DE202006021153U1

DE202006021153U1 - Stabile, haltbare Granulate mit aktiven Mitteln

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Publication number: DE202006021153U1
Application number: DE202006021153U
Authority: DE
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2013-02-22
Anticipated expiration: 2016-10-13
Also published as: WO2007044968A3; EP1940241B1; AU2006299824A1; DE12159269T1; RU2415602C2; ES2392865T3; US20130115297A1; DE202006021148U1; EP2497375A2; DK201300009U1; ES2443018T1; ZA200803025B; EP2497378A2; EP2497372A2; EP2497375A3; EP2497377A2; EP2497379A2; EP2497378A3; EG25772A; BRPI0617342A2

Abstract

Granulat für Tierfutter, umfassend: einen Kern; einen Wirkstoff; und wenigstens eine Beschichtung; wobei das Granulat ein feuchtigkeitshydratisierendes Material umfasst, das wenigstens 25 Gew.-% des Granulats ausmacht, und wobei die Wasseraktivität des Granulats weniger als 0.5 beträgt.

Description

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Diese Anmeldung nimmt die Priorität der U.S. Provisional Application Serien-Nr. 60/726,494 vom 12. Oktober 2005 gemäß 35 U.S.C. § 119 in Anspruch
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft stabile, haltbare Granulate mit aktiven Mitteln (Wirkstoffen). Insbesondere betrifft die Erfindung thermostabile, haltbare Granulate mit aktiven Mitteln, wobei die Granulate insbesondere für den Einschluss bei Dampfbehandlungsverfahren, einschließlich Pelletier- und Tablettierverfahren und Dampfverarbeitung von Futter geeignet sind, ohne merklichen Verlust der Aktivität des aktiven Mittels zu zeigen. Die stabilen, haltbaren Granulate weisen Auflösungsprofile auf, die geeignet sind, um das aktive Mittel freizusetzen und so eine Wirksamkeit für dessen beabsichtigten Zweck bereitzustellen. Die Aktivität der aktiven Mittel bleibt nach Lagerung in unpelletierten Mischungen und Dampfbehandlung beibehalten.
Hintergrund der Erfindung
Die Verwendung von aktiven Mitteln, wie Enzymen, in Tierfuttern ist gebräuchlich. Von Enzymen ist bekannt, dass sie die Verdaulichkeit von Futter verbessern, Anti-Ernährungsfaktoren in Futter verringern und die tierische Produktivität verbessern. In der Industrie ist bekannt, dass saure und basische Futterbestandteile wie auch besondere Bestandteile von Tierfutter, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Spurenmineralien, organische oder anorganische Säuren oder Basen, reduzierende Zucker und hygroskopische Substanzen, insbesondere Cholinchlorid und Natriumchlorid, negative Auswirkungen auf aktive Mittel, wie andere Vitamine, Proteine, antimikrobielle Mittel, Präbiotika, Probiotika und Enzyme haben; und es ist auch bekannt, dass einige Futterherstellungsverfahren den aktiven Mitteln schaden.
In der Industrie besteht das Problem, Schutzformulierungen bereitzustellen, die die aktiven Mittel für die Lagerung in unpelletierten Tierfuttermischungen, wie Basismischungen und Vormischungen, die sauer oder basisch sein können und die Bestandteile enthalten, die eine negative Auswirkung auf die Stabilisierung der aktiven Mittel aufweisen, geeignet machen. Als ein Mechanismus für negative Auswirkungen werden Oxidations-Reduktions-(Redox)-Reaktionen genannt, die zwischen oxidierenden und reduzierenden Verbindungen in den Vormischungen in Anwesenheit von Wasser auftreten. Eine Studie, die in BASF Technical Bulletin NU0013 veröffentlicht ist, berichtet, dass zwei kommerziell erhältliche Enzyme, die Granulate enthalten, 86% bzw. 81% Aktivität nach dreiwöchiger Lagerung in einer Futtervormischung und 55% bzw. 33% Aktivität nach sechswöchiger Lagerung in der Futtervormischung behalten. Derzeit empfehlen einige Hersteller von Enzymen für die Futterindustrie, dass Enzyme mit einer Schutzverpackung geschützt werden, wenn sie in Vormischungen aufbewahrt werden, oder dass sie getrennt von den Vormischungen aufbewahrt werden oder dass sie in Vormischungen nur für einen kurzen Zeitraum aufbewahrt werden.
Zusätzlich sind viele aktive Mittel, die im Essen und im Futter verwendet werden, hitzelabil. Die thermische Stabilität der Enzyme und ihre Fähigkeit, Wärmeverarbeitungsschritte bei der Herstellung von Tierfutter zu überstehen, ist ein Problem in der Industrie, insbesondere bei der Herstellung von Tierfutterpellets. Im Vergleich zu Trockenfuttermischungen weisen Futterpellets Eigenschaften auf, die von der Industrie favorisiert werden, wie z. B. eine verbesserte Futterqualität, weniger Pathogene, geringere Staubkonzentrationen während der Herstellung, gute Handhabbarkeit und eine gleichförmigere Dosierung der Bestandteile. Bevorzugte Pelletierverfahren in der Industrie verwenden eine Dampfinjektion in einem Verfahren, welches als Konditionierung bekannt ist; diese führt Feuchtigkeit zu und erhöht die Temperatur vor dem Pelletierschritt, bei dem anschließend die dampfbeheizten Futterbestandteile oder die konditionierte Maische durch eine Düse gepresst werden. Die Temperaturen des Pelletierverfahrens können von etwa 70°C bis 95°C oder höher reichen.
Enzyme sind wichtige Futterbestandteile und müssen in der Lage sein, zunehmend höhere Verarbeitungstemperaturen, die bei Pelletierverfahren verwendet werden, insbesondere bei Verfahren, die Expandierungsmittel verwenden, auszuhalten, während die In-Vivo-Wirksamkeit weiterhin gewährleistet wird.
Aufgrund des Dampfes, der Temperaturen und der Kompressionskräfte, die in Pelletierverfahren verwendet werden, ist die Stabilität von Enzymen und anderen aktiven Mitteln ein Problem, was durch die Tatsache veranschaulicht wird, dass Futterenzyme in der Industrie oft als stabilisierte flüssige Produkte bereitgestellt werden, welche nach dem Pelletierverfahren zu Futterpellets zugegeben werden, um eine Enzyminaktivierung zu vermeiden. Die homogene Dosierung ist ein Problem, wenn das Enzym nach der Pelletierung aufgetragen wird, beispielsweise durch Aufsprühen des Enzyms auf die Pellets und die Kosten der Apparaturen, um ein Enzym nach der Pelletierung zuzugeben, sind hoch. Alternativ werden flüssige Enzymformulierungen oder Enzymtrockenmischformulierungen zu dem Mischer vor dem Pelletieren zugegeben. Unter bestimmten Umständen können höhere Enzymkonzentrationen als notwendig zugegeben werden, um den Verlust während des Pelletiervorgangs auszugleichen.
Tablettierverfahren verwenden ebenfalls Kompressionskräfte und können, müssen aber nicht Wärme verwenden. Tabletten werden in der Haushaltspflegemittelindustrie verwendet, beispielsweise bei Wäsche-, Geschirr- und Oberflächenreinigungsanwendungen.
In der Ernährungs-, Futter- und Haushaltspflegeindustrie besteht ein Bedarf an stabilen, haltbaren Granulaten mit Wirkstoffen, die als Komponenten in Formulierungen dienen, die einer Dampfbehandlung, beispielsweise Pelletier- und Tablettierverfahren, unterzogen werden, ohne einen merklichen Verlust der Aktivität des Wirkstoffs zu zeigen, und die Auflösungsprofile aufweisen, die geeignet sind, die Wirkstoffe so freizusetzen, dass eine Wirksamkeit für deren beabsichtigten Zweck bereitgestellt wird. Es besteht auch ein Bedarf an stabilen, haltbaren Granulaten mit aktiven Mitteln, die ihre Aktivität beibehalten, wenn sie als Bestandteile in Tierfutterformulierungen verwendet werden, wie z. B. in unpelletierten Mischungen, die Bestandteile enthalten, die einen negativen Einfluss auf die aktiven Mittel ausüben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Granulate für Futterzusammensetzungen, umfassend: einen Kern; ein aktives Mittel; und wenigstens eine Beschichtung, wobei das aktive Mittel des Granulats wenigstens 50% Aktivität, wenigstens 60% Aktivität, wenigstens 70% Aktivität, wenigstens 80% Aktivität nach Bedingungen behält, die ausgewählt werden aus einem oder mehreren von a) einem Futter-Pelletierverfahren, b) einem Futtervorbehandlungsverfahren mit heißem Dampf, c) Lagerung, d) Lagerung als ein Bestandteil in einer unpelletierten Mischung, e) Lagerung als ein Bestandteil in einer Futterbasismischung oder einer Futtervormischung, umfassend wenigstens eine Verbindung, ausgewählt aus Spurenmineralien, organischen Säuren, reduzierenden Zuckern, Vitaminen, Cholinchlorid und Verbindungen, die zu einer sauren oder einer basischen Futterbasismischung oder Futtervormischung führen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Granulat für Tierfutter bereitgestellt, umfassend: einen Kern; ein aktives Mittel, wobei das aktive Mittel des Granulats wenigstens 80% Aktivität nach der Lagerung und nach einem Pelletierverfahren mit heißem Dampf bei dem das Granulat ein Bestandteil ist, behält; eine Feuchtigkeitssperrbeschichtung und eine feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung, die wenigstens 25 Gew.-% des Granulats ausmacht, wobei das Granulat eine Wasseraktivität von weniger als 0,5 vor dem Pelletierverfahren mit heißem Dampf aufweist.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Tierfutterbestandteil bereitgestellt, umfassend: ein Granulat, umfassend einen Kern; ein aktives Mittel, das den Kern umgibt, und wenigstens eine Beschichtung, die das aktive Mittel umgibt, wobei das aktive Mittel wenigstens 50% Aktivität, wenigstens 60% Aktivität, wenigstens 70% Aktivität, wenigstens 80% Aktivität nach Bedingungen behält, die ausgewählt werden aus einem oder mehreren von a) einem Futterpelletierverfahren, b) einem Futtervorbehandlungsverfahren mit heißem Dampf, c) Lagerung, d) Lagerung als ein Bestandteil in einer unpelletierten Mischung und e) Lagerung als ein Bestandteil in einer Futterbasismischung oder einer Futtervermischung, enthaltend wenigstens eine Verbindung, ausgewählt aus Spurenmineralien, organischen Säuren, reduzierenden Zuckern, Vitaminen, Cholinchlorid und Verbindungen, die zu einer sauren oder basischen Futterbasismischung oder Futtervermischung führen.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Granulats mit einem aktives Mittel für das Futter umfasst das Verfahren: Herstellen von stabilen Granulaten mit einem Kern, wenigstens einem aktiven Mittel und wenigstens einer Beschichtung; Mischen der stabilen Granulate zusammen mit einem oder mehreren aus a) einem Streckmittel, b) einer Basismischung, c) einer Vormischung und d) einer Futtermischung zum Pelletieren.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Granulats, das ein Enzym für die Lagerung in einer Cholinchlorid enthaltenden Futtervormischung enthält, bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen eines Kernmaterials und Enzyms, wobei das Enzym innerhalb des Kernmaterials verteilt oder über das Kernmaterial geschichtet ist; Aufbringen eines feuchtigkeitshydratisierenden Materials auf das Kernmaterial und Enzym, um eine Schicht zu bilden, die wenigstens 25 Gew.-% des stabilen Granulats ausmacht; Beschichten der Schicht mit einem Feuchtigkeitssperrmaterial, um eine Beschichtung zu bilden, die wenigstens 2 Gew.-% des Granulats ausmacht, wobei das Aufbringen und das Beschichten unter Bedingungen stattfindet, die derart ausgewählt sind, dass eine Wasseraktivität des stabilen Granulats weniger als 0,5 beträgt.
Stabile, haltbare Granulate der oben angegebenen Ausführungsformen behalten wenigstens 50%, wenigstens 60%, wenigstens 70%, wenigstens 80%, wenigstens 90% und wenigstens 95% Aktivität des aktiven Mittels unter Bedingungen von Pelletierungs- oder Vorbehandlungsverfahren mit heißem Dampf, die die Temperatur des pelletierten Materials bis zu ein paar Minuten lang auf so hohe Temperaturen wie 85°C bis etwa 95°C erhöhen. Die stabilen, haltbaren Granulate der vorliegenden Erfindung sind insbesondere als Bestandteile in Tierfutterpellets und als Bestandteile in Haushaltspflegetabletten geeignet.
In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen stabile, haltbare Granulate ein feuchtigkeitshydratisierendes Material ein, welches wenigstens etwa 55 Gew.-% des Granulats bildet.
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weist ein stabiles, haltbares Granulat eine feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung auf, die wenigstens etwa 25 Gew.-%, etwa 30 Gew.-%, etwa 35 Gew.-%, etwa 40 Gew.-%, etwa 50 Gew.-%, etwa 55 Gew.-% und etwa 60 Gew.-% des Granulats umfasst, und eine Feuchtigkeitssperrbeschichtung, die wenigstens etwa 2 Gew.-% bis etwa 40 Gew.-%, etwa 2 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%, etwa 2 Gew.-% bis etwa 7 Gew.-% und etwa 5 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-% des Granulats umfasst.
In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließt ein stabiles, haltbares Granulat drei Schutzbeschichtungen ein, wobei eine Beschichtung etwa 20 Gew.-% bis 25 Gew.-% des Granulats ein feuchtigkeitshydratisierendes Material umfasst, und die beiden anderen Beschichtungen etwa 5 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-% des Granulats ein Feuchtigkeitssperrmaterial umfassen. In dieser Ausführungsform wird ein Wärmeschmelzverarbeitungsschritt verwendet, um das Feuchtigkeitssperrmaterial zu anzuschmelzen.
In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst ein stabiles, haltbares Granulat einen Silikat- oder Tonkern und ein inhärent thermisch stabiles, aktives Mittel in einer Matrix; gegebenenfalls eine feuchtigkeitshydratisierende Schutzbeschichtung aus anorganischem Salz und gegebenenfalls eine Feuchtigkeitssperrbeschichtung. In dieser Ausführungsform bilden die optionalen Beschichtungsschichten etwa 0 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-% des Granulats.
Die vorliegende Erfindung schließt ferner Verfahren zur Herstellung von stabilen, haltbaren Granulaten sowie Futterpellets, Tierfutter- und Haushaltspflege- und Ernährungstabletten, die solche stabilen, haltbaren Granulate enthalten, ein.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt stabile, haltbare Granulate mit aktiven Mitteln bereit, die sowohl hohen Temperaturen als auch Kompressionskräften standhalten, wenn sie zu Formulierungen zugegeben werden, die beispielsweise Wärmedampfvorbehandlungen, Futterpelletierverfahren und Tablettierverfahren unterzogen werden, während Auflösungsprofile beibehalten werden, die geeignet sind aktive Mittel freizusetzen, die in der Lage sind, Wirksamkeit für ihren beabsichtigten Zweck bereitzustellen.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt überraschenderweise stabile, haltbare Granulate mit Futterwirkstoffen bereit, die Dampfvorbehandlungsverfahren und Futterpelletier-Dampfbehandlungstemperaturen und Kompressionskräften standhalten, während sie Auflösungsprofile behalten, die die aktiven Futtermittel freisetzen, um so die beabsichtigte Wirksamkeit bereitzustellen. In dieser Ausführungsform sind die Granulatkomponenten vorzugsweise für die Verwendung in Futter zugelassen.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt stabile, haltbare Granulate mit Enzymen bereit, die Dampf-Futtervorbehandlungs- und Pelletierverfahrenstemperaturen und Kompressionskräften standhalten, während die Auflösungsprofile beibehalten, die das Enzym freisetzen, um eine In-Vivo-Bioverfügbarkeit und Wirksamkeit bereitzustellen. In dieser Ausführungsform sind die Granulatkomponenten für Tiere zum Verzehr geeignet und vorzugsweise sind sie auch verdaulich.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt stabile, haltbare Granulate mit aktiven Mitteln für unpelletierte Tierfuttermischungen, beispielsweise Vormischungen, bereit. Die stabilen, haltbaren Granulate behalten ihre Wirksamkeit, wenn die unpelletierte Mischung vor dem Verfüttern an Tiere wärme- und dampfbehandelt wird oder nachdem die unpelletierte Mischung pelletiert wird. In diesem Aspekt der Erfindung behalten überraschenderweise die aktiven Mittel ihre Aktivität, wenn sie in unpelletierten Mischungen gelagert werden, die Bestandteile enthalten, die für die Enzymstabilität schädlich sind. In diesem Aspekt der Erfindung wird angenommen, ohne an irgendeine besondere Theorie gebunden zu sein, dass ein feuchtigkeitshydratisierendes Material in den Granulaten in Kombination mit einem Feuchtigkeitssperrmaterial in Granulaten zusammenwirkt, um den aktiven Bestandteil vor den schädlichen Bestandteilen in den unpelletierten Mischungen zu schützen. Das feuchtigkeitshydratisierende Material verzögert oder vermindert die Rate oder das Ausmaß der Wassermigration in den Bereich des aktiven Mittels, und das Feuchtigkeitssperrmaterial schließt Wasser aus. Die Kombination des feuchtigkeitshydratisierenden Materials und des Feuchtigkeitssperrmaterials stellt eine mechanische Stabilität bereit, um weiter das aktive Mittel in dem Fall zu schützen, dass eine Schicht aus einem Feuchtigkeitssperrmaterial beschädigt wird. Zusätzlich werden in manchen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Feuchtigkeitssperrmaterialien verwendet, die nur unter extremen Bedingungen oxidieren, wodurch in Kombination mit feuchtigkeitshydratisierenden Materialien die Granulate chemisch stabil sind, da angenommen wird, dass Redoxreaktionen während der Lagerung der Granulate in unpelletierten Materialien vermindert werden.
Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt stabile, haltbare Granulate mit aktiven Mitteln bereit, die Tablettierverfahren standhalten, während Auflösungsprofile aufrechterhalten werden, die das aktive Mittel freisetzen, um eine Wirksamkeit bei Haushaltspflegeanwendungen, wie bei Wasch-, Geschirr- und Oberflächenreinigungsanwendungen, bereitzustellen. In dieser Ausführungsform können Granulatkomponenten auch Materialien einschließen, die nicht von Tieren verdaut werden können, beispielsweise Tenside, Zeolithe, Bleichmaterialien und Farbmittel.
Die stabilen, haltbaren Granulate der vorliegenden Erfindung sind sphärische oder nahezu sphärische Granulate, obwohl andere Formen, wie Scheiben, ovale, zylindrische und rechteckige Formen, falls erwünscht, verwendet werden können. Die Granulate weisen ein oder mehrere Schutzschichten auf, die das aktive Mittel umgeben.
Die Granulate können vor der Verwendung in einem Pelletierungs- oder Tablettierungsverfahren zusammen mit Trockenbestandteilen, wie Futter oder Haushaltspflegeformulierungen oder unpelletierten Futtermischungen, beispielsweise Prä-Mix-Formulierungen, vermischt werden, oder sie können in Trockenfuttermischungen und Mischfuttern, die unpelletiert sind, verwendet werden. Die Granulate sind insbesondere für die Verwendung bei in Futterpelletierungsverfahren geeignet; sie sind auch für Lebensmittel-, einschließlich Tiernahrung-, und Haushaltspflegetabletten-Herstellungsverfahren geeignet.
Sofern nicht anderweitig definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die Bedeutung, wie sie gewöhnlich von dem Fachmann, an den sich diese Erfindung richtet, verstanden wird. In der Beschreibung und in den Ansprüchen schließt der Singular „ein”, „eine” und „der” auch den Plural ein, es sei denn, der Kontext diktiert deutlich etwas anderes. Beispielsweise kann der Begriff Granulat eine Vielzahl von Granulaten einschließen.
Zum Zwecke dieser Offenbarung kann das „aktive Mittel” (Wirkstoff) irgendein Material sein, welches zu einem stabilen, haltbaren Granulat zugegeben wird. Das aktive Mittel kann ein biologisches lebendes Material sein, ein Lebensmittel- oder Futterbestandteil, ein antimikrobielles Mittel, ein antibiotisches Ersatzmittel, ein präbiotisches, ein probiotisches, ein agrochemisches Mittel, wie ein Pestizid, Dünger oder Herbizid, ein pharmazeutischer Bestandteil oder ein Wirkstoff für die Haushaltspflege oder Kombinationen davon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der aktive Bestandteil ein Protein, Enzym, Peptid, Polypeptid, Aminosäure, Kohlenhydrat, Lipid oder Öl, Vitamin, Co-Vitamin oder Hormon oder Kombinationen davon. In einer anderen Ausführungsform ist der aktive Bestandteil ein Enzym, Bleichstoff, Bleichaktivator, Parfüm oder ein anderer biologisch aktiver Bestandteil. Inhärent thermostabile, aktive Mittel sind durch die vorliegende Erfindung umfasst und zeigen in den Granulaten der vorliegenden Erfindung eine erhöhte Thermostabilität. Alternativ können weniger Beschichtungsmaterialien verwendet werden, wenn Granulate mit inhärent thermostabilen, aktiven Mitteln bereitgestellt werden, und die Mengen des Schutzbeschichtungsmaterials, die hierin bereitgestellt werden, werden in erster Linie für aktive Mittel, welche nicht inhärent thermostabil sind, ausgewählt.
