DK201300009U1 - Stabile, holdbare granduler med aktive stoffer - Google Patents

Abstract

Et stabilt og holdbart granule til fodersammensætninger, der har en kerne, mindst et aktivstof og mindst en coating. Det aktive stof i granulet bibeholder mindst 50% aktivitet, mindst 60% aktivitet, mindst 70% aktivitet, mindst 80% aktivitet efter betingelser valgt blandt en eller flere af a) en foderpelleteringsproces, b) en dampopvarmet foderforbehandlingsproces, c) lagring, d) lagring som en ingrediens i en upelleteret blanding, og e) lagring som ingrediens i en foder basisblanding eller en foderforblanding omfattende mindst en forbindelse valgt blandt spormineraler, organiske syrer, reducerende sukkerarter, vitaminer, cholinchlorid, og forbindelser, som resulterer i en sur eller en basisk foderbasisblanding eller foderforblanding.

Description

i DK 2013 00009 U1

Stabile, holdbare granuler med aktive stoffer

Beskrivelse

RELATEREDE ANSØGNINGER

[0001] Denne ansøgning kræver prioritet under 35 USC § 119 fra U.S. Provisional Application Serial No. 60/726,494, indleveret den 12. oktober, 2005.

Opfindelsens område

[0002] Den foreliggende opfindelse angår stabile, holdbare granuler med aktivstoffer. Specifikt angår opfindelsen termostabile, holdbare granuler med aktivstoffer, hvilke granuler er særligt egnede til at indgå i vanddampbehandlingsprocesser, herunder pelleterings- og tabletteringsprocesser og dampbehandling af foder, uden væsentligt tab af aktivitet af aktivstoffet. De stabile, holdbare granuler har opløsningsprofiler der er egnede til at frigive aktivstoffet for at tilvejebringe virkning med det tilsigtede formål. Aktiviteten af aktivstofferne er bibeholdt efter lagring i upelleterede blandinger og dampbehandling.

Opfindelsens baggrund

[0003] Anvendelsen af aktivstoffer, såsom enzymer, i foder er almindelig. Enzymer er kendt for at forbedre fordøjeligheden af foder, reducere antiernæringsmæssige faktorer i foder, og forbedre dyreproduktionen. Det er kendt i branchen, at sure og basiske foderingredienser samt særlige ingredienser i dyrefoder, herunder, men ikke begrænset til spormineraler, organiske eller uorganiske syrer eller baser, reducerende sukkerarter og hygroskopiske stoffer, især cholinchlorid og natriumchlorid, har en negativ indvirkning på aktivstoffer, såsom andre vitaminer, proteiner, antimikrobielle midler, præbiotika, probiotika og enzymer, og er det endvidere kendt, at nogle produktionsprocesser for foder er skadelige for aktivstofferne.

[0004] Der eksisterer i industrien et problem med at lave beskyttende formuleringer, der gør aktivstofferne egnede til opbevaring i upelleterede foderblandinger, såsom basisblandinger og forblandinger, der kan være sure eller basiske og indeholde de ingredienser, der har en negativ virkning på stabiliteten af aktivstofferne. Én mekanisme for den negative virkning nævnes at være oxidations-reduktions-(redox) reaktioner, der foregår mellem oxiderende og reducerende forbindelser i foderforblandinger i nærvær af vand. En undersøgelse beskrevet i BASF Technical Bulletin NU0013 rapporterer, at to kommercielt tilgængelige enzymholdige granuler bibeholdt henholdsvis 86% og 81% aktivitet efter opbevaring i 3 uger i en foderforblanding og 55% og 33% aktivitet, henholdsvis efter opbevaring i foderforblandingen i 6 uger. I øjeblikket anbefaler nogle producenter af enzymer til foderindustrien, at enzymer beskyttes med 2 DK 2013 00009 U1 emballagebarrierer, hvis de skal lagres i forblandinger, eller at de lagres adskilt fra forblandinger, eller at de kun lagres i forblandinger i kort tid .

[0005] Derudover er mange aktive stoffer, der anvendes i fødevarer og foder, varmelabile. Termisk stabilitet af enzymer og deres evne til at overleve varmebehandlingstrin i fremstillingen af dyrefoder er et problem i industrien, især i produktionen af dyrefoderpellets. Sammenlignet med tørre foderblandinger, har foderpiller egenskaber, der er fortrukne af industrien, såsom forbedret foderkvalitet, færre patogener, lavere støvniveauer under fremstilling, gode håndteringsegenskaber og mere ensartet ingrediensdosering. Foretrukne pelleteringsprocesser i industri udnytter dampinjektion, i en proces kaldet konditionering, hvor fugt tilføres og temperaturen hæves inden pelleteringstrinnet, som så tvinger de dampopvarmede foderingredienser, eller konditioneret mæsk, gennem en dyse. Temperaturerne i pelleteringsprocessen kan være fra omkring 70°C til 95°C, eller højere.

[0006] Enzymer er vigtige foderingredienser og skal kunne modstå stadigt højere forarbejdningstemperaturer anvendt i foderpelleteringsprocesser, især processer, der anvender expanders, samtidig med at der stadig leveres in v/Vo-virkning.

[0007] På grund af dampen, temperaturen og kompressionskræfterne, der anvendes i pelleteringsprocessen, er stabiliteten af enzymer og andre aktivstoffer et problem, der illustreres af, at foderenzymer ofte leveres til industrien som stabiliserede flydende produkter, der tilsættes til foderpellets efter pelleteringsprocessen for at undgå enzyminaktivering. Ensartet dosering er et problem, når enzymet anvendes efter pelletering, for eksempel ved at sprøjte enzymet på pellets, og omkostningerne til udstyr for at tilføre enzym efter pelletering er høj. Alternativt tilsættes flydende enzymformuleringer eller tørre enzymblandinger til blanderen forud for pelletering. I visse tilfælde kan højere enzymeniveauer end nødvendigt tilsættes for at kompensere for tab under pelletering.

[0008] Tabletdannende processer bruger også kompressionskræfter og der anvendes måske eller måske ikke varme. Tabletter anvendes i husholdningsplejeindustrier, for eksempel til tøjvask, opvask og overfladerensning.

[0009] Der er et behov i fødevare-, foder-, og husholdningsplejeindustrien for stabile, holdbare granuler med aktive ingredienser til anvendelse som komponenter i formuleringer, som udsættes for dampbehandling, for eksempel, pelleterings- og tabletteringsprocesser, uden væsentligt tab af aktivitet af aktivstof og med opløsningsprofiler der er egnede til at frigive de aktive bestanddele for at tilvejebringe virkning til det tilsigtede formål. Der er også et behov for stabile, holdbare granuler med aktivstoffer, der bibeholder deres aktivitet, når de anvendes som bestanddele i dyrefoderformuleringer, såsom upelleterede blandinger, der indeholder ingredienser, som skader aktivestoffer.

SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN

[0010] Den foreliggende opfindelse angår granuler til fodersammensætninger omfattende: 3 DK 2013 00009 U1 en kerne; et aktivstof; og mindst en coating, hvor aktivstoffet i granulet bibeholder mindst 50% aktivitet, mindst 60% aktivitet, mindst 70% aktivitet, mindst 80% aktivitet efter betingelser valgt blandt en eller flere af a) en foderpelleteringsproces, b) en dampopvarmet foderforbehandlingsproces, c) lagring, d) lagring som en ingrediens i en upelletet blanding, e) lagring som bestanddel i en foderbasisblanding eller en foderforblanding, omfattende mindst en forbindelse valgt blandt spormineraler, organiske syrer, reducerende sukkerarter, vitaminer, cholinchlorid, og forbindelser, som resulterer i en sur eller en basisk foderbasisblandingen eller foderforblanding.

[0011] I en udførelsesform for den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt et granule til dyrefoder, omfattede: en kerne; et aktivstof, hvor aktivstoffet i granulet bibeholder mindst 80% aktivitet efter lagring og efter en dampopvarmet pelleteringsproces, hvor granulet er en bestanddel; en fugtighedsbarrierecoating; og en fugtighedshydratiseringscoating, der udgør mindst 25% vægt/vægt af granulet, hvor granulet har en vandaktivitet på mindre end 0,5 inden den dampopvarmede pelleteringsproces.

[0012] I endnu en udførelsesform for den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt en dyrefoderingrediens omfattende: et granule omfattende en kerne; et aktivstof der omgiver kernen; og mindst en coating, der omgiver aktivstoffet, hvor aktivstoffet bibeholder mindst 50% aktivitet, mindst 60% aktivitet mindst 70% aktivitet, mindst 80% aktivitet efter betingelser valgt blandt en eller flere af a) en foderpelleteringsproces, b) en dampopvarmet foderforbehandlingsproces, c) lagring, d) lagring som en bestanddel i en upelleteret blanding, og e) lagring som bestanddel i en foderbasisblanding eller en foderforblanding indeholdende mindst en forbindelse valgt blandt spormineraler, organiske syrer, reducerende sukkerarter, vitaminer, cholinchlorid, og forbindelser, som resulterer i en sur eller en basisk foderbasisblanding eller foderforblanding.

[0013] Ved en fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse til fremstilling af et granule, der omfatter et aktivstoftil foder, omfatter fremgangsmåden: fremstilling af stabile granuler med en kerne, mindst et aktivstof; og mindst en coating; blanding af de stabile granuler med en eller flere af a) et fortyndingsmiddel, b) en basisblanding, c) en forblanding, og d) en foderblanding til pelletering.

[0014] I en anden udførelsesform af den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af et stabilt granule omfattende enzym til lagring i en foderforblanding indeholdende cholinchlorid, hvilken fremgangsmåde omfatter: tilvejebringelse af et kernemateriale og enzym, hvor enzymet er fordelt i hele kernematerialet eller placeret i lag ovenpå kernematerialet; tilsætning af et fugtighedshydratiserende materiale til kernematerialet og enzym til dannelse af et lag, der er mindst 25% vægt/vægt af det stabile granule; coating af laget med et fugtighedsbarrieremateriale til dannelse af en coating, der er mindst 2 % vægt/vægt af granulet, hvor anvendelse og coating er under betingelser,der er udvalgt således at en vandaktivitet på den stabile granule er mindre end 0,5.

[0015] Stabile, holdbare granuler af de ovennævnte udførelsesformer bibeholder mindst 4 DK 2013 00009 U1 50%, mindst 60%, mindst 70%, mindst 80%, mindst 90%, og mindst 95% af aktivstoffets aktivitet under betingelser med dampopvarmet pelletering eller forbehandlingsprocesser, der øger temperaturen af det pelleterede materiale til så højt som 85°C til omkring 95°C i op til omkring flere minutter. De stabile, holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse er særligt egnede som bestanddele i dyrefoderpellets, og som ingredienser i tabletter til husholdningspleje.

[0016] I udførelsesformer ifølge den foreliggende opfindelse, indbefatter stabile varige granuler et fugtighedshydratiserende materiale, der udgør mindst omkring 55% vægt/vægt af granulet.

[0017] I andre udførelsesformer for den foreliggende opfindelse, har en stabil holdbar granule en fugtighedhydratiserende coating, der omfatter mindst omkring 25%, omkring 30%, omkring 35%, omkring 40%, omkring 50%, omkring 55% og omkring 60% vægt/vægt af granulet og en fugtighedsbarrierecoating, der omfatter mindst omkring 2% til omkring 40% vægt/vægt, omkring 2% til omkring 10%, omkring 2% til omkring 7%, og omkring 5% til omkring 15% af granulet.

[0018] I udførelsesformer ifølge den foreliggende opfindelse, indbefatter en stabil holdbar granule tre beskyttende coatings hvori en coating omfatter et fugtighedshydratiserende materiale på omkring 20% til 25% vægt/vægt af granulet og de to andre coatings omfatter et fugtighedsbarrieremateriale på omkring 5% til omkring 15% vægt/vægt af granulet. I denne udførelsesform anvendes et varme-sammensmeltningstrin til at sammensmelte fugtighedsbarrierematerialet.

[0019] I udførelsesformer for den foreliggende opfindelse omfatter en stabil holdbar granule en silicat- eller lerkerne og et aktivstof med en iboende termostabilitet i en matrix; en valgfri uorganisk salt-fugtighedshydratiserende beskyttende coating, og en valgfri fugtighedsbarrierecoating. I denne udførelsesform udgør de valgfrie coatings omkring 0% til omkring 15% vægt/vægt af granulet.

[0020] Den foreliggende opfindelse omfatter endvidere fremgangsmåder til fremstilling af de stabile, holdbare granuler samt foderpiller, foder til kæledyr, og husholdningspleje-og fødevaretabletter indeholdende sådanne stabile, holdbare granuler.

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

[0021] Den foreliggende opfindelse tilvejebringer stabile, holdbare granuler med aktivstoffer, der kan modstå både høje temperaturer og kompressionskræfter når de tilsættes til formuleringer underkastet for eksempel, forbehandlinger med opvarmet damp, foderpelleteringsprocesser og tabletteringsprocesser, samtidig med at have opløsningsprofiler egnet til at frigive aktivstoffer, der er i stand til at give effekt med hensyn til det tilsigtede formål, bibeholdes.

[0022] Et første aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringer overraskende stabile holdbare granuler med foderaktive stoffer, der kan modstå dampforbehandlinger og dampopvarmet procestemperaturer til foderpelletering og kompressionskræfter 5 DK 2013 00009 U1 under bibeholdelse af opløsningsprofiler, der frigiver aktivstoffer til tilvejebringelse af tilsigtet effekt. I denne udførelsesform er de granulære komponenter fortrinsvis godkendt til anvendelse i foder.

[0023] Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringer stabile, holdbare granuler med enzymer, der kan modstå dampopvarmet foderforbehandling og pelleteringsprocestemperaturer og kompressionskræfter under bibeholdelse af opløsningsprofiler, der frigiver enzymet til tilvejebringelse af in vivo biotilgængelighedseffekt. I denne udførelsesform er granulære komponenter spiselige af dyr, og fortrinsvis også fordøjelige.

[0024] Et tredje aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringer stabile, holdbare granuler med aktivstoffer til upelleterede dyrefoderblandinger, f.eks forblandinger. De stabile, holdbare granuler bevarer effektivitet, når den upelleterede blanding er varme-og dampforbehandlet før fodring til dyr, eller efter upelleterede blanding er pelleteret. I dette aspekt af opfindelsen, bibeholder aktivstofferne overraskende aktivitet ved lagring i upelleterede blandinger, der indeholder bestanddele, der er skadelige for enzymstabilitet. Uden at ønske at være bundet af nogen bestemt teori, antages det i dette aspekt af opfindelsen, at et fugtighedshydratiserende materiale i granulerne virker i kombination med et fugtighedsbarrieremateriale i granulerne til beskyttelse af den aktive bestanddel mod de skadelige bestanddele i upelleterede blandinger. Det fugtighedshydratiserende materiale forsinker eller reducerer hastigheden eller omfanget af vandring af vand ind i området med det aktive stof, og fugtighedsbarrierematerialet udelukker vand. Kombinationen af fugtighedshydratiserende materiale og fugtighedsbarrieremateriale tilvejebringer mekanisk stabilitet der yderligere beskytter aktivestoffet i tilfælde af, at et lag af en fugtighedsbarrieremateriale er beskadiget. I visse udførelsesformer af den foreliggende opfindelse, anvendes endvidere fugtighedsbarrierematerialer, som kun oxiderer under ekstreme betingelser, hvilket i kombination med fugtighedshydratiserende materialer gør, at granulerne er kemisk stabile, fordi det antages, at redoxreaktioner reduceres under lagring af granulerne i upelleterede materialer.

