän ei mikä käy ilmi seuraavasta taulukosta: 5 Taulukko 2 "Valmiin" ksylanaasin aminohappojakautuma Aminohappo Määrä Prosentuaalii moolina:
Tyrosiini 16 11,f 10 Treoniini 19 8,i
Asparagiini 16 8,:
Seriini 18 7,(
Lysiini 11 6,ί
Glysiini 22 5,1 15 Arginiini 8 5,'
Fenyylialaniini 8 5,;
Glutamiinihappo 9 5,:
Isoleusiini 10 5,(
Leusiini 10 5, ( 20 Tryptofaani 6 5,<
Asparagiinihappo 7 3,1 :*·*: Väliini 8 3,!
Metioniini 6 3,
Glutamiini 6 3,- 25 Alaniini 10 3,: : :* Histidiini 4 2,' ·· proiiini 5 2,:
Kysteiini 1 0,J
Asparagiinihappo ja • * : 30 asparagiini 0 0 1 s Glutamiini ja 55
Esimerkki 6
Moolimassan päätteleminen aminohappojakau Tämän keksinnön mukaisen ksylanaasin m< pääteltiin epäsuorasti (laskettiin) edellä taul 5 esitetystä aminohappojakauturoasta. Tämä päätte tämän keksinnön mukaisen ksylanaasin mool: 22 534,55 daltonia (D).
Esimerkki 7
Moolimassan määrittäminen SDS-PAGE-analyyi 10 Kukin näyte, jota käytettiin tässä moolima rittämiseen, saatiin esimerkin 3 mukaisista puhdii fraktioista.
Tämän keksinnön mukaisten puhdistettujen 1 sinäytteiden moolimassat arvioitiin käyttämällä 1 15 analyysiä, joka toteutettiin denaturoivissa oloi polyakryyliamidigeelillä käyttämällä Pharmacia geelejä, joissa pitoisuudet olivat 10 - 15 ja 2( no/tilavuus).
Pharmacia LMW -markkereita käytettiin moi 20 ja liikkumismatkan suhteuttamiseen. Yksi pulloll mennettiin 1,5 ml:11a seuraavaa puskuria, jota k myös näytteille: 10 mmol/1 Trisiä (pH 8); 1 mmol ,\\ 2,5 % (paino/tilavuus) SDS:a, 5 til-% beeta-merka ♦ · * ··,·. lia ja 0,1 % (paino/tilavuus) bromifenolisinistä ♦ * 25 Kukin näyte saostettiin trikloorietikkaha] * ; nen laimentamistaan suunnilleen proteiinipiti ”·· 100 mg/ml edellä mainitulla, markkereiden laime; '·* * käytetyllä puskurilla (määritys: muunnos Bradford tumismäärityksestä, jossa käytetään Coomassie-sd * * :J : 30 jota kuvaavat Read ja Northcote julkaisussa Ai : : Biochem. 116, 53 - 64). Laimennetut näytteet dena 56 Tämän SDS-PAGE-analyysin tulokset ovat n kuvion 2 käyrästä, joka esittää llikkumlsmatkaa Kummassakin tapauksessa (10 - 15-%:iset ja 20-%: lit) luonnon B. pumilus PRL12 -kannasta ja B. IX 5 mis SE2 delapl (pUB-BPX12) -yhdistelmäkannasta ksylanaaslnäyteillä on täsmälleen sama liikkuvuus foreesissa. Lisäksi näennäisen moolimassan havalt massakin tapauksessa olevan 26 kD.
Esimerkki 8 10 pl:n ennustaminen aminohapposekvenssin pe: Tämän keksinnön mukaisen ksylanaasin isoe piste (pl) ennustettiin kuvioissa la ja Ib esitet nohapposekvenssistä. Tämä päättely antoi tämän mukaisen ksylanaasin isoelektriseksi pisteeksi 9 15 Esimerkki 9 pl:n määritys isoelektrisellä fokusointien Kukin näyte, jota käytettiin tässä isoe pisteen (pl) määrittämiseen, saatiin esimerkin 3 i ta puhdistetuista fraktioista.
20 Tämä määritys tehtiin isoelektrisellä foku polyakryyliamidigeeleissä käyttämällä Pharmaci -geelejä, jotka oli hydratoitu uudelleen 2 ml:11a « ·*·*. niliuosta [1 tilavuusosa Pharmacian 8 - 10,5-%;i :v. liinia (paino/tilavuus) lisättynä 15 tilavuusosaa ψ * ·«.·, 25 soitua vettä] noudattamalla toimittajan suositte * * I j elmaa.
'Hl 4 μ1:η annos kutakin veteen tehtyä entsyyi * * * nosta, joka sisälsi noin 100 pg ksylanaasia, lait ladattiin (200 V, 15 Vh) geelien keskelle esifo! * ψ : 30 (2 000 V, 75 Vh) jälkeen. Standardeina käytettii: • · # < « ρί Λη nT- ATnrol ‘t-aan lrnrlrA^ 4-m 4-a »isr—- : - 57 r Käyttämällä tätä menetelmää B. pumilus : samoin kuin B. licheniformis SE2 delapl (pUB-B: erittyneen ksylanaasln losoelektrlsen pisteen mää: olevan 9,8 - 9,9. Niiden käyttäytyminen on llsäk: 5 laista. Tämän analyysin tulokset esitetään kuvioi
Esimerkki 10
Ksylaanin hydrolyysin kannalta optlmaalisi tilan määritys
Kukin näyte, jota käytettiin tässä optlmili 10 määrittämiseen, saatiin esimerkin 3 mukaisista ] tuista fraktioista.
18 näytettä, joista kukin sisälsi 1 % (pa: vuus) koivuksylaanlsubstraattia (Roth, Atr. 750(
tettiin glyserofosfaattipuskuriin (50 mmol/1, pH
15 Kukin näyte tutkittiin sitten käyttämällä inkubointiaikaa. Nämä määritykset tehtiin näy käyttämällä erilaisia 5 °C:n lämpötilan korotuks 40 °C:sta ja lopettaen 80 °C:seen. Vapautuneiden ] vien sokereiden määrä on osoituksena tutkittavan ] 20 sinäytteen aktiivisuudesta. Vapautuneiden peli sokereiden määrä mitattiin noudattamalla esime :T: kuvattua Somogyi-Nelson-menetelmää.
•V. Näiden määritysten tulokset ilmoitettuina · tiosuuksina maksimiaktiivisuudesta esitetään sei : .1 :v. 25 taulukossa 3.
• ♦ • · • ••i ··· • · · • 1 · • · • · · • · · ·2 · t» • 1 2
• I
58
Taulukko 3
Optimilämpötllan määritys Lämpö- Osuus maksimiaktiivisuudesta (%) tila B. pumllus PRLl2:n B. licheniformls 5 (°C) tuottama ksylanaasi delaplin tuottama ki 40.0 54,4 51,2 45.0 62,2 62,4 50.0 81,5 81,4 55.0 100,0 100,0 10 60,0 94,0 84,7 65.0 79,7 81,3 70.0 32,5 31,1 75.0 20,5 24,4 80.0 12,2 11,4 15 Edellä mainitut testit antoivat tuloksi osoittavat, että tämän keksinnön mukaisen ksylan< timilämpötila on 55 eC»
Esimerkki 11 Lämpötilastabiiliusalueen määritys 20 Kukin näyte, jota käytettiin tässä tämän ) mukaisen ksylanaasin lämpötilastabiiliusalueen mä< seen, saatiin esimerkin 3 mukaisista puhdistetut! tioista ja preparoitiin esimerkissä 10 kuvatulla Kukin näyte analysoitiin sitten esi-in) * · 25 jälkeen, jonka kesto (min) ja lämpötila esitetääi • * * vassa taulukossa 4. Näiden näytteiden aktilvisuv ···· tettiin 0, 10, 30, 60 ja 120 minin kuluttua noud< • · · edellä esimerkissä 2 esitettyä ohjelmaa» Näiden määritysten tulokset, jotka esitet • * : 30 senttiosuuksina maksimiaktiivisuudesta, annetaan vassa taulukossa 4.
11 59
Taulukko 4 Lämpötilastabiiliusalueen määritys Aika (min) Osuus maksimiaktiivisuu<
50 *C 60 *C
5 0 100,0 100,0 10 111,0 80,0 30 113,0 68,0 60 119,0 52,0 120 110,0 40,0 10 Edellä mainitut testit antoivat tuloksi osoittavat, että tämän keksinnön mukainen ksyla lämpötilassa 50 °C täysin stabiilia vähintään : ajan.
Esimerkki 12 15 Ksylaanin hydrolyysin kannalta optimaali määrittäminen
Kukin näyte, jota käytettiin tässä optimi-] rittämiseen, saatiin esimerkin 3 mukaisista puhdii fraktioista ja preparoitiin esimerkissä 10 kuvat 20 valla.
Kukin 22 näytteestä (joiden pH oli säädett; ·*:*. siin, alla olevassa taulukossa 5 esitettyihin * analysoitiin lämpötilassa 50 °C (pH-lämpötilarii] • # · *·,·' aiheuttama korjaus on mitätön tämän puskurin yhi s * j. I' 25 ja käyttämällä inkubointiaikaa 15 min noudattamal • · * ; esimerkissä 2 esitettyä ohjelmaa. Vapautuneiden ] v »*
···· vien sokereiden määrä on osoituksena tutkittavan J
t·» • · · sinäytteen aktiivisuudesta. Vapautuneiden peli sokereiden määrä mitattiin noudattamalla esime • * ·*· ; 30 kuvattua Somogyi-Nelson-menetelmää.
: **: Näiden määritysten tulokset esitetään sei 60
Taulukko 5
Optimi-pH: n määritys pH Osuus maksimiaktiivisuudesta (% B. pustllus PRL12:n B. licheniformis 5 tuottama ksylanaasi delapl:n tuottama k 5.0 45,4 45,1 5.5 78,6 78,3 6.0 98,7 93,2 6.5 96,6 100,0 10 7,0 100,0 96,1 7.5 82,2 86,2 8.0 73,8 63,7 8.5 52,7 44,6 9.0 24,6 18,8 15 9,5 11,0 4,7 10,0 0,4 2,0
Edellä mainitut testit antoivat tuloksi osoittavat, että tämän keksinnön mukaisen ksylan timi-pH on 6,5 - 7,0.
20 Kaikista edellä olevista esimerkeistä h
että tämän keksinnön mukainen ksylanaasi on sam **·1· matta siitä, tuottaako sitä luonnollinen lähde (B
•V. PRL12) vain rekombinantti-isäntä, B. lichenifc delapl (pUB-BPXl2). Lisäksi käy ilmi, että tämän • 1 25 mukaisella ksylanaasilla on erilainen aminohappo s · * 1 ja -jakautuma kuin muilla ksylanaaseilla, jopa i •••| pumllus -kantojen tuottamilla ksylanaaseilla.
V: Esimerkki 13 pH:n vaikutus ksylanaasiesikäsittelyn teh • a :.· : 30 Valmistettiin 8 havupuukraftmassasuspensi *»· s · l__——..¾_____«.I Λc e j t-_—___ S- ------- 61 samoissa olosuhteissa mutta ksylanaasin poissa Näille esikäsitellyille kraftmassanäytteille teh ten, ilman välipesua, klooraus (C) käyttämällä i vassa taulukossa 6A esitettyä kloorimäärää (ilmi 5 aktiivinen kloori -kertoimena), ja sen jälkeen i (E).
Valmistettiin 24 lehtipuukraftmassasus] joiden kappaluku on alussa 13 ja konsistenssi 2, tä suspensioita esikäsiteltiin 2 tunnin ajan läm; 10 50 °C käyttämällä 30 XU tämän keksinnön mukaista : siä grammaa kohden sillä käsiteltävää kuivaa mass le esikäsitellyille kraftmassanäytteille tehtiii ilman välipesua, 1,0 tuntia kestävä klooraus (C) lassa 22 °C konsistenssin ollessa noin 3 % ja se: 15 1,5 tuntia kestävä emäsuutto (E) lämpötilassa 6< sistenssin ollessa noin 5 % (katso taulukko 6B).
Käsittelyssä käytetyt erilaiset pH:t saati lisäämällä pieniä eriä laimeaa (0,1 ekv/1) happ< rikkihappoa, pH-arvon 9,5 vallitessa tehtävä 20 vastaa itse asiassa olennaisesti todellisia teol lanteita, joissa pH-arvoa ei säädellä ja massa s daan puskuroimattomaan veteen (tämä testi osoite * ,V; lukossa 6A asteriskilla). Esikäsittelyjen tuloksi :v. tään alla olevissa taulukoissa 6A ja 6B.
• s * · SS s s s · : .· s s s • SS··
• SS
s s s • s s ' s • · s s s s s s Its · 1
SS
s · s s s·· * 62
Taulukko 6A
pH:n vaikutus B. pxmilus PRI* B12 -ksylanaasilla esikäsittelyn tehoon klassisissa valkaisuprosei
Havupuukra ftaassat
5 Alku-pH XU/g Kloorlkerroln I
6.5 30 0,17 7.0 30 0,17 8.0 30 0,17 8.5 30 0,17 10 9,0 30 0,17 9,5* 30 0,17 9.5 0 0,17 9.5 30 0,20
15 Taulukko 6B
pH:n vaikutus B. pumilus PRX· B12 -ksylanaasilla esikäsittelyn tehoon klassisissa valkaisuprosei
Lehtipuukraftmassat
Kappaluku 20 0 XU/g 5 XU/g 11
Alku-pH Kerroin 0,20 Kerroin 0,12 Keri 6,5 2,40 2,25 ;V; 7,0 2,15 2,22 JV, 7,5 2,10 2,16 !. f 25 8,0 2,16 2,18 ; 8,5 2,16 2,22 ··”* 9,0 2,13 2,32 : 9,5 2,11 2,54 10.0 2,09 2,56 30 Yllättävästi (ja esimerkissä 12 taulukost • tavien tulosten vastaisesti, joiden mukaan optd 63
Lisäksi, ja ehkä vielä yllättävämmin, hi että tämän keksinnön mukainen ksylanaasi edisti kaasti ligniinin poistamista puumassoista koko pH-7 -9,5 (tämän kraftmassan vesisuspension luoi 5 pH).
Aikaansaadut, taukoista 6A ja 6B nähtävät i set ovat merkittäviä myös siinä mielessä, että en* sittely antaa mahdollisuuden (pH:n ollessa 6,5 -hentää havupuun kemialliseen käsittelyyn ligniin: 10 vaiheessa tarvittavaa kloorin määrää 15 %:lla ja : kemialliseen käsittelyyn ligniininpoistovaiheess; tavaa kloorin määrää 40 %:lla.
Esimerkki 14
Ksylanaasipitoisuuden vaikutus ksylanaasi< 15 telyn tehoon
Havupuukraftmassa esikäsiteltiin hapella ] maila menetelmää, jota kuvataan yksityiskohta!ses tentti julkaisussa Letters 4 462 864, niin että happikäsiteltyä massaa, jonka kappaluku oli aluss 20 ISO-vaaleus 33,4.
Sitten happikäsitellystä massasta valmis*! suspensiota (näytettä).
♦ * ♦ 'I,·, Toimintaolosuhteet olivat teollisuuskäytt ,1 l dolliset (50 °C, 1 tunti, konsistenssi 5 %). M< • · i j, ·* 25 teelle toteutettiin sitten yleinen valkaisuproses: 5 V (C/D)EDPD.
