CN114350727A - 联合磷酸化与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了联合磷酸化与ATP再生系统合成D‑阿洛酮糖的方法，以D‑葡萄糖为原料，依次经重组大肠杆菌构建、湿菌体制备、全细胞催化反应，最后去磷酸化制取D‑阿洛酮糖。其中重组大肠杆菌的构建过程中包括引入ATP再生系统基因。通过本方法提高了D‑葡萄糖合成D‑阿洛酮糖的平衡转化率，减少了外源ATP添加。本发明具有制备过程简单、产品转化率高、绿色经济的特点，可用于工业化生产。

Description

联合磷酸化与ATP再生系统合成D-阿洛酮糖的方法

技术领域

本发明属于合成生物技术领域，具体涉及一种联合磷酸化与ATP再生系统构建的多酶级联体系催化D-葡萄糖高效合成D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体，在自然界中含量稀少，甜度为蔗糖的70％，能量仅占0.3％。同时，D-阿洛酮糖被美国食品药品监督管理局评为“GRAS”安全级，被建议作为食品中蔗糖的理想替代品。近年来，研究表明D-阿洛酮糖具有降低血糖水平，预防动脉粥样硬化以及清除活性氧(ROS)的能力，因此受到越来越多的关注。另外，一些D-阿洛酮糖的衍生物具有抗癌和抗病毒活性的作用。因此，开发一种高效生产D-阿洛酮糖的方法是满足市场增长的必要条件。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)可以催化D-果糖合成D-阿洛酮糖。不同来源的DPEase在大肠杆菌中异源表达时，D-果糖至D-阿洛酮糖的平衡转化率可以达到20-30％。然而，该转化率相并不高，导致大量的底物D-果糖大量积累。近年来，有研究者将底物D-果糖替换为易得、低价的D-葡萄糖，由葡萄糖异构酶与D-阿洛酮糖-3-差向异构酶共表达合成D-阿洛酮糖。根据前人研究，酶与酶之间存在空间距离，而上一个酶的产物是下一个酶的底物，导致物质转化率更低。双酶体系表达中，D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的平衡转化率在12％-16％之间，底物和中间底物积累严重，提高其转化率是解决底物积累的一个有效策略。

L-鼠李树胶糖激酶作为一种己糖激酶，能够将D-阿洛酮糖磷酸化为D-阿洛酮糖-1-磷酸，提高催化体系平衡反应转化率，再使用去磷酸化策略将磷酸基团脱去，转变为D-阿洛酮糖。同时，L-鼠李糖树胶激酶是一种腺苷三磷酸(ATP)依赖酶，需要ATP参与才能有效完成磷酸化反应，多聚磷酸盐激酶(PPK)利用底物多聚磷酸盐进行ATP和ADP相互转化，实现ATP的循环再生。此外，催化反应中大肠杆菌内源性ATP含量高更能促进酶反应进行，过表达腺苷酸激酶(ADK)能有效提高胞内ATP含量。

相对比纯酶反应，全细胞反应不需要繁琐的蛋白纯化过程，操作简单方便，并且全细胞更能适应外界环境变化，胞内的辅酶因子也能对多酶级联反应起到积极作用。利用全细胞生产D-阿洛酮糖更能适应工业化生产，并且产物也相对容易分离。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种联合磷酸化与ATP再生系统的全细胞合成D-阿洛酮糖的方法，利用该方法可以提高D-阿洛酮糖的产率。

为解决上述技术发明，本发明的技术方案是：

一种高效制备D-阿洛酮糖的方法，以D-葡萄糖为底物，经全细胞催化反应并去磷酸化后制得；所述全细胞催化反应以同时表达葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶、L-鼠李树胶糖激酶、多聚磷酸盐激酶和腺苷酸激酶的重组大肠杆菌进行催化反应。

所述全细胞催化反应按以下操作进行：pH是7-10，反应温度为30-50℃，反应时间12-18h，反应时添加辅因子，所述辅因子为金属离子和腺苷三磷酸。

所述的金属离子为Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ca²⁺中的一种或几种组合。

所述全细胞催化反应，底物浓度为20～100g/L，金属离子的添加量为：5mM，ATP的添加量为20～200mM。

所述去磷酸化按以下操作进行：催化反应后再加热，温度控制在90-100℃，然后降温，降温后的温度控制在30-37℃,pH控制在5.0-6.0之间，取500μL全细胞催化反应液添加酸性磷酸酶30μL,摇床过夜反应所制取的为D-阿洛酮糖。

