CN116355435B - 一种用于抗氧化应激的南瓜果皮色素及其应用 - Google Patents

一种用于抗氧化应激的南瓜果皮色素及其应用

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Abstract

本发明公开了一种用于抗氧化应激的南瓜果皮色素及其应用，所述南瓜果皮色素提取方法：将南瓜果皮粉加入去离子水中，室温浸泡、超声浸提后加入提取剂，纤维素酶，混匀酶解，超声处理，离心，上清液浓缩，冷冻干燥，获得南瓜果皮色素。本发明方法所制得的南瓜果皮色素提取得率达632.75mg/100g，能显著延长双氧水氧化应激状态下C.elegans的存活率，增强C.elegans体内SOD活性，降低C.elegans体内MDA水平(p<0.05)；对ABTS+清除率达91.26％、对α‑淀粉酶抑制率达83.4％、对蔗糖酶抑制率达75.7％，C.elegans的平均存活时间为8.88h。

Description

一种用于抗氧化应激的南瓜果皮色素及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种用于抗氧化应激的南瓜果皮色素及其应用。
(二)背景技术
南瓜是葫芦科、南瓜属(Cucurbita moschata(Duch.ex Lam.)Duch)中叶片具有白斑、果柄五棱形的一年生蔓性草本植物。依性状种类不同其栽培种属常分为三大类：中国南瓜(C.moschata Duch)，印度南瓜(C.maxima Duch)和美洲南瓜(C.pepo L.)。根据考古资料及品种资源的分布考察，中国南瓜(又称窝瓜、番瓜、饭瓜)原产于亚洲南部，我国在十九世纪就有栽培；印度南瓜(又称笋瓜、搅瓜)和美洲南瓜(又称西葫芦)原产于美洲和印度，是近百年才引入我国栽培的。目前南瓜在世界各地都有种植，其栽培面积以亚洲最多，其次为欧洲和南美洲。据联合国粮农组织网站数据，2018年，中国是世界第一大南瓜生产国。南瓜既能作为一种蔬菜又能作为一种粮食，是一种极其宝贵的资源。南瓜果肉是用于加工和消费的主要原料，而占南瓜重量18～21％的南瓜果皮由于不可食用，常用于饲料或在加工过程中被作为加工废弃物而被舍弃，这样不但造成了资源浪费，还污染环境。南瓜果皮中富含淀粉、果胶、可溶性糖、纤维素、氨基酸、矿物质、维生素等多种营养物质。若将南瓜生产的副产品——果皮回收利用，不仅会解决污染及浪费问题，还能提高南瓜的综合开发利用价值，进一步发挥资源优势。
南瓜果皮中活性成分的提取主要集中于果胶、多糖等，对南瓜果皮色素的提取研究较少。南瓜果皮中富含类胡萝卜素，其类胡萝卜素和维生素A原占南瓜总类胡萝卜素和维生素A原的10％-40％。叶黄素是南瓜果皮中南瓜类胡萝卜素主要存在的形式，具有着阻挡自由基损伤人体细胞和器官的功能，还能够减少某些慢性疾病的发病率，类似心脏病、癌症、2型糖尿病等。因此，如何提高产品中叶黄素含量、优化提取南瓜果皮色素的工艺及并探索其抗氧化特性，是研究亟待解决的问题。
目前已有关于南瓜果肉色素提取、稳定性方面的研究报道，在南瓜果肉色素分离纯化及抗氧化性方面的研究也逐渐开展。但南瓜果皮中不溶性膳食纤维较高(23.87g/100g南瓜粉)且含有蜡质成分，适用于南瓜果肉色素的提取方法不一定适合南瓜果皮色素。针对南瓜果皮蜡质、粗纤维的特性，南瓜果皮色素对光、热等敏感以及常规溶剂提取(如正乙烷、90％乙醇等)提取南瓜果皮色素得率不高，本发明将南瓜果皮进行真空冷冻干燥与低温超微粉碎预处理后，采用酶法结合超声提取，以获得高得率高生物活性的南瓜果皮色素，可实现南瓜果皮加工的新利用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种南瓜果皮色素及其提取方法，以南瓜果皮为原料，在真空冷冻干燥与超微粉碎预处理基础上，利用纤维素酶结合超声处理工艺，低共熔溶剂-醇双相体系作为溶剂萃取，对南瓜果皮色素进行有效提取，进一步提高其α-淀粉酶与蔗糖酶抑制率以及抗Caenorhabditis elegans氧化应激能力。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种用于抗氧化应激的南瓜果皮色素，所述南瓜果皮色素按如下步骤进行提取：
(1)将南瓜果皮粉加入去离子水中，室温浸泡8～12h，超声浸提，获得料浆；
(2)向步骤(1)料浆中加入提取剂，然后加入纤维素酶，混匀，在20～60℃(优选33℃)、50-150rpm水浴摇床(转速100rpm)上保温酶解70～150min(优选110min)，获得酶解混合液；所述提取剂包括正丁醇、甲醇、异丙醇、丙酮、95％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、低共熔溶剂、低共熔溶剂-醇双相体系中的一种；所述低共熔溶剂-醇双相体系由低共熔溶剂与无水乙醇以体积比1:1-3混合而成，所述的低共熔溶剂是将甜菜碱与三乙二醇混合，在78℃加热120min后制成，所述甜菜碱与三乙二醇物质的量之比为1:1～1:4；
(3)步骤(2)酶解混合液在20-60℃、120-240W条件下超声处理10～90min，离心(8000rpm，20min)，上清液浓缩至原体积1/3，冷冻干燥，获得南瓜果皮色素。
进一步，步骤(1)中南瓜果皮粉按如下方法制备：将新鲜南瓜果皮切丝后，置于真空冷冻干燥机中，初始温度为-30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至-20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h以上至样品含水量在8％以下，在-10℃低温冷冻粉碎机中进行粉碎，过100-300目筛(优选300目)，获得南瓜果皮粉。
进一步，步骤(1)中超声浸提条件为：超声功率210W～270W(优选240W)、温度30～40℃(优选35℃)，超声处理20～30min(优选25min)。
进一步，步骤(1)去离子水体积用量以南瓜果皮粉重量计为5-12mL/g。
进一步，步骤(2)中提取剂体积用量以步骤(1)南瓜果皮粉质量计为30～50mL/g(优选40mL/g)；所述纤维素酶与步骤(1)南瓜果皮粉质量比为0.001～0.02:1，优选0.0194:1。
进一步，步骤(2)提取剂为低共熔溶剂-醇双相体系；低共熔溶剂与无水乙醇的体积比为1:1，所述低共熔溶剂为甜菜碱与三乙二醇物质的量之比为1:3。
进一步，步骤(3)中超声条件优选为：超声功率180W、温度28℃，超声时间40min。
进一步，步骤(3)冷冻干燥是在初始温度为-30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至-20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h以上至样品含水量在8％以下。
本发明所述纤维素酶的活力为10000U/g，可常规商购获得。
本发明还提供一种所述南瓜果皮色素在制备酶抑制剂中的应用，所述酶包括α-淀粉酶或蔗糖酶。
本发明还提供一种所述南瓜果皮色素在制备抗氧化应激制剂中的应用，所述制剂为秀丽隐杆线虫抗氧化应激的制剂。
本发明南瓜果皮色素作为天然功能色素，能够用于抗秀丽隐杆线虫(C.elegans)氧化应激，同时也能够用于酶抑制剂；所述的抗氧化应激包括显著延长双氧水应激下C.elegans的存活率，增强C.elegans体内T-SOD活性，降低C.elegans体内MDA水平。所述的酶抑制包括α-淀粉酶抑制剂与蔗糖酶抑制剂。