...T Sitten valittiin 2 näytettä (näytteet 1 ja V : renssivalkaisuprosesseihin, jotka toteutettiin kä; 1 annos aktiivista klooria, joka on yhtä suuri jef: 30 kertaa kappaluku, C/D-toimenpiteen aikana. Sitten ·***· tiin tämä annos käyttämällä 80 % kloorikaasua 11 64 3 ja 4) tai 13 (näytteille 5 ja 6) ksylanaasiyksi grammaa kohden kuivaa massaa. Huomautettakoon, et maattista esikäsittelyä välittömästi seuraava väli sessi toteutettiin ilman välipesua. Käytetyt ai 5 kloori -kertoimet olivat 0,16 - 0,14 (edustavat vastaavasti 38 %:n säästöä alkuainekloorin määräsi määrä kloorausvaiheessa pidettiin vakiona). Nämä set saatiin aikaan pienentämällä molekulaariser annostusta klooridioksidiannostuksen pysyessä sai 10 Näiden näytteiden lähtö-ISO-vaaleus oli 3: tökappaluku oli 12,3. Toimintaolosuhteita koskeva sityiskohdat ja tämän esimerkin mukaisten erila: keiden tulokset ovat nähtävissä taulukosta 7.
• ·♦ • « « i · ♦ « · « · « I I I • · • t 9 • » » • « I * «9 · * « * • · I * * f · « «999 • »· 9 9 9 9 9 · « 1 · 9 9 9 9 9 9 ♦·· * 99· • * 9 9 ψ~- 11 65
Taulukko 7 Β. pumllus PRL B12 -ksylanaasiesikäsittelyn klassisissa valkaisuprosesseissa
Reagoivat aineet Lämpö- Pitoi-
5 Mäyta Toinen- (g/100 g uunikuivaa maaaaa) tila Mka suus pH
pide Cl2 MaOH ClOj H^02 (’c) (h) (*) Riku Loppu i 1-2 X - - - - 0 XU/g uunikuivaa maaaaa 10 C/D 1.96 - 0,5 - 40 0.5 3 2,2 2,1 E - 2,0 - - 70 1,5 12 12,7 11,4
Kappaluku 2,6 ID 0,6 75 3.0 12 5,6 4,4 P - 0,6 - 0,2 70 1.5 12 12.0 10,7 15 D - - 0,3 - 85 2.5 12 5,5 4,8 2D 0,9 75 3,0 12 5,5 3,6 P 0.6 0,2 70 1,5 12 12,0 10,6 D 0,3 85 2,5 12 6,0 4,9 20 3 - 4 X - - 50 1,0 5 7.0 7,0 8 xu/g uunikuivaa »aasaa C/D 1,22 - 0,5 - 40 0.5 3 3.0 3.0 E 2,0 - 70 1,5 12 12.5 11.6 2 5 Kappaluku 3,2 3 D 0.6 75 3.0 12 5.0 4.4 P 0.6 0,2 70 1.5 12 11,7 10.7 ·*:·, D 0.3 85 2.5 12 5.6 4.9
» « I
* * 30 4 D 0,9 75 3,0 12 5.0 3,6 ·*·'· P - 0,6 - 0,2 70 1,5 12 11,7 10,7 !. \ D - - 0,3 - 85 2.5 12 5,7 5.0 • · * » t * e ··· 5 - 6 X - - 50 1.0 5 7.0 7.1
Mil /s r- ·«« OD 13 XU/g uunikuivaa »aasaa • ♦ · V ' C/D 1,22 - 0,5 - 40 0.5 3 3.1 3.1 E - 2.0 - - 70 1.5 12 12.5 11,4 • « Kappaluku 3,0 • · · ··♦ ♦ 5 D 0.6 - 75 3.0 12 5.0 4,3
♦·· M A
l J 40 P - 0,6 - 0.2 70 1,5 12 11,9 10.6 »m» 66
Kuten edellä esitetystä on nähtävissä, B. PRL12 -ksylanaasi on tehokasta puumassan esikäs: (biovalkaisussa) klassisissa valkaisuprosesseissa tettakoon, että ksylanaasin käyttö esikäsittelyss 5 listi ensinnäkin ligniininpoistovaiheen kemialli; sittelyssä käytettävän aktiivisen kloorin olenn* hentämisen. Toiseksi kunkin edellä mainitun näyt paluku oli ligniininpoistovaiheen jälkeen alenti resti (12,3:sta 3,0 - 3,2:een), mikä osoittaa, e 10 ksylanaasin käyttö esikäsittelyssä mahdollistaa ] saannin, jolla on hyväksyttävän alhainen ligniini] (mitattuna puumassan kappaluvulla).
Esimerkki 15
Ksylanaaslesikäsittelyn teho ECF-prosesse 15 Valmistettiin 6 suspensiota (näytettä) esi mukaisesta hapella käsitellystä lehtipuumassast näistä näytteistä (näytteet 4, 5 ja 6) käsitelt: entsymaattisesti ilman entsyymikäsittelyn ja en: dioksidikloorauksen välistä pesua. Kaikki näytti 20 teltiin tyyppiä DPDPD olevalla ECF-valkaisupro: Nämä ECF-prosessit toteutettiin käyttämällä kasva f:·. ridioksidimääriä.
;y; Kaikki toimintaolosuhteita koskevat yksit; :v. ja näillä näytteillä tehtyjen erilaisten kokeiden • · I. .* 25 ovat nähtävissä taulukosta 8.
• « · • * • · * • »a aasa »aa aa» * · a a a » a » a a a a aa» « a a 67
Taulukko 8 B. pumilus PRL B12 -ksylanaasiesikäsittelyn valkaisuprosesseissa, joissa ei käytetä alkuaine
Reagoivat aineet Läapö· Pitoi- 5 Käyte Toisen- (g/100 g uunlk. seeeee) tila Aika suu· pH ISO· pide CIO2 h2°2 kaOH (1 2 3C) (h) (1) Alku Loppu vaaleus 1 - 3 D 2.0 - - 60 0,5 3 3.6 3,5 P - 0,5 2,0 70 1,5 12 12.2 11,5 68,9 10 1 D 0,4 75 3.0 12 5,7 5.3 79.5 P - 0.2 0.6 70 1,5 12 12.0 11,0 82.3 D 0.3 - 85 2.5 12 5,9 5.0 86,0 15 2 D 0.6 - 75 3.0 12 5,4 4,8 79,4 P - 0.2 0,6 70 1,5 12 12.0 11.0 83,0 D 0.3 - - 85 2.5 12 5.6 4.9 86,6 3 D 0.8 75 3.0 12 6.1 4,6 80.6 20 P 0.2 0.6 70 1.5 12 12.0 10.9 84.2 D 0.3 - 85 2.5 12 5.5 4,9 87,5 4 - 6 X - - - 50 1.0 5 7,0 7.0 8 XU/g uunikuivaa sassea 25 D 1.3 - 60 0,5 3 3.8 3,8 P - 0,5 2,0 70 1,5 12 12.5 11,6 66,9 4 D 0.4 - - 75 3,0 12 5.4 5,0 76.0 *** P 0,2 0,6 70 1,5 12 12,0 10.8 82.4 • 1 ! ! ; 30 D 0,3 85 2,5 12 S,2 4,5 86,2 4« « • · 1 1 5 D 0,6 - 75 3,0 12 5,5 4,6 78,5 2
91 I
; P - 0,2 0,6 70 1,5 12 12.0 10,7 83,6 D 0,3 - 85 2,5 12 5,0 4.2 86,6 ·;;; 35 ·.· · 6 D 0.8 - 75 3,0 12 5,9 4,6 79,3 P - 0.2 0,6 70 1,5 12 12.0 10,8 84,3 . . D 0,3 - - 85 2.5 12 5,6 4,8 88,2 3 5 Kuten edellä esitetystä on nähtävissä, oi 68 vuttaa olennaisia säästöjä tarvittavan kloori* suhteen saavuttaen silti kohonnut loppuvalkoisuus kiintoisaa siitä syystä, että klooridioksidigene: kapasiteetti on teollisuusolosuhteissa usein raj< 5 Edellä esitetyn suhteen huomautettakoon, < kin edellä mainitun näytteen kohdalla kappaluku nentynyt suuresti (12,3:sta 5,9:ään) ksylanaasik jälkeen, mikä osoittaa, että massaan jääneen määrä samoin kuin valkaisuprosessin myöhemmissä ’ 10 tarvittava C102-määrä olivat pienentyneet voimakk
Esimerkki 16
Ksylanaasiesikäsittelyn teho TCF-prosesse
Valmistettiin 4 suspensiota (näytettä) esi mukaisesta hapella käsitellystä lehtipuukrafti 15 Kahta näytettä (näytteet 1 ja 2) käytettiin sitte OQPZP (happi, kompleksinmuodostaja, peroksidi, peroksidi) olevassa täysin kloorittomassa (TCF-) prosessissa. Kaksi muuta näytettä käsiteltiin OX/QPZP olevalla täysin kloorittomalla (TCF-) 20 prosessilla. Entsymaattisessa käsittelyssä käyte syymi oli B. pumilus PRL12:sta peräisin oleva ks;
Massaa ei pesty toimenpiteiden X ja Q väli .V. ta pH säädettiin alla olevassa taulukossa 9 mai arvoihin.
• · 25 Käytetty entsyymiaktiivisuus oli 10 XU/ * · * massaa.
·«· ··*; Prosessien vaiheissa käytetyt reagoivat ai • · *
sonia lukuunottamatta) ovat seuraavat (grammoi grammaa kohden käsiteltävää uunikuivaa massaa): C
* ♦
: 30 neella 6 bar; 2,5 NaOH:a; 0,5 MgS04·7H20:a]; X/Q
O pH 7,5; 0,5 % DTPA:ta (40 %), pH 5,5 (tehdään h 69 H202:a; 1,6 NaOH:a, 1,0 MgS04*7H20:a; 3,0 natriumsi (vesilasi, laatu 38 °beaum6)]. Tolmlntaolosuhte< (grammoina 100:aa grammaa kohden käsiteltävää u massaa) ja näillä näytteillä tehtyjen erilaisten 5 tulokset ovat nähtävissä taulukosta 9.
Taulukko 9 B. pumllus PRL B12 -ksylanaasiesikäsittelyn täysin kloorittomissa valkaisuprosesseiss Näyte Valhe 03 Lämpötila Aika Pltolauua pH ISO- 1 10 (*C) (aln) (S) Alku Loppu vaaleus 1-20 - 120 90 15 12,7 9.6 56.8 Q 50 30 5 5,5 6,0 P 70 120 12 11,6 11.2 73,1 < 15 1 Z 0.35 22 2 1/4 40 3,0 3,6 79.7 P 80 240 30 n. 11,0* 9.6 88.8 2 Z 0,52 22 3 1/2 40 3,0 3.4 83,1 P 80 240 30 n. 11,0* 9,5 91.0 20 3 - 4 0 - 120 90 15 12,7 9.6 56,8 X/Q - 50 90 5 7.5 7,6 P 70 120 12 11.7 10,9 76.0 ! 25 3 Z 0,28 22 2 1/4 40 3,0 4.0 81,3 ... P - 80 240 30 n. 11.0* 10,8 89,6 • « ♦ • · « • V; 4 Z 0.43 22 3 40 3.0 3.9 83.5 • I I P - 80 240 30 n. 11.0* 10,4 91,5 • · · ' 30 * Nämä pH:t ovat summittaisia arvoja, Todellis : .· ovat alueella 10,5 - 11,5* ..ΙΓ Edellä kuvattujen kokeiden tulokset osoitt *,·· västi, että entsymaattinen käsittely tämän keks: kaisella ksylanaasilla mahdollistaa TCF-prosess: : 35 vittavan otsonimäärän vaikuttavan vähentämisen an • *« * ti tulokseksi korkeamman lopullisen valkoisuuden 70
Esimerkki 17
Ksylanaas i-ilmentämi»vektorin valmistus 1. Kromosomi-DNA:n eristäminen Bacillus PRL12:sta 5 L-B-alusta inokuloitiin 200 ml:11a pullon mää (esimerkki 1) ja kasvatettiin tätä viljelmä L-B-alustassa 16 tuntia lämpötilassa 37 “C. DNA tiin sitten viljelmästä edellä kohdassa "Menet tekniikat" kuvatulla tavalla.
10 2. Bacillus pumilus PRL12 -geenikirjaston
Eristetty Bacillus pumilus PRL12:n krom< pilkottiin sitten osittain Sau3Al:llä. Käytetty rän suhde entsyymiin säädettiin siten, että saai simimäärä kromosomi-DNA-fragmentteja, joiden ] 15 alueella 2 - 7 ke (ke - 103 emäsparia).
Saadut DNA-fragmentit käsiteltiin sitten e reettisesti 0,8-%:isella (paino/tilavuus) agaroos DNA-fragmenttien erottelemiseksi koon mukaan. DNA tit, joiden koko oli geelielektroforeesin pe: 20 alueella 2 - 7 ke, eristettiin ja puhdistettii "Gene Clean" -menetelmällä tai suodatusmenetelmä: tämällä sentrifugointia.
,v« Puhdistetut DNA-fragment it ligatoitiin sit * < 1 midin pBR322 kanssa, joka oli katkaistu ennalta B< l. I 25 dasta ja defosforyloitu sitten.
* 1 1 2 Saadulla ligaatiotuotteella trasformoitid *« 1 2 ··;· E. coll MC1061 -solut elektroporaation avulla. 1
V
71 3. Bacillus piallus PRLl2:n ksylanaasigeen tävien yhdistelmäplasmidien etsiminen gee tosta
Kun oli maljakasvatusta oli jatkettu 24 tu 5 pötilassa 37 °C edellä kuvatuissa alustoissa, id tiin pesäkkeet, joilla esiintyi AZCL-ksylaanihy< vyöhyke, ja analysoitiin niiden plasmidit. Näis: keissä läsnä olevat plasmidit eristettiin viitt* sivuilla 1.25 - 1.28 kuvatulla emäshajotusmenete: 10 Analyysi (restriktio) osoitti, että erilai tetyt plasmidit sisälsivät saman ksylanaasigeen: kooltaan erilaisissa B. pumllus -kromosomifragm Restriktioanalyysi osoitti lisäksi, että lyh DNA-fragmentti, joka sisälsi ksylanaasigeenin, < 15 taan noin 2,7 - 2,8 ke ja esiintyi pBR322-pla joka oli ligatoitu sen kanssa. Tälle uudelle pl annettiin nimeksi pBPXl.
4. Ksylanaasigeenin sisältävät kromosomif alikloonaus 20 Ilmentämisvektori, joka sisältää Bacillus PRL12:n ksylanaasigeenin, on pUB-BPX12 (kuvio 4), misvektori saatiin alikloonaamalla pBPXl:stä perä m va kromosomi fragmentti, joka sisälsi ksylanaasigi * *
:v. Sukkulavektori (E. coli - B. subtills) pUB
··.·. 25 tu EP*hakemuksessa 90 116 322.0 kuvatulla tavaJ
* .
' 'j' kaistiin BamHI-kohdasta ja defosforyloitiin.
*::: Yhdistelmäplasmidi pBPX (saatu edellä · · tavalla) pilkottiin sitten osittain Sau3AI:llä. T konnassa saadut fragmentit ligatoitiin sitten li : 30 dun ja defosforyloidun sukkulaplasmidin pUB131 ··· * · Saadulla liaaatiotuotteella transformoitiin sitte 72 maljoja oli viljelty 24 tuntia lämpötilassa 37 °i keet, joilla esiintyi vyöhykkeenmuodostusta, si pois ja eristettiin uudelleen. Näissä transfori läsnä oleva plasmidi pUBC-BPX12, eristettiin sit 5 hajotusmenetelmällä. Restriktioanalyysi osoitti, eristetty plasmidi (pUBC-BPXl2) sisältää ksylana B. pumilus PRL12 -kromosomi-DNA:n noin 1,0 ke:r fragmentissa (ilmentymiskasetti).
