DE69428238T2

DE69428238T2 - Xylanase von einer Bacillus Spezies, Expressionsvektoren für diese Xylanase und andere Proteine, Wirtsorganismus dafür und Verwendungen davon

Info

Publication number: DE69428238T2
Application number: DE69428238T
Authority: DE
Inventors: Antoine Amory; Christophe Andre; Eric De Buyl; Rene Detroz; Andree Lahaya; Pierre Ledoux; Roman Vetter
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1993-07-15
Filing date: 1994-07-11
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2014-07-12
Also published as: US6180382B1; US6426211B1; NO942652L; JPH0767637A; BR9402834A; GB9314780D0; FI116848B; NZ260989A; MX9405386A; EP0634490B1; NO942652D0; DE69428238D1; US6423523B1; AU6743294A; GB2279955A; CA2128050C; FI943389A0; AU687808B2; GB2279955B; DK0634490T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft heterologe Enzyme, die von rekombinanten Stämmen von Bacillus licheniformis produziert werden, und im Speziellen eine von Bacillus pumilus PRL B12 stammende Xylanase, die zur Verwendung beim biologischen Bleichen von Lignocellulose-Pulpe wirksam ist, Expressionsvektoren und rekombinante Bacillus licheniformis-Wirte für die Expression der Xylanase sowie die Verwendung der Xylanase beim biologischen Bleichen von Lignocellulose-Pulpe.
Ein allgemeines Ziel bei der Herstellung von Produkten (wie z. B. Papierprodukten) aus Lignocellulose-Pulpe besteht darin, eine Pulpe bereitzustellen, bei der ein daraus hergestelltes Produkt einen höchstmöglichen End-Weißgrad aufweist. Ein Hauptfaktor, der diesen End-Weißgrad begrenzt, ist die in der Pulpe vorhandene Lignin-Menge.
Lignin in solchen Lignocellulose-Pulpen ist meist in einem Lignocellulose-Komplex mit Hemicellulose gebunden. Ein Haupt-Berührungsfläche zwischen dem Lignin und den übrigen Kohlenhydraten des Lignocellulose-Komplexes wird von Xylan (1,4-β-D-Xylan) gebildet, das daran gebunden ist. Um das Lignin aus der Pulpe zu entfernen, müssen diese Bindungen zunächst aufgebrochen werden.
Üblicherweise werden Lignocellulose-Pulpen, wie z. B. Holzschliff, delignifiziert, indem sie chemisch aufgeschlossen werden. Chemisches Aufschließen ist zwar extrem nützlich für diesen Zweck (bis zu 95% des vorhandenen Lignins kann durch derartiges chemisches Aufschließen daraus entfernt werden), aber mit ihm alleine können keine höheren Prozentsätze erzielt werden, ohne die Kohlenhydrate in der Pulpe stark anzugreifen. Daher muss das Aufschließen unterbrochen werden, bevor der Verlust an Kohlenhydraten zu hoch ist und bevor weitere Delignifizierung aufgetreten ist. Dieses Rest- Lignin verleiht den Cellulosefasern in der Pulpe eine braune Farbe, wodurch verhindert wird, dass das daraus hergestellte Produkt den höchstmöglichen End-Weißgrad aufweist.
Um eine weitere Delignifizierung der Pulpe nach dem chemischen Aufschließen zu erreichen, werden verschiedene "Bleich"-Sequenzen verwendet. Üblicherweise umfassen solche Bleichsequenzen "klassische" (oder herkömmliche) Bleichsequenzen und von elementarem Chlor freie Bleichsequenzen (ECF-Sequenzen). Diese Bleichsequenzen umfassen einen Delignifizierierungsschritt gefolgt von einer Abfolge von Bleichschritten. Im Delignifizierungsschritt wird die Pulpe zunächst einem Chlor- und/oder Chlordioxid- Behandlungsschritt unterzogen, üblicherweise gefolgt von einem Laugenextraktionsschritt.
Obwohl sie wirksam das Entfernen (die "Delignifizierung") beträchtlicher Lignin-Mengen aus der chemisch aufgeschlossenen Pulpe erleichtert, hat die Behandlung der Pulpe dennoch Nachteile. Der vielleicht unangenehmste dieser Nachteile (insbesondere im Fall klassischer Sequenzen) besteht darin, dass ihre Verwendung zur Freisetzung chlorierter Verbindungen führt, die mit der Bildung absorbierbarer organischer Halogenide (AOX) in Zusammenhang gebracht worden sind. Es wird angenommen, dass die AOX- Konzentration in Abwässern direkt mit der Menge an Chlor- und Chlordioxidverbindungen in Zusammenhang stehen, die bei diesem Verfahren eingesetzt werden. Daher werden die AOX-Mengen üblicherweise als Standard in der Industrie verwendet, um den Gehalt an chlorierten organischen Substanzen in den Abwässern der Bleichanlage zu bestimmen. Demgemäß sind Industriezweige wie die Holzzellstoff- und Papierindustrie, die Produkte aus solcher Pulpe herstellen, zunehmend unter Druck gekommen und mit gesetzlichen Auflagen konfrontiert worden, sowohl die AOX-Produktion als auch den Verbrauch von Chlor und Chlordioxid während des Bleichens zu verringern.
Um die AOX-Produktion und den Verbrauch von Cl&sub2; und ClO&sub2; zu verringern oder auszuschalten, während weiterhin eine angemessene Delignifizierung erzielt wird, ist vorgeschlagen worden, verschiedene hemicellulolytische Enzyme einzusetzen, um die Lignocellulose-Pulpe-Delignifizierung zu erleichtern (in einem Verfahren, das üblicherweise als "biologisches Bleichen" bezeichnet wird). Insbesondere ist vorgeschlagen worden, eine große Vielzahl verschiedener Xylanasen zu verwenden, die von einer Bandbreite verschiedener Fungi und Bakterien ausgeschieden werden, einschließlich von Bakterien des Genus Bacillus, um die Pulpe zu behandeln. Diese Versuche waren jedoch je nach den genauen Eigenschaften der Xylanase, die dafür eingesetzt worden ist, unterschiedlich erfolgreich. Um sie erfolgreich bei kommerziellen Bio-Bleichanwendungen einzusetzen, sollte eine Xylanase über einen pH-Bereich wirksam sein, den die Pulpe auf natürliche Weise aufweist, wenn die Xylanase beim biologischen Bleichen eingesetzt wird. Weiters sollte die Xylanase keinerlei verbleibende Cellulase-Aktivität aufweisen.
Beim biologischen Bleichen kann Xylanase der Pulpe zugegeben werden, nachdem sie den chemischen Aufschluss verlassen hat, aber bevor sie chemisch behandelt worden ist. An diesem Punkt hat die Pulpe typischerweise einen pH im Bereich von etwa 7,0 bis 9,5. Die Identifizierung und der Einsatz einer Xylanase, die über diesen alkalischen pH- Bereich wirksam ist, würde das Ausmaß an Kontrolle, die über diesen Aspekt der Verfahrensbedingungen ausgeübt werden muss, stark verringern, und auch die Menge an Chlor und reaktiven Oxidationsmitteln verringern, die erforderlich sind, um die chemisch aufgeschlossene Pulpe chemisch zu behandeln.
Es ist seit einigen Jahren bekannt, dass Mikroorganismen der Spezies Bacillus pumilus extrazelluläre Xylanasen ausscheiden. Tatsächlich wurde schon 1960 offenbart, dass das Kulturmedium von B. pumilus Xylanasen enthält, die diese Kulturbrühe für Nahrungsmittelverarbeitungsanwendungen nützlich machen (siehe die kanadische Patentschrift Nr. 603.953 und US-Patent Nr. 2.821.501). Allerdings wird in diesen Patenten an keiner Stelle offenbart, gelehrt oder vorgeschlagen, die Enzyme (einschließlich der Xylanasen) aus der Kulturbrühe zu isolieren und/oder zu reinigen, in die sie ausgeschieden werden. Weiters wurde darin berichtet, dass bei pH-Werten über 8 diese Xylanasen im Allgemeinen inaktiviert werden.
Soweit den Erfindern des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes bekannt ist, ist nur die Xylanase von zwei Stämmen von Bacillus pumilus isoliert und/oder gereinigt worden: Bacillus pumilus IPO und Bacillus pumilus DSM 6124. Es ist jedoch nicht angegeben, ob die Xylanase von B. pumilus PRL B12 potentielle Nützlichkeit in Bio-Bleichanwendungen hätte.
Nur eine Xylanase von jeglichen Stämmen von B. pumilus ist jemals zur Verwendung beim Bio-Bleichen vorgeschlagen worden, und diese Xylanase stammt von einer speziell konstruierten Mutante - B. pumilus DSM 6124. Die Isolierung und Reinigung der von B. pumilus DSM 6124 ausgeschiedenen Xylanase sowie ihre Verwendung beim Bio-Bleichen wird in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 91/02839 und der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 92/03540 offenbart. Wie darin berichtet, weist die Xylanase von Stamm DSM 6124 jedoch einen optimalen pH-Wert von nur 5 bis 7 auf und scheint für die Delignifizierung von Pulpen mit pH-Werten von bis zu nur etwa 8,5 begrenzt wirksam zu sein.
Das Vorhandensein von extrazellulären Xylanasen, die von Bacillus pumilus PRL B12 und B. pumilus PRL B92 ausgeschieden werden, in der Kulturbrühe ist ebenfalls seit langem bekannt und wurde schon 1954 berichtet (1). Darin wurde weiters berichtet, dass, wenn sie im Milieu der Kulturbrühe vorliegt, die Xylanase von B. pumilus B12 bis zu einem pH von 11 stabil ist. Allerdings wird in diesem Dokument an keiner Stelle offenbart, gelehrt oder vorgeschlagen, die Xylanase aus der Kulturbrühe zu isolieren und/oder zu reinigen, in die sie ausgeschieden worden ist, und es gibt in (1) auch keinerlei Hinweis darauf, welche physikalischen Eigenschaften eine solche isolierte und/oder gereinigte Xylanase aufweist, wenn sie nicht im Milieu der Kulturbrühe vorliegt. Weiters sind diese Xylanasen nie für die Verwendung beim Bio-Bleichen chemischer Pulpe vorgeschlagen worden.
Es ist bekannt dass Xylanasen, wenn sie sich in der Kulturbrühe befinden, in die sie ausgeschieden werden, oft mit anderen Enzymen verunreinigt sind. Das kann die Isolierung und Reinigung der Xylanase schwierig und kostspielig machen. Das ist insofern von besonderer Bedeutung, als es in (1) keine Information darüber gibt, ob diese Xylanasen jemals isoliert und/oder gereinigt worden sind oder das jemals getan werden könnte, und es in (1) auch keine Information darüber gibt, wie schwierig oder erfolgreich eine solche Aufgabe erwartungsgemäß sein könnte.
Weiters ist bekannt, dass die Verunreinigung der Xylanase durch andere Enzyme in der Kulturbrühe die offensichtlichen physikalischen Eigenschaften der Xylanase beeinträchtigen kann, einschließlich ihrer Effizienz über unterschiedliche pH-Bereiche. Dieser Aspekt ist im Lichte der Tatsache, dass Xylanasen eine große Vielzahl von Eigenschaften aufweisen, selbst wenn sie von stark homologen Mikroorganismen des gleichen Genus ausgeschieden werden, von besonderer Bedeutung.
Daraus ist zu erkennen, dass es immer noch notwendig ist, eine isolierte und/oder gereinigte Xylanase zu lokalisieren und bereitzustellen, die für die Delignifizierung von Lignocellulose-Pulpe mit einem pH im alkalischen Bereich von 7 bis 9,5 wirksam ist, um für die Vorbehandlung von Lignocellulose-Pulpe nützlich zu sein, indem die Delignifizierung der Lignocellulose-Pulpe vor ihrem Bleichen erleichtert wird. Auf diese Weise ermöglicht die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung eine Reduktion der Menge an Chlor, Chlordioxid und/oder anderen reaktiven Oxidationsmitteln, die in den Bleichsequenzen eingesetzt werden müssen, um die Lignocellulose-Pulpe chemisch zu behandeln, sowie eine Reduktion der Produktion von AOX-Verbindungen, um immer noch eine Lignocellulose-Pulpe bereitzustellen, die einen annehmbar niedrigen Lignin-Gehalt (wie durch den κ-Index der Pulpe gemessen) aufweist.
Es ist weiters wünschenswert, einen Wirt für die Expression verschiedener Enzyme, wie z. B. Xylanase, in guten Ausbeuten bereitzustellen. In diesem Zusammenhang ist festzustellen, dass, wenn die Enzymausbeute aus dem Wirtsorganismus zu niedrig ist, die Enzymproduktion ineffizient und zu teuer ist.
B. pumilus-Stämme werden zwar oft als Überproduzenten von Xylanase genannt, die von ihnen erhaltenen Ausbeuten sind jedoch trotzdem zu niedrig, um ihre Verwendung in industriellen Anwendungen zu ermöglichen.
Um eine Zunahme der Ausbeute an B.pumilus-Xylanase zu erreichen, ist vorgeschlagen worden, das bzw. die Xylanase-Gen(e) aus Bacillus pumilus IPO in kompatible Wirte zu klonieren, um die heterologe Expression der Xylanase in erhöhten Ausbeuten aus den transformierten Wirten zu erzielen. Die Expression der Xylan-abbauenden Gene von Bacillus pumilus IPO in Spezies von Escherichia coli, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae ist offenbart worden. Den Erfindern des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes ist jedoch keine Offenbarung der Nützlichkeit dieser transformierten Wirte für industrielle Anwendungen bekannt.
Ungeachtet der obigen Dokumente ist es dennoch weiterhin wünschenswert, geeignete Wirte zu identifizieren und herzustellen, die stabil sind, in kommerziellen Anwendungen eingesetzt werden können und Xylanase, und insbesondere Xylanase, die von B. pumilus PRL B12 stammt, in geeigneten Ausbeuten extrazellulär ausscheiden können.
Fuhsaki et al. (FEBS 171 (2), 197-201 (1984)) offenbaren die vollständigen Nukleotidsequenzen des Xylanase-Gens von Bacillus pumilus IPO. Die JP-60075286 offenbart die Transformation von Bacillus subtilis MI 111 mit einem Xylanase-Gen von Bacillus IPO.
Stämme von Bacillus licheniformis werden routinemäßig in großangelegtem industriellem Maßstab als Wirte für die heterologe extrazelluläre Expression verschiedener neutraler und saurer Enzyme (hauptsächlich Proteasen und α-Amylasen) verwendet.
Es ist zwar mit Erfolg gelungen, die heterologe Expression dieser oben genannten neutralen und sauren Enzyme zu erreichen, aber die Verwendung der Stämme von B. licheniformis für die heterologe Produktion von Enzymen, wie z. B. Xylanase, unter alkalischen Bedingungen weist aber dennoch mehrere Nachteile auf. Einer dieser Nachteile besteht darin, dass B. licheniformis ein Produzent von Alkalischen Proteasen ist, die Xylanasen und andere Enzyme unter alkalischen Bedingungen abbauen können. Ein solches Merkmal stellt einen offensichtlichen Nachteil dar und ist für die Verwendung von B. licheniformis als Wirt für die Sekretion einer Xylanase kennzeichnend. Weiters gibt es, selbst wenn die vorgeschlagenen Deletionen der Alkalischen Proteasen durchgeführt werden, keine Erfolgsgarantie, insbesondere im Lichte der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 91/02792, worin berichtet worden ist, dass das Vorhandensein auch nur eines Teils eines Protease-Gens eine Reduktion der Produktivität heterologer Enzyme durch den Stamm verursachen kann. Demgemäß ist, soweit den Erfindern des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes bekannt ist, die Verwendung von Stämmen von Bacillus licheniformis für die heterologe Expression von Xylanase noch von niemandem vorgeschlagen worden.
Daher ist zu erkennen, dass weiter Bedarf daran besteht, einen stabilen Wirt bereitzustellen, der zur Expression einer solchen Xylanase in hohen Ausbeuten fähig ist.
Gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung wird eine gereinigte Xylanase offenbart, die die in Seq.-ID Nr. 24 dargelegte Aminosäuresequenz und gegebenenfalls die in Seq.-ID Nr. 25 dargelegte Leadersequenz aufweist. Diese Xylanase besteht im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz der mit 1 bis 200 nummerierten Aminosäuren aus den Fig. 1a und 1b sowie Mutanten und Varianten dieser Aminosäuresequenz. Diese Xylanase ist wirksam, um die Delignifizierung von Pulpe mit einem vorzugsweise im Bereich von 7,0 bis 9,5 liegenden pH zu erleichtern.
Die hierin offenbarte gereinigte Xylanase weist ein Molekulargewicht von etwa 26 kDa, wie nach einem SDS-PAGE-Gel-Elektrophoreseverfahren wie hierin definiert, ermittelt, und ein Molekulargewicht von etwa 22.500 Kilodalton (genauer angegeben etwa 22.534 kD) auf, wie durch ein Ableitungsverfahren, wie hierin definiert, von der Aminosäuresequenz der reifen Xylanase abgeleitet.
Schließlich ist anzumerken, dass die hierin offenbarte gereinigte Xylanase für die Bio- Bleichung von Lignocellulose-Pulpe eine optimale xylanolytische Aktivität von etwa 7,5 bis 8,5 aufweist, wie anhand des κ-Index von in einem gemäß vorliegender Erfindung definierten Verfahren behandelter Lignocellulose-Pulpe gemessen.
Mit dem Begriff "wie gemäß vorliegender Erfindung definiert" ist gemeint, dass das Verfahren in den verschiedenen nachstehend angeführten Beispielen definiert ist.
Mit dem Begriff "stammend von" sind in Zusammenhang mit B. pumilus PRL B12 und der bzw. den hierin offenbarten Xylanase und Nukleotidsequenzen die Xylanase und die Nukleotidsequenzen gemeint, die für B. pumilus PRL B12 nativ sind (oder mit jener Xylanase bzw. jenen Nukleotidsequenzen identisch sind, die dazu nativ ist bzw. sind).
Weiters wird gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung hierin eine Xylanase offenbart, die heterolog durch einen Mikroorganismus des Genus Bacillus jenes Typs produziert wird, der ein natürlich vorkommendes Alkalische Protease-Gen aufweist, und davon erhalten wird. Vorzugsweise sind solche Wirte aerob. Weiters bevorzugt sind solche Wirte nicht thermophil. Beispiele für solche Wirte sind Mikroorganismen der Spezies Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis. Andere Beispiele sind Mikroorganismen der Spezies Bacillus alkalophilus, Bacillus lentus und Bacillus amyloliquefaciens. Weiters bevorzugt wird diese Xylanase heterolog durch einen solchen Mikroorganismus produziert, aus dem das Alkalische Protease-Gen deletiert worden ist, wie z. B. S. Licheniformis SE2 delap1, B. licheniformis SE2 delap3, B. licheniformis SE2 delap6 und B. subtilis 5E3, und davon erhalten: Noch mehr bevorzugt wird die Xylanase von Stämmen solcher Mikroorganismen heterolog exprimiert und erhalten, die transformiert worden sind, um die Xylanase-Kodierungssequenz (und vorzugsweise das gesamte Xylanase- Gen) von B. pumilus PRL B12 zu enthalten, so dass die Xylanase dadurch exprimiert werden kann.
Alternativ dazu wird hierin eine Xylanase offenbart, die von einem Stamm von Bacillus pumilus erhalten wird, wie z. B. B. pumilus PRL B12.
Weiters wird gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung hierin ein Verfahren zur Herstellung einer Xylanase in einer Bacillus-Spezies offenbart. Das Verfahren umfasst das Transformieren eines geeigneten Stamms eines Bacillus mit einer Nukleotidsequenz, die für zumindest den reifen Abschnitt der Xylanase (Seq.-ID Nr. 34) kodiert. Auf diese Weise wird ein Bacillus gebildet, der eine vollständige Xylanase-Gen-Expressionseinheit aufweist. Der Bacillus wird dann unter geeigneten Bedingungen für die Expression von Xylanase kultiviert. Schließlich umfasst das offenbarte Verfahren die Gewinnung der Xylanase aus der Kultur. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Bacillus Bacillus licheniformis. Weiters wird bevorzugt, dass die Nukleotidsequenz von Bacillus pumilus PRL B12 stammt.
Noch weiter ist gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung das Gen (DNA-Molekül), das für die Xylanase von B. pumilus PRL B12 kodiert, davon isoliert und gereinigt worden. In diesem Zusammenhang wird die Nukleotidsequenz des gesamten Xylanase- Gens von B. pumilus PRL B12 offenbart. Diese Nukleotidsequenzen umfassen jene Nukleotide, die für die reife Xylanase kodieren, sowie jene Nukleotide, die für die Vorläufer-Xylanase (Seq.-ID Nr. 31) von B. pumilus PRL B12 (Seq.-ID Nr. 32) kodieren. Diese Nukleotidsequenz umfasst weiters Promotoren des Gens sowie stromauf und stromab gelegene Nukleotidsequenzen.
Weiters werden gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung hierin geeignete Expressionsvektoren offenbart. Ein bevorzugter Expressionsvektor, der als eine Komponente die Nukleotidsequenz aufweist, die für die reife Xylanase kodiert, ebenso wie Verfahren zu seiner Herstellung werden offenbart. Alternativ dazu kann dieser Expressionsvektor weiters die Nukleotidsequenzen (Seq.-ID Nr. 30) umfassen, die für die Vorläufer-Xylanase kodieren. Falls gewünscht können auch die stromauf und/oder stromab gelegenen Kodierungssequenzen des Xylanase-Gens enthalten sein. Am meisten bevorzugt umfasst dieser Expressionsvektor das gesamte in den Fig. 1a und 1b gezeigte Xylanase-Gen (Seq.-ID Nr. 35). Dieser am meisten bevorzugte Expressionsvektor ist pUB-BPX12.
Andere hierin offenbarte Expressionsvektoren sind pUBDEBRA1, pKAC1, pLI1, pL7SBT, pL7TAKA, die jeweils für verschiedene andere Proteine kodieren, so dass deren heterologe Expression durch die hierin offenbarten Expressionsvektoren ermöglicht wird.
Weiters sind gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung geeignete Wirte identifiziert und Verfahren für ihre Herstellung offenbart worden. Die Wirte sind stabil, können unter verschiedenen Verfahrensbedingungen effizient arbeiten und sind zur heterologen Produktion von Enzymen, einschließlich Xylanase, die von B. pumilus PRL B12 stammt, in guten Ausbeuten fähig. Vorzugsweise umfassen diese Wirte (biologisch reine Kulturen von) Stämme(n) von Bacillus licheniformis und insbesondere den Stamm, der hierin als B. licheniformis SE2 delap1 bezeichnet wird und Mutanten und Varianten davon, wie z. B. den hierin als B. licheniformis SE2 delap3 bezeichneten Stamm und Mutanten und Varianten davon sowie den als B. licheniformis S32 delap6 bezeichneten Stamm und Mutanten und Varianten davon. Hierin offenbart werden auch Verfahren zur Herstellung solcher Stämme von B. licheniformis durch die Durchführung chromosomaler Deletionen des Gens bzw. der Gene davon, das bzw. die für Alkalische Protease kodiert bzw. kodieren. In Diesem Zusammenhang werden gemäß vorliegender Erfindung auch die Deletionsplasmide LD1, LD3 und LD6 sowie Verfahren zu deren Konstruktion offenbart.
Weiters wird gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung hierin die Verwendung der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung als eine Behandlung für die Bio-Bleichung von Lignocellulose-Pulpe, wie z. B. Kraft-Holzzellstoff, offenbart. Vorzugsweise kann die Xylanase als Vorbehandlung in Verbindung mit traditionellen Bleichsequenzen eingesetzt werden. Im Speziellen wird die Verwendung der Xylanase als Vorbehandlung für klassische Bleichsequenzen des Typs CEDPD und C/DEDPD offenbart, wie diese Sequenzen hierin definiert sind. Außerdem wird im Speziellen die Verwendung der Xylanase als Vorbehandlung in Verbindung mit von elementarem Chlor freien Sequenzen vom Typ DEDPD offenbart, wie diese Sequenzen hierin definiert sind.