本发明以南瓜果皮为原料，经真空冷冻干燥与低温冷冻粉碎处理后，采用浸泡溶胀与超声预处理后，通过特定提取剂协同酶的提取工艺结合优化的超声提取参数，对南瓜果皮色素进行提取。本发明的技术要点在于，原料南瓜果皮的真空冷冻干燥与低温冷冻粉碎处理，可以避免高温烘干与机械粉碎过程中的温度对南瓜果皮色素的破坏，提高溶出率、抗氧化应激活性与酶抑制能力；低温超声结合特定提取剂协同酶的提取工艺，可以使南瓜果皮中的色素有效溶出，且充分保持其抗氧化活性与酶抑制能力。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
1.从南瓜加工废弃物果皮中提取天然功能色素，所制得的色素具有抑制α-淀粉酶与蔗糖酶能力；并能显著延长双氧水应激下C.elegans的存活率，增强C.elegans体内T-SOD活性，降低C.elegans体内MDA水平。
2.针对南瓜果皮中不溶性膳食纤维高且含有蜡质成分的特点，浸泡溶胀结合超声可使物料受到空化作用及机械作用，不溶性膳食纤维物质分子间和分子内空间结构扩展变形，使果皮原料形成疏松多孔的状态，有利于果皮色素的有效溶出。
3.针对南瓜果皮色素对光、热等敏感以及常规溶剂提取得率不高的特点，南瓜果皮采用真空冷冻干燥与低温冷冻粉碎处理，避免南瓜果皮色素结构与活性的破坏；采用低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇按1:3摩尔比配成)-醇双相体系，具有低成本、低毒性、易制备等优点，可以在较低的温度下实现高效提取，不会破坏南瓜果皮色素的活性，使提取物保持较好的抗氧化等性能，可实现对热不稳定色素的提取。
4.低共熔溶剂-醇双相体系配合酶法处理可以进一步改善南瓜果皮坚韧的细胞壁，使纤维素等高分子结构疏松，同时酶法处理制备的产品无异味、感官性状好。低温条件下的预处理、以及酶法结合超声(一定比例乙醇存在条件下)的提取工艺至关重要，经低共熔溶剂-醇双相体系+酶法处理，再进行超声处理的工艺，可使南瓜果皮色素的提取得率达632.75mg/100g。提取的南瓜果皮色素具有抗氧化应激能力与酶抑制能力，能显著延长双氧水氧化应激状态下C.elegans的存活率，增强C.elegans体内SOD活性，降低C.elegans体内MDA水平(p<0.05)；对ABTS+清除率达91.26％、对α-淀粉酶抑制率达83.4％、对蔗糖酶抑制率达75.7％，C.elegans的平均存活时间为8.88h(阴性对照组仅为2.72h)。该方法比传统的热风干燥处理得到的果皮色素提取得率、对α-淀粉酶、蔗糖酶的抑制率与线虫平均存活时间分别提高了1.236倍、1.703倍、1.576倍、1.502倍、1.285倍；比传统的机械粗粉处理得到的果皮色素分别提高了1.556倍、1.125倍、1.450倍、1.371倍、1.260倍；比传统的机械细粉处理得到的果皮色素分别提高了1.312倍、1.173倍、1.423倍、1.384倍、1.228倍；比不经浸泡溶胀与超声预处理提取得率提高了1.463倍；比酶法提取后不经过超声处理提取得率提高了1.187倍；比预处理后不经过酶法提取直接经过超声提取得率提高了1.208倍。该工艺条件温和，绿色环保，符合保健食品的生产要求。
(四)附图说明
图1、南瓜果皮色素的紫外-可见光谱扫描图。
图2、南瓜果皮色素的浓度-吸光度关系曲线。
图3、不同类型有机溶剂对南瓜皮色素提取得率的影响：不同字母代表组间存在显著性差异(p<0.05)。
图4、乙醇浓度对南瓜果皮色素提取得率的影响。
图5、甜菜碱与三乙二醇的摩尔比对南瓜果皮色素提取得率的影响。
图6、低共熔溶剂中乙醇含量对南瓜果皮色素提取得率的影响。
图7、酶法提取不同单因素南瓜果皮色素的得率与ABTS+清除率。
图8、南瓜果皮的酶法辅助提取对色素溶出效果的响应面图与等高线图。
图9、超声波提取不同单因素南瓜果皮色素的得率与ABTS+清除率。
图10、南瓜果皮的超声辅助提取对色素溶出效果的响应面图与等高线图。
图11、ABTS+清除率的测定流程图。
图12南瓜果皮色素对氧化应激状态下C.elegans寿命的影响。
图13、南瓜果皮色素对C.elegans体内MDA水平与总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的影响：不同字母代表组间存在显著性差异(p<0.05)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1材料与试剂
黄狼南瓜(超市购买)，无病虫害和腐烂。
邻苯三酚、ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)、水杨酸、H2O2、正丁醇、甲醇、异丙醇、丙酮、95％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甜菜碱、三乙二醇、95％乙醇、无水乙醇等均为分析纯；
D-101树脂，购自天津波鸿树脂科技有限公司；
纤维素酶(活力10000U/g)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
低共熔溶剂的制备：100g甜菜碱与三乙二醇按摩尔比1:3混合，在78℃加热2h后，加入33.3mL的去离子水(使去离子水的质量浓度为25％)，充分混匀后，78℃加热30min，获得低共熔溶剂80mL。
2实验仪器
小型高速粉碎机(型号WK-400A，北京国卫和教医药设备有限公司)、AL04型电子天平、SHA-B水浴摇床、DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱、CT14R0高速离心机、低温冷冻粉碎机(型号SDL，江阴市尚得力机械有限公司)、搅拌器、BILON-10000FDA真空冷冻干燥机、UV1800PC紫外-可见分光光度计、DS-5510DTH超声波清洗器。
3实验方法
3.1南瓜果皮色素定量分析方法的建立
(1)南瓜果皮粉：黄狼南瓜洗净，削皮，将60g南瓜果皮切丝后，置于真空冷冻干燥机中，初始温度为-30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至-20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h至含水量在8％以下。然后在-10℃低温冷冻粉碎机中进行粉碎，过筛300目筛，获得南瓜果皮粉40.8g。
(2)采用超声辅助醇提的方法提取南瓜果皮粉中的南瓜果皮色素，具体为：取30g南瓜果皮粉，加入1050mL 95％乙醇(液料比为35mL:1g)作为提取剂，在超声功率210W、30℃下提取70min。离心(8000rpm，20min)，上清液浓缩至原来体积的1/5，然后上样D-101树脂柱，每次上样量为30mL，以丙酮为流动相，重力作用下流动洗脱，每8mL收集一管洗脱液，收集到有黄色色带的洗脱液时(即为第208mL-264mL洗脱液)，将所有收集到的有黄色色带的洗脱液集中，取样在300-800nm范围内进行光谱扫描获得最大吸收峰；然后将集中的有黄色色带的洗脱液在初始温度-30℃冷冻干燥54h，获得南瓜果皮色素58mg。
(3)采用比色法建立定量分析方法：步骤(2)方法制备的南瓜果皮色素25mg，用无水乙醇配置成不同浓度的稀释液(2,4,6,8,10μg/mL)，测定最大吸收波长446nm下的吸光值，建立色素浓度-吸光值标准曲线。
南瓜果皮色素提取得率的计算公式如下：
南瓜果皮色素提取得率(mg/100g)＝C×V×F/M×10
