KR101421615B1 - 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헛개나무 열매에서 유효성분인 암페롭신을 분리하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 섬유소 분해효소를 사용하여 낮은 온도에서 헛개나무 열매로부터 유효성분을 추출하는 기술을 개발하여 공정의 안전성을 확립함과 동시에 헛개나무 열매로부터 유효성분의 추출 효율을 높이고, 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 최종적으로 앞페롭신을 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 헛개나무 열매로부터 암페롭신(ampelopsin)을 분리하는 방법은, 특정 미생물에서 유래된 섬유소 분해효소를 이용하여 낮은 온도에서 열처리하는 공정을 통해 헛개나무 열매로부터 유효성분을 안정적이고 높은 효율로 추출할 수 있으며, 또한 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 추출 물질을 분획하는 공정을 통해 최종적으로 단시간에 암페롭신이 분리할 수 있는 이점을 갖는다.

Description

헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법{Isolation Method of Ampelopsin from Hovenia Dulcis Fruit}
본 발명은 헛개나무 열매에서 유효성분인 암페롭신을 분리하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 섬유소 분해효소를 사용하여 낮은 온도에서 헛개나무 열매로부터 유효성분을 추출하는 기술을 개발하여 공정의 안전성을 확립함과 동시에 헛개나무 열매로부터 유효성분의 추출 효율을 높이고, 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 최종적으로 암페롭신을 분리하는 방법에 관한 것이다.
헛개나무의 열매는 ‘지구자’라 하며 알코올로 인한 숙취해소 및 주독으로 인한 제반증상에 대하여 간에 직접적으로 작용하여 해독작용을 한다고 알려져 있다. 최근에 헛개나무와 관련된 숙취해소 음료 및 차 등이 다량으로 판매되고 있다.
특히, 한국야쿠르트가 개발한 헛개나무에서 추출한 유효성분을 사용한 기능성 식품은 2009년 8월에 출시되어 2009년에 400억의 매출을 올렸으며 2010년 현재 약 1,200억원의 매출을 올리고 있다. 국내의 기능성 식품 생산업체인 굿푸드의 ‘헛개 컨디션’, 대웅제약의 ‘헛개 컨디션파워’, 천호식품의 ‘헛개나무 100’ 및 유한양행의 ‘헛개보감’과 같은 헛개나무를 이용한 제품이 출시되어 판매되고 있다. 이와 같이 헛개나무 추출물을 이용한 기능성 식품의 수요가 증가하는 것은 소비자들의 헛개나무에 대한 인지도가 70%를 넘어섰기 때문이며, 헛개나무가 간 건강에 좋다는 사실이 이미 잘 알려져 있기 때문이다. 따라서 헛개나무 추출물을 이용한 기능성 식품의 수요는 계속 증가할 것이다.
상기 헛개나무 추출물의 유효성분으로는 호베니틴, 라리세트린, 암페롭신, 미리세틴 및 갈로카테친 등이 존재하는 것으로 보고되고 있다. 이들의 분리를 위해서는 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 용매를 이용 고온에서 추출을 한 후, 크로마토그램을 이용하여 분획시켜 유효성분은 얻어내고 있다. 하지만 상기의 방법은 높은 온도에서 장시간 처리하는 과정을 통한 유효성분의 변성, 낮은 추출 수율(0.0003% 내지 0.012% 정도로 매우 낮은 수율을 보임) 및 여러 종류의 분획을 통해 유효성분을 분리하기 때문에 많은 시간이 필요한 단점이 존재한다.
한편, 이러한 헛개나무에서 유효성분의 추출 효율을 개선하기 위해 현재까지 몇몇 기술이 개발되어 있으며, 관련된 특허로는 2003년 이후에 약 6건이 있으며 출원인은 (주)생명의 나무 (4건), 공주대학교 산학협력단 (1건) 및 기인 (1건) 등이다. 특허로 등록된 대부분의 추출방법은 저급 알코올 등을 사용하여 반응온도 70 ~ 100℃에서 2~10시간 반응시킨 후 필터 등을 사용하여 유효물질을 추출하고 있다.
