CN111172091B - 一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种5‑甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程领域。本发明通过代谢改造对DHF合成途径进行强化，增加前体供给；再通过将dCas9蛋白整合到枯草芽孢杆菌基因组中，并诱导表达dCas9蛋白与关键基因序列中的sgRNA结合，阻断前体供给途径、竞争途径及分解代谢途径中的关键基因的转录起始，使基因表达水平下调，得到的一株高产5‑MTHF的重组菌株，产量达到1.58mg/L，是出发菌株的3.9倍，为枯草芽孢杆菌代谢工程高效生产5‑MTHF奠定了基础。

Description

一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)是叶酸在人体内发挥作用的惟一活性形式，是叶酸类药物中唯一能透过血脑屏障的药物。叶酸是所有细胞中一碳代谢的辅助因子，它们参与核苷酸的生物合成，叶酸水平不足会使细胞分裂时间延长，从而导致巨幼细胞性贫血；叶酸缺乏还可能导致多种疾病，如孕妇早期自然流产或未出生婴儿脊柱裂和无脑畸形等神经管缺陷(NTD)、听力损失、阿尔兹海默症，心血管疾病等，也会增加癌症的风险。尽管叶酸在人类饮食中无处不在，叶酸缺乏的问题仍然影响着全球数十亿人，叶酸作为食品添加剂已经成为必需品，成人建议摄取叶酸400微克/天，因此导致叶酸的市场需求不断增长。目前5-MTHF生产主要以工业合成为主，但是存在拆分工艺复杂，难以纯化等问题。而且其前体物质叶酸也是通过工业化学合成生产，会对环境造成污染。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别，Bacillus subtilis中存在合成5-MTHF的内源途径，因此运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级5-MTHF的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌野生型菌株产量极低，5-MTHF及其中间代谢产物参与途径繁多复杂，传统理性代谢工程调节效率较低。首先强化DHF合成途径，增加前体供给，再利用CRISPRi系统可同时对多个基因的表达进行单独抑制及组合抑制，提高了代谢改造的效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高产5-MTHF的重组枯草芽孢杆菌菌株及其构建方法。构建方法是在低产5-MTHF重组菌株基因组中利用P43强启动子过表达对氨基苯甲酸酯合酶(A亚基)(编码基因pabB)，GTP环化水解酶IA(编码基因folE)，锌非依赖性GTP环化水解酶IB(编码基因yciA)，强化DHF合成途径，增加前体供给；再将dCas9蛋白整合到枯草芽孢杆菌基因组中，并诱导表达dCas9蛋白与关键基因序列中的sgRNA结合，阻断基因的转录起始，使基因表达水平下调，最终实现对竞争和分解代谢途径等的抑制而提高5-MTHF产量。
本发明的第一个目的是提供一种产5-MTHF的重组枯草芽孢杆菌，强化了DHF合成途径，并抑制中心代谢途径、嘌呤代谢途径、泛酸代谢途径和竞争代谢途径中一个或多个关键基因的表达。
在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的出发菌株为B.subtilis A10，已公开于公开号为CN109652351A、发明名称为“一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用”的专利申请中；所述强化DHF合成途径是过表达所述DHF合成途径中的对氨基苯甲酸酯合酶A亚基、GTP环化水解酶IA、锌非依赖性GTP环化水解酶IB。
在一种实施方式中，利用P43强启动子过表达编码对氨基苯甲酸酯合酶(A亚基)的基因pabB，编码GTP环化水解酶IA的基因folE和编码锌非依赖性GTP环化水解酶IB的基因yciA，以强化DHF合成途径，增加前体供给。
在一种实施方式中，所述抑制中心代谢途径、嘌呤代谢途径、泛酸代谢途径和竞争代谢途径中一个或多个关键基因的表达，是将dCas9蛋白整合到枯草芽孢杆菌基因组中，并诱导表达dCas9蛋白与关键基因序列中的sgRNA结合，阻断基因的转录起始，使基因表达水平下调，实现对竞争和分解代谢途径等的抑制而提高5-MTHF产量。
在一种实施方式中，所述中心代谢途径的基因包括：调控参与5-MTHF前体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)合成的基因pyk和tkt；所述嘌呤代谢途径的基因包括：调控参与嘌呤代谢的5-MTHF前体10-甲酰四氢叶酸和5,10-亚甲基四氢叶酸的基因purN，purH和thyA；所述泛酸代谢途径包括：调控参与泛酸代谢前体5,10-亚甲基四氢叶酸的基因panB和ykpB；所述竞争代谢途径的基因包括：调控核黄素竞争前体GTP合成的基因ribA，调控参与芳香族氨基酸竞争前体分支酸合成的基因pheA，tyrA和trpE。
在本发明的一种实施方式中，利用CRISPRi技术抑制的关键基因包括但不限于pyk(编码丙酮酸激酶),tkt(编码转酮醇酶),purN(编码磷酸核糖甘氨酰胺甲酰基转移酶),purH(编码磷酸核糖氨基咪唑羧酰胺甲酰基转移酶和肌苷一磷酸环水解酶),thyA(编码胸苷酸合酶A),panB(编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶),ykpB(编码假定的酮戊酸酯还原酶),ribA(编码GTP环水解酶II)，pheA(编码苯甲酸酯脱水酶),tyrA(编码苯甲酸酯脱氢酶)和trpE(编码邻氨基苯甲酸合酶)。
在一种实施方式中，编码pabB的基因在NCBI上公开的序列为Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168 genome:CP019662.1 82864 to 84276，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在一种实施方式中，编码folE的基因在NCBI上公开的序列为Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168 genome:CP019662.1 2384783 to 2385355，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
