JP2023538225A - アセチル-CoA誘導産物を産生するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
アセチル-CoAから産物を産生するための遺伝子操作された微生物株及び関連バイオプロセス。具体的には、特定の酵素の活性を低下させるための動的制御された合成代謝バルブの使用により、2段階プロセスにおける産物産生の増加がもたらされる。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年7月24日に出願された米国仮特許出願第63/056,031号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年7月24日に出願された米国仮特許出願第63/056,031号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、細菌株などの代謝的に操作された微生物、及びそのような株を利用するバイオプロセスに関する。これらの株は、アセチル-CoAからの産物の産生をもたらす代謝経路の動的制御を提供する。
配列表
本出願は、サイズが26,740バイトであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2021年7月13日に作成された49186-48_ST25.txtとしてASCII形式で電子出願された配列表を含む。
本出願は、サイズが26,740バイトであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2021年7月13日に作成された49186-48_ST25.txtとしてASCII形式で電子出願された配列表を含む。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、NSF EAGER:#1445726、DARPA#HR 0011-14-C-0075、ONR YIP#N 00014-16-1-2558、DOE EEREグラント#EE 0007563の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、NSF EAGER:#1445726、DARPA#HR 0011-14-C-0075、ONR YIP#N 00014-16-1-2558、DOE EEREグラント#EE 0007563の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
バイオテクノロジーベースの発酵プロセスは、発酵科学及び合成生物学、並びに代謝及び酵素工学の分野における技術開発のために、近年急速な進歩を遂げている。しかしながら、商業的に競争力のあるプロセスを可能にするために、速度、力価及び収率の改善が必要とされることが多い。これらのメトリックを改善することを目的としたほとんどの代謝工学的戦略は、所望の経路酵素の過剰発現並びに競合する生化学的活性の欠失及び/又はダウンレギュレーションに依存している。過去数十年にわたって、代謝の化学量論的モデルは、遺伝子発現レベルを操作することから、増殖と産物形成を組み合わせるように設計することができるネットワークを操作することに分野を移行させるのに役立っており、選択を使用して両方を最適化することができる。
これらのアプローチの残りの制限は、細胞増殖に必要な代謝境界条件である。動的代謝制御及び具体的には2段階制御は、代謝産物及び酵素のレベルを増殖に必要な境界を超えて押し進めることができる産生状態に切り替えることによって、これらの制限を克服するための潜在的な工学的戦略を提供する。制御システム、代謝バルブ及びモデリングアプローチを含む動的代謝制御のためのツールを開発するための多大な努力がなされてきた。しかしながら、現在まで、以前の研究は、所望の経路と化学量論的に競合する「オフ」経路を切り替えることによって、フラックス動的に方向転換することに主に焦点を当ててきた。
本発明者らは、定常期フラックスが増加したのは、競合する代謝経路の減少ではなく、中心的代謝のフィードバック調節因子として作用する代謝産物の動的減少に起因することを実証した。2段階動的代謝制御を使用して、本発明者らは、中心的代謝におけるフィードバック調節の操作及び遺伝子改変微生物における生合成の改善について記載する。具体的には、本発明者らは、定常期フラックスに対する2つの中心的な代謝酵素であるクエン酸シンターゼ及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼに対する動的制御の影響を記載する。クエン酸シンターゼレベルの低下は、糖輸送の阻害剤であるα-ケトグルタル酸の低下をもたらし、グルコース取り込み及び解糖フラックスの増加をもたらす。
他の方法、特徴及び/又は利点は、以下の図及び詳細な説明を検討すると明らかになるか、又はそうなるであろう。そのような追加の方法、特徴、及び利点は全て、この説明内に含まれ、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。
本発明の新規な特徴は、特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が使用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
中心的代謝におけるフィードバック調節を操作し、遺伝子改変大腸菌(E.coli)における生合成を改善するための2段階動的代謝制御の使用について本明細書で実証する。具体的には、本発明者らは、定常期フラックスに対する2つの中心的な代謝酵素であるクエン酸シンターゼ及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼに対する動的制御の影響を報告する。第1に、クエン酸シンターゼレベルの低下は、糖輸送の阻害剤であるα-ケトグルタル酸の低下をもたらし、グルコース取り込み及び解糖フラックスの増加をもたらす。低下したグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、SoxRSレギュロン及びピルビン酸フェレドキシンオキシレダクターゼの発現を活性化し、これは次にアセチル-CoA産生の大きな増加の原因となる。これらの2つの機構により、126±7g/Lの力価を可能にするシトラマル酸の改善された定常期産生がもたらされる。これらの結果は、定常期における「中心的」代謝経路としてのピルビン酸フェレドキシンオキシレダクターゼを介したピルビン酸酸化を同定し、2段階動的代謝制御を使用して必須の中心的調節機構を操作することによってフラックスを改善する可能性を強調している。
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「発現ベクター」への言及は、単一の発現ベクター並びに同じ(例えば、同じオペロン)又は異なる複数の発現ベクターを含み、「微生物」への言及は、単一の微生物並びに複数の微生物を含む、などである。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「発現ベクター」への言及は、単一の発現ベクター並びに同じ(例えば、同じオペロン)又は異なる複数の発現ベクターを含み、「微生物」への言及は、単一の微生物並びに複数の微生物を含む、などである。
本明細書で使用される「異種DNA」、「異種核酸配列」などの用語は、以下の、(a)核酸の配列が、所与の宿主微生物に対して外来性(すなわち、天然で見出される)である、(b)配列が、所与の宿主微生物において天然に見出すことができるが、不自然な(例えば、予想よりも大きい)量であるか、又は(c)核酸の配列が、自然界で互いに同じ関係で見出されない2つ以上の部分配列を含む、のうちの少なくとも1つが真である核酸配列を指す。例えば、例(c)に関して、組換え生産される異種核酸配列は、遺伝子発現を駆動する非天然プロモータなどの新たな機能性核酸を作成するように配置された無関係な遺伝子由来の2つ以上の配列を有する。
本明細書で使用される「合成代謝バルブ」などの用語は、制御されたタンパク質分解、遺伝子サイレンシング、又は代謝フラックスを変化させるためのタンパク質分解と遺伝子サイレンシングの両方の組合せの使用を指す。
「異種」という用語は、「外因性」という用語を含むことを意図しており、これは、後者の用語が当技術分野で一般的に使用されるためである。異種核酸配列の導入前の宿主微生物のゲノムを参照すると、酵素をコードする核酸配列は、(異種核酸配列がそのゲノムに導入されるか否かにかかわらず)異種である。本明細書で使用される場合、染色体、並びに天然及び内因性は、宿主微生物の遺伝物質を指す。
本明細書で使用される場合、「遺伝子破壊」という用語、又はその文法的等価物(「酵素機能を破壊する」、「酵素機能の破壊」などを含む)は、コードされた遺伝子産物が、そのように改変されていない微生物細胞中又は微生物細胞由来のポリペプチド活性と比較して低下したポリペプチド活性を有するようにする微生物への遺伝子改変を意味することを意図している。遺伝子改変は、例えば、遺伝子全体の欠失、転写若しくは翻訳に必要な調節配列の欠失若しくは他の改変、切断された遺伝子産物(例えば、酵素)をもたらす遺伝子の一部の欠失、又はコードされた遺伝子産物の活性を低下させる(検出できる活性レベルにならないことも含める)様々な突然変異戦略のいずれかによるものであってもよい。破壊には、酵素をコードする核酸配列の全部又は一部の欠失を広く含むことができ、他のタイプの遺伝子改変、例えば、停止コドンの導入、フレームシフト変異、遺伝子の一部の導入又は除去、及び分解シグナルの導入も含まれるが、これらに限定されず、これらの遺伝子改変は、mRNA転写レベル及び/又は安定性に影響を及ぼし、酵素をコードする遺伝子の上流のプロモータ又はリプレッサーを改変する。
本明細書で使用される生物産生、微小発酵(Micro-fermentation)(微小発酵(microfermentation))又は発酵は、好気性、微好気性又は嫌気性であってもよい。
遺伝子産物、すなわち酵素の遺伝子改変が本明細書において特許請求の範囲を含めて言及される場合、遺伝子改変は、述べられた遺伝子産物、すなわち酵素を通常コードする、遺伝子などの、又は遺伝子を含む核酸配列のものであることが理解される。
本明細書で使用される場合、「代謝フラックス」などの用語は、所与の基質からの産生速度、産生力価及び産生収率を含む、産物及び/又は副産物形成の変化をもたらす代謝の変化を指す。
種及び他の系統発生的同定は、微生物学の当業者に公知の分類に従う。
酵素は、UniProt識別番号を参照して本明細書に列挙されており、これは当業者に公知である。UniProtデータベースは、UniProt.orgでアクセスすることができる。遺伝子産物、すなわち酵素の遺伝子改変が本明細書において特許請求の範囲を含めて言及される場合、遺伝子改変は、述べられた遺伝子産物、すなわち酵素を通常コードする、遺伝子などの、又は遺伝子を含む核酸配列のものであることが理解される。
本明細書に記載の方法及び工程が特定の順序で生じる特定の事象を示す場合、当業者は、特定の工程の順序を変更することができ、そのような変更が本発明の変形例に従うことを認識するであろう。更に、特定の工程は、可能であれば並列処理で同時に実行されてもよく、順次実行されてもよい。