Weiters wird gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung die Verwendung der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung hierin beim Bio-Bleichen von Lignocellulose-Pulpe in vollständig chlorfreien Sequenzen (TCF-Sequenzen) offenbart, im Speziellen die Verwendung der Xylanase in vollständig chlorfreien Sequenzen vom Typ OQPZP. Besonders wird bevorzugt, dass die Xylanase in solchen Sequenzen in Verbindung mit dem Maskierungs-(Q-)Schritt verwendet wird, um die Sequenz OX/QPZP zu ergeben.
Es wird besonders bevorzugt, diese Xylanase in den oben beschriebenen Sequenzen für die Bio-Bleichung von Holzzellstoff und im Speziellen Kraft-Holzzellstoff, zu verwenden.
Weiters wird gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung eine enzymatische Behandlung unter Einsatz der Xylanase offenbart. Vorzugsweise ist eine solche Behandlung eine Vorbehandlung für klassische und von elementarem Chlor freie Bleichtechniken oder in Verbindung mit einem der Schritte einer vollständig chlorfreien Bleichsequenz. Diese enzymatische Behandlung ermöglicht eine Reduktion der Menge an Chlor, Chlordioxid und/oder anderen reaktiven Oxidationsmitteln, die verwendet werden müssen, um die Lignocellulose-Pulpe in der Folge chemisch zu behandeln, sowie eine Verringerung der Produktion an AOX-Verbindungen, während es gleichzeitig weiterhin ermöglicht wird, eine Pulpe zu erhalten, die einen annehmbar niedrigen Lignin-Gehalt aufweist.
Weiters gilt für diese enzymatische Vorbehandlung entweder, dass sie (a) den erreichten End-Weißgrad nicht verringert (im Fall der klassischen Sequenzen oder ECF-Sequenzen); oder (b) weiterhin für einen End-Weißgrad des Produktes sorgt, der zufriedenstellend ist, während annehmbare Mengen an Reaktanden eingesetzt werden (im Fall von TCF-Sequenzen).
Die Verwendung der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung bei der Behandlung (Bio- Bleichung) von Lignocellulose-Pulpe erfolgt üblicherweise in einem eigenen Schritt. Sie kann auch in Kombination mit Maskierungsmitteln durchgeführt werden. Die Xylanase kann daher nicht nur eingesetzt werden, um die Chemikalien-Chargen von Chlor, Chlordioxid und/oder anderen reaktiven Oxidationsmitteln, wie z. B. Sauerstoff, Ozon oder Peroxid, zu verringern, sondern verringert auch die Kosten des Bio-Bleichverfahrens.
Es ist anzumerken, das die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung nicht nur bei der Bio-Bleichung von Lignocellulose-Pulpe Verwendung findet (wie nachstehend ausführlicher erörtert wird), sondern auch bei der Herstellung von Xylooligosacchariden aus Pflanzenmaterialien nützlich ist.
Die Fig. 1a und 1b zeigen die Nukleotidsequenz des Gens, das für die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung kodiert, und die Aminosäuresequenz der Vorläufer-Xylanase gemäß vorliegender Erfindung, einschließlich der Präsequenz des reifen Enzyms, für das die Nukleotidsequenz kodiert.
Fig. 2 ist ein Graph, der die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse zur Ermittlung des Molekulargewicht der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung veranschaulicht, worin die Y- Achse das Molekulargewicht in Kilodalton (kD) darstellt und die X-Achse die Migrationsdistanz in mm darstellt.
Fig. 3 ist ein Graph, der die Ergebnisse der PAGE-Analyse zum Bestimmen des isoelektrischen Punkts (pl) der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung darstellt, wobei die Y- Achse den pl darstellt, die X-Achse die Distanz von der Kathode in mm darstellt und Xyl den pl darstellt, der für die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung erhalten wird.
Fig. 4 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pUB-BPX12.
Fig. 5 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pUBDEBRA1.
Fig. 6 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pKAC1.
Fig. 7 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pLI1.
Fig. 8 ist ein Restriktionskarte von Plasmid pL7SBT.
Fig. 9 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pL7TAKA.
Fig. 10 veranschaulicht die chromosomalen Deletionen in vivo, die in Bacillus licheniformis SE2 durch die Deletionsplasmide pLD1, pLD3 und pLD6 vorgenommen werden.
Fig. 11 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pLD1.
Fig. 12 ist ein Restriktionskarte von Plasmid pLD3.
Fig. 13 ist eine Restriktionskarte von Plasmid pLD6.
Die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung wird durch ein Gen bzw. Gene produziert, das bzw. die von Bacillus pumilus PRL B12 stammt bzw. stammen.
Die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung ist eine 1,4-b-D-Xylan-Xylanhydrolase mit der Bezeichnung EC 3.2.1.8 (Endoxylanase). Diese Xylanase wird als größeres "Vorläuferprotein" (Seq.-ID Nr. 1) synthetisiert, das aus einer "Präsequenz" (Seq.-ID Nr. 25) und einer "reifen" Proteinsequenz (Seq.-ID Nr. 24) besteht. Die Aminosäuresequenz der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung, einschließlich ihrer Präsequenz, ist den Fig. 1a und 1b zu entnehmen.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe "Vorläufer-Protein", "Vorläufer-Enzym" oder "Vorläufer-Xylanase" auf das bzw. die gesamte Protein, Enzym oder Xylanase, einschließlich aller "Prä"- (und/oder) "Pro"-Sequenzen, wie transkribiert und translatiert und vor jeglichen post-translationalen Modifikationen davon.
Wie hierin verwendet, bezeichnen die Begriffe "reifes Protein", "reifes Enzym" und/oder "reife Xylanase" jenen Abschnitt des Proteins, des Enzyms oder der Xylanase, der nach der post-translationalen Modifikation daran in die Kulturbrühe ausgeschieden wird und darin zu finden ist.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Präsequenz" jenen Abschnitt des Proteins, des Enzyms oder der Xylanase, der nicht extrazellulär ausgeschieden wird, sondern (durch enzymatische Spaltung oder auf andere Weise) vor der extrazellulären Exkretion des reifen "Abschnitts" aus der "reifen" Sequenz entfernt wird.
Die isolierte und gereinigte Xylanase gemäß vorliegender Erfindung ist hierin, wie nachstehend ausführlich erörtert wird, umfassend als Enzym charakterisiert worden, das eine "reife Sequenz" aus 200 Aminosäuren aufweist. Wie aufgrund ihrer Aminosäuresequenz bestimmt (die von der Nukleotidsequenz des dafür kodierenden strukturellen Gens abgeleitet worden ist), weist die Xylanase ein Molekulargewicht von 22.534,55 Kilodalton (kDa) auf (im Vergleich zu einem Molekulargewicht von 26 kDa, wie durch SDS-PAGE- Analyse ermittelt) und einen pl von 9,56 auf (im Vergleich zu einem pl von 9,8 bis 9,9, wie durch isoelektrische Fokussierung ermittelt). Die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung weist über einen breiten Temperaturbereich von unter 40ºC bis über 65ºC wirksame xylanolytische Aktivität auf, bei einer optimalen Temperatur von 55ºC. der für diese Xylanase unter Testbedingungen ermittelte optimale pH beträgt 6,5 bis 7,0, ein Bereich, von dem man erwarten würde, dass er zu niedrig ist, um für den Einsatz beim Bio-Bleichen wirksam zu sein.
Dennoch ist die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung, wie nachstehend ausführlich erörtert, überraschenderweise trotz den niedrigen optimalen pHs, den sie unter Testbedingungen aufweist, dennoch effizient, um die Delignifizierung von Pulpen mit einem alkalischen pH über den gesamten pH-Bereich von 7,0 bis 9,5 zu erleichtern.
Diese Xylanase weist keinerlei Cellulase-Restaktivität auf.
Die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung kann durch Bacillus pumilus PRL B12 homolog exprimiert und extrazellulär in die Kulturbrühe ausgeschieden werden. Diese Xylanase kann auch von anderen Bacillus-Wirten heterolog exprimiert und extrazellulär in die Kulturbrühe exkretiert werden, wie z. B. Stämmen von B. licheniformis, B. subtilis, B. alkalophilus, B. lentus und B. amyloliqufaciens, die unter Einsatz von rDNA-Techniken mit dem bzw. den geeigneten Xylanase-Gen(en) von B. pumilus PRL B12 transformiert worden sind. Unabhängig davon, welcher Ansatz gewählt wird, weisen die Xylanasen von diesen zwei verschiedenen Wirten identische oder teilweise identische immunochemische Eigenschaften auf, wie immunologisch durch verschiedene allgemein bekannte Kreuzreaktions-Identitätstests ermittelt werden kann. (Siehe N.H. Axelsen, "Handbook of Immunoprecipititation-in-Gel Techniques", Blackwell Scientific Publications (1983), Kapitel 5 und 14).
Die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung kann durch die Kultivierung von Bacillus pumilus PRL B12 produziert werden.
Xylanase-erzeugender B. pumilus PRL B12 kann unter aeroben Bedingungen in Nährstoffmedium kultiviert werden, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff gemeinsam mit (einem) anderen essentiellen Nährstoff bzw. Nährstoffen enthält. Das Medium kann nach Prinzipien zusammengestellt werden, die nach dem Stand der Technik allgemein bekannt sind. Weiters ist anzumerken, dass B. pumilus PRL B12 nicht thermophil ist.
Während der Kultivierung scheiden die Wirtszellen Xylanase extrazellulär aus. Das ermöglicht, dass das Isolieren und Reinigen (die Gewinnung) der Xylanase beispielsweise durch Trennung von Zellmasse von einer Kulturbrühe erreicht wird (z. B. durch Filtration oder Zentrifugation), während Lyse vermieden wird. Die resultierende zellfreie Kulturbrühe kann als solche verwendet werden oder kann, falls, gewünscht, zunächst konzentriert werden (beispielsweise durch Verdampfung oder Ultrafiltration). Falls gewünscht kann die Xylanase dann nach herkömmlichen Verfahren von der zellfreien Brühe getrennt und im gewünschten Ausmaß, beispielsweise durch Säulenchromatographie, gereinigt werden oder sogar kristallisiert werden.
Vorzugsweise wird die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung auf folgende Weise von der Xylanase-Kulturbrühe isoliert und gereinigt, in, die sie extrazellulär ausgeschieden worden ist: (1) Konzentration des Überstands über einen Ionenaustauschsäule; (2) Leiten des konzentrierten Überstands über eine Ionenaustauschsäule; und (3) Leiten des konzentrierten Überstands über eine Hydrophob-Chromatographiesäule.
Die Xylanase ist auch unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnologieverfahren erhältlich, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, wie etwa durch Isolieren eines DNA-Fragments, das für die Xylanase kodiert; Kombinieren des DNA-Fragments mit einem geeigneten Expressionssignal in einem geeigneten Plasmidvektor; Einführen des Plasmidvektors in einen geeigneten Wirt (etwa als autonom replizierendes Plasmid oder in das Chromosom integriert); Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die zur Expression der Xylanase führen; und Gewinnen der Xylanase aus der Kulturbrühe.
Die Xylanase kann auch hergestellt werden wie im Wesentlichen in der japanischen Patentbeschreibung Nr. 86039036 und/oder der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 92/03540 beschrieben.
Die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung kann eingesetzt werden, um verschiedene Lignocellulose-Pulpe-Bleichsequenzen zu ergänzen. Derartige Bleichsequenzen werden nach dem chemischen Aufschließen der Pulpe eingesetzt, um weitere Delignifizierung und Bleichung zu erzielen, um den gewünschten End-Weißgrad zu erzielen. Derartige Bleichsequenzen weisen üblicherweise einen erste Delignifizierungsschritt auf, worin der Schritt der chemischen Behandlung durchgeführt wird, gefolgt von einem Laugenextraktionsschritt. Diesem Delignifizierungsschritt folgt dann eine Reihe von Bleichschritten.
Bei klassischen (oder herkömmlichen) Bleichsequenzen wird Chlor in elementarer Form (Cl&sub2;) allein oder zusätzlich zu Chlordioxid (ClO&sub2;) verwendet, um die aufgeschlossene Pulpe (durch Chlorierung) im Delignifizierungsschritt chemisch zu behandeln (gefolgt von Laugenextraktion). Bei ECF-Bleichsequenzen wird im Delignifizierungsschritt ClO&sub2; anstelle von Cl&sub2; verwendet.
Während solche ECF-Sequenzen verringerte AOX-Mengen aufweisen, führen sie dennoch immer noch zu gewisser AOX-Produktion. Weiters ist ClO&sub2; teurer als Cl&sub2;. Schließlich ist Chlordioxid nicht so effizient für die chemische Behandlung der aufgeschlossenen Pulpe wie Chlor. Daher sind (im Vergleich zu Cl) höhere Mengen an ClO&sub2; erforderlich, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen. Die Verwendung höherer ClO&sub2;-Konzentrationen erhöht die Produktion von AOX-Verbindungen, die damit verbunden sind, und erhöht auch die Kosten des Gesamtverfahrens. Tatsächlich kann bei industriellen Anwendungen die Menge für ein solches Bleichen erforderliche Menge an ClO&sub2; eine beträchtliche Investition in die Anlage, wie z. B. einen ClO&sub2;-Generator "vor Ort" erfordern.
Bei TCF-Bleichsequenzen werden anstelle von elementarem Chlor und Chlordioxid andere Quellen für reaktive Oxidationsmittel, wie z. B. Peroxide (d. h. Wasserstoffperoxid) und Ozon, verwendet, um die Pulpe im Delignifizierungsschritt chemisch zu behandeln. Obwohl die gewünschte Reduktion der AOX-Mengen erzielt wird, lässt sich mit solchen TCF-Sequenzen kein so hohes Delignifizierungsausmaß erreichen wie gewünscht. Weiters können solche reaktive Oxidationsmittel eine Beeinträchtigung der Pulpe bewirken. Schließlich können die bei solchen TCF-Sequenzen eingesetzten reaktiven Oxidationsmittel ziemlich teuer sein, wodurch die mit solchen Bio-Bleichsequenzen verbundenen Kosten weiter erhöht werden.
Wie nachstehend ausführlich erörtert haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes festgestellt, dass die Vorbehandlung von Pulpe mit Xylanase gemäß vorliegender Erfindung, wenn sie in Verbindung mit ECF- und klassischen Sequenzen eingesetzt wird, überraschenderweise beträchtliche Reduktionen der Mengen an Chlor- und/ oder Chlordioxid-Beschickung, ermöglicht, die während des nachfolgenden Delignifizierungsschritts notwendig sind. Eine direkte Konsequenz davon ist eine Reduktion der AOX-Konzentration in den Abwässern der Anlage, was für die Umwelt von Vorteil ist. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben weiters festgestellt, dass eine Xylanase-Vorbehandlung bei ECF- und klassischen Sequenzen sowie bei TCF-Sequenzen dazu beiträgt, einen möglichst hohen End-Weißgrad zu erreichen (wie beispielsweise durch den ºISO der Pulpe gemessen).
Die Erfindung betritt im Speziellen Pulpen, an denen chemisches Aufschließen vorgenommen worden ist. Nach dem Aufschließen wird Xylan (nachdem es seine Seitenketten verloren hat) in die Faserstruktur der Pulpe rückgefällt, wo es das Lignin schützt, das in den Fasern verbleibt. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes nehmen an, dass die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung einen Teil des erneut gefällten Xylans fällt, wodurch das Lignin freigelegt wird und sein nachfolgendes Entfernen während des Delignifizierungsschritts der Bleichsequenz erleichtert wird. Alle Typen von Lignocellulose-Materialien, wie z. B. Holz, die für die Herstellung chemischer Pulpen verwendet werden, eignen sich zur Verwendung beim Verfahren gemäß vorliegender Erfindung. Diese Pulpen umfassen insbesondere jene, die für Kraftzellstoffe verwendet werden, nämlich die (weichen) Nadelhölzer, wie beispielsweise verschiedene Kiefer- und Tannen-Spezies, und die (harten) Laubhölzer, wie beispielsweise Buche, Eiche, Eukalyptus und Weißbuche, sowie andere Quellen für Lignocellulose-Materialien, wie z. B. Flachs und Jute.
Wie hierin verwendet bezeichnet "κ-Index" ein Maß für die Menge an in Holzzellstoff vorhandenem Lignin. Der κ-Index ist eine Zahl, die das Volumen (in ml) an 0,1 N Kaliumpermanganat- (KMnO&sub4;-) Lösung darstellt, das pro 1 g feuchtigkeitsfreier Pulpe unter den Bedingungen der Verfahren aufgenommen wird, die in TAPPI (Technical Committee of the Association of the Pulp and Paper Industry) Norm Nr. T236cm-85 (1985) beschrieben werden.
Wie hierin verwendet bezeichnet "ºISO" das Maß des Weißgrads des aus der Pulpe erzeugten Papiers. Dieser Wert ist ein Faktor des Reflexionsvermögens des Papiers aus der Pulpe unter den Bedingungen der Verfahren, die in ISO (the International Organization for Standardization) Norm Nr. 2469, wie in Bezugs-Nr. ISO 2470-1977 (F) veröffentlicht, wie durch Norm Nr. 2470 ergänzt, angegeben sind.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Multiple", "Chlor-Multiple" und/oder "Aktivchlor-Multiple" die Oxidationsstärke von Chlor und Chlordioxid, ausgedrückt als Chloräquivalente und berechnet als:
[Cl&sub2; + ClO&sub2; (2,63) % der ofen-getrockneten Pulpe (o.d.p.)]/κ-Zahl der ungebleichten Pulpe.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff "XE" Xylanaseeinheiten, eine Zahl, die wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben erhalten wird.
Die Xylanase kann an verschiedenen Punkten während der verschiedenen Bleichverfahren zugegeben werden. Vorzugsweise wird Xylanase der Pulpe nach deren chemischem Aufschließen zugegeben, aber bevor der chemische Behandlungsschritt des Delignifizierens der Bleichsequenz erfolgt. In diesem Zusammenhang stellt die Xylanase eine Art von Vorbehandlung dar, die eine Reduktion der Mengen an Chlor, Chlordioxid und/oder anderen reaktiven Oxidationsmitteln ermöglicht, die im chemischen Behandlungsschritt des Delignifizierens der Bleichsequenz nicht eingesetzt werden müssen. Xylanase kann entweder in ihrer gereinigten Form zugegeben werden, oder sie kann in einer konzentrierten oder unkonzentrierten Kulturbrühe vorliegen.
Für klassische Pulpebleichsequenzen wird Chlor in elementarer Form (Cl&sub2;) gegebenenfalls zusammen mit Chlordioxid (ClO&sub2;) für den Delignifizierungsschritt eingesetzt. Übliche Beispiele für klassische Bleichsequenzen sind: CEDPD (chemische Chlorbehandlung, Laugen-Extraktion, Dioxid, Peroxidase und Dioxid) sowie C/DEDPD (Chlor/chemische Dioxidbehanldung, Laugen-Extraktion, Dioxid, Peroxid und Dioxid). In jeder dieser klassischen Sequenzen tritt Delignifizierung im Wesentlichen in den ersten beiden Schritten auf, die hierin als "Delignifizierungsschritt" der Bleichsequenz bezeichnet werden. Bleichung ist das, was im Wesentlichen in den übrigen Schritten stattfindet, die gemäß vorliegender Erfindung als "Bleichschritt" der Bleichsequenz bezeichnet werden.
Die Verwendung der Xylanase (X) gemäß vorliegender Erfindung in klassischen Bleichsequenzen ist als Vorbehandlung der Pulpe in einem eigenen Schritt unmittelbar vor dem chemischen Behandlungsschritt des Delignifizierungsschritts vorzuziehen. Sie kann ohne Waschen dazwischen durchgeführt werden. Bei Verwendung auf diese Weise ermöglicht die B. pumilus PRL B12-Xylanase beträchtliche Verringerungen im Bereich von etwa 15% (für Weichhölzer) bis 40% (für Harthölzer) der Menge an Chlor, die im Delignifizierungsschritt eingesetzt werden muss. Diese Chlor-Reduktion wird erreicht, während weiterhin eine Pulpe mit einem annehmbaren Ausmaß an Delignifizierung beibehalten wird (wie durch den κ-Index der Pulpe mit einem bestimmten pH zum Zeitpunkt der Xylanase-Behahdlung gemessen).
Bei ECF-Pulpe-Bleichsequenzen wird Chlordioxid für die Delignifizierung und für das Bleichen von Pulpe eingesetzt. Ein übliches Beispiel für eine ECF-Sequenz ist: DPDPD (chemische Dioxidbehandlung, Peroxid, Dioxid, Peroxid und Dioxid). Bei diesen ECF- Sequenzen erfolgt Delignifizierung im Wesentlichen in den ersten beiden Schritten, die gemäß vorliegender Erfindung als "Delignifizierungsschritte" der Bleichsequenz bezeichnet werden. Bleichung ist das, was im Wesentlichen in den verbleibenden Schritten stattfindet, die gemäß vorliegender Erfindung als "Bleichstufe" der Bleichsequenz bezeichnet werden.
Die Verwendung von Xylanase (X) gemäß vorliegender Erfindung ist als Vorbehandlung der Pulpe in einem eigenen Schritt unmittelbar vor dem Schritt der chemischen Behandlung im Delignifizierungsschritt und ohne Waschen dazwischen vorzuziehen. Bei Verwendung auf diese Weise ermöglicht die B. pumilus PRL B12-Xylanase beträchtliche Reduktionen der Menge an Chlordioxid, die im Delignifizierungsschritt eingesetzt werden muss. Diese Reduktion wird erreicht, während die im Delignifizierungsschritt erreichte Delignifizierung tatsächlich verbessert wird.
Für die TCF-Pulpebleichsequenzen wird für die Delignifizierungs- und Bleichphasen ein reaktives Oxidationsmittel in Abwesenheit von Cl&sub2; und/oder ClO&sub2; eingesetzt. Ein übliches Beispiel für eine TCF-Sequenz ist: OQPZP (Sauerstoff, Maskierungsmittel, Peroxid, Ozon und Peroxid). In solchen Sequenzen besteht das Ziel darin, die Menge an Ozon (oder anderen reaktiven Oxidiationsmitteln) im vierten Schritt so weit wie möglich zu verringern, während ein möglichst hoher End-Weißgrad des Holzzellstoffs erzielt wird (wie durch den End-ºISO der Pulpe gemessen). Diese Ozon-Verringerung ist insofern wichtig, als Ozon die Pulpe beeinträchtigen kann.