所述重组大肠杆菌构建按以下操作进行：将来源于Bacillussp.的葡萄糖异构酶基因gi连接到载体pRSFDuet-1上，得到重组质粒pRSFDuet-gi；将来源于ClostridiumbolteaeATCCBAA-613的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因dpe连接在pRSFDuet-gi上，得到重组质粒pRSFDuet-gi-dpe；再将来源于大肠杆菌BL21的L-鼠李树胶糖激酶基因rhaB与多聚磷酸盐激酶基因ppk连接到载体pETDuet-1上，二者通过linker(GGGGS)连接，得到重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk；将来源于大肠杆菌BL21的腺苷酸酶基因adk连接到pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk上，得到重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk-adk；再将重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk-adk和重组质粒pRSFDuet-gi-dpe转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。

所述重组大肠杆菌经以下方法制备湿菌体：将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养，采用IPTG在20℃·条件下诱导20-24h,收集得到湿菌体。

IPTG:Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

所述的将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养的接种量为：1％。

所述的LB培养基按以下组分制备：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠。

本发明的有益效果如下：

本发明在重组大肠杆菌构建时引入磷酸化系统，将催化反应生成的D-阿洛酮糖及时磷酸化为D-阿洛酮糖-1-磷酸，推动异构酶平衡反应向右移动，D-葡萄糖转化率最高可达到55％。

本发明联合多聚磷酸盐激酶和腺苷酸激酶提升胞内ATP含量及实现催化反应时ATP循环再生，减少了外源ATP供给，外源ATP消耗减少为对照组的25％。

本发明以D-葡萄糖为底物进行转化，D-葡萄糖作为自然界中一种成本低廉、易获得的单糖，相对于常规合成D-阿洛酮糖所用的果糖，能有效降低制备成本。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图；

图2为本发明的反应流程图；

图3为实施例1的反应产物的HPLC图。

图4为实施例13的反应产物的HPLC图。

图5为对比例1的反应产物的HPLC图。

HPLC:高效液相色谱。

图中GI:葡萄糖异构酶；DPE:D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；RhaB:L-鼠李树胶糖激酶；PPK:多聚磷酸盐激酶；ADK:腺苷酸激酶；AP:酸性磷酸酶。

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步说明。若为特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明实施例中所用到的原料和试剂均为常规化学试剂，均能通过商业渠道购买得到。LB培养基按以下组分制备：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠。

实施例1

本实施例是联合磷酸化与ATP再生系统合成D-阿洛酮糖的方法的一个实施实例，具体步骤如下：

(1)重组大肠杆菌构建：

重组质粒pRSFDuet-gi的构建：以来源于Bacillus.sp的gi基因片段为模板，以gi-F:ccacagccaggatccgaattcaatgagcctgaccaccgc(BamHI)为上游引物，以gi-R:gcattatgcggccgcaagcttttaaccacgcgcgccc(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对质粒pRSFDuet-1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒对基因片段和质粒pRSFDuet-1进行重组连接，得到重组质粒pRSFDuet-gi。

重组质粒pRSFDuet-gi-dpe构建:以来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的dpe基因片段为模板,以dpe-F:agatatacatatggcagatctaatgcgttacttcaaagaagaagttg(BglII)为上游引物，dpe-R:ggtttctttaccagactcgagttagataccgaaaacgtgcctac(XhoI)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BglII和XhoI分别对质粒pRSFDuet-gi在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒对基因片段和质粒pRSFDuet-gi进行重组连接，得到重组质粒pRSFDuet-gi-dpe。

重组质粒pETDuet-rhaB构建：以大肠杆菌BL21基因组为模板，以rhaB-F:tcatcaccacagccaggatccgatgacctttcgcaattgtgtcg(BamHI)为上游引物，以rhaB-R:gcattatgcggccgcaagctttcatgcgcaaagctcctttg(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对质粒pETDuet-1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒进行同源重组连接，得到重组质粒pETDuet-rhaB；

重组质粒pRSFDuet-gi-dpe和重组质粒pETDuet-rhaB转化：将重组质粒pRSFDuet-gi-dpe和重组质粒pETDuet-rhaB共同转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；