略語の意味は以下の通りであり、使用法から明らかなように、「C」は摂氏若しくは摂氏度又は℃を意味し、DCWは乾燥細胞重量を意味し、「s」は秒を意味し、「min」は分を意味し、「h」、「hr」又は「hrs」は時間を意味し、「psi」は平方インチ当たりのポンドを意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「d」は日数を意味し、「μL」又は「uL」又は「ul」はマイクロリットルを意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「mm」はミリメートルを意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「mM」はミリモルを意味し、「μmol」又は「uMol」はマイクロモルを意味し、「g」はグラムを意味し、「μg」又は「ug」はマイクログラムを意味し、「ng」はナノグラムを意味し、「PCR」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「OD」は光学密度を意味し、「OD600」は光子波長600nmで測定された光学密度を意味し、「kDa」はキロダルトンを意味し、「g」は重力定数を意味し、「bp」は塩基対を意味し、「kbp」はキロ塩基対を意味し、「%w/v」は「重量/体積パーセント」を意味し、「%v/v」は体積/体積パーセントを意味し、「IPTG」はイソプロピル-μ-D-チオガラクトピラノイジドを意味し、「aTc」はアンヒドロテトラサイクリンを意味し、「RBS」はリボソーム結合部位を意味し、「rpm」は毎分回転数を意味し、「HPLC」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「GC」はガスクロマトグラフィーを意味する。
I.炭素源
組換え微生物と共に本発明で使用される生物産生培地は、増殖段階と産生段階の両方に適した炭素源又は基質を含有しなければならない。適切な基質としては、グルコース、又はキシロース、グルコース、スクロース、キシロース、マンノース、アラビノース、油、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド又はグリセロールの組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記の炭素基質及びそれらの混合物の全てが、炭素源として本発明に適していると考えられる。
組換え微生物と共に本発明で使用される生物産生培地は、増殖段階と産生段階の両方に適した炭素源又は基質を含有しなければならない。適切な基質としては、グルコース、又はキシロース、グルコース、スクロース、キシロース、マンノース、アラビノース、油、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド又はグリセロールの組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。上記の炭素基質及びそれらの混合物の全てが、炭素源として本発明に適していると考えられる。
II.微生物
本明細書に記載され、特許請求される特徴は、本明細書のリストから選択される微生物、あるいは1つ又は複数の天然、導入、若しくは強化された産物の生物産生経路も含む別の適切な微生物において提供することができる。したがって、いくつかの実施形態では、微生物は、内因性産物産生経路(いくつかのそのような実施形態では、強化されてもよい)を含むが、他の実施形態では、微生物は内因性産物産生経路を含まない。
本明細書に記載され、特許請求される特徴は、本明細書のリストから選択される微生物、あるいは1つ又は複数の天然、導入、若しくは強化された産物の生物産生経路も含む別の適切な微生物において提供することができる。したがって、いくつかの実施形態では、微生物は、内因性産物産生経路(いくつかのそのような実施形態では、強化されてもよい)を含むが、他の実施形態では、微生物は内因性産物産生経路を含まない。
より具体的には、本明細書に記載の様々な基準に基づいて、化学産物の生物産生に適した微生物宿主には、一般に、共通方法の項に記載の生物が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書に記載の任意の遺伝子又はタンパク質の宿主微生物又は供給源微生物は、微生物の以下のリストである、シトロバクター(Citrobacter)、エンテロバクター(Enterobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、クレブシエラ(Klebsiella)、アエロバクター(Aerobacter)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、アスペルギルス(Aspergillus)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ジゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、ピキア(Pichia)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ムコール(Mucor)、トルロプシス(Torulopsis)、メチロバクター(Methylobacter)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、バチルス(Bacillus)、ストレプトミセス(Streptomyces)及びシュードモナス(Pseudomonas)から選択することができる。いくつかの態様では、宿主微生物は大腸菌(E.coli)微生物である。
III.培地及び培養条件
本明細書に開示される種類の1つから選択されるような適切な炭素源に加えて、生物産生培地は、培養物の増殖及び本発明の下での化学産物の生物産生の促進に適した、当業者に公知の適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液及び他の成分を含有しなければならない。
本明細書に開示される種類の1つから選択されるような適切な炭素源に加えて、生物産生培地は、培養物の増殖及び本発明の下での化学産物の生物産生の促進に適した、当業者に公知の適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液及び他の成分を含有しなければならない。
本発明の別の態様は、本発明の遺伝子改変微生物及び場合によりサプリメントを含む培地及び培養条件に関する。
典型的には、細胞は、適切な培地中で約25℃~約40℃の範囲の温度、並びに好熱性微生物については最大70℃の温度で増殖される。適切な増殖培地は、当技術分野において十分に特徴付けられ、公知である。生物産生に適したpH範囲はpH2.0~pH10.0であり、pH6.0~pH8.0が初期条件の典型的なpH範囲である。しかし、特定の実施形態の実際の培養条件は、これらのpH範囲によって限定されることを意味しない。生物産生は、撹拌の有無にかかわらず、好気性、微好気性又は嫌気性条件下で行うことができる。
IV.生物産生反応器及びシステム
本発明による方法及び/又は組成物を利用する発酵システムも本発明の範囲内である。本明細書に記載及び/又は言及される組換え微生物はいずれも、商業的に実行可能な操作で微生物が炭素源を産物に変換する産業用生物産生システムに導入することができる。生物産生システムは、そのような組換え微生物を、組換え微生物を増殖させるのに適した炭素源基質及び生物産生培地を用いてバイオリアクター容器に導入し、生物産生システムを適した温度範囲(及び反応が好気性又は微好気性である場合は溶存酸素濃度範囲)で適切な時間維持し、基質分子の一部を選択された化学産物に所望の変換を得ることを含む。生物産生は、撹拌の有無にかかわらず、好気性、微好気性又は嫌気性条件下で行うことができる。産業用生物産生システム及びその操作は、化学工学及びバイオプロセス工学の当業者に公知である。
本発明による方法及び/又は組成物を利用する発酵システムも本発明の範囲内である。本明細書に記載及び/又は言及される組換え微生物はいずれも、商業的に実行可能な操作で微生物が炭素源を産物に変換する産業用生物産生システムに導入することができる。生物産生システムは、そのような組換え微生物を、組換え微生物を増殖させるのに適した炭素源基質及び生物産生培地を用いてバイオリアクター容器に導入し、生物産生システムを適した温度範囲(及び反応が好気性又は微好気性である場合は溶存酸素濃度範囲)で適切な時間維持し、基質分子の一部を選択された化学産物に所望の変換を得ることを含む。生物産生は、撹拌の有無にかかわらず、好気性、微好気性又は嫌気性条件下で行うことができる。産業用生物産生システム及びその操作は、化学工学及びバイオプロセス工学の当業者に公知である。
生物産生培地中で産生される産物の量は、一般に、当技術分野で公知の多くの方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)又はGC/質量分析(MS)を用いて決定することができる。
V.遺伝子改変、ヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列
本発明の実施形態は、発現ベクターの宿主微生物への導入から生じてもよく、発現ベクターは、宿主微生物に通常見られる、又は通常見られない酵素をコードする核酸配列を含有する。
本発明の実施形態は、発現ベクターの宿主微生物への導入から生じてもよく、発現ベクターは、宿主微生物に通常見られる、又は通常見られない酵素をコードする核酸配列を含有する。
宿主細胞を遺伝子改変する能力は、任意の遺伝子改変された(組換え)微生物の作成に不可欠である。遺伝子導入技術のモードは、エレクトロポレーション、接合、形質導入、又は自然形質転換によるものであってもよい。広範囲の宿主接合性プラスミド及び薬物耐性マーカが利用可能である。クローニングベクターは、その宿主において機能することができる抗生物質耐性マーカの性質に基づいて、宿主生物に合わせて調整される。また、本明細書に開示されるように、遺伝子改変(組換え)微生物は、そのゲノムDNAに対する改変を含む、プラスミド導入以外の改変を含むことができる。
より一般的には、制御配列と適合する条件下で、大腸菌(E.coli)などの微生物におけるコード配列の発現を指示する1つ又は複数の(いくつかの)制御配列に作動可能に連結された、酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物を調製することができる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらすように操作することができる。発現ベクターに応じて、ベクターへの挿入前にポリヌクレオチドの配列の操作が望ましいか、又は必要であり得る。組換えDNA法を利用してポリヌクレオチド配列を改変するための技術は、当技術分野において十分に確立されている。
制御配列は、適切なプロモータ配列、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるヌクレオチド配列であってもよい。プロモータ配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含むことができる。プロモータは、変異プロモータ、切断プロモータ及びハイブリッドプロモータを含む、好まれる宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってもよく、宿主細胞と相同又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。組換えDNAプロモータ配列を改変及び利用するための技術は、当技術分野において十分に確立されている。
本発明の様々な実施形態では、遺伝子操作は、酵素の調節、したがって最終的な活性、又はそれぞれの経路のいずれかで同定された酵素の酵素活性を変更することを目的とした操作を含むことができる。そのような遺伝子改変は、選択された培養条件下で酵素活性及び/又は選択性の変化をもたらす転写、翻訳及び翻訳後改変を対象とすることができる。核酸配列の遺伝子操作は、コピー数を増加させ、及び/又は産物産生に関連する酵素の変異体の使用を含むことができる。そのような遺伝子改変を達成するための具体的な方法及びアプローチは、当業者に公知である。