C为按色素浓度-吸光值标准曲线计算出的南瓜果皮色素的浓度(μg/mL)；
V表示提取液的体积(mL)；
F表示稀释倍数；
M表示南瓜果皮粉质量(g)。
3.2提取剂的选择
(1)不同提取剂对南瓜果皮色素提取得率的影响。称取步骤3.1南瓜果皮粉5g，按料液比1g：20mL的量，分别以正丁醇、甲醇、异丙醇、丙酮、95％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇的摩尔比1:3)为提取剂提取南瓜果皮色素，封盖后50℃水浴震荡40min，8000rpm离心15min，取上清液，使用各自的提取剂将其稀释10倍后，在最大吸收波长(446nm)下测定吸光值，计算提取得率。
(2)乙醇浓度对南瓜果皮色素提取得率的影响。选取体积浓度50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇水溶液作为提取剂，同步骤(1)条件下进行提取，在最大吸收波长446nm下测定吸光值，计算提取得率。
(3)低共熔溶剂中甜菜碱与三乙二醇的摩尔比对南瓜果皮色素提取得率的影响。甜菜碱与三乙二醇的摩尔比分别设置为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4时，制备不同的低共熔溶剂-醇双相体系，同步骤(1)条件下进行提取，在最大吸收波长446nm下测定吸光值，计算提取得率。
(4)低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇的摩尔比1:3)与乙醇配比对南瓜果皮色素提取得率的影响。称取5份步骤3.1南瓜果皮粉0.5g，按料液比1g：50mL的量，分别加入25mL乙醇(乙醇含量100％)，25mL低共熔溶剂与乙醇的混合液(混合液中乙醇浓度75％)，25mL低共熔溶剂与乙醇的混合液(混合液中乙醇浓度50％)，25mL低共熔溶剂与乙醇的混合液(混合液中乙醇浓度25％)，25mL低共熔溶剂(乙醇浓度0％)，同步骤(1)条件下进行提取，在最大吸收波长446nm下测定吸光度，计算提取得率。
3.3南瓜果皮粉的预处理
将3.1方法制备的10g南瓜果皮粉置于棕色瓶中，以料液比1g:10mL的量加入去离子水，室温浸泡10h后，在温度35℃，超声功率240W条件下超声处理25min后，获得预处理后的料浆100g，用于下一步的色素提取。
3.4南瓜果皮色素提取工艺
分别采用以下两种方法对预处理后的南瓜果皮粉进行色素提取：
3.4.1纤维素酶法：
(1)单因素：
A加酶量，步骤3.3中预处理后的料浆10g，加入400mL低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇的摩尔比1:3)-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液比达到1g:40mL，再加入纤维素酶(酶量以料浆重量计分别为0.2％、0.8％、1.4％、2％和2.6％)，混匀，30℃提取110min。以南瓜果皮色素提取得率和抗氧化指标(ABTS+清除率)作为筛选指标。
B温度，在A的基础上，选择酶量为1.4％，温度改为20-60℃(20、30、40、50、60℃)，其他操作相同。
C时间，在A的基础上，选择酶量为1.4％，时间改为70-150min(70、90、110、130、150min)，其他操作相同。
(2)响应面优化：在单因素的基础上，同时以南瓜果皮色素提取得率和抗氧化指标(ABTS+清除率)两项筛选指标作为响应值，根据中心组合试验原理，以加酶量(E/S)、酶解温度、酶解时间为变量，采用Design-Expert 8.0.6软件设计了三因素三水平响应面分析试验，进行Box Benhnken Design响应面优化。
3.4.2超声波法：
(1)单因素：
A超声功率，步骤3.3中预处理后的料浆10g，在50℃水浴摇床上浸提90min后，置于超声波清洗仪，30℃、超声波频率为30kHz，超声功率120-240W(120、150、180、210、240W)提取30min，以南瓜果皮色素提取得率和抗氧化指标(ABTS+清除率)作为筛选指标。
B超声温度，在A的基础上，将温度改为20-60℃(20、30、40、50、60℃)。
C超声时间，在A的基础上，将时间改为10-90min(10、30、50、70、90min)。
(2)响应面优化：
在单因素的基础上，同时以南瓜果皮色素提取得率和抗氧化指标(ABTS+清除率)两项筛选指标作为响应值，根据中心组合试验原理，以超声功率、超声温度、超声时间为变量，采用Design-Expert 8.0.6软件设计了三因素三水平响应面分析试验，进行BoxBenhnken Design响应面分析。
3.4.3南瓜果皮色素提取工艺
纤维素酶法与超声波法分别优化获得最佳提取工艺参数后，经步骤3.3预处理后的料浆，首先采用低共熔溶剂-醇双相体系，通过纤维素酶法在最佳提取工艺参数下提取料浆中的色素，再通过最佳提取工艺参数下超声波法对色素进一步提取，获得高得率的南瓜果皮色素，具体如下：
步骤3.3中预处理后的料浆10g，加入400mL低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇的摩尔比1:3)-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液比达到1g:40mL，再加入纤维素酶(酶量以料浆重量计为1.94％)，混匀，33℃、100rpm保温酶解112min，获得酶解混合液；然后将酶解混合液置于超声波清洗仪，在28℃、超声波频率为30kHz，超声功率180W条件下超声提取40min，离心(8000rpm，20min)，上清液浓缩至原体积1/3，在初始温度为-30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至-20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h以上至样品含水量在8％以下，获得南瓜果皮色素57.2mg。
3.5南瓜果皮色素的理化性质测定
3.5.1样品溶液：0.05g步骤3.4.3方法制备的南瓜果皮色素用无水乙醇溶解制成不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL)的样品溶液。
空白样品：不含样品，与样品溶液相同体积的无水乙醇。
阳性对照样品：与样品溶液浓度相同的Vc乙醇溶液。
3.5.2ABTS+清除能力的测定。
ABTS+清除率的测定方法参考(Yaoyao Xu,Meng Shen,Yidan Chen,Yeqing Lou,Ruichao Luo,Jiajia Chen,Yongjun Zhang,Jia Li,Weimin Wang.Optimization of thepolysaccharide hydrolysate from Auricularia auricula with antioxidantactivity by response surface methodology[J].Int J Biol Macromol.,2018,113:543-549.)，流程见图11。
ABTS+清除能力计算公式：清除率％＝[A0-A/A0]×100％(其中，A0为空白对照吸光度，A为样品吸光度)。
3.5.3α-淀粉酶抑制率的测定。