그러나 상기와 같은 방법 또한, 높은 온도에서 장시간 처리에 따른 유효성분 변성 문제 및 헛개나무의 주요 성분인 섬유소질의 단단한 구조 때문에 추출률이 높지 않은 단점이 여전히 존재하고 있다. 따라서 헛개나무의 특성 및 헛개나무 추출 유효성분의 효능을 유지할 수 있는 친환경적인 방법의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 헛개나무 열매로부터 유효성분을 추출/분리함에 있어 안정적으로 추출 효율을 높일 수 있는 방법을 모색하였으며, 그 결과 특정 미생물에서 유래된 섬유소 분해효소를 이용하는 경우 낮은 온도에서도 효과적으로 헛개나무 열매로부터 유효성분이 추출될 수 있으며, 여기에 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 추출 물질을 분획화하는 경우 최종적으로 단시간에 암페롭신이 분리될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-0524659호
따라서 본 발명의 목적은 유효성분의 변성 문제없는 안정적인 추출 공정, 높은 유효성분 추출 효율 및 이를 통해 최종적으로 암페롭신(ampelopsin)을 분리할 수 있는 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 (a) 물에 헛개나무 열매와 섬유소 분해효소를 첨가하여 혼합하는 단계; (b) 혼합물에 열처리하여 헛개나무 열매 추출물을 제조하는 단계; (c) 헛개나무 열매 추출물에서 불용성 물질을 제거하는 단계; 및 (d) 불용성 물질이 제거된 추출물을 분획하는 단계를 포함하는, 헛개나무 열매로부터 암페롭신(ampelopsin)을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 헛개나무 열매는 40 내지 120 g/L의 농도로 첨가되며, 섬유소 분해 효소는 50 내지 100 U/mL의 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명의 일시시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 섬유소 분해효소는 미생물 유래일 수 있다.
또한, 본 발명의 일시시예에 있어서, 상기 미생물은 바실러스(Bacillus) 속, 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 루미노코커스(Ruminococcus) 속 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.
또한, 본 발명의 일시시예에 있어서, 상기 바실러스 속 미생물은 바실러스 아미로리퀘페이션스 DL-3(Bacillus amyloliquefaciens DL-3: KACC 91344P)일 수 있다.
또한, 본 발명의 일시시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 섬유소 분해효소는 셀룰레이즈(cellulase)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 열처리 온도는 40℃ 내지 60℃일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 불용성 물질 제거는 필터프레스와 연속원심분리기를 사용하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d) 단계에서 분획은 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 분자량 300,000 Da 이하의 물질을 분획하고, 다시 15,000 Da 이하의 물질을 분획하는 과정을 통해 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 방법으로 분리된 암페롭신을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 헛개나무 열매로부터 암페롭신(ampelopsin)을 분리하는 방법은, 특정 미생물에서 유래된 섬유소 분해효소를 이용하여 낮은 온도에서 열처리하는 공정을 통해 헛개나무 열매로부터 유효성분을 안정적이고 높은 효율로 추출할 수 있으며, 또한 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 추출 물질을 분획하는 공정을 통해 최종적으로 단시간에 암페롭신이 분리할 수 있는 이점을 갖는다.
도 1은 헛개나무 열매의 열수추출물에 있어서 열처리 온도별( 20℃(●), 40℃(■), 50℃(▲), 60℃(◆), 80℃() 및 100℃(□)) 시간경과에 따라 생산되는 환원당의 농도를 나타낸 그래프이다(비교예 1).
도 2는 헛개나무 열매에 섬유소 분해효소를 첨가한 후 열처리를 통해 제조되는 헛개나무 열매 추출물에 있어서, 열처리 온도별(20℃(●), 40℃(■), 50℃(▲), 60℃(◆), 80℃() 및 100℃(□)) 시간경과에 따라 생산되는 환원당의 농도를 나타낸 그래프이다(실시예 1).