在一种实施方式中，编码yciA的基因在NCBI上公开的序列为Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168 genome:CP019662.1 364259 to 365173，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述pabB，folE，yciA基因重组于基因组上，并利用P43强启动子整合表达。
在一种实施方式中，所述关键基因pyk，tkt，ribA，pheA，thyA，trpE，purH，purN，thyA，panB和ykpB(含其sgRNA非编码链)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4～14所示。
在一种实施方式中，所述基因pyk的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.15～17所示。
在一种实施方式中，所述基因tkt的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.18～20所示。
在一种实施方式中，所述基因ribA的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.21～23所示。
在一种实施方式中，所述基因pheA的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.24～26所示。
在一种实施方式中，所述基因thyA的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.27～29所示。
在一种实施方式中，所述基因trpE的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.30～32所示。
在一种实施方式中，所述基因purH的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.33～35所示。
在一种实施方式中，所述基因purN的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.36～38所示。
在一种实施方式中，所述基因thyA的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.39～41所示。
在一种实施方式中，所述基因panB的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.42～44所示。
在一种实施方式中，所述基因ykpB的sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.45～46所示。
本发明的第二个目的是提供一种构建5-MTHF的重组枯草芽孢杆菌的方法，所述方法包括：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组上的对氨基苯甲酸酯合酶(A亚基)编码基因pabB克隆片段，与同源重组臂以及Spectinomycin-lox抗性基因敲除框融合，将融合片段通过转化整合到低产5-MTHF菌株A10基因组中，将重组菌株命名A11；
(2)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组上的GTP环化水解酶IA编码基因folE克隆片段，与同源重组臂以及Spectinomycin-lox抗性基因敲除框融合,将融合片段通过转化整合到重组枯草芽孢杆菌A11基因组中，将重组菌株命名A12；
(3)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组上的锌非依赖性GTP环化水解酶IB编码基因folE克隆片段，与同源重组臂以及Spectinomycin-lox抗性基因敲除框融合,将融合片段通过转化整合到重组枯草芽孢杆菌A12基因组中，将重组菌株命名A13；
(4)将pLCx质粒(公开于论文《CRISPRi allows optimal temporal control ofN-acetylglucosamine T bioproduction by a dynamic coordination of glucose andxylose metabolism in Bacillus subtilis》中)中dCas9蛋白及其同源臂扩增下来，通过转化整合到重组枯草芽孢杆菌A13基因组中。
(5)将psga质粒(公开于论文《CRISPRi allows optimal temporal control ofN-acetylglucosamine T bioproduction by a dynamic coordination of glucose andxylose metabolism in Bacillus subtilis》中)sgRNA嵌合体扩增下来，通过Gibson连接的方式插入pHT01质粒中。
(6)将关键基因pyk，tkt，purN，purH，thyA，panB，ykpB，ribA，pheA，tyrA和trpE序列中的sgRNA以设计引物的方式单独插入pHT01质粒的sgRNA嵌合体中。
(7)将步骤(6)构建的pHT01质粒转化入含有dCas9蛋白的重组枯草芽孢杆菌A13中。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)通过Golden Gate连接的方式将多个基因的sgRNA嵌合体组合在一起并插入pHT01质粒中。
本发明还提供了一种生产5-MTHF的方法，是应用上述任一所述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵。
在一种实施方式中，所述方法是将重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至发酵培养基中，于30～37℃发酵4～6h后，加入木糖，继续发酵至少10h。
在一种实施方式中，所述方法是首先挑取单菌落至5mL种子液培养基中，于37℃、220rpm培养10小时。然后，取2mL种子液转接于50ml发酵培养基中，于37℃、220rpm发酵，接种6小时后添加15g/L木糖诱导dCas9蛋白表达，接种16小时后结束发酵。
有益效果：本发明通过强化DHF合成途径，并抑制了竞争和分解代谢途径，使重组菌株发酵液中5-MTHF产量达1.18mg/L以上，是出发菌株的3.9倍。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌中前体DHF合成途径(a)及5-MTHF合成途径(b)。
图2为枯草芽孢杆菌中与5-MTHF相关的其他代谢途径；
图3为组合抑制sgRNA靶点的重组菌株于对照菌株发酵16h的OD600和5-MTHF产量。
具体实施方式