Kun plasmidi pUBC-BPX12 viedään takaisin k 10 coli MC1061, kaikilla tuloksena olevilla transfori esiintyy laaja vyöhyke AZCL-ksylaanialustalla, mi taa ksylanaasigeenin hyvän ilmentymisen E. colts pUBC-BPX12:a käytettiin sitten E. colt JM1 jen transformointiin käyttämällä CaCl2-menetelmää 15 koitiin transformantit. Yksi transformantti, jok plasmidia pUBC-BPX12, eristettiin ja toteutetti: mittainen valmistus ksylanaasigeenin sisältävän dun fragmentin nuleotidisekvenssin määrittämisek; Käytetty sekventointistrategia oli suora s 20 jossa käytettiin progressiivisia oligonukleotid* teessä (3) sivuilla 13.15 ja 13.15 (kuvio 13.3B) tavalla ja kaksisäikeistä plasmidia pUBC-BPX12 te ;Vs na· :*·*. Sekvenssin määrittämisen käynnistämiseks: ··.·. 25 teltiin vektorin pUBC131 kanssa hybridi soi taviks • · * J tettuja oligonukleotideja noin 1,0 ke:n ksylanaas ”” tin kummankin pään nukleotidisekvenssin määritt • * * *** * Näiden synteettisten oligonukleotidien sekvenss: tään seuraavassa: : 30
SEQ ID NO:3 5 ’-GTAGAGGATCATCATGT-3T
-----^—.- - r 73
Loppuosa sekvenssistä määritettiin käyttöni ri määritetyn sekvenssin mukaisesti syntetisoitu, nukleotideja.
Tämän sekvenssimäärityksen tulokset osi 5 että ksylanaasigeeni oli saatu 1022 ep:n Sau3AI-tina, joka esitetään kuvioissa la ja lb (SEQ ID ] Sitten valmistettiin 1061 ep:n SalI-EcoRV-1 mentissa oleva ksylanaasigeeni pilkkomalla p Sällillä ja EcoRV:llä, minkä jälkeen tehtiin e 10 reettinen puhdistus agaroosigeelissä.
Vektori pUB131 pilkottiin sitten restrikt millä EcoRV- ja Sali-kohdista ja ligatoitiin Sai1-EcoRV-fragmentti sen kanssa.
Tuloksena oleva ligaatiotuote vietiin sitt 15 tentti solu -tekniikalla B. sub111 is SE3 -isäntä Transformantit valikoitiin L-B-maljoilla, joita dennetty kanamysiinillä (25 pg/ml), ja tehtiin re analyysi edellä kuvatulla tavalla. Tuloksena olev di oli pUB-BPX12 (kuvio 4).
20 Esimerkki 18
Pui lulanaasi-ilmentämi s vektorin pUBDEBRAl Ilmentämisvektori pUBDEBRAl (kuvio 5) on ;*;v; joka sisältää B. deramif leans T 89.117D:n puli :v. koodit tavan geenin oman pullulanaasitranskriptiop 8 ·
25 rinsa ohjauksessa kloonattuna vektoriin pUB131. T
• · I midi (pUBDEBRAl) saadaan seuraavasti.
*::: B. deramiflcans T 89.117D:tä viljeltiin 2 • · · *·’ * MYE-alustaa, jonka koostumus oli 33 mmol/1 6 mmol/1 KH2P04-3H20:a, 45 mmol/1 (NH4)2S04:a, • m : 30 MgCl2*6H20:a, 1 mmol/1 CagCl2*2H20: a, 0,5 % (paino/ ♦ ·· * hiivauutetta ja 0,5 % (paino/tilavuus) glukoosia 74
pilkontafragmentteja pBR322:een esimerkissä 17 I
kuvatulla tavalla, paitsi että osittais-Sau3Al-: menttien koko oli 5 - 10 ke eikä 2 - 7 ke ja tra: dut E. coll MC1061 -solut siirrostettiin eri a 5 ampisilliinilla (100 pg/ml) täydennetylle L-B-ali
Pesäkkeitä kasvatettiin 18 tuntia läm] 37 °C ja ne siirrettiin toiselle maljalle, joki samanlaista alustaa. Yksi maljoista peitettiin 1 agarpäällyskerroksella, joka sisälsi 100 mmol/1 10 asetaattia (pH 4,5) ja 0,1 % AZCL-pullulaania.
inkuboitu lämpötilassa 60 eC 18 tuntia, ident pesäke, jolla esiintyi vyöhykkeenmuodostusta, ja tiin se vastaavalta replikamalJalta. Plasmidi, ; nettiin nimeksi pBRDEBRA3, eristettiin tästä pe 15 pienessä mittakaavassa toteutetulla, edellä ! emäshajotusmenetelmällä, ja sen restriktioanalyy ti, että plasmidi sisälsi insertoidun, 9 ke:n ko: deramifleans T 89.117D:stä peräisin olevan fragim pBRDEBRA3: n 4, 5 ke: n EcoRI -BamHI - f ragmentt 20 pilkkomalla pBRDEBRA3 EcoRI:llä Ja BamHI:llä ja sitten elektroforeettinen puhdistus 0,8-%:isessa ;T: geelissä. Tämä fragmentti ligatoitiin sitten
•V. pUB131 kanssa, joka oli ennalta pilkottu BamE
EcoRI:llä BamHI- ja EcoRI-kohdistaan, käyttämän *. 1 25 tills PSLl:ä kloonausisäntänä.
♦ · · • · * l Tuloksena oleva plasmidi pUBDEBRAl eristi ·*· puhdistettiin transformoiduista PSLl-soluista a · mitassa toteutetulla emäshajotusmenetelmällä. Pia misteesta testattiin kloonatun pullulanaasigeen: • * : 30 vuus transformoimalla sillä B. subtllis PSL1.
• at ! saaduilla transformanteilla oli kyky ilmentää du aw·])·,1'-"-— - 75
Transformoidut B. subtills PSL1 -pesäkkec sisälsivät pUBDEBRAl:ä, siirrettiin toiselle L-B-i jota oli täydennetty kanamysiinillä (25 pg/ml). ' joista peitettiin l-%:isella agarpäällyskerrokse 5 sisälsi 100 mmol/1 natriumasetaattia (pH 4,5) AZCL-pullulaania. Kun oli inkuboitu lämpötilassa tuntia, kaikilla transformanttipesäkkeillä havait van AZCL-hajotuskehä.
Esimerkki 19 10 Alkalinen proteaasi -ilmentämisvektorin p] mistus
Ilmentymisvektori pKACl (kuvio 6) on plasm sisältää B. subtllis 168:n alkalista proteaasia ] van geenin oman promoottorinsa ohjauksessa kli 15 vektoriin pUBllO* Tämä plasmidi (pKACl) saadaan s< ti.
Eristettiin plasmidi pSBT2 B. subtllis 168 somi-DNA:sta seuraavasti:
Ensin eristettiin ja puhdistettiin kromi 20 edellä kohdassa "Menetelmät ja tekniikat" kuvatul la. Eristetty ja puhdistettu DNA restriktiopilkot ·*»'. ten Clal:llä. Tuloksena olevat DNA-fragmentit e * ;y. sitten koon mukaan agaroosigeelillä [0,8 % (pa ··.·. vuus)] Ja eristettiin ja puhdistettiin fragments • « I. 25 koko oli 3 - 5 ke, Gene Clean -menetelmällä.
• « s • · * ; Tuloksena oleva valmiste käsiteltiin DNA-pi sin Klenow-fragmentilla tarttuvien ulkonevien Cl ’·* * täyttämiseksi. Tuloksena oleva DNA-valmiste lii sitten vektorin pMK4 kanssa, joka oli pilkotti * # : 30 Smaltllä ja defosforyloitu. Ligaatiotuotteella moitiin E. coll MC1061 käyttämällä CaCl^-menetelm e- 76 plasmidisisältö eristettiin käyttämällä suuressi toteutettavaa plasmidinpreparointimenetelmää.
Tällä plasmidivalmisteella transformoitu B. subtilis 512 PN" ja transformantit siirrostet 5 teaasindetektointimaljoille. B. subtilis 512 PN
subtilis 168:n mutantti, joka tuottaa pienen ke teaasindetektointimaljoilla [Millet et ai., Bio< (1976) 109 - 117]· Transformanttipesäkkeistä tark sitten visuaalisesti suuremman kehän läsnäolo. Er 10 pesäke, jolla esiintyi täilainen kehä, j a sen eristettiin käyttämällä edellä kuvattua pienii plasmidinerlstysmenetelmää.
Tuloksena olevalla plasmidilla, josta merkintää pSBT2, transformoitiin sitten E. coli 15 valmistettiin plasmidia pSBT2 laajamittaisesti -transformantista. Tällä pSBT2-plasmidivalmisteel formoitiin B. subtilis 512 PN". Kaikilla saaduil formanteilla esiintyi proteaasindetektointimaljo rempi kehä kuin vertailukannalla (B. subtilis 512 20 sisältää vektorin pMK4), mikä osoittaa, että pSBT4 alkalista proteaasia koodittava geeni ili subtiileissa.
.\\ Plasmidi pSBT2 pilkottiin sitten EcoRI:lJ
2,7 ke:n EcoRI-EcoRI-fragmentti alikloonattiii •V. 25 plasmidin pUBHO EcoRI-kohtaan käyttämällä B.
* · * l SE3:a kloonausisäntänä. Tuloksena oleva plasmidi ·::: (kuvio 6).
*·* * Esimerkki 20
Aikaiinen proteaasi -ilmentämisvektorin i • · : 30 mistus ··*
Ilmentymi s vektori pLIl (kuvio 7) on plasm 11 77 pKPl:n 800 ep:n Dral-Pastl-fragmentti, jo: midin konstruointia kuvataan jäljempänä esimerkin sa 3, alikloonattiin fagemidin pBS- Pstl-HincII jolloin saatiin plasmidi pKN8. Plasmidille pKNf 5 sitten kohdennettu mutageneesi Styl-kohdan pois käyttämällä seuraavaa synteettistä oligonukleoti* oli muodostettu juuri aikaisemmin: SEQ ID NO:6 5'-AAGCTTGTATGCCTGCAG-3' 10
Muodostunut plasmidi oli pKN9.
Sitten konstruoitiin vektori pUBC134. Enä toitiin pUBC132:n PstI-kohta poistamalla ulkone^ käsittelemällä se T4-DNA-polymeraasilla viitte 15 sivuilla F.4 - F.5 kuvatulla tavalla. Tulokse plasmidi oli pUBC133.
Konstruoitiin seuraava synteettinen kaksi; DNA ja kloonattiin se pUBC133:n SacI-BamHI-kohti: 20 SEQ ID NO:7 5'-GATCCCCTTGGCTGCAGGAGCT-3* SEQ ID NO:8 3f- GGGAACCGACGTCC -5'
*M
• * · I · I » «*.*· Tällä insertiolla saatiin plasmidi pUBC13 a *
Sitten muodostettiin plasmidi pUBC134C klo * » ;v, 25 pKCl:n (konstruoitu jäljempänä esimerkn 23 osassa * J tavalla tavalla) 548 ep:n PstI-Sacl-fragmentti ·::: Sad-Pstl-kohtiin, kun sekä pUBC1354 että pKCl oi J tu PstI: llä ja Sacl:llä.
pKN9:n 812 ep:n BamHI-PstI-fragmentti saat • » : 30 koraalia pKN9 BamHI:llä ja PstI:llä. Tämä 812 ej ·** ! mentti kloonattiin sitten vektorin DUBC134C Ps 11 78 pLINC:n 1001 ep:n Styl-SacI-fragmentti pilkkomalla Styil:llä ja Sacl:llä ja eristetti 1001 ep:n DNA·fragmentti alikloonattiin sitten ] pKPNl4:n SacI-Styl-kohtiin, jonka plasmidin konsl 5 kuvataan jäljempänä esimerkissä 25, jolloin saatd midi pKPNl5. pKPNIS-tranformantit valikoitiin tet] nillä.
Sitten konstruoitiin plasmidin pKPNl5 johd< joka on replikaatiokykyinen B. subtilis ja B. lii 10 mis -kannoissa, korvaamalla plasmidin pKPN15 * Sacl-Bglll-fragmentin sisältämät E. coli repiiki minnot 2199 ep:n BglII-Sad-fragment!11a, joka replikaatiotoiminnot Bacillusta varten ja joka er: plasmidista pUB131.
15 Konstruoitiin edellä mainitun plasmidin pK
dannainen kloonaamalla B. subtilis SE3:ssa pKPNl! räisin oleva 3402 ep:n Bglll-Sacl-fragmentti pl peräisin olevaan 2198 ep:n BglII-SacI-vektorifragi Tuloksena oleva plasmidi nimettiin pLIl:ksi (kuvd 20 Esimerkki 21
Aikai inen proteaasi -ilmentämisvektorin pL mistus • V. Konstruoitiin ilmentämi s vektori pL7SBT (h * · joka sisältää B. subtilis 168:n alkalista protea* »V, 25 dittavan sekvenssin B. licheniformisin alkalisen * * ' ^ sin (subtilisiini Carlsberg) transkriptiopromootl *;;; jauksessa. Tämä plasmidi (pL7SBT) saadaan seuraan * · » *·* ' 1. pLl2NC:n valmistus pLINC:n (muodostettu edellä esimerkissä 20 • · :J : 30 la tavalla) 1001 ep:n Styl-SacI-fragmentti aliklt ** * pLIDItn (muodostettu jäljempänä esimerkissä 25 ) 11 79 2. pBS7MASE:n valaistus
Vektori pBS5 muodostettiin kloonaamall< BamHI-SacI-kohtiin seuraava kaksisäikeinen syni DNA, jolloin muodostui pBS5: 5 A 5'-GATCC CC GGGACCT T AGGCCT ΤΤΛΑΤΤΛΑ CCTTOO CGGCCG CTCOAO GAOCT-3' B 3'- 0 00 CCCTOGA A TCCQGA AATTAATT GCAACC QCCGGC GAOCTC C -5'
BamHI Sami PpuHI Stul P*cl Styl Heti XhoI Sacl A - SEQ ID NO:9 10 B * SEQ ID NO:10
Plasmidista pKPN15 (muodostettu edellä esimerkisi vatulla tavalla) peräisin oleva 422 ep:n Stul-Si mentti kloonattiin pBS5:n Stul-StyI-kohtiin, joi: 15 dostui plasmidi pBSSMASE. pBSSMASE mutagenisoiti: Pad-kohdan tuomiseksi siihen transkriptiopromoo' translaation aloituskohdan väliin käyttämällä s< juuri ennen käyttöä muodostettua synteettistä oli< tidia: 20 SEQ ID NO:11 5'- ATTATATTATCCTTCTATTTAATTAATCTGAATAAAGAGGAG-3
Pad « · # · * • · · s · :**: 25 Tällä mutageneesilla saatiin plasmidi ] •V. joka sisälsi täydentävän Pacl-kohdan verrattuna p: * pBSSMASE.