Aktive Bestandteile für Lebensmittel- und Futteranwendungen, die am stärksten bevorzugt sind, sind Enzyme, Peptide und Polypeptide, Aminosäuren, anti-mikrobielle Mittel, Mittel zur Gesundheitsförderung, Vitamine und Kombinationen davon.
Jedes beliebige Enzym kann verwendet werden und eine nicht beschränkende Liste an Enzymen schließt Phytasen, Xylanasen, β-Glucanasen, Phosphatasen, Proteasen, Amylasen (Alpha- oder Beta- oder Glukoamylasen), Zellulasen, Lipasen, Cutinasen, Oxidasen, Transferasen, Reduktasen, Hemizellulasen, Mannanasen, Esterasen, Isomerasen, Pektinasen, Laktasen, Peroxidasen, Lakkasen, andere Redoxenzyme und Mischungen davon ein.
Besonders bevorzugte Enzyme schließen eine Xylanase von Trichoderma reesei und eine Xylanase-Variante von Trichoderma reesei ein, beide erhältlich von Danisco A/S, Dänemark und/oder Genencor International, Inc., Palo Alto, Kalifornien, oder die inhärent thermostabile Xylanase, die in EP1222256B1 beschrieben ist, wie auch andere Xylanasen von Aspergillus niger, Aspergillus kawachii, Aspergillus tubigensis, Bacillus circulans, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Neocallimastix patriciarum, Penicillin-Arten, Streptomyces lividans, Streptomyces thermoviolaceus, Thermomonospora fusca, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride; Beispiele von Phytasen sind Finase L^®, eine Phytase von Aspergillus sp., erhältlich von AB Enzymes, Darmstadt, Deutschland; Phyzyme^TM XP, eine Phytase von E. Coli, erhältlich von Danisco, Kopenhagen, Dänemark, und andere Phytasen von beispielsweise den folgenden Species: Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Buttiauxella, Citrobacter, Enterobacter, Penicillium, Humicola, Bacillus und Peniophora.
Ein Beispiel einer Zellulase ist Multifect^® BGL, eine Zellulase (BetaGlucanase), erhältlich von Danisco A/S, Dänemark, und andere Zellulasen von Species, wie Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Humicola, Bacillus, Cellulomonas, Penicillium, Thermomonospore, Clostridium und Hypocrea. Die Zellulasen und EndoGlucanasen, die in US20060193897A1 beschrieben sind, können auch verwendet werden. Amylasen können beispielsweise von Arten, wie Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Bacillus, B. subtilis, B. stearothermophilus, B. lentus, B. licheniformis, B. coagulans und B. amyloliquefaciens sein. Geeignete fungale Amylasen sind von Aspergillus, wie zum Beispiel A. oryzae und A. niger, abgeleitet. Proteasen können von Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis und Aspergillus und Trichoderma-Arten sein.
Phytasen, Xylanasen, Phosphatasen, Proteasen, Amylasen, Esterasen, Redoxenzyme, Lipasen, Transferasen, Zellulasen und β-Glucanasen sind Enzyme, die häufig für die Aufnahme bei Tierfutter verwendet werden. Enzyme, die für den Einschluss in Tabletten für Haushaltspflegeanwendungen geeignet sind, sind gleichermaßen insbesondere Proteasen, Amylasen, Lipasen, Hemizellulasen, Redoxenzyme, Peroxidasen, Transferasen und Zellulasen.
In besonders bevorzugten Aspekten der Erfindung werden die Enzyme von Phytasen, Xylanasen, Beta-Glucanasen, Amylasen, Proteasen, Lipasen, Esterasen und Mischungen davon ausgewählt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zwei Enzyme in dem Granulat bereitgestellt, eine Xylanase und eine Beta-Glucanase. Die Enzyme können zusammen vermischt werden oder getrennt auf das Granulat aufgetragen werden. In einer anderen Ausführungsform werden drei Enzyme in dem Granulat bereitgestellt, nämlich Beta-Glucanase, Xylanase und Phytase.
Die oben angegebenen Enzymlisten sind nur Beispiele und sind nicht abschließend zu verstehen. Jedes beliebige Enzym kann in den haltbaren Granulaten der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich der Wildtyp, rekombinante und verschiedene Enzyme von bakteriellen, fungalen, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und Tierquellen, und saure, neutrale oder alkalische Enzyme.
Dem Fachmann ist es klar, dass die Enzymmenge, die verwendet wird, von wenigstens teilweise dem Typ und der Eigenschaft des ausgewählten Enzyms und dem beabsichtigen Zweck abhängen wird.
Die haltbaren Granulate der Erfindung schließen zwischen etwa 0,0005 bis etwa 20% auf Trockengewichtsbasis der Enzymkomponente des Granulats ein. Beispielsweise umfassen Gewichtsprozente von Enzymen in Ausführungsformen der Erfindung wenigstens 0,0005 bis etwa 15%, wenigstens 0,001 bis etwa 15%, wenigstens 0,01 bis etwa 10%, wenigstens 0,1 bis etwa 10%, wenigstens 1,0 bis etwa 10%, wenigstens 1,0 bis etwa 8%, wenigstens 1,0 bis etwa 5% und wenigstens etwa 2,0 bis wenigstens 5% in dem Granulat. Typische Dosierungen von 25 bis 400 Gramm der stabilen, haltbaren Enzymgranulate pro Tonne Futter werden etwa 0,0001 bis etwa 80 Gramm von aktiven Enzymproteinen pro Tonne Futter abgeben, und die Enzymgranulate können so hoch wie 5.000 Gramm pro Tonne Futter dosiert werden. Dosierungen für andere aktive Bestandteile sind typischerweise 0,001 bis etwa 400 Gramm/Tonne Futter oder höher. Dosierungen können auch höher sein, wenn die thermostabilen Granulate der vorliegenden Erfindung als eine Komponente von unpelletierten Tierfuttermischungen verwendet werden, beispielsweise Vormischungen, die zahlreiche aktive Mittel enthalten können und zu den Futterzusammensetzungen zugegeben werden. Beispielsweise kann die Dosierung der Enzymgranulate zu einer Vormischung etwa 0,2% bis 10% der Vormischung oder etwa 0,1% bis etwa 3% der Grundmischung betragen. In einer beispielhaften Ausführungsform, die stabile, haltbare Granulate enthält, beträgt der Aktivitätslevel von Phytase, gelagert in einer Vormischung, etwa 500 U/g oder höher. Vormischungen werden typischerweise zu etwa 0,5% bis etwa 2% und Grundmischungen werden zu etwa 2% bis etwa 6% dem Futter zugegeben.
Der Anteil des haltbaren Granulats, ohne Schutzbeschichtung(en) der Erfindung, und umfassend den aktiven Bestandteil, einschließlich etwaiger der Verarbeitung dienender Feststoffe, Bindemittel und andere Bestandteile darin, kann weniger als etwa 70 Gew.-%, weniger als etwa 60 Gew.-%, weniger als etwa 50 Gew.-%, weniger als etwa 40 Gew.-%, weniger als etwa 30 Gew.-% und weniger als etwa 20 Gewichtsprozent des Granulats umfassen, wobei im Allgemeinen die Gewichtsprozente im Bereich von 25 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-%, etwa 40 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-% oder etwa 50 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-% liegen.
Die Beschichtungsschicht(en) kann/können mehr als etwa 30 Gew.-%, mehr als etwa 40 Gew.-%, mehr als etwa 50 Gew.-%, mehr als etwa 60 Gew.-%, mehr als etwa 70 Gew.-% und mehr als etwa 80 Gew.-% des Granulats umfassen, mit, im Allgemeinen, Gewichtsprozenten im Bereich von etwa 50 Gew.-% bis etwa 75 Gew.-%, 40 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-% oder etwa 40 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-%, in Abhängigkeit von der Art und der Anzahl der Beschichtungsschichten.
Für Ausführungsformen, die ein inhärent thermostabiles, aktives Mittel verwenden, kann der Kern so viel wie etwa 85 bis etwa 100 Gew.-% des Granulats bilden und die Beschichtung kann etwa 0 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-% des Granulats bilden.
Die haltbaren Granulate der vorliegenden Erfindung können, falls gewünscht, in ihrer Größe eingestellt werden und haben Durchmesser zwischen etwa 300 μm bis etwa 1.000 μm, etwa 300 μm bis etwa 900 μm, etwa 400 μm bis etwa 800 μm und etwa 400 μm bis etwa 600 μm.
„Kompressionskräfte” zum Zwecke dieser Offenbarung beziehen sich im Allgemeinen auf axial angewandte Kräfte, die bewirken, dass sich die Atome eines Materials verdichten. Kompressionskräfte, wie hierin verwendet, treten bei Pelletier- und Tablettierverfahren auf und können ein Element von Biegespannung einschließen, wenn die angewandten Kräfte in Bezug auf die Längsachse des Materials nicht vollständig symmetrisch sind.
Ein „inhärent thermostabiles Enzym oder Protein” bezeichnet Enzyme und Proteine mit einem Schmelzpunkt, der oberhalb von etwa 60°C bis etwa 65°C liegt, beispielsweise weist das inhärent thermostabile Enzym, das in Tabelle 2 für Granulate 28, 29 und 30 verwendet wird, einen Schmelzpunkt von 69°C bei einem pH-Wert von 5,5 und einen Schmelzpunkt von 72°C bei einem pH-Wert von 8,0 auf. Eine Anzahl der thermolabilen Enzyme, auf die sich die Beschreibung bezieht, hatte beispielsweise einen Schmelzpunkt von weniger als 60°C bei pH-Werten von 5,5 und 8,0.
„Feuchtigkeitssperrmaterialien” bezeichnen Materialien, die die Wasseraufnahme ausschließen, verhindern oder im Wesentlichen verzögern. Diese Materialien sind typischerweise hydrophob oder amphiphil, stellen eine Isolierung gegen Wasser bereit und absorbieren und/oder binden Wasser nicht inhärent; sie schließen filmbildende Materialien ein, sind aber darauf nicht beschränkt. Beispiele von Feuchtigkeitssperrmaterialien schließen Polymere, Proteine, Lipide, Fette und Öle, Fettsäuren und Gummen ein. Beispiele von filmbildenden Feuchtigkeitssperrmaterialen sind natürliche und modifizierte Polymere, wie Gummiarabikum, Molke, Molkeproteinkonzentrat, PVA, einschließlich modifiziertem PVA, und synthetische Polymere, wie Latex, HPMC und säureverdünnte Hydroxypropylstärke, beispielsweise PureCote^TM, oxidierte Stärke und modifizierte Stärke. Nicht-filmbildende Feuchtigkeitssperrmaterialien schließen beispielsweise Wachse, Fette, Öle und Lipide und Lecithin ein. Ausgewählte Feuchtigkeitssperrmaterialien, die nicht leicht oxidieren, sind beispielsweise Latexpolymer und Polymere, wie Gummiarabikum.
„Feuchtigkeitshydratisierende Materialien” bezeichnen Materialien, die wässrige Flüssigkeiten, wie Wasser, durch einen oder mehrere Mechanismen aufnehmen. In einem ersten Mechanismus absorbiert das Material freies Wasser. In einem zweiten Mechanismus nimmt das Material gebundenes Wasser auf, welches im Allgemeinen als kristallines Hydratationswasser vorhanden ist. Dementsprechend können die Materialien als teilweise oder vollständig hydratisierte Materialien oder als nicht-hydratisierte Materialien bereitgestellt werden, die wässrige Flüssigkeiten absorbieren oder binden werden und die Geschwindigkeit oder das Ausmaß der Migration solcher Flüssigkeiten zum aktiven Mittel verzögern oder vermindern. In einem dritten Mechanismus isolieren feuchtigkeitshydratisierende Materialien das aktive Mittel thermisch durch Verzögerung des Wärmeübergangs an das aktive Mittel innerhalb des Granulats und dadurch, dass sie das aktive Mittel bei einer niedrigeren Temperatur halten als die Temperatur auf der äußeren Oberfläche des Granulats. Feuchtigkeitshydratisierende Materialien schließen Kohlenhydrate und anorganische Salze, einschließlich hydratisierte Salze, wie Magnesiumsulfat, Natriumsulfat und Ammoniumsulfat, Maltodextrin, Zucker, beispielsweise Sucrose, und Maisstärke ein.
In beispielhaften Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die feuchtigkeitshydratisierenden Materialien anorganische Salze, die, wenn sie zu dem Granulat in einer Menge von mehr als etwa 25 Gew.-% zugegeben werden, wasserfrei sind oder relativ geringe Mengen an gebundenem oder freiem Wasser derart enthalten, dass die Wasseraktivität des vervollständigten Granulats weniger als 0,5 beträgt. Ohne an irgendeine besondere Theorie gebunden zu sein, wird, wenn das Granulat einem Dampferwärmungsverfahren unterzogen wird, das feuchtigkeitshydratisierende Material, das ein anorganisches Salz ist, mit der Aufnahme von Wasser von der Dampfbehandlung beginnen, wobei das Wasser in das feuchtigkeitshydratisierende Material in einem kinetischen Prozess über eine kurze Zeitperiode der Dampfbehandlung wandert, um das Wasser vom Penetrieren in den Bereich des Granulats, der das aktive Mittel enthält, abzuhalten. In Ausführungsformen mit einer Wasseraktivität des Granulats von weniger als 0,5 kann das feuchtigkeitshydratisierende Material so wenig wie 25 Gew.-% des Granulats bilden. In Ausführungsformen mit feuchtigkeitshydratisierendem Material, die etwa 40–70% des Granulats bilden, ermöglicht die dickere Schicht des feuchtigkeitshydratisierenden Materials die Verwendung von hydratisierten oder teilweise hydratisierten Materialien, insbesondere anorganischen Salzen. Zum Zwecke dieser Offenbarung bezieht sich „hydratisiert”, „teilweise hydratisiert” und „nicht hydratisiert” auf das Hydratisierungspotential des Materials, wenn sich das Granulat vor der Dampfbeheizung im Gleichgewicht befindet. Ein „hydratisiertes” Material bezeichnet ein Material, das Wasser in einer freien oder gebundenen Form enthält, oder eine Kombination davon. Wasser kann entweder während oder nach dem Beschichtungsverfahren zugegeben werden und das Ausmaß der Hydratation des Granulats ist eine Funktion des Granulatmaterials und der Temperatur, Feuchtigkeit und der Trocknungsbedingungen, unter der es aufgebracht wird.
„Pellets” und „Pelletieren” bezeichnen feste abgerundete, sphärische und zylindrische Tabletten oder Pellets und auf Verfahren zur Bildung solcher festen Formen, insbesondere Futterpellets und feste, extrudierte Tierfutter. Bekannte Futterpelletier-Herstellungsverfahren schließen im Allgemeinen das Zusammenmischen von Futterbestandteilen für etwa 1 bis etwa 5 Minuten, Überführen der Mischung zu einem Auffangbehälter, Befördern der Mischung zu einem Dampfkonditionierer, gegebenenfalls Überführung der dampfkonditionierten Mischung zu einen Expander, Überführen der Mischung an die Pelletmühle oder Extruder und schließlich Transferieren der Pellets in einen Pelletkühler ein. Fairfield, D. 1994, Kapitel 10, Pelleting Cost Center. In Feed Manufacturing Technology IV. (McEllhiney, Herausgeber), American Feed Industry Association, Arlington, VA, Seiten 110–139.
Der Dampfkonditionierer behandelt die Mischung etwa 20 bis etwa 90 Sekunden und bis zu einigen Minuten bei etwa 85°C bis etwa 95°C. Die Menge an Dampf kann gemäß der Menge an Feuchtigkeit und der Anfangstemperatur der Futtermischung variieren. Etwa 4% bis etwa 6% zugegebener Dampf wurde bei Pelletierverfahren verwendet, und die Menge wird ausgewählt, um weniger als etwa 18% Feuchtigkeit in der Maische vor dem Pelletieren oder bis zu etwa 28% Feuchtigkeit in der Maische, die für die Extrusion vorgesehen ist, bereitzustellen.
Ein optionaler Entspannungsprozess tritt etwa 4 bis etwa 10 Sekunden in einem Temperaturbereich von etwa 100°C bis etwa 140°C auf. Der Pelletmühlen-Abschnitt des Herstellungsverfahrens ist typischerweise etwa 3 bis etwa 5 Sekunden bei einer Temperatur von etwa 85°C bis etwa 95°C in Betrieb.
Ein „stabiles” Granulat bezeichnet ein Granulat, bei dem die Aktivität der/des aktiven Mittel(s) nach seinem Einschluss als Bestandteil in einer Formulierung, die einem Dampf-Vorbehandlungsverfahren, einem Dampf-Pelletierverfahren, einem Dampf-Tablettierverfahren unterzogen wird, nach der Lagerung alleine bzw. nach der Lagerung als Bestandteil in unpelletierten und nicht tablettierten Mischungen im Wesentlichen erhalten bleibt. Die Stabilität schließt die Thermostabilität, die Haltbarkeitsdauer oder die Lagerungsstabilität, mechanische Stabilität und/oder chemische Stabilität, wenn die wirkstoffhaltigen Granulate in unpelletierten oder nicht tablettierten Mischungen gelagert werden und/oder einem Dampfbeheizungs- und Pelletierverfahren und Tablettierverfahren unter Druck unterzogen werden, ein. Mechanische Stabilität bezeichnet die physikalische Robustheit oder die strukturelle Integrität der Granulate, wobei die strukturelle Integrität eine Resistenz gegenüber Mikroben, eine Resistenz gegenüber Staubproduktion und eine Resistenz gegenüber der Freisetzung von Bestandteilen einschließt, die zu Geruchsbildung führen können. Chemische Stabilität bezeichnet die im wesentlichen Erhaltung der Aktivität, wenn die Granulate in unpelletierten oder nicht tablettierten Mischungen mit Bestandteil(en), die für das aktive Mittel schädlich sind, gelagert werden. Die Thermostabilität wird hierin näher definiert und bezeichnet im Allgemeinen auf den Erhalt der Aktivität nach Exposition an Temperaturen bis zu etwa 85°C bis 95°C, wenn die stabilen, haltbaren Granulate ein Bestandteil von Pellets, Tabletten und unpelletierten und nicht tablettierten Mischungen sind.
„Tablettieren” bezeichnet Verfahren zur Bildung von festen Rohlingen oder Tabletten durch Komprimieren einer Mischung von Bestandteilen in einer Tablettenpresse, wie es in EP 1 257 631 B1 beschrieben ist, die in diese Anmeldung durch Bezugnahme miteingeschlossen wird.
Tabletten können durch Direktverpressung von Mischungen von aktiven Mitteln, Füllstoffen/Bindemitteln, Gleitmitteln und irgendwelchen anderen optionalen Bestandteilen hergestellt werden. Die Wirkstoffkomponente wird mit den anderen Tablettenbestandteilen gründlich gemischt, bevor sie in die Tablettiermaschine kommt. Die Bestandteile werden in irgendeiner geeigneten Mischvorrichtung, wie einem Zweischalenmischer oder einer ähnlichen Vorrichtung oder unter Verwendung von irgendeinem Mischverfahren, das zur Mischung der Tablettenbestandteile führt, vermischt.
Die Mischungen werden anschließend unter Verwendung einer Tablettiermaschine, wie z. B. einer Tablettenpresse (Stokes Model R-4, Warminster, PA) zu Tabletten gepresst. Tablettenpressen weisen im Allgemeinen obere und untere formkorrespondierende Stempel auf, die in eine Form oberhalb und unterhalb der Passform passen. Das vermischte Tablettenmaterial wird in den Stempelhohlraum eingeführt und wenigstens einer der Stempel, typischerweise der obere Stempel, tritt in den Stempelhohlraum ein. Es wird Druck sowohl auf die oberen als auch die unteren Stempel angelegt. Die Wirkung der oberen und unteren Stempel, die sich direkt aufeinander zu zu bewegen, erzeugt Druck auf das Material zwischen den beiden Stempeln, wodurch eine Tablette gebildet wird.
Eine große Vielzahl an Tablettenformen kann hergestellt werden. Die Tablettenform wird durch das Werkzeug der Stempel bestimmt. Verdichtungskräfte können in Abhängigkeit von der Stempelgeometrie, den Instrumententypen und der verwendeten Formulierung variieren. Alternativ können Tabletten unter Verwendung von Trocken- oder Nassgranulationsverfahren, wie in US-Patent Nr. 6,852,336 beschrieben wird, was hierin durch Bezugnahme in seiner Gänze eingeschlossen wird, hergestellt werden. Das '336-Patent legt dar, dass Trockengranulationsverfahren verwendet werden können, wenn eine der Komponenten ausreichend kohäsive Eigenschaften hat, um tablettiert werden zu können. Das Verfahren mischt die Bestandteile, falls erforderlich, mit einem Schmiermittel. Das beschriebene Nassgranulationsverfahren, mischt den Trockenbestandteil unter Verwendung einer Zweischalenmischvorrichtung oder Zweikegelmischvorrichtung unter Scher-Mischbedingungen und gibt anschließend den gemischten Pulvern Lösungen eines Bindemittels zu, um eine Granulierung zu erreichen.
Ein „thermostabiles” Granulat bezeichnet ein Granulat mit einem aktiven Mittel, das nach Einschluss in eine Formulierung und Exposition an Wärme oder an Wärme und Dampf, derart, dass die Formulierung Temperaturen von bis zu etwa 85°C bis etwa 95°C für bis zu einige Minuten erreicht, wenigstens 50%, wenigstens 60%, wenigstens 70%, wenigstens 80%, wenigstens 90% und wenigstens 95% von dessen Aktivität behält, gemessen durch ein herkömmliches Assay, welches für das ausgewählte aktive Mittel spezifisch ist. Der Fachmann weiß, dass thermostabile Granulate in Formulierungen, die Temperaturen von weniger als 85°C ausgesetzt werden, stabil sind, und Testergebnisse, die bei 80°C durchgeführt wurden, zeigen, dass dies tatsächlich der Fall ist. Dementsprechend ist klar, dass „bis zu 85°C bis 95°C” Temperaturen von weniger als 85°C einschließen, die ebenfalls zum Umfang dieser Erfindung gehören.