关键基因pyk，tkt，purN，purH，thyA，panB，ykpB，ribA，pheA，tyrA和trpE及其sgRNA非编码链序列如SEQ ID NO.4～14所示。
重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
种子液培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉；发酵培养基配方为：60g/L葡萄糖，12g/L酵母粉，6g/L胰蛋白胨，6g/L硫酸铵，12g/L三水合磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，3g/L七水合硫酸镁，1g/L谷氨酸钠，0.3g/L对氨基苯甲酸。
发酵过程为：首先挑取单菌落至5mL种子液培养基中，于37℃、220rpm培养10小时。然后，取2mL种子液转接于50ml发酵培养基中，于37℃、220rpm发酵，接种6小时后添加15g/L木糖诱导dCas9蛋白表达，接种16小时后结束发酵。
样品处理及检测方法：首先，将1mL发酵液离心后取沉淀，加入5mg/L溶菌酶破壁，37℃水浴1小时，沸水浴10分钟终止反应；离心取上清，加入小鼠血清，37℃、220rpm反应3小时，沸水浴10分钟终止反应；离心取上清，通过0.22μm滤膜后用于液相检测。高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260，FLD检测器，ODS-C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：7％乙腈，93％50mM磷酸二氢钾溶液(pH3.0)，流速1.0mL/min，柱温23℃，进样量20μL，激发波长为295nm，发射波长为356nm。
实施例1基因pabB重组片段的构建以及重组菌株A11的构建
设计引物pabB_1F:tatctaaaacttgaatacatgaaccctggaagca和pabB_1R:
gttatccgctcttgtatcattcctctattttcttttttacttgtttttaattgtaaagc,在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组上扩增基因pabB左侧同源臂；设计引物pabB_3F:ggaatgtacacatggcacaacgcagaccg和pabB_3R：
gaattcatttacgcgcacagacc，在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组上扩增基因pabB右侧同源臂；根据lox71-spc-lox66敲除框(构建过程参考论文：Yan X,Yu HQ,Li S.Cre/lox system and PCR-based genome engineering in Bacillus subtilis[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(17):5556-5562)的序列信息Cloning vectorp7S6,complete sequence：EU541493.1 2186to 3452，设计引物spc_pabB_2F：caagtaaaaaagaaaatagaggaatgatacaagagcggataacaatttcacacaggaa；spc_pabB_2R：tgcgttgtgccatgtgtacattcctctcttacctataatggtacc。3段扩增片段通过融合PCR技术融合，获得重组片段spc_lox_pabB。将构建好的重组片段spc_lox_pabB通过转化整合到低产5-MTHF枯草芽孢杆菌A10(菌株公开于公开号为CN109652351A的专利申请文件中)。进行菌落PCR及测序验证，重组枯草芽孢杆菌A11构建成功。
实施例2基因folE重组片段的构建以及重组菌株A12的构建
设计引物folE_1F:ggaattccgatatcttcggaaggtcg和folE_1R:ccgctcgttctatgtcctccaccaatgaatacatttaatttcg,在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组上扩增基因folE左侧同源臂；设计引物folE_3F:ataggtaagagaggaatgtacacatgaaagaagttaataaagagcaaatcgaacaagct和folE_3R：gtagatgtcttgcaaaaatatcacccttgtcc，在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组上扩增基因folE右侧同源臂；根据lox71-spc-lox66敲除框(本实验室前期构建,参考论文：Yan X,Yu H Q,Li S.Cre/lox system and PCR-basedgenome engineering in Bacillus subtilis[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(17):5556-5562)的序列信息Cloning vector p7S6,complete sequence：EU541493.12186to 3452，设计引物spc_folE_2F：ggtggaggacatagaacgagcggataacaatttcacacaggaaaca；spc_folE_2R：tgctctttattaacttctttcatgtgtacattcctctcttacctataatggtaccg。3段扩增片段通过融合PCR技术融合，获得重组片段spc_lox_folE。将构建好的重组片段spc_lox_folE通过转化整合到重组枯草芽孢杆菌A11中。进行菌落PCR及测序验证，重组枯草芽孢杆菌A12构建成功。
实施例3基因yciA重组片段的构建以及重组菌株A13的构建