様々な実施形態では、より効率的に機能するために、微生物は1つ又は複数の遺伝子欠失を含むことができる。例えば、大腸菌(E.coli)では、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(pta)、ピルビン酸オキシダーゼ(poxB)、ピルビン酸ギ酸リアーゼ(pflB)、メチルグリオキサルシンターゼ(mgsA)、酢酸キナーゼ(ackA)、アルコールデヒドロゲナーゼ(adhE)、clpXPプロテアーゼ特異性増強因子(sspB)、ATP依存性Lonプロテアーゼ(lon)、外膜プロテアーゼ(ompT)、arcA転写二重調節因子(arcA)、及びiclR転写調節因子(iclR)をコードする遺伝子を、欠失させることを含めて破壊することができる。欠失を含むそのような遺伝子破壊は、限定することを意味するものではなく、様々な実施形態において様々な組合せで実施することができる。遺伝子欠失は、外来DNAを宿主染色体に組み込む方法と同様に、当技術分野で公知の多数の戦略によって達成することができる。
様々な実施形態では、より効率的に機能するために、微生物は、制御されたタンパク質分解、発現サイレンシング、又は制御されたタンパク質分解と発現サイレンシングの両方の組合せを標的とする酵素で構成される1つ又は複数の合成代謝バルブを含むことができる。例えば、大腸菌(E.coli)の1つの遺伝子によってコードされる1つの酵素又は多数の遺伝子によってコードされる多数の酵素の組合せは、代謝を変化させ、産物形成を改善するための合成代謝バルブとして設計することができる。大腸菌(E.coli)の代表的な遺伝子としては、以下のfabI、zwf、gltA、ppc、udhA、lpd、sucD、aceA、pfkA、lon、rpoS、pykA、pykF、tktA又はtktBを挙げることができるが、これらに限定されない。これらの遺伝子のホモログ及び/又は更なる微生物種における他の遺伝子を同定する方法は当業者に公知であることが理解される。
本明細書で提供される全ての核酸及びアミノ酸配列について、これらの配列の保存的に改変された変異体が含まれ、その様々な実施形態において本発明の範囲内であることが理解される。機能的に等価な核酸及びアミノ酸配列(機能的変異体)は、保存的に改変された変異体、並びに十分に当業者の技能の範囲内であるより広範囲に変化する配列、及びこれらを含む微生物を含むことができ、また、そのような配列及び/又は微生物を含む方法及びシステムと同様に、本発明の様々な実施形態の範囲内である。
したがって、上記の様々なセクションに記載されるように、本発明のいくつかの組成物、方法及びシステムは、フラックスを再分配するための合成代謝バルブと組み合わせて、中央中間体から所望の産物を産生するための産生経路の両方を含む遺伝子改変微生物を提供することを含む。
本発明の態様はまた、選択された炭素源を選択された産物に変換する際の微生物の全体的な有効性を改善するための複数の遺伝子改変の提供に関する。遺伝子改変のより基本的な組合せを実質的に超えて比産生性、体積産生性、力価及び収量を増加させるための特定の組合せが、例などに示されている。
上記の遺伝子改変に加えて、様々な実施形態では、合成代謝バルブを含む遺伝子改変も提供され、産物の産生において消費され得るNADPH及び/又はNADHなどの補因子のプール及び利用可能性を増加又は減少させる。
VI.合成代謝バルブ
合成代謝バルブの使用は、産生期中の代謝フラックス及び生理学的要求をよりシンプルにモデル化することができ、増殖細胞を定常期の生体触媒に変える。これらの合成代謝バルブを使用して、多段階発酵プロセスにおいて、必須遺伝子をオフにし、炭素、電子、及びエネルギーフラックスを産物形成に向け直すことができる。以下の、1)転写遺伝子サイレンシング又は抑制技術と、2)誘導性及び選択的酵素分解との組合せ、並びに3)定常又は非分裂細胞状態を誘導するための栄養制限の1つ又は複数は、記載される合成バルブを提供する。SMVは、任意の経路及び微生物宿主に一般化することができる。これらの合成代謝バルブは、再生可能な化学物質及び燃料、並びに全細胞触媒作用によって産生することができる任意の産物の産生に有用な新規の迅速な代謝工学戦略を可能にする。
特に、本発明は、制御された遺伝子サイレンシング及び制御されたタンパク質分解の1つ又は複数若しくは組合せを含む合成代謝バルブの構築を記載する。当業者は、遺伝子サイレンシング及び制御されたタンパク質分解のためのいくつかの方法を認識していることが理解される。
VI.A遺伝子サイレンシング
特に、本発明は、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御された遺伝子サイレンシングの使用を記載する。mRNAサイレンシング又はRNA干渉、転写リプレッサーを介したサイレンシング及びCRISPR干渉を含むがこれらに限定されない、制御された遺伝子サイレンシングのための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。RNA干渉のための方法及び機構は、Agrawal et al.「RNA Interference:Biology,Mechanism,and Applications」Microbiology and Molecular Biology Reviews,December 2003;67(4)p657-685.DOI:10.1128/MMBR.67.657-685.2003によって教示されている。CRISRPR干渉のための方法及び機構は、Qi et al.「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression」Cell February 2013;152(5)p1173-1183.DOI:10.1016/j.cell.2013.02.022によって教示されている。更に、ネイティブ大腸菌(E.coli)CASCADEシステムを使用したCRISRPR干渉のための方法論及び機構は、Luo et al.「Repurposing endogenous type I CRISPR-Cas systems for programmable gene repression」NAR.October 2014;DOI:10.1093によって教示されている。更なる多数の転写リプレッサーシステムは当技術分野で周知であり、遺伝子発現をオフにするために使用することができる。
特に、本発明は、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御された遺伝子サイレンシングの使用を記載する。mRNAサイレンシング又はRNA干渉、転写リプレッサーを介したサイレンシング及びCRISPR干渉を含むがこれらに限定されない、制御された遺伝子サイレンシングのための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。RNA干渉のための方法及び機構は、Agrawal et al.「RNA Interference:Biology,Mechanism,and Applications」Microbiology and Molecular Biology Reviews,December 2003;67(4)p657-685.DOI:10.1128/MMBR.67.657-685.2003によって教示されている。CRISRPR干渉のための方法及び機構は、Qi et al.「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression」Cell February 2013;152(5)p1173-1183.DOI:10.1016/j.cell.2013.02.022によって教示されている。更に、ネイティブ大腸菌(E.coli)CASCADEシステムを使用したCRISRPR干渉のための方法論及び機構は、Luo et al.「Repurposing endogenous type I CRISPR-Cas systems for programmable gene repression」NAR.October 2014;DOI:10.1093によって教示されている。更なる多数の転写リプレッサーシステムは当技術分野で周知であり、遺伝子発現をオフにするために使用することができる。
VI.B制御されたタンパク質分解
特に、本発明は、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御されたタンパク質分解(protein degradation)又はタンパク質分解(proteolysis)の使用を記載する。特定のプロテアーゼによる標的化タンパク質切断及び特定のペプチドタグによる分解のためのタンパク質の制御された標的化を含むがこれらに限定されない、制御されたタンパク質分解のための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。制御されたタンパク質分解のための大腸菌(E.coli)clpXPプロテアーゼの使用のためのシステムは、McGinness et al「Engineering controllable protein degradation」Mol Cell.June 2006;22(5)p701-707によって教示されている。この方法は、DAS4(又はDAS+4)タグなどの特定のC末端ペプチドタグを付加することに依存する。このタグを有するタンパク質は、特異性増強シャペロンsspBが発現されるまで、clpXPプロテアーゼによって分解されない。sspBは、clpXPプロテアーゼによるDAS4タグ付きタンパク質の分解を誘導する。更なる多数の部位では、特異的プロテアーゼ系が当技術分野で公知である。タンパク質は、所与のプロテアーゼの特定の標的部位を含むように操作され、次いでプロテアーゼの制御された発現後に切断することができる。いくつかの実施形態では、切断は、タンパク質の不活性化又は分解をもたらすと予想することができる。例えば、Schmidt et al(「ClpS is the recognition component for Escherichia coli substrates of the N-end rule degradation pathway」Molecular Microbiology March 2009.72(2),506-517.doi:10.1111)は、clpS依存性clpAP分解を提供する際に目的のタンパク質にN末端配列を付加することができることを教示している。更に、この配列は、ULPヒドロラーゼなどによって制御可能に切断されることができる追加のN末端配列によって更にマスクすることができる。これにより、ヒドロラーゼ発現に依存する制御されたN末端則分解が可能になる。したがって、N末端又はC末端のいずれかで制御されたタンパク質分解のためにタンパク質をタグ化することが可能である。N末端タグとC末端タグのどちらを使用するかは、制御された分解開始前にどちらのタグがタンパク質機能に影響を及ぼすかどうかに大きく依存する。