[0025] Et fjerde aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringer stabile, holdbare granuler med aktivstoffer, der kan modstå tabletteringsprocedurer og samtidig bevare opløsningsprofiler, der frigiver aktivstoffet for at tilvejebringe virkning i husholdningspleje, såsom tøjvask, opvask, og overfladerensning. I denne udførelsesform kan granulære bestanddele indbefatte materialer, der ikke fordøjes af dyr, for eksempel, overfladeaktive midler, zeolitter, blegemidler og farvestoffer.

[0026] De stabile, holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse, er sfæriske eller næsten sfæriske granuler, skønt andre former, såsom skiver, ovale, cylindriske og aflange former kan anvendes om ønsket. Granulerne har et eller flere beskyttende lag, der omgiver aktivstoffet.

[0027] Granulerne kan blandes sammen med tørre bestanddele, såsom foder eller formuleringer til husholdningspleje eller upelleterede foderblandinger, for eksempel, forblandingsformuleringer, inden anvendelse i en pelleterings eller tabletteringsproces, eller anvendes i tørre foderblandinger og mæsk, der ikke er pelleteret. Granulerne er 6 DK 2013 00009 U1 særligt egnede til anvendelse i fremstillingsprocesser til foderpelletering, og er også egnede til fødevarer, herunder foder til kæledyr, og fremstillingsprocesser til fremstilling af husholdningsplejetabletter.

[0028] Medmindre andet er defineret, har alle tekniske og videnskabelige udtryk anvendt heri, den samme betydning som almindeligt forstået af en med almindelig fagkundskab inden for teknikken, hvortil denne opfindelse hører. Som anvendt i beskrivelsen og kravene, indbefatter entals "en/et" og "den/det" også flertalsreferencer med mindre sammenhængen klart dikterer noget andet. For eksempel kan udtrykket granule omfatte et antal granuler.

[0029] Med hensyn the denne beskrivelse, kan "aktivstoffet" være ethvert materiale, der sættes til et stabilt, holdbart granule. Aktivstoffet kan være et biologisk levende materiale, en fødevare- eller foderstofbestanddel, et antimikrobielt stof, et antibiotisk erstatningsstof, et præbiotikum, et probiotikum, en agrokemisk bestanddel, såsom et pesticid, gødningsstof eller herbicid; en farmaceutisk bestanddel eller en aktiv husholdningsplejebestanddel eller kombinationer deraf. I en foretrukken udførelsesform er den aktive bestanddel et protein, enzym, peptid, polypeptid, aminosyre, kulhydrat, lipid eller olie, vitamin, co-vitamin, eller hormon, eller kombinationer deraf. I en anden udførelsesform er den aktive bestanddel et enzym, blegemiddel, blegeaktivator, parfume eller en anden biologisk aktiv bestanddel. Aktivstoffer, med en iboende termostabilitet, er omfattet af den foreliggende opfindelse og udviser forøget termostabilitet i granulerne ifølge den foreliggende opfindelse. Alternativt kan der anvendes mindre coatningsmateriale ved fremstilling af granuler med aktivestoffer med en iboende termostabilitet, og mængderne af beskyttende coatningsmateriale angivet heri, er primært blevet valgt til aktivestoffer, som ikke selv er termostabile.

[0030] De mest foretrukne aktive bestanddele i fødevare- og foderanvendelser er enzymer, peptider og polypeptider, aminosyrer, antimikrobielle midler, tarmsundhedsfremmende stoffer, vitaminer og kombinationer deraf.

[0031] Et hvilket som helst enzym kan anvendes, og en ikke-begrænsende liste af enzymer indbefatter phytaser, xylanaser, β-glucanaser, phosphataser, proteaser, amylaser (alfa eller beta eller glucoamylaser) cellulaser, lipaser, cutinaser, oxidaser, transferaser, reduktaser, hemicellulaser, mannanaser, esteraser, isomeraser, pectinaser, lactases, peroxidaser, laccaser, andre redox-enzymer og blandinger deraf.

[0032] Særligt foretrukne enzymer indbefatter en xylanase fra Trichoderma reesei og en xylanasevariant fra Trichoderma reesei, begge tilgængelige fra Danisco A/S, Danmark, og/eller Genencor International, Inc., Palo Alto, Californien, eller den iboende termostabile xylanase beskrevet i EP1222256B1, samt andre xylanaser fra Aspergillus niger, Aspergillus kawachii, Aspergillus tubigensis, Bacillus circulans, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Neocallimastix patricianum, Penicillium arter, Streptomyces lividans, Streptomyces thermoviolaceus, Thermomonospora fusca, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei, Trichoderma vinde; eksempler på phytaser er Finase L®, en phytase fra Aspergillus sp., tilgængelig fra AB Enzymes, Darmstadt, Tyskland.

TM

Phyzyme XP, en phytase fra E. coli, tilgængeligt fra Danisco, København, Danmark, 7 DK 2013 00009 U1 og andre phytaser fra for eksempel følgende arter: Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Buttiauxella, Citrobacter, Enterobacter, Penicillium, Humicola, Bacillus, og Peniophora.

[0033] Et eksempel på en cellullase er Multifect® BGL, en cellulase (beta-glucanase), tilgængelig fra Danisco A/S, Danmark, og andre cellulaser fra arter såsom Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Humicola, Bacillus, Cellulomonas, Penicillium, Thermomonospore, Clostridium, og Hypocrea. Cellulaserne og endoglucanaserne beskrevet i US20060193897A1kan også anvendes. Amylaser kan for eksempel være fra arter, såsom Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Bacillus, foreksempel, B. subtilis, B. stearothermophilus, B. lentus, B. licheniformis, B. coagulans, og B. amyloliquefaciens. Egnede svampeamylaser kommer fra Aspergillus, såsom A. Oryzae og A. niger. Proteaser kan være fra Bacillus, amyloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis og Aspergillus- og Trichodermaarter.

[0034] Phytaser, xylanaser, phosphataser, proteaser, amylaser, esteraser, redox-enzymer, lipaser, transferaser, cellulaser og β-glucanaser er enzymer, der ofte anvendes til at indgå i dyrefoder. Enzymer egnede til inkorporering i tabletter til husholdningsplejeanvendelser er tilsvarende, især proteaser, amylaser, lipaser, hemicellulaser, redoxenzymer, peroxidaser, transferaser, og cellulaser.

[0035] I særligt foretrukne aspekter af opfindelsen er enzymerne valgt blandt phytaser, xylanaser, beta-glucanaser, amylaser, proteaser, lipaser, esteraser og blandinger deraf.

I én udførelsesform for den foreliggende opfindelse, er to enzymer, en xylanase og en beta-glucanase, tilvejebragt i granulet. Enzymerne kan blandes sammen eller påføres separat på granulet. I en anden udførelsesform er tre enzymer, nemlig beta-glucanase, xylanase og phytase, tilvejebragt i granulet.

[0036] Ovenstående enzym lister er kun eksempler og er ikke ment som værende udtømmende. Ethvert enzym kan anvendes i de holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse, herunder vildtype, rekombinante og enzymevarianter stammende fra bakterier, svampe, gær, planter, insekt og dyr, samt sure, neutrale eller alkaliske enzymer.

[0037] Det vil forstås af fagfolk på området, at mængden af enzym, der anvendes, afhænger mindst delvis, af enzymetypen og enzymets egenskaber og den påtænkte anvendelse.

[0038] De holdbare granuler ifølge opfindelsen omfatter mellem omkring 0,0005 til omkring 20% på tørvægtsbasis af enzymkomponenten i granulet. For eksempel omfatter vægtprocenten af enzym i udførelsesformer af opfindelsen mindst 0,0005 til omkring 15%, mindst 0,001 til omkring 15%, mindst 0,01 til omkring 10%, mindst 0,1 til omkring 10%, mindst 1,0 til omkring 10%, mindst 1,0 til omkring 8%, mindst 1,0 til omkring 5%, og mindst 2,0 til mindst 5% i granulet. Typiske doser på 25 to 400 g af de stabile, holdbare enzymgranuler per ton foder vil give omkring 0,0001 til omkring 80 g aktivt enzymprotein pr ton foder, og enzymgranulerne kan doseres så højt som 5000 g pr ton foder. Doser for andre aktive bestanddele er typisk 0,001 til omkring 400 g/ton af foderet, eller højere. Doseringer kan være endnu højere, når de termostabile granuler ifølge den foreliggende opfindelse anvendes som en bestanddel af upelleterede 8 DK 2013 00009 U1 foderblandinger, f.eks forblandinger, som kan indeholde flere aktivstoffer og som tilsættes til foderblandinger. For eksempel kan den dosis af enzymgranuler der tilsættes til en forblanding være omkring 0,2% til 10% af forblandingen, eller omkring 0,1.% til omkring 3% af en basisblanding. I et eksempel på en udførelsesform, er aktivitetsniveauet af phytaseindeholdende, stabile, holdbare granuler anbragt i en forblanding omkring 500 U/g eller højere. Forblandinger tilsættes typisk til kosten i en mænde på omkring 0,5% til omkring 2%, og basisblandinger tilsættes i en mængde på omkring 2% til omkring 6%.

[0039] Den del af det holdbare granule uden de(n) beskyttende coating(er) ifølge opfindelsen, som omfatter den aktive bestanddel, inklusiv faste processeringsstoffer, bindemidler og andre ingredienser deri, kan omfatte mindre end omkring 70 vægt-%, mindre end omkring 60 vægt-%, mindre end omkring 50 vægt-%, mindre end 40 vægt-%, mindre end omkring 30 vægt-%, og mindre end omkring 20 vægt-% af granulet, hvor vægtprocenten generelt er omkring 25% til omkring 50% vægt/vægt, omkring 40 % til omkring 60%, eller omkring 50% til omkring 60%.

[0040] Coatinglag(et/ene) kan omfatte mere end omkring 30 vægt-%, mere end omkring 40 vægt-%, mere end omkring 50 vægt-%, mere end omkring 60 vægt-%, mere end omkring 70 vægt-%, og mere end omkring 80 vægt-% af granulet, hvor vægtprocenten generelt er omkring 50% til omkring 75% vægt/vægt, 40% til omkring 60% eller omkring 40% til omkring 50%, afhængig af type og antal af coatinglag.

[0041] I udførelsesformer, der udnytter et aktivstof med en iboende termostabilitet kan kernen udgøre så meget som omkring 85 til omkring 100% vægt/vægt af granulet og coatingen kan udgøre omkring 0% til omkring 15% vægt/vægt af granulet.

[0042] De holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse kan dimensioneres som det ønskes og er mellem omkring 300 pm til omkring 1000 pm i diameter, omkring 300 pm til omkring 900 pm, omkring 400 pm til omkring 800 pm, og omkring 400 pm til omkring 600 pm.

[0043] "Kompressionskræfter" refererer med hensyn til denne beskrivelse generelt til aksialt påførte kræfter, der får atomerne i et materiale til at komprimere. Kompressionskræfter, som det anvendes heri, forekommer i pelleterings- og tabletteringsprocesser og kan omfatte et element af flexibilitet i trykket, hvor de anvendte kræfter ikke er helt symmetriske med hensyn til længdeaksen af materialet.

[0044] Et "enzym eller protein med iboende termostabilitet" refererer til enzymer og proteiner med et smeltepunkt, der er over omkring 60°C til omkring 65°C, for eksempel har det i tabel 2 anvendte enzym med iboende termostabilitet til granule 28, 29 og 30, et smeltepunkt på 69°C ved et pH på 5,5 og et smeltepunkt på 72°C ved et pH på 8,0. En række af de termolabile enzymer, der er nævnt igennem hele beskrivelsen har for eksempel et smeltepunkt på under 60°C ved pH-værdier på 5,5 og 8,0.

[0045] "Fugtighedsbarrierematerialer" refererer til materialer, der udelukker, forhindrer eller væsentligt forsinker vandoptagelse. Disse materialer er typisk hydrofobe eller amfifile, giver isolation mod vand og absorberer og/eller binder ikke selv vand og 9 DK 2013 00009 U1 indbefatter, men er ikke begrænset til, filmdannende materialer. Eksempler på fugtighedsbarrierematerialer indbefatter polymerer, proteiner, lipider, fedtstoffer og olier, fedtsyrer og gummier. Eksempler på filmdannende fugtighedsbarrierematerialer er naturlige og modificerede polymerer, såsom gummi arabicum, valle, valleproteinkoncentrat, PVA, herunder modificeret PVA og syntetiske polymerer, såsom latex, HPMC, og syrefortyndet hydroxypropylstivelse, f.eks; PureCote™, oxideret stivelse og modificeret stivelse. Ikke-filmdannende fugtighedsbarrierematerialer indbefatter for eksempel voksarter, fedtstoffer, olier og lipider, og lecithin. Udvalgte fugtighedsbarrierematerialer, der ikke let oxiderer er for eksempel, latexpolymer og polymerer, såsom gummi arabicum.

[0046] "Fugtighedshydratiserende materialer" referer til materialer, der optager vandige væsker, såsom vand, ved en af adskillige mekanismer. I en første mekanisme, absorberer materialerne frit vand. I en anden mekanisme, optager materialerne bundet vand, der almindeligvis er til stede som krystallinske hydratiseringsvand. Derfor kan materialerne tilvejebringes som delvis eller fuldstændig hydratiserede materialer eller som ikke-hydratiserede materialer, som vil absorbere eller binde vandige væsker og forsinke eller reducere hastigheden eller omfanget af bevægelse af sådanne væsker til aktivstoffet. I en tredje mekanisme, isolerer fugtighedshydratiserende materialer termisk det aktive middel ved at forsinke varmeoverførsel til aktivstoffet i granulet og ved at opretholde aktivstoffet ved en lavere temperatur end temperaturen på den ydre overflade af granulet. Fugtighedshydratiserende materialer indbefatter kulhydrater og uorganiske salte, herunder hydratiserede salte, såsom magnesiumsulfat, natriumsulfat og ammoniumsulfat, maltodextrin, sukkere, f.eks saccharose, og majsstivelse.