Die Verwendung der Xylanase (X) gemäß vorliegender Erfindung in solchen TCF-Bleichsequenzen wird vorzugsweise in Verbindung mit dem Maskierungsschritt durchgeführt (so dass die Sequenz OX/QPZP ist). Auf diese Weise verwendet ermöglicht die B. pumilus PRL B12-Xylanase Reduktionen der Menge an Ozon, die in der Sequenz verwendet werden muss. Diese Reduktion wird erreicht, während der erreichte End-Weißgrad (wie durch den End-ºISO der Pulpe gemessen) verbessert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das für die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung kodierende Gen isoliert und gereinigt worden, wie gemäß vorliegender Erfindung beschrieben. Die für die Xylanase kodierende Nukleotidsequenz kann nach herkömmlichen Klonierungsverfahren aus der chromosomalen DNA von Bacillus pumilus PRL B12 isoliert werden. Die Xylanase-Kodierungssequenz kann auf einem partiellen Sau3Al-DNA-Fragment mit 1022 Basenpaaren (bp) erhalten werden. Die Nukleotidsequenz dieses Fragments ist ermittelt worden, wie unter Bezugnahme auf die Fig. 1a und 1b (Seq.-ID Nr. 1) zu erkennen, worin "N" ein nicht identifiziertes Nukleotid darstellt. Dieses Fragment mit 1022 bp umfasst die Nukleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 27), die für die Xylanase-Präsequenz (Seq.-ID Nr. 33) und/oder die stromauf gelegenen Kodierungssequenzen (Seq.-ID Nr. 28) und/oder die stromab gelegenen Kodierungssequenzen (Seq.-ID Nr. 29) des Xylanase-Gens gemäß vorliegender Erfindung kodiert.
Gemäß wiederum einem anderen Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren, die (eine) Nukleotidsequenz(en) (Strukturgen) enthalten, die für ein bestimmtes Protein oder Proteine kodiert bzw. kodieren, wie z. B. Xylanasen, α-Amylasen, Pullulanasen und Alkalische Phosphatasen, wobei die Expressionsvektoren für die Transformation geeigneter Wirtszellen verwendet werden können, um die Expression des Proteins bzw. der Proteine zu erzielen, für das bzw. die dadurch kodiert wird.
Wie hierin verwendet bezieht der Begriff "Expressionsvektor" auf jede diskrete DNA-Sequenz, die ein Replikon enthält, sowie andere DNA-Regionen (Nukleotidsequenzen), so dass er unabhängig im Wirt als vollständige Genexpressionseinheit fungiert.
Mit dem Begriff "vollständige Genexpressionseinheit" sind ein Strukturgen und der bzw. die Promotorregion(en) und Regulationsregion(en) gemeint, die für die Transkription und Translation erforderlich ist bzw. sind.
Mit dem Begriff "Promotorregion" ist jede Region stromauf von einer Kodierungssequenz eines Strukturgens gemeint, die es ermöglicht, dass die Bindung von RNA-Polymerase und die Transkription und/oder Translation der Kodierungssequenz stattfindet.
Mit dem Begriff "Regulationsregion" ist jede Region gemeint, die die Transkription und/oder Translation des Strukturgens reguliert.
Mit dem Begriff "Strukturgen" ist eine Kodierungssequenz gemeint, die als Templat für die Synthese von RNA dient und die die Synthese des Proteins von Interesse in einem Wirt dafür ermöglicht.
Je nach den spezifischen Gegebenheiten in jedem Fall kann bzw. können die Nukleotidsequenz(en) der Expressionsvektoren die Nukleotidsequenz(en) umfassen, die entweder für das bzw. die Vorläuferprotein(e) oder reife(n) Protein(e) kodiert bzw. kodieren.
Zusätzlich zu der bzw. den oben erörterten Sequenz(en) können die Expressionsvektoren gemäß vorliegender Erfindung weitere Nukleotidsequenzen umfassen, die die Aufrechterhaltung des Expressionsvektors unterstützen und/oder die die Expression und/ oder Sekretion des Proteins bzw. der Proteine unterstützen, das bzw. die von der bzw. den Proteinkodierungssequenz(en) zu erzeugen sind. Derartige zusätzliche Sequenzen können entweder von der bzw. den Proteinkodierungssequenz(en) unabhängig sein oder operabel damit verbunden sein.
Mit dem Begriff "unabhängig von der bzw. den Proteinkodierungssequenz(en)" ist gemeint, dass die Synthese, Expression und/oder Sekretion des Proteins bzw. der Proteine, für die Proteinkodierungssequenz(en) des Expressionsvektors kodiert bzw. kodieren, die zusätzliche(n) Nukleotidsequenz(en) weder reguliert noch fördert oder auf andere Weise steuert oder bewirkt.
Mit dem Begriff "operabel mit der/den Kodierungssequenz(en) verbunden" ist gemeint, dass die Synthese, Expression und/oder Sekretion des Proteins bzw. der Proteine, für die die Kodierungssequenz des Expressionsvektors kodiert, die zusätzliche(n) Nukleotidsequenz(en), die damit assoziiert (operabel verbunden) sind, reguliert, fördert und/oder auf andere Weise steuert oder herbeiführt.
Die Expressionsvektoren gemäß vorliegender Erfindung können aus Nukleotidsequenz(en) konstruiert werden, die zu den Wirtszellen, die sie transformieren (oder transformieren sollen) entweder homolog oder heterolog sind.
Mit dem Begriff "zu den Wirtszellen homolog" ist gemeint, dass die Nukleotidsequenz(en) des Expressionsvektors entweder vom Wirtsstamm oder von einem Stamm stammt bzw. stammen, der zur gleichen Spezies gehört (die sie transformieren soll bzw. sollen), oder modifiziert oder synthetisch erzeugt werden, so dass sie äquivalent mit Nukleotiden des Wirtsstamms (des Expressionswirts) funktioniert bzw. funktionieren.
Mit dem Begriff "zu den Wirtszellen heterolog" ist gemeint, dass die Nukleotidsequenz(en) des Expressionsvektors von einem Stamm stammt bzw. stammen, der sich vom Wirtsstamm (den sie transformieren soll bzw. sollen) unterscheidet oder modifiziert oder so synthetisch erzeugt ist, dass sie äquivalent zu Nukleotiden des Wirtsstamms (des Expressionswirts) funktioniert bzw. funktionieren.
Die Expressionsvektoren gemäß vorliegender Erfindung können aus (einer) Nukleotidsequenz(en) konstruiert werden, die entweder homolog oder heterolog zueinander sind.
Mit dem Begriff "Nukleotidsequenz(en), die homolog ist bzw. sind" sind Nukleotidsequenzen (der Expressionsvektoren) gemeint, die entweder vom gleichen Ursprungsorganismus stammen und/oder so modifiziert oder synthetisch erzeugt sind, dass sie zu Nukleotiden des gleichen Ursprungsorganismus äquivalent funktionieren.
Mit dem Begriff "Nukleotidsequenz(en), die heterolog ist bzw. sind" sind Nukleotidsequenzen (der Expressionsvektoren) gemeint, die von unterschiedlichen Ursprungsorganismen stammen und/oder so modifiziert oder synthetisch erzeugt sind, dass sie nicht äquivalent zu Nukleotiden des gleichen Quellenorganismus funktionieren.
Mit dem Begriff "isoliert" ist gemeint, dass die so bezeichneten Nukleotide (wie jene des Expressionsvektors) nicht in ihrer natürlich vorkommenden Umgebung vorhanden sind.
Die Nukleotidsequenz(en) der Expressionsvektoren gemäß vorliegender Erfindung werden durch die Restriktion von DNA hergestellt, um DNA-Fragmente herzustellen und durch die Ligation solcher DNA-Fragmente rekombinante Moleküle herzustellen.
Mit dem Begriff "DNA-Fragment(e)" sind ein oder mehrere DNA-Nukleotide gemeint, die aneinander gebunden sind, nachdem sie Restriktion mit einem Restriktionsenzymen unterzogen worden sind. Die Nukleotide solcher Fragmente können entweder heterolog oder homolog zueinander sein.
Mit dem Begriff "rekombinante Moleküle" sind zumindest zwei DNA-Nukleotide gemeint, die aneinander gebunden sind, nachdem sie Ligation mit einer Ligase unterzogen worden sind (beispielsweise T4-DNA-Ligase). Die Nukleotide solcher rekombinanter Moleküle können entweder heterolog oder homolog zueinander sein.
Sofern hierin nicht anders angegeben werden eine solche Restriktion von DNA, um gemäß vorliegender Erfindung verwendete DNA-Fragmente herzustellen, Ligation solcher Fragmente, um rekombinante Moleküle herzustellen, die gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, sowie die Einführung von DNA in Wirtsmikroorganismen oder -zellen unter Einsatz bekannter Techniken durchgeführt, die in verschiedenen hierin genannten Dokumenten offenbart werden. Auch werden, sofern nicht anders angegeben, die Bedingungen so gewählt, dass Denaturierung der eingesetzten DNA und Enzyme vermieden wird. Beispielsweise wird der pH im Allgemeinen gepuffert, so dass er in einem neutralen Bereich bleibt, und die Temperatur wird im Allgemeinen unter etwa 60 ºC gehalten. Vorzugsweise wird Restriktion im Allgemeinen bei etwa 37ºC durchgeführt, mit Ausnahme einiger Enzyme, die von thermophilen Bakterien ausgeschieden werden.
Restriktionsenzyme und Ligasen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind im Handel erhältlich und sollte gemäß den damit mitgelieferten Anweisungen der Hersteller verwendet werden.
Die verschiedenen Fragmente und End-Konstruktionen können nach herkömmlichen Techniken verbunden werden. In vielen Fällen sind Gene isoliert und restriktionskartiert sowie sequenziert worden. In diesem Ausmaß ist man in der Lage, die Sequenz von Interesse, wie z. B. die Kodierungssequenz für das Protein von Interesse, durch Restriktion des Gens zu selektieren. Weiters kann in diesem Ausmaß weitere Manipulation eingesetzt werden, wie sie notwendig ist (etwa durch Mutagenese in vitro unter Einsatz synthetischer Oligonukleotide), um die DNA-Sequenz zu modifizieren und/oder ein Fragment mit einer bestimmten Größe bereitzustellen, das die gewünschte Sequenz umfasst und die richtigen Termini aufweist. Linker und Adapter können eingesetzt erden, um Sequenzen aneinanderzufügen, sowie um verlorene oder deletierte Sequenzen zu ersetzen, wenn die Restriktionsstelle innerhalb der Region von Interesse liegt. Die verschiedenen Fragmente, die isoliert werden, können nach Bedarf durch Elektrophorese gereinigt, elektroeluiert, an andere DNA-Fragmente ligiert, kloniert, erneut isoliert und weiter manipuliert werden.
Die Expressionsvektoren gemäß vorliegender Erfindung können autonom replizierende Vektoren sein. Das heißt, wenn sie in einen Wirtsorganismus transformiert werden, werden diese Vektoren unabhängig voneinander beibehalten (entweder als kopielose, Einzelkopie- oder Mehrfachkopie-Plasmide) ohne signifikante Rekombination oder Integration mit der chromosomalen DNA des Wirts. Alternativ dazu können die Vektoren dem Typ angehören, bei dem das Expressionssystem chromosomal in den Wirt integriert wird.
Geeignete Expressionsvektoren, die für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind im Allgemeinen jene, die mit dem Organismus verträglich sind, mit denen der Vektor transformiert wird. In diesem Zusammenhang weisen sie beispielsweise kompatible Regulationssequenzen und Replikationsursprünge auf. Sie sind weiters vorzugsweise Mehrfachkopie-Plasmide und weisen ein bzw. mehrere selektierbare(s) Markergen(e) auf (beispielsweise Gene, die für Antibiotika-Resistenz kodieren). Beispiele für solche geeigneten Expressionsvektoren sind Phagen, Plasmide, Cosmide, Transposone und chromosomale Integrationsvektoren. Außerdem kann der Expressionsvektor gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, um die Expressionselemente und heterologen Genelemente nach herkömmlichen Techniken in das Wirtschromosom zu integrieren, wie von Saunders et al., J. Bacteriol. 157, 718-726 (1984), beschrieben.
Ein bevorzugter Expressionsvektor gemäß vorliegender Erfindung umfasst die Nukleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 26), die für die reife Xylanase von B. pumilus PRL B12 kodiert. Diese Expressionsvektoren können weiters die Nukleotidsequenz umfassen, die für die Präsequenz (Seq.-ID Nr. 27) der Xylanase von P. pumilus PRL B12 kodiert. Diese Expressionsvektoren können noch weiter verschiedene Xylanase-Promotor- und -Regulationsregionen (-sequenzen) (Seq.-ID Nr. 28 und Seq.-ID Nr. 29) von B. pumilus PRL B12 umfassen, die die Expression der Xylanase beeinflussen/steuern. Expressionsvektor pUB- BPX12 ist ein solcher Expressionsvektor.
Es ist hier anzumerken, dass alternativ dazu andere Regulationssequenzen (homolog oder heterolog) verwendet werden können, um die Expression des Xylanase-Gens zu steuern.
Expressionsvektor pUB-BPX12 umfasst die folgenden Elemente: (a) ein Fragment von Vektor pUB131, das die Replikationsfunktionen für Bacillus trägt; und (b) die Xylanase- Kodierungssequenz von B. pumilus BRL B12. In diesem Zusammenhang sei angemerkt, dass, wie nachstehend in den Beispielen ausführlich erörtert, das Xylanase-Gen von B. pumilus PRL B12 durch Klonieren in Plasmid pUB131 isoliert wurde.
Der Vektor pUB131 ist ein autonom replizierendes Mehrfachkopie-Plasmid, das aus dem allgemein bekannten Plasmid pUB110 konstruiert wurde (ein Derivat davon ist). Plasmid pUB110 ist gut charakterisiert, so dass seine volle DNA-Sequenz bekannt ist und seine Gene von McKenzie et al., Plasmid 15, 93-103 (1986), definiert wurden.
pUB131 wird konstruiert, indem zuerst eine DNA-Sequenz von pUB110 deletiert wird, die für ein Polypeptid kodiert, von dem angenommen wird, dass es an Mobilisierungsfunktionen beteiligt ist. Diese deletierte Sequenz wird dann durch eine synthetische Polylinker-Sequenz ersetzt, wodurch Plasmid pUB131 erzeugt wird. Die Konstruktion und Sequenz von Vektor (Plasmid)pU8131 wird im Detail in (2) berichtet.
Die Xylanase-Kodierungssequenz, die auf dem partiellen Sau3Ai-Fragment mit 1022 bp vorhanden war, wurde in Vektor pUB131 subkloniert, so dass Expressionsvektor pUB- BPX12 erzeugt wurde. Am meisten bevorzugt enthält pUB-BPX12 die folgenden Elemente:
1. eine Sequenz von pUB131, die für die autonome Replikation des Plasmids im Wirt verantwortlich ist. (Dieses Merkmal ermöglicht, pUB-BPX12 in einer Reihe von Bacillus- Wirtspezies zu verwenden, wie z. B. Stämmen von B. subtilis, B. pumilus und B. licheniformis, B. alkalophilus, B. lentus und B. amyloliquefaciens usw.);
2. ein Gen von pUB131, die den Wirtszellen Resistenz gegen Kanamycin oder Neomycin verleiht;
3. ein Gen von pUB131, die den Wirtszellen Resistenz gegen Phleomycin verleiht; und
4. das Gen aus Kodierung der Xylanase von B. pumilus PRL B12.
Eine Restriktionskarte von Plasmid pUB-BPX12 ist in Fig. 4 angegeben.
Andere Expressionsvektoren, die gemäß vorliegender Erfindung vorgesehen sind, umfassen die Nukleotidsequenz, die für die Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D (pUBDEBRA1) kodiert, oder die Nukleotidsequenz, die für die α-Amylase von B. licheniformis ATCC 9789 (pL7TAKA) kodiert, oder die Nukleotidsequenz, die für die Alkalische Protease von B. licheniformis SE2 kodiert (pLI1), oder das Subtilisin (Alkalische Protease) von Bacillus subtilis 168 (pKAC1 und pL7SBT). Die Expressionswirte gemäß vorliegender Erfindung sind Stämme des Genus Bacillus, die mit dem Expressionsvektor für das Protein kompatibel sind, das dadurch exprimiert werden soll. Vorzugsweise sind diese Stämme aerob. Weiters wird vorgezogen, dass diese Stämme nicht thermophil sind. Derartige Stämme umfassen B. subtilis, B. pumilus und B. licheniformis, B. alkalophilus, B. lentus und B. amyloliquefaciens. Vorzugsweise ist bzw. sind dessen Alkalische(s) Protease-Gen(e) aus diesen Expressionsvektoren deletiert worden.
Der bzw. die bevorzugte(n) Wirt(e) gemäß vorliegender Erfindung für die Expression der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung ist bzw. sind (biologisch reine Kulturen von) rekombinante(n) Stämme(n), die von Bacillus licheniformis abstammen. Als Spezies, die routinemäßig zur industriellen Produktion extrazellularer Enzyme, hauptsächlich Proteasen und α-Amylasen, im großen Maßstab verwendet wird, ist er ein interessanter Wirt für die Expression klonierter Genprodukte im industriellen Maßstab.
Der spezielle rekombinante Stamm von B. licheniformis, der gemäß vorliegender Erfindung für Wirte für die Expressionsvektoren gemäß vorliegender Erfindung verwendet wird, ist B. licheniformis SE2. B. licheniformis SE2 ist unter Produktionsbedingungen asporogen. B. licheniformis SE2 fehlt die neutrale Proteaseproduktion und ist ein Alkalische Protease-Produzent.
Die von B. licheniformis SE2 produzierte Alkalische Protease wird zunächst intrazellulär als inaktiver Vorläufer synthetisiert, der als "Präproenzym" bezeichnet wird. Die "Prä"- und die "Pro"-Sequenz werden während der Translokation des Polypeptid in das extrazelluläre Kulturmedium eliminiert, wodurch die ausgeschiedene aktive Alkalische Protease produziert wird.
Um die deletierten SE2-Stämme (delap1, delap3 und delap6) daraus zu erhalten, wurde die DNA-Kodierungssequenz des Gens, das für zumindest den reifen Teil der Alkalischen Protease kodiert, aus dem bakteriellen Chromosom entfernt (wie nachstehend ausführlich erörtert), wodurch ein deletierter Stamm erzeugt wird, der keine funktionelle Alkalische Protease erzeugen kann.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "reifer Teil der Alkalischen Protease" auf die aktive Alkalische Protease, das heißt das sekretierte Alkalische Protease-Polypeptid, das in der Kulturbrühe zu finden ist.
In diesem Wirt bzw. diesen Wirten ist B. licheniformis SE2 unter Einsatz von rDNA- Techniken behandelt worden, um die (biologisch reinen Kulturen von) deletierten Stämme(n) gemäß vorliegender Erfindung zu erhalten: B. licheniformis SE2 delap1, SE2 delap3 und SE2 delap6, von denen keines Alkalische Proteasen produziert, die das heterologe Protein, das dadurch exprimiert wird, erzeugen, bevor ein solches heterologes Protein gewonnen werden kann. Weiters kann insbesondere der spezielle rekombinante B. licheniformis SE2-Stamm mit pUB-BPX12 transformiert werden, wie oben beschrieben, der die Xylanase-Kodierungssequenz von B. pumilus PRL B12 sowie die Gene trägt, die für Resistenz gegen Kanamycin und Neomycin kodieren.
Die Konstruktion des speziellen B. licheniformis SE2 delap-Stammes umfasst die folgenden Schritte:
1) Das Gen, das für die Alkalische Protease kodiert, wurde aus der chromosomalen DNA von B. licheniformis SE2 gemeinsam mit den sie flankierenden 5'- und 3-Regionen isoliert und dann in pUB131, ein replizierendes Plasmid in B. subitilis, eingeführt.
2) Es wurden Deletionsplasmide konstruiert, welche die Nukleotidsequenz aufweisen, die für den reifen Teil der daraus deletierten Alkalischen Protease kodiert.
3) B. licheniformis SE2 wurde dann mit dem resultierenden Deletionsplasmid transformiert.
4) Das chromosomale Protease-Gen vom B. licheniformis SE2-Stamm wurde dann durch homologe Rekombination durch die deletierte Sequenz des Plamids ersetzt, wodurch ein bestimmter deletierter B. licheniformis SE2-Stamm erzeugt wurde.
5) Das für die Deletion verwendete Plasmid wurde durch Curing aus den deletierten SE2-Stämmen eliminiert.
Die resultierenden deletierten B. licheniformis SE2 delap-Stämme unterscheiden sich somit nur dadurch vom Ausgangs-SE2-Stamm, dass chromosomale Deletionen der Alkalische Protease-DNA-Sequenz, einschließlich der DNA-Sequenz, die für die reife Protease kodiert, aufgetreten ist. Eine schematische Darstellung der Deletion ist in Fig. 10 angeführt.
Die obige Beschreibung ist zwar unter Bezugnahme auf B. licheniformis SE2 erfolgt, es versteht sich jedoch, dass die gleiche Strategie nach Bedarf und nach Wunsch eingesetzt werden kann, um deletierte Stämme anderer Bacillus-Stämme (B. subtilis, B. alkalophilus, B. lentus und B. amyloliquefaciens) herzustellen.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Sofern nicht in den folgenden Beispielen (und in verschiedenen der vorangegangenen Beispiele) anders angegeben, wurden darin die folgenden Materialien eingesetzt:
Luria-Bertani-Medium ("L-B", hierin manchmal als L-B-Medium bezeichnet) liegt entweder in einer flüssigen Form oder in seiner festen Form vor und enthält 15 g/l Agar. Das flüssige L-B-Medium ist jenes, das in (3) auf Seite A.1 beschrieben wird. Das feste L-B- Medium ist jenes, das in (3) auf Seite A.4 beschrieben wird.
Die Proteasedetektionsplatten bestanden aus L-B-Medium, ergänzt mit 1% (Gew./Vol.) Magermilch.
Die Zusammensetzung und die Herstellung von Tris-Acetat-(TAE-) Puffern und Tris-Borat-(TBE-) Puffern, wie hierin verwendet, folgen der Beschreibung in (3) unter 6.7.
Die Zusammensetzung und die Herstellung des gemäß vorliegender Erfindung verwendeten TE-Puffer folgen der Beschreibung in (3) auf Seite B.20.
AZCL-Pullulan und AZCl-Xylan wurden von Megazyme Pty.Ltd. erstanden.
Die Polyacrylamid-Sequenzierungs-Gele wurden nach dem in (3) auf den Seiten 13.45- 13.53 beschriebenen Verfahren unter Einsatz von 6% (Gew./Vol.) Acrylamid anstelle eines Gradienten hergestellt.
Acrylamid wurde von Biozym erstanden.
DM3-Medium wurde nach den in (4) auf den Seiten 150-151 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Bakterienstämme und -Plasmide wurden von den Quellen unter den Katalognummern erhalten, wie nachstehend in Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1 Bakterienstämme und Plasmid-Quellen
¹Clontech Laboratories, (U.S.A.).
²B.G.S.C. ist die Sammlung des BACILLUS GENETIC STOCK CENTER (Ohio State University) USA
³B.C.C.M. (L.M.G.) ist die Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (Laboratorium voor Microbiologie), Universität Gent, Belgien
&sup4;A.T.C.C. ist die American Type Culture Collection, USA
&sup5;Stratagene, Inc. (USA)
&sup6;Biolabs New England (USA).
Die Plasmide pU8131, pUB131 und pUBC132 wurden konstruiert, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 90116322.0 beschrieben.
Bacillus licheniformis SE2 wurde unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens vom 21. Juni 1993 bei den Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, Laboratorium voor Microbiologie, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgien, unter der Hinterlegungsnummer LMG P-14034 hinterlegt.
Bacillus subtilis SE3 wurde unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens vom 21. Juni 1993 bei den Belgian Coordinated Collections of Microorganisms, Laboratorium voor Microbiologie, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgien, unter der Hinterlegungsnummer LMG P-14035 hinterlegt.
Bacillus pumilus PRL B12 (ursprünglich im Mai 1938 unter der Hinterlegungsnummer 6631 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt) wurde unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens vom 24. Juni 1993 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA unter der Hinterlegungsnummer 55443 hinterlegt.