In einer Ausführungsform bezeichnet „thermostabil” ein aktives Mittel, das nach dem Einschluss in einer Formulierung, die mit Dampf derart behandelt wird, dass die Formulierung Temperaturen von etwa 85°C–95°C für etwa 30 Sekunden erreicht, wenigstens 80% von seiner Aktivität behält, gemessen durch ein herkömmliches Assay, das für den ausgewählten aktiven Bestandteil spezifisch ist. In noch einer anderen Ausführungsform bezeichnet thermostabil ein aktives Mittel, das nach dem Einschluss in einer Formulierung und Dampfbehandlung derart, dass die Formulierung Temperaturen von etwa 85°C–95°C für etwa 30 Sekunden erreicht, wenigstens 50% von dessen Aktivität behält, gemessen durch ein herkömmliches Verfahren, welches für das ausgewählte aktive Mittel spezifisch ist.
„Unpelletierte Mischungen” bezeichnen Vormischungen oder Vorläufer, Basismischungen, Maischen und Verdünner. Vormischungen enthalten typischerweise Vitamine und Spurenmineralien. Basismischungen enthalten typischerweise Nährstoffe und Futterbestandteile, wie Dicalciumphosphat, Kalk, Salz und eine Vitamin- und Mineralienvormischung, aber keine Körner und Proteinbestandteile. Streckmittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Körner (beispielsweise Weizen mittlerer Qualität und Reiskleie) und Tone, wie Phyllosilikate (Magnesiumsilikat, Sepiolit, Bentonit, Kaolin, Montmorillonit, Hectorit, Saponit, Beidellit, Attapulgit und Stevensit). Tone fungieren auch als Träger und Fluidisierungsmittel oder Verdünner für Futtervormischungen. Maische umfasst typischerweise eine vollständiges tierisches Nährfutter.
Die stabilen Granulate der vorliegenden Erfindung können zu diesen unpelletierten Mischungen und zu Maischemischungen zugegeben werden, welche nachfolgend mit Dampf behandelt und/oder dampfpelletiert oder getrocknet werden können.
„Wasseraktivität”, symbolisiert als a_w, bezeichnet die fraktionelle relative Feuchtigkeit einer Atmosphäre im Gleichgewicht mit einem festen oder flüssigen Phasenmaterial, d. h. das Verhältnis des Partialdrucks von Wasserdampf zu dem Partialdruck, der oberhalb von reinem Wasser bei der gleichen Temperatur herrscht. In allen Phasen, zwischen denen die Wasserverteilung ein Gleichgewicht erreicht hat, ist sie definitionsgemäß gleich. Der Begriff „relative Feuchtigkeit” wird im Allgemeinen verwendet, um das Wasser in der Atmosphäre oder Gasphase im Gleichgewicht mit dem Feststoff zu beschreiben und wird als ein Prozentsatz angegeben, wobei 100% der relativen Feuchtigkeit von reinem Wasser in einem geschlossenen System entsprechen. Somit gibt es für jeden beliebigen Wasseraktivitätswert eine korrespondierende relative Feuchtigkeit, ausgedrückt durch %RH = 100·a_w. Die Wasseraktivität kann leicht durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gemessen werden, typischerweise, indem eine Probe des Materials in die temperaturkontrollierte Kammer eines Wasseraktivitätsmessers gegeben wird, wie z. B. das Wasseraktivitätssystem Modell D2100, erhältlich von Rotronic Instrument Corp. (Huntington, N. Y.), und es der Messung ermöglicht wird, ein Gleichgewicht zu erreichen, wie auf dem Display angegeben wird. Die Wasseraktivität, auf die hierin Bezug genommen wird, ist die des Granulats selbst nach der Aufbringung aller Beschichtungen.
Die Wasseraktivität für die Granulate der vorliegenden Erfindung beträgt bevorzugt, insbesondere wenn äußere Polymerbeschichtungen verwendet werden, weniger als 0,5.
Das stabile, haltbare Granulat der vorliegenden Erfindung ist ein Granulat, welches durch jedes beliebige Verfahren hergestellt werden kann, das zur Aufbringung von einer oder mehreren Schutzschichten auf einen Kern führt. Das aktive Mittel kann eine Komponente des Kerns des Granulats sein oder kann über ein Kernmaterial beschichtet werden, und für die Zwecke dieser Offenbarung bezieht sich ein Kern auf alle Komponenten des haltbaren Granulats mit Ausnahme von irgendwelchen Schutzschicht(en), die auf den Kern des Granulats aufgebracht werden.
Der Kern kann durch jedes beliebige Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, hergestellt werden, wie Granulierung, Extrusion, Dragieren, Spheronisierung, Trommelgranulierung, Agglomeration mit hoher Scherung, Fließbett-Sprühbeschichtung, Kristallisation, Präzipitation und Granulierverfahren. Solche Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und sind in US-Patent Nr. 4,689,297 und US-Patent Nr. 5,324,649 (Festbettverarbeitung); EP656058B1 und US-Patent Nr. 454332 (Extrusionsverfahren); US-Patent Nr. 6,248,706 (Granulation, hohe Scherung); und EP804532B1 ) und US-Patent Nr. 6,534,466 (Kombinationsverfahren unter Verwendung eines Fließbettkerns und einer Mixerbeschichtung) beschrieben, wobei deren Lehren durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit miteingeschlossen werden.
Die Schutzbeschichtungen der vorliegenden Erfindung können wie beschrieben mit den Granulations-, Extruktions-, Fließbett- und Granulierverfahren, die oben angegeben wurden, aufgebracht werden. Zusätzlich können die Schutzbeschichtungen durch Gießverfahren aufgebracht werden, einschließlich Spinning disk-Gießverfahren, die in WO 03/000625 beschrieben sind, welches hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen wird.
Zusätzlich kann in einer Ausführungsform das Verfahren einen Wärmeschmelzschritt einschließen, wobei das Granulat auf oberhalb der Glasübergangstemperatur (Tg) einer Feuchtigkeitssperrkomponente erwärmt wird und anschließend allmählich die Temperatur vermindert wird, um zu bewirken, dass sich das Schutzmaterial aushärtet oder glasartig wird.
Kerne
Der Kern ist der innere Nukleus des Granulats und kann, wie oben angegeben, den aktiven Bestandteil einschließen, oder der aktive Bestandteil kann um ein Kernmaterial herum beschichtet sein. Geeignete Kerne für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise hydratisierbare oder poröse Stoffe (d. h. ein Material, welches in Wasser dispergierbar oder löslich ist), welche Futtermittel-tauglich sind. Das Kernmaterial sollte sich entweder in Wasser dispergieren (desintegrieren, wenn hydratisiert) oder in Wasser auflösen, indem es in eine echte wässrige Lösung übergeht. Tone (beispielsweise Phyllosilikat, Bentonit, Kaolin, Montmorillonit, Hectorit, Saponit, Beidellit, Attapulgit und Stevensit, Silikate, wie Sand (Natriumsilikat), Nonpareils und agglomerierte Kartoffelstärke oder Mehl oder andere Stärkegranulatquellen, wie Weizen und Maiskolben, werden als dispergierbar betrachtet. Nonpareils sind sphärische Teilchen, die ausgehend von einem Impfkristall aufgebaut und zu einer sphärische Form gerundet werden, indem man Schichten von Pulver und gelösten Stoffen in einem rotierenden sphärischen Behälter damit verbindet. Nonpareils werden typischerweise aus einer Kombination eines Zuckers, wie Sucrose, und eines Pulvers, wie Maisstärke, hergestellt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Kern ein Natriumchlorid- oder Natriumsulfatkristall, der manchmal als Impfkristall bezeichnet wird, oder ein anderer anorganischer Salzkristall. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Kern ein Sucrosekristall.
Teilchen aus anorganischen Salzen und/oder Zuckern und/oder kleinen organischen Molekülen können als Kerne der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete wasserlösliche Bestandteile für die Einarbeitung in Kerne schließen ein: anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Zinksulfat oder Harnstoff, Zitronensäure, Zucker, wie Sucrose, Lactose und dergleichen.
Kerne der vorliegenden Erfindung können ferner ein oder mehrere der folgenden umfassen: aktive Mittel (Wirkstoffe), futter- oder nahrungsmitteltaugliche Polymere, Füllstoffe, Weichmacher, faserartige Materialien, Streckmittel und andere Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie in Kernen verwendet werden. Geeignete Polymere schließen Polyvinylalkohol (PVA), Polyethylenglykol, Polyethylenoxid, Polyvinylpyrrolidin und Kohlenhydratpolymere (wie Stärke, Amylose, Amylopektin, Alpha- und Beta-Glukane, Pektin, Glykogen), einschließlich Mischungen und Derivaten davon ein.
Kerne, die in den Beispielen verwendet werden, schließen Zuckerkristalle, anorganische Salzkristalle, Maiskolbenkerne, Tone und Silikate ein.
Geeignete Füllstoffe, die für Kerne geeignet sind, schließen inerte Materialien ein, die verwendet werden, um Masse zuzusetzen und um die Kosten zu vermindern, oder die zum Zwecke des Einstellens der beabsichtigen Enzymaktivität in den verarbeiteten Granulaten verwendet werden. Beispiele von solchen Füllstoffen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf wasserlösliche Mittel, wie Salze, Zucker und wasserdispergierbare Mittel, wie Ton, Kalk, Silikate, Cellulose und Stärken und Cellulose- und Stärkederivate.
Geeignete Weichmacher, die in den Kernen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind organische Verbindungen mit geringem Molekulargewicht und sind hoch spezifisch für das Polymer, welches weichgemacht werden soll. Beispiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Zucker (wie Glukose, Fruktose und Sucrose), Zuckeralkohole (wie Sorbit, Xylit, Maltit und andere Glykole), polare organische Verbindungen mit geringem Molekulargewicht, wie Harnstoff oder andere bekannte Weichmacher, wie Wasser oder futtermitteltaugliche Weichmacher.
Geeignete Fasermaterialien, die in den Kernen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: Cellulosederivate, wie HPMC (Hydroxypropylmethyl-Cellulose), CMC (Carboxymethylcellulose), HEC (Hydroxyethylcellulose).
In einer Ausführungsform insbesondere für die Futteranwendungen der vorliegenden Erfindung ist der Kern ein wasserlösliches oder dispergierbares Maiskolbenmaterial oder ein Zucker- oder Salzkristall. In einer anderen Ausführungsform, die insbesondere für Haushaltsreinigungsanwendungen geeignet ist, ist der Kern ein wasserlöslicher oder dispergierbarer Zucker oder ein Salzkristall oder ein Nonpareil.
Der Fachmann weiß, dass für Futter- und Nahrungsmittelanwendungen die Kerne (und etwaige Polymere, Füllstoffe, Weichmacher, Fasermaterialien und Streckmittel) für Nahrungsmittel- und/oder Futteranwendungen akzeptabel sein müssen. Für Haushaltsreinigungsanwendungen muss diese Einschränkung nicht gelten.
Der Kern der Granulate der vorliegenden Erfindung, einschließlich etwaiger Beschichtungen mit aktiven Bestandteilen und ausschließlich der Schutzschichten, die unten beschrieben sind, umfasst vorzugsweise weniger als etwa 70 Gew.-%, weniger als etwa 60 Gew.-%, weniger als etwa 50 Gew.-%, weniger als etwa 40 Gew.-%, weniger als etwa 30 Gew.-% und weniger als etwa 20 Gew.-% des haltbaren Granulats.
Aktives Mittel
Das aktive Mittel (Wirkstoff) oder die aktiven Mittel, insbesondere die oben diskutierten Enzyme, werden von einer Fermentationsbrühe erhalten und können von einer ganzen Brühe, einer lysierten Brühe oder einer geklärten Fermentationsbrühe, die von dem Fermentationsverfahren wiedergewonnen wird, herrühren. Das Enzym kann in einer flüssigen, aufgeschlämmten, getrockneten, lyophilisierten oder kristallinen Form vorliegen, wie sie durch Wiedergewinnungsverfahren aus Fermentationsbrühen erhalten wird. Das Enzym/die Enzyme wird/werden optional zusammen mit Weichmachern, wie Kohlenstoff und Polymere, wie modifiziert, oder native Stärke, um eine Matrix zu bilden, vermischt. Eine nicht-beschränkende Liste an Weichmachern schließt Zucker, Glukose, Fruktose und Sucrose, Dextrine, PVA und Zuckeralkohole, wie Sorbit, Xylit und Maltit ein, oder ähnliche der oben angegebenen Weichmacher. Modifizierte Stärken schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Maisstärke und säure-verdünnte Hydroxypropylstärke, beispielsweise PureCote^®, und oxidierte Stärken. Alternativ kann das aktive Mittel zu dem Kern oder sowohl zu dem Kern als auch zu einer Schicht, die den Kern umgibt, zugegeben werden.
Schutzbeschichtungen
Die Schutzbeschichtungen der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen als eine oder mehrere Schichten aufgetragen, die den Kern umgeben, wenn das aktive Mittel nicht inhärent thermostabil ist. Ausführungsformen schließen eine, zwei, drei oder vier Schutzbeschichtungsschichten ein.
Geeignete Schutzbeschichtungsmaterialien sind Polymere, Kohlenhydrate, Proteine, Lipide, Fette und Öle, Fettsäuren, anorganische Salze und Gummen und Mischungen davon.
Die Schutzbeschichtungen schließen Feuchtigkeitssperrbeschichtungen und feuchtigkeitshydratisierende Beschichtungen ein. Die Feuchtigkeitssperrbeschichtungen fungieren durch den Ausschluss von Feuchtigkeit, beispielsweise durch Bildung einer Kapselschicht, welche typischerweise keine Feuchtigkeit absorbiert und die Feuchtigkeitsmigration in das Granulat verhindert oder seine Geschwindigkeit verzögert. Feuchtigkeitshydratisierende Beschichtungen auf dem Granulat absorbieren oder binden Feuchtigkeit entweder als freies Wasser oder als Hydradationswasser, wodurch sie das Ausmaß oder die Geschwindigkeit des Transports von externer Feuchtigkeit in das Granulat behindern oder verzögern. Die feuchtigkeitshydratisierenden Beschichtungen machen typischerweise wenigstens etwa 35 Gew.-% des Granulats aus. Die feuchtigkeitshydratisierenden Materialien in den Beschichtungen isolieren die aktiven Mittel thermisch und werden eine bestimmte Menge an Feuchtigkeit absorbieren und es innerhalb des hydratisierenden Materials behalten, ohne zu ermöglichen, dass es in den Abschnitt des Granulats mit dem aktiven Mittel passiert. Für feuchtigkeitshydratisierende Beschichtungen auf stabilen, haltbaren Granulaten, die nicht beträchtliche Mengen an Wasser vor der Dampfbehandlung enthalten, können solche Beschichtungen etwa 25 Gew.-% des Granulats ausmachen.
Feuchtigkeitssperrbeschichtungen umfassen typischerweise hydrophobe Materialien, wie hydrophobe Polymere, beispielsweise PVA, HPMC, säure-verdünnte Hydroxypropylstärken und oxidierte Stärke; Proteine, beispielsweise Weizen und Weizenproteinkonzentrate, Lipide, beispielsweise Lecithin, Fette und Öle, Fettsäuren, Latex und Gummen, beispielsweise Gummiarabikum. Bestimmte Feuchtigkeitssperrbeschichtungen, wie PVA und Gummiarabikum, werden nicht leicht oxidiert und finden besondere Anwendbarkeit bei der Bereitstellung einer chemischen Stabilität, wenn die Granulate der Erfindung in unpelletierten oder nicht tablettierten Mischungen gelagert werden, beispielsweise in Vormischungen, die Cholinchlorid enthalten. Feuchtigkeitshydratisierende Beschichtungsmaterialien sind typischerweise hydrophile Materialien, wie Kohlenhydrate und anorganische Salze, einschließlich hydratisierte Salze. Beispiele an feuchtigkeitshydratisierenden Materialien sind Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Maltodextrin, Ammoniumsulfat, Zucker, beispielsweise Sucrose und native Maisstärke.
Polymere, die für die Schutzbeschichtungen verwendet werden, sind Polyvinylalkohol (PVA), Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyethylenoxide (PEO), Polymilchsäure, Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat, Polyvinylpyrrolidone (PVP), Celluloseether, Alginate, Gelatine, modifizierte Stärken und substituierte Derivate, Hydrolysate und Copolymere davon, wie säure-verdünnte Hydroxypropylstärke, wie Pure Cote^TM, HydroxypropylmethylCellulose (HPMC), MethylCellulose (MC), CarboxymethylCellulose (CMC) und EthylCellulose. Am stärksten bevorzugte Polymere für die Schutzbeschichtungen. sind PVA, modifizierte PVA, wie beschrieben in dem U.S.-Patent Nr. 6,872,696 , und modifizierte Cellulose, wie MethylCellulose und HydroxypropylmethylCellulose, wie beschrieben in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 99/51210 , wobei beide hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Kohlenhydrate, die für die Schutzbeschichtungen verwendet werden, sind Maltodextrin, Hydroxylmethylcellulose, modifizierte oder native Stärken, hergestellt aus Korn, Sorghum, Arrowroot, Reis, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Kartoffel, Süßkartoffel, Tapioka, Maniok, Sago, und Zucker, einschließlich Sucrose, Maissirup-Feststoffen, Molassen, Glukose, Fruktose und Laktose.
Proteine, die für die Schutzschichten verwendet werden, sind Molkepulver, Molkeproteinkonzentrat, Molkeproteinisolat, Caseinate, Sojaproteinkonzentrat und -Isolat, Zein, Albumin und Gelatine.
Einfache Verbindungen und abgeleitete Lipide, die in den Schutzbeschichtungen verwendet werden können, sind Wachse (beispielsweise pflanzliche, mineralische und synthetische, wie Carnauba, Candelilla, Bienenwachs, Cerumen, Carnuba, Schellack, Paraffin und mikrokristalline Wachse); Lecithin (beispielsweise Mono- und Diglyceride); Fettsäuren (beispielsweise Stearin-, Palmitin-, Linol-, Öl-, Butter- und Arachidonfettsäuren und deren Natrium-, Kalium-, Calcium- und Zinksalze); und Fette und Öle (zum Beispiel hydrierte oder teilweise hydrierte Fette und Öle, wie Soja, Korn, Baumwollsamen, Talg, Canola und Leinsamenöl). Ein bevorzugtes Lipid für die Schutzbeschichtungen ist Lecithin.
Anorganische Salze, die für die Schutzbeschichtungen verwendet werden, schließen Salze von Sulfat, Citrat, Chlorid, Karbonat, Sulfit, Phosphat, Phosphonat und Bicarbonatsalze von Natrium, Ammonium, Kalium, Kalzium, Magnesium und Zink ein. Bevorzugte Salze sind Magnesium-, Natrium- und Ammoniumsulfate.
Gummen, die in den Schutzbeschichtungen verwendet werden können, schließen Gummiarabikum, Guargummi, Agar, Gummitragakanth, Karayagummi, Johannisbrotgummi, Carageenan, Xanthangummi und Alginate ein.
Die Schutzbeschichtungen der vorliegenden Erfindung können ferner Weichmacher, Gleitmittel, Pigmente und Pulver, wie Talk, Bentonit, Kaolin, Maisstärke, Magnesiumsilikat, Kalziumcarbonat und Chitosan umfassen.
Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weisen typischerweise eine einzelne Schicht eines feuchtigkeitshydratisierenden Materials auf, die etwa wenigstens 55 Gew.-% des Granulats ausmacht. Da die Kapazität der feuchtigkeitshydratisierenden Beschichtungen zur Aufnahme und zum Einfangen von Wasser eine Grenze hat, werden relativ hohe Mengen an Einzelschichtbeschichtungen aufgetragen. Alternativ kann/können ein feuchtigkeitshydratisierendes Material/feuchtigkeitshydratisierende Materialien in zwei Schichten aufgetragen werden. Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weisen Schutzbeschichtungen auf, die sowohl feuchtigkeitshydratisierende Materialien als auch Feuchtigkeitssperrmaterialien verwenden. In diesen Ausführungsformen kann die Menge an feuchtigkeitshydratisierendem Material geringer sein, wenigstens etwa 25 Gew.-% des Granulats, und das Feuchtigkeitssperrmaterial beträgt etwa 2 Gew.-% bis 25 Gew.-% des Granulats. Die Verwendung von sowohl feuchtigkeitshydratisierenden Materialien als auch Feuchtigkeitssperrmaterialien kombiniert Schutzmechanismen und verringert typischerweise die Kosten, insbesondere der Feuchtigkeitssperrmaterialien. Feuchtigkeitssperrmaterialien, insbesondere filmbildende Materialien, können mechanische Schäden erleiden, was, wenn diese Materialien allein als eine dünne Beschichtung verwendet werden, zu einem Verlust des Schutzes des aktiven Mittels führen kann. Die Kombination ermöglicht die Verwendung von weniger von beiden Materialien, als erforderlich wäre, wenn die Materialien alleine verwendet würden. Die Kombination lässt angesichts des Vorliegens des feuchtigkeitshydratisierenden Materials eine gewisse Schädigung der Feuchtigkeitssperrschicht zu. Wie oben diskutiert, ist die Kombination der Materialien insbesondere geeignet, um eine chemische Stabilität bereitzustellen, indem die Aktivität aufrechterhalten wird, wenn die Granulate in unpelletierten Mischungen gelagert werden.
Für Granulate mit einem hohen Wärmeschmelzverarbeitungsschritt kann die Menge des feuchtigkeitshydratisierenden Materials bis auf etwa 20 Gew.-% des Granulats vermindert werden, da die geschmolzene Feuchtigkeitssperrschicht eine verbesserte Kontinuität aufweist und weniger leicht mechanisch beschädigt wird.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen, zusätzlich zu den Verfahren, die für die Herstellung von stabilen, haltbaren Granulaten beschrieben wurde, Vermischen der Granulate mit unpelletierten Futtermischungen und Lagerung der entstandenen Mischungen ein. Zusätzliche Verfahren schließen die Dampfbehandlung der resultierenden Mischungen und/oder Pelletieren der resultierenden Mischungen ein. Natürlich können die stabilen, haltbaren Granulate der vorliegenden Erfindung gewünschtenfalls auch alleine gelagert und mit Futter gemischt oder pelletiert werden.
Die folgenden Beispiele sind nicht einschränkend zu verstehen.
Beispiele