特に、本発明は、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御されたタンパク質分解(protein degradation)又はタンパク質分解(proteolysis)の使用を記載する。特定のプロテアーゼによる標的化タンパク質切断及び特定のペプチドタグによる分解のためのタンパク質の制御された標的化を含むがこれらに限定されない、制御されたタンパク質分解のための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。制御されたタンパク質分解のための大腸菌(E.coli)clpXPプロテアーゼの使用のためのシステムは、McGinness et al「Engineering controllable protein degradation」Mol Cell.June 2006;22(5)p701-707によって教示されている。この方法は、DAS4(又はDAS+4)タグなどの特定のC末端ペプチドタグを付加することに依存する。このタグを有するタンパク質は、特異性増強シャペロンsspBが発現されるまで、clpXPプロテアーゼによって分解されない。sspBは、clpXPプロテアーゼによるDAS4タグ付きタンパク質の分解を誘導する。更なる多数の部位では、特異的プロテアーゼ系が当技術分野で公知である。タンパク質は、所与のプロテアーゼの特定の標的部位を含むように操作され、次いでプロテアーゼの制御された発現後に切断することができる。いくつかの実施形態では、切断は、タンパク質の不活性化又は分解をもたらすと予想することができる。例えば、Schmidt et al(「ClpS is the recognition component for Escherichia coli substrates of the N-end rule degradation pathway」Molecular Microbiology March 2009.72(2),506-517.doi:10.1111)は、clpS依存性clpAP分解を提供する際に目的のタンパク質にN末端配列を付加することができることを教示している。更に、この配列は、ULPヒドロラーゼなどによって制御可能に切断されることができる追加のN末端配列によって更にマスクすることができる。これにより、ヒドロラーゼ発現に依存する制御されたN末端則分解が可能になる。したがって、N末端又はC末端のいずれかで制御されたタンパク質分解のためにタンパク質をタグ化することが可能である。N末端タグとC末端タグのどちらを使用するかは、制御された分解開始前にどちらのタグがタンパク質機能に影響を及ぼすかどうかに大きく依存する。
本発明は、大腸菌(E.coli)における、制御された多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御を提供するための制御されたタンパク質分解(protein degradation)又はタンパク質分解(proteolysis)の使用を記載する。広範囲のグラム陰性並びにグラム陽性細菌、酵母及び更には古細菌を含む、他の微生物宿主における制御されたタンパク質分解のための当技術分野で公知のいくつかの方法がある。特に、制御されたタンパク質分解のための系は、天然の微生物宿主から移され、非天然宿主で使用することができる。例えば、Grilly et al「A synthetic gene network for tuning protein degradation in Saccharomyces cerevisiae」Molecular Systems Biology 3,Article 127.doi:10.1038は、酵母(Saccharomyces cerevisiae)における大腸菌(E.coli)clpXPプロテアーゼの発現及び使用を教示している。そのようなアプローチは、合成代謝バルブのための方法を任意の遺伝的に扱いやすい宿主に移すために使用することができる。
VI.C合成代謝バルブの制御
特に、本発明は、多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスを制御するための合成代謝バルブの使用を記載する。多段階発酵における段階間の移行で使用することができる、発現を誘導するための当技術分野で公知の多数の方法がある。これらとしては、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ラクトース、IPTG(イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド)、アラビノース、ラフィノース、トリプトファンなどを含む人工化学誘導剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの公知の誘導物質の使用を遺伝子発現サイレンシング及び/又は制御されたタンパク質分解の制御に結び付けるシステムは、多段階発酵プロセスにおける増殖期と産生期との間の移行を制御するために遺伝子改変微生物系に組み込むことができる。
特に、本発明は、多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスを制御するための合成代謝バルブの使用を記載する。多段階発酵における段階間の移行で使用することができる、発現を誘導するための当技術分野で公知の多数の方法がある。これらとしては、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ラクトース、IPTG(イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド)、アラビノース、ラフィノース、トリプトファンなどを含む人工化学誘導剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの公知の誘導物質の使用を遺伝子発現サイレンシング及び/又は制御されたタンパク質分解の制御に結び付けるシステムは、多段階発酵プロセスにおける増殖期と産生期との間の移行を制御するために遺伝子改変微生物系に組み込むことができる。
更に、増殖中に消費される1つ又は複数の制限栄養素の枯渇によって、多段階発酵における増殖と産生との間の移行を制御することが望ましい場合がある。制限栄養素としては、リン酸塩、窒素、硫黄及びマグネシウムを挙げることができるが、これらに限定されない。これらの栄養制限に応答する天然の遺伝子発現系を使用して、遺伝子発現サイレンシング及び/又は制御されたタンパク質分解の制御を、多段階発酵プロセスにおける増殖期と産生期との間の移行に作動可能に結び付けることができる。
本発明の範囲内には、遺伝子改変微生物が含まれ、その微生物は、0.05g/gDCW-hr超、0.08g/gDCW-hr超、0.1g/gDCW-hr超、0.13g/gDCW-hr超、0.15g/gDCW-hr超、0.175g/gDCW-hr超、0.2g/gDCW-hr超、0.25g/gDCW-hr超、0.3g/gDCW-hr超、0.35g/gDCW-hr超、0.4g/gDCW-hr超、0.45g/gDCW-hr超、又は0.5g/gDCW-hr超の速度から選択される比速度で産物を産生することができる。
様々な実施形態では、本発明は、水性媒体中の炭素源と、本明細書の請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物とを含む培養系を含み、当該遺伝子改変微生物は、水性媒体の体積が5mL超、100mL超、0.5L超、1L超、2L超、10L超、250L超、1000L超、10,000L超、50,000L超、100,000L超又は200,000L超から選択される場合など、及び水性媒体の体積が250L超で鋼製容器内に含まれる場合などでは、0.05gDCW/L超、0.1gDCW/L超、1gDCW/L超、5gDCW/L超、10gDCW/L超、15gDCW/L超、又は20gDCW/L超から選択される量で存在する。
発明態様の概要
一態様では、バイオ発酵プロセスで使用可能な遺伝子改変微生物が提供され、その微生物は、アセチルCoA前駆体から産物を産生するための少なくとも1つの酵素を含む産生経路を含む。微生物は、遺伝子改変微生物が増殖している増殖培地から制限栄養素を枯渇させる条件下で、定常期又は非分裂細胞状態に誘導される。この定常期では、ピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性が、定常期又は非分裂細胞状態の間の好気性又は部分好気性条件下で遺伝子改変微生物内で増加して、アセチルCoAプールを産生し、非遺伝子改変微生物と比較した場合、遺伝子改変微生物内で更なる糖取り込みが増強される。
一態様では、バイオ発酵プロセスで使用可能な遺伝子改変微生物が提供され、その微生物は、アセチルCoA前駆体から産物を産生するための少なくとも1つの酵素を含む産生経路を含む。微生物は、遺伝子改変微生物が増殖している増殖培地から制限栄養素を枯渇させる条件下で、定常期又は非分裂細胞状態に誘導される。この定常期では、ピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性が、定常期又は非分裂細胞状態の間の好気性又は部分好気性条件下で遺伝子改変微生物内で増加して、アセチルCoAプールを産生し、非遺伝子改変微生物と比較した場合、遺伝子改変微生物内で更なる糖取り込みが増強される。
一態様では、遺伝子改変微生物は、クエン酸シンターゼ(gltA)及び/又はグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングする条件付きトリガ合成代謝バルブ、又はクエン酸シンターゼ(gltA)及び/又はグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)酵素の選択的タンパク質分解を可能にする条件付きトリガ合成代謝バルブを含み、微生物の合成代謝バルブは、定常期又は非分裂細胞状態の間に条件付きでトリガされる。
一態様では、遺伝子改変微生物は、内因性poxB及びpflB遺伝子の欠失を含む。
一態様では、遺伝子改変微生物のピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性の増加は、定常期又は非分裂細胞状態の間のピルビン酸フェレドキシンオキシレダクターゼをコードする遺伝子の過剰発現に起因する。
一態様では、遺伝子改変微生物のピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性の増加、ピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素は、ydbK遺伝子によってコードされ、遺伝子改変微生物は、エンテロバクター(Enterobacter)微生物である。
一態様では、遺伝子改変微生物のピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性の増加は、定常期又は非分裂細胞状態の間の酸化的soxRSレギュロンの誘導に起因する。
一態様では、遺伝子改変微生物のピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性の増加、ピルビン酸フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性の増加は、定常期又は非分裂細胞状態中の遺伝子改変微生物内のNADPHレベルの減少の結果として増加する。
一態様では、遺伝子改変微生物の少なくとも1つの糖輸送体の活性は、糖取り込みを増強するために少なくとも1つの糖輸送体の活性を増加させる。
一態様では、遺伝子改変微生物の少なくとも1つの糖輸送体の活性は、糖輸送体遺伝子の構成的発現の結果、遺伝子改変微生物内の糖輸送体活性の増加をもたらす。
一態様では、遺伝子改変微生物の少なくとも1つの糖輸送体の活性は、定常期又は非分裂細胞状態の間に条件付きで過剰発現された結果である。
一態様では、遺伝子改変微生物の糖輸送体は、pts遺伝子によってコードされる。
一態様では、遺伝子改変微生物はエンテロバクター(Enterobacter)微生物である。一態様では、微生物は大腸菌(E.coli)微生物である。
一態様では、遺伝子改変微生物は、産生経路の酵素としてシトラマル酸シンターゼを含む。