(2)湿菌体制备：将重组大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，至OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入终浓度为1mM IPTG,16-25℃诱导16-24h,8000r/min离心发酵液后经PBS缓冲液重悬再离心后得到湿菌体；

(3)全细胞催化反应：以D-葡萄糖为底物，D-葡萄糖浓度为20g/L，温度控制为：50℃，以tris-HCl缓冲液为反应液，pH为8.5，加入辅因子ATP和金属离子，ATP加入量为20mM、金属离子为5mM的Mg²⁺，以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体，湿菌体的浓度为25g/L，经过12-18h催化反应，其中反应体系为1mL。

(4)去磷酸化：待反应结束后再沸水浴加热10min，离心并调节上清液pH至5.0左右，加入酸性磷酸酶(AP)20-60μL，37℃摇床过夜反应，再加热终止反应，高速离心收集上清液，即可得到D-阿洛酮糖。

(5)通过高效液相色谱(HPLC)检测底物D-葡萄糖的消耗和D-阿洛酮糖的产生，并计算转化率。

HPLC检测条件如下：色谱分析柱Carbomix-Pb-NP10:8％(7.8×300mm),流动相为超纯水，流速为0.5mL/min,柱温78℃，示差(RI)检测器,其中D-葡萄糖标准品保留时间为14.28min,D-果糖标准品保留时间为20.12min，D-阿洛酮糖标准品保留时间为34.63min。

实施例2

全细胞催化反应时整个反应体系的温度为30℃，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例3

全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，pH为8.0其余操作均与实施例1操作相同。

实施例4

全细胞催化反应时整个反应体系的温度为40℃，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例5

全细胞催化反应时整个反应体系的pH为6.0，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例6

全细胞催化反应时整个反应体系的pH为8.0，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例7

全细胞催化反应时整个反应体系的pH为10.0，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例8

全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为5mM Co²⁺，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例9

全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为5mM Ca²⁺，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例10

全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为5mM Mn²⁺，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例11

全细胞催化反应时整个反应体系D-葡萄糖浓度为50g/L,加入ATP量为50mM；金属离子为Mg²⁺，添加量为5mM；经大肠杆菌经诱导后的湿菌体，湿菌体浓度为30g/L，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例12

全细胞催化反应时整个反应体系D-葡萄糖浓度为100g/L,加入ATP量为200mM。金属离子为Mg²⁺，添加量为5mM。以及经大肠杆菌经诱导后的湿菌体，湿菌体浓度为30g/L，其余操作均与实施例1操作相同。

实施例13

本实施例是联合磷酸化与ATP循环系统生产D-阿洛酮糖的方法的另一个实施例，具体步骤如下：

(1)重组大肠杆菌构建：

质粒pRSFDuet-gi-dpe构建：参照实施例1；

重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk-adk构建：在实施例1构建的重组质粒pETDuet-rhaB的基础上，以大肠杆菌MG1655为模板，以ppk-fusion-F:tttgcgcaGGAGGCGGCGGCAGCggtcaggaaaagctatacatcgaaaaag为上游引物，以ppk-fusion-R:GCATTATGCGGCCGCAAGCTTttattcaggttgttcgagtgatttgatg为下游引物，进行PCR扩增，用限制性内切酶BamHI和HindIII对质粒pETDuet-1进行双酶切，再通过无缝克隆试剂盒进行基因片段与载体的连接，得到重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk。以adk-F:GGCAGATCTCAATTGGATATCGATGCGTATCATTCTGCTTGGC(EcoRV)为上游引物，以adk-R:GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTAGCCGAGGATTTTTTCCAGATCAG(XhoI)为下游引物，进行PCR扩增，用限制性内切酶EcoRV和XhoI对质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk进行双酶切，再通过无缝克隆试剂盒进行基因片段与载体的连接，得到重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk-adk；

重组质粒pRSFDuet-gi-dpe和重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk-adk转化：将pRSFDuet-gi-dpe和pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk-adk共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌；

(2)湿菌体制备：参照实施例1；

(3)全细胞催化反应：以D-葡萄糖为底物，D-葡萄糖浓度为20g/L，加入ATP，加入量为5mM,金属离子为Mg²⁺，加入量为5mM，5mM的多聚磷酸盐及重组大肠杆菌经诱导后的湿菌体，湿菌体的浓度为25g/L，调节pH至8.0，控制反应温度为45℃，经过12-18h的催化反应；