Verfahren und Techniken

Sofern nicht in den folgenden Beispielen anders angegeben, wurden darin die folgenden Verfahren und Techniken eingesetzt:
Wenn der Begriff "kloniert", "subkloniert" und/oder "eingeführt" unter Bezugnahme auf DNA-Fragmente verwendet wird, ist damit, nach Bedarf, die Spaltung (Restriktion) von Donor- und/oder Rezeptor-DNA-Sequenzen, die Behandlung kohäsiver, überstehender 3'- und' 5'-Enden davon (falls erforderlich und/oder gewünscht), die Trennung solcher Fragmente je nach Größe und/oder Extraktion solcher Fragmente (falls erforderlich und/ oder gewünscht), die Dephosphorylierung solcher Fragmente, einschließlich linearisierter Vektoren (falls erforderlich und/oder gewünscht) und die Ligation solcher Fragmente aneinander, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu bilden, gemeint. Eine solche Definition umfasst weiters die Transformation von Wirtszellen mit solchen rekombinanten Molekülen, die Selektion solcher Transformanten und die Isolierung und Reinigung rekombinanter DNA-Moleküle (wie z. B. Plasmide) aus solchen Wirtszellen.
Spaltungen und Restriktionen von (Donor- und Rezeptor-) Plasmiden, chromosomaler DNA und dergleichen wurden unter Einsatz einer oder mehrerer Restriktionsenzyme nach Bedarf durchgeführt, um das DNA-Fragment von Interesse zu isolieren. Die für solche Spaltungen verwendeten Restriktionsenzyme sind von einer Reihe von Herstellern im Handel erhältlich. Die Restriktionsspaltungen wurden unter den in (3) auf 5.28-5.32 angeführten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Restriktionsreaktion um einen Faktor 10 verstärkt wurde, um eine ausreichende Menge an DNA für weitere Reinigungsschritte zu erhalten.
Kohäsive, überstehende 5'-Enden der Fragmente wurden durch Behandlung mit Klenow- Fragment von E. coli DNA-Polymerase I unter den in (3) bei F.2-F.3 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren abgestumpft.
Kohäsive, überstehende 3'-Enden des Fragments wurden durch Behandlung mit Bakteriophagen T4-DNA-Polymerase unter den in (3) bei F.4-F.5 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren abgestumpft.
Trennungen der DNA-Fragmente nach der Größe (nachdem die Restriktionen abgeschlossen waren) wurden durch Agarosegel-Elektrophorese unter Einsatz von 0,8% (Gew./Vol.) Agarose in einem Tris-Acetatpuffer unter den in (3) bei 6.01 bis 6.19 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt. Für die Trennung kleiner Fragmente (. < 1000 bp) wurde die verwendete Agarose-Konzentration auf zwischen 1 und 1, 2% (Gew./Vol.) erhöht.
Andere Agarosegel-Elektrophoresen wurden unter den in (3) bei 6.9-6.15 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei Tris- Acetatpuffer (TAE) für präparative Gele (DNA-Reinigung) oder Tri-Borat-(TBE-)Puffer für Analysenzwecke verwendet wurde.
Nach der Trennung nach der Größe wurden die DNA-Fragmente von Interesse vom Agarosegel extrahiert und, sofern nicht anders angegeben, entweder nach einem Filtrationsverfahren unter Einsatz von Zentrifugieren, wie von Zhu et al., Bio/Technology 3, 1014-1016 (1985), beschrieben, oder dem Reinigungsverfahren unter Einsatz von Glaskugeln, das unter dem Markennamen "Gene Clean" von Bio101 angeboten wird, isoliert und gereinigt.
Dephosphorylierungen der DNA-Fragmente von Interesse, einschließlich linearisierter Vektoren, wurden unter den in (3) bei 1.60-1.61 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Ligationen von DNA-Fragmenten an die linearisierten Vektoren oder auf andere Weise wurden unter den in (3) bei 1.68-1.69 angegebenen Bedingungen und nach dem darin beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dieses Verfahren wurde unabhängig davon eingesetzt, ob die zu ligierenden Fragmente kohäsive oder stumpfendige Termini enthielten. In diesem Zusammenhang ist festzustellen, dass die hierin eingesetzte Ligase T4- DNA-Ligase war.
Synthetische Oligonukleotide wurden nach den von S.L. Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22, 1859-1882 (1981), beschriebenen Verfahren und unter Einsatz von β-Cyanoethylphosphoramiditen in einem Biosearch Cyclone Synthesizer konstruiert.
Markierung synthetischer Oligonukleotide wurde durch Phosphorylierung mit [γ-³²P]ATP unter-Einsatz von Bakteriophagen T4-Polynukleotidkinase unter den in (3) auf den Seiten 11.31-11.33 angeführten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Klonierungen, Subklonierungen und/oder Einführungen doppelstrangiger DNA-Linker (die als Donor-DNA verwendet werden) in Rezeptorvektoren wurden erreicht, indem zwei komplementäre synthetische Oligonukleotide zusammengestellt wurden, die in einer phosphorylierten Form erhalten wurden. Beide Oligonukleotide wurden in 1 · KGB-Puffer vermischt, wie in (3) auf Seite 5.31 beschrieben, und für 10 min auf 95ºC erhitzt. Das Gemisch wurde dann langsam (über einen Mindestzeitraum von 15 min) auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Auf diese Weise wurden die doppelstrangigen synthetischen Linker bereitgestellt. Diese doppelstrangigen synthetischen Linker wurden als Donor-Fragment entweder direkt in Ligationen, wie oben erörtert, eingesetzt, oder vor einer solchen Ligation Restriktionsspaltung unterzogen, wie oben erörtert, wie in den Beispielen gewünscht und angegeben.
DNA-Konstruktionen wurden durchgeführt, indem Stämme von E.coli als Klonierungswirt eingesetzt wurden. Alternativ dazu und sofern angegeben, wurden Stämme von Bacillus subtilis als Klonierungswirte verwendet.
Transformationen von E.coli-Wirtszellen wurden unter Einsatz des CaCl&sub2;-Verfahrens unter den in (3) bei 1.82-184 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Alternative (und angegebene) Transformationen von E.coli-Wirtszellen wurden unter Einsatz von Elektroporation unter den in (3) bei 1.75-1.81 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die für die Transformationen verwendeten E.coli-Wirtszellen waren E.coli C1061.
Transformationen von B. subtilis-Wirtszellen wurden unter Einsatz des Competent Cell Method unter den in (5) bei 9-11 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Alternative (und angegebene) Transformationen von B. subtilis wurden unter Einsatz der Proplast-Technik unter den in (6) auf S. 150-151 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei die folgenden Modifikationen vorgenommen wurden: Lysozympulver wurde mit 5 mg/ml in SMMP zugeben, anstelle von 1 mg/ml wie in Schritt 7 des in (6) auf S. 151 angegebenen Verfahrens (die zum Erhalt einer maximalen Lyse mit Lysozym erforderliche Inkubationszeit betrug 60 min); und die Regeneration wurde auf DM3-Medium ergänzt mit 200 ug/ml Kanamycin durchgeführt.
Die für die Transformationen verwendeten B. subtilis-Wirtszellen waren B. subtilis BR151.
Transformationen von Bacillus licheniformis-Wirtszellen wurden unter Einsatz der Proplast-Technik unter den in (6) auf S. 150-151 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei die folgenden Modifikationen vorgenommen wurden: Lysozympulver wurde mit 5 mg/ml in SMMP zugegeben, anstelle von 1 mg/ml wie in Schritt 7 des in (6) auf S. 151 angegebenen Verfahrens. Die zum Erhalt maximaler Lyse mit Lysozym erforderliche Inkubationszeit betrug 60 min.
Die Selektion von E.coli-Transformanten wurde unter Verwendung eines geeigneten Antibiotikums durchgeführt. Für alle Plasmide, die von pBR322, pUC18, pUBC131 oder pMK4 stammten, wurde Ampicillin (100 ug/ml Kulturmedium) verwendet. Für alle von pACYC184 stammenden Plasmide wurde Tetracyclin (12,5 ug/ml Kulturmedium) verwendet.
Die Selektion von B. subtilis-Transformanten wurde auf Luria-und-Bertani-Medium, ergänzt mit dem geeigneten Antibiotikum, durchgeführt. Kanamycin (25 ug/ml) wurde für alle Plasmide verwendet, die von pUB110, pUB131 und pUBC131 stammten. Chloramphenicol (10 ug/ml) wurde für alle von pMK4 stammenden Plasmide verwendet.
Die Selektion von B. licheniformis-Transformanten wurde mit Phleomycin mit 14 ug/ml (für pUB110 und pUB131-Derivate) durchgeführt, und die Regenerationszeit auf DM3- Platten [siehe (6) Seite 150] betrug 3 bis 4 Tage. Die auf den DM3-Platten erscheinenden Kolonien wurden für die weitere Arbeit auf L-B-Platten übertragen, die das geeignete Antibiotikum enthielten.
Die Isolierung von Plasmiden aus selektierten Transformantenkolonien wurde dadurch durchgeführt, dass die Kolonien in Kulturen in kleinem Maßstab gezüchtet und dann einem Laugenlyseverfahren unterzogen wurden, und zwar unter den in (3) bei 1.25- 1.28 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren. Für Transformantenkolonien von B. subtilis-Wirtszellen wurde dieses Verfahren in den folgenden zwei Aspekten modifiziert: (a) die Glucose in der in (3) bei 1.25 beschriebenen Lysepufferlösung I wurde durch 20 0/0 (Gew./Vol.) Saccharose ersetzt, und Lysozym (10 mg/ml) wurde frisch zugegeben; und (b) die Lyse wurde für 30 min bei 37ºC durchgeführt, bevor Lösung 11 zugegeben wurde.
An den Plasmid-DNA-Präparaten im kleinen Maßstab durchgeführte Restriktionsanalysen wurden unter den in (3) bei 1.85 und in (6) auf S. 374-379 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die für die Analyse verwendeten relevanten Restriktionsenzyme werden in den Restriktionskarten gezeigt, die in den entsprechenden Figuren für jede neue Plasmidkonstruktion angeführt sind.
Bei einigen Klonierungsversuchen wurden zwei Ausrichtungen des Donor-DNA-Fragments in Bezug auf das Rezeptorplasmid erwartet. In solchen Fällen wurde an den Plasmid-DNA-Präparaten im kleinen Maßstab durch Restriktionsanalyse ein Screening durchgeführt, und zwar unter den in (3) bei 1.25-1.28 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren. Die beim Screenen eingesetzten relevanten Restriktionsstellen werden in den Restriktionskarten gezeigt, die in den entsprechenden Figuren für jede Plasmidkonstruktion dargelegt sind.
Nachdem das bzw. die gewünschte(n) Plasmid(e) ausgewählt worden war(en), wurden Präparationen im großen Maßstab unter Einsatz des Laugenlyseverfahrens unter den in (3) bei 1.38-1.39 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt, gefolgt von einer CsCl-Reinigung unter den in (3) bei 1.42-1.45 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren.
Plasmide von E.coli wurden unter Einsatz des Laugenlyseverfahrens nach den in (3) bei 1.38-1.39 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt, gefolgt von einer CsCl-Reinigung, die nach den in (3) bei 1,4-1.45 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt wurde.
Plasmide von B. subtilis und/oder B. licheniformis wurden unter Einsatz des Laugenlyseverfahrens nach den in (3) bei 1.38-1.39 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren isoliert, hergestellt und gereinigt und in den zwei folgenden Punkten modifiziert: (a) die Glucose in der in (3) bei 1.38 beschriebenen Lysepufferlösung I wurde durch 20% Saccharose ersetzt; und Lysozym wurde frisch in 10 mg/ ml zugegeben; und (b) die Lyse wurde im Verlauf von 30 min bei 37ºC durchgeführt, bevor Lösung II zugegeben wurde. Das Plasmid wurde dann durch eine CsCl-Reinigung unter den in (3) bei 1.42-1.45 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren gereinigt.
DNA-Extraktionen stammten von Bakterien-Spezies, die für 16 h bei 37ºC in L-B-Medium gezüchtet worden waren.
Extraktionen und Reinigungen chromosomaler DNA aus Zellkulturen wurden durch Zentrifiguation der Kulturen mit 5.000 U/min für 10 min erhalten, während sie sich in der stationären Phase befanden. Das resultierende Pellet wurde dann in 9 ml 0,1M TRIS- HCL-Puffer (pH 8,0), 0,1 M EDTA und 0,15M NaCl suspendiert, der 18 mg Lysozym enthielt. Die resultierende Lösung wurde dann für 15 min bei 37 T inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde das Lysat mit 20 pl einer RNAse-Lösung (10 mg/ml) für 20 min bei 50ºC behandelt. Daraufhin wurden dem Lysat 1 ml einer 10 Wo (Gew./Vol.) SDS- (Natriumdodecylsulfat-) Lösung zugegeben und das Gemisch bei 70ºC für 30 min inkubiert. Das Lysat wurde dann unter gelegentlichem manuellem Rühren auf etwa 45ºC abgekühlt, bis eine transparente Lösung erhalten wurde. Dann wurden an dieser transparenten Lösung mehrere Phenolextraktionen unter den in (3) auf Seite E.3 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt, bis eine gut definierte Grenzfläche (wie darin beschrieben) erhalten wurde. Die extrahierte DNA wurde dann durch die Zugabe von 20 ml Ethanol gefällt. Das Pellet wurde durch Zentrifugieren mit 5.000 U/min für 5 min gewonnen und in 2 ml TE-Puffer (pH 8,0) gelöst.
Kulturen von E.coli, B. licheniformis und B. subtilis wurden entweder in flüssigem oder festem L-B-Medium gezüchtet.
"Plattierungen" wurden durchgeführt durch: (a) Verteilen der entsprechenden Lösung auf einer flüssigen Bakterien-Kultur, im Wesentlichen unter den in (b) auf S. 60 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren auf einem geeigneten Agar-hältigen Medium mit 15% (Gew./Vol.); und (b) Züchten der resultierenden Platte bei 37ºC für 18 h, um isolierte Kolonien des Bakteriums zu erhalten.
Isolierungen einzelner Kolonien wurden unter den in (6) auf S. 58-60 dargelegten Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt, und allgemeine Bedingungen für das Wachstum und die Beibehaltung der Stränge waren die in (6) auf S. 61-62 und in (4) auf S. 5-6 dargelegten Bedingungen und beschriebenen Verfahren.
Mit dem Begriff "übertragen" ist das Übertragen einer bakteriellen Kolonie von einem Kulturmedium (wie z. B. einer Petri-Platte) in ein anderes unter Einsatz von Standard- Impftechniken gemeint, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind.
Zentrifugieren im großen Maßstab (> 100 ml) wurde unter Einsatz einer Beckman-Zentrifuge durchgeführt, die mit einem G2-21-Rotor ausgestattet war. Die gleiche mit einem JA-10-Rotor ausgestattete Zentrifuge wurde für alle Zentrifugationen von 50-100 ml verwendet. Zentrifugationen mit 3-49 ml wurden unter Einsatz der gleichen Zentrifuge, ausgerüstet entweder mit einem JA-20- oder einem JA-A-Rotor, durchgeführt.
Quantifizierungen der DNA wurden nach den photometrischen Bestimmungsverfahren durchgeführt, wie in (3) auf S. E.5 beschrieben.
Amplifizierungen in vitro von DNA durch Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden unter den in (3) bei 14.18-14.19 sowie in den detaillierten Vorschriften, die in von Biolabs erstandenen PCR-Amplifizierungssets verfügbar sind, angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Übertragungen von DNA-Fragmenten von Agarosegelen auf Nitrocellulosemembran (für Southern-Blotting-Versuche) wurden unter den in (3) auf S. 9.38-9.39 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Southern Blotting-Techniken wurden unter den in (3) auf S. 9.31 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Hybridisierungen von radiomarkierten Sonden an die auf die Nitrocellulosefilter übertragene DNA wurden unter den in (3) bei 9.52-9.55 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Nukleotidsequenzierungen wurden unter dem allgemeinen Kettenterminations-Didesoxyverfahren unter den von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977), angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei synthetische Oligonukleotide verwendet wurden, die als Primer für die DNA-Polymerasereaktionen dienten.
Präparate für die Didesoxy-vermittelten Reaktionen unter Verwendung der T7-DNA-Polymerase wurden unter den im T7-Sequenzierungsset-Handbuch von Pharmacia LKB Biotechnology angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren hergestellt. Die für die Reaktionen verwendeten Template waren doppelstrangige Plasmide, die durch großangelegte Plasmid-Herstellung unter Einsatz von CsCl-Gradienten- zentrifugation isoliert wurden, wie oben beschrieben. Die in den Sequenzierungsreaktionen verwendeten Template wurden durch Behandlung mit NaOH denaturiert, wie in den T7-Sequenzierungssets beschrieben.
Die eingesetzten Sequenzierungsstrategien waren direkte Strategien unter Einsatz progressiver Oligonukleotide, wie in (3) auf S.13.15 und 13.17 (Fig. 13.3B) beschrieben.
Aufladen und Laufenlassen der Sequenzierungsgele sowie deren Autoradiographie und Ablesungen wurden unter den in (3) auf S. 13.54-13.58 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Stellengerichtete Mutagenese wurde unter den von T.A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USÄ 82, 488-492 (1985), sowie in (3) auf S. 15.74-15.79 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Mutagenesen wurden unter Einsatz des von Bio-Rad erstandenen Mutagenphagemid-In vitro-Mutagenesesets (Nr. 170-3.576) durchgeführt. Das Verfahren besteht aus einer Verlängerung eines mutagenen synthetischen Oligonukleotids unter Einsatz von einstrangiger uracylierter DNA als Templat, die vom Phagemidvektor synthetisiert wird.
Bestimmungen der Menge an ausgeschiedenen Proteinen, die den gegebenen Enzymen entspricht, wurden durchgeführt, indem der Kulturüberstand Polyacrylamidgelelektrophorese-(PAGE-)Analyse in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) durchgeführt wurde, um die verschiedenen Polypeptidkomponenten wie folgt zu trennen: eine Probe mit 1 ml des Kulturüberstand wurde durch Zugabe von 7% (Gew./Vol.) Trichloressigsäure (TCA) gefällt und für 1 h bei 0ºC inkubiert. Die gefällten Proteine wurde dann durch Zentrifugieren mit 15.000 U/min für 10 min gesammelt, und das Pellet wurde in 1 ml Probenpuffer gelöst, der aus 10 mM Tris/HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 2,5% (Gew./Vol.) SDS, 5 Vol.-% β-Mercaptoethanol und 0,001% (Gew./Vol.) Bromphenolblau bestand. Die resultierende Suspension wurde entsprechend (siehe unten) mit dem Probenpuffer verdünnt und bei 98ºC 15 min lang denaturiert. Unlösliche Materialien wurden dann durch Zentrifugieren mit 15.000 U/min für 5 min entfernt. Die resultierenden Proben wurden dann SDS-PAGE-Analyse unter Verwendung eines Pharmacia LKB Biotechnology erstandenen PhastSystem unterzogen, und zwar unter den in der Separation Technique File No. 110 angegebenen Bedingungen und nach den darin beschriebenen Verfahren, wobei ein 10&supmin;¹ S % (Gew./Vol.) Polyacrylamidgradient verwendet wurde. Die Gele wurden für 60 Vh mit einer maximalen Spannung von 250 Volt, einer maximalen Leistung von 3 Watt und einer maximalen Stromstärke von 10 mA laufen gelassen. Nach der Trennung der Polypeptide wurden die Gele mit Coomassie-Blue gefärbt, wie in der Development Technique File No. 200 von Pharmacia beschrieben. Die gefärbten Gele wurden dann Densiometrie-Abtastung unter Einsatz eines Laser-Densiometers (XL) von Pharmacia LKB Biotechnology unterzogen. Die Proteinmenge in der gefärbten Bande, die dem Enzym von Interesse entsprach, wurde durch Vergleich mit einem Rinderserumalbumin-(BSA-) Standard ermittelt, der parallel laufen gelassen wurde. Die die folgenden scheinbaren Molekulargewichte aufweisenden Banden wurden für die verschiedenen analysierten Enzyme in Betracht gezogen:
Xylanase: 26 kDa
Pullulanase: 110 kDa
Subtilisin 168: 28 kDa
Subtilisin Carlsberg: 28 kDA
Die Verdünnungen der Überstandsproben, die PAGE/Densiometrie-Analyse unterzogen wurden, wurden so eingestellt, dass etwa die gleiche Peakfläche für die Proben und den BSA-Standard gemessen wurde. Hintergrundwerte wurden von jeder Probe abgezogen. Die Hintergrundwerte wurden aufgrund von Vergleichsversuchen geschätzt, die in der parallelen Analyse eines Überstands vom entsprechenden Wirt bestanden, der anstelle des Expressionsvektors den Kontrollvektor pUB 131 aufweist.
Verdünnungen, Mengen usw., die in der vorliegenden Beschreibung als Prozentsätze ausgedrückt sind, sind, sofern nicht anders angegeben, Prozentsätze, die als prozentuelles Gewicht pro Volumen (Gew./Vol.) angeführt sind. Wie hierin verwendet beziehen sich Verdünnungen, Mengen usw., die als Vol.-% ausgedrückt sind, auf prozentuelles Volumen pro Volumen.
Die hierin angeführten Temperaturen sind in Grad Celsius (ºC) angegeben.
Die Restriktionsenzymstellen, die durch den Restriktionsenzym-Namen, gefolgt von einer Zahl in Klammern ([]) angegeben sind, beziehen sich unter Bezugnahme auf die Figuren auf die erste Nukleotidposition in der Sequenz des Plasmids (oder Fragments), das vom Restriktionsenzym erkannt wird.
Folgerungen der Aminosäureverteilung, des Molekulargewichts und des pl wurden alle unter Einsatz der IntelliGenetics Suite-Software von Molecular Biology (Version Nr. 5.4) von IntelliGenetics, Inc., USA, durchgeführt.
Die angegebenen Größen von DNA-Fragmenten, die durch Restriktionsspaltungen erhalten werden, wird durch die Differenz zwischen den beiden Nukleotidpositionen definiert, die den Restriktionsstellen entsprechen.
Nachdem die verschiedenen Verfahren zum Herstellen und Erhalten der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung von verschiedenen Wirten, die Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Xylanase-Gens, die Konstruktion von Expressionsvektoren und Expressionswirten für die Expression der Xylanase und die Verwendung der Xylanase als enzymatische Vorbehandlung zum biologischen Bleichen von Pulpen (und insbesondere Holzzellstoff) somit beschrieben worden sind, werden nun die folgenden Beispiele allein zum Zweck der Veranschaulichung angeführt, und diese sind nicht als Einschränkung gedacht oder als solche zu intepretieren.

Beispiel 1

Herstellung von bacillus pumilus PRL B12 Xylanase

Eine Kultur von Bacillus pumilus PRL B12 wurde von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 55443 erhalten.
Eine Kultur von Bacillus licheniformis SE2 delap1 wurde auf die nachstehend in Beispiel 28 beschriebene Weise erhalten.
Es wurde ein Agarmedium hergestellt, das 1000 ml Luria-und-Bertani-Medium und 0,5 g AZCL-Xylan enthielt.
Beginnend mit einer gefrorenen Zellsuspension jeder der Kulturen wurden zwei sterile Impfkolben (Kolben A und Kolben B), die das Agarkulturmedium enthielten, durch jeweiliges Ausstreichen mit jeweils einer Suspensionen geimpft. Auf diese Weise wurde Kolben A mit dem B. pumilus PRL B12 geimpft, während Kolben B mit dem B. licheniformis SE2 delap1 geimpft wurde. Die geimpften Kolben wurden dann für 24 h inkubiert, Kolben A bei 30ºC und Kolben B bei 37ºC, so dass jeweilige Kulturen des B. pumilus- und des 8. licheniformis-Stamms darin erhalten wurden.
Ein Vorkulturmedium wurde hergestellt, das bestand aus: 5 g Bacto-Pepton; 5 g Hefeextrakt; 5 g Glucose; und 1000 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0). Das Vorkulturmedium wurde dann sterilisiert.
Ein Paar steriler 250 ml-Erlenmayer-Kolben (Vorkultur-Kolben Nr. 1 und Vorkultur-Kolben Nr. 2) wurden jeweils mit 50 ml Vorkulturmedium gefüllt. Vorkultur-Kolben Nr. 1 wurde dann mit dem B. pumilus PRL B12 aus der Kultur von Kolben A geimpft. Auf ähnliche Weise wurde Vorkultur-Kolben Nr. 2 mit dem B. licheniformis SE2 delap1 aus der Kultur von Kolben B geimpft. Diese beiden Vorkultur-Kolben wurden dann bei 30 ºC unter Rühren (Orbitalbewegung mit 250 U/min mit einer Amplitude von etwa 2,54 cm) für 16 bis 24 h geimpft (wobei 24 h bevorzugt waren). Am Ende der Inkubation wurde das Vorhandensein einer Kultur des B. pumilus PRL B12-Stamms in Vorkultur- Kolben Nr. 1 visuell beobachtet, und das Vorhandensein einer Kultur des B. licheniformis SE2 delap 1-Stamms wurde in Vorkultur-Kolben Nr. 2 visuell beobachtet. Die Identität dieser Kulturen wurde durch Standard-Detektionstechniken bestätigt.
Der B. licheniformis SE2 delap1-Stamm wurde dann mit dem pU8-BPX12-Expressionsvektor für Xylanase transformiert (der konstruiert worden war, wie nachstehend in Beispiel 17 beschrieben), um B. licheniformis SE2 delap1 (pUB-BPX12) zu bilden, und jeweilige Transformanten wurden selektiert, isoliert und gereinigt, wie nachstehend in Beispiel 29 beschrieben.
B. pumilus PRL B12 und B. licheniformis SE2 delap1 (pUB-8PX12) vermehren sich jeweils in unterschiedlichen Kulturmedien am besten. Außerdem vermehrt sich jeder dieser Stämme nicht zufriedenstellend in dem Kulturmedium, in dem sich der andere Stamm am besten vermehrt. Daher wurden zwei verschiedene Kulturmedien (hierin als "M1" und "M2" bezeichnet) wie folgt hergestellt:
(1) M1-Kulturmedium umfasste 60 g Weizenkleie; 13 g löslichen Weizenkeimextrakt; 1 g Natriumchlorid; und 1000 ml entionisiertes H&sub2;O.
(2) M2-Kulturmedium umfasste 60 g Sojamehl; 75 g lösliche Stärke; 2 g Natriumsulfat; 5 mg Magnesiumchlorid; 3 g NaH&sub2;PO&sub4;, 0,2 g CaCl&sub2;·H&sub2;O; und 1000 ml H&sub2;O. Der pH der Suspension wird mit 10 N NaOH auf 5,8 eingestellt.
Das M1-Kulturmedium ist ein Medium, in dem sich der B. pumilus-PRL B12-Stamm gut vermehrt. Das M2-Kulturmedium ist ein Medium, in dem such die verschiedenen B. licheniformis SE2 delap-Stämme gut vermehren.
Die Kulturbrühen wurden dann sterilisiert.
Ein Paar sterilisierter 1 l-Rührkolben, die jeweils mit 4 Brechern ausgestattet waren (wobei die Kolben in der Folge als Kulturkolben Nr. 1 und Kulturkolben Nr. 2 bezeichnet werden), wurden dann wie folgt mit dem Kulturmedium gefüllt: Kulturkolben Nr. 1 wurde mit 100 ml des M1-Kulturmediums gefüllt; und Kulturkolben Nr. 2 wurde mit 100 ml des M2-Kulturmediums gefüllt.
Kulturkolben Nr. 1 wurde dann aus der Kultur von B. pumilus PRL B12 von Vorkultur- Kolben Nr. 1 geimpft, und Kulturkolben Nr. 2 wurde aus der Kultur von B. licheniformis SE2 delap1 (pUB-BPX12) von Vorkulturkolben Nr. 2 geimpft. Dabei wurde das Kulturmedium in den Kulturkolben mit 1 Vol.-% des Kulturmaterials in den Vorkultur-Kolben geimpft. Das heißt, Kulturkolben, die 100 ml des Kulturmediums enthalten, werden mit 1 ml Kulturmaterial aus den Vorkulturkolben geimpft.
Die Kulturkolben, die das M1- und das M2-Kulturmedium enthielten, wurden dann bei 30ºC 72 h lang unter Rühren inkubiert (Orbitalbewegung mit 250 U/min mit einer Amplitude von etwa 2,54 cm).
Inkubation der Kulturkolben, wie oben angeführt, resultiert unter anderem in der extrazelluläre Produktion von Xylanase. Eine solche Xylanase wird in die Kulturbrühen in den Kulturkolben Nr. 1 und 2 ausgeschieden. Auf das Vorhandensein einer solchen Xylanase in den Kulturbrühen wurde dann getestet, indem die Kulturbrühen spezifisch auf enzymatische Xylanase-Aktivität getestet wurden, wie nachstehend in Beispiel 2 dargelegt.

Beispiel 2

Testen der Kulturbrühe auf Xylanase-Aktivität

Die Bestimmung der Xylanaseaktivität in den Kulturbrühen erfolgte unter Einsatz des XE- (Xylanase-Einheit-) Verfahrens. Bei diesem Verfahren wird das Vorhandensein und das Maß der Xylanase in der Kulturbrühe durch Testen auf die reduzierenden Zucker bestimmt, die als Ergebnis der xylanolytischen Aktivität der Xylanasen in den jeweiligen Kulturbrühen aus einem Xylanasesubstrat (wie z. B. Birken-Xylanan) freigesetzt werden. Die Bestimmung (das Messen) der Konzentration an freigesetzten reduzierenden Zuckern wurde nach dem Somogyi-Nelson-Verfahren durchgeführt, wie in J. Biol. Chem. 153, 375-380 (1944), und J. Biol. Chem: 160, 61-68 (1945), beschrieben.
Sofern nicht anders angegeben wurden die in diesem Beispiel genannten Puffer nach den von Gomori, Method. Enzymol. 1, 138-146, beschriebenen Verfahren hergestellt. Das Somogyi-Reagens und das Nelson-Reagens wurden hergestellt, wie in J. Biol. Chem. 153, 375-380 (1944), und J. Biol. Chem. 160, 61-68 (1945), beschrieben. Das Substrat wurde hergestellt, indem 20 g Xylan (ROTH Atr. 7500) in 1 l eines 50 mM Glycerophosphatpuffers (pH 6,0) gelöst wurden. Diese Lösung wurde dann für 10 min bei 95ºC inkubiert und manuell gerührt, um eine homogene Xylansuspension zu erhalten.
Tests wurden an der B. pumilus PRL B12-Kulturbrühe in Kulturkolben Nr. 1 (dem M1- Kulturmedium) und an der B. licheniformis SE2 delap 1-(pUB-BPX12-)Kulturbrühe in Kulturkolben Nr. 2 (dem M2-Kulturmedium) durchgeführt, wobei 0,1 M Substrat (vorinkubiert bei 50ºC), das vor der Verwendung vorgewärmt worden war, wie oben beschrieben verwendet wurden. Diesem Substrat wurden 0,1 ml der jeweiligen Kulturbrühen mit der Xylanase (mit einer Aktivität zwischen 0,2 und 0,6 XE/ml) darin (die auf 50 ºC vorinkubiert worden war) zugegeben und die Lösungen durch manuelles Rütteln vermischt. Der Test wurde dann für 15 min bei 50ºC laufen gelassen. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von 0,3 ml 0,5 N NaOH zum Gemisch abgebrochen.
Blindproben wurden für jede Verdünnung des Enzyms durch Zugabe von 0,3 ml 0,5 N NaOH vor dem Substrat hergestellt.
Standards wurden hergestellt, indem 0,1 ml Kulturbrühe mit der Xylanase darin durch 0,1 ml einer Reihe von Glucoseverdünnungen mit Konzentrationen von 0 bis 5,555 uM Glucose pro ml Lösung ersetzt wurden.
Wie hierin und in den übrigen Beispielen gemäß vorliegender Erfindung gebraucht ist eine XE (Xylanaseeinheit) als Menge an Xylanase definiert, die unter den Bedingungen des Tests die Freisetzung von reduzierenden Zuckern katalysiert, deren Reduktionsstärke 1 uM Glucose pro Minute entspricht.
Die Ergebnisse der obigen Tests zeigten eine Aktivität für die von B. licheniformis SE2 delap1 (pUB-BPX12) in die Kulturbrühe (von Kulturkolben Nr. 2) ausgeschiedene Xylanase, die zumindest 15-mal stärker war als die Aktivität für die durch B.pumilus PRL B12 in die Kulturbrühe (von Kulturkolben Nr. 1) ausgeschiedene Xylanase.