设计引物yciA_1F:ctgtatgccatcgggattctgc和yciA_1R:gtgtgaaattgttatccgctctcagaaaactcctctcactaacaaatcgtaat,在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组上扩增基因yciA左侧同源臂；设计引物yciA_3F:taggtaagagaggaatgtacacatgaatcaacatacgctgctccc和yciA_3R：atacttgcgtgttcttctgcatgatc，在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168基因组上扩增基因yciA右侧同源臂；根据lox71-spc-lox66敲除框(本实验室前期构建,参考论文：Yan X,Yu H Q,Li S.Cre/lox system and PCR-based genomeengineering in Bacillus subtilis[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(17):5556-5562)的序列信息Cloning vector p7S6,complete sequence：EU541493.1 2186 to 3452，设计引物spc_yciA_2F：gttagtgagaggagttttctgagagcggataacaatttcacacagga；spc_yciA_2R：gagcagcgtatgttgattcatgtgtacattcctctcttacctataatggtacc。3段扩增片段通过融合PCR技术融合，获得重组片段spc_lox_yciA。将构建好的重组片段spc_lox_yciA通过转化整合到重组枯草芽孢杆菌A12中。进行菌落PCR及测序验证，重组枯草芽孢杆菌A13构建成功。
实施例4含有dCas9蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建
设计引物rh_dCas9_F:gtgatgtcaaagcttgaaaaaacgcacg,rh_dCas9_R:ctaatgtgtgtttacgacaattctcacttcatac,将pLCx质粒中的dCas9蛋白及其同源臂序列扩增下来，转化至重组枯草芽孢杆菌A13感受态中，最后通过菌落pcr挑取验证正确的菌株。
实施例5含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒的构建
设计引物rh_0.2k_sgRNA_F：attcgagctccgtcgacctgcaggcttattaac，rh_0.2k_sgRNA_R：cgactctagaggaattcaaaaaaagcaccgactcgg，将psga质粒中的sgRNA嵌合体扩增下来；设计引物fx_6.4k_pHT01_sgRNA_F：tttgaattcctctagagtcgacgtccccgg，fx_6.4k_pHT01_sgRNA_R：caggtcgacggagctcgaattcactggccg，将pHT01质粒反向pcr成线性。通过Gibson连接的方式将sgRNA嵌合体插入pHT01质粒中。
实施例6构建含有pheA2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
设计引物pHT01_6.6k_sgRNA_F：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataag，pHT01_6.6k_pheA-2_sgRNA_R：tttctagctctaaaacgggcggcagcaaagtttgtcacatttattgtacaacacgagcc，将实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒反向pcr成线性，接下来将片段转化入大肠杆菌感受态dH5α中，最后通过菌落pcr及测序得到构建正确的菌株。pheA2靶点的20bpsgRNA序列包含于下游引物pHT01_6.6k_pheA-2_sgRNA_R中。
实施例7构建含有pyk1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.15序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-pyk1。
实施例8构建含有pyk2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.16序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-pyk2。
实施例9构建含有pyk3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.17序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-pyk3。
实施例10构建含有tkt1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.18序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-tkt1。
实施例11构建含有tkt2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.19序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-tkt2。
实施例12构建含有tkt3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.20序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-tkt3。
实施例13构建含有ribA1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.21序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-ribA1。
实施例14构建含有ribA2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.22序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-ribA2。
实施例15构建含有ribA3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.23序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-ribA3。
实施例16构建含有pheA1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.24序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-pheA1。
实施例17构建含有pheA3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.26序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-pheA3。