[0047] I eksempler på udførelsesformer for den foreliggende opfindelse er fugtighedshydratiserende materialer uorganiske salte, som, når de tilsættes til granulet ved højere mængder end omkring 25% vægt/vægt, er vandfrie eller indeholder relativt lave mængder bundet eller frit vand, således at vandaktiviteten af det færdige granule er mindre end 0,5. Uden at ønske at være bundet af nogen bestemt teori, når granulet underkastes dampopvarmningsprocesser, vil det fugtighedshydratiserende uorganiske salt-materiale begynde at optage vand fra dampopvarmningsbehandlingen, vandet bevæger sig ind i det fugtighedshydratiserende materiale ved en kinetisk proces over et kort tidsrum af dampbehandlingen og derved forhindres vandet i at trænge ind i det område af granulet, der indeholder aktivstoffet. Med en vandaktivitet af granulet på mindre end 0,5, kan det fugtighedshydratiserende materiale i disse udførelsesformer udgøre så lidt som 25% vægt/vægt af granulet. I udførelsesformer med fugtighedshydratiserende materialer der udgør omkring 40-70% vægt/vægt af granulet, tillader det tykkere lag af fugtighedshydratiserende materiale brugen af hydratiserede eller delvist hydratiserede materialer, især uorganiske salte. Til formål for denne beskrivelse refererer "hydratiseret", "delvis hydratiseret" og "ikke-hydratiseret” til et materiales hydratiseringspotentiale, når granulet er i ligevægt før det bliver udsat for dampopvarmning. Et "hydratiseret" materiale referer til et materiale, som indeholder vand i fri eller bundet form, eller en kombination deraf. Vand kan tilsættes enten under eller efter coatingprocesser og graden af hydratisering af granulet er en funktion af de granulære materialer og temperatur-, fugtigheds- og tørringsbetingelserne, hvorunder de anvendes.

10 DK 2013 00009 U1

[0048] "Pellets" og "pelletering" henviser til faste afrundede, sfæriske og cylindriske tabletter eller pellets samt processerne til dannelse af sådanne faste former, især foderpellets og fast, ekstruderet dyrefoder. Kendte fremstillingsprocesser til foderpelletering omfatter generelt sammenblanding af foderingredienser i omkring 1 til omkring 5 minutter, overføring af blandingen til en hopper, fremføring af blandingen til en dampbehandler, eventuelt overføre den dampbehandlede blanding til en ekspander, overføre blandingen til pelleteringsapparatet eller -ekstruderen, og endelig overførsel af pellets til en pelletafkøler. Fairfield, D. 1994. Kapitel 10, Pelleting Cost Center. In, Feed Manufacturing Technology IV. (McEllhiney, editor), American Feed Industry Association, Arlington, VA, pp. 110-139.

[0049] Dampbehandleren behandler blandingen i omkring 20 til omkring 90 sekunder og i op til flere minutter, ved omkring 85°C til omkring 95°C. Mængden af damp kan variere i overensstemmelse med mængden af fugt og foderblandingens udgangstemperaturen. Omkring 4% til 6% tilsat damp er rapporteret i pelleteringsprocesser, og mængden er valgt til at producere mindre end omkring 18% vand i mæsken før pelletering, eller op til omkring 28% fugtighed i mæsk, der er beregnet til ekstrudering.

[0050] En valgfri expanderproces foregår i omkring 4 til omkring 10 sekunder ved en temperatur i området omkring 100 °C til omkring 140 °C. Pellet formalingsdelen af fremstillingsprocessen varer typisk i omkring 3 til omkring 5 sekunder ved en temperatur på omkring 85 °C til omkring 95 °C.

[0051] Et "stabilt" granule refererer til et granule, hvor aktiviteten af de(t) aktive stof(fer) i det væsentlige opretholdes efter optagelsen af dette som en ingrediens i en formulering der underkastes dampopvarmede forbehandlingsprocesser, dampopvarmede pelleteringsprocesser, dampopvarmede tabletteringsprocesser, efter opbevaring alene og efter opbevaring som en ingrediens i upelleterede og utabletterede blandinger. Stabilitet omfatter termostabilitet, holdbarheds- og opbevaringsstabilitet, mekanisk stabilitet og/eller kemisk stabilitet, når granuler indeholdende det aktive stof lagres i upelleterede eller utabletterede blandinger og/eller udsættes for dampopvarmede og trykudøvende pelleteringsprocesser og tabletteringsprocesser. Mekanisk stabilitet refererer til fysisk robusthed eller strukturel integritet af granuler, hvilken strukturel integritet omfatter modstandsdygtighed over for mikroorganismer, modstandsdygtighed overfor støvdannelse, og modstandsdygtighed overfor frigivelse af ingredienser, som kan resultere i dannelse af lugt. Kemisk stabilitet refererer til i det væsentlige opretholdelse af aktivitet, når granulerne er lagret i upelleterede eller utabletterede blandinger sammen med ingrediense(r) der er skadelig(e) for de(t) aktive stof(fer). Termostabilitet er yderligere defineret heri, og henviser generelt til opretholdelse af aktivitet efter udsættelse for temperaturer på op til omkring 85 °C til 95 °C, når de stabile, holdbare granuler er en ingrediens i pellets, tabletter og upelleterede og utabletterede blandinger.

[0052] "Tablettering" henviser til fremgangsmåder til dannelse af faste snegle eller tabletter ved komprimering af en blanding af ingredienser i en tabletpresse som beskrevet i REP 1 257 631B 1, der herved er inkorporeret som reference.

11 DK 2013 00009 U1

[0053] Tabletter kan fremstilles ved direkte kompressionstablettering af blandinger af aktivstoffer, fyldstoffer/bindere, smøremidler og andre valgfrie ingredienser. Det aktive stof blandes grundigt med de andre tabletbestanddele før indføring i tabletteringsmaskinen. Ingredienser blandes i en egnet blandeindretning, såsom en twin shell blander eller lignende apparat, eller ved hjælp af en hvilken som helst blandingsmetode, der resulterer i blanding af indholdsstofferne i tabletten.

[0054] Blandingerne presses derefter til tabletter under anvendelse af en tabletteringsmaskine, såsom en tabletpresse (Stokes Model R-4, Warminster, PA). Tabletpressere har generelt øvre og nedre formtilpassende stempler, der passer ind i en matrice fra over og under matricen. Blandet tabletmateriale fyldes i matricehulrummet og mindst et af stemplerne, typisk det øvre stempel, bevæges ind i matricehulrummet. Tryk påføres både de øvre og nedre stempler. Bevægelsen mod hinanden af de øvre og nedre stempler, påfører tryk på materialet mellem stemplerne, hvorved der dannes en tablet.

[0055] Der kan fremstilles mange forskellige former for tabletter. Tabletform bestemmes af udformningen af stemplerne. Komprimeringskræfterne varierer afhængigt af stempelgeometrien, instrumenttype, og den anvendte formulering. Alternativt kan tabletter fremstilles ved anvendelse af tør-eller vådgranulering som beskrevet i US Pat. No. 6,852,336, som herved er inkorporeret i sin helhed som reference. 336-patentet angiver, at tørgranuleringsprocedurer kan anvendes, når en af komponenterne, der skal tabletteres, har tilstrækkelige kohæsive egenskaber. Fremgangsmåden blander bestanddelene med et smøremiddel, hvis det kræves. I vådgranuleringsproceduren blandes den tørre bestanddel under anvendelse af en twin Shell blander eller dobbelt-kegleblander under forskydningsblandingsbetingelser, hvorefter der tilføres opløsninger af et bindemiddel til de blandede pulvere til opnåelse af et granule.

[0056] Et "termostabilt" granule refererer til et granule, der har et aktivt stof, der bibeholder mindst 50%, mindst 60%, mindst 70%, mindst 80%, mindst 90%, og mindst 95% af sin aktivitet, målt med et konventionelt assay, der er specifikt for det valgte aktivstof, efter inklusion i en formulering, og udsættelse for varme eller varme og damp, således at formuleringen når temperaturer på op til omkring 85 °C til omkring 95 °C i op til flere minutter. Fagfolk inden for området vil erkende, at termostabile granuler i formuleringerne der udsættes for temperaturer under 85 °C er stabile, og testresultater udført ved 80 ° C fastslår, at dette er tilfældet. Det skal derfor forstås, at op til 85 °C til 95 °C betyder at temperaturer under 85 ° C er omfattet, som derfor indgår i omfanget af denne opfindelse.

[0057] I en udførelsesform henviser "termostabilt" til et aktivtstof, der bibeholder mindst 80% af dets aktivitet målt ved et konventionelt assay specifikt for den valgte aktive bestanddel efter inklusion i en formulering, udsat for damp, således at formuleringen når temperaturer på omkring 85 °C - 95 °C i omkring 30 sekunder. I endnu en udførelsesform henviser termostabil til et aktivtstof, der bibeholder mindst 50% af dets aktivitet målt ved en konventionel fremgangsmåde som er specifik for den valgte aktive bestanddel efter inklusion i en formulering, udsat for damp, således at formuleringen når temperaturer på omkring 85 °C - 95 °C i omkring 30 sekunder.

12 DK 2013 00009 U1

[0058] "Upelleterede blandinger" refererer til forblandinger eller precurserer, basisblandinger, mæsk og fortyndingsmidler. Forblandinger indeholder typisk vitaminer og spormineraler. Basisblandinger indeholder typisk fødevarer og foderingredienser såsom dicalciumphosphat, kalksten, salt og et vitamin og mineralforblanding, men ikke korn og proteiningredienser. Fortyndingsmidler indbefatter, men er ikke begrænset til kornsorter (f.eks hvedefodermel og risklid) og lerarter, såsom phyllosilicater (magnesium silikat sepiolit, bentonit, kaolin, montmorillonit, hectorit, saponit, beidellit, attapulgit, og stevensit). Ler fungerer i foderforblandinger også som bærere og fluidiseringsmiddel, eller fortyndingsmidler. Mæsk omfatter typisk en komplet animalsk kost.

[0059] De stabile granuler ifølge den foreliggende opfindelse kan tilsættes til disse upelleterede blandinger, samt mæsk blandinger, der efterfølgende kan behandles med damp og/eller damppelleteres eller tørres.

[0060] "Vandaktivitet", symboliseret med aw, refererer til den fraktionelle relative fugtighed i en atmosfære i ligevægt med et stof i fast eller flydende fase, dvs forholdet mellem partialtrykket af vanddamp og det som findes over rent vand ved den samme temperatur. I alle faser imellem hvilke vandfordelingen har nået ligevægt, er det per definition ens. Udtrykket "relativ fugtighed" anvendes generelt til at beskrive vand i atmosfæren eller gasfase i ligevægt med det faste stof, og udtrykkes som en procentdel, med 100% som den relative fugtighed af rent vand i et lukket system. For enhver vandaktivitet, er der en tilsvarende relativ luftfugtighed givet ved% RH = 100*aw. Vandaktivitet kan let måles ved fremgangsmåder kendt inden for teknikken, typisk ved at anbringe en prøve af materialet inde i et temperaturstyret kammer i en vandaktivitetsmåler, såsom water Activity System Model D2100, tilgængelig fra Rotronic Instrument Corp (Huntington, NY), og lade målingen nå til ligevægt, som vist på displayet. Vandaktiviteten refereret til heri, er det som granulet selv besidder efter påføring af alle coatinger.

[0061] Den foretrukkne vandaktivitet for granulerne ifølge den foreliggende opfindelse er, især når ydre polymercoatinger anvendes, mindre end 0,5.

[0062] Det stabile, holdbare granule ifølge den foreliggende opfindelse er et granule, der kan fremstilles ved enhver proces, der resulterer i anvendelsen af et eller flere beskyttende coatinger på en kerne. Det aktive stof kan være en del af kernen i granulet, eller kan være coatet på et kernemateriale, og med henblik på denne beskrivelse refererer en kerne til alle dele af det holdbare granule undtagen enhver beskyttende coating påført kernen i granulet.

[0063] Kernen kan fremstilles ved enhver fremgangsmåde kendt inden for området, såsom granulering, ekstrudering, pandecoating, sfæronisering, tromlegranulering, high-shear agglomerering, fluid-bed spraycoating, krystallisering, udfældning og prill processer. Sådanne fremgangsmåder er kendte inden for området og er beskrevet i US Pat. No. 4,689,297og US Pat. No. 5,324,649 (fluid bed behandlingssystem); EP656058B1og US Pat. No. 454332 (ekstruderingsproces); US Pat. No. 6,248,706 (granulering med high-shear), og EP804532B1og US Pat. No. 6,534466 13 DK 2013 00009 U1 (kombinationsprocesser under anvendelse af en fluid bed kerne og mix coating) og er alle beskrivelser der er medtaget her som reference i deres helhed.

[0064] De beskyttende coatinger ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes som beskrevet i granulering, ekstrudering, fluid bed og prill processer som anført ovenfor. Desuden kan de beskyttende coatinger påføres ved støbemetoder, herunder spinning disk støbemetoder, som beskrevet i WO 03/000625, som herved medtages som reference i sin helhed.

[0065] Derudover kan fremgangsmåden i en udførelsesform omfatte et varmehærdningsstrin, som opvarmer granulet til over glas transition temperaturen (Tg) af en fugtighedsbarrieremateriale og derefter gradvist reducerer temperaturen for at få barrierematerialet til at hærde, eller blive glasagtigt.

KERNER

[0066] Kernen er den indre kerne i granulet, der som angivet ovenfor, kan omfatte den aktive bestanddel eller den aktive bestanddel kan coates omkring et kernemateriale. Egnede kerner til anvendelse i den foreliggende opfindelse er fortrinsvis et hydratiserbart eller porøst materiale (dvs. et materiale, som er dispergerbart eller opløseligt i vand), der er af foderkvalitet. Kernematerialet bør enten dispergeres i vand (desintegrere når det hydratiseres) eller opløses i vand ved at gå i en ægte vandig opløsning. Lerarter (f.eks phyllosilicater bentonit, kaolin, montmorillonit, hectorit, saponit, beidellit, attapulgit, og stevensit, silicat, såsom sand (natriumsilicat), nonpareils og agglomereret kartoffelstivelse eller mel eller andre kilder til stivelsesgranuler, såsom hvede og majskolber, betragtes som dispergerbare. Nonpareils er sfæriske partikler bestående af en podekrystal, der er blevet bygget ovenpå og afrundet til en sfærisk form ved at binde lag af pulver og opløste stoffer på podekrystallen i en roterende sfærisk beholder. Nonpareils er typisk fremstillet af en kombination af en sukker såsom saccharose, og et pulver, såsom majsstivelse. I én udførelsesform for den foreliggende opfindelse er kernen en natriumchlorid- eller natriumsulfatkrystal, der undertiden omtales som et kim, eller en krystal af et andet uorganisk salt. I en anden udførelsesform for den foreliggende opfindelse er kernen en saccharosekrystal.

[0067] Partikler bestående af uorganiske salte og/eller sukkerarter og/eller små organiske molekyler kan anvendes som kerner ifølge den foreliggende opfindelse. Egnede vandopløselige bestanddele til inkorporering i kerner indbefatter: uorganiske salte såsom natriumchlorid, ammoniumsulfat, natriumsulfat, magnesiumsulfat, zinksulfat, eller urinstof, citronsyre, sukkerarter, såsom saccharose, lactose og lignende.

[0068] Kerner ifølge den foreliggende opfindelse kan endvidere omfatte en eller flere af følgende: aktivstoffer, fødevare- eller foderpolymerer, fyldstoffer, plastificeringsmidler, fibermaterialer, strækkemidler og andre forbindelser kendt til anvendelse i kerner. Egnede polymerer indbefatter polyvinylalkohol (PVA), polyethylenglycol, polyethylenoxid, polyvinylpyrrolidin, og carbohydrat-polymerer (såsom stivelse, amylose, amylopectin, alfa-og beta-glucaner, pectin, glycogen), herunder blandinger og derivater deraf.