Beispiel 3

Isolierung und Reinigung von Xylanase aus der Kulturbrühe Die Xylanase wurde aus der Kulturbrühe beginnend mit jeweiligen 100 ml-Proben Kulturgemisch, wie aus den Kulturkolben Nr. 1 und 2 erhalten, isoliert und gereinigt, wie oben in Beispiel 1 angeführt.
Etwa 100 ml der Fermentationsbrühe aus jedem der Kolben Nr. 1 und 2 wurden in jeweilige Testkolben Nr. 1 und Nr. 2 gefüllt. Jedem Testkolben wurde eine jeweilige Menge an Filterhilfe und PERLITE F50 bis zu einer Konzentration von 5,4% (Gew./Vol.) zugegeben.
Die Fermentationsbrühen in den Testkolben wurden dann unter Verwendung eines Büchner-Filtrationstrichters durch Papier filtriert. Bei jeder Filtration wurden etwa 38 ml (flüssiges) Filtrat erhalten, ebenso wie Filterkuchen. Jeder der Filterkuchen wurde dann mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis jeweilige Endvolumina von 100 ml Filtrat erhalten wurden.
Die erhaltenen Filtrate wurden dann in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle (gerührte Zelle Serie 800 mit einer YM10-Membran mit einem 10 kD-Abschnitt) konzentriert. Die Konzentrataktivität wurde dann gemessen.
1 ml jeder dieser konzentrierten Proben wurde dann auf jeweilige Sepharose Mono-Q HP 16/10-Anionenaustauschsäulen geladen, die mit einem 20 mM TRIS-Puffer (ph 8,0) äquilibriert worden waren. Die Elution wurde unter Einsatz einer Durchflussrate von 3 ml/min eines 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-(TRIS-)Puffers (pH 8,0) mit linear zunehmender NaCl-Konzentration von 0 bis 1 Mol durchgeführt. Das führte zu den Elutionen der Xylanase-Aktivität direkt nach dem Todvolumen auf der Säule in ein Volumen von 15 ml. Dann wurden jeweilige Fraktionen erhalten.
1 ml jeder dieser Fraktionen wurde dann auf jeweilige Phenyl Sepharose 16/10-Säulen geladen, die mit einem 20 mM Glycinpuffer (pH 9,0), 1M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; äquilibriert worden waren. Die Elutionen wurden durch einen absteigenden Gradienten von Ammoniumsulfat in ebendiesem Puffer von 1 M auf 0 M in 10 min durchgeführt, gefolgt von einer isokratischen Elution mit einer Abgabe von 5 ml/min. In jeder Säule wurde die Xylanase-Aktivität in einer Fraktion nach 20 bis 21 min eluiert. Diese gereinigten eluierten Fraktionen erwiesen sich als elektrophoretisch homogen.

Beispiel 4

Aminosäuresequenz

Die Aminosäuresequenz der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung wurde direkt durch Ableitung von der Nukleotidsequenz des dafür kodierenden Gens bestimmt (wobei das Gen erhalten und sequenziert wurde, wie nachstehend in Beispiel 17 ausführlich erörtert).
Um den korrekten Leserahmen zu bestimmen, wurden die N-terminalen Sequenzen der Xylanase der erhaltenen Fraktionen (wie oben in Beispiel 3 beschrieben) sowohl vom B. pumilus-Stamm als auch vom 8. licheniformis-Stamm nach dem in J. Vandekerkhove et al., Eur. J. Biochemistry 152, 9 (1985), beschriebenen Verfahren ermittelt. Diese N-terminalen Sequenzen erwiesen sich als identisch wie folgt:
Seq.-ID Nr. 2
Glu-Thr-Ile-Tyr-Asp-Asn-Arg-Ile-Gly-Thr-His-Ser-Gly-Tyr-Asp
Unter Einsatz der N-terminalen Sequenzen zur Bestimmung des korrekten Leserahmens wurde festgestellt, dass die Vorläufer-Xylanase gemäß vorliegender Erfindung aus 227 Aminosäureresten besteht (siehe die Fig. 1a und 1b) Seq.-ID Nr. 1. Die übrigen 200 dieser Aminosäuren sind das reife Protein. Dieses ist dasselbe, ob das Gen homolog von B. pumilus PRL B12 exprimiert wird oder heterolog von einem rekombinanten Wirt exprimiert wird, der damit transformiert worden ist, wie z. B. die deletierten B. licheniformis SE2 delap-(pUB-BPX12-)Stämme.
Die von der Xylanase von Bacillus pumilus PRL B12 abgeleitete Aminosäuresequenz (wie in den Fig. 1a und 1b zu sehen) unterscheidet sich ziemlich stark von denen, die für die Xylanasen abgeleitet wurden, die entweder von B. pumilus IPO oder B. pumilus DSM 6124 ausgeschieden werden.

Beispiel 5

Aminosäureverteilung

Die Aminosäureverteilung der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung wurde direkt anhand der Aminosäuresequenz der Xylanase bestimmt (die indirekt bestimmt wurde, wie oben in Beispiel 4 beschrieben).
Die Untersuchung der Aminosäureverteilung der 200 Aminosäuren, die das "reife" Xylanaseprotein umfasst, zeigt ein Enzym das reich an Tyrosin, Threonin und Asparagin ist, wie folgt: Tabelle 2 Aminosäurevereilung der "reifen" Xylanase
Eine solche Aminosäureverteilung unterscheidet sich beträchtlich von jenen, die für die von B. pumilus IPO und B. pumilus DSM 6124 produzierten Xylanasen berichtet wird.

Beispiel 6

Ableitung des Molekulargewichts von der Aminosäureverteilung

Die Ableitung des Molekulargewichts der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung wurde indirekt anhand der oben in Tabelle 2 angegebenen Aminosäureverteilung ermittelt (berechnet). Diese Ableitung gab der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung ein Molekulargewicht von 22.534,55 Dalton (D).

Beispiel 7

Bestimmung des Molekulargewichts mittels SDS-PAGE-Analyse

Jede der gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Proben zur Bestimmung des Molekulargewichts wurde aus den gereinigten Fraktionen aus Beispiel 3 erhalten.
Eine Abschätzung des Molekulargewichts der gereinigten Xylanaseproben gemäß vorliegender Erfindung unter Einsatz von SDS-PAGE-Analyse wurde unter Denaturierungsbedingungen auf Polyacrylamidgel unter Verwendung von Parmacia PhastGel 10-15% (Gew./Vol.) und 20% (Gew./Vol.) Gelen durchgeführt.
Pharmacia LMW-Marker wurden eingesetzt, um die Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und der Migrationsdistanz zu bestimmen. Eine Phiole wurde in 1,5 ml des folgenden Puffers verdünnt, der ebenfalls für die Proben verwendet wurde: 10 mM TRIS (pH 8), 1 mM EDTA, 2,5% (Gew./Vol.) SDS; 5 Vol.-% β-Mercaptoethanol und 0,1% (Gew./Vol.) Bromphenolblau.
Die Proben wurden jeweils mit Trichloressigsäure gefällt, bevor sie auf eine Konzentration von etwa 100 ug Protein/ml verdünnt wurden (Test: Modifikation des Bradford Coomassieblau-Bindungstests, beschrieben von Read und Northcote, Analytical Biochem., 116, 53-64) im gleichen Puffer, wie oben angeführt, wie er verwendet wurde, um die Marker zu verdünnen. Die verdünnten Proben wurden dann bei 98ºC für 1 S min denaturiert, und 4 ul wurden auf den Gelen abgelagert. Die Gele wurden für 60 Vh mit einer maximalen Spannung von 250 Volt, einer maximalen Leistung von 3 Watt und einer maximalen Stromstärke von 10 mA laufen gelassen.
Die Ergebnisse dieser SDS-PAGE-Analyse sind unter Bezugnahme auf den Graph in Fig. 2 abzulesen, wo die Migrationsdistanz von der Anode aufgetragen ist. In beiden Fällen (10 bis 1 S % und 20% Gele) weisen die Xylanaseproben vom nativen 8. pumilus PRL B12-Stamm und dem rekombinanten B. licheniformis SE2 delap1- (pUB-BPX12-) Stamm genau dieselbe elektrophoretische Mobilität auf. Weiters wurde das scheinbare Molekulargewicht in beiden Fällen mit 26 kD festgestellt.

Beispiel 8

Vorhersage des pl aufgrund der Aminosäuresequenz

Vorhersage des isoelektrischen Punkts (pl) der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung aufgrund der in den Fig. 1a und 1b angegebenen Aminosäuresequenz. Diese Ableitung ergab für die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung einen isoelektrischen Punkt von 9,56.

Beispiel 9

Bestimmung des pl durch isoelektrische Fokussierungsanalyse

Jede der hierin für die Bestimmung des isoelektrischen Punkts (pl) verwendeten Proben wurde aus den gereinigten Fraktionen aus Beispiel 3 erhalten.
Diese Bestimmung erfolgte durch isoelektrische Fokussierung in Polyacrylamidgelen unter Einsatz von Pharmacia DryIEF Gelen, die mit 2 ml einer Ampholinlösung (1 Volumen Pharmacia 8-10,5% (Gew./Vol.) Amphilin, zugesetzt zu 15 Volumina entionisiertem Wasser) rehydriert worden waren, nach der vom Lieferanten empfohlenen Vorschrift.
Eine 4 ul-Aliquote jeder der Enzymverdünnungen in H&sub2;O, die etwa 100 ug Xylanase enthielt, wurde in der Mitte der Gele abgelagert und geladen (200 V, 15 Vh), nachdem Vorfokussierung erfolgt war (2.000 V, 75 Vh). Pharmacia high pH-Marker wurden als Standards verwendet.
Nach dem Fokussieren wurden Gele mit Coomassieblau nach der Vorschrift gefärbt, die in der Separation Technique File No. 101 (Veröffentlichung 18-1018-20, Pharmacia LKB Biotechnology) ausgeführt ist.
Unter Einsatz dieser Technik wurde der Wert des isoelektrischen Punkts der von B. pumilus PRL B12 ausgeschiedenen Xylanase sowie der von B. licheniformis SE2 delap1 (pUB-BPX12) ausgeschiedenen Xylanase mit 9,8 bis 9, 9 bestimmt. Weiters ist ihr Verhalten dasselbe. Die Ergebnisse dieser Analyse sind Fig. 3 zu entnehmen.

Beispiel 10

Bestimmung der optimalen Temperatur für Xylanase-Hydrolyse

Jede der gemäß vorliegender Erfindung für die Bestimmung der optimalen Temperatur verwendeten Proben wurde aus den gereinigten Fraktionen aus Beispiel 3 erhalten.
18 Proben, von denen jede 1% (Gew./Vol.) Birkenholz-Xylansubstrat (Roth Atr. 7500) enthielt, wurden in 50 mM Glycophosphatpuffer (pH 6,5) gelöst.
Tests an jeder der Proben wurden dann mit einer Inkubationszeit von 15 min durchgeführt. Diese Tests wurden an Paaren von Proben mit Temperatursteigerungen von 5ºC, beginnend mit 40ºC bis hinauf zu 80ºC durchgeführt. Die Menge an freigesetzten reduzierenden Zuckern gibt einen Hinweis auf die Aktivität der getesteten, Xylanaseprobe. Die Menge an freigesetzten Zuckern wurde nach dem Somogyi-Nelson-Verfahren gemessen, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die Ergebnisse dieser Tests, angegeben in Prozentsätzen der maximalen Aktivität, sind in Tabelle 3 wie folgt angeführt: Tabelle 3 Bestimmung der optimalen Temperatur
Die Durchführung der oben genannten Tests lieferte Ergebnisse, die zeigen, dass die optimale Temperatur der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung 55ºC beträgt.

Beispiel 11

Bestimmung des Bereichs der Temperaturstabilität

Jede der hierin für die Bestimmung des Bereichs der Temperaturstabilität der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Proben wurde aus den gereinigten Fraktionen aus Beispiel 3 erhalten und präpariert, wie in Beispiel 10 beschrieben.
Tests an jeder der Proben wurden dann nach der in nachstehender Tabelle 3 angeführten Vorinkubationszeit (in min) und bei den dortigen Temperaturen durchgeführt. Die Aktivität dieser Proben wurde nach der oben in Beispiel 2 dargelegten Vorschrift nach 0, 10, 30, 60 und 120 min bestimmt.
Die Ergebnisse dieser Tests, angegeben als Prozentsätze der maximalen Aktivität, sind in Tabelle 4 wie folgt angeführt: Bestimmung des Bereichs der Temperaturstabilität
Die Durchführung der oben genannten Tests lieferte Ergebnisse, die zeigen, dass bei 50 ºC die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung für zumindest 120 min vollständig stabil ist.

Beispiel 1 2

Bestimmung des optimalen pH Für Xylan-Hydrolyse

Jede der gemäß vorliegender Erfindung für die Bestimmung des optimalen pH verwendeten Proben wurde von den gereinigten Fraktionen aus Beispiel 3 erhalten und präpariert, wie in Beispiel 10 beschrieben.
Tests an jeder der 22 Proben (eingestellt auf unterschiedliche pH-Werte, wie unten in Tabelle 5 angegeben) wurden bei 50ºC (die Korrektur für pH/Temperatur-Beziehung ist bei diesem Puffer vernachlässigbar) mit einer Inkubationszeit von 15 min nach der oben in Beispiel 2 dargelegten Vorschrift durchgeführt. Die Menge an freigesetzten reduzierenden Zuckern gibt einen Hinweis auf die Aktivität der getesteten Xylanase-Probe. Die Menge an freigesetzten reduzierenden Zuckern wurde nach dem Somogyi-Nelson-Verfahren gemessen, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 5 wie folgt angeführt: Bestimmung des optimalen pH
Die Durchführung der oben genannten Tests liefert Ergebnisse, die zeigen, dass der optimale ph der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung 6,5 bis 7,0 beträgt.
Aus allen obigen Beispielen geht hervor, dass die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung dieselbe ist, unabhängig davon, ob sie von ihrer natürlichen Quelle (B. pumilus PRL B12) oder vom rekombinanten Wirt B. licheniformis SE2 delap1 (pUB-BPX12) exprimiert wird. Weiters scheint es, dass die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung eine Aminosäuresequenz und -verteilung aufweist, die sich von jenen anderer Xylanasen unterscheiden, sogar jenen Xylanasen, die von anderen Stämmen von B. pumilus produziert werden.

Beispiel 13

Auswirkung des pH auf die Wirksamkeit der Xylanase-Vorbehandlung

Es wurden 8 Suspensionen einer Weichholz-Kraftpulpe hergestellt, die jeweils einen anfänglichen κ-Index von 25,5 und eine Konsistenz von 2,5% aufweisen. 6 dieser Suspensionen wurden für 2 h bei 50ºC mit 30 XE der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung pro Gramm damit zu behandelnder trockener Pulpe vorbehandelt. Zwei zusätzliche Suspensionen des Kraft-Holzzellstoffs wurden den gleichen Bedingungen unterzogen, aber in Abwesenheit jeglicher Xylanase. Diese vorbehandelten Kraftzellstoff-Proben wurden dann ohne Waschen dazwischen einer Chlorierung (C) unter Verwendung des nachstehend in Tabelle 6A angeführten Gewichts an Chlor (bezogen auf aktive Chlor- Multiple angegeben) unterzogen, gefolgt von einer Laugenextraktion (E).
Es wurden 24 Suspensionen einer Hartholz-Kraftpulpe hergestellt, die einen anfänglichen κ-Index von 13 und eine Konsistenz von 2,5% aufwiesen. Diese Suspensionen wurden für 2 h bei 50ºC mit 30 XE der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung pro Gramm damit zu behandelnder trockener Pulpe vorbehandelt. Diese vorbehandelte Kraftpulpe-Proben wurden dann ohne Waschen dazwischen einer Chlorierung (C) bei 22ºC für 1,0 h und einer Konsistenz von etwa 3% unterzogen, gefolgt von einer Laugenextraktion (E) bei 60ºC für 1,5 h und bei einer Konsistenz von 5% (siehe Tabelle 6B).
Die unterschiedlichen Behandlungs-pHs wurden durch geringfügige Zugabe verdünnter Säure (0,1 N), wie z. B. Schwefelsäure, erhalten. Die Behandlung bei pH 9,5 entspricht im Wesentlichen tatsächlichen industriellen Situationen, wo der pH nicht reguliert wird, wobei die Pulpe in nicht-gepuffertem Wasser suspendiert wird (dieser Test ist in Tabelle 6A mit einem Stern markiert).
Die Ergebnisse der Vorbehandlung sind nachstehend in den Tabellen 6A und 6B angeführt: Tabelle 6A Wirkung des pH auf die Wirksamkeit der Vorbehandlung mit B.pumilus PRL B12-Xylanase in klassischen Bleichsequenzen Tabelle 6B Wirkung des pH auf die Wirksamkeit der Vorbehandlung mit B. pumilus PRL B12- Xylanase in klassischen Bleichsequenzen
Überraschenderweise (und im Gegensatz zu den Beispiel 12 und Tabelle 5 zu entnehmenden Ergebnissen, worin der optimale pH, wenn er auf einem gereinigten Substrat bestimmt wurde, nur etwa 7,0 beträgt) scheint, wie hierin gezeigt, unter Bio-Bleichbedingungen der optimale pH der Xylanase etwa 8,5 zu betragen, wenn Weichhölzer beteiligt sind, und etwa 7,5 bis 8,0, wenn Harthölzer beteiligt sind.
Weiters und vielleicht noch überraschender ist festzustellen, dass die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung effizient die Delignifizierung von Holzpulpen bei allen pHs im Bereich von 7 bis 9,5 (dem natürlichen pH dieser Kraft-Pulpe in einer wässrigen Suspension) erleichtert.
Die in den Tabellen 6A und 6B festzustellenden erzielten Wirkungen sind auch insofern signifikant, als die enzymatische Behandlung (bei pHs von 6,5 bis 9,5) eine 15%ige Reduktion der Chlormenge, die für die chemische Behandlung von Weichhölzern im Delignifizierungsschritt erforderlich ist, und eine 40%ige Reduktion der Chlormenge ermöglicht, die für die chemische Behandlung von Harthölzern im Delignifizierungsschritt verwendet werden muss.

Beispiel 14

Auswirkung der Xylanase-Konzentration auf die Wirksamkeit der Xylanase-Vorbehandlung

Eine Kraft-Hartholzpulpe wurde nach dem Verfahren, das ausführlich in US-Patent Nr. 4.462.864 beschrieben ist, mit einer Sauerstoffbehandlung behandelt, um eine Sauerstoff-behandelte Pulpe mit einem anfänglichen κ-Index von 12,3 und einem anfänglichen ºISO von 33,4 herzustellen.
Sechs Suspensionen (Proben) wurden dann aus der Sauerstoff-behandelten Pulpe hergestellt.
Die eingesetzten Betriebsbedingungen waren jene, die industriell eingesetzt werden können (50ºC für 1 h bei einer Konsistenz von 5%). Daraufhin wurde mit der Pulpe- Probe das allgemeine Schema der Bleichsequenz (C/D)EDPD durchgeführt.
Zwei der Proben (als Proben 1 und 2 bezeichnet) wurden dann als Bezugs-Bleichsequenzen ausgewählt und wurden hergestellt, indem 1 Dosis aktives Chlor, die dem 0,2- fachen des κ-Index entsprach, im Verlauf des C/D-Schritts eingesetzt wurde. Diese Dosis wurde dann in 80%igem Chlorgas und 20% in Chlordioxid wiederum aufgenommen. Höhere Dosen an Chlordioxid wurden verwendet, um einen realistischen Bereich des End-Weißgrads abzudecken.
Die übrigen 4 Proben wurden ausgewählt, um sie einer enzymatischen Vorbehandlung zu unterziehen, die unter Verwendung von entweder 8 (Proben 3 und 4) oder 13 (Proben 5 und 6) Xylanase-Einheiten (XE) pro g trockener Pulpe durchgeführt wurde. Es ist festzustellen, dass die Bleichsequenz unmittelbar nach der enzymatischen Vorbehandlung ohne Waschen dazwischen durchgeführt wurde. Die verwendeten aktiven Chlor- Multiplen betrugen 0,16 bis 0,14 (was eine Einsparung von Chlor in elementarer Form -- wobei ClO&sub2; im Chlorierungsschritt konstant gehalten wird - von 25% bzw. 38% darstellt). Diese Reduktionen wurden erhalten, indem die Dosis an molekularem Chlor verringert wurde, wobei die Dosis an Chlordioxid konstant blieb.
Der Ausgangs-ºISO dieser Proben betrug 33,4. Der Ausgangs-κ-Index betrug 12,3. Genaue Details der Betriebsbedingungen und der Ergebnisse der verschiedenen Versuche dieses Beispiels sind Tabelle 7 zu entnehmen. Tabelle 7 Wirksamkeit von B. pumilus-PRL B12-Xylanase-Vorbehandlung in klassischen Bleichsequenzen Tabelle 7 (Fortsetzung) Wirksamkeit von B. pumilus-PRL B12-Xylanase-Vorbehandlung in klassischen Bleichsequenzen
Wie Obigen Ausführungen zu entnehmen ist die Verwendung der Xylanase von B. pumilus PRL B12 für die Vorbehandlung (das Bio-Bleichen) von Holzzellstoff in klassischen Bleichsequenzen effizient. Zunächst ist anzuführen, dass die Verwendung der Xylanase als Vorbehandlung eine beträchtliche Reduktion des im chemischen Behandlungsschritt des Delignifizierungsschritts eingesetzten aktiven Chlors ermöglichte. Zweitens war nach dem Delignifizierungsschritt der κ-Index jeder der oben angeführten Proben stark verringert (von 12,3 auf 3,0 bis 3,2), was anzeigt, dass die Verwendung dieser Xylanase als Vorbehandlung ermöglicht, Holzzellstoff zu erhalten, der einen annehmbar niedrigen Ligningehalt aufweist (wie durch den κ-Index des Holzzellstoffs gemessen).

Beispiel 15

Auswirkung der Xylanase-Vorbehandlung in ECF-Sequenzen

Aus der Sauerstoff-behandelten Hartholzpulpe aus Beispiel 14 wurden sechs Suspensionen (Proben) hergestellt. Drei dieser Proben (die als Proben 4, 5 und 6 bezeichnet wurden) wurden zunächst einer enzymatischen Behandlung ohne Waschen zwischen der enzymatischen Behandlung und der ersten Dioxidchlorierung unterzogen. Alle Proben wurden dann einer ECF-Bleichsequenz vom Typ DPDPD unterzogen. Diese ECF-Sequenzen wurden unter Verwendung zunehmender Gewichte an Chlordioxid durchgeführt.
Die genauen Details der Betriebsbedingungen und der Ergebnisse der verschiedenen Versuche dieser Proben sind Tabelle 8 zu entnehmen. Tabelle 8 Wirksamkeit von B. pumilus PRL B12-Xylanase-Vorbehandlung bei von Chlor in elementarer Form freien Bleichsequenzen Tabelle 8 (Fortsetzung) Wirksamkeit von B. pumilus PRL B12-Xylanase-Vorbehandlung bei von Chlor in elementarer Form freien Bleichsequenzen
Wie aus obigen Ausführungen zu erkennen ist klar, dass eine enzymatische Behandlung unter Verwendung der Xylanase von B. pumilus PRL B12 gute Effizienz und Wirksamkeit beider Vorbehandlung (dem Bio-Bleichen) von Holzzellstoff in ECF-Bleichsequenzen zeigt, was ermöglicht, einen Holzzellstoff zu erhalten, der einen annehmbar niedrigen Lignin-Gehalt aufweist, sowie eine beträchtliche Einsparung an Chlordioxid ermöglicht, das verwendet werden muss, während weiterhin ein erhöhter End-Weißgrad erzielt wird. Das ist aufgrund der Tatsache interessant, dass im industriellen Bereich die Kapazität des Chlordioxid-Generators oft beschränkt ist.
In Hinblick auf obige Ausführungen ist festzustellen, dass nach dem Xylanase-Behandlungsschritt für jede der oben angeführten Proben der κ-Index stark verringert war (von 12,3 auf 5,9), was darauf hinweist, dass die Menge Lignin, das in der Pulpe verblieb, sowie die Menge an ClO&sub2;, die während der nachfolgenden Schritte der Bleichsequenz erforderlich war, stark verringert waren.