步骤3.4.3方法制备的南瓜色素用无水乙醇溶解制成0.25mg/mL样品溶液，再用无水乙醇依次稀释10、25、50、75、100倍作为待测样品，按表1中方法测定对α-淀粉酶抑制率。
表1α-淀粉酶抑制率的测定
各管于37℃水浴30min后，加入3mL DNS，经沸水浴10min，冷却后取0.5mL反应液加蒸馏水4.5mL，于520nm处测吸光值。
α-淀粉酶抑制率按下式计算：
处测吸光值。
3.5.4蔗糖酶抑制率的测定。
步骤3.4.3方法制备的南瓜色素用无水乙醇溶解制成0.25mg/mL样品溶液，然后依次用无水乙醇稀释10、25、50、75、100倍，作为待测样品，按表2中方法测定对蔗糖酶抑制率。
表2蔗糖酶抑制率的测定
各管均加入1.5mL DNS，沸水浴5min，冷却后加去离子水定容至25mL，于在520nm处测吸光值。蔗糖酶抑制率计算公式如下：
抑制率＝[A对照1-(A样品-A对照2)]/A对照1
3.5.5南瓜果皮色素对C.elegans寿命与抗氧化物酶活影响。
M9溶液：准确称取Na2HPO4·12H2O 15.0g、KH2PO4 3.0g、NaCl 5.0g、MgSO4 0.12g，用水800mL溶解后再定容至1000mL，混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
样品溶液：将步骤3.4.3方法制备的南瓜果皮色素溶于DMSO中，制成质量浓度为100mg/mL的样品液，经0.22μm滤膜滤过除菌，于-20℃保存；后续试验时以M9溶液将其稀释至所需浓度即可(体系中DMSO终浓度<2‰)。
阳性对照溶液：精密称取Ve或GSH(谷胱甘肽)对照品100mg，溶于DMSO 1mL中，制成浓度为100mg/mL的贮备液，经0.22μm滤膜滤过除菌，于-20℃保存；后续试验时以M9溶液将其稀释至所需浓度即可(体系中DMSO终浓度<2‰)。
NGM培养基的配制：NGM培养基(1L)组成：2.5g蛋白胨、3g NaCl、17g琼脂、25mL1mol/L PBS缓冲液(pH 6.0)，975mL蒸馏水，灭菌后加入滤膜除菌的1mL 5mg/mL胆固醇溶液(溶剂为乙醇)，1mL 1mol/L MgSO4，1mL 1mol/L CaCl2。
LB培养基(1L)：10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl，以5M NaOH调至中性，溶剂为水。
裂解液：0.5mL去离子水、0.3mL NaClO、0.2mL 10mol/L NaOH，现配现用。
线虫培养：将100μL E.coli OP50菌液接菌于100mL的LB液体培养基中，37℃摇床培养12h，当培养基变浑浊时，取出放于4℃冰箱备用。吸取50μL E.coli OP50菌液于NGM平板上，晾干后，将线虫(C.elegans)切块接种于平板上，于20℃恒温培养72h后，可见培养基上有大量成虫和幼虫。
线虫同步化：选择线虫生长良好的平板，吸取1.5mL M9缓冲液于平板上，洗涤平板数次直至将大部分虫体洗下，吸取1mL线虫悬浊液于1.5mL EP管中，3000rpm离心1min，弃去上清液，用0.25mL去离子水复溶沉淀。然后加入0.15mL裂解液，漩涡振荡5min，4000rpm离心1min，弃去上清液，再加入1mL M9缓冲液复溶，涡旋洗涤，4000rpm离心1min，重复洗涤直至无次氯酸钠的味道。将裂解出的虫卵置于未涂布E.coli OP50的NGM培养基上，于20℃培养箱中培养12～18h，获得L1期线虫。用M9缓冲液将虫体洗下，置于已涂布E.coli OP50的NGM培养基上，在20℃培养箱中培养48h，得同步化完成的L4期线虫，用于后续实验。
C.elegans寿命实验：实验设阴性对照组(M9缓冲液)、Vc阳性对照组(0.5mg/mL)与南瓜果皮色素样品组(0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0mg/mL，溶剂M9缓冲液)。各组的NGM平板上分别涂布有1mL的M9、Vc溶液及样品溶液，每个板上涂布150μL的E.coli OP50。分别挑取10条同步化处理后L4期的线虫至各组平板上，每组3个平行，于20℃培养48h。然后将各组C.elegans分别转移至含200μL双氧水(1mM)的96孔板，于20℃培养，从转移时刻起开始计时，转移时记为0min，每隔40min记录C.elegans存活数目。
抗氧化物酶活：设置C.elegans寿命实验同样实验，不同之处在于南瓜果皮色素样品组(0.0625、0.125、0.25mg/mL，溶剂M9缓冲液)。各组的NGM平板上分别涂布有1mL的M9、Vc溶液及样品溶液，每个板上涂布有150μL的E.coli OP50。分别挑取10条同步化处理后L4期的线虫至各组平板上，每组3个平行，于20℃培养48h。然后将各组C.elegans分别转移至含200μL双氧水(1mM)的96孔板，于20℃培养2h后取C.elegans匀浆，按试剂盒法检测MDA与SOD含量。
4实验结果
4.1南瓜果皮色素的定量分析方法
南瓜果皮色素的紫外-可见光谱扫描图见图1。由图1可知，南瓜果皮色素在446nm和472.5nm处出现峰值，其中446nm为南瓜果皮色素的最大峰值，故选取446nm为最大吸收波长。
绘制不同浓度南瓜果皮色素的浓度-吸光度标准曲线，见图2所示，其线性回归方程为y＝38.536x-0.4071，R2＝0.98318。这表明南瓜果皮色素的浓度与吸光度之间存在较好的线性关系。
4.2提取剂对南瓜果皮色素得率的影响
(1)分别以正丁醇、甲醇、异丙醇、丙酮、95％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、低共熔溶剂(即色素提取剂)为提取剂提取南瓜果皮色素，色素的提取得率见图3。
由图3可知，不同提取剂对南瓜果皮色素的提取得率影响不同，其中，低共熔溶剂的提取得率最高，其次为95％乙醇，与其他六种提取剂的提取得率间均存在显著性差异(p＜0.05)。结合溶剂的稳定性、安全性、成本等多方面因素，后续超声波法提取色素时，选取乙醇为提取剂进行单因素与响应面优化，获得最佳提取工艺条件，进而通过低共熔溶剂与乙醇的不同配比获得超声波法提取南瓜果皮色素的最优工艺参数。
(2)乙醇浓度对南瓜果皮色素提取得率的影响见图4。随着乙醇浓度的增加，南瓜果皮色素的提取得率不断增大，乙醇浓度达100％时，南瓜果皮色素的提取得率最大，故低共熔溶剂-醇双相体系中的乙醇采用无水乙醇。
(3)甜菜碱与三乙二醇的摩尔比分别设置为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4时，制备不同低共熔溶剂，不同提取剂对南瓜果皮色素提取得率的影响见图5。由图5可知，甜菜碱与三乙二醇的摩尔比对南瓜果皮色素提取得率有较大影响，随着混合物中三乙二醇比例的增加，南瓜果皮色素提取得率不断增大，当两者比例为1:3时，南瓜果皮色素提取得率最大，以下纤维素酶法提取实验选取这个比例进行提取工艺参数的优化。
(4)低共熔溶剂与乙醇体积比对南瓜果皮色素提取得率的影响。低共熔溶剂与乙醇体积比对南瓜果皮色素的提取得率影响见图6。由图6可知，随着乙醇含量的增加，低共熔溶剂对于南瓜果皮色素的提取得率逐渐增加，在乙醇含量达到50％时最大。低共熔溶剂本身由于流动性不好，具有较高的粘度，影响了其对南瓜果皮色素的提取。当低共熔溶剂中加入乙醇时，它的粘度逐渐降低，其对南瓜果皮色素的提取得率逐渐增大，当乙醇含量达到50％达到最大，且比之前的最佳提取溶剂——乙醇的提取率高。
4.3南瓜果皮色素酶法提取的单因素实验及响应面优化