Tabelle 1 unten stellt eine Liste der Bestandteile und Abkürzungen dar, die in den folgenden Beispielen verwendet werden. Tabelle 1

Bestandteil	Name & Produkt-Nr.	Lieferant
Sucrose	Domino Pure Cane – Extrafein granulierter Zucker	Tate & Lyle North American Sugars, Baltimore, MD
Maisstärke	Maisstärke	Cargill Foods, Minneapolis, MN
MgSO₄	Magnesiumsulfatheptahydrat, MgSO₄7H₂O (Epsom-Salze)	PQ Corporation, Berwyn, PA
HPMC	HydroxypropylmethylCellulose, Herstellername: METHOCEL	Dow Chemical
Carnaubawachs	Michem Lube 160HS (Carnaubaemulsion, 50% Feststoffe)	Michelman Inc. Cincinnati, OH
Modifizierte Stärke	PURE-COTE^®	Grain Processing Corporation, Muscatine, IA
Lecithin	ULTRALEC^® P-Sojalecithin	ADM Corp., Decatur, IL
PVA	Polyvinylalkohol, Elvanol^® 51-05	DuPont, Wilmington, DE
Natriumsulfat	Wasserfreies Natriumsulfat	Cooper Natural, Tulsa, Oklahoma
Ammoniumsulfat	Ammoniumsulfat CAS # 7783-20-2	General Alum & Chemical Corp. Searaport, Maine
Talk	NYTAL 4000 TALC	RT Vanderbilt Co, Inc. Norwalk, CT
Molkepulver	PC42010	Leprino Foods, Dever CO
Molkeprotein	Proliant-Molkeprotein-Instantkonzentrat, #8010, Lot H4212	Hilmar Cheese Company, Hilmar, CA (WPC, formal verkauft durch Proliant)
Leinsamenöl	ASTM Rohes Leinsamenöl	Cargill Industrial Oils, Chicago, IL
Maltodextrin	Maltodextrin M150	Grain Processing Corp. (GPC) Muscatine, IA
Gummiarabikum	TIC PRETESTED Gummiarabikum FT Prähydratisiert	TIC Gums, Belcamp, MD
Canolaöl	Canolaöl	Safeway
Latex	Aquacoat ECD (Ethyl-Cellulosedispersion 30%)	FMC BioPolymer, Philadelphia, PA
Sand	Natriumsilikat	Sigma-Aldrich Chemical Co.
Maiskolben	Gemahlener Maikolben oder Maiskern	ICBP Independence, IA

Tabelle 2 veranschaulicht die Zusammensetzung einer Anzahl an beispielhaften, stabilen, haltbaren Granulaten der vorliegenden Erfindung und von einigen Granulaten, die nicht wenigstens 50% wiedergewonnene Aktivität des aktiven Mittels unter speziellen Pelletierbedingungen zeigten. Tabelle 2 Formulierung #1*

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Sucrose, 35–50 Maschenweite	36,9
Wirkstoff	Enzym	7,4
	Sucrose	12,6
	Maisstärke	12,6
1te Beschichtung	Sucrose	10,5
	Maisstärke	10,5
2te Beschichtung	Carnaubawachs	6,0
3te Beschichtung	HPMC	3,5

*Wärmeschmelzschritt Formulierung #2

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Sucrose, 35–50 Maschenweite	17,5
Wirkstoff	Enzym	3,5
	Sucrose	6,0
	Maisstärke	6,0
1te Beschichtung	MgSO₄	67,0

Formulierung #3

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	16,5
Wirkstoff	Enzym	4,8
	Sucrose	4,0
	Maisstärke	8,0
1te Beschichtung	MgSO₄	66,7

Formulierung #4

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Sucrose 35–50 Maschenweite	17,5
Wirkstoff	Enzym	3,5
	Sucrose	4,0
	Maisstärke	8,0
1te Beschichtung	Maltodextrin	67

Formulierung #5

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	14,8
Wirkstoff	Enzym	2,9
	Sucrose	3,3
	Maisstärke	6,6
1te Beschichtung	MgSO₄	55,6
2te Beschichtung	Gummiarabikum	17,0

Formulierung #6

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	14,8
Wirkstoff	Enzym	2,9
	Sucrose	3,3
	Maisstärke	6,6
1te Beschichtung	MgSO₄	55,6
2te Beschichtung	Molke	16,7

Formulierung #7

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kern Material	Natriumsulfat	14,8
Aktives Mittel	Enzym	2,9
	Sucrose	3,3
	Maisstärke	6,6
1te Beschichtung	MgSO₄	55,6
2te Beschichtung	Weizenproteinkonzentrat	17,0