14 DK 2013 00009 U1

[0069] Kerner anvendt i eksemplerne indbefatter sukkerkrystaller, uorganiske saltkrystaller, majskolbekerner, lerarter og silikater.

[0070] Egnede fyldstoffer, der er anvendelige i kernerne, indbefatter inerte materialer, der anvendes til at tilføje masse og reducere omkostninger, eller anvendes med henblik på at justere den tilsigtede enzymaktivitet i det færdige granule. Eksempler på sådanne fyldstoffer indbefatter, men er ikke begrænset til, vandopløselige midler, såsom salte, sukkere og vanddispergerbare midler, såsom ler, talkum, silicat, cellulose og stivelse, og cellulose og stivelsesderivater.

[0071] Egnede plastificeringsmidler, der er anvendelige i kernerne ifølge den foreliggende opfindelse, er lavmolekylære organiske forbindelser og er stærkt specifikke i forhold til polymeren, der plastificeres. Eksempler indbefatter, men er ikke begrænset til, sukkere (såsom glucose, fructose og saccharose), sukkeralkoholer (såsom sorbitol, xylitol og maltitol og andre glycoler), polære lavmolekylære organiske forbindelser, såsom urinstof, eller andre kendte plastificeringsm idler, såsom vand eller plastificeringsmidler af foderkvalitet.

[0072] Egnede fibermaterialer, der er anvendelige i kernerne ifølge den foreliggende opfindelse indbefatter, men er ikke begrænset til: cellulose, og cellulosederivater, såsom HPMC (hydroxypropyl-methylcellulose), CMC (carboxymethylcellulose), HEC (hydroxy-ethylcellulose).

[0073] I en udførelsesform, især til foderanvendelser ifølge den foreliggende opfindelse, er kernen et vandopløseligt eller dispergerbart majskolbemateriale eller en sukker- eller saltkrystal. I en anden udførelsesform særligt egnet til anvendelse i rengøringsmidler er kernen en vandopløselig eller dispergerbar sukker- eller salt krystal eller en nonpareil.

[0074] Fagfolk inden for området vil erkende, at til foder- og fødevareanvendelser, er kernerne (og eventuelle polymerer, fyldstoffer, plastificeringsmidler, fibermaterialer, og strækmidler) acceptable til fødevare og/eller foderstofanvendelser. Til brug ved husholdningsanvendelser, er det ikke nødvendigt med en sådan begrænsning.

[0075] Kernen i granulerne ifølge den foreliggende opfindelse, herunder enhver coating der har aktivstoffer heri, undtaget beskyttende coatinger som beskrevet nedenfor, omfatter fortrinsvis mindre end omkring 70%, mindre end 60%, mindre end 50%, mindre end omkring 40 %, mindre end omkring 30%, og mindre end omkring 20% vægt/vægt af det holdbare granule.

AKTIVSTOF

[0076] Det aktive stof eller stoffer, især enzymerne beskrevet ovenfor, opnås ud fra et fermenteringsmedium, der kan være et helt medium, lyseret medium, eller klaret fermenteringsmedium genvundet fra fermenteringssprocessen. Enzymet kan være i flydende form, i form af en opslæmning, tørret, lyofiliseret eller krystallinsk form, som 15 DK 2013 00009 U1 opnået ved anvendelse af udvindingsprocesser fra fermenteringsmedier. Enzymet/enzymerne blandes eventuelt sammen med blødgøringsmidler, såsom kulhydrater og polymerer, såsom modificeret eller naturlig stivelse til dannelse af en matrix. En ikke-begrænsende liste af plastificeringsmidler indbefatter sukkerne glucose, fructose og saccharose, dextriner, PVA, og sukkeralkoholer, såsom sorbitol, xylitol og maltitol eller nogen af de plastificeringsm idler, der er anført ovenfor. Modificeret stivelse indbefatter, men er ikke begrænset til majsstivelse og syrefortyndet hydroxypropylstivelse, f.eks PureCote® og oxiderede stivelser. Alternativt kan aktivstoffet tilsættes til kernen, eller tilsættes til både kernen og et lag der omgiver kernen.

BESKYTTENDE COATING

[0077] De beskyttende coatinger ifølge den foreliggende opfindelse anvendes generelt som et eller flere lag omkring kernen, hvor det aktive stof ikke i sig selv er termostabilt. Udførelsesformer indbefatter en, to, tre eller fire beskyttende coatinglag.

[0078] Egnede beskyttende coatingmaterialer er polymerer, carbohydrater, proteiner, lipider, fedtstoffer og olier, fedtsyrer, uorganiske salte og gummier og blandinger deraf.

[0079] De beskyttende coatinger omfatter fugtighedsbarrierecoatinger og fugtighedshydratiserende coatinger. Fugtighedsbarrierecoatinger fungerer ved at udelukke fugt, for eksempel ved at danne et skallag, som typisk ikke absorberer fugt og forebygger eller forsinker hastigheden af fugtvandring ind i granulet. Fugtighedshydratiserende coatinger på granulet absorberer eller binder fugt, enten frit vand eller hydratvand, hvorved de virker ved at hindre eller forsinke omfanget eller hastigheden af transport af ydre fugtighed ind i granulet. Fugtighedshydratiserende coatinger udgør typisk mindst omkring 35% vægt/vægt af granulet. De fugtighedshydratiserende materialer i coatingerne isolerer aktivstofferne termisk og vil absorbere en vis mængde fugt og holde det tilbage i det hydratiserende materiale uden at lade det passere igennem ind i den del af granulet med aktivstoffet. For fugtighedshydratiserende coatinger af stabile, holdbare granuler, der ikke indeholder væsentlige mængder af vand før dampbehandling, kan sådanne coatinger være omkring 25% vægt/vægt af granulet.

[0080] Fugtighedsbarrierercoatinger omfatter typisk hydrofobe materialer, såsom hydrofobe polymerer, for eksempel PVA, HPMC, syrefortyndet hydroxypropylstivelse og oxideret stivelse, proteiner, for eksempel valle og valleproteinkoncentrater, lipider, for eksempel lecithin, fedtstoffer og olier, fedtsyrer, latex og gummier, f.eks. gummi arabicum. Visse fugtighedsbarrierecoatinger, såsom PVA og gummi arabicum, oxideres ikke let og finder særlig anvendelighed ved at give kemisk stabilitet, når granulerne ifølge opfindelsen lagres i upelleterede eller utabletterede blandinger, for eksempel i forblandinger, der indeholder cholinchlorid. Fugtighedshydratiserende coatingmaterialer er typisk hydrofile materialer, såsom kulhydrat og uorganiske salte, herunder hydratiserede salte. Eksempler på fugtighedshydratiserende materialer er magnesiumsulfat, natriumsulfat, maltodextrin, ammoniumsulfat, sukkere, f.eks saccharose og naturlig majsstivelse.

16 DK 2013 00009 U1

[0081] Polymerer, der anvendes til de beskyttende coatinger er polyvinylalkohol (PVA), polyethylenglycol, polyvinylpyrrolidon, polyacrylater, polyethylenoxider (PEO), polymælkesyre, polyvinylcloride, polyvinylacetat, polyvinylpyrrolidoner (PVP), celluloseethere, alginater, gelatine, modificerede stivelser og substituerede derivater, hydrolysater og copolymerer deraf, såsom syrefortyndet hydroxypropylstivelse, såsom, Pure Cote™, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), methylcellulose (MC), carboxymethylcellulose (CMC), og methylcellulose. Mest foretrukne polymerer til de beskyttende coatinger er PVA, PVA, som beskrevet i US patent. NO. 6,872,696 og modificeret cellulose, såsom methylcellulose og hydroxylpropylmethylcellulose, som beskrevet i PCT Publication No. WO 99/51210, der begge er inkorporeret heri som reference.

[0082] Kulhydrater der anvendes til de beskyttende coatinger er maltodextrin hydroxylmethylcellulose, modificerede eller naturlige stivelser fra majs, sorghum, pilerod, ris, hvede, rug, byg, havre, kartoffel, yams, tapioka, kassava, sago, og sukkere, herunder saccharose, faste majssirupper, melasse, glucose, fructose og lactose.

[0083] Proteiner, der anvendes til de beskyttende coatinger er vallepulver, valleproteinkoncentrat, valleproteinisolat, kaseinater, sojaproteinkoncentrat og-isolat, zein, albumin og gelatine.

[0084] Enkle forbindelse og afledte lipider, som kan anvendes i beskyttende coatinger er voksarter (fx vegetabilske, mineralske og syntetiske, såsom carnauba, candelilla, bivoks, cerumen, carnaubavoks, shellak, paraffin og mikrokrystallinske vokser), lecithin (for eksempel mono-og diglycerider), fedtsyrer (for eksempel stearinsyre, palmitinsyre, linolsyre, oliesyre, smørsyre, og arachidonsyre fedtsyrer og deres salte af natrium, kalium, calcium og zink), og fedtstoffer og olier (f.eks. hydrogeneret eller delvist hydrogenerede fedtstoffer og olier, såsom soja, majs, bomuldsfrø, talg, canola og linolie). Et foretrukket lipid til de beskyttende coatinger er lecithin.

[0085] Uorganiske salte, der anvendes til de beskyttende coatinger, inkluderer salte af sulfat, citrat, chlorid, carbonat, sulfit, phosphat, phosphonat, og bicarbonatsalte af natrium, ammonium, kalium, calcium, magnesium og zink. Foretrukne salte er magnesium, natrium og ammoniumsulfater.

[0086] Gummier, der kan anvendes i beskyttende coatinger, inkluderer gummi arabicum, guargummi, agar, tragantgummi, karyagummi, johannesbrødgummi, carrageenan, xanthangummi og alginater.

[0087] De beskyttende coatinger ifølge den foreliggende opfindelse kan yderligere inkludere plastificeringsmidler, smøremidler, pigmenter og pulvere, såsom talkum, bentonit, kaolin, majsstivelse, magnesiumsilicat, calciumcarbonat og chitosan.

[0088] Visse udførelsesformer ifølge den foreliggende opfindelse har typisk et enkelt lag af et fugtighedshydratiserende materiale, som udgør ca mindst 55% vægt/vægt af granulet. Fordi fugtighedshydratiserende coatingers kapacitet til at optage og binde vand er begrænset, anvendes relativt tykke enkeltlagscoatinger.

17 DK 2013 00009 U1

Fugtighedshydratiserende materiale(r) kan alternative påføres i to lag. Andre udførelsesformer ifølge den foreliggende opfindelse indeholdende beskyttende coatinger anvender både fugtighedshydratiserende materialer og fugtighedsbarriermaterialer.l disse udførelsesformer kan mængden af fugtighedshydratiserende materialer være lavere, mindst 25% vægt/vægt af granulet og fugtighedsbarrierematerialet er omkring 2% til 25% vægt/vægt af granulet. Brugen af både fugthedshydratiserende materialer og fugtighedsbarrierematerialer kombinerer beskyttende mekanismer og reducerer typisk omkostninger, især for fugtighedsbarrierematerialer. Fugtighedsbarrierematerialer, især filmdannende materialer, kan være udsat for mekaniske skader, som, hvis disse materialer anvendes alene som en tynd coating, kan føre til tab af beskyttelse af aktivstoffet. Kombinationen tillader anvendelse af mindre af begge materialer end det ville være nødvendigt, hvis materialerne blev anvendt alene. Kombinationen tillader en vis beskadigelse af fugtighedsbarrierelaget ved tilstedeværelse af det fugtighedshydratiserende materiale.Som diskuteret ovenfor, er kombinationen af materialer særlig egnet til at tilvejebringe kemisk stabilitet ved at opretholde aktivitet, når granulerne lagres i upelleterede blandinger.

[0089] For granuler med et varmehærdningstrin, kan mængden af fugtighedshydratiserende materiale sænkes til omkring mindst 20% vægt/vægt af granulet, fordi det sammensmeltede fugtighedsbarrierelag har forbedret kontinuitet og er mindre udsat for mekanisk beskadigelse.

[0090] Fremgangsmåder ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter ud over de processer der er beskrevet til fremstilling af stabile, holdbare granuler, også blanding af granulerne med unpelleterede foderblandinger og lagring af de resulterende blandinger. Yderligere fremgangsmåder omfatter dampbehandling af de resulterende blandinger og/eller pelletering af de fremkomne blandinger. Naturligvis kan de stabile, holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse også lagres alene og blandet med foder, eller pelleteret, når det ønskes.

[0091] De følgende eksempler er ikke ment som være begrænsende.

EKSEMPLER

[0092]. Nedenstående tabel 1 er en liste over ingredienser og forkortelser som bruges i de følgende eksempler

Table 1

Ingrediens Navn & Produkt Nr. Leverandør Saccharose Domino Pure Cane Extra Fine Granuleed Sugar Tate & Lyle North American Sugars, Baltimore, MD Majsstivelse Corn Starch Cargill Foods, Minneapolis, MN MgS04 Magnesium sulfate heptahydrate, MgS04 7FI20 (Epsom salts) PQ Corporation, Berwyn, PA

18 DK 2013 00009 U1

Ingrediens Navn & Produkt Nr. Leverandør HPMC Hydroxypropyl Methylcellulose, Brandname: METHOCEL Dow Chemical Carnaubavoks Michem Lube 160HS (carnauba emulsion, 50% solids) Michelman Inc. Cincinnati, OH Modificeret stivelse PURE-COTE® Grain Processing Corporation, Muscatine, IA Lecithin ULTRALEC® P Soy lecithin ADM Corp., Decatur, IL PVA polyvinyl alcohol, Elvanol® 51-05 DuPont, Wilmington, DE Natriumsulfat Sodium Sulfate Anhydrous Cooper Natural, Tulsa, Oklahoma Ammonium Ammonium Sulfate CAS # General Alum & Chemical Corp. sulfat 7783-20-2 Searaport, Maine Talkum NYTAL 4000 TALC RT Vanderbilt Co, Inc. Norwalk, CT Vallepulver PC42010 Leprino Foods, Denver CO Valleprotein Proliant instantized whey protein concentrate, #8010, lot H4212 Hilmar Cheese Company, Hilmar, omkring (WPC formally sold through Proliant) Hørfrøolie ASTM Raw Linseed Oil Cargill Industrial Oils, Chicago, IL Maltodextrin Maltodextrin M150 Grain Processing Corp (GPC) Muscatine, IA Gummi arabicum TIC PRETESTED Gun Arabic FT PreHydrated TIC Gums, Belcamp, MD Canolaolie Canola Oil Safeway Latex Aquacoat ECD (Ethylcellulose dispersion 30%) FMC BioPolymer. Philadelphia, PA Sand Sodium silicate Sigma-Aldrich Chemical Co. Majskolbe Ground corn cobs or corn pith ICBP Independence, IA

[0093] Tabel 2 illustrerer sammensætningen af et antal eksempler på stabile, holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse og adskillige granuler som ved særlige 5 pelleteringsbetingelser ikke viste mindst 50 % bibeholdt aktivitet af aktivstoffet 10 19 DK 2013 00009 U1