加酶量、酶解温度与酶解时间对南瓜果皮色素提取得率与ABTS+清除率影响单因素实验见图7，根据单因素实验，分别选取加酶量1.4％，温度30℃，时间110min作为响应面优化的中心点。
纤维素酶法提取工艺优化是在单因素试验基础上，同时以南瓜果皮色素提取得率与ABTS+清除率作为筛选指标，根据中心组合试验原理，采用Design-Expert 8.0.6软件设计了三因素三水平响应面分析试验，响应面实验因素水平见表3，实验设计及结果见表4。
表3纤维素酶法提取南瓜果皮色素实验设计因素水平表
编码水平 A：加酶量(％) B：酶解温度(℃) C：酶解时间(min)
-1 0.8 20 90
0 1.4 30 110
1 2.0 40 130
表4纤维素酶法提取南瓜果皮色素实验设计及及实验结果
使用Design-Expert 8.0.6软件对表4中的南瓜果皮色素提取得率实验数据进行多元拟合，得到南瓜果皮色素提取得率(Y1)与加酶量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)二次多元回归模型为：
Y1＝423.19+24.76*A+26.94*B+8.92*C-0.64*AB-8.74*AC-77.96*BC-28.4*A2-57.68*B2-36.98*C2
回归模型的显著性分析见表5，表明各因素对南瓜果皮色素提取得率影响依次为酶解温度＞加酶量＞酶解温度。因变量和全体自变量之间的线性关系显著，回归方程中Y1表示南瓜果皮色素溶出的预测值。R2(决定系数)与R2Adj(调节决定系数)分别为0.9339和0.8490，表明预测值与观测值间具有较高相关性。同时，较低的变异系数(C.V.％6.83)表明高度的可靠性与精密度。p用于检测每个系数的显著性，其中模型的p(0.0023)<0.01，说明模型适应性显著；失拟项(0.2910)的p>0.05不显著，表明实验方法可靠，模型达到很好的拟合。
表5纤维素酶法提取南瓜果皮色素溶出率回归模型分析
由实验结果做响应面图(图8)，即响应值Y与对应因素A，B，C构成的三维空间图，能直观反映出每个因素对响应值Y1的影响。根据响应面优化图，可看出各因素对南瓜果皮色素溶出过程中的相互作用，从而确定合适的工艺条件。
ABTS+清除率(Y2)与加酶量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)二次多元回归模型为：
Y2＝80.66+13.26A+7.40B+5.54C+1.60AB-0.13AC+2.4BC-4.77A2-9.2B2-10.72C2
回归模型的显著性分析见表6，回归方程中Y2表示南瓜果皮色素对ABTS+清除率的预测值，各因素对南瓜果皮色素清除率影响依次为加酶量＞酶解温度＞酶解时间。R2(决定系数)与R2Adj(调节决定系数)分别为0.9396和0.8620，表明预测值与观测值间具有较高相关性。同时，较低的变异系数(C.V.％7.81)表明高度的可靠性与精密度。p用于检测每个系数的显著性，其中模型的p(0.0017)<0.01，说明模型适应性极显著；失拟项(0.2105)的p>0.05不显著，表明实验方法可靠，模型达到很好的拟合。由表6可知，加酶量、酶解温度与酶解时间三个因素的p值小于0.01，说明三个因素对ABTS+清除率影响显著。三者的交互项均不显著(p>0.05)，不需要做响应面与等高线图。
表6纤维素酶法提取南瓜果皮色素清除率回归模型分析
Source Sum of Squares df Mean Square F Value P-value Prob＞F
Model 3164.12 9 351.57 12.10 0.0017
A-加酶量 1407.15 1 1407.15 48.44 0.0002
B-酶解温度 438.08 1 438.08 15.08 0.0060
C-酶解时间 245.31 1 245.31 8.44 0.0228
AB 10.24 1 10.24 0.35 0.5714
AC 0.062 1 0.062 0.00215 0.9643
BC 23.04 1 23.04 0.79 0.4027
A2 95.70 1 95.70 3.29 0.1124
B2 363.58 1 363.58 12.52 0.0095
C2 483.64 1 483.64 16.65 0.0047
Residual 203.34 7 29.05
Lack of fit 130.33 3 43.44 2.38 0.2105
Pure error 73.01 4 18.25
Cor total 3367.46 16
综合酶法辅助提取南瓜果皮色素的溶出率与ABTS+清除率，得到响应的最佳点为：A＝0.90(即加酶量为1.94％)，B＝0.33(即酶解温度为33.30℃)，C＝0.04(即酶解时间为112.00min)。在此条件下，预测南瓜果皮色素溶出率理论值可达423.976mg/100g，对ABTS+的清除率理论值达90.846％。考虑到实际操作的可行性，将其最优改性条件调整为：加酶量为1.94％，酶解温度为33℃，酶解时间为112min。
为了进一步验证该模型与实际情况的有效性与准确性，按优化条件进行3次平行实验，南瓜果皮色素得率平均值为424.69±4.07mg/100g，ABTS+的清除率平均值为89.46％±2.45％，与预测值基本一致，说明响应面分析方法可靠，与实际情况拟合较好。
4.4南瓜果皮色素的超声提取工艺优化
超声功率、超声温度与超声时间对南瓜果皮色素提取得率与ABTS+清除率影响单因素实验见图9，选取超声功率180W，超声温度30℃，超声时间30min作为响应面优化的中心点。
超声波法提取工艺优化是在单因素试验基础上，同时以南瓜果皮色素提取得率与ABTS+清除率作为筛选指标，进行Box Benhnken Design响应面分析，响应面实验因素水平见表7，实验设计及结果见表8。
表7超声辅助提取南瓜果皮色素实验设计因素水平表
编码水平 A：超声功率(W) B：超声温度(℃) C：超声时间(min)
-1 150 20 10
0 180 30 30
1 210 40 50
表8超声辅助提取南瓜果皮色素实验设计及及实验结果
使用Design-Expert 8.0.6软件对表中的南瓜果皮色素提取得率实验数据进行多元拟合，得到南瓜果皮色素提取得率(Y1)与超声功率(W)、超声温度(B)、超声时间(C)二次多元回归模型为：
Y1＝373.09+16.03A+9.42B+38.80C+6.84AB+12.83AC-66.05BC-26.61A2-63.14B2-35.18C2
回归模型的显著性分析见表9，表明各因素对南瓜果皮色素提取得率影响依次为超声时间＞超声功率＞超声温度。因变量和全体自变量之间的线性关系显著，回归方程中Y表示南瓜果皮色素溶出的预测值。R2(决定系数)与R2Adj(调节决定系数)分别为0.9771和0.9476，表明预测值与观测值间具有较高相关性。同时，较低的变异系数(C.V.％4.53)表明高度的可靠性与精密度。p用于检测每个系数的显著性，其中模型的p<0.0001，说明模型适应性极显著；失拟项(0.4921)的p>0.05不显著，表明实验方法可靠，模型达到很好的拟合。
表9超声辅助提取南瓜果皮色素溶出率回归模型分析
Source Sum of Squares df Mean Square F Value P-value Prob＞F
Model 60502.40 9 6722.49 33.17 <0.0001
A-超声功率 2056.33 1 2056.33 10.15 0.0154