(4)去磷酸化：参照实施例1；

(5)D-阿洛酮糖检测：参照实施例1。

实施例14

全细胞催化反应时整个反应体系的温度为30℃，其余操作均与实施例13操作相同。

实施例15

全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，调节pH至8.5，其余操作均与实施例13操作相同。

实施例16

全细胞催化反应时整个反应体系的温度为50℃，其余操作均与实施例13操作相同。

实施例17

全细胞催化反应时整个反应体系的的温度为45℃，pH为6.0，其余操作均与实施例13操作相同。

实施例18

全细胞催化反应时整个反应体系的的温度为45℃，pH为7.0，其余操作均与实施例13操作相同。

实施例19

全细胞催化反应时整个反应体系的的温度为45℃，pH为8.5,其余操作均与实施例13操作相同。

实施例20

全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为5mM Co²⁺,其余操作均与实施例13操作相同。

实施例21

全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为5mM Ca²⁺,其余操作均与实施例13操作相同。

实施例22

全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为5mM Mn²⁺,其余操作均与实施例13操作相同。

实施例23

全细胞催化反应时整个反应体系D-葡萄糖浓度为50g/L,加入ATP，加入量为25mM,金属离子Mg²⁺，加入量为5mM，以及经大肠杆菌经诱导后的湿菌体，湿菌体浓度为30g/L，25mM的多聚磷酸盐，其余操作均与实施例13操作相同。

实施例24

全细胞催化反应时整个反应体系中D-葡萄糖浓度为100g/L。加入ATP，加入量为50mM,金属离子Mg²⁺，加入量为5mM，以及经大肠杆菌经诱导后的湿菌体，湿菌体浓度为30g/L，50mM的多聚磷酸盐，其余操作均与实施例13操作相同。

为了更好的证明本发明的方法可以提高D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的平衡转化率，设定对比例与实施例1为参照进行对比。此对比例与实施例的主要区别在于重组大肠杆菌中仅有gi与dpe两个基因，功能为将底物D-葡萄糖转化为D-果糖，再转化为D-阿洛酮糖，无磷酸化基因rhaB与ATP再生系统基因ppk。

对比例1

全细胞催化反应时整个反应体系中D-葡萄糖浓度为20g/L，加入ATP(加入量为20mM)，金属离子(5mM的Mg²⁺)，重组大肠杆菌(同时表达葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，即构建的重组质粒pRSFDuet-gi-dpe转化至大肠杆菌BL21)经诱导后的湿菌体(湿菌体浓度为25g/L),其余操作均与实施例1相同。

本发明实施例1-12以及对比例1中的D-阿洛酮糖的转化率分别见表1，本发明实施例13-24中的D-阿洛酮糖的转化率分别见下表2。

表1

表2

通过表1和表2数据可以发现，本发明以D-葡萄糖为底物，经重组大肠杆菌构建、湿菌体制备、全细胞催化反应和去磷酸化制取D-阿洛酮糖。该方法与现有技术(对比例1中)的方法相比较)可以大大提高D-阿洛酮糖的转化率，此外，将表1中的实施例1-12与表2中的实施例13-24对比可以发现，选择重组大肠杆菌(可同时表达葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶、L-鼠李树胶糖激酶、多聚磷酸盐激酶和腺苷酸激酶)经过诱导后的湿菌体，在转化率相似的情况下，外源ATP消耗减少为原来的25％，在辅因子方面节约了成本。

以上所述仅为本发明的较佳实例而已，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广西大学

<120> 联合磷酸化与ATP再生系统合成D-阿洛酮糖的方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccacagccag gatccgaatt caatgagcct gaccaccgc 39

<210> 2

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcattatgcg gccgcaagct tttaaccacg cgcgccc 37

<210> 3

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agatatacat atggcagatc taatgcgtta cttcaaagaa gaagttg 47

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ggtttcttta ccagactcga gttagatacc gaaaacgtgc ctac 44

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tcatcaccac agccaggatc cgatgacctt tcgcaattgt gtcg 44

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gcattatgcg gccgcaagct ttcatgcgca aagctccttt g 41