Formulierung #8

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	13,4
Wirkstoff	Enzym	2,6
	Sucrose	3,0
	Maisstärke	6,0
1te Beschichtung	PureCote^®-Stärke	15,0
2te Beschichtung	Lecithin	10,0
3te Beschichtung	MgSO₄	50,0

Formulierung #9

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	9,1
Wirkstoff	Enzym	1,8
	Sucrose	2,0
	Maisstärke	4,1
1te Beschichtung	MgSO₄	83,0

Formulierung #10 (Thermolabil)

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kern Material	Sucrose, 35–50 Maschenweite	26,5
Aktives Mittel	Enzym	5,3
	Sucrose	9,1
	Maisstärke	9,1
1te Beschichtung	Carnaubawachs	50

Formulierung #11

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	10,7
Wirkstoff	Enzym	2,1
	Sucrose	2,4
1te Beschichtung	Maisstärke	4,8
	PVA	4
2te Beschichtung	Talk	36
	MgSO₄	40

Formulierung #12 (Testgranulat ohne Schutzbeschichtung)

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kern-Material	Sucrose 35–50 Maschenweite	53,1
Wirkstoff	Enzym	10,6
	Sucrose	18,1
	Maisstärke	18,1

Formulierung #13 (Thermolabil)

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Sucrose 35–50 Maschenweite	44,2
Wirkstoff	Enzym	8,9
	Sucrose	15,1
1te Beschichtung	Maisstärke	15,1
	Sucrose & Stärke (Verhältnis 1:1)	16,7

Formulierung #14 (Thermolabil)

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Sucrose, 35–50 Maschenweite	48,3
Wirkstoff	Enzym	9,7
	Sucrose	16,5
1te Beschichtung	Maisstärke	16,5
1te Beschichtung	Carnaubawachs	9,1

Formulierung #15 (Thermolabil)

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Sucrose, 35–50 Maschenweite	49,6
Wirkstoff	Enzym	9,9
	Sucrose	16,9
1te Beschichtung	Maisstärke	16,9
	Ethylcellulose	11,5

Formulierung #16 (Thermolabil)

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Sucrose, 35–50 Maschen weite	48,3
Wirkstoff	Enzym	9,7
	Sucrose	16,5
	Maisstärke	16,5
1te Beschichtung	Hydroxypropylmethylzellulose	9,1

Formulierung #17

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	10,7
Wirkstoff	Enzym	2,1
	Sucrose	2,4
	Maisstärke	4,8
1te Beschichtung	MgSO₄	40
2te Beschichtung	PVA	4
	Talk	36

Formulierung #18

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	13,4
Wirkstoff	Enzym	2,6
	Sucrose	3,0
1te Beschichtung	Maisstärke	6,0
2te Beschichtung	MgSO₄	50,0
3te Beschichtung	Lecithin	10,0
	PureCote^® Stärke	15,0

Formulierung #19

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernnmaterial	Natriumsulfat	16,6
Wirkstoff	Enzym	4,8
	Sucrose	4,0
	Maisstärke	0,0
	Talk	8,0
1te Beschichtung	MgSO₄	66,7

Formulierung #20

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	14,8
Wirkstoff	Enzym	2,9
	Sucrose	3,3
	Maisstärke	6,6
1te Beschichtung	Gummiarabikum	17,0
2te Beschichtung	MgSO₄	55,6

Formulierung #21 (Thermolabil)

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Sucrose, 35–50 Maschenweite	51,9
Wirkstoff	Enzym	10,4
	Sucrose	17,7
	Maisstärke	17,7
1te Beschichtung	Canolaöl	2,2

Formulierung #22

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Gemahlener Maiskolben	17,5
Wirkstoff	Enzym	3,5
	Sucrose	6,0
	Maisstärke	6,0
1te Beschichtung	MgSO₄	67

Formulierung #23

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	31,1
Wirkstoff	Enzym	2,4
	Maisstärke	9,4
1te Beschichtung	MgSO₄	43,7
2te Beschichtung	Gummiarabikum	3,4
	Maltodextrin	10,1

Formulierung #24 (Thermolabil)

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	29,9
Wirkstoff	Enzym	3,3
	Maisstärke	9,3
1te Beschichtung	PureCote	12,0
2te Beschichtung	Lecithin	8,0
3te Beschichtung	MgSO₄	37,5

Formulierung #25 (Thermolabil)

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	47,8
Wirkstoff	Enzym	5,3
	Maisstärke	14,9
1te Beschichtung	PureCote	19,2
2te Beschichtung	Lecithin	12,8

Formulierung #26

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	31,0
Wirkstoff	Enzym	2,4
	Maisstärke	9,4
1te Beschichtung	Natriumsulfat	43,7
2te Beschichtung	Gummiarabikum	13,5

Formulierung #27

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	31,0
Wirkstoff	Enzym	2,4
	Maisstärke	9,4
1te Beschichtung	MgSO₄	43,7
2te Beschichtung	Molke	13,5

Formulierung #28**

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	32,7
Aktives Mittel #1	Enzym #1	9,1
	Sucrose	4,1
	Maisstärke	8,5
Aktives Mittel #2**	Enzym #2	1,9
	Sucrose	0,9
	Maisstärke	1,8
Beschichtung #1	Natriumsulfat	33,6
Beschichtung #2	PVA 51-05	2,5
	Talk	5,0

**Inhärent thermostabiles Enzym Formulierung #29**

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	32,7
Aktives Mittel #1 und #2 vermischt	Enzym #1 und #2	10,9
	Sucrose	5,0
	Maisstärke	10,3
Beschichtung #1	Natriumsulfat	33,6
Beschichtung #2	PVA 51-05	2,5
	Talk	5,0

**Inhärent thermostabiles Enzym Formulierung #30**

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Sand	84,80
Aktives Mittel #1	Enzym #1	3,52
	Sucrose	1,62
	gemahlener Vollweizen	3,31
Beschichtung #1	Natriumsulfat	5,50
Beschichtung #2	PVA 51-05	0,42
	Talk	0,83

**Inhärent thermostabiles Enzym Formulierung #31

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	40,0%
Spray 1	Enzym	5,0%
	PVA	1,0%
	Maisstärke	5,0%
Spray 2	Natriumsulfat	40,0%
Spray 3	PVA	3,0%
	Talk	6,0%

Formulierung #32

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	40,0%
Spray 1	Enzym	5,0%
	Maisstärke	9,0%
Spray 2	Natriumsulfat	39,0%
Spray 3	Gummiarabikum	7,0%

Formulierung #33

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	54,8
Aktive Mittel	Gemischte Enzyme	11,8
(2)	Sucrose	5,4
	Maisstärke	11,1
Beschichtung 1	Natriumsulfat	26,0
Beschichtung 2	PVA	2,5
	Talk	4,9

Formulierung #34

	Komponente	Gew.-% Trockenbasis
Kernmaterial	Natriumsulfat	54,8
Aktive Mittel	E Enzym	11,8
(2)	Mischung
Beschichtung 1		26,0
Beschichtung 2	Natriumsulfat	2,5
	PVA	4,9
	Talk

Beispiel 1. Herstellung der Granulate in Tabelle 2.
Alle Granulate in Tabelle 2 mit Ausnahme von Granulat Nummer 1 sind Granulate, die unter Verwendung eines Wirbelschichtverfahrens, wie es in dem US-Patent Nr. 5,324,649 beschrieben ist, hergestellt wurden. Das Wirbelschichtverfahren verwirbelt die Kernmaterialien in einem Vector-FL-1-Prozessor (hergestellt von Vector Corp, Marion, IA, USA), einem Glatt-3- oder einem Uniglatt-Prozessor (beide hergestellt von Glatt Air Techniques, Binzen, Deutschland). Es wurde eine Enzym/Zucker/Stärkemischung auf das Kernmaterial sprühbeschichtet. Anschließend wurde eine oder mehrere Schutzbeschichtung(en) nacheinander auf die Enzymschicht aufgesprüht und getrocknet.
Beispielsweise wurde die Formulierung #3 Granulat wie folgendermaßen hergestellt: In einem Glatt 3 Topspray-Wirbelschichtbeschichter wurden Natriumsulfatkristalle, gesiebt auf –45/+140-mesh, beladen und unter Verwendung einer erwärmten Bett-Temperatur verwirbelt. Ein Xylanase-Ultrafiltrationskonzentrat von Trichoderma reesei wurde mit Maisstärke und mit Sucrose vermischt und auf die Kristalle aufgesprüht. Die Lösung betrug etwa 33% Trockengewicht. Das endgültige Batchgewicht betrug 4.000 Gramm.
In einem Vektor-FL-1-Topsprüh-Wirbelbettbeschichter wurde ein feuchtigkeitshydratisierendes Material, eine Magnesiumsulfatlösung, auf 833 Gramm des oben beschriebenen Materials aufgesprüht. Die Bett-Temperatur betrug 50°C. Der endgültige Batch wog 2.500 Gramm.
Die Herstellung des Granulats Nummer 1 schloss ferner einen Wärmekühlschritt ein, bei dem das Granulat auf eine Temperatur erwärmt wurde, die ausreichend ist, um die Glasübergangstemperatur (Tg) des Carnaubawachsmaterials zu übersteigen, gefolgt von einem langsamen Abkühlen, was eine gehärtete, glasartige Wachsschicht ergab.
Beispiel 2: Herstellung von Maischeproben mit Granulaten und Pelletierung
Es wurden drei verschiedene Futterformulierungen und Pelletierverfahren verwendet, um Pellets mit den Granulaten, die in Tabelle 2 aufgelistet sind, herzustellen. Es wurden relativ hohe Dosierungen der Granulate zu den Futterformulierungen gegeben, um die Assays zur Messung der verbleibenden Aktivität des aktiven Mittels zu optimieren.
Mühle #1:
Es wurden ausgewählte Granulate von Tabelle 2 zusammen mit einer Futterformulierung vermischt. Die Zusammensetzung der Futterformulierungen war wie nachfolgend:
75% (Gew.-%) Maismehl (angereichertes, gelbes, entkeimtes Maismehl, Nr. 50956, General Mills Operations, Minneapolis, MN); und 25% (Gew.-%) Sojabohnenmehl (Pro-Sojabohnenmehl, Cargill Oilseed Co., Cedar Rapids, IA).
12 kg der oben angegebenen Futtermischung wurde mit jedem Probengranulat (dosiert mit 5 g/kg der Futterformulierung) kombiniert und in einem großen Hobart-Mischer (Modell D-300T, Troy OH) 8 Minuten vermischt. Es wurden etwa 150 g von jeder Probe als Maischeprobe oder als unpelletierte Futtermischung zurückgehalten. Jedes Batch wurde anschließend in drei 4 kg Unterbatches aufgeteilt und in drei Durchgängen mit der Pelletmühle pelletiert.
Die verwendete Pelletmühle war ein CPM-Modell CL5 (California Pellet Mill Co., Crawfordsville, IN). Die Temperatur in dem Dampfkonditionierer wurde durch die Menge an injiziertem Dampf bei 1,36 atm gesteuert. Die Konditionierungstemperatur der Maische, die unmittelbar vor der Austrittsdüse der Pelletmühle gemessen wurde, wurde auf einen Sollwert von 89–90°C eingestellt. Die Temperaturmessung wurde unter Verwendung eines Thermometers und eines „J”-Typ-Thermocouple (OMEGA Engineering, Inc. Stamford, CT) durchgeführt. Die Verweilzeit in dem Konditionierer betrug etwa 5 Sekunden. Die Dimensionen der Austrittsdüse waren 12,7 cm Innendurchmesser, 17,8 cm Außendurchmesser, 4,7 mm Lochdurchmesser. Die Pelletmühle war kontinuierlich in Betrieb und die Proben wurden in der Mühle nacheinander verarbeitet, getrennt durch Läufe von etwa 2 kg einer Maismehl/Sojamischung zwischen den Proben. Etwa 1 Minute nachdem die Testmaische zu dem Konditionierer zugegeben wurde und sich die Konditionierertemperatur auf eine Zieltemperatur stabilisiert hatte, wurden die Pellets über ein 30-Sekunden-Intervall gesammelt, wodurch etwa 1 kg Pellets für jede Probe gesammelt werden konnten. Die gesammelten Pellets wurden 30 Sekunden unter Umgebungsbedingungen gehalten und anschließend mit einem Luftkühler für 2–3 min. bis auf Raumtemperatur abgekühlt.
Mühle #2:
Hergestellte, haltbare Granulate von Tabelle 2 wurden mit einer Mais- und Sojafutterformulierung pelletiert. Die exakte Zusammensetzung der Futterformulierungen war wie nachfolgend: 61,2% (Gew.-%) Maismehl, 31,6% (Gew.-%) Sojabohnenmehl, 3,0 Gew.-% Fleisch- und Knochenmehl, 2,5 Gew.-% Sojabohnenöl, 1,3 Gew.-% Kalk, 0,28 Gew.-% Salz und 0,08 Gew.-% Methionin. Für jedes getestete Granulat wurden 370 bis 2.000 Gramm der Granulate, in Abhängigkeit von dem Enzymtyp und der Aktivität, mit 450 kg des Futters ohne Öl kombiniert und in einem Pflugmischer für 2 Minuten vermischt. Anschließend wurde Sojabohnenöl zugegeben und die Probe weitere 3 Minuten gemischt. Die Pelletmühle war das Modell „Master”, hergestellt von California Pellet Mill. Der Lochdurchmesser der Pelletmühlen-Austrittsöffnung betrug 4,5 mm. Die typische Zuführgeschwindigkeit betrug 780 kg pro Stunde. Die Temperatur in dem Dampfkonditionierer wurde manuell kontrolliert und wurde an dem Futterauslass von dem Konditionierer gemessen. Es wurden zwei Konditionierungstemperaturen verwendet: 85°C und 95°C. Die Verweilzeit in dem Konditionierer betrug etwa 30 Sekunden. Als die Zieltemperatur erreicht wurde, wurde das System etwa 5 Minuten, bevor die Probe eingelassen wurde, im Leerlauf betrieben. Proben von etwa 5 kg pelletiertem Futter wurden entnommen und wurden durch Ausbreiten auf Siebböden abgekühlt.
Mühle #3:
Die hergestellten, haltbaren Granulate wurden mit einer Weizen- und Sojafutterformulierung oder einer Weizen- und Gerstenformulierung pelletiert. Die Zusammensetzung der Futterformulierung war entweder 60% Weizen, 31,5% Sojabohnenmehl, 4% Sojabohnenöl, 1,5% Dicalciumphosphat, 1,23% Vitaminmineralvormischung, 1,2% Kalk, 0,4% Salz und 0,2% DL-Methionin; oder 60% Weizen, 30% Gerste, wobei zwei Konditionierungstemperaturen von 90°C und 95°C verwendet wurden. Für jedes getestete Granulat wurden 200 bis 500 Gramm Granulat in Abhängigkeit von dem Enzymtyp und der Aktivität mit 160 kg Futter kombiniert und in einem horizontalen Bandmischer etwa 15 Minuten vermischt. Die Pelletmühle war ein Simon Heesen, Einwalzentyp, ausgestattet mit einer Austrittsdüse mit 17,3 cm innerem Durchmesser, mit einem Pelletlochdurchmesser von 3 mm. Die Düsengeschwindigkeit betrug 500 U/min und wurde durch einen 7,5 kW Motor erzeugt. Die typische Futtergeschwindigkeit war 300 kg/h. Die Temperatur in dem Dampfkonditionierer, gemessen am Futterauslass des Konditionierers wurde auf +/–0,1 Grad Celsius gehalten. Der Konditionierer wies ein Mischersystem vom Kaskadentyp auf. Es wurden drei Konditionierungstemperaturen verwendet: 85°C, 90°C und 95°C. Der Dampfeinlassdruck betrug 2 atm, und die Temperatur in dem Konditionierer wurde durch manuelles Einstellen von drei Ventilen, die die Dampfabgabe regulieren, gesteuert. Die Verweilzeit in dem Konditionierer betrug etwa 30 Sekunden. Als die Zieltemperatur erreicht wurde, wurde das System für etwa 5 bis 10 Minuten in Betrieb genommen, bevor die Probe eingelassen wurde. Proben wurden in Intervallen von 1–1,5 Minuten entnommen, was 5–7,5 kg pelletiertem Futter entspricht, und sofort in eine Kühlbox mit einem perforierten Boden und einem Luftfluss von 1.500 Kubikmetern pro Stunde gegeben. Nach dem Abkühlen für 15 Minuten wurden die Proben zweimal unter Verwendung eines Probenteilers verkleinert und 1 kg wurde für Labortests entnommen.
Beispiel 3: Enzymaktivitätsmessungen
Bestimmung der Enzymaktivität
Um die Enzymaktivität nach dem Pelletieren zu bestimmen, wurden die Maische und die pelletierten Proben anschließend 30 Sekunden in einer Küchenkaffeemühle (Modell 203-42, Krups North America Inc., Medford MA) gemahlen und für die Enzymaktivität wie unten beschrieben bewertet. Alternativ wurden Proben in einer ZM-200-Zentrifugenmühle, ausgestattet mit einem 1 mm Sieb (Retsch GmbH, Deutschland), vermahlen.
Berechnung des Prozentsatzes der wiedergewonnenen Aktivität:
Für jede Testprobe wurden sowohl die Maische als auch die korrespondierenden pelletierten Proben auf Aktivität untersucht. Der Prozentsatz der wiedergewonnenen Aktivität wurde wie folgt berechnet: % wiedergewonnene Aktivität = Aktivität in den Pellets × 100 / Aktivität in der Maische
Das Phytase-Enzymassay wurde gemäß ADAC (Association of Analytical Chemists) Official Method 2000.12 durchgeführt, wie in „Determination of Phytase activity in feed by a colorimetric enzymatic method: collaborative interlaboratory study", Engelen AJ, van der Heeft FC, Randsdorp PH, Somers WA, Schaefer J, van der Vat BJ. J ADAC Int. 2001 Mai-Juni; 84(3):629–33 beschrieben ist. Kurz gesagt wurden die gemahlenen Proben in 220 mM Natriumacetattrihydrat, 68,4 mM Calciumchloriddihydrat, 0,01% Tween 20, pH-Wert 5,5, extrahiert. Der Überstand wird anschließend untersucht. Das Assay misst die Freisetzung von anorganischem Phosphat von Reisphytat bei einem pH-Wert von 5,5, für 60 min. bei 37°C. Das Assay wird mit saurem Molybdat/Vanadatreagens gestoppt und Phosphat durch die Intensität des gelb gefärbten Komplexes des Vanadomolybdophosphors quantifiziert.
Das Xylanase-Enzymassay wurde unter Verwendung des Xylanase Assay Kits (Xylazyme AX Format), Cat No: K-XYLS Megazyme International Ireland Ltd., Wicklow, Irland, durchgeführt. Materialien für das Assay schließen 16 × 125 mm Einwegglaskulturröhrchen; Extraktionspuffer: 100 mM MES Natriumsalzpuffer, pH-Wert 6,0; Assaypuffer: 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0; Stoplösung: 20 g NaPO₄12H₂O in 1 Liter MilliQ Wasser; Gewebekulturflaschen aus Polystyrol, 225 ml (Corning Incorporated – Life Sciences Big Flats, New York) ein. 6–12 g gemahlenes Futter wird in 120 ml Extraktionspuffer in einer Kulturflasche 1 Stunde bei 20–25°C extrahiert, während es auf einem Orbitalgelschüttler, der auf 100 U/min eingestellt ist, geschüttelt wird. Die Proben werden anschließend bei 2.000 g 1 min. zentrifugiert und der Überstand wird untersucht. Für das Assay werden 20 bis 100 μl des Futterüberstands in 500 μl unter Verwendung eines Assaypuffers in Kulturröhrchen verdünnt und in einem Wasserbad bei 40°C für 10 min. equilibriert. Anschließend wird eine Substrattablette in jedes Kulturröhrchen gegeben und die Proben werden weitere 10 Minuten bei 40°C inkubiert. 10 ml der Stoplösung werden anschließend zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Proben werden kurz verwirbelt und anschließend durch Whatman #1 Filterpapier filtriert. Die Absorption des Filtrats wird mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 590 nm abgelesen. Das Spektrophotometer wird zunächst mit einer Leerprobe, hergestellt durch Kombinieren von 20 bis 100 μl des Futterüberstands, 500 μl Assaypuffer und 10 ml der Stoplösung, auf Null eingestellt. Anschließend wird eine Substrattablette zugegeben, gefolgt von einem Verwirbeln und Filtrieren auf die gleiche Weise wie die Proben. Die Interferenz von einigen Futterkomponenten kann die Assayantwort beeinflussen. Um etwaige Interferenzen zu korrigieren, wurden Standardkurven mit Futterhintergrund hergestellt. Unbeschichtete Xylanasegranulate wurden zu Rohmaischen und zu Rohpellets in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die angereicherten Maische- und Pelletproben wurden anschließend vermahlen und exakt wie oben beschrieben extrahiert. Aus dieser Serie an Extrakten wurden Standardkurven für sowohl die Maische als auch die Pellets erzeugt.
Das Beta-Glucanase-Enzymassay wurde unter Verwendung eines Beta-Glucanase-Assay-Kits (Beta-Glucazyme Tablet format), Cat No: T-BGZ200, Megazyme International Ireland Ltd., Wicklow, Irland, durchgeführt. Materialien für das Assay schließen 16 × 125 mm Einwegglaskulturröhrchen; Extraktionspuffer und Assaypuffer: 25 mM Natriumacetatpuffer; Stoplösung: 2% NaPO₄12H₂O in 1 Liter MilliQ-Wasser; 140 ml Glasbecher ein. Es wurden 10 g von vermahlenem Futter in 100 ml Extraktionspuffer durch Mischen in einem Becherglas für 1 Stunde bei 20–25°C extrahiert. Proben wurden anschließend bei 2.000 g für 1 min. zentrifugiert und der Überstand wird untersucht. Für das Assay werden 20 bis 100 μl des Futterüberstands in 500 μl unter Verwendung von Assaypuffer in Kulturröhrchen verdünnt und in einem Wasserbad bei 40°C für 10 min. equilibriert. Anschließend wird eine Substrattablette in jedes Kulturröhrchen gegeben und die Proben werden für weitere 10 Minuten bei 40°C inkubiert. Anschließend werden 10 ml Stoplösung zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Proben werden kurz verwirbelt und anschließend durch Whatman #1 Filterpapier filtriert. Die Absorbanz des Filtrats wird mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 590 nm abgelesen. Das Spektrophotometer wird zunächst mit einem Rohling auf Null eingestellt, hergestellt durch Kombinieren von 20 bis 100 ml des Futterüberstands, 500 μl Assaypuffer und 10 ml Stoplösung. Anschließend wird eine Substrattablette zugegeben, gefolgt von einem Verwirbeln und Filtern auf die gleiche Weise wie die Proben. Es wird eine Standardkurve hergestellt, indem eine Serie an Enzymen, verdünnt auf geeignete Level, in Assaypuffer untersucht werden.
Beibehaltene Enzymaktivität: Ergebnisse