B-超声温度 709.33 1 709.33 3.50 0.1035
C-超声时间 12041.19 1 12041.19 59.42 0.0001
AB 187.01 1 187.01 0.92 0.3687
AC 658.69 1 658.69 3.25 0.1144
BC 17450.41 1 17450.41 86.11 <0.0001
A2 2980.54 1 2980.54 14.71 0.0064
B2 16785.14 1 16785.14 82.83 <0.0001
C2 5210.64 1 5210.64 25.71 0.0014
Residual 1418.56 7 202.65
Lack of fit 594.71 3 198.24 0.4921
Pure error 823.85 4 205.96
Cor total 61920.96 16
由实验结果做响应面图(图10)，即响应值Y与对应因素A，B，C构成的三维空间图，能直观反映出每个因素对响应值Y的影响。根据响应面优化图，可看出各因素对南瓜果皮色素溶出过程中的相互作用，从而确定合适的工艺条件。
ABTS+清除率(Y2)与超声功率(W)、超声温度(B)、超声时间(C)二次多元回归模型为：
Y2＝77.94-7.78A-9.13B-7.68C+2.65AB+2.45AC+1.20BC-10.59A2-10.19B2-9.65C2
回归模型的显著性分析见表10，回归方程中Y2表示南瓜果皮色素对ABTS+清除率的预测值，各因素对南瓜果皮色素提取得率影响依次为超声温度＞超声功率＞超声时间。R2(决定系数)与R2Adj(调节决定系数)分别为0.9383和0.8589，表明预测值与观测值间具有较高相关性。同时，较低的变异系数(C.V.％8.53)表明高度的可靠性与精密度。p用于检测每个系数的显著性，其中模型的p<0.01，说明模型适应性极显著；失拟项(0.4036)的p>0.05不显著，表明实验方法可靠，模型达到很好的拟合。由表10可知，超声温度、超声功率与超声时间三个因素以及它们的平方项的p值小于0.01，说明三个因素对ABTS+清除率影响显著。三者的交互项均不显著(p>0.05)，不需要响应面与等高线图。
表10超声辅助提取南瓜果皮色素清除率回归模型分析
综合超声辅助提取南瓜果皮色素的溶出率与ABTS+清除率，得到响应的最佳点为：A＝-0.16(即超声功率为175.20W)，B＝-0.19(即超声温度为28.10℃)，C＝0.041(即超声时间为40.82min)。在此条件下，预测南瓜果皮色素溶出率理论值可达368.028mg/100g，对ABTS+的清除率理论值达79.987％。考虑到实际操作的可行性，将其最优改性条件调整为：超声功率为180W，超声温度为28℃，超声时间为40min。
为了进一步验证该模型与实际情况的有效性与准确性，按优化条件进行3次平行实验，南瓜果皮色素得率平均值为365.26±3.67mg/100g，ABTS+的清除率平均值为81.24％±1.06％，与预测值基本一致，说明响应面分析方法可靠，与实际情况拟合较好。
4.5南瓜果皮色素的酶抑制能力
4.5.1南瓜果皮色素对α-淀粉酶的抑制率
α-淀粉酶属α-葡萄糖苷酶，是人体中碳水化合物转化的关键酶之一，能催化α-1,4-糖苷键水解，人体对淀粉、糊精等碳水化合物的吸收依赖于小肠刷状缘上该类酶的活性。研究发现，α-淀粉酶抑制剂对肠道内唾液及胰α-淀粉酶的活性具有抑制效果，能遏制食物中淀粉及其他碳水化合物的转化利用，减少糖分的摄取，具有降低血糖和血脂的效果。目前，α-淀粉酶抑制剂类降糖药物阿卡波糖(拜唐苹TM)已广泛应用于临床上对2型糖尿病的治疗。采用3.5.3检测不同浓度(表11)的南瓜果皮色素对α-淀粉酶的抑制率如下表11。
表11南瓜果皮色素对α-淀粉酶的抑制率
由表11可知，南瓜果皮色素的浓度为2.5μg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率达43.8％，随着浓度的不断增加，南瓜果皮色素对α-淀粉酶的抑制率不断提高，当南瓜果皮色素的浓度增加至25μg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率增加至83.4％，说明南瓜果皮色素对α-淀粉酶的抑制率具有浓度依赖关系。
4.5.2南瓜果皮色素对蔗糖酶的抑制率
蔗糖酶又叫做转化酶，主要存在于小肠中，是对消化吸收功能具有重要作用的二糖酶，能够使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，对于控制血糖高低具有重要意义。糖尿病患者的肠道二糖酶的酶活性偏高，促进了葡萄糖的生成和吸收，导致血糖的升高，因此降低二糖酶的活性对控制血糖水平具有重要作用。采用3.5.4检测不同浓度的南瓜果皮色素对蔗糖酶的抑制率如下表12。
表12南瓜果皮色素对蔗糖酶的抑制率
由表12可知，南瓜果皮色素的浓度为2.5μg/mL时，对蔗糖酶的抑制率达44.2％，随着浓度的不断增加，南瓜果皮色素对蔗糖酶的抑制率不断提高，当南瓜果皮色素的浓度增加至25μg/mL时，对蔗糖酶的抑制率增加至75.7％，说明南瓜果皮色素对蔗糖酶的抑制率具有浓度依赖关系。
因南瓜果皮色素对α-淀粉酶与蔗糖酶的活性均具有较好的抑制作用，有望作为酶抑制剂类降糖药物的开发潜力。
4.6南瓜果皮色素对氧化应激状态下C.elegans存活率的影响
由图12，双氧水应激状态阴性(M9)组线虫最大存活时间(Tmax)仅为6h，阳性物质(Vc)可以使线虫Tmax延长至10h，所有实验浓度组线虫存活时间均长于8h。双氧水处理200min后，所有浓度南瓜果皮色素(0.0625-1.0mg/mL)均能使应激状态下线虫生长曲线右移，且Tmax延长至13h以上。M9组线虫的平均存活时间为2.72h，Vc组线虫的平均存活时间为5.07h。不同浓度样品组线虫的平均存活时间均显著高于M9组，分别为5.03h、7.10h、8.88h、3.68h与4.11h，样品浓度为0.25mg/mL时效果最好，能使线虫寿命延长3.26倍。高浓度南瓜果皮色素的效果不如中等浓度，其原因推测为浓度过高可能产生其它生理毒性，影响线虫正常生理活动，也可能是渗透压过高所致。总体，实验所选所有浓度均能延长应激状态下线虫寿命，表明南瓜果皮色素具有显著抗氧化应激作用。
SOD是抗氧化防御系统中起重要作用的酶系，可清除超氧阴离子自由基。由图13，与M9组比较，阳性物质(Vc)能显著增强双氧水应激状态下线虫体内SOD活性(p<0.05)。不同浓度南瓜果皮色素(0.0625，0.125与0.25mg/mL)，均能显著增强双氧水应激状态下线虫体内SOD活性(p<0.05)。MDA作为脂质氧化终产物，其含量越大表明机体氧化损伤越严重。由图13，Vc与不同浓度南瓜果皮色素均可以使应激状态下线虫体内MDA水平显著下降(p<0.05)，表明南瓜果皮色素在减缓氧化应激损伤方面起重要作用。
实施例2、最佳提取工艺
综合实施例1纤维素酶法与超声波法优化出来的最佳提取工艺参数，先在低温条件下制备南瓜果皮粉，再对制备的南瓜果皮粉进行溶胀与超声破壁预处理，然后依次采用优化出来的纤维素酶法的最佳提取工艺参数与超声波法优化出来的最佳提取工艺参数提取南瓜果皮色素，最后对提取的南瓜果皮色素的自由基清除能力与酶抑制能力进行测定。具体如下：