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atgagcctga ccaccgctag cagcaaaacc atcgaagttg cgaccccgtc taaagaagat 60

cgtttcagct tcggcctgtg gaccgttggc tggcaggcgc gtgatccgtt cggcgaagcg 120

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tacgttgaaa aagttgctcg tttaggtttc gatcttttag aaatcggtgc tgctccatta 120

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acatctctcg tggcgcttct gaagctgagc ttgataaaga cgctaaaaac gctgtagctt 840

tccaaaaata catgcttgac tggaaataa 869

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aatcctgaga cgatgtgcag cgaaattcag gctgcgtgtc gggaaacggc gcaaccgatc 1080

ccggaaagtg atgctgaact ggcgcgctgc attttcgaca gtctggcgct gctgtatgcc 1140

gatgtgttgc atgagctggc gcagctgcgc ggtgaagatt tctcgcaact gcatattgtc 1200

ggcggaggct gccagaacac gctgctcaac cagctatgcg ccgatgcctg cggtattcgg 1260

gtgatcgccg ggcctgttga agcctcgacg ctcggcaata tcggcatcca gttaatgacg 1320

ctggatgaac tcaacaatgt ggatgatttc cgtcaggtcg tcagcaccac cgcgaatctg 1380

accaccttta cccctaatcc tgacagtgaa attgcccact atgtggcgca gattcactct 1440

acacgacaga caaaggagct ttgcgcatga 1470

<210> 10

<211> 2067

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgggtcagg aaaagctata catcgaaaaa gagctcagtt ggttatcgtt caatgaacgc 60