(*|»t 3. pLI7NC:n valmistus • *
Sen jälkeen konstruoitiin plasmidi pLI7NC
, . 30 maila edellä kuvatun plasmidin pLl2NC 422 ep:n S1 • * · kohta edellä kuvatun plasmidin pBS7MASE 421 ep 80 SEQ ID NO:12 5 * -COCTTAATTIUUmATGAaGHqOGlUlCCOAQTOAQKAQC3UUUU>ATTGTGQATCAQCTT-3 *
Pad 5 SEQ ID NO:13
5 * -GATCATGGAACGAGCTCAACATGCGGAGAAAGAAGAG-SacI
Näitä oligonukleotideja käytettiin sittei 10 nistukseen lähtien plasmidista pSBT2 (muodostef esimerkissä 19 kuvatulla tavalla).
pSBT2 sisältää B. subtiilein 168:n koko proteaasia (subtilisiinia) koodittavan geenin. P tettu fragmentti sisälsi ribosomi sitou tiimi skohd< 15 lista proteaasia koodittavan sekvenssin samoin ku transkription terminaattorin kahden restriktiokoh ja SacI, reunustamina (välissä). PCR toteutettii tamalla edellä kuvattua menettelyä.
Monistettu fragmentti puhdistettiin agaroo 20 lä [1 % (paino/11 lavuus)] , pilkottiin Pad:llä ja ja kloonattiin vektorin pLI7NC Sad-Pad-kohtiin syntyi plasmidi pLI7SBT.
·« « : Sitten konstruoitiin plasmidin pLI7SBT j 8 8
nen, joka on replikaatiokykyinen B. subtilisis \ 25 licheniformislssar korvaamalla plasmidin pLI7SBT
Sacl-Bglll-fragmentin sisältämät £. coli replik minnot 2199 ep:n Bglll-SacI-fragmentilla, joka «M* replikaatiotoiminnot Bacillusta varten ja joka er plasmidista pUB131.
. . 30 Replikaatiotoimintojen korvaaminen tehtiin
naamalla B. subtilis SE3:ssa plasmidin pLI7SBT
• « 81
Esimerkki 22
Alfa-amylaasi-ilaentäMisvektorin pL7TAKA
Ilmentäraisvektori pL7TAKA (kuvio 9) sis licheniformis ATCC 9789:n α-amylaasia koodittavan 5 sin B. licheniformis SE2:n alkalisen proteaasin t tiopromoottorin ohjauksessa. Tämä plasmidi (pL7T tiin seuraavasti.
Ensin eristettiin plasmidi pS, joka sis licheniformis ATCC 9789: n koko a-amylaasigeenin k 10 na 3,5 ep:n EcoRl-fragmentissa pUB110:n EcoRl Eristys tehtiin seuraavasti:
Eristettiin ja puhdistettiin 200 ml:n L-mästä B. licheniformis ATCC 9789:n kromosomi-I kromosomi-DNA-valmiste pilkottiin sitten 15 EcoRl:llä. Saadut fragmentit ligatoitiin sitten pUNHO, joka oli linearisoitu ennalta EcoRl:llä. olevalla ligaatioseoksella transformoitiin B. BR151 käyttämällä protoplastimenetelmää. Reg transformantit siirrettiin L-B-alustaan, jota oi 20 netty kanamysiinillä (25 pg/ml) ja tärkkelyksc (paino/tilavuus)J.
Kun oli viljelty 18 tuntia lämpötilass transformanttipseäkkeet peitettiin 0,0025-%: ise: • « « •V. liuoksella. Sitten identifioitiin pesäke, jolla • * *••1' 25 suurempi tärkkelyshydrolyysikehä kuin vertail : f (B, subtilis BR151), joka sisältää plasmidin pUBl • « « 'Hl midi pS uutettiin tästä transformantista, eristi *·* * analysoitiin restriktiokartoituksella. Plasmidi p insertoidun, B. licheniformis ATCC 9789:sta perä • * ; 30 van, noin 3,5 ke:n DNA-fragmentin. Insertoidun f : : sekvenssit määritettiin käyttämällä samaa lähest 82 SEQ ID NO:14: 5 '-CTTGTTAAAAATTCGGAATATTTAATTAAATCATATGT'
PacI
5 SEQ ID NO:15: 51-GCTGCAAAGCATAATGATGACGGTCC-3' Näitä kahta synteettistä oligonukleotidi; tiln sitten PCR-monistukseen lähtien plasmldlsta 10 PCR-monistettu fragmentti sisältää B. 1I< mis ATCC 9789:n rlbosomlsltoutumlskohdan ja a-koodittavan geenin samoin kuin kyseisen geenin tion terminaattorin, kahden restriktiokohdan, Sacl, reunustamina (välissä).
15 Sitten valmistettiin plasmidi pLI7NC edell kissä 21 kuvatulla tavalla.
Monistettu fragmentti puhdistettiin agaroo lä (l-%:inen), pilkottiin Pacl:llä ja Sacl:llä ja ti in sitten vektorin pLl7NC SacI-PacI-kohtiin, 20 muodostui plasmidi pLI7TAKA.
Sitten konstruoitiin plasmidin pLI7TAKA ji nen, joka on repiikaatiokykyinen B. subtilisis .y. lichenlformistssa, korvaamalla plasmidin 3623 ep:n Bglll-Bglll-fragmentin sisältämät E. c • 9 ’ 25 likaatiotoiminnot plasmidista pUB131 eristetyllä * · Bglll-BamHI-fragmentilla, joka sisältää fragment on replikaatlotoiminnot Bactllusta varten.
*·* * Replikaatiotoimintojen korvaaminen tehtiir maila B. subtilis SE3:ssa plasmidin pLI7TAKA · 30 Bgl 11 -Bgll I - fragmentti plasmidista pUB131 er 2238 ep:n Bgl11-BamHl-fragmenttiin. Tuloksena oi 83
Esimerkki 23
Bacillus lichen 1 fozmis -isäntäkannan aikai teaasla koodittavan geenin terminaalist kloonaaminen 5 Alkalista proteaasia koodittavan geenin < seksi B. licheniformis SE2:n kromosomi-DNA:sta strategia oli eristää ensin kromosomi-DNA. Ky sei s terminaaliset osat kloonattiin sitten hybridisoim gonukleotidikoettimien kanssa.
10 1. Kromosomi-DNA: n eristäminen B. Heh* SE2:sta B. licheniformisin kromosomi-DNA eriste puhdistettiin edellä kohdassa "Menetelmät ja t< kuvatulla tavalla.
15 2. Alkalista proteaasia koodit tavan geenin naalisen osan kloonaaminen
Eristetylle kromosomi-DNA:lie tehtiin si striktioanalyysi. Näistä pilkkomisista tuloksen DNA-fragmentit eroteltiin koon mukaan 0,8-%:iseJ
20 no/tilavuus) agaroosigeelillä.
Agaroosigeeli analysoitiin sitten South' menetelmällä niiden restriktiofragmenttien iden- * · · I. seksi, jotka sisältävät alkalista proteaasia koi • * * .! I geenin C-terminaalisen osan.
• · * j. l 25 Hybridi säätiöi ta varten muodostettu ja ni: * * · : ·' tetty koetin oli synteettinen oligonukleotidi, joi ...T alkalista proteaasia koodittavan geenin C-term: V : osaa. Tähän tarkoitukseen muodostettu C-päätä synteettinen oligonukleotidi oli seuraava: : 30 • M » SEQ ID NO: 16 51 -GGCGGAGCAAGCTTTGTGG-3 84 B. licheniformis SE2:sta eristetty kromoi valmiste pilkottiin sitten Pstl:llä ja eroteltiin kaan agaroosigeelielektroforeesilla (0,8 %). Sa1 2 3 2,7 ke:n fragmentit eristettiin sitten geeleistä 5 distettiin noudattamalla Gene Clean -menettelyä. PstI-fragmentit ligatoitiin sitten plasmidin pUCl joka oli ennalta katkaistu PstX-kohdasta ja defo: tu. Siten saadulla ligaatiotuotteella transformoi ten Escherichia coli MC1061 käyttämällä CaCl2-mer 10 Transformantit valikoitiin L-B-alustalla, täydennetty ampisilliinilla (100 pg/ml). MC1061:ssa saadut transformantit tutkittiin sitt< disoimalla radionuklidileimatun, synteettisen oli; tidin kanssa, jota käytettin C-terminaalisena k< 15 Southem-tutkimuksessa, ja eristettiin siten pKCl.
3. Alkalista proteaasla koodittavan geenin naalisen osan kloonaaminen
Eristetylle kromosomi-DNAzlle tehtiin sl 20 striktioanalyysi. Näistä pilkkomisista tuloksen DNA-fragmentit eroteltiin koon mukaan 0,8-%:iseJ no/tilavuus) agaroosigeelillä.
Agaroosigeeli analysoitiin sitten South1 • « t ··,·. menetelmällä niiden restriktiofragmenttien iden • 1 I. ! 25 seksi, jotka sisältävät alkalista proteaasla koi ;1 geenin N-terminaalisen osan.
• t» 2 “•j Hybridi säätiöi ta varten muodostettu ja ni: 3 1 tetty koetin oli synteettinen oligonukleotidi, jo alkalista proteaasla koodittavan geenin N-terra; • 1 * 30 osaa. Tähän tarkoitukseen muodostettu N-päätä • s s : : synteettinen oligonukleotidi oli seuraava: 85
Tulokset osoittivat, että alkalista protea dittavan geenin C-terminaalinen osa sijaitsi noin Pstl-fragmentissa ja yhtä hyvin pienemmässä, nod BclI-PstI-fragmentissa. Tämä fragmentti ei s: 5 Xbal-, Clal-, Hpal- eikä SphI-restriktiokohtia.
B. licheniformis SE2:sta eristetty kromoi valmiste pilkottiin sitten Pstl:llä ja eroltet mukaan agaroosigeelielektroforeesilla (0,8 %)· Sa
5,5 ke:n fragmentit eristettiin sitten geeleistä 10 distettiin noudattamalla Gene Clean -menettelyä. 1 oleville 5,5 ke:n Päti-fragmenteille tehtiin sit* pilkkomisia Bcll:llä, Xbaltllä, Claltllä, Hpa Sphl:llä. Siten saadut DNA-fragmentit ligatoitid plasmidin pMK4 kanssa [Sullivan et ai.. Gene 2 15 21 - 26], joka oli linearisoitu ennalta BamH
Pstl:llä.
Siten saadulla ligaatiotuotteella transf< sitten E. coll MC1061 käyttämällä CaCl2-menetelmä
Transformantit valikoitiin L-B-alustalla, 20 täydennetty ampisilliinilla (100 pg/ml).
MC1061:ssa saadut transformantit tutkittiin sitti disoimalla radionuklidileimatun, synteettisen < • * « leotidin kanssa, jota käytettin C-terminaalisena ] * » · I na Southern-tutkimuksessa, ja eristettiin siten \./ 25 pKPl.
• Esimerkki 24
«M
·*.ί Alkalista proteaasia koodittavan geenin sei ··· * « · .
V * ti
Plasmideihin pKPl ja pKCl insertoidut f: : :: 30 sekventoitiin Pstl-kohdistaan Sacl-kohtiinsa ede ··· i 1 dassa "Menetelmät 1a tekniikat" kuvatulla men< 86
Esimerkki 25
Valmista alkalista proteaasia vastaavan < plasmidin pLDl muodostaminen
Noudattamalla edellä esimerkissä 24 kuvai 5 lista proteaasia koodittavan geenin sekventointii tettiin deleetioplasmidi pLDl (kuvio 11) B, Heh SE2 delapl:n valmistamiseksi. Tämä plasmidi pLD: seuraavasti.
Plasmidi pKPl osoittautui äärimmäisen pysyi 10 si E. coli MC1061:ssä. Tästä syystä alikloonatti somi-DNA-fragmentti, joka sisältää B. Hchenifon alkalista proteaasia koodittavan geenin N-term osan, vektoriin pACYC184. Alikloonaus tehtiin pKPl:stä peräisin oleva 1849 p:n EcoRI-EcoRI-f 15 pACYC184:n EcoRI-kohtaan, ja ligaatiotuotetta k E. coli MC1061 -solujen transformointiin. Tuloksi plasmidi oli pKPNll.
Transformantit valikoitiin sitten L-B-aga: la, jota oli täydennetty tetrasykliinillä (12, 20 1849 ep:n EcoRI-EcoRI-fragmentin orientaatio p: määritettiin sitten restriktioanalyysillä.
:*·*; Plasmidi pKPN12 saatiin deletoimalla •V. 1671 ep:n Styl-StyI-fragmentti pilkkomalla Styl:l * * jälkeen kyseinen fragmentti korvattiin seuraave 25 teettisellä kaksisäikeisellä DNA: 11a, joka oli j • · ! mistettu: e··· ··· • · ·
SEQ ID NO:18 5f- CTTG GAGCTC GTTAAC AGATCT SEQ ID NO:19 3f- CTCGAG CAATTG TCTAGA GTTC
• * : 30 (StyI) Sacl Hpal Bglll (sty: ··· • · • « 87
Ensin hankittiin 2666 ep:n Pstl-TaqI-f: (sisältää kanamysiini- ja joko bleomysiini- tai f niresistenssiä koodittavat geenit) tekemällä pii pUB131 Pstl-Taql-pilkkominen. Tämä fragmentti vie 5 ten fagemidin pBS- Pstl-Accl-kohtiin. Tuloksena < distyminen johti plasmidin pBSKMPM muodostuin! see]
Edellä kuvatun pBSKMPM-kloonauksen aikana pBS-:n kytkijän alueella pieni deleetio, joka s< PshI- ja Pstl-kohtien menetyksen plasmidissa 10 Niinpä plasmidia pBSKMPM käytettiin yksisäikeis tuottamiseen, jota käytettiin sitten kohdennetun neesin aikaansaantiin, jotta plasmidiin saadaan kaksi synteettistä nukleotidia, joissa on alla es vastaavat Smal-kohdat, niin että plasmidissa o] 15 kaksi Smal-kohtaa, toinen kanamysiini- ja fleom; sistenssigeenien edellä ja toinen niiden jäljessä
Mutageneesiin käytettyjen synteettisten i leotidien sekvenssit ovat seuraavat: 20 SEQ ID NO:20
5 * - CATCTAATCTTCAACACCCGGGCCCGTTTGTTGAAC
Smal «V· SEQ ID NO:21 • · 4 5 ' - CAAAATAAAAAAGATACAACCCGGGTCTCTCGTATCT' • · *·· l 25 Smal • · · • · • · ··· ”·· Tämän, kahden oligonukleotidin läsnä oi les • · · mutageneesin seurauksena oleva plasmidi on pBSKM: plasmidi sisältää kaksi Smal-restriktiokohtaa, j< * * : 30 dollistavat kanamysiini- ja fleomysiiniresistenss \..5 ttavat geenit sisältävän DNA-fragmentin eristämii 88
Kloonatun fragmentin hyvä orientaatio pii pKPN14 todettiin sitten tutkimalla pienessä mit< mistetut plasmidi-DNA-preparaatit restriktioan edellä kohdassa "Menetelmät ja tekniikat" kuvatul 5 la.
Sitten eristettiin pKClzssä oleva ja aikai teaasia vastaavan sekvenssin N-pään jäljessä s DNA-fragmentti pKClzn (muodostettu edellä esin kohdassa 2 kuvatulla tavalla) 1,2 ke:n Sacl-Hind 10 mentin osana. Tämä eristys tehtii pilkkomalla p] Hindlll:11a. Ulkoneva HindIII-5f-pää tehtiin si' päksi käsittelemällä DNA-polymer aasin Klenow-frag Sitten tehtiin Sacl-restriktio halutun (tylpä Hindlll-fragmentin aikaansaamiseksi. Tämä f ragmen 15 nättiin sitten pKPNl4:n Sacl- ja Hpal-kohtiin, muodostui plasmidi pLIDl.