Tabelle 3: Pelletierungsergebnisse – Prozentsatz wiedergewonnene Aktivität nach dem Pelletieren

Formulierung	Mühle #1, 90°C	Mühle, 2, 3 oder 4 bei 85–95°C
10	< 30% Xylanase
12	< 30% Xylanase
13	< 30% Xylanase
14	< 30% Xylanase
15	< 30% Xylanase
16	< 30% Xylanase
21	< 30% Xylanase
25	< 30% Xylanase
1	> 50% Xylanase
2	> 50% Xylanase
3	> 70% Xylanase	> 70% Xylanase
5	> 50% Xylanase, > 70% E.-Coli-Phytase	> 50% Xylanase, > 80% E.-Coli-Phytase
6	> 50% Xylanase
7	> 50% Xylanase
9	> 50% Xylanase
11		> 50% Xylanase, > 70% Aspergillus-Phytase
30		> 60% thermostabile Xylanase
22	> 50% Xylanase
23	> 60% E.-Coli-Phytase	> 50% Xylanase, > 80% E.-Coli-Phytase
27	> 50% Xylanase	> 80% E.-Coli-Phytase
33		> 90% BGL, > 70% thermostabile Xylanase
4	> 70% Xylanase
8	> 70% Xylanase
17	> 70% Xylanase
18	> 70% Xylanase
19	> 70% Xylanase
20	> 70% Xylanase
26	> 70% Xylanase	> 90% E.-Coli-Phytase
28		> 90% BGL, > 90% thermostabile Xylanase
29		> 70% BGL, > 90% thermostabile Xylanase
31		> 90% E.-Coli-Phytase
32		> 90% E.-Coli-Phytase

Die verwendeten Pelletmühlen können in zwei Gruppen unterteilt werden. Mühle #1 ist eine Mühle im Labormaßstab, die viel aggressiver ist als diejenige, welche typischerweise in der kommerziellen Praxis verwendet wird. Die Aggressivität ist auf die große Menge an Dampf zurückzuführen, die zu einer relativ kleinen Portion Maische gegeben wird, zusammen mit der Tatsache, dass die Futtermischung kein Öl erhält, welches typischerweise das Futter einschmiert, während es die Austrittsdüse passiert. Die Mühlen #2 bis #4 werden als stärker repräsentativ für kommerzielle Bedingungen betrachtet.
Die beibehaltenen Aktivitäten der getesteten Granulate sind in Tabelle 3 gezeigt. Granulate der vorliegenden Erfindung, die nicht als stabile, haltbare Granulate betrachtet werden, waren Nummern 10, 12, 13, 14, 15, 16, 21 und 25, wobei alle davon weniger als 30% wiedergewonnene Aktivität zeigten. Diese Granulate weisen einen mit einer Enzymmatrixschicht beschichteten Kern auf, wobei der beschichtete Kern mehr als etwa 50 Gew.-% des gesamten Granulats ausmacht. Die meisten dieser nicht-stabilen Granulate wiesen nur eine Schutzbeschichtungsschicht aus einem Feuchtigkeitssperrmaterial, wie Carnaubawachs oder Ethylcellulose oder HPMC oder Canolaöl, auf. Ohne dass wir uns an irgendeine besondere Theorie binden wollen, und anerkennend, dass diese Granulate auch mehr als 50% beibehaltene Aktivität des aktiven Mittels bei 70–85°C zeigen können, kann die geringe Thermostabilität dieser Granulate unter diesen Testbedingungen relativ zu stabilen, haltbaren Granulaten darauf zurückzuführen sein, dass die Beschichtungsmaterialien als relativ dünne Schichten vorliegen, die in fünf Beispielen etwa 2,0 bis etwa 17,0 Gew.-% des Granulats umfassen und/oder können auf das besondere verwendete Beschichtungsmittel zurückzuführen sein. Beispielsweise wies Granulat Nummer 10 eine einzige Schicht Beschichtungsmaterial auf, die zu 50 Gew.-% Feuchtigkeitssperrmaterial (Carnaubawachs) ist; und Granulat Nummer 25 weist zwei Feuchtigkeitssperrschutzschichten auf, die zusammen 32 Gew.-% des Granulats ausmachen.
Besonders stabile, haltbare Granulate der vorliegenden Erfindung waren Nummern 4, 8, 17, 18, 19, 20, 26, 28, 29, 31 und 32, wobei alle davon mehr als 70% wiedergewonnene Xylanaseaktivität aufweisen, wenn sie bei etwa 90°C für etwa 5 Sekunden pelletiert wurden. Zusätzlich zeigten Granulate 26, 31 und 32 mehr als 90% wiedergewonnene Phytaseaktivität, wenn sie zwischen 85°C und 95°C für etwa 30 Sekunden pelletiert wurden. Granulate 28 und 29 zeigten mehr als 90% behaltene Aktivität einer inhärent thermostabilen Xylanase in der Enzymmischung und 70%–90% beibehaltene Aktivität einer thermolabilen Beta-Glucanase, wenn zwischen 85°C und 95°C für 30 Sekunden pelletiert wurde. Solche stabilen, haltbaren Granulate, die ein aktives Mittel aufweisen, welches nicht inhärent thermostabil ist, sind entweder: 1) mit einer einzelnen dicken Schutzschicht eines feuchtigkeitshydratisierenden Materials beschichtet oder 2) mit zwei oder drei Schutzschichten beschichtet, wobei wenigstens eine der Schichten ein feuchtigkeitshydratisierendes Material und eine Schicht ein Feuchtigkeitssperrmaterial ist.
Im Allgemeinen, wenn feuchtigkeitshydratisierende Materialien als individuelle Schichten aufgetragen werden, muss die Beschichtung wenigstens etwa 55% des Granulats umfassen, um einen geeigneten Thermoschutzbereich bereitzustellen; und, wenn die Menge des feuchtigkeitshydratisierenden Materials bei Verwendung einer individuellen Schicht auf weniger als 55% eingestellt wurde, sank der Prozentsatz der beibehaltenen Aktivität auf weniger als 50% ab. Wenn allerdings feuchtigkeitshydratisierende Materialien in Kombination mit Feuchtigkeitssperrmaterialien verwendet werden, kann die wasserhydratisierende Schutzschicht auf wenigstens etwa 25 Gew.-% des Granulats verringert werden, während das Feuchtigkeitssperrmaterial etwa 2 Gew.-% bis 40 Gew.-% des Granulats ausmachen kann.
Andere stabile, haltbare Granulate der vorliegenden Erfindung waren die Nummern 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 11, 22, 23, 27, 30 und 33, die alle mehr als 50% wiedergewonnene Xylanase- oder Phytaseaktivität zeigten, wenn sie bei 90°C für 5 Sekunden oder bei 85°C bis 95°C für 30 Sekunden pelletiert wurden. Wie aus diesen Ergebnissen gesehen werden kann, stellen anorganische Salze von Außen- oder Innenbeschichtungen alleine einen guten Schutz für das Enzym und einen erhöhten Schutz bereit, wenn sie mit Feuchtigkeitssperrbeschichtungen kombiniert werden. Wie früher angemerkt wurde, wurde Granulat Nummer 1 unter Verwendung eines Wärmeschmelzverarbeitungsschrittes hergestellt und es wird angenommen, dass die Hinzufügung von solch einem Wärmeschmelzschritt die Sperreigenschaften der Feuchtigkeitssperrmaterialien, wie Polymere, Proteine und Lipide, verstärkt, wodurch die Menge des feuchtigkeitshydratisierenden Materials, welches notwendig ist, um eine Thermostabilität bereitzustellen, vermindert wird. Wenn ein Granulat auf der anderen Seite zu Granulat 1 identisch ist, ohne Wärmeschmelzen hergestellt wurde, betrug die wiedergewonnene Aktivität 35%. Granulate 2, 3 und 22 zeigen, dass verschiedene Kernmaterialien verwendet werden können, ohne die Granulatstabilität zu kompromittieren.
Granulat 3 zeigte mehr als 70% wiedergewonnene Enzymaktivität bei sowohl 5 Sekunden als auch 30 Sekunden Pelletierzeit. Granulat 11 zeigte mehr als 50% wiedergewonnene Xylanaseaktivität, wenn bei 85°C bis 95°C für etwa 30 Sekunden pelletiert wurde und mehr als 70% wiedergewonnene Phytaseaktivität, wenn bei 85°C bis 95°C etwa 30 Sekunden pelletiert wurde. Granulat #23 zeigt mehr als 60% wiedergewonnene Aktivität von Phytase, wenn 5 Sekunden bei 90°C pelletiert wurde; mehr als 50% wiedergewonnene Aktivität von Xylanase, wenn bei 85°C bis 95°C 30 Sekunden pelletiert wurde; und mehr als 80% wiedergewonnene Aktivität von Phytase, wenn bei 85°C bis 95°C 30 Sekunden pelletiert wurde.
Beispiel 4: Direkter Bedampfungstest
100 Gramm Portionen von Maische, die 75% Maismehl und 25% Soja umfassten, wurden mit Granulaten, die E.-Coli-Phytase enthalten, mit einer Einschlussrate von 1,25 g Granulat pro Kilogramm Maische dosiert. Maischeproben wurden anschließend in einen durchsichtigen Gewebebeutel verpackt und 20 Sekunden unter Dampf gesetzt, indem die Beutel in einen Trichter mit 30 psi Dampf, eingeleitet vom Boden des Trichters, platziert wurden. Nach der Dampfbehandlung wurden die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt, über Nacht getrocknet und anschließend auf die Phytaseaktivität untersucht. Der Prozentsatz wiedergewonnene Aktivität der dampfbehandelten Proben, relativ zu der nicht erwärmten Maische, wurde ermittelt.
Ein Granulat, welches bezüglich einer Dampfbeständigkeit unter diesen Testbedingungen nicht als geeignet betrachtet wurde, war Nummer #25, welche weniger als 35% wiedergewonnene Aktivität nach der Dampfbehandlung aufwies. Stabile, haltbare Granulate der vorliegenden Erfindung waren Nummern #5 und #23, welche mehr als 50% wiedergewonnene Aktivität nach der Dampfbehandlung aufwiesen.
Beispiel 5: Bioverfügbarkeitstest der pelletierten Granulate
Die stabilen, haltbaren Granulate der vorliegenden Erfindung können auf die Bioverfügbarkeit des Enzymwirkstoffs unter Verwendung von bekannten Bioverfügbarkeitstests, wie die Phytase-Bioverfügbarkeitsuntersuchung, die in WO 00/47060 offenbart ist; Bioverfügbarkeitstests, die in Enzymes in Animal Nutrition, Proceedings of the 1st Symposium, Kartause Ittingen, Schweiz, Oktober 13016, 1993 beschrieben sind; Bioverfügbarkeitstests, die in Chemgen Patents beschrieben sind, getestet werden.
Stabile Granulate der vorliegenden Erfindung wurden nach dem Pelletieren bewertet, um die Bioverfügbarkeit bei jungen Masthähnchen zu bestimmen, die mit einer herkömmlichen Nahrung gefüttert wurden.
Materialien und Methoden
Getestete Enzyme und Granulate und Ernährungsbehandlungen schlossen Phyzyme^®XP-(6-Phytase; E.C. 3.1.3.26)-Enzyme alleine, und sowohl PVA-beschichtete- und mit Gummiarabikum (GA) beschichtete, stabile Granulate der vorliegenden Erfindung ein, die Phyzyme XP-Enzym enthalten (siehe Tabelle 4). Die getesteten Enzyme und Granulate wurden an die Masthähnchen in entweder einer Maischenahrung oder einer Pellet-Nahrung (hergestellt bei 90°C) verfüttert. Die experimentellen Nahrungen waren: positive Kontrolle (kommerzielle Nahrung), negative Kontrolle, negative Kontrolle + 500 U/kg Phyzyme^® XP, negative Kontrolle + 500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, negative Kontrolle + 500 U/kg GA-beschichtete Phytase, negative Kontrolle + 500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C, und negative Kontrolle + 500 U/kg GA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C. Mit Ausnahme von Calcium und Phosphor waren alle Nahrungen isokalorisch und isostickstoffhaltig (siehe Tabelle 6). Calcium und erhältlicher Phosphor in den positiven und negativen Kontrollnahrungen waren 0,90% bzw. 0,78% und 0,37% bzw. 0,26%. Titandioxid (0,10%) wurde zu den Nahrungen als ein nicht verdaubarer Marker zugegeben, um das Abschätzen der Nahrungsmittelverdaubarkeit zu unterstützen. Die experimentellen Nahrungen wurden durch ADAS Gleadthorpe mit einer kommerziellen Spezifizierung hergestellt und bei ADAS Gleadthorpe gehalten und unter Kühlung gelagert. Proben der Enzymadditivmischungen (25 g), Getreide (250 g), Sojabohnenmehl (250 g) und eine Probe von allen Nahrungen (250 g) wurde an Danisco Animal Nutrition Enzymes Feed Services, Edwin Rahrs Vej 38, DK-8220 Braband, Dänemark, geschickt. Alle Futterproben wurden vor dem Füttern auf Phytase untersucht.
Experimentelle Tiere und Design:
Die Hühnchen waren männliche Ross 308 Masthähnchen mit einem Alter von 0 bis 21 Tagen unter Verwendung von acht Replikat-Pferchen pro Behandlung mit 30 Vögeln pro Pferch. Die Hühnchen wurden randomisiert in Boxen platziert, bevor sie gewogen wurden und randomisiert den Behandlungspferchen zugeteilt. Jedes Replikat enthielt eine Rohrfuttervorrichtung und die Vögel hatten über Nippel-Trinkvorrichtungen (4 pro Replikat) freien Zugang zu Wasser und zu jeder Zeit Futter. Die Höhe der Trinkvorrichtungen wurde regelmäßig eingestellt, um das Niveau auf der Höhe des Rückens der Vögel zu halten. Einstreu wurde in Form von sauberen Holzspänen mit einer Tiefe von 5 cm bereitgestellt. Das Haus wurde durch ein Warmluftbrutsystem erwärmt und die Brutsolltemperatur betrug 31°C am Tag 1, vermindert um 1°C jeden Tag, bis 21°C am Tag 21 erreicht wurde. Die minimale Ventilationsrate wurde automatisch berechnet, um 1,9 × 10⁴ m³ an Luft pro Sekunde pro kg^0,75 Körpergewicht zu liefern, und diese Rate wurde durch einen 610 mm Ventilator, kontrolliert durch ein Farm-Ex Diacam Kontrollpanel, zugeführt. Das Lichtprogramm war 23 Stunden Licht und 1 Stunde dunkel. Die Lichtintensität wurde von einem Maximum, erhältlich am ersten Tag (40–60 Lux) auf eine Intensität von etwa 10 Lux nach 10 Tagen Alter eingestellt. Die relative Feuchtigkeit wurde auf einer täglichen Basis unter Verwendung eines Tinytalk^©-Datenloggers überwacht. Die Hühnchen wurden mit IB H120 & 50% Avinue (ND) in der Brutanstalt geimpft.
Futteraufnahme/Körpergewicht
Die Futterverwertung wurde zwischen 0 und 21 Tagen gemessen. Das Futter in jedem Pferch wurde gemessen, indem die Menge an Futter, das am Ende der Periode verblieb, zurückgewogen und von der angebotenen Menge abgezogen wurde. Die Vögel wurden in ihren Pferchgruppen am 1. Tag gewogen. Nach 21 Tagen wurden alle Vögel in allen Pferchen batchweise gewogen. Das Gesamtgewicht aller Vögel in jedem Pferch wurde bestimmt und der Mittelwert berechnet. Alle Vögel, die starben, wurden gewogen und die Details aufgezeichnet, und irgendwelche kranken Vögel oder Vögel, die nicht in der Lage waren, Futter und Wasser zu erreichen, wurden von der Studie ausgeschlossen und der Grund für den Ausschluss aufgelistet.
Tibia-Asche
Als die Vögel 21 Tage alt waren, wurden 2 Vögel von jedem Replikat ausgewählt, unter Anwendung von zervikaler Dislokation getötet und es wurde das linke Bein entfernt. Die Tibia wurde ausgeschnitten und der Knochen wurde an Eurofins Laboratories, Woodthorne, Wolverhampton zum Veraschen auf einer Plot-Basis geschickt. Alle Daten wurden unter Verwendung von allgemeinen linearen Modellverfahren von SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC) analysiert. Wenn signifikante Unterschiede festgestellt wurden, wurde der Duncan's Test verwendet, um individuelle Behandlungsmittel zu vergleichen.
Ergebnisse und Diskussion
Die analysierte Phytaseaktivität in den experimentellen Nahrungen betrug < 50, < 50, 563, 467, 558 FTU/kg (PVA-beschichtete Phytase), und 554 und 440 (GA-beschichtete Phytase) für die positive Kontrolle, negative Kontrolle, negative Kontrolle + 500 U/kg Phyzyme^® XP, negative Kontrolle + 500 U/kg PVA-beschichtete Phytase und GA-beschichtete Phytase, und negative Kontrolle + 500 U/kg PVA-beschichtete Phytase bzw. GA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C (Tabelle 5), was anzeigt, dass die Aktivität von sowohl der PVA-beschichteten Phytase wie auch der GA-beschichteten Phytase nach dem Pelletieren bei 90°C nicht zerstört wurde.
Die Vögel, denen mit 500 U/kg PVA-beschichteter Phytase und GA-beschichteter Phytase angereicherte und bei 90°C pelletierte Nahrung gefüttert wurde, waren am Tag 21 schwerer als Vögel, die mit der positiven Kontrolle, negativen Kontrolle und negativen Kontrolle + 500 U/kg Phyzyme^®XP-Nahrungen (Tabelle 7) gefüttert wurde. Vögel, die mit der negativen Kontrollnahrung gefüttert wurden, verbrauchten weniger Futter als Vögel, die mit der Nahrung gefüttert wurden, die mit 500 U/kg PVA-beschichteter Phytase und GA-beschichteter Phytase angereichert und bei 90°C pelletiert wurde (Tabelle 8). Vögel, die mit Maischenahrungen, angereichert mit 500 U/kg Phyzyme^®- und PVA-beschichteter Phytase gefüttert wurden, zeigten zu der positiven Kontrolle keinen statistischen Unterschied. Vögel, die mit Futter gefüttert wurden, das mit 500 U/kg PVA-beschichteter Phytase und GA-beschichteter Phytase angereichert und bei 90°C pelletiert worden war, wiesen bessere Futterkonversionsverhältnisse am Tag 21 auf als Vögel, die mit einer negativen Kontrolle + 500 U/kg Phyzyme^®XP und positiven Kontrollnahrungen (Tabelle 9) gefüttert wurden. Die Tibia-Asche war bei den Vögeln am geringsten, die mit der negativen Kontrollnahrung gefüttert wurden, im Vergleich zu allen anderen Behandlungen. Vögel, die mit einer positiven Kontrolle und phytase-angereicherten Nahrungen gefüttert wurden, wiesen ähnliche Tibia-Asche auf (Tabelle 10).