一態様では、遺伝子改変微生物からタンパク質産物を産生するためのバイオプロセスが提供される。バイオプロセスは、第1段階では、培地中で遺伝子改変微生物を増殖させ、第2段階では、増殖培地からの制限栄養素の枯渇時に、定常期又は非分裂細胞状態を誘導することを含む。定常期又は非分裂細胞状態の遺伝子改変微生物であるバイオプロセスは、30g/L以上の割合で産物を産生する。
別の態様では、バイオプロセスは、活性ピルビン酸フェレドキシンオキシレダクターゼをコードする遺伝子の過剰発現、酸化的soxRSレギュロンの誘導、NADPHレベルの減少、zwf遺伝子の遺伝子サイレンシング又はグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ酵素の選択的タンパク質分解を対象とする合成代謝バルブによるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼレベルの減少、定常期又は非分裂細胞状態で活性化されるバルブ、又はそれらの組合せによって引き起こされる、ピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素の活性を含む。
一態様では、バイオプロセスは、少なくとも1つの糖輸送体の活性が増加している。
一態様では、バイオプロセスは、シトラマル酸産物をもたらし、産生経路の酵素は、シトラマル酸シンターゼを含み、バイオプロセスは、100g/L以上のシトラマル酸を産生する。一態様では、シトラマル酸シンターゼ酵素は、cimA3.7遺伝子によってコードされる。
一態様では、バイオプロセスの遺伝子改変微生物は、低リン酸誘導性プロモータに作動可能に連結されたシトラマル酸シンターゼ遺伝子を含むプラスミドを含む。
一態様では、バイオプロセスは、内因性poxB及びpflB遺伝子の欠失を含む遺伝子改変微生物の使用を含む。
開示された実施形態は非限定的である
本発明の様々な実施形態を本明細書で示し説明してきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることが強調される。その様々な実施形態において、本明細書の本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置き換えを行うことができる。具体的には、いかなる理由であれ、本明細書においてリスト、表若しくは他のグループ(図3A、図4A、図5Aに示す代謝経路酵素など)において述べられているか、若しくは別段で提示されている、化合物、核酸配列、機能性酵素を含む特定のタンパク質を含むポリペプチド、代謝経路酵素若しくは中間体、要素若しくは他の組成物、又は濃度の任意のグループ化について、別段明確に述べられていない限り、そのような各グループ化は、様々なサブセット実施形態の基礎を提供し、それを識別するのに役立ち、その最も広い範囲のサブセット実施形態は、それぞれ述べられているグループ化の1つ又は複数のメンバー(又はサブセット)を除外することによって、そのようなグループ化の全てのサブセットを含むことが意図されている。更に、本明細書に任意の範囲が記載されている場合、別段明確に述べられていない限り、その範囲は、その中の全ての値及びその中の全ての部分範囲を含む。
また、より一般的には、本明細書の開示、議論、例及び実施形態によれば、当業者の技術の範囲内で、従来の分子生物学、細胞生物学、微生物学、及び組換えDNA技術を使用することができる。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook and Russell「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」Third Edition 2001(volume 1-3),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.、Animal Cell Culture,R.I.Freshney,ed.,1986を参照されたい。これらの公開されたリソースは、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の公開リソースは、本明細書に記載された本発明と併せて有用な説明、例えば、糖源から化学産物を工業的に生物産生する方法、及びそのような変換を達成するために使用することができる産業システムに関して、参照により本明細書に組み込まれる(例えば、バイオリアクターの設計に関して、Biochemical Engineering Fundamentals,2nd Ed.J.E.Bailey and D.F.Ollis,McGraw Hill,New York,1986の第9章、533~657ページ、例えば、プロセス及び分離技術分析に関して、Unit Operations of Chemical Engineering,5th Ed.,W.L.McCabe et al.,McGraw Hill,New York 1993、例えば、分離技術の教示に関して、Equilibrium Staged Separations,P.C.Wankat,Prentice Hall,Englewood Cliffs,NJ USA,1988)。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、2015年6月11日に出願された国際出願US2015/035306号及び2018年2月21日に出願された国際出願US2018/019040号を含めて、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
例
本明細書の例は、限定することを意図しないいくつかの例を提供する。全ての試薬は、特に明記しない限り、商業的に入手される。種及び他の系統発生的同定は、微生物学、分子生物学及び生化学の当業者に公知の分類に従う。
本明細書の例は、限定することを意図しないいくつかの例を提供する。全ての試薬は、特に明記しない限り、商業的に入手される。種及び他の系統発生的同定は、微生物学、分子生物学及び生化学の当業者に公知の分類に従う。
一般的な方法
培地及び試薬
特に明記しない限り、全ての材料及び試薬はSigma(ミズーリ州セントルイス)から購入した。Lennox LB製剤を日常的な株及びプラスミドの増殖及び構築に使用した。FGM1、FGM30及びSM10++種培地を、Menacho-Melgarらが以前に記載したように調製した(doi:10.1101/820787)。SM10++及びSM10無リン酸培地を、Morebらが以前に記載したように調製した(doi:10.1021/acssynbio.0c00182)。biolector研究で使用されるFGM3培地は、補足材料に詳述されている。使用した抗生物質濃度は以下の、カナマイシンが35μg/mL、クロラムフェニコールが35μg/mL、ゼオシンが100μg/mL、ブラスチシジンが100μg/mL、スペクチノマイシンが25μg/mL、テトラサイクリンが5μg/mLの通りであった。
FGM3培地/培地原液
水に30gの(NH4)2SO4及び1.5gのクエン酸を撹拌しながら混合し、NaOHでpHを7.5に調整することによる、10倍濃縮クエン酸アンモニウム30塩(1L)。オートクレーブし、室温(RT)で保存する。
水に90gの(NH4)2SO4及び2.5gのクエン酸を撹拌しながら混合し、NaOHでpHを7.5に調整することによる、10倍濃縮クエン酸アンモニウム90塩(1L)。オートクレーブし、室温で保存する。
KOHでpH7.4に調整した、1Mカリウム3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)。濾過滅菌(0.2μm)し、室温で保存する。
248.5mLの1.0M K2HPO4及び251.5mLの1.0M KH2PO4を混合し、超純水で最終容量1000mLに調整することによる、0.5Mリン酸カリウム緩衝液、pH6.8。濾過滅菌(0.2μm)し、室温で保存する。
2M MgSO4及び10mM CaSO4溶液。濾過滅菌(0.2μm)し、室温で保存する。
チアミン-HClの50g/L溶液。濾過滅菌(0.2μm)し、4℃で保存する。
加熱撹拌によって溶解させた、500g/Lのグルコース溶液。冷却し、濾過滅菌(0.2μm)し、室温で保存する。
500倍微量金属ストック:10mLの濃H2SO4を含有する1000mLの水中の微量栄養素の溶液を調製する。0.6gのCoSO4・7H20、5.0gのCuSO4・5H20、0.6gのZnSO4・7H20、0.2gのNa2MoO4・2H2O、0.1gのH3BO3、及び0.3gのMnSO4・H2O。濾過滅菌(0.2μm)し、暗所で室温で保存する。
40mM硫酸第二鉄七水和物の新鮮な水溶液を調製し、培地を調製する前に毎回濾過滅菌(0.2μm)する。
培地成分:沈殿を最小限に抑えるように記載された順序で以下の表に基づいて原液を無菌的に混合することによって最終作業培地を調製し、次いで(0.2μmフィルタを用いて)濾過滅菌する。
改変株
株及びプラスミド
プラスミド及び株の情報を表2~4に示す。オリゴヌクレオチド及び合成直鎖状DNA(Gblocks(商標))の配列は、Integrated DNA Technologies(IDT、アイオワ州コーラルビル)から入手した。欠失を、tet-sacBに基づく選択及び逆選択によって構築した。C末端DAS+4タグ(スーパーフォルダGFPタグあり又はなし)を直接組み込みによって染色体遺伝子に付加し、遺伝子の抗生物質耐性カセット3’の組み込みによって選択した。全ての株をPCR、アガロースゲル電気泳動によって確認し、全領域に隣接する対のオリゴヌクレオチドを使用して配列決定(Eton Biosciences、又はGenewiz)によって確認した。組換えプラスミドpSIM5及びtet-sacB選択/逆選択マーカカセットは、Donald Court(NCI、redrecombineering.ncifcrf.gov/court-lab.html)から譲り受けた。株BW25113は、Yale Genetic Stock Center(CGSC:cgsc.biology.yale.edu)から入手した。株DLF_R002は、Menacho-Melgarらによって以前に報告されたように構築した(doi:10.1101/820787)。株DLFZ_0025は、最初にネイティブなsspB遺伝子を欠失させることによって(tet-sacBベースの選択及び逆選択を使用して)DLF_R002から構築した。続いて、cas3遺伝子を欠失させ、低リン酸誘導性sspB(ugpB遺伝子プロモータを使用)対立遺伝子並びに構成的プロモータで置き換えて、Cascadeオペロンの発現を駆動した(再びtet-sacBに基づく選択及び逆選択を使用)。C末端DAS+4タグ修飾(スーパーフォルダGFPタグあり又はなし)を組み込みによってDLF_Z0025及びその誘導体の染色体に付加し、遺伝子の抗生物質耐性カセット3’の組み込みよって選択した。
プラスミドpCDF-ev(Addgene#89596)、pHCKan-yibDp-GFPuv(Addgene#127078)及びpHCKan-yibDp-cimA3.7(Addgene#134595)は、以前に報告されたように構築した(doi:10.1101/820787)。プラスミドpCDF-mCherry1(Addgene#87144)及びpCDF-mCherry1(Addgene#87145)は、PCR及びGibsonアセンブリによってpCDF-evから、C末端DAS+4デグロンタグを含む又は含まないmCherryオープンリーディングフレームをコードする合成DNAと共に、Davisらによって以前に報告された強力な合成構成的proDプロモータを用いて構築した。