Kaikki edellä esitetyt konstruoinnit tot transformoimalla kanta E. coli MC1061 tetra (12 pg/ml) läsnä ollessa transformaattien välikö
20 Sen jälkeen muodostettiin plasmidin pLID
nainen, joka on replikaatiokykyinen B. subtilisi ·1·1. l±chenlform±s±ssa, korvaamalla plasmidin pLIDl #\\ Bglll-Bglll-fragment in sisältämät E. coli -replik • · « minnot fragmentilla, jossa on replikaatiotoiminn « 9 25 lusta varten, eli plasmidista pUB131 eristetyllä l Bglll-BamHI-fragmentilla.
·1· E. coli -replikaatiotoimintojen korvaamine 89 tamaan agaroosigeelielektroforeesilla. 3,6 ke:;
Bglll-fragmentti kloonattiin sitten B. subtiili 2238 ep:n Bglll-BamHI-fragmenttiin, joka oli < plasmidista pUB131, jolloin saatiin plasmid! pLl 5 11).
Esimerkki 26
Koko alkalista proteaasia koodittavaa s vastaavan deleetioplasmidin pLD3 muodosta
Muodostettiin toinen deleetioplasmidi, pL 10 12) B. licheniformis SE2 delap3:n valmistamise) plasmidi pLD3 saatiin seuraavasti.
Konstruoitiin kaksisäikeinen synteettinen leotidi, jonka sekvenssi oli seuraava: 15 SEQ ID NO:22 S’-CCT TTAATTAA CCTTGG CGGCCG CTCGAi SEQ ID NO:23 31 -CGA AATTAATT GGAACC GCCGGC GAGC (Stul) Pad StyI NotI Xho Tämä synteettinen oligonukleotidi kloonattiin sit 20 midin pLIDl (muodostettu edellä esimerkissä 25 tavalla), jolloin muodostui plasmidi pLID3.
Sen jälkeen muodostettiin plasmidin pLID: «\\ nainen, joka on replikaatiokykyinen Bacillus-k * * · •V korvaamalla plasmidin pLID3 3623 ep:n Bglll-Bglll * · l.lm 25 tin sisältämät E. coli -replikaatiotoiminnot pl : l PUB131 eristetyllä 2238 ep:n Bglll-BamHI-fra
IM
(fragmentilla, jossa on replikaatiotoiminnot B
I · I
*·* * varten).
E. coli -replikaatiotoimintojen korvaamine • * f.j · 30 villa Bacillus-toiminnoilla tehtiin kloonaamalla f": PLID3 3,2 ke:n Bglll-Bglll-fraamentti oUB131:stä 90
Esimerkki 27
Koko alkalissa proteaasia koodittavaa se] transkriptiopromoottori mukaan luettuna, 1 deleetioplasmidin pLD6 muodostaminen 5 Muodostettiin vielä toinen deleetioplasmj (kuvio 13) B. licheniformis SE2 delap6:n vaimist. Tämä plasmidi pLD6 saatiin seuraavasti.
Konstruoitiin plasmidi pLlD6 deletoimalla ; pL!D3 (muodostettu edellä esimerkissä 26 kuvatul, 10 la) 0,9 ke:n Afllll-Afllll-fragmentti. Sitten im tiin tämän plasmidin johdannainen, joka on repii: kyinen Bacillus-kannoissa, korvaamalla plasmid 3623 ep:n Bglll-Bglll-fragmentin sisältämät E. c< likaatiotoiminnot plasmidista pUB131 eristetyllä 15 Bglll-BamHI-fragmentilla (fragmentilla, jossa on : tiotoiminnot Bacillusta varten).
E. coli -replikaatiotoimintojen korvaamine villa Bacillus-toiminnoilla tehtiin kloonaamalla ; pLID6 2,3 ke:n Bglll-Bglll-fragmentti (fragmenti 20 on B. licheniformis SE2:n alkalista proteaasia ko< geenin 5'-pään edellä ja 3'-pään jäljessä oleva s< pUB131:stä eristettyyn 2238 ep:n Bglll-BamHI-fragi » * * e.\.e Tuloksena on plasmidi pLD6 (kuvio 13).
Esimerkki 28 • * · |. I 25 Deletoitujen B. licheniformis -kantojen mu I I · ! ·* nen in vivo • e» ····* Bacillus licheniformis SE2:n kromosomi-DN, *«« : tut deleetiot tehtiin käyttämällä menetelmiä, jot tuvat homologiseen rekombinaatioon, mitä käsitel Ι.Γ: 30 jempänä yksityiskohtaisesti. Plasmideilla pLDl,
Tra efaarra β+·ΐ ηΤ.ΠΛ a-4 Uaaf\eaa^n4> I,i^nninenm4 e±er%+- -ί , i 91
Kullakin deleetioplasmideista (pLDl, pLD3 transformoitiin vastaavat Bacillus llchentformis jelmät käyttämällä protoplastitekniikkaa.
Vastaavat transformantit eristettiin 5 transformaatioseoksesta ja tarkistettiin niihi deleetioplasmidin restriktiokartat.
Sen jälkeen transformantit laitettiin omi alustoihinsa, 50 ml:aan L-B-alustaa, jota oli tä glukoosilla 2 g/1 ja kanamyslinillä 25 pg/ml, 10 ajaksi lämpötilassa 37 eC.
Inokuloitiin 0,1 ml:11a kutakin tulokser viljelmää vastaavat pullot, jotka sisälsivät 50 alustaa, ja inkuboltiin 18 tuntia lämpötilassa 37 takin tuloksena olevasta viljelmästä otettiin i 15 siirrostettiin se sopivina laimennoksina proteaa tointimaljoille, joita oli täydennetty kanain (25 pg/ml).
Vastaavista maljoista tutkittiin visuaalis laisten pesäkkeiden läsnäolo, joilta puuttuu vy 20 muodostus, mikä osoittaa näiden pesäkkeiden kyvy tuottaa alkalista proteaasia. Viljely- ja tarkast piteitä poistettiin, kunnes saatiin eristetyksi ,V. deleetion sisältäviä ehdokkaita, jotka olivat se • i · tömiä tuottamaan alkalista proteaasia (apr") et' • * 25 tenttejä kanamysiinille (Kmr) vastaavien deleetiop * * ♦ * * läsnäolon ansiosta.
··* ···· Deleetioihin käytetyt plasmidit poistet *·* * jälkeen deleetion sisältävästä B. licheniformis kannasta (kanta SE2 delapl, SE2 delap3 tai SE2 : 30 joka oli transformoitu niillä, tekemällä yksinke • · « ! ί viHelv kasvualustoilla lämnAtnaeaa Q7 ° r 92 37 “C. Inokuloitiin 0,1 ml:11a tuloksena olevia vastaavat toiset pullot, joista kukin sisälsi 50 alustaa, ja inkuboitiin 18 tuntia lämpötilassa 3 loksena olevista viljelmistä otettiin näyte, ja 5 tettiin se sopivina laimennoksina L-B-maljoille. pesäkkeet replikasiirrostettiin sitten vastaavin le L-B-maljoille, joita oli täydennetty kanam; (25 pg/ml), ja tarkastettiin visuaalisesti kanam; herkkien (Km“) pesäkkeiden identifioimiseksi.
10 Viljely- ja tarkastustoimenpiteitä toistet kin pesäkkeen kohdalla, kunnes saatiin eristetyks dokkaita. Sitten nämä ehdokaskannat eristettiin j tettiin niiden fenotyypit (apr‘, Km“).
Sen jälkeen eristettiin ja puhdistettiin k 15 DNA ja varmistettiin kromosomideleetion rakenne blotting-menetelmällä. Deleetioiden havaittiin o vin sijoittuneina, ja ne olivat tapahtuneet kaks sella homologisella rekombinaatiolla edellä (5' jessä (3’) sijaitseviin sekvensseihin, kuten näl 20 viosta 10. Kuviossa 10 pisteviivat osoittavat ] useamman deletoidun sekvenssin poissalon B. lich .1:1· SE2:n kromosomi-DNA: s ta.
• 1 «
Tuloksena olevista kannoista käytetään m B. lichenlformis SE2 delapl, SE2 delap3 ja vastaa • 9 25 delap6. Yksikään näistä kannoista ei tuottanut I proteaasia.
2 3 2 ***** Esimerkki 29 3
1 Deleetion sisältävien B. lichenUiormis SE
jen transformointi pUB-BPX:llä * 30 PUB-BPX12 (kuvio 4) uutettiin esimerkissä ! . 5 mistetusta E. coli MC1061:stä ja eristettiin ja p 93 toplastimenetelraää ja valikoitiin, eristettiin ji tettiin vastaavat transofrmantit.
Tuloksena olevat transformoidut kannat c licheniformis SE2 delapl (pUB-BPX), delap3 (pUE 5 delap6 (pUB-BPX). Transformantit sijoitettiir asianomaisiin viljelmiin jäljempänä esimerkissä : tavalla tavalla tämän keksinnön mukaisen ksylanaa tamiseksi. Tämän plasmidin läsnäolo antaa tuloki ville deleetion sisältäville B. licheniformis SE! 10 binanttikannoille seuraavat ominaisuudet: 1. ksylanaasin tuottaminen solun ulkopuoli 2. kanamysiini- tai fleomysiiniresistenss:
Esimerkki 30
Deleetion sisältävien B. licheniformis SE! 15 jen transformointi muilla vektoreilla
Edellä esimerkissä 18 kuvatulla taval! pUBDEBRAl (kuvio 5), edellä esimerkissä 19 kuval valla saatu pKACl (kuvio 6), edellä esimerkissä tulla tavalla saatu pLIl (kuvio 7), edellä esime: 20 kuvatulla tavalla saatu pL7SBT (kuvio 8) ja edell kissä 22 kuvatulla tavalla saatu pL7TAKA (kuvio 1 tiin kukin isännästään ja eristettiin ja puhdi: Valmistettiin viisi viljelmää kustakin deleetion • · · «X' västä B. licheniformis SE2 -kannasta (delapl, c I. ; 25 delap6) edellä esimerkissä 28 kuvatulla tavall • « « ! ·* näistä deleetion sisältävien kantojen viljelmisl aa» ***| formoitiin sitten yhdellä asianomaisista plasi V · Transformoinnit tehtiin käyttämällä protoplastimei
Sitten valikoitiin, eristettiin ja puhd: ·,· · 30 kussakin viidestä viljelmästä olevat transformani
Transformantit siirrettiin sitten omiin lii 94
Esimerkki 31 B. sabtllis SE3:n transformointi iImenta reillä
Edellä esimerkissä 17 kuvatulla tavalla s 5 BPX12 (kuvio 4), edellä esimerkissä 18 kuvatuli; saatu pUBDEBRAl (kuvio 5), edellä esimerkissä 19 tavalla saatu pKACl (kuvio 6), edellä esimerkissä tulla tavalla saatu pLll (kuvio 7), edellä esime kuvatulla tavalla saatu pL7SBT (kuvio 8) ja edell 10 kissä 22 kuvatulla tavalla saatu pL7TAKA (kuvio tiin kukin isännästään ja eristettiin ja puhdi Valmistettiin 6 Bacillus subtilis SE3 -viljelmi viljelmistä transformoitiin sitten yhdellä asian plasmideista. Transformoinnit tehtiin käyttämät 15 plastimenetelmää.
Sitten valikoitiin, eristettiin ja puhd kussakin näistä kuudesta viljelmästä olevat tra tit.
Transformantit siirrettiin sitten omiin li 20 miinsä jäljempänä esimerkissä 35 kuvattavalla tav dittamansa entsyymin tuottamiseksi.
·*·*. Esimerkki 32
•V, B. pumUus PRL Bl2:n transformointi pUB-B
pUB-BPX12 (kuvio 4) uutettiin esimerkissä • * 25 mistetusta E. coli MC1061:stä ja eristettiin ja p
* l tiin. pUB-BPX12 vietiin sitten transformoimalla B
* * · ;;; PRL B12 -kantaan käyttämällä protoplastimenetelmä « · · *** ' formantit valikoitiin suoraan DM3-alustalla fle (20 pg/ml) läsnä ollessa.
• * : 30 Sitten valikoitiin, eristettiin ja puhd ϊ ϊ kussakin näistä viidestä viljelmästä olevat tra 95
Esiaerkki 33 pUB-BPX12:n aikaansaama ilmentyminen de lei sältävissä B. licheniformis SE2 -kannoissa Valmistettiin asianomaiset viljelmät delei 5 sältävistä B. lichenlformis SE2 -kannoista (delap ja delap6), jotka oli transformoitu ilmentämisvi pUB-BPX12 edellä esimerkissä 29 kuvatulla tavall< Transformantteja viljeltiin 17 tuntia läm] 37 *C L-B-esiviljelyaluetässä, jota oli täydennc 10 koosilla [0,5 % (paino/tilavuus)] ja kanam; (20 mg/ml). Tällä esiviljelmällä (5 til-%) ino! 50 ml M2-alustaa (kuvattu esimerkissä 1), jota oi netty kanamysiinillä (20 mg/ml), väliseinällisis meyerpulloissa. Viljelyt tehtiin sekoittaen 80 tu 15 pötilassa 37 eC. Kun oli viljelty 80 tuntia k olosuhteissa, solubiomassa poistettiin sentrif 10 min kierros taajuudella 5000 min-1.
Sitten määritettiin kasvatusliemissä olev naasin entsymaattinen aktiivisuus ja laskettiin p 20 määrä (μς) entsyymin ominaisaktiivisuuden per Näitä tuloksia verrattiin sitten pUB131-vertailup la transformoidun isäntäkannan B. lichenlformis S
» entsymaattiseen aktiivisuuteen (katso jäljempä taulukko 10).
* A
25 Saadut tulokset esitetään jäljempänä taul • · '1 ja ne ilmoitetaan prosentteina verrattuna aikai: teaasin määrään, jonka tuotti plasmidin PLI1 (kuv sältävä, deleetion sisältävä B. lichenlformis SE joka sisältää alkalinen proteaasi Carlsberg -geei i 30 Esimerkki 34 _ · Tl I—nn < Hm I n·· ui· t η··η I ίί·ι·· M J mm. AM A T 1 -!- i
A
96 ja delap6), jotka oli transformoitu ilmentämisvel pUBDEBRAl, pKACl, pLIl, pL7SBT ja pL7TAKA edellä kissä 30 kuvatulla tavalla.
Transformantteja viljeltiin 17 tuntia läm] 5 37 °C L-B-esiviljelyalustassa, jota oli täydennc koosilla [0,5 % (paino/tilavuus)] ja kananr (20 mg/ml). Tällä esiviljelmällä (5 til-%) inol 50 ml M2-alustaa (kuvattu esimerkissä 1), jota oi netty kanamysiinillä (20 mg/ml), väliseinällisisa 10 meyerpulloissa. Viljelyt tehtiin sekoittaen 80 tu: pötilassa 37 °C. Kun oli viljelty 80 tuntia ki olosuhteissa, solubiomassa poistettiin sentrifi 10 min kierrostaaj uudella 5000 min-1.
