ES2239046T3 - Metodo para mejorar la estabilidad y ampliar el intervalo de ph de xilanasas de la familia g/11. - Google Patents
Metodo para mejorar la estabilidad y ampliar el intervalo de ph de xilanasas de la familia g/11.Info
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Abstract
Una enzima xilanasa modificada de la familia G/11, en la que dicha xilanasa modificada tiene una termoestabilidad y una estabilidad frente al pH aumentadas con respecto a una xilanasa salvaje correspondiente, habiéndose modificado la enzima salvaje mediante la unión de la secuencia N-terminal de la enzima por al menos un puente disulfuro a la cadena â adyacente.
Description
Método para mejorar la estabilidad y ampliar el
intervalo de pH de xilanasas de la familia G/11.
Esta invención se refiere a la ingeniería de
proteínas, y concierne especialmente a las xilanasas de la familia
G/11, y a los genes que codifican dichas enzimas. Específicamente,
la invención concierne al gen XYNII de Trichoderma
reesei, que codifica la
endo-1,4-\beta-xilanasa
(EC 3.2.1.8). La invención describe cómo la mutagénesis dirigida
puede usarse para mejorar las propiedades de una enzima para
ajustarse a las condiciones industriales donde se usa. La ingeniería
de proteínas puede usarse para mejorar la termoactividad y
termoestabilidad de las xilanasas, así como para ampliar su
intervalo de pH.
Las xilanasas son
glicosil-hidrolasas que hidrolizan cadenas de
xilopiranósido unidas mediante uniones \beta-1,4.
Las xilanasas se han encontrado en al menos un centenar de
organismos diferentes. Junto con otras
glicosil-hidrolasas, forman una superfamilia que
incluye más de 40 familias de enzimas diferentes (Henrissat y
Bairoch, 1993). Las xilanasas de la familia 11 (previamente G) se
definen por las similitudes en sus secuencias génicas, estructuras
proteicas y mecanismos catalíticos. Las características comunes
para los miembros de esta familia son una alta homología genética,
un tamaño de aproximadamente 20 kDa, y un mecanismo catalítico de
doble desplazamiento (Tenkanen et al., 1992; Wakarchuk et
al., 1994).
Las xilanasas de la familia 11 consisten
principalmente en cadenas \beta que forman dos grandes láminas
\beta, y en una hélice \alpha. Éstas forman una estructura que
se asemeja a una mano derecha parcialmente cerrada, en la que las
láminas \beta se denominan láminas A y B (Törrönen y Rouvinen,
1997). Las xilanasas de la familia 11 tienen un especial interés en
aplicaciones industriales, porque su estructura es estable, y no son
susceptibles a la actividad de las proteasas. Además, las xilanasas
pueden producirse económicamente a escala industrial. Se sabe que
Trichoderma reesei produce tres xilanasas diferentes, de las
cuales las xilanasas I y II (XynI y XynII) son las mejor
caracterizadas (Tenkanen et al., 1992).
XynI tiene un tamaño de 19 kDa, y comparada con XynII tiene un bajo punto isoeléctrico y pH óptimo (pI 5,5, pH 3-4). XynII tiene un tamaño de 20 kDa y tiene un pI de 9,0 y un pH óptimo de 5,0-5,5 (Törrönen y Rouvinen, 1995).
XynI tiene un tamaño de 19 kDa, y comparada con XynII tiene un bajo punto isoeléctrico y pH óptimo (pI 5,5, pH 3-4). XynII tiene un tamaño de 20 kDa y tiene un pI de 9,0 y un pH óptimo de 5,0-5,5 (Törrönen y Rouvinen, 1995).
Las aplicaciones industriales más importantes de
las xilanasas son el blanqueo de pasta, la modificación de fibras
textiles, y la modificación de biomasa para mejorar su digestión en
alimentación animal (Prade, 1996). Un denominador común a todas
estas aplicaciones es las condiciones extremas a las que se enfrenta
la enzima. Las altas temperaturas, y un pH que difiere
sustancialmente del pH óptimo de muchas xilanasas disminuyen la
utilidad eficaz de las xilanasas actualmente disponibles en
aplicaciones industriales.
En aplicaciones para piensos, la enzima se
enfrenta a condiciones de alta temperatura en un tiempo corto (p.ej.
2-5 min a 90ºC) durante la preparación del pienso.
Sin embargo, la actividad catalítica real de la enzima se necesita a
temperaturas inferiores (p.ej. \sim37ºC). Por consiguiente, la
enzima no debería inactivarse irreversiblemente a altas
temperaturas, mientras que tiene que ser activa a temperaturas
relativamente bajas.