Beispiel 16

Auswirkung der Xylanase-Vorbehandlung in TCF-Sequenzen

Aus der Sauerstoff-behandelten Kraft-Hartholzpulpe aus Beispiel 14 wurden vier Suspensionen (Proben) hergestellt. Zwei Proben (als Proben 1 und 2 bezeichnet) wurden dann in einer vollständig chlorfreien (TCF-) Bleichsequenz vom Typ OQPZP (Sauerstoff, Maskierungsbehandlung, Peroxid, Ozon, Peroxid) verwendet. Die anderen beiden Proben wurden einer vollständig chlorfreien (TCF-) Bleichsequenz vom Typ OX/QPZP unterzogen. Das in der enzymatischen Behandlung verwendete Enzym stammte von B. pumilus PRL B12.
Zwischen X und Q wurde kein Waschen der Pulpe durchgeführt, aber der pH wurde auf den in nachstehender Tabelle 9 angeführten Wert eingestellt.
Die eingesetzte enzymatische Aktivität stammte von 10 XE/g trockener Pulpe.
Die Reaktanden (mit Ausnahme von Ozon), die in den Schritten der Sequenzen verwendet wurden, sind (in g pro 100 g der damit zu behandelnden Ofen-getrockneten Pulpe) folgende: 0 [6 bar O&sub2;, 2,5 NaOH, 0,5 MgSO&sub4;·7H&sub2;O]; X/Q [10 XE/g bei pH 7,5, 0,5% DTPA (40%) bei pH 5,5 (Ansäuerung mit verdünnter H&sub2;SO&sub2;]; Q [0,5% DTPA (40%) bei pH 5,5 (Ansäuerung mit verdünnter H&sub2;SO&sub2;)]; P [1,5 H&sub2;O&sub2;, 1,8 NaOH; 0,5 MgSO&sub4;· 7H&sub2;O, 2,5 Natriumsilikat (Wasserglasqualität 38º Beaumé)]. Die Betriebsbedingungen, die Menge (in g pro 100 g damit zu behandelnder ofengetrockneter Pulpe) und die Ergebnisse der verschiedenen Versuche dieser Proben sind Tabelle 9 zu entnehmen. Tabelle 9 Wirksamkeit von B. pumilus PRL B12-Xylanase-Vorbehandlung bei vollständig chlorfreien Bleichsequenzen
* Diese pHs stellen ungefähre Werte dar. Die tatsächlichen Werte liegen im Bereich von 10,5 bis 11,5.
Die Ergebnisse der oben angeführten Versuche zeigen deutlich, dass eine enzymatische Behandlung mit der Xylanase gemäß vorliegender Erfindung eine eindrucksvolle Verringerung der Menge an Ozon ermöglicht, die in einer TCF-Sequenz eingesetzt werden muss, während dennoch ein höherer Weißgrad erzielt wird. Das stellt nicht nur eine beträchtliche Einsparung an kostspieligem Ozon dar, sondern verringert auch die darin eingesetzte Menge an Ozon, das die Pulpe beeinträchtigen kann.

Beispiel 17

Herstellung von Xylanase-Expressionsvektor

1. Extraktion von chromosomaler DNA aus Bacillus pumilus PRL B12

L-B-Medium wurde mit 200 ml der Kultur aus Kolben A (Beispiel 1) geimpft und dann für 16 h bei 37ºC im L-B-Medium kultiviert. Die DNA wurde dann aus der Kultur extrahiert wie oben im Abschnitt "Verfahren und Techniken" beschrieben.

2. Konstruktionen einer Bacillus pumilus PRL B12-Genbibliothek

Die extrahierte chromosomale B. pumilus PRL B12-DNA wurde dann teilweise mit Sau3Al digeriert. Die berichtete Menge an DNA pro verwendetem Enzym wurde auf solche Weise eingestellt, dass ein Maximum an chromosomalen DNA-Fragmenten mit Größen zwischen 2 und 7 kbp erhalten wurde (kbp: 10³ Basenpaare).
Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden dann 0,8% (Gew./Vol.) Agarosegelelektrophorese unterzogen, um eine Trennung der DNA-Fragmente nach der Größe zu bewirken. Die DNA-Fragmente mit einer Größe zwischen 2 und 7 kbp, wie durch Gel-Elektrophorese identifiziert, wurden dann unter Einsatz des "Gene Clean"-Verfahrens oder des Filtrationsverfahrens unter Einsatz von Zentrifugation isoliert und gereinigt.
Die gereinigten DNA-Fragmente wurden dann mit Plasmid pBR322 ligiert, das zuvor an der BamHI-Stelle gespalten worden war, und dann dephosphoryliert.
Die erhaltene Ligation wurde dann durch Elektroporation in Zellen von E. coli transformiert. Die transformierten E. coli-MC1061-Zellen wurden dann bei 37ºC auf 1,5 L-B- Agarplatten kultiviert, die mit 100 ug/ml Ampicillin und 0,3 g/l, AZCL-Xylan ergänzt worden waren.
Die resultierenden Kolonien bildeten die Genbibliothek von B. pumilus PRL B12.

3. Screenen der Genbibliothek auf rekombinante Plasmide, die das Xylanase-Gen von Bacillus pumilus PRL B12 enthalten

Nach etwa 24 h Wachstum auf den Platten bei 37ºC in den oben beschriebenen Kulturmedien wurden die Kolonien, die eine AZCl-Xylan-Hydrolysezone aufwiesen, identifiziert und ihre Plasmide analysiert. Die in diesen Kolonien vorhandenen Plasmide wurden nach der in (3) bei 1.25-1.28 beschriebenen Laugenlysetechnik isoliert.
Die Analyse (durch Restriktion) wies darauf hin, dass verschiedene isolierte Plasmide dasselbe Xylanase-Gen enthielten, wenn auch in unterschiedlichen Größen von chromosomalen B. pumilus-Fragmenten. Die Restriktionsanalyse zeigte weiters, dass die kürzesten erhaltenen DNA-Fragmente, die das Xylanase-Gen enthielten, eine Größe von etwa 2,7 bis 2,9 kbp hatten, wobei sie vom pBR322-Plasmid getragen wurden, das damit ligiert worden war. Dieses neue Plasmid wurde als pBPX1 bezeichnet.

4. Subklonieren des chromosomalen Fragments, das Xylanase-Gen enthält

Der Expressionsvektor, der das B. pumilus PRL B12-Xylanase-Gen enthält, ist pUB-BPX- 12 (Fig. 4). Der Expressionsvektor wurde durch Subklonieren des chromosomalen Fragments von pBPX1 erhalten, das das Xylanase-Gen enthält.
Der Shuttle-Vektor (E. coli-B. subtilis) pUB131 (erhalten, wie in der europäischen Patentanrneldung Nr. 901163322.0, Veröffentlichungsnr. EP-A-0.415.296 beschrieben) wurde an der BamHI-Stelle gespalten und dephosphoryliert.
Das rekombinante pBPXI-Plasmid (erhalten wie oben beschrieben) wurde dann einer teilweisen Spaltung mit Sau3Al unterzogen. Die aus dieser Spaltung erhaltenen Fragmente wurde dann mit dem linarisierten und dephosphorylierten pUB131-Shuttle-Plasmid ligiert. Die erhaltene Ligation wurde dann durch Elektroporation in E. coli MC1061- Zellen transformiert.
Die Transformanten wurden dann auf L-B-Platten, ergänzt mit 100 Ng/ml Ampicillin, 25 pgml Kanamycin und 0,8 g/l, AZCI-Xylan, selektiert. Nach Vermehrung für 24 h bei 37 ºC wurden die Zonenbildung zeigenden Kolonien transferiert und erneut isoliert. Plasmid pUBC-BPX12, das in diesen Transformanten vorhanden war, wurde dann durch die Laugenlysetechnik isoliert. Restriktionsanalyse zeigte, dass dieses isolierte Plasmid (pUBC-BPX12) das Xylanase-Gen auf einem Sau3Al-Fragment mit etwa 1,0 kbp (der Expressionskassette) von chromosomaler 8. pumilus PRL B12-DNA enthält.
Wenn das Plasmid pUBC-BPX12 erneut in den Stamm E. coli MC1061 eingeführt wird, zeigen alle resultierenden Transformanten starke Zonenbildung auf AZCL-Xylanmedium, was die gute Expression des Xylanase-Gens in E. coli zeigt:
pUBC-BPX12 wurde dann verwendet, um Zellen von E. coli JM109 unter Einsatz der CaCl&sub2;-Technik zu transformieren, und Transformanten wurden selektiert. Ein Transformant, der Plasmid pUBC-BPX12 enthielt, wurde isoliert, und es wurde ein Präparat in großem Maßstab angesetzt, um die Nukleotidsequenz des insertierten Fragments zu bestimmen, das das Xylanase-Gen enthält.
Die eingesetzte Sequenzierungsstrategie war eine direkte Strategie unter Verwendung progressiver Oligonukleotide, wie in (3) auf S. 13.15 und 13.17 (Fig. 13.3B) beschrieben, wobei das doppelstrangige pUBC-BPX12-Plasmid als Templat verwendet wurde.
Um die Sequenz-Bestimmung in Gang zu setzen, wurden die Oligonukleotide so konstruiert, dass sie mit dem Vektor pUBC131 hybridisieren, um die Nukleotidsequenz an beiden Enden des Fragments mit etwa 1,0 kbp Xylanase zu bestimmen. Die Sequenz dieser synthetischen Oligonukleotide ist wie folgt angegeben:
SEQ ID NO: 3 5'-GTAGAGGATCATCATGT-3'
SEQ ID NO: 4 5'-TACCTTGTCTACAAACCCC-3'
SEQ ID NO: 5 5'-TGAGTTGCTAGTAACATCTCACCGA-3'
Der Rest der Sequenz wurde unter Verwendung von Oligonukleotiden bestimmt, die gemäß der neu bestimmten Sequenz synthetisiert wurden.
Die Ergebnisse dieser sequenzierten Bestimmung zeigten, dass das Xylanase-Gen als 1.022 bp-Sau3Al-Fragment erhalten worden war, das in den Fig. 1a und 1b (Seq.-ID Nr. 1) dargestellt ist.
Das Xylanase-Gen wurde dann durch doppelte Spaltung von pUBC-BPX12 mit Sall und EcoRV, gefolgt von Reinigung durch Elektrophorese in Agarosegel, auf einem 1061 bp- Sall-EcoRV-DNA-Fragment erhalten, das das Xylanase-Gen enthielt.
Der Vektor pUB131 wurde dann mit dem Restriktionsenzym an der EcoRV- und der Sall-Stelle gespalten, und das 1061 bp Sall-EcoRV-Fragment wurde damit ligiert.
Die resultierende Ligation wurde dann gemäß der kompetenten Zelltechnik in B. subtilis SE3-Wirtszellen eingeführt. Transformanten wurden auf L-B-Platten, ergänzt mit 25 ug/ml Kanamycin selektiert und durch Restriktion analysiert wie oben beschrieben. Das resultierende Plasmid war pUB-BPX12 (Fig. 4).

Beispiel 18

Herstellung von Pullulanase-Expressionsvektor pUBDEBRA1

Expressionsvektor pUBDEBRA1 (Fig. 5) ist ein Plasmid, das das für Pullulanase von B. deramificans T 89.117D kodierende Gen unter der Kontrolle seines eigenen Pullulanase-Transkriptionspromotor enthält, kloniert in den Vektor pU131. Dieses Plasmid (pUBDEBRA1) wird erhalten wie nachstehend beschrieben.
Bacillus deramificans T 89.117D wurde in 200 ml MYE-Medium mit folgender Zusammensetzung kultiviert: K&sub2;HPO&sub4; 33 mM, KH&sub2;PO&sub4;·3H&sub2;O 6 mM, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 45 mM, MgCl&sub2;·6H&sub2;O 1 mM, CaClO·2H&sub2;O 1 mM, Hefeextrakt 0,5% (Gew./Vol.), Glucose 0,5% (Gew./Vol.), pH eingestellt auf 4,5 mit H&sub3;PO&sub4;. Die chromosomale DNA wurde aus dieser Kultur extrahiert und wie oben im Abschnitt "Verfahren und Techniken" beschrieben gereinigt. Eine B. deramificans-Genbibliothek wurde durch Klonieren von partiellen Sau3Al-Fragmenten in pBR322 konstruiert, wie in Beispiel 17 (Teil 2) beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Größe der partiellen Sau3Al-DNA-Fragmente 5-10 kbp anstelle von 2-7 kbp betrug, und die transformierten E. coli MC1061-Zellen, die die Bibliothek bilden, wurden auf einem anderen Medium ausplattiert: L-B ergänzt mit 100 ug/ml Ampicillin.
Die Kolonien wurden für 18 h bei 37ºC gezüchtet und auf eine zweite Platte übertragen, die ein identisches Medium enthielt. Eine der Platten wurde mit einem 1% Agar- Überzug bedeckt, der 100 mM Natriumacetat (pH 4,5) und 0,1% AZCL-Pullulan enthielt. Nach einer Inkubation bei 60ºC für 18 h wurde eine Kolonie, die Zonenbildung aufwies, identifiziert und von der entsprechenden replizierten Platte isoliert. Ein Plasmid mit der Bezeichnung pBRDEBRA3 wurde von dieser Kolonie durch das oben beschriebene Laugenlyse-Verfahren im kleinen Maßstab isoliert, und dessen Restriktionsanalyse zeigte, dass das Plasmid ein insertiertes Fragment von B. deramificans T89.117D mit 9 kbp enthielt.
Ein 4,5 kbp EcvoRI-BamHI-Fragment von pBRDEBRA3 wurde durch doppelte Spaltung von pBRDEBRA3 mit EcoRI und BamHI und nachfolgende Reinigung durch Elektrophorese in einem 0,8% Agarosegel erhalten. Dieses Fragment wurde dann mit Vektor pUB- 131 ligiert, der zuvor einer doppelten Spaltung mit BamHI und EcoRI an seiner BamHI- und der EcoRI-Stelle unterzogen worden war, wobei B. subtilis PSL1 als Klonierungswirt verwendet wurde.
Das resultierende Plasmid pUBDEBRA1 wurde durch das Laugenlyse-Verfahren im großen Maßstab isoliert und von den transformierten pSLI-Zellen gereinigt. Das Plasmidpräparat wurde durch Transformation in B. subtilis PSL1 auf die Funktionalität des klonierten Pullulanase-Gens getestet. Alle erhaltenen Transformanten konnten das Pullulanase-Gen exprimieren und ausscheiden, da Zonenbildung beobachtet wurde, wenn die Kolonien mit AZCL-Pullulan überlagert wurden.
Die pUBDEBRA1 enthaltenden transformierten B. subtilis PSL1-Kolonien wurden auf eine zweite L-B-Platte übertragen, die mit 25 ug/ml Kanamycin ergänzt war. Eine der Platten wurde mit einem 1% Agar-Überzug bedeckt, der 100 mM Natriumacetat (pH 4,5) und 0,1% AZCL-Pullulan enthielt. Nach einer Inkubation bei 60ºC für 18 h zeigte als Transformantenkolonien einen AZCI-Abbau-Hof.

Beispiel 19

Herstellung von Alkalische Protease-Expressionvektor pKAC1

Expressionsvektor pKAC1 (Fig. 6) ist ein Plasmid, das das Gen enthält, das für die Alkalische Protease von B. subtilis 168 kodiert, unter der Kontrolle seines eigenen Promotors, kloniert in Vektor pUB110. Dieses Plasmid (pKAC1) wird erhalten, wie nachstehend beschrieben.
Plasmid pSBT2 wurde aus der chromosomalen DNA von B. subtilis 168 wie folgt isoliert.
Zunächst wurde die chromosomale DNA extrahiert und gereinigt, wie im Abschnitt "Verfahren und Techniken" beschrieben. Dann wurde die extrahierte und gereinigte DNA einer Restriktionsspaltung mit Clal unterzogen. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden dann auf einem Agarosegel (0,8% Gew./Vol.) nach der Größe getrennt, und Fragmente mit einer Größe von 3 bis 5 kbp würden durch das Gene Clean-Verfahren extrahiert und gereinigt.
Das resultierende Präparat wurde dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase behandelt, um die kohäsiven überstehenden 5'-Clal-Termini aufzufüllen. Das resultierende DNA-Präparat wurde dann mit Vektor pMK4 ligiert, der zuvor mit Smal gespalten und dephosphoryliert worden war. Die Ligation wurde durch die CaCl&sub2;-Technik in E. coli MC1061 transformiert, und etwa 1.000 Transformantenkolonien wurden auf L-B- Platten selektiert, die 100 ug/ml Ampicillin enthielten.
Die erhaltenen Transformantenkolonien wurden dann durch erneutes Suspendieren in 50 ml flüssigem L-B-Medium gepoolt, und ihr Plasmidgehalt wurde unter Einsatz des Plasmid-Präparationsverfahrens im großen Maßstab extrahiert.
Dieses Plasmid-Präparar wurde dann in B. subtilis 512 PN&supmin; transformiert und die Transformanten auf Proteasedetektionsplatten ausplattiert. B. subtilis 512 PN&supmin; ist eine Mutante von B. subtilis 168, die einen kleinen Zonenbildungshof auf Proteasedetektionsplatten produziert (Millet et al., Biochimie 58, 109-117 (1976)). Die Transformantenkolonien wurden dann visuell auf das Vorhandensein eines größeren Hofs untersucht. Eine Kolonie, die einen solchen Hof aufwies, wurde isoliert, und ihr Plasmid wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Plasmidpräparationsverfahrens im kleinen Maßstab extrahiert.
Das resultierende Plasmid mit der Bezeichnung pSBT2 wurde dann in E. coli JM109 transformiert und ein Plasmidpräparat von pSBT2 im großen Maßstab wurde aus einem E. coli-Transformanten hergestellt. Dieses Plasmidpräparat von pSBT2 wurde wieder in B. subtilis 512 PN&supmin; transformiert. Alle erhaltenen Transformanten wiesen einen größeren Hofauf Proteasedetektionsplatten auf als der Kontrollstamm (B. subtilis 51 PN, der Vektor pMK4 enthält), was zeigt, dass das Alkalische Protease-Gen in B. subtilis aus Plasmid pSBT2 exprimiert wurde.
Das Plasmid pSBT2 wurde dann mit EcoRI gespalten, und ein EcoRI-EcoRI-Fragment von Plasmid pSBT2 mit 2,7 kbp wurde dann in die EcoRI-Stelle des pUB110-Plasmids subIkloniert, wobei B. subtilis SE3 als Klonierungswirt verwendet wurde. Das resultierende-Plasmid ist pKAC1 (Fig. 6).

Beispiel 20

Herstellung von Alkalische Protease-Expressionsvektor pLI1

Expressionsvektor pLI1 (Fig. 7) ist ein Plasmid, das das gesamte Gen, das für die Alkalische Protease von B. licheniformis SE2 kodiert, unter der Kontrolle seines eigenen Transkriptionspromotors in Vektor pUB131 kloniert enthält. Dieses Plasmid (pLI1) wird wie nachstehend beschrieben erhalten.
Das Dral-PstI-Fragment von pKP1 mit 800 bp, dessen Konstruktion nachstehend in Beispiel 23 Teil 3 beschrieben wird, wurde in die Pstl-HincII-Stellen von Phagemid pBS- subkloniert, um das Plasmid pKN8 zu erzeugen. Plasmid pKN8 wurde dann unter Einsatz des folgenden synthetischen Oligonukleotids, das zuvor extemporär hergestellt worden war, stellengerichteter Mutagenese unterzogen, um die Styl-Stelle zu entfernen:
Seq.-ID Nr. 6 5'-AAGCTTGTATGCCTGCAG-3'
Das erzeugte Plasmid war pKN9.
Dann wurde der Vektor pUBC134 konstruiert. Zunächst wurde die Pstl-Stelle von pUBC132 deletiert, indem der überstehende 3'-Terminus durch Behandlung mit T4 DNA-Polymerase entfernt wurde, wie in (3) auf S. F.4-F.5 beschrieben. Das resultierende Plasmid war pUBC133.
Die folgende synthetische doppelstrangige DNA wurde konstruiert und in die Sacl-Bam- HI-Stellen von pUBC133 kloniert:
SEQ ID NO: 7 5'-GATCCCCTTGGCTGCAGGAGCT-3'
SEG ID NO: 8 3'- GGGAACCGACGTCC -
Diese Insertion erzeugte das Plasmid pUBC134.
Das Plasmid pUBC134C wurde dann nach doppelter Spaltung von sowohl pUBC134 als auch pKCl mit Pstl und Sacl durch Klonieren des 548 bp Pstl-Sacl-Fragments von pKC1 (konstruiert wie nachstehend in Beispiel 23, Teil 2 beschrieben) in die Sacl-Pstl-Stellen von pUBC134 konstruiert.
Das 812 bp-BamHI-Pstl-Fragment von pKN9 würde durch eine doppelte Spaltung von pKN9 mit BamHI und Pstl erhalten. Dieses 812 bp-Fragment wurde dann in die Pstl- BamHI-Stellen von Vektor pUBC134C kloniert. Das dadurch erzeugte Plasmid war das Plasmid pLINC, das das vollständige B. licheniformis SE2-Alkalische Protease-Gen enthält.
Das 1001 bp-Styl-Sacl-Fragment von pLINC wurde durch eine doppelte Spaltung mit Styl und Sacl erhalten und isoliert. Dieses DNA-Fragment mit 1001 bp wurde dann in die Sacl-Styl-Stellen von pKPN 14 subkloniert, dessen Konstruktion nachstehend in Beispiel 25 beschrieben wird, wodurch Plasmid pKPN 15 erzeugt wurde. Die pKPN 15- Transformanten wurden unter Einsatz von Tetracyclinselektion selektiert.
Ein Derivat von Plasmid pKPN15, das in B. subtilis- und B. licheniformis-Stämmen replizieren kann, wurde dann konstruiert, indem die Replikationsfunktionen für E. coli, die vom Sacl-BglII-Fragment von Plasmid pKPN15 mit 3635 bp getragen werden, durch das BglII-Sacl-Fragment mit 2199 bp ersetzt wurden, das die Replikationsfunktionen für Bacillus trägt und aus Plasmid pUB131 isoliert wurde.
Das oben angesprochene Derivat von Plasmid pKPN15 wurde konstruiert, indem in B. subtilis SE3 das BglII-Sacl-Fragment von pKPN15 mit 3402 bp in das BglII-Sacl-Vektorfragment von pUB 131 mit 2198 bp kloniert wurde. Das resultierende Plasmid wurde als Plasmid pLI1 bezeichnet (Fig. 7).

Beispiel 21

Herstellung von Alkalische Protease-Expressionsvektor pL7SBT

Es wurde Expressionsvektor pL7SBT (Fig. 8) konstruiert, der die Sequenz enthält, die unter der Kontrolle des Transkriptionspromotors der Alkalischen Protease von B. licheniformis für die Alkalische Protease von B. subtilis 168 kodiert (Subtilisin Carlsberg). Dieses Plasmid (pL7SBT) wird erhalten, wie nachstehend beschrieben.

1. Herstellung von pLI2NC

Das Styl-Sacl-Fragment mit 1001 bp von pLINC (wie in obigem Beispiel 20 beschrieben konstruiert) wurde in die Sacl-Styl-Stelle von pLID1 (wie im nachstehenden Beispiel 25 konstruiert) subkloniert, wodurch das Plasmid pLI2NC erhalten wurde.

2. Herstellung von pBS7MASE

Der Vektor pBSS wurde durch Klonieren der folgenden doppelstrangigen synthetischen DNA:
A = SEQ ID NO: 9
B = SEQ ID NO: 10
in die BamHI-Sacl-Stellen von pBS- erzeugt, wodurch pBSS gebildet wurde. Das Stul- Styl-Fragment mit 422 bp von Plasmid pKPN15 (wie oben in Beispiel 20 beschrieben konstruiert) wurde in die Stul-Styl-Stellen von pBS5 kloniert, wodurch das Plasmid pBS5- MASE erzeugt wurde. pBS5MASE wurde dann mutagenisiert, um darin eine Pacl-Stelle zwischen dem Transkriptionspromotor und der Translationsinitationsstelle einzuführen, und zwar mit dem folgenden synthetischen Oligonukleotid, das extemporär konstruiert wurde: SEQ ID NO: 11
Diese Mutagenese erzeugte Plasmid pBS7MASE, das im Vergleich zu pBSSMASE eine zusätzliche Pacl-Stelle enthielt.

3. Herstellung von pLI7NC

Das Plasmid pLI7NC wurde daraufhin konstruiert, indem das Stul-Styl-Fragment mit 422 bp des Plasmids pLI2NC, wie oben beschrieben, durch das Styl-Stul-Fragment von pBS7- MASE mit 421 bp, wie oben beschrieben, ersetzt wurde.