遺伝子サイレンシングガイド及びガイドアレイを一連のpCASCADEプラスミドから発現させた。pCASCADEコントロールプラスミドを、pcrRNA.Tet(C.Beiselから譲り受けた)中のpTetプロモータを、孤立した低リン酸誘導ugpBプロモータと交換することによって調製した。CASCADEガイドアレイを設計するために、目的のプロモータの-35又は-10ボックス付近のCASCADE PAM部位を同定し、PAM部位の3’末端の30bpをガイド配列として選択し、5%v/vのDMSOをQ5 PCR反応に追加するという修正を加えて、製造業者のプロトコルに従ってQ5部位特異的突然変異誘発(NEB、マサチューセッツ州)を使用してpCASCADEプラスミドにクローニングした。PCRサイクルは以下の、増幅が98℃で30秒間の初期変性工程、続いて98℃で10秒間、72℃で30秒間、及び72℃で1.5分間のサイクル(伸長速度は30秒/kbであった)を25サイクル、次いで72℃で2分間の最終伸長の通りであった。2μLのPCR混合物を10μLのKLD反応(NEB、マサチューセッツ州)に使用し、室温下で1時間進行させ、その後、1μLのKLD混合物をエレクトロポレーションに使用した。pCASCADEガイドアレイプラスミド(pCASCADE-G2Z)は、各々より小さいガイドプラスミドの相補的な半数をPCRによって連続的に増幅し、続いて表に示すようにDNAアセンブリを行うことによって調製した。pCASCADEアセンブリに使用されるプライマー及びgRNA配列を以下の補足表5に提供する。更に、gRNAプラスミドを含有する全ての株を日常的に確認して、以下に記載されるようにPCRによってgRNA安定性を評価した。
bioLector研究
各株の単一コロニーを適切な抗生物質を含む5mLのLBに接種し、37℃、220rpmで9時間、又はOD 600が>2に達するまで培養した。500μLの培養物を適切な抗生物質を含む10mLのSM10培地に接種し、正方形振盪フラスコ(CAT#:25-212、Genesee Scientific,Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ)内で37℃、220rpmで16時間培養した。細胞を遠心分離によってペレット化し、FGM3培地を使用して培養密度をOD600=5に正規化した。増殖及び蛍光測定を、高物質移動FlowerPlate(カタログ番号:MTP-48-B、m2p-labs、ドイツ)を使用してBiolector(m2p labs、ドイツのベスヴァイラー)で得た。40μLのOD正規化培養物を、適切な抗生物質を含む760μLのFGM3培地に接種した。Biolectorの設定は以下の、RFP増加=100、GFP増加=20、バイオマス増加=20、振盪速度=1300rpm、温度=37℃、湿度=85%の通りであった。各株を3連で分析した。
ELISA
C末端GFPタグを介したタンパク質の定量は、AbCamのGFP定量キット(英国ケンブリッジ、製品番号ab171581)を製造者の説明書に従って使用して行った。簡潔には、上記のような微小発酵から試料を得た。リン酸枯渇の24時間後に細胞を回収し、水で洗浄し、提供された抽出緩衝液で溶解した。
ガイドRNAの安定性試験
ガイドRNAアレイの安定性を、5μLの2X EconoTaq Master mix(Lucigen)、1μLの各プライマー(10μM)、3μLのdH2Oからなる10μLのPCR反応物中の2X EconoTaq Master mix(Lucigen)を使用して、以下の2つのプライマーgRNA-for:5’-GGGAGACCACAACGG-3’(配列番号25)、gRNA-rev:5’-CGCAGTCGAACGACCG-3’(配列番号26)を使用するコロニーPCRによって確認した。98℃で2分間の初期変性の後、94℃で30秒、60℃で30秒、及び72℃で30秒の35サイクルを行い、最後に72℃で5分間の最終伸長を行った。次いで、PCR反応物をアガロースゲル上で泳動し、精製プラスミドDNAをテンプレートとして使用した対照PCR反応とバンドサイズを比較した。ガイドアレイサイズが予想よりも小さい場合にガイドプロトスペーサの損失が発生し、1つ又は複数のプロトスペーサの損失を示した。
発酵
最小培地微小発酵を以前に報告されたように行った(doi:10.1021/acssynbio.0c00182)。パラコート誘導を使用する微小発酵については、リン酸枯渇の1時間前にパラコートを添加し、続いて培地中のリン酸塩を枯渇させるために使用される細胞洗浄工程中で除去した。機器付きバイオリアクターでの1L発酵も、株及びプロセスの関数であるグルコース供給プロファイルをわずかに変更して、以前に報告されたように実施した。一般に、産生速度が供給制限されないことを確実にするために、過剰な残留グルコースを可能にするために供給を増加させた。グルコース供給は以下の通りであった。10gのCDW/L発酵の場合、出発バッチグルコース濃度は25g/Lであった。細胞が指数増殖期中期に入ったとき、一定の濃縮滅菌濾過グルコース供給物(500g/L)を1.5g/hでタンクに添加した。25gのCDW/L発酵の場合、出発バッチグルコース濃度は25g/Lであった。細胞が指数増殖期中期に入ったとき、濃縮滅菌濾過グルコース供給物(500g/L)を9g/hの初期速度でタンクに添加した。次いで、この速度を指数関数的に増加させ、総グルコース40gが添加されるまで1.083時間(65分)ごとに倍増し、その後、供給材料を1.75g/hrに維持した。
同位体標識代謝産物の産生。
C13ピルビン酸塩(CLM-1082-PK)及びC13 D-グルコース(U-13C6、99%)は、Cambridge Isotope Laboratories,Inc.(Tewksbury、マサチューセッツ州)から購入した。同位体標識シトラマル酸を、cimA3.7を発現するDLF_Z0044株を使用して、微小発酵を模倣する2段階の最小培地振盪フラスコ研究で生成した。簡潔には、SM10++培地の20mL培養物に、バッフル付き250mLエルレンマイヤー振盪フラスコ中で150rpmで振盪しながら、37℃で一晩増殖させた株を接種した。16時間の増殖後、遠心分離によって細胞を回収し、洗浄し、グルコースをC13標識グルコースで置き換えた20mLのSM10最小培地(リン酸塩を欠く)に再懸濁した。培養物を37℃で25時間、150rpmで振盪しながら増殖させ、その後、細胞を遠心分離によって除去し、使用済み培地を内部標準として使用する前に滅菌した。
分析方法
細胞乾燥重量:Menacho-Melgarらによって決定されたOD/細胞乾燥重量相関係数(1OD(600nm)=0.35gCDW/L)を本試験で使用した。
グルコース及び有機酸の定量:グルコース及び有機酸の定量に2つの方法を使用した。まず、グルコース、シトラマル酸、酢酸、ピルビン酸、シトラコン酸、クエン酸、並びに乳酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、及びメバロン酸塩を含む他の有機酸の同時定量のためのUPLC-RI法を開発した。Rezex Fast Acid Analysis HPLCカラム(100×7.8mm、粒径9μm、CAT#:#1250100、Bio-Rad Laboratories,Inc.、カリフォルニア州ハーキュリーズ)を使用して55℃でクロマトグラフィー分離を行った。5mM硫酸を定組成溶離液として使用し、流速はXmL/分であった。試料注入量は10μLであった。次に、Bio-Rad Fast Acid Analysis HPLCカラム(100×7.8mm、粒径9μm、CAT#:#1250100、Bio-Rad Laboratories,Inc.、カリフォルニア州ハーキュリーズ)を使用して65℃で定量を行った。溶離液として10mM硫酸を使用し、定組成流速は0.3mL/分であった。両方の方法において、試料注入量は10μLであり、クロマトグラフィー及び検出は、Waters 2414 Refractive Index(RI)検出器(Waters Corp.、米国マサチューセッツ州ミルフォード)と統合されたWaters Acquity H-Class UPLCを使用して達成した。試料を正確な線形範囲内になるように必要に応じて希釈した。希釈は超純水を用いて行った。
RapidFire-qTOF-MSによる有機酸の定量:微小発酵試料(並びにバイオリアクターからの試料の確認サブセット)を遠心分離して細胞を除去した。ブロスを水で100倍希釈して20μLの最終容量にした。これに、最終濃度10mg/LのC13ピルビン酸を添加するか、又はC13標識シトラマル酸を含有する2μLのブロスを添加した。最終試料をHILIC(H1型又は同等のH6)RapidFire(商標)カートリッジ(Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ)に注入した。600msの吸引後、1.0mL/分の流速で、95%ヘキサン、5%イソプロパノールを含むカートリッジに注入剤を3000msにわたって充填した。充填後、カートリッジをイソプロパノールで2000ms、流速1.0mL/分で洗浄した。溶出は、50%水/0.2%酢酸を含む50%メタノール及び0.5uMの(NH4)3PO4を用いて、1.0mL/分の流速で8000ms行った。カラム平衡化を4000ms行った。qTOFは、脆弱イオン、負ESIモードで50~250m/zの質量範囲に調整された。検出時の設定は、乾燥ガスが流量13L/分で250C、シースガスが流量12L/分で400C、ネブライザー圧力が35psi、フラグメンター電圧が100V、スキマー電圧が65V、ノズル電圧が2000V、キャピラリー電圧が3500Vであった。取得速度は1スペクトル/秒であった。
例1:遺伝子サイレンシングアレイ及び経路発現構築物
pCASCADEガイドアレイベースの遺伝子サイレンシング
pCASCADEガイドアレイベースの遺伝子サイレンシング
CASCADEガイド及びガイドアレイの設計及び構造は、以下の図1及び図2に示されている。pCASCADEコントロールプラスミドは、図1に示すように、pcrRNA.Tet中のpTetプロモータを、孤立した低リン酸誘導ugpBプロモータと交換することによって調製した。2つのプロモータがgltA遺伝子の調節を担い、sgRNAを両方のプロモータ用に設計した。増殖の指数期の間、gapA mRNAは主に高効率のgapA P1プロモータで開始され、他の3つのgapAプロモータと比較して定常期の間は高いままであったので、4つのプロモータがgapA遺伝子の調節に関与し、sgRNAを第1のプロモータ用に設計した。lpd遺伝子の上流の複数のプロモータがlpd調節に関与し(ecocyc.org/gene?orgid=ECOLI&id=EG 10543#tab=showAll)、したがって、lpdのみについてのユニークで効果的なsgRNAの設計は不可能であった。fabI、udhA及びzwfのプロモータ配列は、EcoCycデータベース(ecocyc.org)から得た。CASCADEガイドアレイを設計するために、目的のプロモータの-35又は-10ボックス付近のCASCADE PAM部位を同定し、PAM部位の3’末端の30bpをガイド配列として選択し、5%v/vのDMSOをQ5 PCR反応に追加するという修正を加えて、製造業者のプロトコルに従ってQ5部位特異的突然変異誘発(NEB、マサチューセッツ州)を使用してpCASCADEプラスミドにクローニングした。pCASCADE-コントロールベクターをテンプレートとして使用した。2つ以上のガイドのアレイを有するpCASCADEプラスミドを以下に記載し、図2に示すように調製した。pCASCADEガイドアレイプラスミドは、各々より小さいガイドプラスミドの相補的な半数をPCRによって連続的に増幅し、続いてDNAアセンブリを行うことによって調製した。表6及び7は、sgRNAガイド配列及びそれらを構築するために使用されるプライマーを列挙する。全てのpCASCADEサイレンシングプラスミドを以下の表に列挙し、これらはAddgeneで入手可能である。