Tabel 2

Formulering #1* Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale saccharose 35-50 mesh 36.9 Aktivstof Enzym 7.4 Saccharose 12.6 Majsstivelse 12.6 1. Coating Saccharose 10.5 Majsstivelse 10.5 2. Coating carnuabavoks 6.0 3. Coating HPMC 3.5 *Varmehærdningstrin

Formulering #2 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale saccharose 35-50 mesh 17.5 Aktivstof Enzym 3.5 Saccharose 6.0 Majsstivelse 6.0 1. Coating MgS04 67.0

Formulering #3 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale natriumsulfate 16.5 Aktivstof Enzym 4.8 Saccharose 4.0 Majsstivelse 8.0 1. Coating MgS04 66.7

Formulering #4 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale saccharose 35-50 mesh 17.5 Aktivstof Enzym 3.5 Saccharose 4.0 20 DK 2013 00009 U1

Formulering #4 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Majsstivelse 8.0 1. Coating maltodextrin 67

Formulering #5 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale natriumsulfat 14.8 Aktivstof Enzym 2.9 Saccharose 3.3 Majsstivelse 6.6 1. Coating MgS04 55.6 2. Coating gummi arabicum 17.0

Formulering #6 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale natriumsulfat Aktivstof Enzym 2.9 Saccharose 3.3 Majsstivelse 6.6 1. Coating MgS04 55.6 2. Coating Valle 16.7

Formulering #7 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale natriumsulfat 14.8 Aktivstof Enzym 2.9 Saccharose 3.3 Majsstivelse 6.6 1. Coating MgS04 55.6 2. Coating proteinkoncentrat 17.0

Formulering #8 Komponent % (vægt/vægt) tørstof 21 DK 2013 00009 U1

Formulering #8 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale natriumsulfat 13.4 Aktivstof Enzym 2.6 Saccharose 3.0 Majsstivelse 6.0 1. Coating PureCote® stivelse 15.0 2. Coating lecithin 10.0 3. Coating MgS04 50.0

Formulering #9 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale natriumsulfat 9.1 Aktivstof Enzym 1.8 Saccharose 2.0 Majsstivelse 4.1 1. Coating MgS04 83.0

Formulering #10 (Termolabil) Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale saccharose 35-50 mesh 26.5 Aktivstof Enzym 5.3 Saccharose 9.1 Majsstivelse 9.1 1. Coating carnuabavoks 50

Formulering #11 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale natriumsulfat 10.7 Aktivstof Enzym 2.1 Saccharose 2.4 Majsstivelse 4.8 1. Coating PVA 4 Talkum 36 22 DK 2013 00009 U1

Formulering #11 j Komponent % (vægt/vægt) tørstof 2. Coating MgS04 40 I

23 DK 2013 00009 U1

24DK 2013 00009 U1

Formulering #19 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Majsstivelse 0.0 talkum 8.0 1. Coating MgS04 66.7

Formulering #20 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale natriumsulfat 14.8 Aktivstof enzym 2.9 saccharose 3.3 Majsstivelse 6.6 1. Coating gummi arabicum 17.0 2. Coating MgS04 55.6

Formulering #21 (Termolabil) Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale saccharose 35-50 mesh 51.9 Aktivstof enzym 10.4 saccharose 17.7 Majsstivelse 17.7 1. Coating canola olie 2.2

Formulering #22 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Kernemateriale Malet majskolbe 17.5 Aktivstof enzym 3.5 saccharose 6.0 Majsstivelse 6.0 1. Coating MgS04 67

Formulering #23 Komponent

Kernemateriale natriumsulfat % (vægt/vægt) tørstof 31.1 25 DK 2013 00009 U1

26DK 2013 00009 U1

Formulering #30 27 DK 2013 00009 U1

28 DK 2013 00009 U1

Formulering #33 Komponent % (vægt/vægt) tørstof Coating 1 Natriumsulfat 26,0 Belægning 2 PVA 2,5 talkum 4,9

Formulering # 34 Komponent % (Vægt/vægt) tørbasis Kernemateriale Natriumsulfat 54,8 Aktivstof (2) E enzymblanding 11,8 Coating 1 26,0 Coating 2 Natriumsulfat 2,5 PVA 4,9 talkum

[0094] EKSEMPEL 1. Fremstilling af granuler i tabel 2.

5

[0095] Alle granulerne i tabel 2, bortset granule nummer 1, er granuler, der blev fremstillet under anvendelse af en fluid bed-proces som beskrevet i US Pat. No. 5,324,649. Ved fluid bed-processen fluidiseredes kernematerialerne i en Vector FL-1 processor (fremstillet af Vector Corp, Marion, IA, USA), en Glatt 3, eller en Uniglatt 10 processor (begge fremstillet af Glatt Air Techniques, Binzen, Tyskland). En enzym/sukker/stivelse-blanding blev spraycoatet på kernematerialet. Derefter blev beskyttende coating(er) sprayet sekventielt på enzym laget og tørret.

[0096] For eksempel blev formulering #3 granulet fremstillet som følger: 15 Natriumsulfatkrystaller screenet til -45/+140 mesh blev fyldt i et Glatt 3 top spray fluid bed-coatingapparat og fluidiseredes ved anvendelse af en opvarmet lejetemperatur. Et xylanaseultrafiltreringskoncentrat fra Trichoderma reesei blev blandet med majsstivelse og saccharose og sprayet på krystallerne. Opløsningen indeholdt omkring 33% tørstof. Den endelige batchvægt var 4000 gram.

20

[0097] I en vektor FL-1 top spray coater blev en magnesiumsulfat-opløsningen, et fugtighedshydatiserende materiale, sprøjtet på 833 g af det ovenfor beskrevne materiale. Lejetemperaturen var 50°. Det endelige batch vejede 2500 gram.

25 [0098] Fremstilling af Granule nummer 1 omfattede endvidere et varmehærdningstrin, hvor granulet blev opvarmet til en temperatur tilstrækkelig over glastranssitiontemperaturen (Tg) af carnaubavoksmaterialet efterfulgt af langsom afkøling som gav et hærdet, glasagtigt vokslag.

29 DK 2013 00009 U1

Eksempel 2: Fremstilling af mæskprøver med granuler og pelletering

[0099] Tre forskellige foderblandinger og pelleteringsprocesser blev anvendt til fremstilling af pellets med granulerne som anført i tabel 2. Der blev tilsat relativt høje doser af granuler til foderblandingerne for at optimere aktivitetsassays for det resterende aktivstof.

Mølle# 1:

Udvalgte granuler fra tabel 2 blev blandet sammen med en foderformulering.

Sammensætningen af foderblandinger var som følger: 75% (vægt/vægt) majsmel (enriched yellow degerminated cornmeal, nr. 50956, General Mills Operations, Minneapolis, MN), og 25% (vægt/vægt) sojabønnemel (Pro Soybean meal, Cargill Oilseed Co, Cedar Rapids, IA).

12 kg af den ovennævnte foderblanding blev kombineret med hver af granuleprøverne (doseret med 5 g/kg foderblanding), og blandet i en stor Hobart mixer (model D-300T, Troy OH) i 8 minutter. Omkring 150 g af hver prøve blev bibeholdt som mæskprøven, eller upelleterede foderblanding. Hver batch blev derefter opdelt i tre 4 kg underbatches, og pelleteret i tredobbelte pelletproduktionsserier.

[0100] Det anvendte pelleteringsapparat var en CPM model CL5 (California Pellet Miil Co, Crawfordsville, IN). Temperaturen i dampbehandleren kontrolleredes med mængden af den indsprøjtede damp ved 1,36 atm. Behandlingstemperaturen af mæsken, målt umiddelbart før pelleteringsapparatets indgangmatrice, blev reguleret til 89-90 °C. Temperaturmåling blev udført med et termometer og et "J" type termoelement (Omega Engineering, Inc. Stamford, CT). Opholdstiden i behandleren var omkring 5 sekunder. Matricedimensioner var 12,7 cm indre diameter, 17,8 cm udvendig diameter, 4,7 mm huldiameter. Pelleteringsapparatet blev kørt kontinuerligt, og prøverne blev behandlet sekventielt i apparatet og adskilt ved at køre omkring 2 kg af en majsmel/sojablanding mellem prøverne. Omkring 1 minut efter prøvemæsken blev tilsat til behandleren, og behandlingstemperaturen havde stabiliseret sig ved måltemperaturen, blev pellets opsamlet over et 30 sekunders interval, så omkring 1 kg pellets kunne opsamles for hver prøve. De opsamlede pellets blev holdt under omgivelsesbetingelser i 30 sekunder og derefter afkølet med en luftkøler i 2-3 min til stuetemperatur.

Mølle #2:

Tilberedte holdbare granuler fra tabel 2 blev pelleteret med en majs og sojafoderformulering. Den nøjagtige sammensætning af foderblandingen var som følger, 61,2% (vægt/vægt) majsmel, 31,6% (vægt/vægt) sojabønnemel, 3,0% kød- og benmel, 2,5% sojaolie, 1,3% kalksten, 0,28% salt, og 0,08% methionin.

30 DK 2013 00009 U1

For hver testet granule, blev 370 til 2000 g af granulet, afhængigt af enzymtype og aktivitet, kombineret med 450 kg af foderet uden olie, og blandet i en plovblander i 2 minutter. Derefter blev sojabønneolie tilsat, og prøven blev blandet i nogle yderligere minutter. Pelleteringsapparatet var en Master model, fremstillet af California Pellet Miil. Pelletmatricehullets diameter var 4,5 mm. Den typiske tilførselshastighed var 780 kg per time. Temperaturen i dampbehandleren blev styret manuelt, og blev målt ved foderudløbet fra behandleren. Der blev anvendt to behandlingstemperaturer, 85 °C og 95 °C. Opholdstiden i behandleren var omkring 30 sekunder. Når måltemperaturen var nået, blev systemet kørt i omkring 5 minutter før prøveudtagning fandt sted. Prøver på omkring 5 kg af pelleteret foder blev udtaget, og afkølet ved spredning på screeningsbakker.

Mølle Nr. 3:

De fremstillede holdbare granuler blev pelleteret med en hvede og sojafoderformulering eller en hvede og bygformulering. Sammensætningen af foderformuleringen var enten 60% hvede, 31,5% sojabønnemel, 4% sojabønneolie, 1,5% dikalciumphosphat, 1,23% vitamin-mineral forblanding, 1,2% kalksten, 0,4% salt og 0,2% DL methoinine, eller 60% hvede, 30% byg, med anvendelse af to behandlingstemperaturer, 90 °C og 95 °C. For hver testet granule, blev 200 til 500 g granuler, afhængig af enzymtype og aktivitet, kombineret med 160 kg af foderet og blandet i en horisontal snegleblander, i omkring 15 minutter. Pelleteringsapparatet var en Simon Heesen, mono rulletype, udstyret med matrice med en indre diameter på 17,3 cm, med en pellet huldiameter på 3 mm. Matricehastigheden var 500 omdrejninger per minut og blev drevet af en 7,5 kW motor. Den typiske tilførselshastighed var 300 kg per time. Temperaturen i dampbehandleren blev holdt ved + / - 0,1 grader Celcius, målt ved foderudgangen fra behandleren. Behandleren indholdt et kaskadetypemixersystem. Der blev anvendte tre behandlingstemperaturer, 85 °C, 90 °C og 95 °C. Dampindløbstrykket var 2 atm, og temperaturen i behandleren blev reguleret ved manuel justering af tre ventiler, som regulerer dampen. Opholdstiden i behandleren var omkring 30 sekunder. Når måltemperaturen var nået, blev systemet kørt i omkring 5 til 10 minutter før prøveudtagning fandt sted. Prøver blev udtaget i 1-1,5 minuttersperioder, svarende til 5-7,5 kg af pelleteret foder, og blev straks anbragt i en køleboks med en perforeret bund og luftstrøm på 1500 kubikmeter per time. Efter afkøling i 15 minutter blev prøverne reduceret to gange under anvendelse af en prøvedeler, og 1 kg blev udtaget til laboratorieprøver.

EKSEMPEL 3: ENZYMAKTIVITETSMÅLINGER

Bestemmelse af enzymaktivitet

[0101] Til bestemmelse af enzym aktiviteten efter pelletering blev mæsk og pelleterede 31 DK 2013 00009 U1 prøver malet i 30 sekunder i en køkkenkaffemølle (model 203-42, Krups North America Inc., Medford MA), og analyseret for enzymaktivitet som beskrevet nedenfor. Alternativt blev prøverne formalet i en ZM-200 centrifugeringsmølle, forsynet med en 1 mm sigte (Retsch GmbH, Germany).

[0102] Beregning af procentvis bibeholdt aktivitet:

For hver testprøve blev både mæsk og de tilsvarende pelleterede prøver analyseret for aktivitet. Den bibeholdte aktivitet i procent blev beregnet som følger: aktivitet i pellets x 100 % bibeholdt aktivitet = ------------------------------ aktivitet i mæsken

[0103] Phytaseenzymassayet blev udført ifølge AOAC (Association of Analytical Chemists) Official Method 2000,12, som beskrevet i "Determination of phytase activity in feed by a colorimetric enzymatic method: collaborative interlaboratory study". Engelen AJ, van der Heeft FC, Randsdorp PH, Somers WA, Schaefer J, van der Vat BJ. J AOAC Int. 2001 May-Jun; 84 (3) :629-33. Kort fortalt ekstraheredes de formalede prøver i 220 mM natriumacetat-trihydrat, 68,4 mM calciumchlorid-dihydrat, 0,01% Tween 20, pH 5,5. Derefter analyseredes supernatanten. Assayet måler frigivelse af uorganisk phosphat fra risphytat, ved pH 5,5 i 60 minutter ved 37C. Assayet stoppes med surt molybdat/vanadatreagens og phosphat kvantificeres ved intensiteten af gultfarvet kompleks af vanadomolybdophosphor.

[0104] Xylanaseenzymassayet blev udført under anvendelse af Xylanase Assay Kittet (Xylazyme AX Format), Cat nr.: K-XYLS Megazyme International Ireland Ltd, Wicklow, Irland. Materialer til assayet omfatter 16 x 125 mm dyrkningsrør af engangsglas, ekstraktionsbuffer: 100 mM MES-natriumsalt, pH 6,0, assaybuffer: 25 mM

natriumphosphatbuffer, pH 6,0; stopopløsning: 20 g NaPO4l2H20 i 1 liter MilliQ vand , Polystyren Tissue Culture Flasks, 225 ml (Corning Incorporated - Life Sciences Big Flåts, New York). 6-12 g malet foder ekstraheres i 120 ml ekstraktionsbuffer i en dyrkningskolbe, i 1 time ved 20-25 °C, under omrystning på et orbital gel rysteapparat indstillet til 100 omdrejninger per minut. Prøver centrifugeres derefter ved 2000 g i 1 minut og supernatanten analyseres. Til assayet fortyndes 20 til 100 ul af fodersupernatanten til 500 ul med assaypuffer i dyrkningsrør og ækvilibreres i et vandbad ved 40 °C i 10 minutter. Derefter anbringes en substrattablet i hvert kulturrør, og prøverne inkuberes i yderligere 10 minutter ved 40C. Derefter tilsættes 10 ml stopopløsning til hvert rør. Prøverne vortexes kort, og filtreres derefter gennem Whatman # 1 filterpapir. Absorbansen af filtratet bestemmes med et spektrofotometer ved en bølgelængde på 590 nm. Spektrofotometeret nulstilles først med en blindprøve, fremstillet ved at kombinere 20 til 100 ul af fodersupernatanten, 500 ul assaybuffer og 10 ml stopopløsning. Derefter tilsættes en substrattablet, efterfulgt af vortexbehandling og filtrering på samme måde som for prøverne. Interferens fra nogle foderkomponenter 32 DK 2013 00009 U1 kan påvirke analysesvaret. For at korrigere for enhver interferens, blev der lavet standardkurver med foderbaggrund. Ucoatede xylanasegranuler blev tilsat til mæskblindprøve, og til pelletsblindprøver på flere niveauer. De spikede mæsk- og pelletprøver blev derefter formalet og ekstraheret nøjagtigt som beskrevet ovenfor. Fra denne række af ekstrakter blev der lavet standardkurver for både mæsk og pellets.