实施例18构建含有thyA1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.27序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-thyA1。
实施例19构建含有thyA2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.28序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-thyA2。
实施例20构建含有thyA3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.29序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-thyA3。
实施例21构建含有trpE1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.30序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-trpE1。
实施例22构建含有trpE2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.31序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-trpE2。
实施例23构建含有trpE3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.32序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-trpE3。
实施例24构建含有purH1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.33序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-purH1。
实施例25构建含有purH2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.34序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-purH2。
实施例26构建含有purH3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.35序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-purH3。
实施例27构建含有purN1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.36序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-purN1。
实施例28构建含有purN2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.37序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-purN2。
实施例29构建含有purN3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.38序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-purN3。
实施例30构建含有tyrA1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.39序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-tyrA1。
实施例31构建含有tyrA2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.40序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-tyrA2。
实施例32构建含有tyrA3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.41序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-tyrA3。
实施例33构建含有panB1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.42序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-panB1。
实施例34构建含有panB2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.43序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-panB2。
实施例35构建含有panB3 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.44序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-panB3。
实施例36构建含有ykpB1 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.45序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-ykpB1。
实施例37构建含有ykpB2 sgRNA靶点单独抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例6，区别在于，设计含有SEQ ID NO.46序列靶点的引物，将引物通过pcr的方法插入到实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-ykpB2。
实施例38构建含有thyA1，trpE3，panB3三个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
设计引物pHT01-liner-F-D：GCCGCGGGTCTCACCGATCGACATGGATGAGCGATGATGATATCC，pHT01-liner-R-A：GCCGCGGGTCTCAACCTGTCGACGATTTACCGTTCGTATAATGTATGC，将pHT01质粒反向pcr成线性。
引物sg-F-A：GCCGCGGGTCTCAAGGTCGTCGACCTGCAGGCTTATTAAC，sg-R-B：GCCGCGGGTCTCAGTGGCGGAATTCAAAAAAAGCACCGACTCG，扩增含有thyA1 sgRNA的嵌合体。