例2:タンパク質レベルの動的制御
蛍光タンパク質及びサイレンシングガイドを発現するプラスミドを、表2に列挙した対応する宿主株に形質転換した。GFPuv及びmCherryレベル、並びにバイオマスレベルを含む蛍光を同時に測定するm2p-labs Biolector(商標)で株を3連で評価した。結果を図5に示す。
OD600の読み取り値を以下の式を使用して補正し、式中、OD600はオフライン測定値を指し、OD600*はBiolectorバイオマス読み取り値を指し、t0は開始点を示し、tfは最終点を示す。
例3:解糖及びピルビン酸酸化によるフラックスに対する2つの中心代謝経路TCA及びPPPの動的制御の影響。
図3Aに示すように、解糖及びピルビン酸酸化によるフラックスに対する2つの中心的な代謝経路(トリカルボン酸(TCA)サイクル及びペントースリン酸経路(PPP))の動的制御の影響が望ましい。本発明者らは、合成代謝バルブを作製することによってこれを達成し、各経路の最初にコミットされた工程、すなわちクエン酸シンターゼ(GltA、「G」、gltA遺伝子によってコードされる)及びグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ(Zwf、「Z」、zwf遺伝子によってコードされる)のレベルを動的に低下させる。本発明者らは、これら2つの酵素に対する動的制御が、ピルビン酸及びシトラマル酸の定常期産生を改善し、ピルビン酸及び/又はアセチル-CoAを必要とする多数の産物の産生に適用可能であることを示す。
本発明者らは、最初に、図3B~図3Dに示すように、2段階プロセスでタンパク質レベルを動的に低下させることができる制御システムを開発した。バルブは、制御されたタンパク質分解若しくはCRISPRi/カスケードベースの遺伝子サイレンシング、又は重要な代謝酵素のレベルを低下させるために組み合わせたタンパク質分解及びサイレンシングの両方を含むことができる。誘導は、リン酸枯渇を環境トリガとして使用して実施される。天然の大腸菌(E.coli)I-E型カスケード/CRISPRシステムが遺伝子サイレンシングのために使用される(図3Ci~iii)。標的化タンパク質分解は、シャペロンSspBの発現をリン酸欠乏に連結することによって実施される。SspBは、誘導されると、任意の標的タンパク質上のC末端DAS+4ペプチドタグに結合し、大腸菌(E.coli)のClpXPプロテアーゼによる分解を引き起こす(図3D)。操作された株を使用して、図1Eが実証するように、タンパク質レベルは、GFPを「オン」にし、構成的に発現するmCherryを「オフ」にすることによって例示されるように、2段階プロセスで制御することができる。この場合、遺伝子サイレンシングとタンパク質分解との組合せは、最大のタンパク質分解速度をもたらすが(図3F~図3G)、各アプローチ及び特異的減衰率の影響は、標的遺伝子/酵素並びにその特異的な天然代謝回転速度及び発現レベルに応じて変化する。
GltA及びZwfのレベルを動的に低下させるために(図3H~図3I)、これらの遺伝子にC末端DAS+4デグロンタグを付加する染色体修飾を用いて株を操作した。更に、本発明者らは、C末端デグロンタグの有無にかかわらず、各遺伝子の後ろにC末端スーパーフォルダGFPタグを有するようにいくつかの株を操作した。gRNAを発現するプラスミドを、gltAp2プロモータ及びzwfプロモータからの発現を抑制するように設計した。これらの株及びプラスミドを使用して、Morebらによって報告されているように、2段階最小培地微小発酵においてELISAアッセイを介してGFPを追跡することによって、酵素レベルに対する動的制御を監視した。操作された株では、GFP蛍光を直接レポータとして使用するにはタンパク質レベルが低すぎるため、ELISAを使用した。GltAタンパク質分解及びサイレンシングの場合、GltAレベルはそれぞれ70%及び85%減少し、組合せでは90%減少した。Zwfの場合、タンパク質分解、サイレンシング並びに組合せは全て、タンパク質レベルは本発明者らのアッセイの定量限界未満であった。
代謝フラックスに対する「G」バルブと「Z」バルブの組合せの影響を、異種産生経路なしで実施した最小培地微小発酵で測定した。使用した株は、酢酸産生につながる主要な経路(poxB、及びpta-ackA)に欠失があったため、解糖による代謝フラックスの尺度としてピルビン酸合成を最初に評価した(図4)。「G」バルブは、ピルビン酸産生に最も大きな影響を及ぼし、SMVを含まない対照株では検出可能な産物は測定されなかった。ピルビン酸の産生の改善は、通常TCAサイクルに入るフラックスの一部がオーバーフロー代謝産物に再分配される化学量論的効果、又はより大きなオーバーフロー代謝及びピルビン酸合成を可能にする糖取り込み速度のより全体的な増加のいずれかに起因する可能性がある。これら2つの選択肢を評価するために、グルコース取り込み速度に対する「G」バルブの影響を測定した。図4Cに示す結果は、ピルビン酸産生の増加が、基底フラックスの再分配ではなく取り込み速度の増加に主に起因することを示している。
したがって、「G」バルブによる糖取り込みの増加は、TCAサイクルによって産生される代謝産物、すなわちα-ケトグルタル酸(αKG)の直接的な調節効果による可能性があった。グルタミン酸の前駆体であるαKGは、PTS依存性グルコーストランスポータの酵素Iの直接阻害による糖輸送の調節を含む、いくつかの重要な調節的役割を有する(図3)。このフィードバック調節は、糖取り込みを窒素同化(グルタミン酸合成)と調整する方法である。本発明者らは、産生開始時に20mMのジメチル-αKG(DM-αKG)を微小発酵に添加する補充実験を行った。膜をより良好に横切ることが示されているので、αKGではなくDM-αKGを使用し、加水分解後に細胞内αKGプールに追加した。図4に見られるように、DM-αKGは、対照細胞並びにGltAレベルを低下させるバルブを有する株における糖取り込みを阻害した。まとめると、これらの結果は、主に糖取り込み速度及びピルビン酸生合成の改善に関与するので、GltAレベルの動的減少及びその後のαKGプールの減少を支持する。次に、本発明者らは、機器付きバイオリアクターにおけるピルビン酸産生を評価した。Menacho-Melgarらによって以前に報告されたように、リン酸濃度がバイオマスレベルを制限し、いったん消費されたサイレンシングgRNA及びSspBシャペロンの発現が誘導される最小培地供給バッチ発酵を行った。対照宿主株とGltAレベルに対する動的制御を有する株とを比較した結果を図4Dに示す。最小限のピルビン酸が対照株に一時的に蓄積したが、動的制御を使用すると最大力価が約30g/Lを超えた。
アセチル-CoAフラックスに対する動的制御の影響を評価するために、本発明者らは、1モルのピルビン酸及び1モルのアセチル-CoAから1モルのシトラマル酸を産生するシトラマル酸シンターゼを利用した。シトラマル酸は、産業用化学物質であるイタコン酸及びメタクリル酸メチルの前駆体であり、分枝鎖アミノ酸生合成の中間体である。シトラマル酸を産生するために、本発明者らは、以前に報告されたフィードバック耐性変異シトラマル酸シンターゼ(cimA3.7)を発現する低リン酸誘導性プラスミドを使用した。このプラスミドを「G」及び「Z」バルブ株のセットに導入し、次いで、それらを2段階微小発酵でのシトラマル酸産生について評価した(図5)。最良の産生株は、「G」バルブと「Z」バルブの両方を有していた。
ピルビン酸の場合、「Z」バルブは産生に大きな影響を及ぼさなかった(図4B)。シトラマル酸及びピルビン酸は、それらが両方とも酸化されており、生合成のためにレドックス補因子(NADPHなど)を必要としないという点で類似の産物である。2つの産物の重要な違いは、シトラマル酸が追加の前駆体、すなわちアセチル-CoAを必要とすることである。シトラマル酸産生における「Z-バルブ」依存的改善は、Zwf活性が低下した株におけるアセチル-CoA産生の改善に依存する可能性がある。これは、Zwfレベル又は下流代謝産物のレベルのいずれかが、定常期アセチル-CoA合成に対して負の調節的影響を有することを示唆している。ピルビン酸及びシトラマル酸の産生に使用される株は、(アセチル-CoA合成をもたらすことができる)poxB及びpflBに欠失を有し、全てのアセチル-CoAフラックスが、十分に特徴付けられたピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)多酵素複合体を介していると最初に仮定されたことに留意することが重要である。予想外にも、Lpd(PDHのサブユニット)のタンパク質分解は、シトラマル酸産生に影響を及ぼさなかった。これに基づいて、本発明者らは、定常期培養におけるアセチル-CoA産生の代替主要経路、すなわちydbK遺伝子によってコードされるピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ(Pfo)の可能性を検討した。
図3に示すように、Pfo(ydbK)は、定常期のアセチル-CoA合成に部分的に関与している可能性があり、酸化ストレス応答におけるその役割のために、この活性は、酸化ストレスに対する応答に関与することも知られているPPPの中間体によって調節された。この仮説を試験するために、本発明者らは、「G」バルブ及び「Z」バルブの両方を含有するシトラマル酸株においてydbK欠失を構築し、シトラマル酸産生を測定した。図5Bに見られるように、ydbKの欠失はシトラマル酸合成を有意に減少させ、アセチル-CoAフラックスにおけるPfoの役割を確認した。Pfoは、(NADPHプールによっても調節される)SoxRSレギュロンを介して酸化ストレス時に誘導されることが示されているので、発現は、Zwf活性の低下によって引き起こされるNADPHレベルの変化によるものである可能性がある。
最後に、本発明者らは、機器付きバイオリアクターにおけるシトラマル酸産生株を評価した。対照株は合理的なシトラマル酸力価(約40g/L)をもたらしたが、SMVの導入は産生を改善した。合わせた「GZ」バルブ株は、最も高いシトラマル酸産生を有し、約100g/Lの力価に達した。次いで、バイオマスレベルを約10gCDW/Lから約25gCDW/Lに増加させることによってこのプロセスを強化し、126+/-7g/Lの力価をもたらした。このプロセスを図5Cに示す。全プロセス収率は、0.74~0.77gシトラマル酸/gグルコースであり、産生段階中の収率は、0.80~0.82gシトラマル酸/gグルコースに近づいた。グルコースからのシトラマル酸の理論収率は、1モル/モル又は0.817g/gである。
動的制御を利用する以前の研究は、主に化学量論的フレームワークによって情報提供されており、経路は「オン」及び「オフ」に切り替えられて、所望の産物を化学量論的に競合するフラックス、すなわち言い換えれば経路の方向転換を低減する。例えば、Venayakらは、部分的に化学量論的モデリングに基づいて、動的代謝制御のための中央バルブ候補としてのGltA/CSの重要性を強調している。しかしながら、これらの研究及びモデルは、αKGなどの下流代謝産物の調節的役割の重要性を見落としている。この研究は、フィードバック制御の調節不全によるフラックスの増加が、化学量論又は競合経路の最小化とは無関係に、産生に大きな影響を及ぼし得ることを実証している。特に、Zwf活性を低下させるとアセチル-CoAフラックスが増加することは予想外であった。