En el blanqueo de pasta el material que viene del
lavado alcalino tiene una alta temperatura (> 80ºC) y pH (>
10). Ninguna de las xilanasas comercialmente disponibles sobrevive a
estas condiciones. La pasta debe enfriarse y el pH alcalino
neutralizarse para tratar la pasta con las xilanasas actualmente
disponibles. Esto significa un aumento de los costes. La ingeniería
de proteínas se ha usado - algunas veces exitosamente - para
estabilizar las xilanasas para que resistan el efecto
desnaturalizante de la alta temperatura y pH.
Se han encontrado y clonado varias xilanasas
termoestables, alcalinófilas y acidófilas de organismos termófilos
(Bodie et al., 1995; Fukunaga et al., 1998). Sin
embargo, la producción de cantidades económicas de estas enzimas ha
resultado ser difícil en la mayoría de los casos. Por tanto, la
xilanasa II de T. reesei, que no es tan termoestable, se
encuentra en uso industrial porque puede producirse a un bajo coste
en grandes cantidades. Como una alternativa al aislamiento de nuevas
xilanasas, o al desarrollo de procedimientos de producción, puede
contemplarse la modificación por ingeniería de las xilanasas usadas
actualmente para que sean más estables en condiciones extremas.
La estabilidad de la xilanasa de Bacillus
circulans se ha aumentado mediante puentes disulfuro, uniendo el
extremo N-terminal de la proteína al extremo
C-terminal y la parte N-terminal de
la hélice \alpha a la cadena \beta vecina (Wakarchuk et
al., 1994). También Campbell et al., (1995) han
modificado la xilanasa de Bacillus circulans mediante
puentes disulfuro inter- e intramoleculares, para aumentar la
termoestabilidad. Por otro lado, la estabilidad de la xilanasa II de
T. reesei se ha mejorado cambiando la región
N-terminal por la parte respectiva de una xilanasa
termófila (Sung et al., 1998). Además de la termoestabilidad
mejorada, el intervalo de actividad de la enzima se amplió en el pH
alcalino. También se han usado mutaciones en un solo punto para
aumentar la estabilidad de la xilanasa de Bacillus pumilus
(Arase et al., 1993). La influencia de la mutagénesis en la
estabilidad se ha estudiado en muchas otras enzimas. Comparando las
estructuras de las enzimas termófilas y mesófilas se ha obtenido
mucha información (Vogt et al., 1997). La información
estructural de las xilanasas termófilas ha proporcionado también
información acerca de los factores que influencian la
termoestabilidad de las xilanasas (Gruber et al., 1998;
Harris et al., 1997).
La presente invención se refiere a xilanasas que
pertenecen a las glicosil-hidrolasas de la familia
11 (previamente G). La invención proporciona xilanasas modificadas
para cambiar su termoestabilidad, termoactividad, y/o ampliar su
intervalo de pH.
Varias modificaciones en la estructura de la
xilanasa de Trichoderma reesei, bien solas o en
combinaciones, dan como resultado los cambios descritos en esta
invención:
(1) la estabilidad de la enzima se aumenta
mediante la unión de la región N-terminal por
puentes disulfuro (por ejemplo, los puentes formados por los pares
de mutaciones T2C y T28C; P5C y N19C; T7C y S16C; N10C y N29C) al
cuerpo de la proteína;
(2) el extremo C-terminal se
estabiliza por extensión con un ácido aspártico adicional (+191D)
que forma un puente salino con la arginina 58 (la lisina 58 de la
enzima salvaje se ha cambiado por una arginina (K58R));
Específicamente, la presente invención
proporciona una xilanasa de Trichoderma reesei modificada en
la que los aminoácidos T2 y T28 se han cambiado por cisteínas, K58
se ha cambiado por una arginina, y se ha añadido un ácido aspártico
(+191D) al extremo C-terminal de la enzima, formando
así un puente disulfuro entre los aminoácidos T2C y T28C, y un
puente salino entre los aminoácidos K58R y +191D.
Figura 1. Un juego de oligonucleótidos usados en
la mutagénesis de la xilanasa (codones cambiados subrayados). Las
secuencias se proporcionan también en el Listado de Secuencias que
acompaña como las secuencias 1 a 12.
Figura 2. Una gráfica que presenta el efecto de
las mutaciones T2C, T28C, K58R, y +191D en el óptimo térmico de
XynII de T. reesei (WT = enzima salvaje; Y5 = XynII de T.
reesei mutada).