[0105] Beta-glucanaseenzymassayet blev udført under anvendelse af et beta-glucanase Assay Kit (Beta-Glucazyme Tablet format). Kat nr.: T-BGZ200, Megazyme. International Ireland Ltd, Wicklow, Irland. Materialer til assayet omfatter 16 x 125 mm dyrkningsrør af engangsglas, ekstraktionsbuffer og assaybuffer: 25 mM natriumacetatbuffer; stopopløsning: 2% NaPO4l2H20 i 1 liter MilliQ vand, 140 ml glas-bægerglas. 10 g formalet foder blev ekstraheret i 100 ml ekstraktionsbuffer ved blanding i et bægerglas i 1 time ved 20-25 °C. Derefter centrifugeres prøver ved 2000 g i 1. min, og supernatanten analyseres. Til assayet fortyndes 20 til 100 ul af fodersupernatanten til 500 ul med assaybuffer i dyrkningsrør og ækvilibreres i et vandbad ved 40 °C i 10 minutter. Derefter anbringes en substrattablet i hvert dyrkningsrør og prøverne inkuberes i yderligere 10 minutter ved 40 °C. Derefter tilsættes 10 ml stopopløsning til hvert rør. Prøverne vortexes kort, og derefter filtreres gennem Whatman # 1 filterpapir. Absorbansen af filtratet bestemmes med et spektrofotometer ved en bølgelængde på 590 nm. Spektrofotometeret nulstilles først med en blindprøve, fremstillet ved at kombinere 20 til 100 ul af fodersupernatanten, 500 ul assaybuffer, og 10 ml stopopløsning. Derefter tilsættes en substrattablet, efterfulgt af vortexbehandling, og filtrering på samme måde som for prøverne. En standardkurve fremstilles ved at analysere en enzymrække fortyndet til passende niveauer i assaybuffer.

RESULTATER FOR BIBEHOLDT ENZYMAKTIVITET

[0106]

Tabel 3: pelleteringsresultater - procentvis bibeholdet aktivitet efter pelletering

Formulering Mølle# 1, 90 °C Mølle nr. 2, 3 eller 4 ved 85-95 °C 10 < 30% xylanase 12 <30% xylanase 13 < 30% xylanase 14 < 30% xylanase 15 < 30% xylanase 16 < 30% xylanase 21 < 30% xylanase 25 < 30% xylanase 1 > 50% xylanase 2 > 50% xylanase 3 > 70% xylanase > 70% xylanase 5 > 50% xylanase,> 70% e. coli- > 50% xylanase, > 80% e. coli-phytase 33 DK 2013 00009 U1

Formulering Mølle# 1, 90 °C Mølle nr. 2, 3 eller 4 ved 85-95 °C phytase 6 > 50% xylanase 7 > 50% xylanase 9 > 50% xylanase 11 > phytase > 50% xylanase,> 70% Aspergillus phytase 30 > 60% termostabil xylanase 22 > 50% xylanase 23 > 60% e. coli-phytase > 50% xylanase, > 80% e. coli-phytase 27 > 50% xylanase > 80% e. coli-phytase 33 > 90% BGL,> 70% termostabil xylanase 4 > 70% xylanase 8 > 70% xylanase 17 > 70% xylanase 18 > 70% xylanase 19 > 70% xylanase 20 > 70% xylanase 26 > 70% xylanase > 90% e. coli-phytase 28 > 90% BGL,> 90% termostabil xylanase 29 > 70% BGL,> 90% termostabil xylanase 31 > 90% e. coli-phytase 32 > 90% e. coli-phytase

[0107] De anvendte pelleteringsapparater kan opdeles i to grupper. Mølle #1 er en laboratorieskalamølle, som er meget barskere end det, der typisk bruges i kommerciel 5 praksis. Barskheden tilskrives den store mængde damp, der leveres til en relativt lille mængde mæsk, kombineret med det faktum, at foderblandingen ikke indeholder olie, der typisk smører foderet under turen gennem matricen. Møller # 2 til # 4, anses for at være mere repræsentative for kommercielle forhold.

10 [0108] De bibeholdte aktiviteter af de testede granuler er vist i tabel 3. Granuler ifølge den foreliggende opfindelse, der ikke betragtes som værende stabile, holdbare granuler var numrene 10, 12, 13, 14, 15, 16, 21 og 25, der alle viste mindre end 30% bibeholdt aktivitet. Disse granuler har en kerne coatet med et enzymmatrixlag, hvori den coatede 34 DK 2013 00009 U1 kerne er større end omkring 50% vægt/vægt af hele granulet. De fleste af disse ikke-stabile granuler havde kun et beskyttende coatinglag med et fugtighedsbarrieremateriale, såsom carnaubavoks eller ethylcellulose, eller HPMC, eller canolaolie. Uden at ønske at være bundet af nogen bestemt teori, og idet det anerkendes, at disse granuler kan udvise mere end 50% bibeholdt aktivitet fra aktivstoffet ved 70-85 °C, kan den ringe termostabilitet af disse granuler under disse testbetingelser, i forhold til stabile, holdbare granuler, skyldes tilvejebringelsen af coatingsmaterialer som relativt tynde lag, omfattende, i fem eksempler, omkring 2,0 til omkring 17,0% vægt/vægt af granulet og/eller det bestemte coatingsmateriale der er anvendt. For eksempel har granule nummer 10 et enkelt lag af coatingsmateriale, der er 50% vægt/vægt fugtighedsbarrieremateriale (carnaubavoks), og granula nummer 25 har to fugtighedsbarrierebeskyttende coatinglag, der tilsammen udgør 32% vægt/vægt af granulet.

[0109] Særligt stabile, holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse var numrene 4, 8, 17, 18, 19, 20, 26, 28, 29, 31 og 32, som alle har mere end 70% bibeholdt xylanaseaktivitet når de var pelleteret ved omkring 90 °C i omkring 5 sekunder. Derudover viste granule 26, 31 og 32 mere end 90% bibeholdt phytaseaktivitet, når de var pelleteret ved mellem 85 °C og 95 °C i omkring 30 sekunder. Granuler 28 og 29 viste mere end 90% bibeholdt aktivitet af en xylanase med iboende termostabilitet i enzymblandingen og 70%-90% bibeholdt aktivitet af en termolabil beta-glucanase, når de var pelleteret ved mellem 85 °C og 95 °C i 30 sekunder. Disse stabile, holdbare granuler med et aktivstof, som ikke i sig selv er termostabile er enten: 1) coatet med et enkelt tykt beskyttende lag med et fugtighedshydratiserende materiale, eller 2) coatet med 2-3 beskyttende lag, hvor mindst et af lagene er et fugtighedshydratiseringsmateriale og et lag er et fugtighedsbarrieremateriale.

[0110] I almindelighed, når fugtighedshydratiserende materialer påføres som enkeltlag skal coatingen omfatte fra omkring mindst omkring 55% af granulet, for at tilvejebringe en passende termobeskyttelse, og når mængden af fugtighedshydratiserende materiale blev sænket til mindre end 55% under anvendelse af et enkelt lag, faldt den procentvise bibeholdte aktivitet til under 50%. Men når fugtighedshydratiserende materialer anvendes i kombination med fugtighedsbarrierematerialer, kan det beskyttende vandhydratiserende lag sænkes til mindst omkring 25% vægt/vægt af granulet, mens fugtighedsbarrierematerialet kan være omkring 2% til 40% vægt/vægt af granulet.

[0111] Andre stabile, holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse var numrene 1,2, 3, 5, 6, 7, 9, 11, 22, 23, 27, 30 og 33 som alle viste mere end 50% bibeholdt xylanase- eller phytaseaktivitet, når de var pelleteret ved 90 °C i 5 sekunder eller ved 85 °C til 95 °C i 30 sekunder. Som det kan ses af disse resultater, giver ydre eller indre coatinger med uorganiske salt alene god beskyttelse af enzymet og forbedret beskyttelse ved kombination med fugtighedsbarrierecoatinger. Som tidligere bemærket, blev granule nummer 1 fremstillet ved anvendelse af et varmehærdningsprocesstrin, og det formodes, at tilsætning af et varmehærdningstrin forbedrer barriereegenskaberne af fugtighedsbarrierematerialerne, såsom polymerer, proteiner og lipider, hvorved mængden af fugtighedshydratiserende materiale, der er nødvendig for at give termostabilitet, kan reduceres. Når et granule ellers identisk med granule # 1 blev 35 DK 2013 00009 U1 fremstillet uden varmehærdning, var den bibeholdte aktivitet 35%. Granuler 2, 3, og 22 viser, at forskellige kernematerialer kan anvendes uden, at det går ud over granulestabilitet.

[0112] Granule 3 viste mere end 70% bibeholdt enzymaktivitet ved tidsperioder på både 5 sekunder og 30 sekunder i pelleteringsprocessen. Granule 11 viste mere end 50% bibeholdt xylanaseaktivitet når den blev pelleteret ved 85 °C til 95 °C i omkring 30 sekunder, og mere end 70% bibeholdt phytaseaktivitet, når den blev pelleteret ved 85 °C til 95 °C i omkring 30 sekunder. Granule # 23 viste mere end 60% bibeholdt aktivitet af phytase, når den blev pelleteret i 5 sekunder ved 90 °C, mere end 50% bibeholdt aktivitet af xylanase, når den blev pelleteret ved 85 °C til 95 °C i 30 sekunder, og mere end 80% bibeholdt aktivit af phytase, når den blev pelleteret ved 85 °C til 95 °C i 30 sekunder.

EKSEMPEL 4: TEST MED DIREKTE DAMPNING

[0113] 100 g portioner af mæsk bestående af 75% majsmel og 25% soja blev doseret med granuler, der indeholder E. coli-phytase ved et indhold på 1,25 g granule pr 1 kg mæsk. Mæskprøver blev derefter pakket ind i en pose af osteklæde, og dampet i 20 sekunder ved at placere poserne i en tragt med 30 psi damp tilført i bunden af tragten. Efter dampning blev prøverne afkølet til stuetemperatur, fik lov at tørre natten over og blev derefter analyseret for phytaseaktivitet. Den procentvise bibeholdte aktivitet af de dampede prøver, i forhold til uopvarmet mæsk, blev rapporteret.

[0114] Et granule, der ikke blev anset for passende dampresistent under disse testbetingelser, var nummer # 25, som havde mindre end 35% bibeholdt aktivitet efter dampning. Numrene # 5 og # 23 var stabile, holdbare, granuler ifølge den foreliggende opfindelse, som havde mere end 50% bibeholdt aktivitet efter dampning.

EKSEMPEL 5: TEST FOR BIOTILGÆNGELIGHED AF PELLETEREDE GRANULER

[0115] De stabile, holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse kan testes for biotilgængelighed af det aktive stof, enzymet, under anvendelse af kendte biotilgængelighedsundersøgelser, såsom phytasebiotilgængelighedsundersøgelsen beskrevet i WO 00/47060, biotilgængelighedsundersøgelser beskrevet i Enzymes in Animal Nutrition, Proceedings of the 1 st Symposium, Kartause Ittingen, Switzerland, October 13.016, 1993; biotilgængelighedsundersøgelserne beskrevet i Chemgens patenter.

[0116] Stabile granuler ifølge den foreliggende opfindelse blev vurderet efter pelletering for at bestemme biotilgængelighed i slagtekyllinger fodret med et kommercielt foder.

Materialer og metoder

[0117] Testede enzymer og granuler og foderanvendelser inkluderede Phyzyme®XP (6- 36 DK 2013 00009 U1 phytase, EC 3.1,3.26)-enzym alene og både PVA-coatede og gummi arabicum (GA) -coatede stabile granuler ifølge den foreliggende opfindelse indeholdende Phyzyme XP enzym. (Se tabel 4). De afprøvede enzymer og granuler blev fodret til slagtekyllinger i enten et mæskfoder eller et foder indeholdende pellets (fremstillet ved 90 °C). Det eksperimentelle foder var: positiv kontrol (kommerciel foder), negativ kontrol, negativ kontrol +500 E/kg Phyzyme®XP, negativ kontrol +500 U/kg PVA-coatet phytase, negativ kontrol +500 U/kg GA-coatet phytase, negativ kontrol +500 U/kg PVA-coatet phytase pelleteret ved 90 °C, og en negativ kontrol +500 U/kg GA-coatet phytase pelleteret ved 90 °C. Med undtagelse af calcium og phosphor, var alt foderet isokalorisk og isonitrogenisk. (Se tabel 6). Calcium og tilgængeligt phosphor i de positive og negative foderkontroller var hhv. 0,90% og 0,78% og 0,37% og 0,26%. Titandioxid (0,10%) blev tilsat til foderet som ufordøjelig markør til hjælp til at estimere næringsstoffordøjeligheden. Det eksperimentelle foder blev fremstillet af ADAS Gleadthorpe efter en kommerciel specifikation og opbevaret på ADAS Gleadthorpe og lagret under køling. Prøver af enzymadditivblandinger (25 g), korn (250 g), sojabønnemel (250 g) og en prøve af alt foder (250g) blev sendt til Danisco Animal Nutrition Feed Services, Edwin Rahrs Vej 38, DK-8220 Brabrand, Danmark. Alle foderprøver blev analyseret for phytase før fodring.

Forsøgsdyr og Design: [0118] Kyllingerne var Ross 308 haneslagtekyllinger i alderen 0 til 21 dage under anvendelse af otte ens hønsegårde per behandling med 30 fugle pr hønsegård. Kyllinger blev placeret tilfældigt i kasser før vejning og fordelt tilfældigt i behandlingsgårdene. Hver gård indeholder et foderrør og fuglene havde fri adgang til vand via drikkenipler (4 pr. bur) og foder hele tiden. Højden af drikkeniplerne blev justeret regelmæssigt for, at have samme højde som det øverste af ryggen af fuglene. Strøelse blev leveret i form af rene træspåner i en dybde på 5 cm. Huset blev opvarmet af et varm luftsrugesystem og rugetemperatursstyringen var 31 °C for de daggamle, og nedsættes med 1 °C hver anden dag, indtil 21 °C blev nået på dag 21. Den minimale ventilationshastighed blev automatisk beregnet til at levere 1.9x104 m3 luft per sekund per kg0,75legemesvægt, og denne hastighed blev leveret af en 610 mm blæser, styret af et Farm-Ex Diacam kontrolpanel. Belysningsprogrammet var 23 timers lys og 1 times mørke. Lysintensiteten blev reduceret fra det maksimalt opnåelige for daggamle (40-60 lux) til en intensitet på omkring 10 lux for 10 dage gamle. Relativ luftfugtighed blev overvåget på daglig basis ved hjælp af en Tinytalk © datalogger. Kyllinger blev vaccineret med IB H120 & 50% Avinue (ND) på rugeriet.