これは、定常期における最小Zwfレベル、SoxRS活性化及びPfo活性の間の相互作用の最初の報告である。更に、Pfoによる代謝フラックスの大きさは予想外である。鉄硫黄クラスターを含有する酵素であるPfoは、好気性条件及び嫌気性条件の両方でうまく発現されたが、インビトロでは分子状酸素によって急速に不活性化され、その結果、従来の知見は、これらの種類のフラックスを支持する可能性は低いと示唆している。これらのデータは、Pfo経路が特定の条件下で中心代謝経路として作用することができ、インビボで好気的であっても高レベルの活性を維持することができることを示唆している。この理解が深まると、経路の過剰発現及び/又は酵素工学などの、この経路を通るフラックスを最適化するための代替戦略(Zwfレベルの低下とは無関係)につながる可能性がある。
例4:定常期の糖取り込み及びピルビン酸合成は、大腸菌(E.coli)のPTSマイナス株におけるα-ケトグルタル酸レベルに非感受性である
ここで図7を参照して、7A)大腸菌(E.coli)のPTSマイナス株における糖取り込みの概要。DLF_00286株(遺伝子型F-、λ-、Δ(araD-araB)567、lacZ4787(del)(::rrnB-3)、rph-1、Δ(rhaD-rhaB)568、hsdR514、ΔackA-pta、ΔpoxB、ΔpflB、ΔldhA、ΔadhE、ΔiclR、ΔarcA、ΔsspB、Δcas3::tm-ugpb-sspB-pro-casA、ΔptsG:glk、proDp-galP)は、PTS依存性グルコース取り込みを排除するptsG遺伝子に変異を有する。グルコース取り込みは、galPガラクトースパーミアーゼ(グルコースを輸送することもできる)並びにグルコースを活性化するグルコキナーゼ(glk)の過剰発現によって回復する。図7B)クエン酸シンターゼ(GltAレベル)の動的制御によるDLF_00286株及びDLF_00286株における2段階微小発酵におけるピルビン酸産生。定常期のピルビン酸合成は、PTS(+)対照(DLF_0025)と比較して、LF_00286株において改善される。クエン酸シンターゼ(gltAレベル)の動的制御は、DLF_00286宿主バックグラウンドにおけるピルビン酸合成を改善しない。図7C)グルコース取り込みは、PTS(-)株におけるジメチル-αKG補充に非感受性である。定常期のピルビン酸合成は、PTS(+)対照(DLF_0025)と比較して、LF_00286株において改善される。クエン酸シンターゼ(gltAレベル)の動的制御は、DLF_00286宿主バックグラウンドにおけるピルビン酸合成を改善しない。図7D)DLF_00286株及びその「G」バルブ誘導株について、ピルビン酸及びバイオマス産生を測定した。対照株のバイオマス(灰色)及びピルビン酸産生(青色)、並びに「G」バルブ株のバイオマス(黒色)及びピルビン酸産生(緑色)を時間の関数としてプロットした図である。
例5:アセチル-CoAフラックスはPfo(YdbK)活性に依存する。
ここで図8Aを参照して、Lpdのタンパク質分解(lpd-DAS+4、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ多酵素複合体のサブユニット)及びydbKの欠失を「GZ」バルブバックグラウンドで評価した。図8Bは、「G」バルブ及び「Z」バルブの関数としての相対的な定常期のydbK酵素活性を示す。ydbK活性は、基質としてピルビン酸及びCoA、並びに電子受容体としてメチルビオロゲンを使用して、粗溶解物中で測定した。図8Cは、操作された株におけるNADPHプール(灰色のバー)及びydbK発現レベル(緑色のバー)を示す。スーパーフォルダGFP(sfGFP)レポータの発現は、ydbKプロモータによって駆動される。
例6:アセチル-CoAフラックスはsoxS活性化に依存し、「Z」バルブとは無関係に改善することができる。
ここで図9Aを参照すると、株を、(NADPHプール及びSoxR活性化とは無関係に)SoxSの低リン酸誘導のために操作した。これは、低リン酸誘導性yibD遺伝子プロモータによって誘導される染色体上のSoxSの余分なコピーを操作することによって達成された。図9Bは、「G」バルブと低リン酸誘導性soxSとの組合せで操作されたPTS(+)株における微小発酵でのシトラマル酸産生を示す。重要なことに、soxS誘導を有する株におけるydbKの欠失は、依然としてシトラマル酸フラックスを減少させる。
より一般的には、本発明は、インビボ酵素活性及び代謝フラックスを改善するために既知及び未知のフィードバック調節機構を操作する可能性を強調する。このアプローチは、多数の新規な工学的戦略を開くことができ、産生速度、力価及び収率の大幅な改善につながる。更に、これらの結果は、定常期培養物の代謝能を確認する。2段階培養における動的代謝制御は、これらの戦略を実施するために特に適している。単に重要な酵素を過剰発現させるだけでは、天然の調節を迂回することはなく、中心代謝酵素及び/又は代謝産物の完全な除去は、増殖欠陥や、増殖の要求を満たすために代償性代謝変化を進化させる必要がある株をもたらすことが多い。対照的に、定常期における中央調節代謝産物のレベルの変化により、この制約なしに調節ネットワーク及び代謝フラックスの再配列が可能になる。
上述したように、本出願は実施形態の説明によって例示されており、実施形態はかなり詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲をそのような詳細に限定すること、又は決して制限することは意図されていない。追加の利点及び修正は、本出願の利益を有する当業者には容易に明らかになるであろう。したがって、本出願は、そのより広い態様において、示された特定の詳細及び例示的な例に限定されない。一般的な本発明の概念の精神又は範囲から逸脱することなく、そのような詳細及び例から逸脱することができる。
配列表1~40 <223>合成
Claims (21)
- 遺伝子改変微生物であって、
アセチルCoA前駆体から産物を産生するための少なくとも1つの酵素を含む産生経路を含み、
前記遺伝子改変微生物が増殖している増殖培地から制限栄養素を枯渇させる条件下で、定常期又は非分裂細胞状態が誘導され、
ピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性が、前記定常期又は非分裂細胞状態の間の好気性又は部分好気性条件下で前記遺伝子改変微生物内で増加して、アセチルCoAプールを産生し、
糖取り込みが、非遺伝子改変微生物と比較した場合、前記遺伝子改変微生物内で増強される、遺伝子改変微生物。 - 前記遺伝子改変微生物が、
クエン酸シンターゼ(gltA)及び/又はグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)遺伝子の遺伝子発現をサイレンシングする条件付きトリガ合成代謝バルブ、又は
クエン酸シンターゼ(gltA)及び/又はグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)酵素の選択的タンパク質分解を可能にする条件付きトリガ合成代謝バルブ、を含み、
前記微生物の前記合成代謝バルブが、前記定常期又は非分裂細胞状態の間に条件付きでトリガされる、
請求項1に記載の遺伝子改変微生物。 - 前記遺伝子改変微生物が、内因性poxB及びpflB遺伝子の欠失を含む、請求項1に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記ピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性の増加が、前記定常期又は非分裂細胞状態の間のピルビン酸フェレドキシンオキシレダクターゼをコードする遺伝子の過剰発現に起因する、請求項1に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記ピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素がydbK遺伝子によってコードされ、前記遺伝子改変微生物がエンテロバクター(Enterobacter)微生物である、請求項4に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記ピルビン酸フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性の増加が、前記定常期又は非分裂細胞状態の間の酸化的soxRSレギュロンの誘導に起因する、請求項1に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記ピルビン酸フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素活性の増加が、前記定常期又は非分裂細胞状態の間の前記遺伝子改変微生物内のNADPHレベルの減少の結果として増加する、請求項1に記載の遺伝子改変微生物。
- 少なくとも1つの糖輸送体の活性が増加して糖取り込みを増強する、請求項1に記載の遺伝子改変微生物。
- 糖輸送体遺伝子の構成的発現が、前記遺伝子改変微生物内の糖輸送体活性の増加をもたらす、請求項8に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記糖輸送体が、前記定常期又は非分裂細胞状態の間に条件付きで過剰発現される、請求項8に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記糖輸送体がpts遺伝子によってコードされる、請求項8に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記微生物が、エンテロバクター(Enterobacter)微生物である、請求項1に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記微生物が、大腸菌(E.coli)微生物である、請求項1に記載の遺伝子改変微生物。
- 前記産生経路の酵素が、シトラマル酸シンターゼである、請求項1に記載の遺伝子改変微生物。
- 請求項1に記載の遺伝子改変微生物からタンパク質産物を産生するためのバイオプロセスであって、
第1段階で、前記遺伝子改変微生物を培地中で増殖させることと、
第2段階で、増殖培地からの制限栄養素の枯渇時に、定常期又は非分裂細胞状態を誘導することと、
を含み、
前記定常期又は非分裂細胞状態の前記遺伝子改変微生物が30g/L以上の割合で産物を産生する、バイオプロセス。 - ピルビン酸フラボドキシン/フェレドキシンオキシレダクターゼ酵素の活性の増加が、活性ピルビン酸フェレドキシンオキシレダクターゼをコードする遺伝子の過剰発現、酸化的soxRSレギュロンの誘導、NADPHレベルの減少、zwf遺伝子の遺伝子サイレンシング又はグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ酵素の選択的タンパク質分解を対象とする合成代謝バルブによるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼレベルの減少、前記定常期又は非分裂細胞状態で活性化されるバルブ、又はそれらの組合せによって引き起こされる、請求項15に記載のバイオプロセス。
- 少なくとも1つの糖輸送体の活性が増加している、請求項15に記載のバイオプロセス。
- 前記産物がシトラマル酸であり、前記産生経路の酵素がシトラマル酸シンターゼを含み、前記バイオプロセスが100g/L以上のシトラマル酸を産生する、請求項15に記載のバイオプロセス。
- 前記シトラマル酸シンターゼ酵素がcimA3.7遺伝子によってコードされる、請求項18に記載のバイオプロセス。
- 前記遺伝子改変微生物が、低リン酸誘導性プロモータに作動可能に連結されたシトラマル酸シンターゼ遺伝子を含むプラスミドを含む、請求項18に記載のバイオプロセス。
- 前記遺伝子改変微生物が、内因性poxB及びpflB遺伝子の欠失を含む、請求項15に記載のバイオプロセス。
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