首先将10g南瓜果皮粉(同实施例1)置于棕色瓶中，以料液比1g:10mL加入去离子水100mL，室温浸泡10h后，在温度35℃，超声功率240W条件下超声处理25min，获得料浆。随后向料浆中加入300mL低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇摩尔比1:3)-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液比达到1g:40mL，再加入0.194g纤维素酶(加酶量1.94％)，在水浴摇床(转速100rpm)中，33℃条件下保温酶解110min后，获得酶解混合液；再将酶解混合液在超声功率为180W、超声温度为28℃条件下超声40min。离心(8000rpm，20min)，上清液中南瓜果皮色素得率为632.75mg/100g，上清液浓缩至原体积1/3，初始温度为-30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至-20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h以上至样品干燥(含水量在8％以下)，获得南瓜果皮色素63mg。
南瓜果皮色素的ABTS+的清除率为91.26％；α-淀粉酶的抑制率为83.4％，蔗糖酶的抑制率为75.7％；能使应激状态下线虫生长曲线右移，且Tmax延长至13h以上；显著增强双氧水应激状态下线虫体内SOD活性(p<0.05)，降低线虫体内MDA水平显著(p<0.05)。
比较例1南瓜果皮的处理工艺对色素提取得率的影响
将黄狼南瓜洗净，削皮，将20g南瓜果皮，采用热风干燥机在70℃进行烘干。然后在-10℃低温冷冻粉碎机中进行粉碎，过筛，过300目筛，获得南瓜果皮粉12.2g。
同实施例2方法提取南瓜果皮色素，抗氧化性与酶抑制能力分析测试步骤及操作同实施例1。南瓜果皮色素的提取得率、抗氧化性与酶抑制能力指标见下表13。
表13不同处理工艺南瓜果皮色素的得率、抗氧化性与酶抑制能力指标
由表13可知，南瓜果皮的处理工艺对色素提取得率、抗氧化性与酶抑制能力均有一定影响，南瓜果皮的真空冷冻干燥处理方式可使果皮色素的提取得率、抗氧化能力、酶抑制能力与线虫平均存活时间提高，比传统的热风干燥处理得到的果皮色素分别提高了1.236倍、1.703倍、1.576倍、1.502倍、1.285倍。
比较例2南瓜果皮的处理工艺对色素提取得率的影响
黄狼南瓜洗净，削皮，将20g南瓜果皮经-30℃真空冷冻干燥后，进行机械粉碎，过40目筛，获得南瓜果皮粗粉19.8g。
同实施例2方法提取南瓜果皮色素，抗氧化性与酶抑制能力分析测试步骤及操作同实施例1。南瓜果皮色素的提取得率、抗氧化性与酶抑制能力指标见下表14。
表14不同处理工艺南瓜果皮色素的得率、抗氧化性与酶抑制能力指标
由表14可知，南瓜果皮的处理工艺对色素提取得率、抗氧化性、酶抑制能力与线虫平均存活时间均有一定影响，南瓜果皮的低粉处理方式可使果皮色素的提取得率、抗氧化能力、酶抑制能力与线虫平均存活时间提高，比传统的机械粗粉处理得到的果皮色素分别提高了1.556倍、1.125倍、1.450倍、1.371倍、1.260倍。
比较例3南瓜果皮粉粒径不同
黄狼南瓜洗净，削皮，将60g南瓜果皮切丝后，置于真空冷冻干燥机中，初始温度为-30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至-20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h至含水量在8％以下。然后在-10℃低温冷冻粉碎机中进行粉碎，，过150目筛，得到南瓜果皮细粉55g。后续的提取工艺同实施例2，抗氧化性与酶抑制能力分析测试步骤及操作同实施例1。南瓜果皮色素的提取得率、抗氧化性与酶抑制能力指标见下表15。
表15不同处理工艺南瓜果皮色素的得率、抗氧化性与酶抑制能力指标
由表15可知，南瓜果皮的处理工艺对色素提取得率、抗氧化性、酶抑制能力与线虫平均存活时间有一定影响，南瓜果皮的低粉处理方式可使果皮色素的提取得率、抗氧化能力、酶抑制能力与线虫平均存活时间提高，比传统的机械细粉处理得到的果皮色素分别提高了1.312倍、1.173倍、1.423倍、1.384倍、1.228倍。
比较例4南瓜果皮粉减少预处理对提取得率的影响
将实施例1的3.1步骤(1)方法制备的10g南瓜果皮粉置于棕色瓶中，加入400mL低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇摩尔比1:3)-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液比达到1g:40mL，加入0.194g纤维素酶(加酶量1.94％)，在水浴摇床(转速100rpm)中，33℃条件下保温酶解110min后，再在超声功率为180W、超声温度为28℃条件下超声40min。离心(8000rpm，20min)，上清液中南瓜果皮色素的提取得率、抗氧化性与酶抑制能力指标见下表16。
表16不同处理工艺南瓜果皮色素的得率、抗氧化性与酶抑制能力指标
由表16可知，南瓜果皮的处理工艺对抗氧化性、酶抑制能力与存活率影响不大，对色素提取得率有较大影响，南瓜果皮的浸泡过夜与超声处理可使果皮色素的提取得率提高了1.463倍。
比较例5减少超声对南瓜果皮色素的影响
将实施例1的3.1步骤(1)方法制备的10g南瓜果皮粉置于棕色瓶中，以料液比1g:10mL加入去离子水100mL，室温浸泡10h后，在温度35℃，超声功率240W条件下超声处理25min。随后加入300mL低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇摩尔比1:3)-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液比达到1g:40mL，加入0.194g纤维素酶(加酶量1.94％)，在水浴摇床(转速100rpm)中，33℃条件下保温酶解110min后，离心(8000rpm，20min)，上清液中南瓜果皮色素的提取得率、抗氧化性与酶抑制能力指标见下表17。
表17不同处理工艺南瓜果皮色素的得率、抗氧化性与酶抑制能力指标
由表17可知，南瓜果皮的提取工艺对抗氧化性、酶抑制能力与存活率影响不大，对色素提取得率有较大影响，南瓜果皮粉经酶法提取后再超声处理可使果皮色素的提取得率提高了1.187倍。
比较例6减少纤维素酶处理对南瓜果皮色素的影响
将实施例1的3.1步骤(1)方法制备的10g南瓜果皮粉置于棕色瓶中，以料液比1g:10mL加入去离子水100mL，室温浸泡10h后，在温度35℃，超声功率240W条件下超声处理25min。随后加入300mL低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇摩尔比1:3)-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液比达到1g:40mL，在超声功率为180W、超声温度为28℃条件下超声40min。离心(8000rpm，20min)，上清液中南瓜果皮色素的提取得率、抗氧化性与酶抑制能力指标见下表18。
表18不同处理工艺南瓜果皮色素的得率、抗氧化性与酶抑制能力指标
由表18可知，南瓜果皮的提取工艺对抗氧化性、酶抑制能力与存活率影响不大，对色素提取得率有较大影响，南瓜果皮粉经酶法提取后再超声处理可使果皮色素的提取得率提高了1.208倍。
实施例3