4. Herstellung von pL7SBT

Es wurden zwei synthetische Oligonukleotide konstruiert, die die folgenden Sequenzen aufwiesen: SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13
Diese Oligonukleotide wurden eingesetzt, um eine Amplifizierung durch PCR, beginnend mit dem Plasmid pSBT2 zu bewirken (das wie oben in Beispiel 19 beschrieben erhalten wurde).
pSBT2 enthält das vollständige Gen, das für die Alkalische Protease (Subtilisin) von B. subtilis 168 kodiert. Das durch PCR amplifzierte Fragment enthielt die Ribosomenbindungsstelle, die Alkalische Protease-Kodierungssequenz sowie clen Transkriptionsterminator des Gens, flankiert von (zwischen) zwei Restriktionsstellen: Pacl und Sacl. Die PCR wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Das amplifizierte Fragment wurde auf Agarosegel (1% Gew./Vol.) gereinigt, mit Pacl und Sacl gespalten und in die Sacl-Pacl-Stellen des pLI7NC-Vektors kloniert, wobei das Plasmid pLI7SBT erhalten wurde.
Ein Derivat von Plasmid pLI7SBT, das in B. subtilis und B. licheniformis replizieren konnte, wurde dann konstruiert, indem die Replikationsfunktionen für E. coli, die vom Sacl-BglII-Fragment mit 4,8 kbp des Plasmids pLI7SBT getragen wurden, durch das BglII- Sacl-Fragment mit 2199 bp ersetzt wurde, das vom Plasmid pU13131 isoliert wurde, das das Fragment enthält, das die Replikationsfunktionen für Bacillus trägt.
Ersetzen der Replikationsfunktionen erfolgte durch Subklonieren des BglII-Sacl-Fragments mit 3318 bp von Plasmid pLI7SBT in das BglII-Sacl-Fragment mit 2199 bp, das von Plasmid pUB131 isoliert wurde. das resultierende Plasmid ist das Plasmid pL7SBT (Fig. 8).

Beispiel 22

Herstellung von α-Amylase-Expressionsvektor pL7TAKA

Expressionsvektor pL7TAKA (Fig. 9) enthält die Sequenz, die für die α-Amylase von B. licheniformis ATCC 9789 unter der Kontrolle des Transkriptionspromotors der Alkalischen Protease von B. licheniformis SE2 kodiert. Dieses Plasmid (pLZTAKA) wurde erhalten wie nachstehend beschrieben.
Zunächst wurde Plasmid pS isoliert, das das vollständige u-Amylase-Gen von B. licheniformis ATCC 9789 kloniert auf einem EcoRI-Fragment mit 3,5 kbp in der EcoRI-Stelle von pUB110 enthält. Das Isolieren wurde wie folgt durchgeführt:
Die chromosomale DNA von B. licheniformis ATCC 9789 wurde aus einer 200 ml L-B- Kultur extrahiert und gereinigt. Das chromosomale DNA-Präparat wurde dann teilweise mit EcoRI gespalten. Die erhaltenen DNA-Fragmente wurde dann in den Vektor pUB- 110 ligiert, der zuvor durch EcoRI linearisiert worden war. Das resultierende Ligationsgemisch wurde unter Einsatz des Protoplastenverfahrens in B. subtilis BR151 transformiert. Die regenerierten Transformanten wurden dann auf L-B-Medium, ergänzt mit 25 ug/ml Kanamycin und 1% (Gew./Vol.) Stärke, übertragen.
Nach 18 h Wachstum bei 37ºC wurden die Transformantenkolonien mit einer 0,0025 % Iodlösung bedeckt. Dann wurde eine Kolonie identifiziert, die einen größeren Stärke- Hydrolyse-Hofzeigte als der Kontrollstamm (B. subtilis BR151), der das Plasmid pUB- 110 trägt. Das Plasmid pS wurde aus diesem Transformanten extrahiert, isoliert, und durch Restriktionskartierung analysiert. Plasmid pS enthielt ein insertiertes DNA-Fragment mit etwa 3,5 kbp von B. licheniformis ATCC 9789. De Sequenz des insertierten Fragments wurde unter Verwendung des gleichen Ansatzes bestimmt, wie er für das oben in Beispiel 17 beschriebene Xylanase-Gen verwendet wurde.
Es wurden zwei synthetische Oligonukleotide konstruiert, die die folgenden Sequenzen aufwiesen: SEO ID NO: 14 SEO ID NO: 15
Diese beiden synthetischen Oligonukleotide wurden dann eingesetzt, um die Amplifizierung durch PCR beginnend mit Plasmid pS zu bewirken.
Das durch PCR amplifizierte Fragment enthält die Ribosomenbindungsstelle und die Sequenz, die für die α-Amylase von B. licheniformis ATCC 9789 kodiert, sowie den Transkriptionsterminator des Gens, flankiert von (zwischen) zwei Restriktionsstellen Pacl und Sacl.
Plasmid pLI7NC wurde dann hergestellt, wie oben in Beispiel 21 beschrieben.
Das amplifizierte Fragment wurde auf Agarosegel (1%) gereinigt, mit Pacl und Sacl gespalten und dann in die Sacl-Pacl-Stellen des Vektors pLI7NC kloniert, wodurch das Plasmid pLI7TAKA erzeugt wurde.
Ein Derivat von Plasmid pLI7TAKA, das in B. subtilis und B. licheniformis replizieren konnte, wurde dann konstruiert, indem die Replikationsfunktionen für E. coli, die vom BglII-BglII-Fragment mit 3623 bp des Plasmids pLI7TAKA getragen wurden, durch das BglII-BamHI-Fragment mit 2238 bp ersetzt wurde, das vom Plasmid pUB131 isoliert wurde, das das Fragment enthält, das die Replikationsfunktion für Bacillus trägt.
Ersetzen der Repl ikationsfunktionen wurde durch Klonieren des BglII-BglII-Fragments mit 5,1 kbp von Plasmid pLI7TAKA in das BglII-BamHI-Fragment mit 2238 bp, das von Plasmid pUB131 isoliert wurde, durchgeführt: Das resultierende Plasmid ist pL7TAKA (Fig. 9).

Beispiel 23

Klonieren der Endabschnitte des Alkalische Protease-Gens des Bacillus licheniformis- Wirtsstämms

Um das Alkalische Protease-Gen aus der chromosomalen DNA von B. licheniformis SE2 zu isolieren, bestand die eingesetzte Strategie darin, zunächst die chromosomale DNA zu extrahieren. Dann wurden die Endabschnitte dieses Gens durch Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden kloniert.

1. Extraktion von chromosomaler DNA aus B. licheniformis SE2

Die chromosomale DNA von Bacillus licheniformis SE2 wurde extrahiert und gereinigt wie oben im Abschnitt "Verfahren und Techniken" beschrieben.

2. Klonieren des C-terminalen Abschnitts des Alkalische Protease-Gens

Das Präparat der extrahierten chromosomalen DNA wurde dann einer Restriktionsanalyse unterzogen. Die aus diesen Spaltungen resultierenden DNA-Fragmente wurden dann auf einem 0,8% (Gew./Vol.) Agarosegel nach der Größe getrennt.
Das Agarosegel wurde dann einer Analyse nach der Southern Blot-Technik unterzogen, um die Restriktionsfragmente zu identifizieren, die die Nukleotidsequenzen des C-terminalen Teils des Alkalische Protease-Gens enthalten.
Die für die Hybridisierungen konstruierte und verwendete Sonde war ein synthetisches Oligonukleotid, das dem C-terminalen Teil des Alkalische Protease-Gens entspricht. Die synthetische Oligonukleotidsequenz, die für diesen Zweck konstruiert wurde, war:

Seq.-ID Nr. 16

5' - GGCGGAGCAAGCTTTGTGG - 3' für den C-Terminus.
Die Ergebnisse zeigten, dass der C-terminale Abschnitt des Alkalische Protease-Gens auf einem PstI-Fragment mit etwa 2,7 kbp lokalisiert war.
Das Präparat der extrahierten chromosomalen DNA von B. licheniformis SE2 wurde dann mit Pstl gespalten und durch Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) nach der Größe getrennt. Die resultierenden erhaltenen Fragmente mit etwa 2,7 kbp wurden dann aus den Gelen extrahiert und nach dem Gene Clean-Verfahren gereinigt. Die Pstl-Fragmente mit 2,7 kbp wurden dann mit dem Plasmid pUC18 ligiert, das zuvor an der Pstl-Stelle gespalten und dephosphoryliert worden war. Die so erhaltene Ligation wurde dann durch die CaCl&sub2;-Technik in Zellen von Escherichia coli MC1061 transformiert.
Die Transformanten wurden auf einem L-8-Plattenmedium selektiert, das mit 100 ug/ml Ampicillin ergänzt war. Die in dem E. coli MC1061 erhaltenen Transformanten wurden dann durch Hybridisierung mit dem radiomarkierten synthetischen Oligonukleotid gescreent, das als C-terminale Sonde in der Southern-Untersuchun; verwendet wurde, und das Plasmid pKCl dadurch isoliert.

3. Klonieren des N-terminalen Abschnitts des Alkalische Protease-Gens

Die Herstellung extrahierter chromosomaler DNA wurde dann einer Restriktionsanalyse unterzogen. Die aus diesen Spaltungen resultierenden DNA-Fragmente wurden dann auf einem 0,8% Agarosegel nach der Größe getrennt.
Das Agarosegel wurde dann einer Analyse durch die Southern 13 lot-Technik unterzogen, um die Restriktionsfragmente zu identifizieren, die die Nukleotidsequenzen des N-terminalen Teils des Alkalische Protease-Gens enthalten.
Die für die Hybridisierungen konstruierte und verwendete Sonde war ein synthetisches Oligonukleotid, das dem N-terminalen Teil des Alkalische Protease-Gens entspricht. Die synthetische Oligonukleotidsequenz, die für diesen Zweck konstruiert wurde, war:

Seq.-ID Nr. 17

5' - ATGGCTCCTGGCGCAGGC - 3' für den N-Terminus.
Die Ergebnisse zeigen, dass der N-terminale Abschnitt des Alkalische Protease-Gens auf einem Pstl-Fragment mit etwa 5,5 kbp und gleichermaßen auf einem kleineren BclI-Pstl- Fragment mit etwa 2 kbp lokalisiert war. Dieses Fragment enthielt keine Restriktionsstellen für Xbal, Clal, Hpal und Sphl.
Das Präparat extrahierter chromosomaler DNA aus B. licheniformis SE2 wurde dann mit Pstl gespalten und dann durch Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) nach der Größe getrennt. Die resultierenden erhaltenen Fragment mit etwa 5,5 kbp wurden dann aus den Gelen extrahiert und nach dem Gene Clean-Verfahren gereinigt. Die resultierenden Fragmente mit 5,5 kbp wurden dann einer Reihe von Spaltungen mit Bchl, Xbal, Clal, Hpal und Sphl unterzogen. Die so erzeugten DNA-Fragmente wurden mit Plasmid pMK4 ligiert (wie von Sullivan et al., Gene 29, 21-269 (1984), beschrieben), das zuvor mit BamHI und Pstl linearisiert worden war.
Die dadurch erhaltenen Ligationen wurden dann durch die CaCl&sub2;-Technik in Zellen von E. coli MC1061 transformiert.
Die Transformanten wurden auf einem L-B-Plattenmedium selektiert, das mit 100 ug/ml Ampicillin ergänzt war. Die in E. coli MC1061 erhaltenen Transformanten wurden dann durch Hybridisierung mit dem radiomarkierten synthetischen Oligonukleotid gescreent, das als N-terminale Sonde in der Southern-Untersuchung verwendet wurde, und das Plasmid pKP1 dadurch isoliert.

Beispiel 24

Sequenzierung des Alkalische Protease-Gens

Die in die Plasmide pKP1 und pKC1 insertierten Fragmente wurden nach dem oben in "Verfahren und Techniken" beschriebenen Verfahren von ihren Pstl- zu den Sacl-Stellen sequenziert, wobei die Strategie progressiver Oligonukleotide eingesetzt wurde.

Beispiel 25

Konstruktion von pLD1-Deletionsplasmid von reifer Alkalischer Protease

Nach dem Sequenzieren des Alkalische Protease-Gens, wie oben in Beispiel 24 beschrieben wurde Deletionsplasmid pLD1 (Fig. 11) konstruiert, um B. licheniformis SE2 delap1 herzustellen. Dieses Plasmid, pLD1 wurde erhalten wie nachstehend beschrieben.
Das pKP1-Plasmid erwies sich als extrem instabil in E. coli MC1061. Aus diesem Grund wurde das chromosomale DNA-Fragment, das den N-terminalen Teil des B. licheniformis SE2-Alkalische Protease-Gens enthielt, in den Vektor pACYC184 subkloniert. Dieses Subklonieren wurde durchgeführt, indem das EcoRI-EcoRI-Fragment mit 1849 bp von pKP1 in die EcoRI-Stelle von pACYC184 eingeführt wurde, und die Ligation wurde verwendet, um Zellen von E. coli MC1061 zu transformieren. Das resultierende Plasmid war pKPN11.
Transformanten wurden dann auf einem L-B-Agarmedium selektiert, das mit 12,5 ug/ml Tetracyclin ergänzt war. Die Ausrichtung des EcoRI-EcoRI-Fragments mit 1849 bp im pKPN11-Plasmid wurde dann durch Restriktionsanalyse bestimmt.
Das Plasmid pKPN12 wurde durch Deletion des Styl-Styl-Fragment mit 1671 bp von pKPN11 durch Spaltung mit Styl erhalten, gefolgt von Ersetzen dieses Fragments mit dem folgenden synthetischen DNA-Doppelstrangs, der extemporär erzeugt worden war:
Das DNA-Fragment von pUB131, das für die Resistenz gegen Kanamycin und entweder Bleomycin oder Phleomycin kodiert, wurde dann wie folgt erhalten:
Zunächst wurde ein Pstl-Taql-Fragment mit 2666 bp (das die Gene aufweist, die für die Resistenz gegen Kanamycin und entweder Bleomycin oder Phleomycin kodieren) durch doppelte Pstl-Taql-Spaltung von Plasmid pUB131 erhalten. Dieses Fragment wurde dann in die Pstl-Accl-Stellen des Phagemids pBS-eingeführt. Die resultierende Kombination erzeugte das Plasmid pBSKMPM.
Während des Klonierens von pBSKMPM, wie oben beschrieben, erfolgte eine kleine Deletion im Bereich des Linkers von pBS-, die den Verlust der Sphl- und Pstl-Stellen im Plasmid pBSKMPM hervorrief. So wurde das Plasmid pBSKMP verwendet, um eine einstrangige DNA zu erzeugen, die dann verwendet wurde, um stellengerichtete Mutagenese zu bewirken, um die zwei synthetischen Oligonukleotide mit den jeweiligen Smal- Stellen, wie nachstehend angeführt, einzuführen, so dass dann zwei Smal-Stellen vorhanden waren, eine stromauf und eine stromab von den Kanamycin- und Phleomycin- Resistenzgenen.
Die Sequenzen der für die Mutagenese verwendeten synthetischen Oligonukleotide sind nachstehend angeführt: SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21
Das aus dieser Mutagenese in Gegenwart der beiden Oligonukleotide resultierende. Plasmid ist pBSKMPM1. Dieses Plasmid enthält zwei kleine Smal-Restriktionsstellen, die das Isolieren des DNA-Fragments erlauben, das die Gene enthält, die für die Resistenz gegen Kanamycin und Phleomycin kodieren.
Das Smal-Smal-Fragment mit 1597 bp von pBSKMPM1 wurde daraufhin in die Smal- Stelle von pKPN12 eingeführt, wodurch Plasmid pKPN 14 geschaffen wurde.
Die richtige Ausrichtung des klonierten Fragments im Plasmid pKPN14 wurde dann identifiziert, indem ein Screening an den Plasmid-DNA-Präparaten im kleinem Maßstab durch Restriktionsanalyse durchgeführt wurde, wie oben im Abschnitt "Verfahren und Techniken" beschrieben.
Das DNA-Fragment, das auf pKCl vorhanden war und sich stromab vom N-Terminus der Alkalische Protease-Sequenz befand, wurde daraufhin auf einem 1,2 kbp Sacl-HindIII- Fragment von pKCl (konstruiert wie oben in Beispiel 23, Teil 2 beschrieben) isoliert. Diese Isolierung wurde durchgeführt, indem zunächst pKCl mit HindIII gespalten wurde. Das überstehende HindIII-5'-Ende wurde dann durch Behandlung mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase abgestumpft. Eine Sacl-Restriktion wurde dann durchgeführt, um das gewünschte (stumpfe) Sacl-HindIII-Fragment zu schaffen. Dieses Fragment wurde dann in die Sacl- und Hpal-Stellen von pKPN14 kloniert, wodurch das Plasmid pLID1 erzeugt wurde.
Alle obigen Konstruktionen wurden durch Transformation des Stamms E. coli MC1061 und in Gegenwart von Tetracyclin (12 ug/ml) für die Selektion von Transformanten durchgeführt.
Ein Derivat des Plasmids pLID1, das in Stämmen von B. subtilis und B. licheniformis replizieren konnte, wurde daraufhin konstruiert, indem die Funktionen der Replikation für E. coli, die vom BglII-BglII-Fragment mit 3623 bp des pLID1-Plasmids getragen wurden, durch das Fragment ersetzt wurden, das die Replikationsfunktionen für Bacillus trägt: ein BglII-BamHI-Fragment mit 2238 bp, das aus Plasmid pUB131 isoliert wurde.
Ersetzen der Replikationsfunktionen für E. coli durch jene für Bacillus erfolgte, indem zunächst das BglII-BglII-Fragment mit 3,6 kbp vom pLID1-Plasmid (das Fragment, das die stromauf gelegene 5'-Sequenz und die stromab gelegene 3-Sequenz des Alkalische Protease-Gens von B. licheniformis SE2 trägt) durch Spalten von pLID1 mit BglII und BamHI isoliert wurde. Die zusätzliche BamHI-Spaltung war rotwendig, da eine BglII- Spaltong allein Fragmente mit identischer Größe ergeben hätte, die nicht wie gewünscht durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt werden könnten. Das BglII-BglII-Fragment mit 3,6 kbp wurde dann in B. subtilis SE3 in das BglII-BamHI-Fragment mit 2238 bp kloniert, das aus Plasmid pUB131 isoliert wurde, wodurch Plasmid pLD1 erzeugt wurde (Fig. 11).

Beispiel 26

Konstruktion von pLD3-Deletionsplasmid der Sequenz, die für die gesamte Alkalische Protease kodiert

Ein weiteres Deletionsplasmid pLD3 (Fig. 12) wurde konstruiert, um B. licheniformis SE2 delap3 herzustellen. Dieses Plasmid pLD3 wurde erhalten wie nachstehend beschrieben.
Ein doppelstrangiges synthetisches Oligonukleotid mit der Sequenz:
wurde konstruiert. Dieses synthetische Oligonukleotid wurde dann in die Sacl- und die Stul-Stelle von Plasmid pLID1 kloniert (das wie in Beispiel 25 beschrieben konstruiert wurde), um das Plasmid pLID3 zu erzeugen.
Ein Derivat von Plasmid pLID3, das in Stämmen von Bacillüs replizieren konnte, wurde daraufhin konstruiert, indem die Replikationsfunktionen für E. coli, die vom BglII-BglII- Fragment mit 3623 bp des Plasmids pLID3 getragen wurden, durch das BglII-BamHI- Fragment mit 2238 bp (das Fragment, das die Replikationsfunktionen für Bacillus trägt) ersetzt wurde, das aus Plasmid pUB131 isoliert wurde.
Ersetzen der Replikationsfunktionen für E. coli durch jene für Bacillus erfolgte durch Klonieren des BglII-BglII-Fragments mit 3,2 kbp von Plasmid pLID3 in das BglII-BamHI- Fragrtient mit 2238 bp, das aus pUB131 isoliert wurde. Das resultierende Plasmid ist das Plasmid pLD3 (Fig. 12).

Beispiel 27

Konstruktion von pLD6-Deletionsplasmid der Sequenz, die für das gesamte Alkalische Protease-Gen kodiert, einschließlich des Transkriptionspromotors

Wiederum ein anderes Deletionsplasmid, pLD6 (Fig. 13) wurde konstruiert, um B. licheniformis SE2 delap6 herzustellen. Dieses Deletionsplasmid pLD6 wurde wie nachstehend beschrieben erhalten.
Das Plasmid pLID6 wurde konstruiert, indem das AflIII-AflII-Fragment mit 0,9 kbp aus Plasmid pLID3 (wie in obigem Beispiel 26 beschrieben) deletiert wurde. Ein Derivat dieses Plasmids, das in Stämmen von Bacillus replizieren konnte, wurde dann konstruiert, indem die Replikationsfunktionen von E. coli, die vom BglII-BglII-Fragment mit 3623 bp von Plasmid pLID6 getragen werden, durch das BglII-BamHI-Fragment mit 2238 bp (das Fragment, das die Replikationsfunktion für Bacillus trägt) ersetzt wurde, das aus pUB131 isoliert wurde.
Ersetzen der Replikationsfunktionen für E. coli durch jene für Bacillus erfolgte durch Klonieren des BglII-BglII-Fragments mit 2,3 kbp von Plasmid pLID6 (das Fragment, das die stromauf gelegene 5'-Sequenz und die stromab gelegene 3-Sequenz des Alkalische Protease-Gens von B. licheniformis SE2 trägt) in das BglII-BamHI-Fragment mit 2238 bp, das aus Plasmid pUB131 isoliert wurde. Das Ergebnis ist Plasmid pLD6 (Fig. 13).

Beispiel 28

Erzeugung von deletierten B. licheniformis-Stämmen in vivo

Die gewünschten Deletionen in chromosomaler DNA von Bacillus licheniformis SE2 wurden unter Einsatz von Techniken durchgeführt, die auf der homologen Rekombination basieren, wie nachstehend ausführlich erörtert wird. Die Ergebnisse der chromosomalen Deletionen, die jeweils durch die Plasmide pLDI, pLD3 bzw. pLD6 erhalten werden, sind in Fig. 10 dargestellt. Die Deletionen wurden durchgeführt, wie nachstehend beschrieben, um die B. licheniformis-Stämme SE2 delap1, SE2 delap3 und SE2 delap6 zu erzeugen.
Jedes der Deletionsplasmide (pLD1, pLD3 oder pLD6) wurde durch die Protoplastentechnik in die jeweiligen Bacillus licheniformis SE2-delap-Kulturen transformiert.
Jeweilige Transformanten wurden von jeder der Transformationen isoliert, und die Restriktionskarten des darin eingeführten Deletionsplasmids wurden verifiziert.
Die Transformanten wurden daraufhin für 18 h bei 37ºC in jeweilige Kulturen mit 50 ml L-B-Medium, ergänzt mit 2 g/l Glucose und 25 ug/ml Kanamycin eingebracht.
Ein Volumen von 0,1 ml jeder der jeweiligen resultierenden Kulturen wurde in jeweilige Kolben geimpft, die 50 ml desselben Mediums enthielten, und die Kultivierung wurde für 18 h bei 37ºC durchgeführt. Eine Probe jeder der resultierenden Kulturen wurde gezogen, und geeignete Verdünnungen wurden auf jeweiligen Proteasedetektionsplatten ausplattiert, die mit 25 ug/ml Kanamycin ergänzt waren.
Die jeweiligen Platten wurden visuell auf das Vorhandensein von Kolonien gescreent, die ein Fehlen von Zonenbildung aufwiesen, was die Unfähigkeit dieser Kolonien zeigt, Alkalische Protease zu erzeugen. Der Kultivierungs- und Screeningvorgang wurde wiederholt, bis jeweilige deletierte Kandidaten, die aufgrund des Vorhandenseins der jeweiligen Deletionsplasmide beide unfähig waren, Alkalische Protease zu erzeugen (apr&supmin;) und die gegen Kanamycin resistent waren (Kmr), isoliert wurden (apr&supmin;), Kmr).
Nachdem die Plasmide für die Deletionen gedient hatten, wurden sie daraufhin vom deletierten Kandidaten-B. licheniformis-Stamm (Stamm SE2 delap1, SE2 delap3 oder SE2 delap6) eliminiert, den sie durch einfaches Vermehren auf Kulturmedium bei 37ºC in Abwesenheit eines Antibiotikums transformiert hatten.
Die deletierten Kandidaten wurden daraufhin für 18 h bei 37ºC in jeweilige Kulturen auf 50 ml L-M-Medium, ergänzt mit 2 g/l Glucose, gelegt. Volumina von 0,1 ml der resultierenden Kulturen wurden in jeweilige zweite Kolben eingeimpft, die jeweils 50 ml desselben Mediums enthielten, und die jeweilige Kultivierung wurde für 18 h bei 37ºC durchgeführt. Eine Probe der resultierenden Kulturen wurde gezogen und geeignete Verdünnungen wurden auf L-B-Platten ausplattiert. Die isolierten Kolonien wurden dann auf jeweilige zweite L-B-Platten repliziert, die mit 25 ug/ml Kanamycin ergänzt wurden, und visuell inspiziert, um Kanamycin-empfindliche (Kms-) Kolonien zu identifizieren.
Die Kultivierungs- und Screening-Vorgänge wurden für jede Kolonie wiederholt, bis Kms-Kandidaten isoliert wurden. Diese Kandidatenstämme wurden dann isoliert und ihre Phenotypen (apr&supmin;, Kms) wurden bestätigt.
Die chromosomale DNA wurde daraufhin isoliert und gereinigt, und die Struktur der chromosomalen Deletion wurde durch die Southern Blotting-Technik verifiziert. Die Deletionen erwiesen sich als gut positioniert, nachdem sie durch die doppelte homologe Rekombination in die stromauf (5') und stromab (3') gelegenen Sequenzen erfolgt waren, wie in Fig. 10 zu erkennen. In Fig. 10 zeigen die punktierten Linien das Fehlen der deletierten Sequenz(en) in der chromosomalen B. licheniformis Se2-DNA an.
Der bzw. resultierende(n) Stamm bzw. Stämme wurden jeweils als B. Licheniformis SE2 delap1, SE2 delap 3 bzw. SE2 delap6 bezeichnet. Keiner dieser Stämme produzierte Alkalische Protease.