gtgcttcagg aagcggcgga caaatctaac ccgctgattg aaaggatgcg tttcctgggg 120

atctattcca ataaccttga tgagttctat aaagtccgct tcgctgaact gaagcgacgc 180

atcattatta gcgaagaaca aggctccaac tctcattccc gccatttact gggcaaaatt 240

cagtcccggg tgctgaaagc cgatcaggaa ttcgacggcc tctacaacga gctattgctg 300

gagatggcgc gcaaccagat cttcctgatt aatgaacgcc agctctccgt caatcaacaa 360

aactggctgc gtcattattt taagcagtat ctgcgtcagc acattacgcc gattttaatc 420

aatcctgaca ctgacttagt gcagttcctg aaagatgatt acacctatct ggcggtggaa 480

attatccgtg gcgataccat ccgttacgcg ctgctggaga tcccatcaga taaagtgccg 540

cgctttgtga atttaccgcc agaagcgccg cgtcgacgca agccgatgat tcttctggat 600

aacattctgc gttactgcct tgatgatatt ttcaaaggct tctttgatta tgacgcgctg 660

aatgcctatt caatgaagat gacccgcgat gccgaatacg atttagtgca tgagatggaa 720

gccagcctga tggagttgat gtcttccagt ctcaagcagc gtttaactgc tgagccggtg 780

cgttttgttt atcagcgcga tatgcccaat gcgctggttg aagtgttacg cgaaaaactg 840

actatttccc gctacgactc catcgtcccc ggcggtcgtt atcataattt taaagacttt 900

attaatttcc ccaatgtcgg caaagccaat ctggtgaaca aaccactgcc gcgtttacgc 960

catatttggt ttgataaagc ccagttccgc aatggttttg atgccattcg cgaacgcgat 1020

gtgttgctct attatcctta tcacaccttt gagcatgtgc tggaactgct gcgtcaggct 1080

tcgttcgacc cgagcgtact ggcgattaaa attaacattt accgcgtggc gaaagattca 1140

cgcatcatcg actcgatgat ccacgccgca cataacggta agaaagtcac cgtggtggtt 1200

gagttacagg cgcgtttcga cgaagaagcc aacattcact gggcgaagcg cctgaccgaa 1260

gcaggcgtgc acgttatctt ctctgcgccg gggctgaaaa ttcacgccaa actgttcctg 1320

atttcacgta aagaaaacgg tgaagtggtg cgttatgcac acatcgggac cgggaacttt 1380

aacgaaaaaa ccgcgcgtct ttatactgac tattcgttgc tgaccgccga tgcgcgcatc 1440

accaacgaag tacggcgggt atttaacttt attgaaaacc cataccgtcc ggtgacattt 1500

gattatttaa tggtatcgcc gcaaaactcc cgccgcctat tgtatgaaat ggtggaccgc 1560

gagatcgcca acgcgcagca agggctgccc agtggtatca ccctgaagct aaataacctt 1620

gtcgataaag gcctggttga tcgtctgtat gcggcctcca gctccggcgt accggttaat 1680

ctgctggttc gcggaatgtg ttcgctgatc cccaatctgg aaggcattag cgacaacatt 1740

cgtgccatca gtattgttga ccgttacctt gaacatgacc gggtttatat ttttgaaaat 1800

ggcggcgata aaaaggtcta cctttcttcc gccgactgga tgacgcgcaa tattgattat 1860

cgtattgaag tggcgacgcc gctgctcgat ccgcgcctga agcagcgggt actggacatc 1920

atcgacatat tgttcagcga tacggtcaaa gcacgttata tcgataaaga actcagtaat 1980

cgctacgttc cccgcggcaa tcgccgcaaa gtacgggcgc agttggcgat ttatgactac 2040

atcaaatcac tcgaacaacc tgaataa 2067

<210> 11

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgcgtatca ttctgcttgg cgctccgggc gcggggaaag ggactcaggc tcagttcatc 60

atggagaaat atggtattcc gcaaatctcc actggcgata tgctgcgtgc tgcggtcaaa 120

tctggctccg agctgggtaa acaagcaaaa gacattatgg atgctggcaa actggtcacc 180

gacgaactgg tgatcgcgct ggttaaagag cgcattgctc aggaagactg ccgtaatggt 240

ttcctgttgg acggcttccc gcgtaccatt ccgcaggcag acgcgatgaa agaagcgggc 300

atcaatgttg attacgttct ggaattcgac gtaccggacg aactgatcgt tgaccgtatc 360

gtcggtcgcc gcgttcatgc gccgtctggt cgtgtttatc acgttaaatt caatccgccg 420

aaagtagaag gcaaagacga cgttaccggt gaagaactga ctacccgtaa agatgatcag 480

gaagagaccg tacgtaaacg tctggttgaa taccatcaga tgacagcacc gctgatcggc 540

tactactcca aagaagcaga agcgggtaat accaaatacg cgaaagttga cggcaccaag 600

ccggttgctg aagttcgcgc tgatctggaa aaaatcctcg gctaa 645

Claims (9)

1.一种高效制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，以D-葡萄糖为底物，经全细胞催化反应并去磷酸化后制得；所述全细胞催化反应以同时表达葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶、L-鼠李树胶糖激酶、多聚磷酸盐激酶和腺苷酸激酶的重组大肠杆菌进行催化反应。

2.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述全细胞催化反应按以下操作进行：pH是7-10，反应温度为30-50℃，反应时间12-18h，反应时添加辅因子，所述辅因子为金属离子和腺苷三磷酸。

3.根据权利要求2所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的金属离子为Mg²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ca²⁺中的一种或几种组合。

4.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述全细胞催化反应，底物浓度为20～100g/L，金属离子的添加量为：5mM，ATP的添加量为20～200mM。

5.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述去磷酸化按以下操作进行：催化反应后再加热，温度控制在90-100℃，然后降温，降温后的温度控制在30-37℃,pH控制在5.0-6.0之间，取500μL全细胞催化反应液添加酸性磷酸酶30μL,摇床过夜反应所制取的为D-阿洛酮糖。

6.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌构建按以下操作进行：将来源于Bacillus sp.的葡萄糖异构酶基因gi连接到载体pRSFDuet-1上，得到重组质粒pRSFDuet-gi；将来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因dpe连接在pRSFDuet-gi上，得到重组质粒pRSFDuet-gi-dpe；再将来源于大肠杆菌BL21的L-鼠李树胶糖激酶基因rhaB与多聚磷酸盐激酶基因ppk连接到载体pETDuet-1上，二者通过linker(GGGGS)连接，得到重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk；将来源于大肠杆菌BL21的腺苷酸酶基因adk连接到pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk上，得到重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk-adk；再将重组质粒pETDuet-rhaB-GGGGS-ppk-adk和重组质粒pRSFDuet-gi-dpe转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。

7.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌经以下方法制备湿菌体：将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养，采用IPTG在20℃·条件下诱导20-24h,收集得到湿菌体。

8.根据权利要求7所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养的接种量为：1％。

9.根据权利要求7所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的LB培养基按以下组分制备：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠。

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