引物：sg-F-B：GCCGCGGGTCTCACCACCGTCGACCTGCAGGCTTATTAAC，sg-R-C：GCCGCGGGTCTCATACCGGAATTCAAAAAAAGCACCGACTCG，扩增含有trpE3 sgRNA的嵌合体。
引物sg-F-C：GCCGCGGGTCTCAGGTACGTCGACCTGCAGGCTTATTAAC，sg-R-D：GCCGCGGGTCTCATCGGCGGAATTCAAAAAAAGCACCGACTCG，扩增含有panB3 sgRNA的嵌合体。
通过Golden Gate连接的方式将以上三个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中。
实施例39构建含有thyA1和pheA2两个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例38，区别在于，引物sg-F-A和sg-R-B扩增含有thyA1 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-B和sg-R-D扩增含有pheA2 sgRNA的嵌合体。通过Golden Gate连接的方式将以上两个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-thyA1-pheA2。
实施例40构建含有thyA1和trpE3两个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例38，区别在于，引物sg-F-A和sg-R-B扩增含有thyA1 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-B和sg-R-D扩增含有trpE3 sgRNA的嵌合体。通过Golden Gate连接的方式将以上两个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-thyA1-trpE3。
实施例41构建含有thyA1和panB3两个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例38，区别在于，引物sg-F-A和sg-R-B扩增含有thyA1 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-B和sg-R-D扩增含有panB3 sgRNA的嵌合体。通过Golden Gate连接的方式将以上两个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-thyA1-panB3。
实施例42构建含有pheA2和trpE3两个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例38，区别在于，引物sg-F-A和sg-R-B扩增含有pheA2 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-B和sg-R-D扩增含有trpE3 sgRNA的嵌合体。通过Golden Gate连接的方式将以上两个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-pheA2-trpE3。
实施例43构建含有pheA2和panB3两个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例38，区别在于，引物sg-F-A和sg-R-B扩增含有pheA2 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-B和sg-R-D扩增含有panB3 sgRNA的嵌合体。通过Golden Gate连接的方式将以上两个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-pheA2-panB3。
实施例44构建含有trpE3和panB3两个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例38，区别在于，引物sg-F-A和sg-R-B扩增含有trpE3 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-B和sg-R-D扩增含有panB3 sgRNA的嵌合体。通过Golden Gate连接的方式将以上两个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-trpE3-panB3。
实施例45构建含有thyA1，pheA2，trpE3三个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例38，区别在于，引物sg-F-A和sg-R-B扩增含有thyA1 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-B和sg-R-C扩增含有pheA2 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-C和sg-R-D扩增含有trpE3 sgRNA的嵌合体。通过Golden Gate连接的方式将以上三个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-thyA1-pheA2-trpE3。
实施例46构建含有thyA1，pheA2，panB3三个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例38，区别在于，引物sg-F-A和sg-R-B扩增含有thyA1 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-B和sg-R-C扩增含有pheA2 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-C和sg-R-D扩增含有panB3 sgRNA的嵌合体。通过Golden Gate连接的方式将以上三个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-thyA1-pheA2-panB3。
实施例47构建含有pheA2，trpE3，panB3三个sgRNA靶点组合抑制的pHT01质粒