Sitten määritettiin kasvatusliemissä olevi 15 lanaasin, a-amylaasin ja alkalisten proteaasien ei tinen aktiivisuus ja laskettiin proteiinin määrä syymin ominaisaktiivisuuden perusteella. Näitä verrattiin sitten pUB131-vertailuplasmidilla trai dun isäntäkannan B. llcheniformis SE2 delapl ent; 20 seen aktiivisuuteen (katso jäljempänä oleva tauli Saadut tulokset esitetään jäljempänä tauli ja ne ilmoitetaan prosentteina verrattuna aikai: 9 .V. teaasin määrään, jonka tuotti plasmidin PLIl (kuv sältävä, deleetion sisältävä B. llcheniformis SE! • · ;\*e 25 joka sisältää alkalinen proteaasi Carlsberg -geei : Esimerkki 35 * * · *;;; Ilmentämisvektoreiden aikaansaama ilmentj subtills SE3:ssa
Valmistettiin asianomaiset B. subtilis SE3 • · ·.: · 30 mat, jotka oli transformoitu ilmentämisvektorei BPX12, pUBDEBRAl, pKACl, pLIl, pL7SBT Ja pL7TAf 97 (20 mg/ml). Tällä esiviljelmällä (5 til-%) ino 50 ml M2-alustaa (kuvattu esimerkissä 1), jota oi netty kanamysiinillä (20 mg/ml), väliseinänisis meyerpulloissa· Viljelyt tehtiin sekoittaen 80 tu 5 pötilassa 37 °C. Kun oli viljelty 80 tuntia k olosuhteissa, solubiomassa poistettiin sentrif 10 min kierros taajuudella 5000 min'1.
Sitten määritettiin kasvatusliemissä olevl naasin, pullulanaasin, α-amylaasin ja alkalisten 10 sien entsymaattinen aktiivisuus ja laskettiin p määrä (pg) entsyymin ominaisaktiivisuuden per Näitä tuloksia verrattiin sitten pUBl31-vertailup la transformoidun isäntäkannan B. llchenlformls S entsymaattiseen aktiivisuuteen (katso jäi jenipä 15 taulukko 10).
Saadut tulokset esitetään jäljempänä taul ja ne ilmoitetaan prosentteina verrattuna aikai; teaasin määrään, jonka tuotti plasmidin PLIl (kuv sältävä, deleetion sisältävä B. licheniformis SI 20 -kanta, joka sisältää alkalinen proteaasi Carlsb nin.
Esimerkki 36 ;*.*· llmentämisvektorin pUB-BPXl2 aikaansaama 1 m · n en B„ pimilus PRL Bl2:ssa * * ··.·. 25 Valmistettiin B. pumilus PRL B12 -vilje: • · I oli transformoitu ilmentämisvektorilla pUB-BPXi; *::: esimerkissä 31 kuvatulla tavalla.
* ·
Transformantit valikoitiin suoraan DM3-fleomysiinin (20 pg/ml) läsnä ollessa.
: 30 Yhtä transformanttipesäkettä viljeltiin i tuntia lämpötilassa 37 eC edellä esimerkissä 1 ^Μ·ΒΙ·Ι I M|IWWHHHWIIlif»P I wup II I i^yt?pp^nuyw. —HWf^l"· iJW«mmPitonsaΚΙ—— 98 meyerpullossa noudattamalla edellä esimerkissä 1 ohjelmaa. Viljely tehtiin sekoittaen 30 tuntia läi sa 30 °C.
Kun oli viljelty 40 tuntia, kasvatusliemei 5 ulkopuolinen osa, joka sisälsi B. pumi1us PRL B1 naasin, erotettiin solubiomassasta sentrifugoimal kierros taajuudella 5 000 min'1.
Sitten määritettiin kasvatusliemessä olev naasin entsymaattinen aktiivisuus ja laskettiin p: 10 määrä (pg) entsyymin ominaisaktiivisuuden per Näitä tuloksia verrattiin sitten pUB131-vertailup la transformoidun isäntäkannan B. licheniformis S entsymaattiseen aktiivisuuteen (katso jäljempä taulukko 10).
15 Saadut tulokset esitetään jäljempänä taul ja ne ilmoitetaan prosentteina verrattuna aikai: teaasin määrään, jonka tuotti plasmidin PL11 (kuv sältävä, deleetion sisältävä B. licheniformis SI -kanta, joka sisältää alkalinen proteaasi Carlsb 20 nin.
Esimerkki 37
Eri isäntien tuottamien eri entsyymien sa
Edellä esimerkeissä 33, 34, 35 ja 36 kuvat « * a ,11 supernatenteista analysoitiin kolmen tutkitun • * *, * 25 isännän erittämien vastaavien entsyymien proteiin • » « * ** Tulokset esitetään alla olevassa taulukossa 10.
^ * .*«; Taulukossa 10 * 4 * V : (1) on B, licheniformis SE2 delapl; (2) on B. licheniformis SE2 delap3; j\ 30 (3) on B. licheniformis SE2 delap6; I ·"*· rtn n enhfi 7 ie CCO· 99 prosentteina homologisen alkalisen proteaasin ( määrästä, jonka erittää plasmidin pLIl sisältävä ; niformis SE2 delapl.
Kutakin entsyymiä vastaava proteiinimäärä 5 tavalla, jota kuvataan kokeellisessa osassa kohdi netelmät ja tekniikat".
"NS" osoittaa, että plasmidit olivat hyvi] biileja vastaavissa isäntäkannoissa eikä tuotanti toja ole siten saatavana.
10 Taulukko 10
Xlmentämisvektoreiden tuotantokyky (%) B. lichenlformis SE2 delap -kannoissa Plasmidi Ilmentynyt geenit Suhteellinen isäntäkam 15 (1) (2) (3) pLIl (subtilisiini Carlsberg) 100 PUB-PBX12 (ksylanaasi) 215 - 220 pUBDEBRAl (pullulanaasi) 95 - pKACl (subtilisiini 168) 35 - 101 20 pL7SBT (subtilisiini 168) 50 - 133 pL7TAKA (a-amylaasi) 10 - 32
Tulokset osoittavat, että deleetion sisä: *·* * .V. lichenlformis -kannat ovat paljon edullisempi isi * i * •·#·β B. subtilis, koska heterologisten proteiinien er * · ; 25 on paljon tehokkaampaa. Esimerkiksi B. lichenifi ·' delap6 (pUB-BPX12) pystyy tuottamaan 24 kertas ksylanaasia kuin B. subtllis SE3 (pUB-BPX12) samo « » *·* * suhteissa ja käytettäessä samaa ilmentämisvektoi BPX12)· Ilmentämisvektorilla pUB-BPX12 tässä B.
• * : 30 formis SE2 delap6 -isännässä saadut saannot c : : 4,8-kertaa suurempia kuin saannot, joita saadaai 100 (Carlsberg-proteaasi), pL7TAKA (a-amylaasi), pL7 tilisiini 168) ja pUBDEBRAl (pullulanaasi). Kaiki sä tapauksissa transformatteja pystyttiin tuskii aikaan, sillä deleetioita tapahtui ilmentämisve 5 suurella tiheydellä. Samojen ilmentämisvektoreide tiin toisaalta olevan hyvin stabiileja B. lich SE2 delapl ja delapö -kannoissa ja saatiin aik< saantoja.
Joitakin heterologisia entsyymejä, esimerk 10 lanaasia (220 %) ja vähemmässä määrin subtilisi (133 %), syntyi jopa suurempia määriä kuin tässä referenssi aineena käytettyä homologista Carlsberg siä.
Joitakin entsyymejä syntyy samanlaisella 15 kuin tässä kokeessa referenssiaineena käytettyä h ta Carlsberg-proteaasia [esimerkiksi puli (105 %)].
Taulukko 10 osoittaa myös B. licheniformi räisin olevan homologisen transkriptiopromoottor 20 man tehon subtilisiini 168:n synteesin aikaans Kun verrataan pL7SBT:llä saatuja ilmentymistulok ;*·*: midi 1 la pKACl saatuihin, on nähtävissä, että tuo 9 •V, on itse asiassa 31 % suurempi käytettäessä ho 9 9 :\\ alkali sen proteaasin transkriptiopromoottor ia kui •V. 25 täessä heterologista B. subtills -promoottoria.
• * ! Niinpä taulukon 10 tulokset osoittavat ...
että tässä kuvatun kaltaisen deleetion sisältävä • · · heniformis S2 -kannat ovat erinomaisia isäntiä gista proteiini-ilmentymistä varten.
• « : 30 On ilmeistä, että voidaan tehdä monia
s * joutumatta keksinnön perushengen ulkopuolelle. N
101
Kirjallisuus (1) Simpson, F., Microbial Pentosanases Factors Affecting the Production of Pentosanases lus pumllus, Can. J. Microbiol. 2 (1956) 28 - 38 5 ¢2) DE-hakemusjulkaisu 4 023 458 (3) Sambrook, Fritsch ja Maniatis, ! Cloning - Laboratory Manual, 2. p., 1989 (4) Molecular Biological Methods for i tolm. C. R. Harwood ja S. M. Cutting, John Wiley 10 1990 (5) DNA Cloning, voi. II, toim. D. M. Gl< press, Oxford 1985 (6) T. Maniatis, E. F. Fritsch ja J. ! Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spri 15 Laboratory 1982
Luettelo piirustuksissa käytetyistä lyhen
Seuraavassa esitetään luettelo lyhenteisl on käytetty (koko hakemuksen alueella) piirustuki REP Replikaationkäynnistysproteiini 20 0RI+ Plus-säikeen synteesin alkukohta ORI- Miinusmerkkinen replikaation alkukohta ·*·; KMR Kanamysiiniresistenssin antava geeni t «V. BLMR Bleomysiiniresistenssin antava geeni rv. MAT Valmis proteiini * » •V. 25 PRE Presekvenssi « * * PP Preprosekvenssi **** BPUXYL B. pumllus B12:n ksylanaasia koodittava ; BSUAPR B. subtllisin subtilisiinia koodittava i BLIAMY B. licheniformisin alkalista proteaasia 1 : 30 va sekvenssi 5? BLIAPR BLIAPR:n 5’ -pään edellä oleva sekvenss: 102
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION: <x) APPLICANT: (A) NAME: SOLVAY (Soci€t6 Anonyme) (B) STREET: Rue du Prince Albert, 33 (C) CITY: Bruxelles (E) COUNTRY: Belgique (F) POSTAL CODE (ZIP): 1050 (G) TELEPHONE: 02/509 61 11 (ii) TITLE OF INVENTION: XYLANASE DERIVED FROM A BACILLUS SI EXPRESSION VECTORS FOR SUCH XYLANASE AND OTHER PROTEINS ORGANISMS THEREFOR AND USE THEREOF.
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 35 (iv) COMPUTER READABLE FORM; (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1022 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA
:T: (vi) ORIGINAL SOURCE: * (A) ORGANISM: Bacillus pumilus :Y: (B) STRAIN: PRL B12 * · I· » * I · j. I (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: : ·: • I TCATGTAACT CGCCTTGATC TATTTCATTT GTATCAAAGG ATTTATACAC AAACAAG?
‘S* CATCCATGCC GGGTTAAAGC AGTATCGTTC CATCTAACAG AGAAGGNCTG CATGAAAC
GGTGATGGGT TTTTCATCTT AGGGATGACA GAACAATACG GATGAAAAAA GGAGAGGC : GGAAA ATG AAT TTG AAA AGA TTG AGO CTO TTG TTT GTG ATG TGT ATT C
Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile C -25 -20 -15 '•//l TTT GTG CTG ACA CTG ACG GCT GTG CCG GCT CAT GCG GAA ACG ATT ΤΑΊ *11/ Phe Val Leu Thr Leu Thr Ala Val Pro Ala His Ala Glu Thr He Tyi ; : -10 -5 1 103
GCA AGC TGG AAC AAT ATT GGA AAT GCC TTA TTT CGA AAA GGA AAG A
Ala Ser Trp Asn Asn He Gly Asn Ala Leu Phe Arg Lys Gly Lys L
40 45 50
ITT GAT TCC ACT AAA ACT CAT CAT CAA CTT GGC AAC ATC TCC ATC A
Phe Asp Ser Thr Lys Thr His His Gin Leu Gly Asn He Ser He A
55 €0 65
TAC AAC GCA GCC TTT AAC CCG GGC GGG AAT TCC TAT TTA TGT GTC T
Tyr Asn Ala Ala Phe Asn Pro Gly Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Vai T
70 75 80
GGC TGG ACA CAA TCT CCA TTA GCT GAA TAC TAC ATT GTT GAG TCA T
Gly Trp Thr Gin Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr He Vai Glu Ser T
85 90 95 1
GGC ACA TAT CGT CCA ACA GGA ACG TAT AAA GGA TCA TTT TAT GCC G
Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Ser Phe Tyr Ala A
105 110 115
GGA GGC ACA TAT GAC ATA TAT GAA ACG CTC CGT GTC AAT CAG CCT T
Gly Gly Thr Tyr Asp He Tyr Glu Thr Leu Arg Val Asn Gin Pro S
120 125 130
ATC ATT GGA GAC GCT ACC TTC AAA CAA TAT TGG AGT GTA CGT CAA A
He He Gly Asp Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Vai Arg Gin T
135 140 145
AAA CGC ACA AGC GGA ACG GTC TCC GTC AGT GAG CAT TTT AAA AAA T
Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Ser Val Ser Glu His Phe Lys Lys T
150 155 160
GAA AGC TTA GGC ATG CCA ATG GGA AAA ATG TAT GAA ACA GCA TTA A
Glu Ser Leu Gly Het Pro Het Gly Lye Het Tyr Glu Thr Ala Leu T
165 170 175 1
GTA GAA GGC TAC CGA AGC AAC GGA AGT GCG AAT GTC ATG ACG AAT C
.··», Vai Glu Gly Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Ala Asn Vai Het Thr Asn G
V 185 190 195 • 9
\v CTG ATG ATT CGA TAAAAGCATA TGAAAAAAGC CAGCAAAAAA TGGCTGGCTT
Leu Met He Arg : .· 200 ·· ·
: TTTTCTATGA TAATTTTTCA ACTTCCACTC TGCCAGAAAA GAACGTCGOG CCGCCT
,:. TATCTGCCAA TCGATCAGGT GTTAACCCAT TCACTAAATG CTTTTTGCCT TTTTGA
...: »•1 » * · • * * (2} INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: ; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: !·! ! (A) LENGTH: 15 amino acids ·*·*. (B) TYPE: amino acid *·..* in STOAHnenNESS! sinal* * 104 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
Glu Thr lie Tyr Asp Asn Arg lie Gly Thr His Ser Gly Tyr Asp 15 10 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
GTAGAGGATC ATCATGT
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
TACCTTGTCT ACAAACCCC
Ml * · « *** · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: · * (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: : .* (A) LENGTH: 25 base pairs (B) TYPE: nucleic acid : (C) STRANDEDNESS: single .:. (D) TOPOLOGY: linear *··« (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotid) < * * (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: t · :.: : tgagttgcta gtaacatctc accga M*
* I
• ♦ e · e (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotic 105 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:
AAGCTTGTAT GCCTGCAG
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic.acid (synthetic oligonucleotic (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:
GATCCCCTTG GCTGCAGGAG CT
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 14 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotic (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:
CCTGCAGCCA AGGG
* * « * · · « :Y: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: !***: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: l, I (A) LENGTH: 52 base pairs ; · ί (B) TYPE: nucleic acid . (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
• »I
V · (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotid ; e. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9: * * *
GATCCCCGGG ACCTTAGGCC TTTAATTAAC CTTGGCGGCC GCTCGAGGAG CT
(ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotidi 106 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10:
CCTCGAGCGG CCGCCAAGGT TAATTAAAGG CCTAASGTCC CGGG
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 42 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11:
ΑΤΤΑΤΑΊΤΑΤ CCTTCTATTT AATTAATCTG AATAAAGAGG AG
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 58 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12: ... CGCTTAATTA AAAATGAGGA GGGAACCGAG TGAGAAGCAA AAAATTGTGG ATCAGCj « · · • · · :Y: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13: • e (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: .· * (A) LENGTH: 37 base pairs * ’ · (B) TYPE: nucleic acid . (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear • * · V : (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotide ; (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13: see
"*·* GATCATGGAA CGAGCTCAAC ATGCGGAGAA AGAAGAG
• a • · · (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotid 107 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14:
CTTGTTAAAA ATTCGGAATA TTTAATTAAA TCATATGTTT CA
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:
GCTGCAAAGC ATAATGATGA CGGTCC
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotid (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 16:
... GGCGGAGCAA GCTTTGTGG
e e e tee e :Y: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17: ΓΛ (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: λ I (A) LENGTH: 18 base paire • * 2 (B) TYPE: nucleic acid I (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear *·♦ V * (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotid ; (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17:
III
ATGGCTCCTG GCGCAGGC
(ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotic 108 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18:
CTTGGAGCTC GTTAACAGAT CT
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotic (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19:
CTTGAGATCT GTTAAOGAGC TC
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotic (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 20:
... CATCTAATCT TCAACACCCG GGCCCGTTTG TTGAAC
• · · I « « * :V: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21: Γ·*: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: I. ! (A) LENGTH: 42 base pairs : · : (B) TYPB: nucleic acid : (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear t· V · (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotic . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21: * ! *
CAAAATAAAA AAGATACAAC CCGGGTCTCT CGTATCTTTT AT
(ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotic 109 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22:
CCTTTAATTA ACCTTGGCGG CCGCTCGAGG AGCT
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 23: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: nucleic acid (synthetic oligonucleotic (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23:
CCTCGAGCGG CCGCCAAGGT TAATTAAAGG
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 200 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (v) FRAGMENT TYPE : internal fragment .*;· (vi) ORIGINAL SOURCE: V : (A) ORGANISM: Bacillus pumilus .V, <B) STRAIN: PRL B12 • · « • « * S V (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24: !*·*
! Glu Thr lie Tyr Asp Asn Arg lie Gly Thr His Ser Gly Tyr Asp I
.:. is ίο is » • · e e
Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly Asn Thr Ser Met Thr Leu Asn Asn G
V * 20 25 30
Gly Ala Phe Ser Ala Ser Trp Asn Asn lie Gly Asn Ala Leu Phe A
: ·*. 35 40 45 ♦ · · ·** «
·**". Lys Gly Lys Lys Phe Asp Ser Thr Lys Thr His His Gin Leu Gly A
··** 50 55 60
Vai Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly S
100 105 110 110
Phe Tyr Ala Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu Arg M 115 120 125
Asn Gin Pro Ser Ile Ile Gly Asp Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp S 130 135 140
Vai Arg Gin Thr Lys Arg Thr Ser Gly Thr Vai Ser Vai Ser Glu H
145 150 155 1
Phe Lys Lys Trp Glu Ser Leu Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr G
165 170 175
Thr Ala Leu Thr Vai Glu Gly Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Ala Asn V 180 185 190
Met Thr Asn Gin Leu Met Ile Arg 195 200 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 25: {i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 amino acids (6) ΤϊΡΕ: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (v) FRAGMENT TYPE : internal fragment (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Bacillus pumilua (B) STRAIN; PRL B12
• «I
V ; .V, (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 25: « · · « *
I·.·, Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile Glv P
: .* -25 -20 -15 **·* • Val Leu Thr Leu Thr Ala Val Pro Ala His Ala .:. -ίο -s ...: : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 26: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: : .'. (A) LENGTH: 600 base pairs · (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ’···· (D) TOPOLOGY: linear
Ill (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26:
GAAACGÄTTT ATGATAATAG GATAGGGACA CACAGCGGAT ACGATTTTGA ATTATG GATTACGGAA ATACCTCGAT GACACTCAAT AACGGCGGGG CATTTAGTGC AAGCTG AATATTGGAA ATGCCTTATT TCGAAAAGGA AAGAAGTTTG ATTCCACTAA AACTCA CAACTTGGCA ACATCTCCAT CAACTACAAC GCAGCCTTTA ACCCGGGCGG GAATTC TTATGTGTCT ATGGCTGGAC ACAATCTCCA TTAGCTGAAT ACTACATTGT TGAGTC GGCACATATC GTCCAACAGG AACGTATAAA GGATCATTTT ATGCCGATGG AGGCAC GACATATATG AAACGCTCCG TGTCAATCAG CCTTCTATCA TTGGAGACGC TACCTT CAATATTGGA GTGTACGTCA AACAAAACGC ACAAGCGGAA CGGTCTCCGT CAGTGA TTTAAAAAAT GGGAAAGCIT AGGCATGCCA ATGGGAAAAA TGTATGAAAC AGCATT GTAGAAGGCT ACCGAAGCAA CGGAAGTGCG AATGTCATGA CGAATCAGCT GATGAT
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 27: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 61 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE : genomic DNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27:
ATGAATTTGA AAAGATTGAG GCTGTTGTTT GTGATGTGTA TTGGATTTGT GCTGAC ACGGCTGTGC CGGCTCATGC G
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 28: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 185 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ·«·
V * (ii) MOLECULE TYPE : genomic DNA
* * \V (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26: ·· *
ί TCATGTAACT CGCCTTGATC TATTTCATTT GTATCAAAGG ATTTATACAC AAACAA
;·,· CATCCATGCC GGGTTAAAGC AGTATCGTTC CATCTAACAG AGAAGGNCTG CATGAA
; GGTGATGGGT TTTTCATCTT AGGGATGACA GAACAATACG GATGAAAAAA GGAGAG
.·, GGAAA
··· ! (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 29: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: : .·. (A) LENGTH: 156 base pairs ί·ϊ : (B) TYPE: nucleic acid .*··. (C) STRANDEDNESS: single *___· ΤΠΟΛΤΛϊν . Ί-ίι-ΐΗν (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 30: 112 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 681 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30:
ATGAATTTGA AAAGATTGAG GCTGTTGTTT GTGATGTGTA TTGGATTTGT GCTGAC ACGGCTGTGC CGGCTCATGC GGAAACGATT TATGATAATA GGATAGGGAC ACACAG TACGATTTTG AATTATGGAA GGATTACGGA AATACCTCGA TGACACTCAA TAACGG GCATTTAGTG CAAGCTGGAA CAATATTGGA AATGCCTTAT TTCGAAAAGG AAAGA2 GATTCCACTA AAACTCATCA TCAACITGGC AACATCTCCA TCAACTACAA CGCAGC aacccgggog ggaattccta TTTATGTGTC TATGGCTGGA CACAATCTCC attagc TACTACATTG TTGAGTCATG GGGCACATAT CGTCCAACAG GAACGTATAA AGGATC TATGCOGATG GAGGCACATA TGACATATAT GAAACGCTCC GTGTCAATCA GCCTTC ATTGGAGACG CTACCTTCAA ACAATATTGG AGTGTACGTC AAACAAAACG CACAAG ACGGTCTCCG TCAGTGAGCA TTTTAAAAAA TGGGAAAGCT TA0GCATGCC AATGGG ATGTATGAAA CAGCATTAAC TGTAGAAGGC TACCGAAGCA ACGGAAGTGC GAATG1 ACGAATCAGC TGATGATTCG A
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 31: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: {A) LENGTH: 227 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein <Λβ (v) FRAGMENT TYPE: internal fragment * * Y/ (vi) ORIGINAL SOURCE: ; (A) ORGANISM: Bacillus pumilus '1 l (B) STRAIN: PRL B12
• * I
• ft • ft Τ’*! (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 31:
4l* Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile Gly P
*::: -25 -20 -is • · ♦ • > #
Val Leu Thr Leu Thr Ala Val Pro Ala His Ala Glu Thr lie Tyr a -10 -5 1
•J · Asn Arg lie Gly Thr His Ser Gly Tyr Asp Phe Glu Leu Trp Lys A
*1·· 10 15 20 m » 113
Asn Ala Ala Phe Asn Pro Gly Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Vai Tyr G! 70 7S SO I
Trp Thr Gin Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr Ile Vai Glu Ser Trp G! 90 95 100
Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Ser Phe Tyr Ala Asp g: 105 110 115
Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu Arg Vai Asn Gin Pro Ser i! 120 125 130
Ile Gly Asp Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Vai Arg Gin Thr L 135 140 145
Arg Thr Ser Gly Thr Vai Ser Vai Ser Glu Hi s Phe Lys Lys Trp G! 150 155 160 1'
Ser Leu Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu Thr Ala Leu Thr V 170 175 180
Glu Gly Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Ala Asn Vai Met Thr Asn Gin Li 185 190 195
Met Ile Arg 200 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 32: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 681 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA
:T: (vi) ORIGINAL SOURCE: ; . (A) ORGANISM: Bacillus pumilus ::: (b) strain: prl B12 * · ·· · « * « • · I. * (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 32: * * · •
* ATG AAT TTG AAA AGA TTG AGG CTG TTG TTT GTG ATG TGT ATT GGA T
./·* Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile Gly P] .λ -25 -20 -15 • « β # · · GTG CTG ACA CTG ACG GCT GTG CCG GCT CAT GCG GAA ACG ATT TAT G;
Val Leu Thr Leu Thr Ala Val Pro Ala His Ala Glu Thr lie Tyr A
* . -10 -5 1 e · » • · e
*··/ AAT AGG ATA GGG ACA CAC AGC GGA TAC GAT TTT GAA TTA TGG AAG GJ
114
GAT TCC ACT AAA ACT CAT CAT CAA CTT GGC AAC ATC TCC ATC AAC T
Asp Ser Thr Lys Thr His His Gin Leu Gly Asn Ile Ser Ile Asn T
55 €0 £5
AAC GCA GCC TTT AAC CCG GGC GGG AAT TCC TAT TTA TGT GTC TAT G
Asn Ala Ala Phe Asn Pro Gly Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Vai Tyr G
70 75 80
TGG ACA CAA TCT CCA TTA GCT GAA TAC TAC ATT GTT GAG TCA TGG G
Trp Thr Gin Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr Ile Vai Glu Ser Trp G
90 95 100
ACA TAT CGT CCA ACA GGA ACG TAT AAA GGA TCA TTT TAT GCC GAT G
Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lye Gly Ser Phe Tyr Ala Asp G
105 110 115
GGC ACA TAT GAC ATA TAT GAA ACG CTC CGT GTC AAT CAG CCT TCT A
Gly Thr Tyr Asp He Tyr Glu Thr Leu Arg Val Asn Gin Pro Ser I
120 125 130
ATT GGA GAC GCT ACC TTC AAA CAA TAT TGG AGT GTA CGT CAA ACA A
Ile Gly Asp Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Vai Arg Gin Thr L
135 140 145
CGC ACA AGC GGA ACG GTC TCC GTC AGT GAG CAT TTT AAA AAA TGG G
Arg Thr Ser Gly Thr Val Ser Val Ser Glu His Phe Lys Lys Trp G
150 155 160 1
AGC TTA GGC ATG CCA ATG GGA AAA ATG TAT GAA ACA GCA TTA ACT G
Ser Leu Gly Het Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu Thr Ala Leu Thr V
170 175 180
GAA GGC TAC CGA AGC AAC GGA AGT GOG AAT GTC ATG ACG AAT CAG C
Glu Gly Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Ala Asn Val Met Thr Asn Gin L· 185 190 195 ATG ATT CGA Met He Arg ::: 200 a a a a a m .11 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 33: * a a I (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ; (A) LENGTH: 81 base pairs , (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ... (D) TOPOLOGY: linear » · a a a a
ΐii) MOLECULE TYPE: genomic DNA
. . (vi) ORIGINAL SOURCE: : (A) ORGANISM: Bacillus pumilus (B) STRAIN: PRL B12 . : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 34: 115 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 600 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Bacillus pumilus (B) STRAIN: PRL B12 <xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 34:'
GAA ACG AIT TAT GAT AAT AGG ATA GGG ACA CAC AGC GGA TAC GAT T
Glu Thr Ile Tyr Asp Asn Arg He Gly Thr His Ser Gly Tyr Asp P] 1 5 10 15
GAA TTA TGG AAG GAT TAC GGA AAT ACC TCG ATG ACA CTC AAT AAC G
Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly Asn Thr Ser Met Thr Leu Asn Asn G! 20 25 30
GGG GCA TTT AGT GCA AGC TGG AAC AAT ATT GGA AAT GCC TTA TTT O
Gly Ala Phe Ser Ala Ser Trp Asn Asn He Gly Asn Ala Leu Phe A
35 40 45
AAA GGA AAG AAG TTT GAT TCC ACT AAA ACT CAT CAT CAA CTT GGC A
Lys Gly Lys Lys Phe Asp Ser Thr Lys Thr His His Gin Leu Gly Ai 50 55 60
ATC TCC ATC AAC TAC AAC GCA GCC TTT AAC CCG GGC GGG AAT TCC TJ
He Ser He Asn Tyr Asn Ala Ala Phe Asn Pro Gly Gly Asn Ser T
65 70 75 i V ; TTA TGT GTC TAT GGC TGG ACA CAA TCT CCA TTA GCT GAA TAC TAC A' ,V. Leu °Υ8 Val TVr Gly Trp Thr Gin Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr i: \V 85 90 95 »* * i GTT GAG TCA TGG GGC ACA TAT CGT CCA ACA GGA ACG TAT AAA GGA Tl !V. Val Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly St : .* 100 105 110 * ...: TTT TAT GCC GAT GGA GGC ACA TAT GAC ATA TAT GAA ACG CTC CGT G' *·:·. Phe Tyr Ala Asp Gly Gly Thr Tyr Asp He Tyr Glu Thr Leu Arg Vi V ’ 115 120 125 AAT CAG CCT TCT ATC ATT GGA GAC GCT ACC TTC AAA CAA TAT TGG All : Asn Gin Pro Ser He He Gly Asp Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp S< :.:: no 135 140 ·#· • *
**·*' GTA CGT CAA ACA AAA CGC ACA AGC GGA ACG GTC TCC GTC AGT GAG CJ
116 ACA GCA TTA ACT GTA GAA GGC TAC CGA AGC AAC GGA AGT GCG AAT C Thr Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Ala Asn ^ 180 185 190 ATG ACG AAT CAG CTG ATG ATT CGA Met Thr Asn Gin Leu Met lie Arg 195 200 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 35: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1022 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: genomic DNA
{xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 35:
TCATGTAACT CGCCTTGATC TATTTCATTT GTATCAAAGG ATTTATACAC AAACAi CATCCATGCC GGGTTAAAGC AGTATCGTTC CATCTAACAG AGAAGGNCTG CATGAi GGTGATGGGT TTTTCATCTT AGGGATGACA GAACAATACG GATGAAAAAA GGAGAG GGAAAATGAA TTTGAAAAGA TTGAGGCTGT TGTTTGTGAT GTGTATTGGA TTTGTG CACTGACGGC TGTGCCGGCT CATGCGGAAA CGATTTATGA TAATAGGATA GGGAC? GCGGATACGA TTTTGAATTA TGGAAGGATT ACGGAAATAC CTCGATGACA CTCAAI GCGGGGCATT TAGTGCAAGC TGGAACAATA TTGGAAATGC CITATTTCGA AAAGGi AGTTTGATTC CACTAAAACT CATCATCAAC TTGGCAACAT CTCCATCAAC TACAAC CCTTTAACCC GGGCGGGAAT TCCTATTTAT GTGTCTATGG CTGGACACAA TCTCCi CTGAATACTA CATTGTTGAG TCATGGGGCA CATATCGTCC AACAGGAACG TATAAi CATTTTATGC CGATGGAGGC ACATATGACA TATATGAAAC GCTCCGTGTC AATCAG CTATCATTGG AGACGCTACC TTCAAACAAT ATTGGAGTGT ACGTCAAACA AAACGC GCGGAACGGT CTCCGTCAGT GAGCATTTTA AAAAATGGGA AAGCTTAGGC ATGCC? GAAAAATGTA TGAAACAGCA TTAACTGTAG AAGGCTACCG AAGCAACGGA AGTGCG TCATGACGAA TCAGCTGATG ATTCGATAAA AGCATATGAA AAAAGCCAGC AAAAAi TGGCTTTTTT CTATGATAAT TTTTCAACTT CCACTCTGCC AGAAAAGAAC GTCGCG CTCCCATATC TGCCAATCGA TCAGGTGTTA ACCCATTCAC TAAATGCTTT TTGCCI
: Γ: ga • · • · e • · I • * 4 4 · i * : • 4 44 a 4 4# 4 · B 4 4 444 4 4*4 4 4 44 4 4 # 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 444 4 444 4 4

Claims (19)

1. Puhdistettu ksylanaasi, t u n n e t t ta, että sillä on sekvenssin tunnusnumero 24 mukai 5 nohapposekvenssi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen puhdiste lanaasi, tunnettu siitä, että se lisäksi johtosekvenssin, jolla on sekvenssin tunnusnumerc kainen aminohapposekvenssi.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen k si, tunnettu siitä, että se on peräisin pumilus PRL B12 -kannasta.