Die getestete Phytase, entweder als Phyzyme^®XP oder beschichtet mit PVA oder GA, funktioniert genauso gut wie die positive Kontrollnahrung, wenn diese als Maische verfüttert wurde. Als PVA- oder GA-beschichtete und bei 90°C pelletierte Phytase zu kommerzieller Nahrung zugegeben wurde, wurde die Wiedergewinnung des Produkts auf dem Niveau von unpelletiertem Futter gehalten und die Performance war wenigstens genauso gut oder besser als die der positiven Kontrollnahrung. Die Ergebnisse zeigen, dass Beschichten von Enzym mit PVA oder GA dessen Thermostabilität bei einer Pelletiertemperatur von 90°C verbesserte, ohne die Biowirksamkeit bei kommerziellen Nahrungen, die an Masthähnchen verfüttert wurden, zu verlieren. Tabelle 4 Nahrungsmittelbehandlungen

Ernährung	Enzym, U/kg	Inklusion (g/T)
Positive Kontrolle	0, Maischenahrung	0
Negative Kontrolle	0, Maischenahrung	0
Phyzym XP Maischenahrung	500 U/kg Phyzym XP, Maischenahrung	100
PVA-beschichtete Maischenahrung	500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, Maischenahrung	100
PVA-beschichtete Pelletnahrung	500 U/kg PVA-beschichtete Phytase (Pellet bei 90°C)	100
GA-beschichtete Maischenahrung	500 U/kg GA-beschichtete Phytase, Maischenahrung	100
GA-beschichtetes Maische-nahrung	500 U/kg GA-beschichtete Phytase (Pellet bei 90°C)	100

Tabelle 5 Phytaseaktivität bei experimentellen Nahrungsmitteln

Ernährung	Erwartet	Beobachtet	Beobachtet, %
	FTU/Kg
Positive Kontrolle, Maische	< 50	< 50
Negative Kontrolle, Maische	< 50	< 50
Phyzym XP, Maischenahrung	500	563	112,6
PVA-beschichtet, Maischenahrung	500	467	93,4
PVA-beschichtet, pelletiert bei 90°C	500	558	111,6
GA-beschichtet, Maischenahrung
GA-beschichtet, pelletiert bei 90°C	500	440	88,0

Tabelle 6 Experimentelle Nahrungsmittel

Bestandteile: %	Positive Kontrolle	Negative Kontrolle
Mais	58,56	59,49
Sojabohnenmehl –48	34,65	34,55
Sojaöl	2,82	2,48
Salz	0,30	0,30
Natriumbicarbonat	0,20	0,20
Dikalziumphosphat	1,59	0,83
Kalk	0,95	1,12
Vitaminvormischung	0,50	0,50
Lysin-HCl	0,10	0,10
DL-Methionin	0,23	0,23
Titandioxid	0,10	0,10
Enzymvormischungsträger (Mais)	0	0,10
Nahrungszusammensetzung
Rohprotein, %	21,68	21,68
Metabolisierbare Energie von Geflügel, MJ/kg	12,8	12,8
Kalzium, %	0,90	0,78
Phosphor, %	0,67	0,54
Verfügbarer Phosphor, %	0,37	0,26
Methionin + Cystin, %	0,92	0,92
Methionin, %	0,56	0,56
Lysin, %	1,25	1,25
Threonin, %	0,82	0,82
Tryptophan, %	0,25	0,25

Tabelle 7 Anfangs- und Endkörpergewicht der Masthähnchen, die mit experimentellen Nahrungsmitteln gefüttert wurde

Ernährung	Körpergewicht, g
	Tag 0	Tag 21
Positive Kontrolle, Maische	44,43	789^b
Negative Kontrolle, Maische	43,55	680^d
500 U/kg Phyzym XP, Maische	43,72	753^c
500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, Maische	43,75	740^c
500 U/kg GA-beschichtete Phytase, Maische
500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C	43,70	899^a
500 U/kg GA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C	43,67	934^a
Standardfehlerdifferenz zwischen den Mittelwerten	0,261 (PVA) 0,228 (GA)	6,015 (PVA) 7,741 (GA)
P-Wert	0,165 (PVA 0,053 (GA)	< 0,001 (PVA) < 0,001 (GA)

Verschiedene hochgestellte Buchstaben in der gleichen Spalte weisen auf einen signifikanten Unterschied hin. Tabelle 8 Gesamtfutteraufnahme von Masthähnchen, gefüttert mit experimentellen Nahrungsmitteln

Nahrungsmittelbehandlung	Futteraufnahme (g/Vogel/Tag)
Positive Kontrolle, Maische	56,69^b
Negative Kontrolle, Maische	46,00⁸
500 U/kg Phyzym XP, Maische	59,03^b
500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, Maische	56,70^b
500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C	57,18^b
500 U/kg GA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C	64,33^b
Standardfehlerunterschied zwischen den Mittelwerten	2,321 (PVA) 2,260 (GA)
P-Wert	0,004 (PVA) 0,001 (GA)

Verschiedene hochgestellte Buchstaben in der gleichen Spalte weisen auf einen signifikanten Unterschied hin. Tabelle 9 Futterkonversionsverhältnis von Masthähnchen, die mit experimentellen Nahrungsmitteln gefüttert wurden

Nahrungsmittelbehandlung	Futterkonversionsverhältnis
Positive Kontrolle, Maische	1,617^ab
Negative Kontrolle, Maische	1,548^ab
500 U/kg Phyzym XP, Maische	1,752^a
500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, Maische	1,715^a
500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C	1,412^b
500 U/kg GA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C	1,537
Standardfehlerdifferenz zwischen den Mittelwerten	0,715 (PVA) 0,069 (GA)
P-Wert	0,016 (PVA) 0,061 (GA)

Verschiedene hochgestellte Buchstaben in der gleichen Spalte weisen auf einen signifikanten Unterschied hin. Tabelle 10 Tibia-Asche-Gehalt von Masthähnchen, die mit experimentellen Nahrungsmitteln gefüttert wurden

Nahrungsmittelbehandlung	Tibia-Asche-Gehalt (g/100g)
Positive Kontrolle, Maische	14,03^b
Negative Kontrolle, Maische	10,86^a
500 U/kg Phyzym XP, Maische	13,93^b
500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, Maische	13,24^b
500 U/kg PVA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C	13,50^b
500 U/kg GA-beschichtete Phytase, pelletiert bei 90°C	13,84^a
Standardfehlerunterschied zwischen den Mittelwerten	0,403 (PVA) 0,302 (GA)
P-Wert	< 0,001 (PVA) < 0,001 (GA)

Verschiedene Aufschriften in der gleichen Spalte weisen auf einen signifikanten Unterschied hin.

Beispiel 6: Enzymvormischung & Pelletierstabilität
Granulate, die Phytase enthalten, die gemäß Formulierungen in Tabelle 2 hergestellt wurden, die entweder eine PVA- oder eine Gummiarabikum-Beschichtung und eine feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung aufweisen, wurden mit dem Ton Sepiolit oder mit einer Standardmasthähnchen-Vitamin-Mineralvormischung mit und ohne Cholinchlorid vermischt. Die Mischverhältnisse waren 100 Gramm Granulat, zugegeben zu 900 Gramm Ton (Sepiolit) oder 100 Gramm Granulat, zugegeben zu 500 Gramm Vitamin-Mineral-Vormischung. Die Proben wurden in geschlossenen Behältern bei 35°C für 3 Wochen gelagert und anschließend, wie oben unter Mühle #3 beschrieben wurde, pelletiert. Die experimentelle Kontrolle waren Granulate, die nicht in einer Vormischung aufbewahrt und bei Raumtemperaturbedingungen für 3 Wochen gehalten wurden.

Tabellen 11 und 12 zeigen den Prozentsatz an wiedergewonnener Phytaseaktivität dieser Mischungen nach dem Pelletieren bei 90°C und 95°C. Es wurde festgestellt, dass Granulate, gemischt mit Sepiolit oder den Vitaminmineralvormischungen, signifikant erhöhte Wiedergewinnungsaktivitäten nach dem Pelletieren aufweisen.

Tabelle 11
PVA-Formulierungsgranulat
Vormischung	Prozent wiedergewonnener Aktivität nach dem Pelletieren, relativ zur Maische		Prozentzunahme in der wiedergewonnenen Aktivität, relativ zu Kontrollgra nulaten
	90°C	95°C	90°C	95°C
Granulat alleine (Kontrolle)	71%	57%
Sepiolit + Granulat	95%	88%	34%	53%
Vitaminmineralvormischung, kein Cholinchlorid + Granulat	93%	80%	32%	40%
Vitaminmineralvormischung, mit Cholinchlorid + Granulat	98%	85%	39%	48%

Tabelle 12
GA-Formulierungsgranulat
Vormischung	Prozent wiedergewonnener Aktivität nach dem Pelletieren relativ zu dem Maische		Prozentzunahme in der wiedergewonnenen Aktivität, relativ zu Kontrollgranulaten
	90°C	95°C	90°C	95°C
Granulat alleine (Kontrolle)	92%	81%
Sepiolit + Granulat	99%	88%	8%	9%
Vitaminmineralvormischung, kein Cholinchlorid + Granulat	100%	81%	8%	0%
Vitaminmineralvormischung, mit Cholinchlorid + Granulat	97%	80%	5%	–2%

Ohne dass wir an eine besondere Theorie gebunden sein wollen, nehmen wir an, dass der Ton und die Vitaminmineralvormischung eine Kapazität aufweisen, Wasser aufzunehmen und dass sie während der Lagerung mit stabilen Granulaten Restfeuchtigkeit von den Granulaten absorbieren. Um diesen Effekt zu veranschaulichen, zeigt Tabelle 13 die Ergebnisse eines Experiments, bei dem Granulate und Sepiolit in offenen Behältern, Seite an Seite innerhalb einer geschlossenen Kammer, gelagert werden. Die Wasseraktivität der Granulate und von Sepiolit wurde vor und nach 7 Tagen der Lagerung bei 25°C gemessen. Während der Lagerung absorbierte Sepiolit Wasser von den Granulaten, bis das System ein Gleichgewicht erreichte. Nach der Lagerung zeigen die Granulate eine Abnahme bei der Wasseraktivität, während das Sepiolit eine Zunahme bei der Wasseraktivität zeigt.

Tabelle 13
	Anfängliche Wasseraktiv ität		Wasseraktivität nach 7 Tagen der gemeinsamen Lagerung
	Sepiolit	Granulate	Sepiolit	Granulate
Formulierung GA-Granulat	0,312	0,558	0,359	0,373
Formulierung PVA-Granulat	0,312	0,516	0,354	0,365

Beispiel 7: Lagerungsstabilität mit Cholinchlorid
Cholinchlorid oder N-(2-Hydroxyethyl)trimethylammoniumchlorid ist ein wichtiges Futteradditiv, ein Vitaminnährstoff, bei Geflügel-, Schwein- und anderen Tierfuttern. Cholinchlorid ist ein reaktives Molekül und weist einen bekannten destruktiven Effekt auf andere Vitamine und Enzyme auf. Cholinchlorid wird oft in Prämischungen und in Basismischungen inkludiert. Maximale Level, die in Prämischungen verwendet werden, sind 74.800 mg/kg für Schwein und 150.000 mg/kg für Geflügel. Und typische Level für Schweine-Basismischungen sind etwa 966 bis 1.282,9 mg/kg.