将10g南瓜果皮粉(300目，同实施例1步骤3.1)置于棕色瓶中，以料液质量比1g:8mL加入去离子水，室温浸泡12h后，在超声温度40℃、超声功率240W条件下超声处理20min，获得料浆。随后向料浆中加入220mL低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇摩尔比1:3)-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液质量比达到1g:30mL，加入0.194g纤维素酶(加酶量1.94％)，在水浴摇床(转速100rpm)中，33℃条件下保温酶解110min后，获得酶解混合液；将酶解混合液在超声功率为180W、超声温度为28℃条件下超声40min。离心(8000rpm，20min)，上清液中南瓜果皮色素得率为627.19mg/100g，实施例2方法冻干后获得南瓜果皮色素62.7mg；ABTS+的清除率为90.61％；α-淀粉酶的抑制率为82.1％，蔗糖酶的抑制率为73.9％；线虫平均存活时间为8.52h。
实施例4
将10g南瓜果皮粉(300目，同实施例1步骤3.1)置于棕色瓶中，以料液质量比1g:9mL加入去离子水，室温浸泡8h后，然后在超声温度40℃、超声功率210W条件下超声处理20min，获得料浆。随后向料浆中加入310mL低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇摩尔比1:3)-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液质量比达到1g:40mL，加入0.194g纤维素酶(加酶量1.94％)，在水浴摇床(转速100rpm)中，33℃条件下保温酶解110min后，获得酶解混合液；将酶解混合液在超声功率为180W、超声温度为28℃条件下超声40min。离心(8000rpm，20min)，上清液中南瓜果皮色素得率为625.83mg/100g，实施例2方法冻干后获得南瓜果皮色素62.5mg；ABTS+的清除率为89.7％；α-淀粉酶的抑制率为81.9％，蔗糖酶的抑制率为74.3％；线虫平均存活时间为8.61h。
实施例5
10g南瓜果皮粉(300目，同实施例1步骤3.1)置于棕色瓶中，以料液质量比1g:12mL加入去离子水，室温浸泡10h后，然后在超声温度30℃、超声功率270W条件下超声处理20min，获得料浆。随后向料浆中加入380mL低共熔溶剂-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液质量比达到1g:50mL，加入0.194g纤维素酶(加酶量1.94％)，在水浴摇床(转速100rpm)中，33℃条件下保温酶解110min后，获得酶解混合液；将酶解混合液在超声功率为180W、超声温度为28℃条件下超声40min。离心(8000rpm，20min)，上清液中南瓜果皮色素得率为630.11mg/100g，实施例2方法冻干后获得南瓜果皮色素63.0mg；ABTS+的清除率为91.1％；α-淀粉酶的抑制率为82.1％，蔗糖酶的抑制率为73.7％；线虫平均存活时间为8.42h。
实施例6
10g南瓜果皮粉(300目，同实施例1步骤3.1)置于棕色瓶中，以料液比1g:11mL加入去离子水，室温浸泡8h后，然后在超声温度40℃、超声功率210W条件下超声处理30min，获得料浆。随后向料浆中加入340mL低共熔溶剂(甜菜碱与三乙二醇摩尔比1:2)-醇双相体系(低共熔溶剂与无水乙醇的体积比例为1:1)，使料液比达到1g:45mL，加入0.194g纤维素酶(加酶量1.94％)，在水浴摇床(转速100rpm)中，33℃条件下保温酶解110min后，获得酶解混合液；将酶解混合液在超声功率为180W、超声温度为28℃条件下超声40min。离心(8000rpm，20min)，上清液中南瓜果皮色素得率为629.17mg/100g，实施例2方法冻干后获得南瓜果皮色素62.9mg；ABTS+的清除率为90.7％；α-淀粉酶的抑制率为82.5％，蔗糖酶的抑制率为74.4％；线虫平均存活时间为8.64h。

Claims (8)

1.一种用于抗氧化应激的南瓜果皮色素在制备酶抑制剂中的应用，其特征在于所述南瓜果皮色素按如下步骤进行提取：
(1)将南瓜果皮粉加入去离子水中，室温浸泡8～12h，超声浸提，获得料浆；
(2)向步骤(1)料浆中加入提取剂，然后加入纤维素酶，混匀，在20～60℃、50-150rpm水浴摇床上保温酶解70～150min，获得酶解混合液；所述提取剂包括正丁醇、甲醇、异丙醇、丙酮、95％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、低共熔溶剂-醇双相体系中的一种；所述低共熔溶剂-醇双相体系由低共熔溶剂与无水乙醇以体积比1:1-4混合而成，所述低共熔溶剂是将甜菜碱与三乙二醇混合，在78℃加热120min后制成，所述甜菜碱与三乙二醇物质的量之比为1:1～1:4；
(3)将步骤(2)酶解混合液在20-60℃、120-240W条件下超声处理10～90min，离心，上清液浓缩至原体积1/3，冷冻干燥，获得南瓜果皮色素。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(1)中南瓜果皮粉末按如下方法制备：将新鲜南瓜果皮切丝后，置于真空冷冻干燥机中，初始温度为-30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至-20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h以上至样品含水量在8％以下，在-10℃低温冷冻粉碎机中进行粉碎，过300目筛，获得南瓜果皮粉。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(1)中超声浸提条件为：超声功率210W～270W、温度30～40℃，超声处理20～30min。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(1)去离子水体积用量以南瓜果皮粉重量计为5-12mL/g。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(2)提取剂为低共熔溶剂-醇双相体系，所述低共熔溶剂与无水乙醇以体积比1:1，所述低共熔溶剂中甜菜碱与三乙二醇物质的量之比为1:3。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(2)中提取剂体积用量以步骤(1)南瓜果皮粉质量计为30～50mL/g；所述纤维素酶与步骤(1)南瓜果皮粉质量比为0.001～0.02：1。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(3)冷冻干燥是在初始温度为-30℃，当真空度为80Pa时开始加热，加热至-20℃时保持1h，然后温度每升高10℃保持1h，一直升温至20℃，保持24h以上至样品含水量在8％以下。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述酶包括α-淀粉酶或蔗糖酶。
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南瓜皮类胡萝卜素的提取工艺研究;付莉;《中国农学通报》;20121225;第36卷(第28期);295-299 *

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