Foderoptagelse/legemesvægt [0119] Foderforbrug blev målt mellem 0 og 21 dage. Foderet i hver hønsegård blev målt ved at tilbageveje den fodermængde der er tilbage ved afslutningen af perioden og trække det fra den tilbudte mængde. Fuglene blev vejet i deres hønsegårdsgrupper når de var daggamle. Ved dag 21 blev alle fuglene i alle hønsegårdene vejet i grupper. Den samlede vægt af alle fuglene i hver hønsegård blev bestemt, og middelværdien beregnet. Alle fugle som døde blev vejet og detaljerne registret og eventuelle lamme 37 DK 2013 00009 U1 fugle eller fugle der ikke kan nå foder og vand blev frasorteret fra undersøgelsen og årsagen til frasorteringen blev noteret.

Skinnebensaske

[0120] Ved en alder på 21 dage, blev 2 fugle fra hver hønsegård aflivet ved halshugning, og venstre ben fjernet. Skinnebenet blev skåret ud og knoglen sendt til Eurofins laboratorier, Woodthorne, Wolverhampton til foraskning på basis af et plot. Alle data blev analyseret under anvendelse af almindelige lineære modellers fremgangsmåde ifølge SAS (SAS Inst.. Inc., Cary, MC). Hvor der blev fundet signifikante forskelle, blev Duncantesten anvendt til at sammenligne de enkelte behandlingermidler.

Resultater og diskussion

[0121] Analyseret phytaseaktivitet i det eksperimentelle foder var hhv. < 50, < 50, 563, 467, 558 FTU/kg (PVA-coatet phytase), og 554 og 440 (GA-coatet phytase), for positiv kontrol, negativ kontrol, negativ kontrol + 500 E/kg Phyzyme®XP, negativ kontrol + 500 U/kg PVA-coatet phytase og GA-coatet phytase, og negativ kontrol + 500 U/kg PVA-coatet phytase og GA-coatet phytase pelleteret ved 90 °C (tabel 5), hvilket indikerer, at aktiviteten af både PVA-coatet phytase og GA-coatet phytase ikke blev ødelagt efter granulering ved 90 °C.

[0122] Fugle fodret med foder suppleret med 500 U/kg PVA-coatet phytase og GA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C, vejede mere på dag 21 end fugle fodret med det positive kontrol-, negativ kontrol- og negativ kontrol + 500 U/kg Phyzyme®XP -foder (tabel 7). Fugle fodret med negativt kontrolfoder, indtog mindre foder end fugle fodret med et foder suppleret med 500 U/kg PVA-coatet phytase og GA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C (tabel 8). Fugle fodret med mæskfoder suppleret med 500 U/kg Phyzyme®og PVA-coatet phytase og GA-coatet phytase viste ingen statistiske forskelle til den positive kontrol. De der blev fodret med foder suppleret med 500 U/kg PVA-coatet phytase og GA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C, havde en bedre foderudnyttelse på dag 21 end fugle fodret med negativ kontrol, + 500 U/kg Phyzyme®XP- og positiv kontrolfoder (tabel 9). Skinnebensaske var lavest for fugle fodret med negativ kontrolfoder sammenlignet med alle andre behandlinger. Fugle fodret med positiv kontrol- og phytase-suppleret foder havde ens skinnebensaske (Tabel 10).

[0123] Den testede phytase, enten som Phyzyme®XP eller coatet med PVA eller GA, opførte sig lige så godt som det positive kontrolfoder, når det blev fodret som mæsk.

Når PVA eller GA-coatet phytase blev tilsat til kommercielt foder pelleteret ved 90 °C, blev produktet bevaret på ikke-pelleteret niveau og resultaterne var mindst lige så gode som eller bedre end for det positive kontrolfoder. Resultaterne viser, at coating af enzym med PVA eller GA forbedreder dets termostabilitet ved en pelleteringstemperatur på 90 °C uden at miste bioeffektivitet i slagtekyllinger fodret med kommercielt foder.

38 DK 2013 00009 U1

Tabel 4 foderbehandlinger | Foderbehandling Enzym, U/kg Inklusion (g/T) Positiv kontrol 0, fodermæsk 0 I Negativ kontrol 0, fodermæsk 0 Phyzyme XP | Fodermæsk 500 U/kg Phyzyme XP, fodermæsk 100 PVA-coatet fodermæsk 500 U/kg PVA-coatet phytase, fodermæsk 100 PVA coatet pelletfoder 500 U/kg PVA-coatet phytase (pelleteret ved 90 °C) 100 GA-coatet fodermæsk 500 U/kg GA-coatet phytase, fodermæsk 100 GA coatet pellet kost 500 U/kg GA-coatet phytase (pelleteret ved 90 °C) 100

Tabel 5 phytaseaktivitet i forsøgsfoder

Foderbehandling Forventet Observet Observeret, % FTU/kg Positiv kontrol, mæsk <50 <50 - Negativ kontrol, mæsk <50 <50 - Phyzyme XP, fodermæsk 500 563 112.6 PVA-coatet, fodermæsk 500 467 93.4 PVA coatet, pelleteret ved 90 °C 500 558 111.6 GA-coatet, fodermæsk GA coatet, pelleteret ved 90 °C 500 440 88.0

Tabel 6 forsøgsfoder

Ingredienser: % Positiv kontrol Negativ kontrol Majs 58,56 59,49 Sojabønnemel -48 34,65 34,55 Sojaolie 2,82 2,48 salt 0,30 0,30 Natriumbikarbonat 0,20 0,20 Dicalciumphosphat 1,59 0,83 ] Kalk 0,95 1,12 39 DK 2013 00009 U1

Ingredienser: % Positiv kontrol Negativ kontrol Vitaminforblanding 0,50 0,50 Lysin-HCI 0,10 0,10 DL-Methionin 0,23 0,23 Titandioxid 0,10 0,10 Bærer af enzymforblanding (majs) 0 0,10 Næringsstofsammensætning Råprotein, % 21,68 21,68 Fjerkræ, omsættelig energi, MJ/kg 12,8 12,8 Calcium, % 0,90 0,78 Phosphor,% 0,67 0,54 Tilgængelige phosphor,% 0,37 0,26 Methionin + Cystine,% 0,92 0,92 Methionin,% 0,56 0,56 Lysin,% 1,25 1,25 Threonin,% 0,82 0,82 Tryptophan,% 0,25 0,25

Tabel 7 Indledende og afsluttende legemsvægt af slagtekyllinger fodret med forsøgsfoder

Foderbehandling Legemsvægt, g Dag 0 Dag 21 Positiv kontrol, mæsk 44,43 789b Negativ kontrol, mæsk 43,55 680d 500 U/kg Phyzyme XP, mæsk 43,72 753c 500 U/kg PVA-coatet phytase, mæsk 43,75 740c 500 U/kg GA-coatet phytase, mæsk 500U/kgPVA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C 43,70 899a 500 U/kg GA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C 43,67 934a Standardafvigelse på forskel mellem midler 0,261 (PVA) 6,015 (PVA) 0,228 (GA) 7,741 (GA) P-værdi 0,165 (PVA) < 0,001 (PVA) 0,053 (GA) < 0,001 (GA) Forskellige superscripts i samme kolonne angiver signifikante forskelle 40 DK 2013 00009 U1

Tabel 8 Samlet foderoptagelse af slagtekyllinger fodret med forsøgsfoder

Foderbehandling Foderindtagelse (g/fugl/dag) Positiv kontrol, mæsk 56,69b Negativ kontrol, mæsk 46,00a 500 U/kg Phyzyme XP, mæsk 59,03b 500 U/kg PVA-coatet phytase, mæsk 56,70b 500 U/kg PVA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C 57-18b 500 U/kg GA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C 64,33b Standardafvigelse på forskel mellem midler 2,321 (PVA) 2,260 (GA) P-værdi 0,004 (PVA) 0,001 (GA) Forskellige superscripts i samme kolonne angiver signifikante forskelle

Tabel 9 Foderomdannelsesforhold for slagtekyllinger fodret med forsøgsfoder

Foderbehandling Foderkvotienten Positiv kontrol, mæsk L617ab Negativ kontrol, mæsk 1 ,548ab 500 U/kg Phyzyme XP, mæsk 1,752a 500 U/kg PVA-coatet phytase, mæsk 1,715a 500 U/kg PVA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C 1,412b 500 U/kg GA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C 1,537 Standardafvigelse på forskel mellem midler 0,715 (PVA) 0,069 (GA) P-værdi 0,016 (PVA) 0,061 (GA) Forskellige superscripts i samme kolonne angiver signifikante forskelle

Tabel 10 Skinnebensaskeindhold i slagtekyllinger fodret med forsøgsfoder | Foderbehandling Skinnebensaskeindhold (g/100g) j Positiv kontrol, mæsk 14,03b |Negativ kontrol, mæsk 10,86a 41 DK 2013 00009 U1 | Foderbehandling Skinnebensaskeindhold (g/1 OOg) |500 U/kg Phyzyme XP, mæsk 13,93b |500 U/kgPVA-coatet phytase, mæsk 13,24b 1500 U/kg PVA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C 13,50b |500 U/kg GA-coatet phytase, pelleteret ved 90 °C 13,84a [standardafvigelse på forskel mellem midler 0,403 (PVA) 0,302 (GA) jp-værdi < 0,001 (PVA) < 0,001 (GA) [Forskellige superscripts i samme kolonne angiver signifikante forskelle

EKSEMPEL 6: ENZYMEFORBLANDING & PELLETERINGSSTABILITET

[0124] Granuler indeholdende phytaser, fremstillet ifølge formuleringerne i tabel 2 med 5 enten en PVA eller gummi arabicum coating og en fugtighedshydratiseringscoating, blev blandet med leret sepiolit eller en standard vitamin-mineral-forblanding til slagtekyllinger med og uden cholinchlorid. Blandingsforholdet var 100 g granuler tilsat 900 g ler (sepiolit) eller 100 gram granuler tilsat 500 g vitamin-mineral-forblanding. Prøver blev lagret i forseglede beholdere ved 35 °C i 3 uger, og derefter underkastet 10 pelletering, som beskrevet ovenfor for Mølle # 3. Den eksperimentelle kontrol var granuler som ikke blev lagret i en forblanding, og som blev holdt ved omgivelsesbetingelser i 3 uger.

[0125] Tabeler 11 og 12 viser procent bibeholdt phytaseaktivitet i disse blandinger efter 15 granulering ved 90 °C og 95 °C. Granuler blandet med sepiolit eller vitamin- mineralblandinger viste sig at have en betydelig bibeholdt aktivitet efter pelletering.

Tabel 11 PVA Formuleringseksempler Granuler Forblanding Procent bibeholdt aktivitet efter pelletering i forhold til mæsk Procent stigning i bibeholdt aktivitet i forhold til kontrolgranule CD o o o 95 ° C CD O o o 95 0 C granuler alene (kontrol) 71% 57% Sepiolit + granule 95% 88% 34% 53% Vitamin-mineral-forblanding, uden cholinchlorid + granule 93% 80% 32% 40% 42 DK 2013 00009 U1

Tabel 11 | PVA Formuleringseksempler Granuler Forblanding Procent bibeholdt aktivitet efter pelletering i forhold til mæsk Procent stigning i bibeholdt aktivitet i forhold til kontrolgranule Vitamin mineral-forblanding, med cholinchlorid + granule 98% 85% 39% [48% Tabel 12 GA formuleringsgranuler Forblanding Procent bibeholdt aktivitet efter pelletering, i forhold til mæsk Procent stigning i bibeholdt aktivitet i forhold til kontrolgranule CO o o o CO CJi o O CO 0 O 0 CD 01 O 0 granuler alene (kontrol) 92% 81% | Sepiolit + granule 99% 88% 00 vP σ' CD Vitam in-m ineral-forblanding, uden cholinchlorid + granule 100% 81% nP 0' O vO σ' 00 Vitam in-m ineral-forblanding, med cholinchlorid + granule 97% 80% 5% j -2%

[0126] Uden at ønske at være bundet af nogen bestemt teori, antages det, at leret og vitamin-mineral-forblandingen har en kapacitet til at optage vand og under lagring med 5 stabile granuler absorberer de den tilbageværende fugt fra granulerne. For at illustrere dette, viser tabel 13 resultaterne af et forsøg, hvor granuler og sepiolit opbevares i åbne beholdere, anbragt side ved side, i et lukket kammer. Vandaktiviteten for granulerne, og sepiolit, blev målt før og efter 7 dages lagring ved 25 °C. Under lagring absorberede sepiolit vand fra granulerne indtil systemet nåede en ligevægtstilstand. Efter lagring 10 viser granulerne et fald i vandaktivitet, mens sepiolit viser en stigning i vandaktivitet.

Tabel 13 Initial vandaktivitet Vandaktivitet efter 7 dages lagring sammen Sepiolit J granule Sepiolit granule Formulering GA granule 0,312 jo,558 0,359 0,373 Formulering PVA granule 0,312 |θ,516 0,354 0,365 43 DK 2013 00009 U1

EKSEMPEL 7: LAGRINGSSTABILITET MED CHOLINCHLORID

[0127] Cholinchlorid, eller N-(2-hydroxyethyl) trimethylammoniumchlorid, er et vigtigt fodertilsætningsstof, et vitaminnæringsstof i fjerkræs-, svine- og andre foderstoffer.

5 Cholinchlorid er et reaktivt molekyle og har et velkendt ødelæggende virkning på andre vitaminer og enzymer. Cholinchlorid indgår ofte i forblandinger og basisblandinger. Maksimalgrænseværdier, der anvendes i forblandinger, er 74.800 mg/kg for svin, og 150.000 mg/kg for fjerkræ. Og typiske niveauer for svinebasisblandinger er omkring 966 til 1282,9 mg/kg.

10

[0128] De stabile, holdbare granuler ifølge den foreliggende opfindelse viste sig at bibeholde enzymaktivitet ved lagring i nærvær af cholinchlorid. Granuler indeholdende phytase, fremstillet ved formuleringer med enten PVA eller gummi arabicum og et fugtighedshydratiserende materiale blev blandet med en standard vitamin-mineral- 15 forblanding til slagtekyllinger, med og uden cholinchlorid. Blandingsforholdet var 100 gram granuler tilsat til 500 g vitamin-mineral-forblanding. Prøver blev lagret i forseglede beholdere ved 35 °C i 3 uger og derefter analyseret for aktivitet under anvendelse af den ovenfor beskrevne phytaseassayforskrift. Kontrol for eksperimentet var granuler som ikke blev lagret i en forblanding, og som blev holdt ved 35 °C i 3 uger. Tabeler 14 20 og 15 viser den målte aktivitet af blandingerne før og efter lagring, og den procentvise ændring i aktivitet. Ingen af prøverne udviser et væsentligt tab af aktivitet efter lagring. Fejl i denne analyse, herunder fejl i prøveudtagning, ekstraktion, og aktivitetsassay er omkring 15%.