Von den stabilen, haltbaren Granulaten der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass sie die Enzymaktivität behalten, wenn sie in Anwesenheit von Cholinchlorid gelagert werden. Granulate, die Phytase enthalten und mit Formulierungen mit entweder PVA oder Gummiarabikum und einem feuchtigkeitshydratisierenden Material hergestellt wurden, wurden mit einer Standard-Masthähnchen-Vitamin-Mineralvormischung vermischt, mit und ohne Cholinchlorid. Das Mischverhältnis betrug 100 Gramm Granulat, zugegeben zu 500 Gramm Vitamin-Mineral-Vormischung. Proben wurden in geschlossenen Behältern bei 35°C 3 Wochen gelagert und anschließend unter Verwendung des oben beschriebenen Phytaseassay-Protokolls auf Aktivität untersucht. Als Kontrollexperiment dienten Granulate, welche nicht in einer Vormischung gelagert wurden und welche für 3 Wochen bei 35°C gehalten wurden. Tabellen 14 und 15 zeigen die gemessene Aktivität der Mischungen vor und nach der Lagerung und den Prozentsatz der Änderung bei der Aktivität. Keine der Proben zeigt einen merklichen Verlust der Aktivität nach der Lagerung. Der Fehler dieses Assays, einschließlich der Fehler der Proben, Extraktion und des Aktivitätsassays, beträgt etwa 15%.

Tabelle 14
PVA-Formulierungsgranulat
Probe	Anfangsaktivität (FTU/g)	Aktivität nach der Lagerung von 3 Wochen bei 35°C (FTU/g)	Prozentänderung bei der Aktivität
nur Granulat (Kontrolle)	11.600	11.858	2%
Granulat + Vitamin-Mineral-Vormischung ohne Cholinchlorid	1.933	1.727	–12%
Granulate + Vitamin-Mineral-Vormischung mit Cholinchlorid	1.933	1.720	–12%

Tabelle 15
GA-Formulierungsgranulat
Probe	Anfangsaktivität (FTU/g)	Aktivität nach der Lagerung von 3 Wochen bei 35°C (FTU/g)	Prozentänderung bei der Aktivität
nur Granulat (Kontrolle)	10.373	10.528	1%
Granulat + Vitamin-Mineral-Vormischung ohne Cholinchlorid	1.729	1.543	–12%
Granulat + Vitamin-Mineral-Vormischung mit Cholinchlorid	1.729	1.622	–7%

Beispiel 8: Effekt der Wasseraktivität auf die Pelletierstabilität

Es wurden Phytasegranulate gemäß einer Formulierung mit einer PVA-Beschichtung und/oder einer anorganischen Salzschichtbeschichtung in einem Wirbelschichtverfahren, wie vorher beschrieben, hergestellt. Ein zusätzlicher Trocknungsschritt kann eingesetzt werden, wenn die Wasseraktivität des Granulats nach dem Verarbeiten höher ist als 0,5, so dass in einem Wirbelschichtcoater oder mit einem anderen geeigneten Verfahren die Granulate getrocknet werden können, bis eine Wasseraktivität von < 0,5 erreicht wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt und zeigen, dass die beibehaltene Aktivität nach dem Pelletieren verbessert ist, wenn die Wasseraktivität weniger als 0,5 beträgt.

Tabelle 16
PVA-Formulierungsgranulat
Granulat	Wasseraktivität	Prozentsatz wiedergewonnener Aktivität nach dem Pelletieren, relativ zur Maische		Prozentsatzzunahme bei der wiedergewonnenen Aktivität, relativ zu den Kontrollgranulaten
		90°C	95°C	90°C	95°C
A (Kontrolle)	0,57	81%	69%
B	0,41	98%	87%	21%	26%
C	0,49	110%	97%	36%	41%

Ausführungsformen

1. Granulat für Futterzusammensetzungen, umfassend: einen Kern; ein aktives Mittel; und wenigstens eine Beschichtung, wobei das aktive Mittel des Granulats wenigstens 50% Aktivität, wenigstens 60% Aktivität, wenigstens 70% Aktivität, wenigstens 80% Aktivität unter Bedingungen behält, ausgewählt aus ein oder mehreren von a) einem Futterpelletierungsverfahren, b) einem dampfbeheizten Futtervorbehandlungsverfahren, c) Lagerung, d) Lagerung als ein Bestandteil in einer nicht pelletierten Mischung und e) Lagerung als ein Bestandteil in einer Futterbasismischung oder einer Futtervormischung, umfassend wenigstens eine Verbindung, ausgewählt aus Spurenmineralien, organischen Säuren, reduzierenden Zuckern, Vitaminen, Cholinchlorid und Verbindungen, die zu einer sauren oder einer basischen Futterbasismischung oder Futtervormischung führen.
2. Granulat nach Ausführungsform 1, wobei die wenigstens eine Beschichtung ein feuchtigkeitshydratisierendes Material umfasst, das wenigstens 55 Gew.-% des Granulats bildet.
3. Granulat nach Ausführungsform 1, wobei die wenigstens eine Beschichtung zwei Beschichtungen umfasst.
4. Granulat nach Ausführungsform 3, wobei die beiden Beschichtungen eine feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung und eine Feuchtigkeitssperrbeschichtung sind.
5. Granulat nach Ausführungsform 4, wobei die feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung zwischen 25 Gew.-% und 60 Gew.-% des Granulats liegt und die Feuchtigkeitssperrbeschichtung zwischen 2 Gew.-% und 15 Gew.-% des Granulats liegt.
6. Granulat nach Ausführungsform 5, wobei die feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung aus anorganischen Salzen, Sukrose, Stärke und Maltodextrin ausgewählt ist und die Feuchtigkeitssperrbeschichtung aus Polymeren, Gummi, Molke und Stärke ausgewählt ist.
7. Granulat nach Ausführungsform 1, wobei das aktive Mittel ein oder mehrere Enzyme ist.
8. Granulat nach Ausführungsform 1, wobei das Futterpelletierungsverfahren und das Futtervorbehandlungsverfahren zwischen 70°C und 95°C für bis zu mehrere Minuten durchgeführt wird.
9. Granulat nach Ausführungsform 1, wobei das Futterpelletierungsverfahren und das Futtervorbehandlungsverfahren zwischen 85°C und 95°C durchgeführt werden.
10. Granulat nach Ausführungsform 1, wobei die nicht pelletierte Mischung ein Verdünnungsmittel ist, ausgewählt aus ein oder mehreren Tonen, Weizen mittlerer Qualität oder Reiskleie.
11. Granulat nach Ausführungsform 1, wobei die Futterbasismischung oder die Futtervormischung Cholinchlorid umfasst und der aktive Bestandteil wenigstens ein Enzym ist, das wenigstens 80% Aktivität behält, wenn es in der Futterbasismischung oder Futtervormischung gelagert wird.
12. Tierfutterzusammensetzung, umfassend das Granulat nach Ausführungsform 1.
13. Tierfutterzusammensetzung nach Ausführungsform 12, ausgewählt aus einem Tierfutterverdünnungsmittel, einer Tierfutterbasismischung, einer Tierfuttervormischung, Brei und einem Tierfutterpellet.
14. Granulat für Tierfutter, umfassend: einen Kern; ein aktives Mittel, wobei das aktive Mittel des Granulats wenigstens 80% Aktivität nach der Lagerung und nach einem dampfbeheizten Pelletierungsverfahren behält, wobei das Granulat ein Bestandteil ist; eine Feuchtigkeitssperrbeschichtung; und eine feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung, die wenigstens 25 Gew.-% des Granulats ausmacht, wobei das Granulat eine Wasseraktivität von weniger als 0,5 vor dem dampfbeheizten Pelletierungsverfahren aufweist.
15. Granulat nach Ausführungsform 14, wobei die Feuchtigkeitssperrbeschichtung aus Polymeren und Gummi ausgewählt ist und das feuchtigkeitshydratisierende Material ein anorganisches Salz ist.
16. Granulat nach Ausführungsform 14, wobei die feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung zwischen 25 Gew.-% und 45 Gew.-% des Granulats ausmacht und die Feuchtigkeitssperrbeschichtung zwischen 2 Gew.-% und 10 Gew.-% des Granulats ausmacht.
17. Granulat nach Ausführungsform 14, wobei das aktive Mittel ein oder mehrere Enzyme ist.
18. Granulat nach Ausführungsform 14, wobei das dampfbeheizte Pelletierungsverfahren zwischen 85°C und 95°C für bis zu mehrere Minuten durchgeführt wird.
19. Granulat nach Ausführungsform 14, wobei wenigstens 80% Aktivität nach der Lagerung des Granulats in einer nicht pelletierten Mischung behalten werden, umfassend wenigstens eine Verbindung, ausgewählt aus Spurenmineralien, organischen Säuren, reduzierenden Zuckern, Vitaminen, Cholinchlorid und Verbindungen, die zu einer sauren oder einer basischen nicht pelletierten Mischung führen.
20. Tierfutterzusammensetzung, umfassend das Granulat nach Ausführungsform 14.
21. Tierfutterzusammensetzung nach Ausführungsform 20, ausgewählt aus einem Tierfutterverdünnungsmittel, einer Tierfutterbasismischung, einer Tierfuttervormischung, einer Tierfuttermischung und einem Tierfutterpellet.
22. Tierfutterbestandteil, umfassend: ein Granulat, umfassend einen Kern; ein aktives Mittel, das den Kern umgibt; und wenigstens eine Beschichtung, die das aktive Mittel umgibt, wobei das aktive Mittel wenigstens 50% Aktivität, wenigstens 60% Aktivität, wenigstens 70% Aktivität, wenigstens 80% Aktivität unter Bedingungen behält, ausgewählt aus ein oder mehreren von a) einem Futterpelletierungsverfahren, b) einem dampfbeheizten Futtervorbehandlungsverfahren, c) Lagerung, d) Lagerung als ein Bestandteil in einer nicht pelletierten Mischung und e) Lagerung als ein Bestandteil in einer Futterbasismischung oder einer Futtervormischung, umfassend wenigstens eine Verbindung, ausgewählt aus Spurenmineralien, organischen Säuren, reduzierenden Zuckern, Vitaminen, Cholinchlorid und Verbindungen, die zu einer sauren oder einer basischen Futterbasismischung oder Futtervormischung führen.
23. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 22, wobei wenigstens eine Beschichtung zwei Beschichtungen umfasst.
24. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 23, wobei die beiden Beschichtungen eine feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung und eine Feuchtigkeitssperrbeschichtung sind.
25. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 24, wobei die feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung ein Material umfasst, ausgewählt aus anorganischen Salzen, Kohlenhydraten, Maltodextrin und Stärke, und die Feuchtigkeitssperrbeschichtung ein Material umfasst, ausgewählt aus Polymeren, Proteinen, Lipiden, Fetten, Ölen, Fettsäuren, Gummi, Stärke, Lecithin und Wachs.
26. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 22, wobei der Kern und das aktive Mittel zusammen wenigstens 50 Gew.-% des Granulats ausmachen.
27. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 22, wobei der Kern und das aktive Mittel zusammen etwa 50 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-% des Granulats ausmachen.
28. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 22, wobei der Kern und das aktive Mittel etwa 90 Gew.-% bis etwa 100 Gew.-% des Granulats umfassen und das aktive Mittel ein inhärent thermostabiles Enzym ist.
29. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 22, wobei das aktive Mittel thermolabil ist.
30. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 22, ferner umfassend eine Futterzusammensetzung, wobei das Granulat in die Futterzusammensetzung dispergiert ist.
31. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 30, wobei die Futterzusammensetzung ein Futterpellet ist, das aktive Mittel, das in dem Futterpellet dispergiert ist, eine beibehaltene Aktivität aufweist, die wenigstens 50%, wenigstens 60%, wenigstens 70%, wenigstens 80% und wenigstens 90% einer Aktivität vor dem Pelletieren aufweist.
32. Tierfutterbestandteil nach Ausführungsform 30, wobei die Futterzusammensetzung aus Ton, essentiellen Nährstoffen, Getreiden, Weizen, Roggen, Reis und Mischungen davon ausgewählt ist.
33. Verfahren zur Herstellung eines Granulats, umfassend ein aktives Mittel für das Futter, wobei das Verfahren umfasst: Herstellen von stabilen Granulaten mit einem Kern, wenigstens einem aktiven Mittel und wenigstens einer Beschichtung; Mischen der stabilen Granulate zusammen mit ein oder mehreren von a) einem Verdünnungsmittel, b) einer Basismischung, c) einer Vormischung und d) einer Futtermischung zum Pelletieren.
34. Verfahren nach Ausführungsform 33, ferner umfassend den Schritt des Pelletierens der Futtermischung zum Pelletieren bei einer Temperatur von 70°C bis 95°C für bis zu mehrere Minuten.
35. Verfahren nach Ausführungsform 33, wobei die stabilen Granulate zusammen mit einem Ton vermischt werden.
36. Verfahren nach Ausführungsform 33, wobei die stabilen Granulate zusammen mit einer Vormischung vermischt werden, die Cholinchlorid umfasst.
37. Tierfutterzusammensetzung, hergestellt durch das Verfahren nach Ausführungsform 33.
38. Verfahren zur Herstellung eines stabilen Granulats, umfassend ein Enzym für die Lagerung in einer Futtervormischung, umfassend Cholinchlorid, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen eines Kernmaterials und eines Enzyms, wobei das Enzym in dem Kernmaterial verteilt ist oder über dem Kernmaterial beschichtet ist; Aufbringen eines feuchtigkeitshydratisierenden Materials auf das Kernmaterial und das Enzym, um eine Schicht zu bilden, die wenigstens 25 Gew.-% des stabilen Granulats beträgt; Beschichten der Schicht mit einem Feuchtigkeitssperrmaterial, um eine Beschichtung zu bilden, die wenigstens 5 Gew.-% des Granulats ausmacht, wobei das Aufbringen und Beschichten unter Bedingungen ausgewählt werden, die derart sind, dass eine Wasseraktivität des stabilen Granulats weniger als 0,5 beträgt.
39. Verfahren nach Ausführungsform 38, wobei das feuchtigkeitshydratisierende Material ein anorganisches Salz ist und die Schicht etwa 35 Gew.-% bis etwa 45 Gew.-% des stabilen Granulats beträgt.
40. Verfahren nach Ausführungsform 38, wobei die Beschichtung aus Polymeren und Gummi ausgewählt ist.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1222256 B1 [0032]
US 20060193897 A1 [0033]
EP 1257631 B1 [0052]
US 6852336 [0055]
US 4689297 [0063]
US 5324649 [0063, 0094]
EP 656058 B1 [0063]
US 454332 [0063]
US 6248706 [0063]
EP 804532 B1 [0063]
US 6534466 [0063]
WO 03/000625 [0064]
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WO 00/47060 [0118]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Granulat für Tierfutter, umfassend: einen Kern; einen Wirkstoff; und wenigstens eine Beschichtung; wobei das Granulat ein feuchtigkeitshydratisierendes Material umfasst, das wenigstens 25 Gew.-% des Granulats ausmacht, und wobei die Wasseraktivität des Granulats weniger als 0.5 beträgt.
Granulat gemäß Anspruch 1, bei dem das feuchtigkeitshydratisierende Material ein anorganisches Salz ist.
Granulat gemäß Anspruch 2, wobei das feuchtigkeitshydratisierende Material Natriumsulfat ist.
Granulat gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei das feuchtigkeitshydratisierende Material wenigstens 55 Gew.-% des Granulats ausmacht.
Granulat gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei die wenigstens eine Beschichtung eine feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung ist.
Granulat gemäß Anspruch 5, wobei die feuchtigkeitshydratisierende Beschichtung zwischen 25 und 60 Gew.-% des Granulats ausmacht.
Granulat gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei die wenigstens eine Beschichtung eine Feuchtigkeitssperrbeschichtung ist.
Granulat gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei das Granulat außerdem ein Feuchtigkeitssperrmaterial umfasst.
Granulat gemäß Anspruch 7, wobei die Feuchtigkeitssperrbeschichtung zwischen 2 und 10 Gew.-% des Granulats ausmacht.
Granulat gemäß Anspruch 1, wobei das aktive Mittel ein oder mehrere Enzyme sind.
Granulat gemäß Anspruch 10, wobei das aktive Mittel eine Citrobacterphytase ist.
Granulat gemäß Anspruch 1, wobei das aktive Mittel des Granulats wenigstens 80% der Aktivität nach einem Dampfpelletierverfahren behält, da es zwischen 85°C und 95°C für bis zu einige Minuten ausgeführt wird, worin das Granulat ein Bestandteil ist.
Granulat gemäß Anspruch 1, wobei das Granulat mit einer Vormischung, die Cholinchlorid umfasst, zusammengemischt wird.
Tierfutterzusammensetzung umfassend das Granulat von einem der vorhergehenden Ansprüche.
Tierfutterzusammensetzung gemäß Anspruch 14 ausgewählt aus einem Tierfutterverdünnungsmittel, einer Tierfutterbasismischung, einer Tierfuttervormischung, einer Tierfuttermischung und einem Tierfutterpellet.
Dampfbehandelte pelletierte Futterzusammensetzung, umfassend Granulate gemäß einem der Ansprüche 1–13.