具体实施方式同实施例38，区别在于，引物sg-F-A和sg-R-B扩增含有pheA2 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-B和sg-R-C扩增含有trpE3 sgRNA的嵌合体；引物sg-F-C和sg-R-D扩增含有panB3 sgRNA的嵌合体。通过Golden Gate连接的方式将以上三个sgRNA嵌合体依次组合在一起并插入实施例5构建的含有sgRNA嵌合体的pHT01质粒中，获得重组质粒pHT01-pheA2-trpE3-panB3。
实施例48用CRISPRi系统对关键基因不同靶点进行抑制对5-MTHF在工程菌中生产的影响
分别将实施例6～47制备的抑制sgRNA靶点的重组质粒转化至实施例4构建的含有dCas9蛋白的重组枯草芽孢杆菌A13中，获得对关键基因不同靶点进行抑制的重组菌株。
分别将上述重组菌株于37℃、220rpm、5mL LB培养基、50ml摇菌管中培养10h，获得种子液；分别将各菌株的种子液以4％的接种量转入50mL发酵培养基，于37℃、220rpm条件下发酵16h。相同条件下，没有进行CRISPRi抑制的菌株(重组菌株A13)最终发酵液中5-MTHF产量为960.27μg/L；经过CRISPRi抑制pheA2靶点的菌株，最终发酵液中5-MTHF产量约为1.58mg/L(表1)，是对照的1.65倍。
表1利用CRISPRi系统对关键基因不同靶点进行抑制的菌株5-MTHF产量
Figure BDA0002385321970000091
Figure BDA0002385321970000101
对照例1无CRISPRi系统抑制的重组枯草芽孢杆菌A13的发酵生产
挑取无CRISPRi系统抑制的重组枯草芽孢杆菌A13单菌落至5mL种子液培养基中，于37℃、220rpm培养10小时。然后，取2mL种子液转接于50ml发酵培养基中，于37℃、220rpm发酵16小时。最终发酵液中5-MTHF产量960.27μg/L，作为每次发酵验证的对照。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 46
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
atggcacaac gcagaccggc aggcaaaaaa ataccttttc aaaaagactc attcttacaa 60
caatttgaga aacttgcgca atcccggaaa catcatgtac ttctcgaaag tgcaagaggc 120
ggcagatata gtatagccgg tcttgatcca attgcgactg tgaaaggaaa agacggaata 180
actacaatta agcatggtga tgagatgctg tttaaagaag gtgatccatt acgggccttc 240
cacagctggt ttaaaacact ggaaacagaa acgaatcatg agttccctga ctttcaaggc 300
ggggcaatcg ggtttctcag ctatgattac gcacggtaca ttgaaaattt taaaatgctc 360
tcattagatg atttagaaac accagatatt tattttcttg tttttgatga tatagcagtt 420
tatgaccatc aagaagagtc tctatggctg attactcatg ttaatggttc tgatcaggaa 480
acagcggatg tgaagctatc tgagttagag cagatgtggt tgactgagct tcccgctgtc 540
acttcgcgag agatgaagcc tgaaacagct ggttctttcg cggcgccatt taccgaggat 600
gggttctcac aagctgtaga gaaaatcaaa caatacattg ccagcggaga tgtgtttcaa 660
gtcaatctat caataaggca gtcacagtca ctgtctgtcc acccatatca aatttacaaa 720
accttgagag aagtaaatcc ttctccttat atggcgtatt tagaaacacc tgatttccaa 780
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gcgatcttcg acggaacaga tgcgatcatg ctttctggtg aaactgctgc cggaagttac 960
ccggttgaag cagttcaaac aatgcataac atcgcgtccc gttctgaaga agcattaaat 1020
tataaagaaa ttctctcaaa acgcagagac caagtgggca tgacaattac agacgcaatt 1080
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gttactgtaa atgactctat ttccagaaag cttgccctcg tatctggcgt attcgcggaa 1260
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<400> 25
gggcggcagc aaagtttgtc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tgcaggagct tgaagcactc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gtctcggatt gataggcggt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gaggagcatg atggcgttac 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
caaaagggca gaacaatgca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
catttttaga ggacagcttg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ataaaagcag atgcttttga 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gtgcgctgct gaaaacgatt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ttcgtaaaag aactgacaga 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gctgctgttg ctgtgaagca 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tcaaaaaagc ggatgaatac 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tcgtcacgcg tttgaaggag 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tcaagcatat gggggaaaaa 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