Tabel 14 PVA Granuleformulering Prøve Oprindelig aktivitet (FTU/g) Aktivitet efter lagring i 3 uger ved 35 °C (FTU/g) procentvis ændring i aktivitet kun granuler (kontrol) 11.600 11.858 2% granuler + vitamin-mineral-forblanding uden cholinchlorid 1.933 1.727 -12% granuler + vitamin-mineral-forblanding med cholinchlorid 1.933 1.720 -12% Tabel 15 GA Granuleformulering Prøve Oprindelig aktivitet (FTU / g) Aktivitet efter lagring i 3 uger ved 35 °C (FTU/g) procentvis ændring i aktivitet kun granuler (kontrol) 10.373 10.528 1% granuler + vitamin-mineral- 1.729 1.543 -12% 44 DK 2013 00009 U1

Tabel 14 PVA Granuleformulering Prøve Oprindelig aktivitet (FTU/g) Aktivitet efter lagring i 3 uger ved 35 °C (FTU/g) procentvis ændring i aktivitet forblanding uden cholinchlorid granuler + vitamin-mineral-forblanding med cholinchlorid 1.729 1.622 -7%

EKSEMPEL 8: VANDAKTIVITETSEFFEKT PÅ PELLETERINGSTABILITET

[0129] Phytasegranuler blev ifølge en formulering fremstillet med en PVA-belægning 5 og/eller en uorganisk saltlagscoating, i en fluid bed-proces, som beskrevet ovenfor. Et yderligere tørringstrin kan anvendes, hvis vandaktiviteten af granulet er højere end 0,5 efter bearbejdning, således at granulet kan tørres i et fluid bed-coatingapparat eller anden egnet proces indtil en vandaktivitet på < 0,5 er opnået. Resultaterne er vist i tabel 16 og viser, at bibeholdt aktivitet efter pelletering er forbedret, når vandaktiviteten er 10 mindre end 0,5.

Tabel 16 PVA Granuleformulering [ Granule Vandaktivitet Procent bibeholdt aktivitet efter pelletering i forhold til mæsk Procent stigning i bibeholdt aktivitet i forhold til kontrol-granule 90 °C CD Ol o O 90 °C CD Ol o o A (kontrol) 0,57 81% 69% B 0,41 98% 87% 21% 26% C 0,49 110% 97% 36% 41%

[0130] Udførelsesformer: 15 1. Et granule til fodersammensætninger omfattende: en kerne; et aktivstof; og mindst en coating, hvor aktivstoffet i granulet bibeholder mindst 50% aktivitet, mindst 60% aktivitet, mindst 70% aktivitet, mindst 80% aktivitet efter 45 DK 2013 00009 U1 betingelser valgt blandt en eller flere af a) en foderpelleteringsproces, b) en dampopvarmet foderforbehandlingsproces, c) lagring, d) lagring som en ingrediens i en upelleteret blanding, e) lagring som bestanddel i en foderbasisblanding eller en foderforblanding, omfattende mindst en forbindelse valgt blandt spormineraler, organiske syrer, reducerende sukkere, vitaminer, cholinchlorid, og forbindelser, som resulterer i en sur eller en basisk foderbasisblanding eller foderforblanding.

2. Granulet ifølge udførelsesform 1, hvor den mindst ene coating omfatter et fugtighedshydratiserende materiale, der udgør mindst 55% vægt/vægt af granulet.

3. Granulet ifølge udførelsesform 1, hvor den mindst ene coating omfatter to coatinger.

4. Granulet ifølge udførelsesform 3, hvor de to coatinger er en fugtighedshydratiserende coating og en fugtighedsbarrierecoating.

5. Granulet ifølge udførelsesform 4, hvor den fugtighedshydratiserende coating er mellem 25% og 60% vægt/vægt af granulet og fugtighedsbarrierecoatingen er mellem 2% og 15% vægt/vægt af granulet.

6. Granulet ifølge udførelsesform 5, hvor den fugtighedshydratiserende coating er valgt blandt uorganiske salte, saccharose, stivelse, og maltodextrin og fugtighedsbarrierecoatingen er valgt blandt polymerer, gummier, valle og stivelse.

7. Granulet ifølge udførelsesform 1, hvor aktivstoffet er et eller flere enzymer.

8. Granulet ifølge udførelsesform 1, hvorfoderpelleteringsprocessen og foderforbehandlingsprocessen udføres mellem 70 °C og 95 °C i op til flere minutter.

9. Granulet ifølge udførelsesform 1, hvorfoderpelleteringsprocessen og foderforbehandlingsprocessen udføres ved mellem 85 °C og 95 °C.

10. Granulet ifølge udførelsesform 1, hvor den upelleterede blanding er et fortyndingsmiddel valgt blandt en eller flere af lerarter, hvedefodermel eller risklid.

11. Granulet ifølge udførelsesform 1, hvor foderbasisblandingen eller foderforblandingen omfatter cholinchlorid, og aktivstoffet er mindst et enzym, der bibeholder mindst 80% aktivitet ved lagring i foderbasisblandingen eller foderforblandingen.

46 DK 2013 00009 U1 12. Et dyrefoder der omfatter granulet ifølge udførelsesform 1.

13. Dyrefoderet ifølge udførelsesform 12 valgt blandt et dyrefoderfortyndingsmiddel, en dyrefoderbasisblandingen, et dyrefoderforblanding, mæsk og en dyrefoderpellet.

14. Et granule til dyrefoder omfattende: en kerne; et aktivstof, hvor aktivstoffet i granulet bibeholder mindst 80% aktivitet efter lagring og efter en dampopvarmet pelleteringsproces, hvor granulet er en ingrediens; en fugtighedsbarrierecoating, og en fugtighedshydratiserende coating, der er mindst 25% vægt/vægt af granulet, hvor granulet har en vandaktivitet på mindre end 0,5 inden den dampopvarmede pelleteringsproces.

15. Granulet ifølge udførelsesform 14, hvor fugtighedsbarrierecoatingen er valgt blandt polymerer og gummier og det fugtighedshydratiserende materiale er et uorganisk salt.

16. Granulet ifølge udførelsesform 14, hvor den fugtighedshydratiserende coating er mellem 25% og 45% vægt/vægt af granulet og fugtighedsbarrierecoatingen er mellem 2% og 10% vægt/vægt af granulet.

17. Granulet ifølge udførelsesform 14, hvor det aktivstoffet er et eller flere enzymer.

18. Granulet ifølge udførelsesform 14, hvor den dampopvarmede pelleteringsproces udføres ved mellem 85 °C og 95 °C i op til flere minutter.

19. Granulet ifølge udførelsesform 14, hvor mindst 80% aktivitet bibeholdes efter lagring af granulet i en upelleteret blanding omfattende mindst en forbindelse valgt blandt spormineraler, organiske syrer, reducerende sukkerarter, vitaminer, cholinchlorid, og forbindelser, som resulterer i en sur eller en basisk upelleteret blanding.

20. Et dyrefoder, der omfatter granulet ifølge udførelsesform 14.

21. Dyrefoderet ifølge udførelsesform 20 valgt blandt et dyrefoderfortyndingsmiddel, en dyrefoderbasisblanding, en dyrefoderforblanding, en dyrefoderblanding, og en dyrefoderpellet.

22. En dyrefoderingrediens, der omfatter: 47 DK 2013 00009 U1 et granule omfattende en kerne, et aktivstof der omgiver kernen, og mindst en coating der omgiver aktivstoffet, hvor aktivstoffet bibeholder mindst 50% aktivitet, mindst 60% aktivitet, mindst 70% aktivitet, mindst 80% aktivitet efter betingelser valgt blandt en eller flere af a) en foderpelleteringsproces, b) en dampopvarmet foderforbehandlingsproces, c) lagring, d) lagring som en ingrediens i en upelleteret blanding, og e) lagring som ingrediens i en foderbasisblanding eller en foderforblanding omfattende mindst en forbindelse valgt blandt spormineraler, organiske syrer, reducerende sukkerarter, vitaminer, cholinchlorid, og forbindelser, som resulterer i en sur eller en basisk foderbasisblanding eller foderforblanding.

23. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 22, hvor den mindst ene coating omfatter to coatinger.

24. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 23, hvor de to coatinger er en fugtighedshydratiseringscoating og en fugtighedsbarrierecoating.

25. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 24, hvor den fugtighedshydratiserende coating omfatter et materiale valgt blandt uorganiske salte, carbonhydrater, maltodextrin og stivelse og fugtighedsbarrierecoatingen omfatter et materiale valgt blandt polymerer, proteiner, lipider, fedt, olier, fedtsyrer, gummier, stivelser, lecithin og voks.

26. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 22, hvor kernen og aktivstoffet tilsammen omfatter mindst 50% vægt/vægt af granulet.

27. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 22, hvor kernen og aktivstoffet tilsammen omfatter omkring 50% til omkring 60% vægt/vægt af granulet.

28. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 22, hvor kernen og aktivstoffet omfatter omkring 90% til omkring 100% vægt/vægt af granulet og aktivstoffet er et enzym med iboende termostabilitet.

29. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 22, hvor aktivstoffet er termolabilt.

30. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 22, som yderligere omfatter en fodersammensætning, hvor granulet er dispergeret i fodersammensætningen.

31. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 30, hvor fodersammensætningen er en foderpellet, hvor aktivstoffet er dispergeret i foderpelleten med en bibeholdt aktivitet, som er mindst 50%, mindst 60%, mindst 70%, mindst 80%, og mindst 90% af en pre-pelleting aktivitet.

32. Dyrefoderingrediens ifølge udførelsesform 30, hvor fodersammensætningen er valgt blandt ler, essentielle næringsstoffer, korn, hvede, rug, ris og blandinger deraf.

48 DK 2013 00009 U1 33. Fremgangsmåde til fremstilling af et granule, der omfatter et aktivstof til foder, hvilken fremgangsmåde omfatter: fremstilling af stabile granuler med kerner, i det mindste et aktivstof og mindst en coating, blanding af de stabile granuler med en eller flere af a) et fortyndingsmiddel, b) en basisblanding, c) en forblanding, og d) en foderblanding til pelletering.

34. Fremgangsmåden ifølge udførelsesform 33 som desuden omfatter pelleteringstrinnet af foderblandingen til pelletering ved en temperatur på 70 °C til 95 °C i op til flere minutter.

35. Fremgangsmåden ifølge udførelsesform 33, hvor stabile granuler blandes sammen med ler.

36. Fremgangsmåden ifølge udførelsesform 33, hvor stabile granuler blandes sammen med en forblanding omfattende cholinchlorid.

37. En dyrefodersammensætning fremstillet ved fremgangsmåden ifølge udførelsesform 33.

38. Fremgangsmåde til fremstilling af et stabilt granule omfattende enzym til lagring i en foderforblanding indeholdende cholinchlorid, hvilken fremgangsmåde omfatter: tilvejebringelse af et kernemateriale og enzym, hvor enzymet er fordelt i hele kernematerialet eller lagret på kernematerialet; anbringelse af et fugtighedshydratiserende materiale på kernematerialet og enzymet til dannelse af et lag, der er mindst 25% vægt/vægt af det stabile granule; coating af laget med et fugtighedsbarrieremateriale til dannelse af en coating, som er mindst 5% vægt/vægt af granulet, hvor anbringelse og coating er under betingelser udvalgt således, at en vandaktivitet for det stabile granule er mindre end 0,5.

39. Fremgangsmåden ifølge udførelsesform 38, hvor det fugtighedshydratiserende materiale er et uorganisk salt og laget er omkring 35% til omkring 45% vægt/vægt af den stabile granule.

40. Fremgangsmåden ifølge udførelsesform 38, hvor coatingen er valgt blandt polymerer og gummier.

Claims (16)

49 DK 2013 00009 U1

1. Et granule til fodersammensætninger omfattende: en kerne; et aktivstof; og mindst en coating, hvor aktivstoffet i granulet bibeholder mindst 50% aktivitet, mindst 60% aktivitet, mindst 70% aktivitet, mindst 80% aktivitet efter betingelser valgt blandt en eller flere af a) en foderpelleteringsproces, b) en dampopvarmet foderforbehandlingsproces, c) lagring, d) lagring som en ingrediens i en upelleteret blanding, e) lagring som bestanddel i en foderbasisblanding eller en foderforblanding, omfattende mindst en forbindelse valgt blandt spormineraler, organiske syrer, reducerende sukkere, vitaminer, cholinchlorid, og forbindelser, som resulterer i en sur eller en basisk foderbasisblanding eller foderforblanding; hvor aktivstoffet er en phytase fra Citrobacter.

2. Granulet ifølge krav 1, hvor den mindst ene coating omfatter et fugtighedshydratiserende materiale.

3. Granulet ifølge krav 2, hvor det fugtighedshydratiserende materiale udgør mindst 55% vægt/vægt af granulet.

4. Granulet ifølge kravene 1-3 hvor den mindst ene coating er en fugtighedshydratiserende coating og en fugtighedsbarrierecoating.

5. Granulet ifølge krav 4, hvor den fugtighedshydratiserende coating er mellem 25% og 60% vægt/vægt af granulet og fugtighedsbarrierecoatingen er mellem 2% og 15% vægt/vægt af granulet.

6. Granulet ifølge krav 1, hvor den fugtighedshydratiserende coating er valgt blandt uorganiske salte, saccharose, stivelse, og maltodextrin.

7. Granulet ifølge krav 6, hvor den fugtighedshydratiserende coating er natriumsulfat.

8. Granulet ifølge krav 1, hvor foderpelleteringsprocessen og foderforbehandlingsprocessen gennemføres ved mellem 70 °C og 95 °C i op til flere minutter.

9. Granulet ifølge krav 1, hvor foderpelleteringsprocessen og foderforbehandlingsprocessen udføres ved mellem 85 °C og 95 °C.

10. Granulet ifølge krav 1, hvor den upelleterede blanding er et fortyndingsmiddel valgt blandt en eller flere af lerarter, hvedefodermel eller risklid.

11. Granulet ifølge krav 1, hvor foderbasisblandingen eller foderforblandingen omfatter cholinchlorid, og aktivstoffet er mindst et enzym, der bibeholder mindst 80% aktivitet 50 DK 2013 00009 U1 ved lagring i foderbasisblandingen eller foderforblandingen.

12. Granulet ifølge krav 4, hvor aktivstoffet bibeholder mindst 80% aktivitet efter en dampopvarmet pelleteringsproces, hvor granulet er en ingrediens, og hvor granulet har en vandaktivitet på mindre end 0,5 inden den dampopvarmede pelleteringsproces.

13. Et dyrefoder, der omfatter granulet ifølge ethvert af de foregående krav.

14. Dyrefodersammensætningen ifølge krav 13, som yderligere indeholder cholinchlorid.

15. Anvendelse af en dyrefodersammensætning ifølge krav 13 eller 14 i en dampbehandling og/eller foderpelleteringsproces.

16. En vanddampbehandlet, pelleteret fodersammensætning omfattende granuler ifølge ethvert af kravene 1-12.