Figura 3. Una gráfica que presenta el efecto de
las mutaciones T2C, T28C, K58R, y +191D en la actividad dependiente
del pH de XynII de T. reesei (WT e Y5 como en la Figura
2).
Figura 4. Una gráfica que presenta el efecto de
las mutaciones T2C, T28C, K58R, y +191D en la inactivación de XynII
de T. reesei a diferentes temperaturas (WT e Y5 como en la
Figura 2).
Las xilanasas de la familia G/11 procedentes de
bacterias, levaduras y hongos tienen una estructura molecular común.
Ejemplos de tales xilanasas son:
XynA de Aspergillus niger
XynC de Aspergillus kawachii
XynA de Aspergillus tubigensis
XynA de Bacillus circulans
XynA de Bacillus pumilus
XynA de Bacillus subtilis
XynA de Neocallimastix patriciarum
XynB de Streptomyces lividans
XynC de Streptomyces lividans
XynII de Streptomyces thermoviolaceus
XynA de Thermonospora fusca
Xyn de Trichoderma harzianum
XynI de Trichoderma reesei, XynII de
Trichoderma reesei
Xyn de Trichoderma viride
La invención trata de xilanasas de la familia
G/11 con las siguientes características comunes:
(i) Enzimas en las que la secuencia
N-terminal es una parte de la lámina \beta de
doble capa (en las xilanasas de la familia 11 las láminas A y B
(Gruber et al., 1998)) y en las que la primera cadena
\beta (en XynII de T. reesei los aminoácidos
5-10) o el extremo N-terminal
pueden estar unidos por puentes disulfuro bien a las cadenas \beta
adyacentes (en XynII de T. reesei los aminoácidos
13-19) o a otras regiones vecinas.
(ii) Enzimas en las que la cadena peptídica
C-terminal forma una cadena \beta (en XynII de
T. reesei los aminoácidos 183-190), que es
una parte de una lámina \beta mayor, y en las que la región
C-terminal puede estar unida por puentes disulfuro a
las cadenas \beta adyacentes o por puentes salinos al cuerpo de
la enzima.
La xilanasa II de T. reesei tiene las
propiedades mencionadas anteriormente y en dicha enzima la
termoestabilidad, la estabilidad frente al pH y la termoactividad
pueden modificarse basándose en estas propiedades. Se han realizado
los siguientes cambios en el gen de la xilanasa (XYNII) de
T. reesei:
1. Por mutagénesis dirigida se forman puentes
disulfuro en la región N-terminal:
* Las treoninas 2 y 28 se cambian por cisteínas,
dando como resultado un puente disulfuro que se forma entre ellas
(T2C y T28C).
* La prolina 5 y la asparagina 19 se cambian por
cisteínas, dando como resultado un puente disulfuro que se forma
entre ellas (P5C y N19C).
* La treonina 7 y la serina 16 se cambian por
cisteínas, dando como resultado un puente disulfuro que se forma
entre ellas (T7C y S16C).
* La asparagina 10 y la asparagina 29 se cambian
por cisteínas, dando como resultado un puente disulfuro que se
forma entre ellas (N10C y N29C).
2. Por mutagénesis dirigida, el extremo
C-terminal se une más estrechamente al cuerpo de la
enzima añadiendo como cambio recombinante un aminoácido (p.ej. ácido
aspártico o ácido glutámico) al extremo C-terminal
de la xilanasa, que seguidamente forma un puente salino desde el
extremo C-terminal hacia el cuerpo de la enzima. Si
resulta apropiado, puede realizarse la sustitución de un aminoácido
adecuado en el cuerpo de la proteína, para posibilitar la formación
de un puente salino.
* Se añade un ácido aspártico (+191D) a la serina
C-terminal (S190). Esto da como resultado un puente
salino con la arginina en posición 58, donde la lisina salvaje se
ha sustituido por una arginina (K58R).
La producción de los genes XYNII mutados y
recombinantes se llevó a cabo mediante los siguientes procedimientos
generales:
La xilanasa II de T. reesei se produjo en
las cepas de E. coli XL1-Blue o Rv308 usando
el vector pKKtac (VTT, Espoo, Finlandia) o el vector pALK143 (ROAL,
Rajamäki, Finlandia). El gen XYNII de T. reesei se
clonó directamente por PCR del cDNA de T. reesei en el
vector pKKtac (inducción de la expresión por IPTG).