Beispiel 29

Transformation von deletierten B. licheniformis SE2-Stämmen mit pUB-BPX12

pUB-BPX12 (Fig. 4) wurde von E. coli MC1061, wie in Beispiel 17 erhalten, extrahiert und isoliert und gereinigt, jeder der deletierten B. licheniformis SE2-Stämme (delap1, delap3 und delap6), der wie oben in Beispiel 28 beschrieben erhalten wurde, wurde dann durch jeweilige pUB-BPX12-Plasmide transformiert, gefolgt von Protoplasttechnik, und jeweilige Transformanten wurden selektiert, isoliert und gereinigt.
Die resultierenden transformierten Stämme waren B. licheniformis SE2 delap1 (pUB- BPX12); delap3 (pUB-BPX12); und delap6 (pUB-BPX12). Die Transformanten wurden dann in jeweilige Kulturen eingebracht wie nachstehend in Beispiel 33 beschrieben, um die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung zu erzeugen. Das Vorhandensein dieses Plasmids verleiht den resultierenden rekombinanten deletierten B. licheniformis SE2- Stämmen die folgenden Eigenschaften:
1. extrazelluläre Produktion von Xylanase; und
2. Kanamycin- und Phleomycin-Resistenz.

Beispiel 30

Transformation von deletierten B. licheniformis SE2-Stämmen mit anderen Expressionsvektoren

pUBDEBRA1 (Fig. 5), erhalten wie oben in Beispiel 18 beschrieben, pKAC1 (Fig. 6), erhalten, wie oben in Beispiel 19 beschrieben, pLI1 (Fig. 7), erhalten, wie oben in Beispiel 20 beschrieben, pL7SBT (Fig. 8), erhalten, wie oben in Beispiel 21 beschrieben, und pL7TAKA (Fig. 9), erhalten, wie oben in Beispiel 22 beschrieben, wurden alle aus ihren jeweiligen Wirten extrahiert und isoliert und gereinigt. Fünf Kulturen jedes der deletierten B. licheniformis SE2-Stämme (delap1, delap3 und delap6) wurden erhalten, wie oben in Beispiel 28 beschrieben. Eine jeweilige Kultur jedes dieser deletierten Stämme wurde dann mit einem der jeweiligen Plasmide transformiert. Transformationen wurden unter Einsatz der Protoplastentechnik durchgeführt.
Transformanten in jeder dieser fünf jeweiligen Kulturen wurden dann selektiert, isoliert und gereinigt.
Die Transformanten wurden dann in weitere jeweilige Kulturen eingebracht wie nachstehend in Beispiel 34 beschrieben, um das jeweilige Enzym zu erzeugen, für das kodiert wird.

Beispiel 31

Transformation von B. subtilis SE3 mit Expressionsvektoren

pUB-BPX12 (Fig. 4), wie oben in Beispiel 17 beschrieben erhalten, pUBDEBRA1 (Fig. 5), erhalten wie oben in Beispiel 18 beschrieben, pKAC1 (Fig. 6), erhalten, wie oben in Beispiel 19 beschrieben, pLI1 (Fig. 7), erhalten, wie oben in Beispiel 20 beschrieben, pL7SBT (Fig. 8), erhalten, wie oben in Beispiel 21 beschrieben, und pL7TAKA (Fig. 9), erhalten, wie oben in Beispiel 22 beschrieben, wurden alle aus ihren jeweiligen Wirten extrahiert und isoliert und gereinigt. Sechs Kulturen von Bacillus subtilis 5E3 wurden hergestellt. Jede der Kulturen wurde dann mit einem der jeweiligen Plasmide transformiert. Transformationen wurden unter Einsatz der Protoplastentechnik durchgeführt.
Transformanten in jeder dieser fünf jeweiligen Kulturen wurden dann selektiert, isoliert und gereinigt.
Die Transformanten wurden dann in weitere jeweilige Kulturen eingebracht wie nachstehend in Beispiel 35 beschrieben, um das jeweilige Enzym zu erzeugen, für das dadurch kodiert wird.

Beispiel 32

Transformation von B. pumilus PRL B12 mit pUB-BPX12

pUB-BPX12 (Fig. 4) wurde von E. coli MC1061, wie in Beispiel 17 erhalten, extrahiert und isoliert und gereinigt. pUB-BPX12 wurde dann nach dem Protoplasten-Verfahren durch Transformation in den Stamm B. pumilus PRL B12 eingeführt. Die Transformanten würden direkt auf DM3-Medium in Gegenwart von Phleomycin mit 20 ug/ml selektiert.
Transformanten in jeder dieser fünf jeweiligen Kulturen wurden dann selektiert, isoliert und gereinigt.
Die Transformanten wurden dann in weitere jeweilige Kulturen eingebracht wie nachstehend in Beispiel 36 beschrieben, um die Xylanase gemäß vorliegender Erfindung zu produzieren.

Beispiel 33

Expression von pUB-BPX12 in deletierten B. licheniformis SE2-Stämmen

Es wurden jeweilige Kulturen der deletierten B. licheniformis SE2-Stämme (delap1, delap3 und delap6) erhalten, die mit dem Expressionsvektor pUB-BPX12, wie oben in Beispiel 29 beschrieben, transformiert wurden.
Die Transformanten wurden für 17 h bei 37ºC in einer Vorkultur in L-B-Medium, ergänzt mit 0,5% Glucose (Gew./Vol.) und 20 ug/ml (Gew./Vol.) Kanamycin kultiviert. Diese Vorkultur (5 Vol.-%) wurde in Erlenmeyer-Kolben mit Brechern in 50 ml M2-Medium (beschrieben in Beispiel 1) eingeimpft, die mit 20 ug/ml Kanamycin ergänzt war. Die Kultivierung wurde unter Rühren im Verlauf von 80 h bei 37ºC durchgeführt. Nach 80 h Kultur unter den beschriebenen Bedingungen wurde die zelluläre Biomasse durch Zentrifugieren mit 5.000 U/min für 10 min entfernt.
Die enzymatische Aktivität der Xylanase in den Kulturbrühen wurden dann bestimmt, und die Menge an Protein (ug) wurde dann als Funktion der spezifischen Aktivität des Enzyms berechnet. Diese Ergebnisse wurden dann mit der enzymatischen Aktivität des Wirtsstamms B. licheniformis SE2 delap1 verglichen, der mit dem pUB131-Kontrollplasmid transformiert wurde (siehe nachstehende Tabelle 10).
Die erhaltenen Ergebnisse werden nachstehend in Tabelle 10 gezeigt und sind in Prozentsätzen im Vergleich zur Menge an Alkalischer Protease angegeben, die vom deletierten B. licheniformis SE2-Stamm produziert wird, der das Plasmid pLII enthält (Fig. 7), der das Alkalische Protease-Carlsberg-Gen enthält.

Beispiel 34 v

Expression durch Expressionsvektoren in deletierten B. licheniformis SE2-Stämmen

Jeweilige Kulturen der deletierten B. licheniformis SE2-Stämme (delap1, delap3 und delap6), die mit den Expressionsvektoren pUBDEBRA1, pKAC1, pLI1, pL7SBT und pL7- TAKA transformiert wurden, wie oben in Beispiel 30 beschriebe, wurden erhalten.
Die Transformanten wurden für 17 h bei 37ºC in einer Vorkultur aus L-B-Medium, ergänzt mit 0,5% Glucose (Gew./Vol.) und 20 pg/ml (Gew./Vol.) Kanamycin kultiviert. Diese Vorkultur (5 Vol.-%) wurde in Erlenmeyer-Kolben mit Brechern in 50 ml M2-Medium (beschrieben in Beispiel 1) eingeimpft, das mit 20 ug/ml Kanamycin ergänzt war.
Die Kultivierung wurde unter Rühren für 80 h bei 37ºC durchgeführt. Nach 80 h der Kultivierung unter den beschriebenen Bedingungen wurde die zelluläre Biomasse durch Zentrifugieren mit 5.000 U/min für 10 min entfernt.
Die enzymatische Aktivität der Pullulanase, α-Amylase und Alkalischen Proteasen in den Kulturbrühen wurde dann ermittelt, und die Menge an Protein (ug) wurde dann als Funktion der spezifischen Aktivität des Enzyms berechnet. Diese Ergebnisse wurden dann mit der enzymatischen Aktivität des Wirtsstamms B. licheniformis SE2 delap1 verglichen, der mit dem pUB131-Kontrollplasmid transformiert war (siehe nachstehende Tabelle 10).
Die erzielten Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 10 angegeben und sind in Prozentsätzen im Vergleich zur Menge an Alkalischer Protease angeführt, die vom deletierten B. licheniformis SE2-Stamm produziert wird, der das Plasmid pL11 (Fig. 7) enthält, der ein Alkalische Protease-Carlsberg-Gen enthält.

Beispiel 35

Expression durch Expressionsvektoren in B. subtilis SE3

Es wurden jeweilige Kulturen von B. subtilis SE3 erhalten, die mit den Expressionsvektoren pUBC-BPX12, pUBDEBRA1, pKAC1, pLI1, pL7SBT und pL7TAKA transformiert waren, wie oben in Beispiel 13 beschrieben.
Die Transformanten wurden für 17 h bei 37ºC in einer Vorkultur aus L-B-Medium, ergänzt mit 0,5% Glucose (Gew./Vol.) und 20 ug/ml (Gew./Vol.) Kanamycin kultiviert. Diese Vorkultur (5 Vol.-%) wurde in Erlenmeyer-Kolben mit Brechern in 50 ml M3-Medium (in Beispiel 1 beschrieben) eingeimpft, die mit 20 ug/ml Kanamycin ergänzt war. Die Kultivierung wurde unter Rühren für 80 h bei 37ºC durchgeführt. Nach 80 h Kultivierung unter den beschriebenen Bedingungen wurde die zelluläre Biomasse durch Zentrifugieren mit 5.000 U/min für 10 min entfernt.
Die enzymatische Aktivität der Xylanase, Pullulanase, α-Amylase und Alkalischen Proteasen in den Kulturbrühen wurden dann bestimmt, und die Menge an Protein (ug) wurde dann als Funktion der spezifischen Aktivität des Enzyms berechnet. Diese Ergebnisse wurden dann mit der enzymatischen Aktivität des Wirtsstamms B. licheniformis SE2 delap1, transformiert mit dem pUB131-Kontrollplasmid, verglichen (siehe nachstehende Tabelle 10).
Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 10 angegeben und sind als Prozentsätze im Vergleich zur Menge an Alkalischer Protease angeführt, die vom deletierten B. licheniformis SE2 delap1-Stamm produziert wird, der das Plasmid pLI1 (Fig. 7) enthält, der ein Alkalische Protease-Carlsberg-Gen enthält.

Beispiel 36

Expression durch Expressionsvektor pUB-BPX12 in B. pumilus PRL B12

Es würde eine Kultur des B. pumilus PRL B12-Stamms, der mit dem Expressionsvektor pUB-BPX12 transformiert wurde, wie oben in Beispiel 32 beschrieben.
Die Transformanten wurden direkt auf DM3-Medium in Gegenwart von Phleomycin mit 20 ug/ml erhalten.
Eine Transformantenkolonie wurde dann für 24 h bei 37ºC im oben in Beispiel 1 beschriebenen Vorkulturmedium kultiviert, ergänzt mit 25 ug/ml (Gew./Vol.) Kanamycin. Diese Vorkultur (5 Vol.-%) wurde entsprechend der oben in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift in einem Erlenmeyer-Kolben mit Brechern in 50 ml M1-Medium (in Beispiel 1 beschrieben) eingeimpft, ergänzt mit 20 ug/ml Kanamycin. Die Kultivierung wurde unter Rühren für 40 h bei 30ºC durchgeführt.
Nach 40 h Kultivierung wurde das extrazellulare Gemisch der Kulturbrühe, die die Xylanase von B. pumilus PRL B12 enthielt, durch Zentrifugieren mit 5.000 U/min für 10 min von der zellulären Biomasse abgetrennt.
Die enzymatische Aktivität der Xylanase in der Kulturbrühe wurde dann bestimmt, und die Menge an Protein (ug) wurde dann als Funktion der spezifischen Aktivität des Enzyms berechnet. Diese Ergebnisse wurden dann mit der enzymatischen Aktivität des Wirtsstamms B. licheniformis SE2 delap1 verglichen, der mit dem pUB131-Kontrollplasmid transformiert war (siehe nachstehende Tabelle 10).
Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 10 angegeben und sind als Prozentsätze im Vergleich zur Menge an Alkalischer Protease angeführt, die vom deletierten B. licheniformis SE2 delap1-Stamm produziert wird, der das Plasmid pLI1 enthält (Fig. 7), der ein Alkalische Protease-Carlsberg-Gen enthält.

Beispiel 37

Ausbeuten der verschiedenen Enzymen, die von verschiedenen Wirten produziert werden

Die verschiedenen oben in den Beispielen 33, 34, 35 und 36 beschriebenen Überstände wurde auf den Proteingehalt der jeweiligen Enzyme untersucht, die von den drei getesteten Bacillus-Wirten ausgeschieden wurden. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 10 angeführt.

In Tabelle 10:

steht (1) für B. licheniformis SE2 delap1;
steht (2) für B. licheniformis SE2 delap3;
steht (3) für B. licheniformis SE2 delap6;
steht (4) für B. subtilis SE3; und
steht (5) für B. pumilus PRL B12.
In Tabelle 10 entsprechen die in der Tabelle angegebenen Zahlen der Menge der jeweiligen Enzyme (mg Protein/ml), die von den relevanten Wirtsstämmen (mg Enzym/ml Kulturüberstand) ausgeschiedenen wird, ausgedrückt als Prozentsätze der Menge an homologer Alkalischer Protease Carlsberg, ausgeschieden von B. licheniformis SE2 delap1, von Plasmid pLll.
Die Menge an Protein, die jedem Enzym entspricht, wird gemessen, wie im Experimentellen Teil unter der Überschrift "Verfahren und Techniken" beschrieben.
"NS" gibt an, dass die Plasmide in den entsprechenden Wirtsstämmen in hohem Maße instabil waren und daher keine Produktivitätsdaten verfügbar sind. TABELLE 10 Produktivität (%) der Expressionsvektoren in B. licheniformis SE2 delap-Stämmen
Die Ergebnisse zeigen, dass die deletierten B. licheniformis-Stämme insofern ein viel vorteilhafterer Stamm sind als B. subtilis, als die Ausscheidung heterologer Proteine viel effizienter ist. Beispielsweise kann B. licheniformis SE2 defap6 (pUB-BPX12) 24-mal mehr Xylanase produzieren als B. subtilis SE3 (pUß-BPXl2), und zwar unter den gleichen Bedingungen und unter Einsatz des gleichen Expressionsvektors (pUBC-BPX12). Die mit Expressionsvektor pUBC-BPX12 in diesem β. licheniformis SE2 delap6-Wirt erzielten Ausbeuten sind sogar um das 4,8fache höher als die Ausbeuten, die mit dem gleichen Expressionsvektor im streng homologen Expressionswirt B. pumilus PRL B12 erhalten werden.
Darüber hinaus wurde bei mehreren Expressionsvektoren festgestellt, dass sie in B. subtilis 5E3 vollkommen instabil sind: pLI1 (Carlsberg-Protease), pL7TAKA (α-Amylase), pL7SBT (Subtilisin 168) und pUBDEBRA1 (Pullulanase). In all diesen Fällen konnten kaum Transformanten erhalten werden, da Deletionen in den Expressionsvektoren mit hoher Häufigkeit auftraten. Andererseits erwiesen sich in den B. licheniformis SE2 delapl- und delap6-Stämmen die gleichen Expressionsvektoren als sehr stabil, und es wurden gute Ausbeuten erzielt.
Einige heterologe Enzyme, beispielsweise Xylanase (220%) und in einem geringeren Ausmaß Subtilisin 168 (133%) wurden in noch größeren Mengen produziert als die homologe Carlsberg-Protease, die in diesem Versuch als Bezug verwendet wurde.
Einige Enzyme werden in einer ähnlichen Ausbeute produziert wie die homologe Protease Carlsberg, die in diesem Versuch als Bezug verwendet wird (beispielsweise Pullulanase (105%))
Tabelle 10 zeigt auch die bessere Effizienz des homologen Transkriptionspromotors von B. licheniformis, um die Synthese von Subtilisin 168 anzutreiben. Ein Vergleich der Ergebnisse für die Expression des pL7SBT mit jenen für das pKAC1-Plasmid zeigt, dass die Produktivität tatsächlich unter Einsatz des homologen Alkalische Protease-Transkriptionspromotors höher ist als mit dem heterologen B. subtilis-Promotor.
Daher zeigen die Ergebnisse in Tabelle 10 deutlich, dass die deletierten B. licheniformis SE2-Stämme, wie gemäß vorliegender Erfindung beschrieben, hervorragende Wirte für die heterologe Expression von Proteinen sind.
Offensichtlich können viele Modifikationen vorgenommen werden, ohne vom grundlegenden Geist der Erfindung abzuweichen. Demgemäß werden Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung anerkennen, dass im Schutzumfang der vorliegenden Ansprüche die Erfindung auf andere Weise praktisch umgesetzt werden kann als spezifisch hierin beschrieben worden ist.

BIBLIOGRAPHIE

(1) F. Simpson, "Microbial Pentosanases II. Some Factors Affecting the Production of Pentosanases by Bacillus pumilus and Bacillus subtilis", Can. J. Microbiol. 2, 28-38 (1956).
(2) Deutsche Patentanmeldung Nr. DE 4023458.
(3) "Molecular Cloning - Laboratory Manual" (Sambrook, Fritsch, Maniatis) 2. Aufl. (1989).
(4) "Molecular Biological Methods for Bacillus", C.R. Harwood, und S. M. Cutting (Hrsg.), John Wiley and Sons (1990).
(5) "DNA Cloning", Band II, D.M. Glover (Hrsg.), IRL Press, Oxford (1985).
(6) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook), Cold Spring Harbor Laboratory (1982).

LISTE DER IN DEN ZEICHNUNGEN VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN

Nachstehend folgt eine Liste der Abkürzungen, die (in der gesamten Anmeldung) in den Zeichnungen verwendet werden:
REP Replikationsinitiationsprotein
ORI+ Ursprung der Plus-Strang-Synthese
ORI- Minus-Replikatikonsursprung
KMR Resistenz gegen Kanamycin verleihendes Gen
BLMR Resistenz gegen Bleomycin verleihendes Gen
MAT Reifes Protein
PRE Präsequenz
PP Präprosequenz
BPUXYL für B. pumilus PRL B12-Xylanase kodierende Sequenz
BSUAPR für B. subtilis-Subtilisin kodierende Sequenz
BLIAMY für B. licheniformis-α-Amylase kodierende Sequenz
BLIAPR für B. licheniformis-Alkalische Protease kodierende Sequenz
5'BLIAPR 5'-Sequenz stromauf von BLIAPR
3'BLIAPR 3'-Sequenz stromab von BLIAPR

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: SOLVAY (Société anonyme)
(B) STRASSE: Rue du Prince Albert, 33
(C) STADT: Brüssel
(E) LAND: Belgien
(F) PLZ: 1050
(G) TELEFON: 02/509 61 11
(ii) TITEL DER ERFFINDUNG: XYLANASE VON EINER BACILLUS-SPEZIES, EXPRESSIONSVEKTOREN FÜR DIESE XYLANASE UND ANDERE PROTEINE, WIRTSORGANISMEN DAFÜR UND VERWENDUNGEN DAVON.
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 35
(iv) COMPUTERLESBARE FORM.
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 1
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 1022 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE.
(A) ORGANISMUS: Bacillus pumilus
(B) STAMM: PRL B12 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 1
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 2
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: N-terminal
(vi) URPSRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS: Bacillus pumilus
(B) STAMM: PRL B 12 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 2
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 3
(i) SEQUENZMERKMALE;
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 3
GTAGAGGATC ATCATGT 17
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 4
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 4
TACCTTGTCT ACAAACCCC
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 5
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 5:
TGAGTTGCTA GTAACATCTC ACCGA 25
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 6
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 6:
AAGCTTGTAT GCCTGCAG
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 7
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 7

GATCCCCTTG GCTGCAGGAG CT
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 8
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 14 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 8:
CCTGCAGCCA AGGG 14
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 9
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 52 Basen paare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 9:
GATCCCCGGG ACCTTAGGCC TTTAATTAAC CTTGGCGGCC GCTCGAGGAG CT 52
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 10
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 44 Basen paare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 10
CCCGAGCGG CCGCCAGGT TAATTAAAGG CCTAAGGTCC CGGG 44
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 11
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 42 Basen paare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 11
ATTATATTAT CCTTCTATTT AATTAATCTG AATAAAGAGG AG 42
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 12
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 58 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 12
CGCTTAÄTTA AAAATGAGGA GGGAACCGAG TGAGAAGCAA AAAATTGTGG ATCAGCTT 58
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 13
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 13
GATCATGGAA CGAGCTCAAC ATGCGGAGAA AGAAGAG
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 14
(1) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oiigonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 14
CTTGTTAAAA ATTCGGAATA TTTAATTAAA TCATATGTTT CA 42
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 15
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 15
GCTGCAAAGC ATAATGATGA CGGTCC 26
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 16
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 16
GGCGGAGCAA GCTTTGTGG 19
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 17
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 17
ATGGCTCCTG GCGCAGGC 18
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 18
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 18
CTTGGAGCTC GTTAACAGAT CT 22
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 19
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 19
CTTGAGATCT GTTAACGAGC TC 22
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 20
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 20
CATCTAATCT TCAACACCCG GGCCCGTTTG TTGAAC 36
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 21
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 21
CAAAATAAAA AAGATACAAC CCGGGTCTCT CGTATCITIT AT 42
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 22
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 22
CCTTAATTA ACCTTGGCGG CCGCTCGAGG AGCT 34
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 23
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Nukleinsäure (synthetisches Oligonukleotid)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 23:
CCTCGAGCGG CCGCCAAGGT TAATTAAAGG 30
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 24
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 200 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(v) FRAGMENTTYP: internes Fragment
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE.
(A) ORGANISMUS: Bacillus pumitus
(8) STAMM: PRL 812 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 24
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 25
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 27 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(v) FRAGMENTTYP: internes Fragment
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE.
(A) ORGANISMUS: Bacillus pumilus
(B) STAMM: PRL B12 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 25
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 26
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 600 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 26:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 27
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 81 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 27:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 28
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 185 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 28:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 29
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 156 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 29:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 30
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 681 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 30:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 31
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 227 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(v) FRAGMENTTYP: internes Fragment
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE.
(A) ORGANISMUS: Bacillus pumilus
(8) STAMM: PRL 812 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 31
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 32
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 681 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE.
(A) ORGANISMUS: Bacillus pumilus
(B) STAMM: PRL B 12 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 32
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 33
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 81 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE.
(A) ORGANISMUS: Bacillus pumilus
(B) STAMM: PRL B 12 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 33
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 34
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 600 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE.
(A) ORGANISMUS: Bacillus pumilus
(B) STAMM: PRL B12 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 34:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 35
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 1022 Basen paare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID Nr. 35

Claims

1. Gereinigte Xylanase mit der in Seq.-ID Nr. 24 dargelegten Aminosäuresequenz.

2. Gereinigte Xylanase nach Anspruch 1, worin die Xylanase weiters die Leadersequenz mit der in Seq.-ID Nr. 25 dargelegten Aminosäuresequenz umfasst.

3. Xylanase nach Anspruch 1 oder 2, worin die Xylanase von Bacillus pumilus PRL B12 stammt.

4. Verfahren zur Produktion einer Xylanase in einer Bacillus-Spezies, wobei das Verfahren das Transformieren der Bacillus-Spezies mit einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Xylanase kodiert, welche die in Seq.-ID Nr. 24 dargelegte Aminosäuresequenz. umfasst, das Kultivieren des Bacillus unter geeigneten Bedingungen für die Expression der Xylanase und das Gewinnen der so produzierten Xylanase umfasst.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Bacillus ein transformierter Stamm von Bacillus licheniformis ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, worin die Xylanase von Bacillus pumilus PRL B12 stammt und die Xylanase von einem Mikroorganismus des Genus Bacillus heterolog produziert wird und der Mikroorganismus ein natürlich vorkommendes alkalische Protease-Gen aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das alkalische Protease-Gen aus dem Mikroorganismus deletiert ist.

8. DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die Für eine Xylanase mit der in Seq.-ID Nr. 24 dargelegten Aminosäuresequenz kodiert.

9. DNA-Molekül nach Anspruch 8, worin die Nukleotidsequenz für reife Xylanase kodiert, wie in Seq.-ID Nr. 26 dargelegt.

10. DNA-Molekül nach Anspruch 8 oder 9, das weiters eine Nukleotidsequenz umfasst, die für die Präsequenz der Xylanase mit der in Seq.-ID Nr. 25 dargelegten Aminosäuresequenz kodiert.

11. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 8 bis 10, das weiters stromauf gelegene Nukleotidsequenzen des Xylanase-Gens von Bacillus pumilus PRL B12 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 28 dargelegt.

12. DNA-Molekül, das ein isoliertes Xylanase-Gen von Bacillus pumilus PRL B12 mit der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegten Nukleotidsequenz umfasst.

13. Expressionsvektor, der das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 8 bis 12 umfasst.

14. Bacillus licheniformis, der mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 13 transformiert ist.

15. Verfahren zur Behandlung von Lignocellulose-Pulpe, umfassend die Behandlung des Holzzellstoffs mit einer Xylanase nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das Verfahren die Vorbehandlung der Lignocellulose-Pulpe mit der Xylanase umfasst.