4. Menetelmä ksylanaasin tuottamiseksi B lajissa, tunnettu siitä, että transformoi 15 cillus-laji nukleotidisekvenssillä, joka koodaa k siä, joka käsittää sekvenssin tunnusnumero 24 aminohapposekvenssin, viljellään Bacillus-lajia s olosuhteissa ksylanaasin ilmentämiseksi ja otetaan ksylanaasi viljelmästä.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen me tunnettu siitä, että Bacillus on Bacillus ·***· V * formiksen transformoitu kanta. • · :,V 6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen me ·* · • tunnettu siitä, että ksylanaasi on peräisi j*·*· 25 lus pumilus PRL B12:sta ja sitä tuottaa heterol ··· suvun Bacillus mikro-organismi, jossa on luonnoss tyvä alkalista proteaasia koodittava geeni.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen me • tunnettu siitä, että mikro-organismista < 30 tettu luonnossa esiintyvä alkalista proteaasia ko • * **·* geeni. 118
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen DNA-mo tunnettu siitä, että nukleotidisekvenssi kypsää ksylanaasia, jolla on sekvenssin tunnusni; mukainen aminohapposekvenssi.
10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen D kyyli, tunnettu siitä, että se lisäksi B. pumilus PRL B12:n ksylanaasin esisekvenssiä k sekvenssin tunnusnumero 27 mukaisen nukleotidisekv<
11. Jonkin patenttivaatimuksen 8-10 mukai: 10 molekyyli, tunnettu siitä, että se lisäks tää B. pumilus PRL Bl2:n ksylanaasigeenin edellä nukleotidisekvenssejä, kuten sekvenssissä tunnusm esitetään.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen DNA-mo 15 tunnettu siitä, että se käsittää B. pum. B12:n eristetyn ksylanaasigeenin, jolla on sekven: nusnumero 1.
13. Ilmentämisvektori, tunnettu että se sisältää jonkin patenttivaatimuksen 8-1; 20 sen DNA-molekyylin.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen ilment ·*·* V : tori, tunnettu siitä, että se on kuvion • · V,! nen ilmentämisvektori pUB-BPXl2. Γ·*: 15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen ilment ·*·"· 25 tori, tunnettu siitä, että se on kuvion * * nen ilmentämisvektori pUBDEBRAl.
16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen ilment *·* * tori, tunnettu siitä, että se on kuvion . . nen ilmentämisvektori pKACl. *·* * 30 17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen ilment ··· « * >··* tori, tunnettu siitä, että se on kuvion 119
19. Patenttivaatimuksen 13 mukainen ilment tori, tunnettu siitä, että se on kuvion nen ilmentämisvektori pL7TAKA.
20. Bacillus licheniformis, t u n n e t t 5 tä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 1 sella ilmentämisvektorilla.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen licheniformis, tunnettu siitä, että se o formoitu patenttivaatimuksen 9 mukaisella D 10 kyylillä, ja siitä on poistettu alkalista proteaa daava DNA-sekvenssi.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen licheniformis, tunnettu siitä, että se o lus licheniformis SE2, LGM P-14034, ja sen mutanti 15 riatit.
23. Menetelmä lignoselluloosapitoisen mai sittelemiseksi, tunnettu siitä, että puuni sitellään jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaise lanaasilla.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen me tunnettu siitä, että menetelmä käsittää 1 • •Φ V * luloosapitoisen massan esikäsittelyn ksylanaasilla f · « « « • · m * · »» · * * « * » • 9 • I · • · * • « • # I»· ··* ««· • · · • · · • « • I · • Φ · ··· · 4*··. ·...· 120
FI943389A 1993-07-15 1994-07-15 Bacillus-lajista saatu ksylanaasi, tällaisen ksylanaasin ja muiden proteiinien ekspressiovektori, niiden isäntäorganismit ja käyttö FI116848B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9314780 1993-07-15
GB9314780A GB2279955B (en) 1993-07-15 1993-07-15 Xylanase derived from a Bacillus species, expression vectors for such xylanase and other proteins, host organisms therefor and use thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI943389A0 FI943389A0 (fi) 1994-07-15
FI943389A FI943389A (fi) 1995-01-16
FI116848B true FI116848B (fi) 2006-03-15

Family

ID=10738960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI943389A FI116848B (fi) 1993-07-15 1994-07-15 Bacillus-lajista saatu ksylanaasi, tällaisen ksylanaasin ja muiden proteiinien ekspressiovektori, niiden isäntäorganismit ja käyttö

Country Status (13)

Country Link
US (3) US6180382B1 (fi)
EP (1) EP0634490B1 (fi)
JP (1) JPH0767637A (fi)
AU (1) AU687808B2 (fi)
BR (1) BR9402834A (fi)
CA (1) CA2128050C (fi)
DE (1) DE69428238T2 (fi)
DK (1) DK0634490T3 (fi)
FI (1) FI116848B (fi)
GB (1) GB2279955B (fi)
MX (1) MX9405386A (fi)
NO (1) NO942652L (fi)
NZ (1) NZ260989A (fi)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE183236T1 (de) * 1992-12-28 1999-08-15 Genencor Int Pullulanase, mikroorganismen die sie produzieren, verfahren zur herstellung und ihre anwendung
BE1008751A3 (fr) * 1994-07-26 1996-07-02 Solvay Xylanase, microorganismes la produisant, molecules d'adn, procedes de preparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci.
BE1008570A3 (fr) * 1994-07-26 1996-06-04 Solvay Xylanase, microorganismes la produisant, molecule d'adn, procedes de preparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci.
US5888800A (en) * 1995-08-10 1999-03-30 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Expression systems for commercial production of cellulase and xylanase in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis
HUP9900738A2 (hu) * 1995-10-17 1999-06-28 Institut National De La Recherche Agronomique Xilanáz, azt kódoló oligonukleotid-szekvencia és alkalmazásai
US6685748B1 (en) * 1999-12-23 2004-02-03 Genencor International, Inc. Enzymatic bleaching of natural non-cotton cellulosic fibers
US6833259B2 (en) * 2001-03-19 2004-12-21 Council Of Scientific And Industrial Research ‘Pseudomonas stutzeri’ strain and process for preparation of xylanase
ATE522614T1 (de) * 2002-04-10 2011-09-15 Novozymes As Mutierte bacillus licheniformis wirtszelle
WO2003087149A2 (en) * 2002-04-10 2003-10-23 Novozymes A/S Bacillus licheniformis mutant host cell
BRPI0312121B1 (pt) 2002-06-14 2019-10-01 Verenium Corporation Preparação de proteina, polipeptídeo imobilizado e métodos para prepará-los e empregá-los
WO2006047713A2 (en) * 2004-10-27 2006-05-04 Novozymes North America, Inc. Enzymatic-assisted chlorine dioxide treatment
EP1880053B1 (en) * 2005-05-04 2019-07-31 Novozymes North America, Inc. Chlorine dioxide treatment compositions and processes
US7922705B2 (en) * 2005-10-03 2011-04-12 The Procter & Gamble Company Densified fibrous structures and methods for making same
US8969033B2 (en) 2005-11-02 2015-03-03 Battelle Energy Alliance, Llc Alteration and modulation of protein activity by varying post-translational modification
US7727755B2 (en) * 2005-11-02 2010-06-01 Battelle Energy Alliance, Llc Enzyme and methodology for the treatment of a biomass
BRPI0707784B1 (pt) 2006-02-14 2018-05-22 Verenium Corporation Ácido nucléico isolado, sintético ou recombinante, cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, célula hospedeira isolada transformada, e método para produção de um polipeptídeo recombinante
EP2242841A4 (en) 2008-01-25 2011-05-18 Battelle Energy Alliance Llc BETA-XYLOSIDASES TOLERANT TO ACID AND HEAT, GENES ENCODING THESE BETA-XYLOSIDASES, ASSOCIATED ORGANISMS AND METHODS
US8492114B2 (en) 2008-01-25 2013-07-23 Battelle Energy Alliance, Llc Methods of combined bioprocessing and related microorganisms, thermophilic and/or acidophilic enzymes, and nucleic acids encoding said enzymes
US9732330B2 (en) 2008-01-25 2017-08-15 Battelle Energy Alliance, Llc Methods of combined bioprocessing and related microorganisms, thermophilic and/or acidophilic enzymes, and nucleic acids encoding said enzymes
BRPI0908507A2 (pt) 2008-01-31 2020-08-18 Battelle Energy Alliance, Llc genes e enzimas degradadores de biopolímero termoacidofílico e termofílico de alicyclobacillus acidocaldarius e métodos e organismos relacionados
US8497110B2 (en) * 2008-01-31 2013-07-30 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
US8557557B2 (en) * 2008-01-31 2013-10-15 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
US8426185B2 (en) 2008-01-31 2013-04-23 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
CA2712103A1 (en) 2008-02-22 2009-11-12 Battelle Energy Alliance, Llc Transcriptional control in alicyclobacillus acidocaldarius and associated genes, proteins, and methods
CA2712101A1 (en) 2008-02-26 2009-12-03 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic sugar transporter genes and enzymes from alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
CN102046802A (zh) * 2008-02-27 2011-05-04 巴特勒能源同盟有限公司 来自酸热脂环酸杆菌的嗜热的与嗜热嗜酸的糖基化基因和酶以及相关生物、方法
CN102216451A (zh) 2008-02-28 2011-10-12 巴特勒能源同盟有限公司 来自酸热脂环酸杆菌的嗜热的与嗜热嗜酸的代谢基因和酶以及相关生物
WO2010089302A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 University Of Chile Protein and dna sequence encoding a cold adapted xylanase
US20110275135A1 (en) 2010-05-05 2011-11-10 Battelle Energy Alliance, Llc Genetic elements, proteins, and associated methods including application of additional genetic information to gram (+) thermoacidophiles
DE102012201297A1 (de) * 2012-01-31 2013-08-01 Basf Se Expressionsverfahren

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA603953A (en) 1960-08-23 J. Simpson Frederick Preparation of a pentosanase enzyme
US2821501A (en) 1953-12-08 1958-01-28 Ca Nat Research Council Recovery of starch
JPS6075286A (ja) * 1983-09-28 1985-04-27 Hirosuke Okada キシラナ−ゼ遺伝子を有する組み換え体プラスミドおよびそれにより形質転換されたＢａｃｉｌｌｕｓ属菌
US4828994A (en) * 1984-09-21 1989-05-09 Genex Corporation Bacillus strains with reduced extracellular protease levels
DE3821491A1 (de) 1988-06-25 1989-12-28 Henkel Kgaa Hybridplasmide zur erzeugung von subtilisin carlsberg in bacillus
DE3824827A1 (de) 1988-07-21 1990-02-01 Henkel Kgaa Plasmide zur erzeugung von alpha-amylase in bacillus
JP3220137B2 (ja) 1989-08-25 2001-10-22 ヘンケル・リサーチ・コーポレイション アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法
DK420289D0 (da) 1989-08-25 1989-08-25 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til behandling af lignocellulosepulp
IE912582A1 (en) * 1990-07-24 1992-01-29 Gist Brocades Nv Cloning and expression of xylanase genes from fungal origin
NZ239500A (en) * 1990-08-24 1993-08-26 Novo Nordisk As Xylanases obtained from bacillus pumilus and use in a lignocellulosic chemical pulping process
DK30991D0 (da) * 1991-02-22 1991-02-22 Novo Nordisk As Hidtil ukendte enzymer

Also Published As

Publication number Publication date
US6426211B1 (en) 2002-07-30
CA2128050C (en) 2006-12-19
US6180382B1 (en) 2001-01-30
BR9402834A (pt) 1995-06-13
AU687808B2 (en) 1998-03-05
EP0634490B1 (en) 2001-09-12
NO942652L (no) 1995-01-16
DE69428238D1 (de) 2001-10-18
FI943389A0 (fi) 1994-07-15
DE69428238T2 (de) 2002-06-27
JPH0767637A (ja) 1995-03-14
DK0634490T3 (da) 2002-01-14
FI943389A (fi) 1995-01-16
MX9405386A (es) 1995-01-31
NO942652D0 (no) 1994-07-14
GB2279955A (en) 1995-01-18
GB9314780D0 (en) 1993-08-25
CA2128050A1 (en) 1995-01-16
NZ260989A (en) 1995-08-28
US6423523B1 (en) 2002-07-23
AU6743294A (en) 1995-01-27
GB2279955B (en) 1998-02-18
EP0634490A1 (en) 1995-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI116848B (fi) Bacillus-lajista saatu ksylanaasi, tällaisen ksylanaasin ja muiden proteiinien ekspressiovektori, niiden isäntäorganismit ja käyttö
CA2168344C (en) Thermostable xylanases
CN102080070B (zh) 新的内切葡聚糖酶
JPH03503477A (ja) 変異ズブチリシン遺伝子
CA2156048C (en) Alkali-tolerant xylanases
JPH04507346A (ja) アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法
KR19990008130A (ko) 알카리성 셀룰라제 및 이를 제조하는 방법
JPH08224081A (ja) 耐熱性キシラナーゼ
US5202249A (en) Xylanase for biobleaching
JP4472787B2 (ja) 微生物キシログルカン エンドトランスグリコシラーゼ（ｘｅｔ）
US5434071A (en) α-L-arabinofuranosidase and xylanase from Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221, NCIMB 40222 or mutant thereof for delignification
FI118010B (fi) Actinomaduran ksylanaasisekvenssit ja käyttömenetelmät
Page et al. Effect of signal peptide alterations and replacement on export of xylanase A in Streptomyces lividans
EP0698667B1 (fr) Xylanase, microorganismes la produisant, molécules d&#39;ADN, procédés de préparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci
JP2023523925A (ja) 糸状菌細胞におけるタンパク質産生の増強のための組成物及び方法
KR100526662B1 (ko) 자일라나제를 코딩하는 유전자와 그 형질전환체를 이용하여 생산된 재조합 자일라나제
KR100874873B1 (ko) 신규한 자일라네이즈 효소 및 이를 암호화하는 유전자
US6280984B1 (en) DNA constructs and methods of producing cellulytic enzymes
JP3475930B2 (ja) 耐熱性キシラナーゼを有効成分として含む漂白剤
JP2001245665A (ja) アルカリ性キシラナーゼ及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: GENENCOR INTERNATIONAL, INC.

FG Patent granted

Ref document number: 116848

Country of ref document: FI

MA Patent expired