agtgtgatta aacagctatt 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
agtgggactc agatggaaca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
tcttcacgca gacacattac 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ttgatgattt caagttaatc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
attgtcatgc tgaccgctta 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gtagtcagtc acttaggttt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcgaaacagc aatcagcgga 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ggcttgtcat ccatagtgaa 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ccatgcttcg ggatatggaa 20

Claims (9)

1.一种产L-5-甲基四氢叶酸的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，强化DHF合成途径，并通过CRISPRi系统抑制中心代谢途径、嘌呤代谢途径、泛酸代谢途径和竞争代谢途径中一个或多个关键基因的表达；所述强化DHF合成途径是过表达DHF合成途径中的对氨基苯甲酸酯合酶A亚基基因pabB、GTP环化水解酶IA基因folE、锌非依赖性GTP环化水解酶IB基因yciA；
所述中心代谢途径的基因包括：调控参与5-MTHF前体磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸合成的基因pyk和tkt；
所述嘌呤代谢途径的基因包括：调控参与嘌呤代谢的5-MTHF前体10-甲酰四氢叶酸和5,10-亚甲基四氢叶酸的基因thyA；所述基因thyA的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
所述泛酸代谢途径包括：调控参与泛酸代谢前体5,10-亚甲基四氢叶酸的基因panB和ykpB，所述基因panB的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示，所述基因ykpB的核苷酸序列如SEQID NO.45所示；
所述竞争代谢途径的基因包括：调控核黄素竞争前体GTP合成的基因ribA，调控参与芳香族氨基酸竞争前体分支酸合成的基因pheA，tyrA和trpE；所述基因ribA的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述基因pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.26所示；所述基因tyrA的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；所述基因trpE的核苷酸序列如SEQ IDNO.32所示。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述对氨基苯甲酸酯合酶A亚基、GTP环化水解酶IA、锌非依赖性GTP环化水解酶IB的基因重组于基因组上，并利用P43启动子整合表达。
3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌A10为出发菌株。
4.一种构建权利要求1～3任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将编码对氨基苯甲酸酯合酶A亚基的基因pabB整合到枯草芽孢杆菌A10基因组中；
(2)将编码GTP环化水解酶IA的基因folE整合到步骤(1)构建的枯草芽孢杆菌基因组中；
(3)将编码锌非依赖性GTP环化水解酶IB的基因yciA整合步骤(2)构建的枯草芽孢杆菌基因组中；
(4)将dCas9蛋白整合到步骤(3)构建的枯草芽孢杆菌基因组中；
(5)将sgRNA嵌合体通过Gibson连接的方式插入pHT01质粒中；
(6)分别将基因pyk，tkt，purN，purH，thyA，panB，ykpB，ribA，pheA，tyrA和trpE序列中的sgRNA以设计引物的方式单独插入步骤(5)构建的pHT01质粒的sgRNA嵌合体中；
(7)将步骤(6)构建的pHT01质粒转化入步骤(4)构建的含有dCas9蛋白的重组枯草芽孢杆菌中。
5.权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌在生产L-5-甲基四氢叶酸及其衍生产品中的应用。
6.一种生产L-5-甲基四氢叶酸的方法，其特征在于，将权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于30～37℃发酵4～6h后，加入木糖，继续发酵。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述接种是接种重组枯草芽孢杆菌的种子液；所述种子液按如下方法制备：将重组枯草芽孢杆菌单菌落接种至种子培养基中，于30～37℃、200～220rpm培养8～10小时。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，于30～37℃发酵4～6h后，加入终浓度为10～15g/L木糖，继续发酵至少10h。
9.权利要求6～8任一所述的方法在生产含L-5-甲基四氢叶酸或其衍生物的食品、药品、保健品方面的应用。
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