Alternativamente, se usó el plásmido pALK143 que contiene el gen
XYNII de T. reesei. Ambos vectores secretan la
xilanasa al medio; el vector pKKtac mediante la secuencia señal de
la pectato-liasa (peIB) y el vector pALK143 mediante
la secuencia señal de la amilasa.
La producción del gen XYNII de T.
reesei mutado usado en los Ejemplos de esta solicitud, se
efectuó como sigue: las mutaciones se produjeron por la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotídicos
que contenían las secuencias de los codones cambiados. En la Figura
1 se dan ejemplos de los oligonucleótidos usados, así como en el
Listado de Secuencias que acompaña como las secuencias 1 a 12. La
PCR usando los cebadores (que contenían la mutación deseada) se
llevó a cabo por el método Quick Change (Stratagene, Westburg,
Leusden, Holanda) y por métodos conocidos en general. Se usó
PfuTurbo como DNA polimerasa (Stratagene, La Jolla, Ca, USA). Las
cepas de E. coli clonadas se cultivaron en placas que
contenían xilano (xilano de madera de abedul: Sigma, Steinheim,
Alemania) acoplado a azul brillante de Rhemazol. La actividad
xilanasa pudo verse como halos alrededor de las colonias (Biely
et al., 1985).
La actividad xilanasa de las muestras enzimáticas
se determinó midiendo la cantidad de azúcares reductores liberados
de la fibra de xilano hidrolizada. Los azúcares reductores se
midieron por el método del DNS (ácido
3,5-dinitrosalicílico) en tampón
citrato-fosfato 50 mM (Bailey et al., 1992).
La determinación de la actividad estándar se llevó a cabo a pH 5 y
50ºC.
La estabilidad de las xilanasas se ensayó
midiendo la semivida de las enzimas modificadas a diferentes
temperaturas. La enzima se incubó durante tiempos variables a 55 ó
65ºC y se midió la actividad residual como se describe
anteriormente. La estabilidad a altas temperaturas se midió también
incubando las enzimas durante 10 min a temperaturas variables y
midiendo subsiguientemente la actividad residual por el método del
DNS. La actividad xilanasa dependiente del pH se midió determinando
la actividad de la enzima a valores de pH variables. El óptimo de
temperatura de la enzima se determinó midiendo la actividad a
temperaturas variables (10 min, pH 5). Las propiedades de las
enzimas mutadas se compararon con la enzima XynII de T.
reesei salvaje.
Las tres mutaciones (T2C, T28C y K58R) y el
cambio recombinante (+191D) se realizaron en XynII de T.
reesei usando los métodos descritos anteriormente. La enzima
mutante se designó como Y5. Dicha enzima mutante se expresó en E.
coli, que se cultivó a +37ºC en matraces en agitación usando
caldo Luria como medio de crecimiento. Después del cultivo, las
células se eliminaron por centrifugación y la xilanasa secretada al
medio se caracterizó en condiciones variables, como se describe
anteriormente. La Figura 2 muestra el efecto de la temperatura en la
actividad de la enzima cuando la enzima mutante Y5 (T2C, T28C,
K58R, +191D) y la salvaje (XynII de T. reesei) se incubaron
durante 10 min con xilano de madera de abedul a temperaturas
variables, y la cantidad relativa de los azúcares reductores según
se liberaban se midió con el método del DNS. Dichas mutaciones
mejoraron el óptimo de temperatura de la xilanasa en
aproximadamente 15ºC.
La xilanasa mutante con tres mutaciones (T2C,
T28C, K58R, +191D) descrita en el Ejemplo 1 se incubó durante 10 min
en xilano de madera de abedul al 1% a 50ºC en tampón
citrato-fosfato, a valores de pH variables. La
Figura 3 muestra la cantidad relativa de azúcares reductores según
se liberaban para las xilanasas mutante y salvaje. Las mutaciones
ampliaron ligeramente la actividad dependiente del pH de la enzima
en dirección alcalina. La enzima mutante fue más activa que la
enzima salvaje a pH 7-8; la actividad de la enzima
mutante fue aproximadamente un 20% mayor a pH 8 (50ºC).
El mutante con tres mutaciones mencionado
anteriormente (T2C, T28C, K58R, +191D) y la enzima salvaje se
incubaron durante 10 min a temperaturas variables. Después de la
incubación, las muestras se enfriaron y se determinó la actividad
residual en condiciones estándar. La enzima salvaje estaba
completamente inactivada ya a 55-60ºC. La enzima
mutante retuvo aproximadamente un 50% de su actividad incluso a
65ºC (Figura 4). La Tabla 1 más abajo muestra las semividas (T1/2)
de la xilanasa mutante (Y5) y salvaje a 55ºC y 65ºC.
| pH 5 | pH 8 | |
| 55ºC | ||
| Y5 | estable | estable |
| XynII salvaje | \sim5 min | \sim2 min |
| 65ºC | ||
| Y5 | 20-25 min | \sim10 min |
| XynII salvaje | 40 seg |
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación T28C
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgacgtact gcaatggtcc cggcggg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación K58R
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaccaaga acagggtcat caacttctcg ggc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación +191D
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatcaccg tcagcgatta aagggggctc ttc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación P5C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagacgat tcagtgcggc acgggctaca ac
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación N19C
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctactcg tactggtgcg atggccacgg cg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación T7C
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgattcagcc cggctgcggc tacaacaacg gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación S16C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacggctac ttctactgct actggaacga tggcc
\hfill35
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación N10C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggcacggg ctactgcaac ggctacttct actc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación N29C
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgtgacgt acacctgcgg tcccggcggg c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación L105C
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipggcgccacca agtgcggcga ggtcacc
\hfill27
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<210> 12
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: El oligonucleótido usado en la mutación Q162C
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgtgggctc agtgcggcct gacgctcg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Una enzima xilanasa modificada de la familia
G/11, en la que dicha xilanasa modificada tiene una
termoestabilidad y una estabilidad frente al pH aumentadas con
respecto a una xilanasa salvaje correspondiente, habiéndose
modificado la enzima salvaje mediante la unión de la secuencia
N-terminal de la enzima por al menos un puente
disulfuro a la cadena \beta adyacente.
2. La enzima xilanasa modificada de la
reivindicación 1, habiéndose modificado la enzima salvaje
adicionalmente por la adición al extremo C-terminal
de la enzima de un aminoácido para formar un puente salino desde
dicho aminoácido al cuerpo de la proteína.
3. La xilanasa modificada según la reivindicación
1 ó 2, en la que la unión de la secuencia
N-terminal de la enzima a la cadena \beta
adyacente se ha efectuado formando un puente disulfuro entre los
aminoácidos T2C y T28C, basándose la numeración en la numeración de
los aminoácidos de la xilanasa II de Trichoderma reesei
(XynII).
4. La xilanasa modificada según la reivindicación
3, en la que al extremo C-terminal de la enzima se
ha añadido un ácido aspártico o un ácido glutámico de tal forma que
se forma un puente salino entre dicho aminoácido añadido y un
aminoácido adecuado en el cuerpo de la proteína.
5. La xilanasa modificada según la reivindicación
4, en la que los aminoácidos T2 y T28 se han cambiado por
cisteínas, K58 se ha cambiado por arginina, y al extremo
C-terminal de la enzima se ha añadido un aminoácido
aspártico (+191D), formando así un puente disulfuro entre los
aminoácidos T2C y T28C y un puente salino entre los aminoácidos K58R
y +191D, basándose la numeración en la numeración de los aminoácidos
de la xilanasa II de T. reesei (XynII).
6. La xilanasa modificada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que la xilanasa es una xilanasa de
Trichoderma reesei.
7. La xilanasa modificada según la reivindicación
6, en la que la xilanasa es la xilanasa II de Trichoderma
reesei (XynII).
8. Un método para mejorar la termoestabilidad y
la estabilidad frente al pH de las xilanasas de la familia G/11,
que comprende llevar a cabo el paso de:
- unir la secuencia N-terminal de
la enzima por al menos un puente disulfuro a la cadena \beta
adyacente.
9. El método de la reivindicación 8, que
comprende adicionalmente llevar a cabo el paso de añadir al extremo
C-terminal de la enzima un aminoácido para formar un
puente salino desde dicho aminoácido al cuerpo de la proteína.
10. El método según la reivindicación 9, en el
que el aminoácido añadido es ácido aspártico o ácido glutámico.
11. El método según la reivindicación 10, en el
que en la xilanasa de T. reesei (XynII), el ácido aspártico
o ácido glutámico adicional forma un puente salino con el
aminoácido 58 que se ha cambiado por arginina.
12. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, que comprende cambiar los aminoácidos T2 y
T28 por cisteínas, y K58 por arginina, y añadir al extremo
C-terminal de la enzima un ácido aspártico (+191D),
formando así un puente disulfuro entre los aminoácidos T2C y T28C y
un puente salino entre los aminoácidos K58R y +191D, basándose la
numeración en la numeración de los aminoácidos de la xilanasa II de
T. reesei (XynII).
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