도 3은 비교예 1 및 실시예 1의 결과를 비교한 그래프이다((a) 20℃, (b) 40℃, (c) 50℃, 및 (d) 60℃)).
도 4는 헛개나무 열매에 섬유소 분해효소를 첨가한 후 열처리를 통해 제조되는 헛개나무 열매 추출물에 있어서, 헛개나무 열매의 첨가 농도별(20 g/L(●), 40 g/L(■), 60 g/L(▲), 80 g/L(◆) 및 100 g/L()) 시간경과에 따라 생산되는 환원당의 농도를 나타낸 그래프이다(실시예 2).
도 5a는 암페롭신의 표준물질을 HPLC로 분석한 결과이며, 도 5b는 본 발명의 실시예 3을 통해 헛개나무 열매로부터 분리한 물질을 HPLC로 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 헛개나무 열매로부터 유효성분인 암페롭신을 분리하는 방법에 관한 것으로, 자세하게는 (a) 물에 헛개나무 열매와 섬유소 분해효소를 첨가하여 혼합하는 단계; (b) 혼합물에 열처리하여 헛개나무 열매 추출물을 제조하는 단계; (c) 헛개나무 열매 추출물에서 불용성 물질을 제거하는 단계; 및 (d) 불용성 물질이 제거된 추출물을 분획하는 단계를 포함하는, 헛개나무 열매로부터 암페롭신(ampelopsin)을 분리하는 방법 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명의 (a) 단계는 물에 헛개나무 열매와 섬유소 분해 효소를 첨가하여 혼합하는 단계이다.
본 발명의 헛개나무 열매는 헛개나무 열매 건조물이 바람직하며, 일반적으로 시중에 판매되는 헛개나무 열매 건조물을 사용하거나 헛개나무 열매를 직접 건조하여 사용하여도 무방하다.
본 발명의 일실시예에서, 헛개나무 열매 건조물은 물에 40 내지 120 g/L의 농도로 첨가될 수 있으며, 섬유소 분해 효소는 물에 50 내지 100 U/mL의 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명의 섬유소 분해효소는 섬유소를 분해할 수 있는 효소이면 특별히 종류를 한정하지 않으며, 예를 들어, 셀룰레이즈(cellulase), 자일란레이즈(xylanase), 아비셀레이즈(avicelase) 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 셀룰레이즈일 수 있다.
또한 이러한 섬유소 분해효소는 시중에서 일반적으로 판매되는 것을 사용하거나 또는 섬유소 분해효소 생산 균주로부터 직접 분리하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 (a) 단계의 섬유소 분해효소는 미생물로부터 유래된 효소일 수 있으며, 상기 미생물은 특별히 종류를 제한하는 것은 아니나, 바람직하게는 바실러스(Bacillus) 속, 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 루미노코커스(Ruminococcus) 속 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 바실러스 아미로리퀘페이션스 DL-3(Bacillus amyloliquefaciens DL-3: KACC 91344P)일 수 있다.
상기 바실러스 아미로리퀘페이션스 DL-3(Bacillus amyloliquefaciens DL-3: KACC 91344P)은 본 발명자가 이전에 연구를 통해 규명한 섬유소 분해효소의 생산성이 매우 우수한 균주로서, 한국농업미생물보존센터에 2008.1.9일자로 기탁하고 기탁번호를 KACC 91344P로 부여받은 균주이다(한국공개특허 제2009-0085379호 참조).
본 발명의 (b) 단계는 혼합물(물에 헛개나무 열매와 섬유소 분해효소를 첨가하여 혼합한 혼합물)에 열을 처리하여 헛개나무 열매 추출물을 제조하는 단계 단계이다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 (b) 단계의 열처리 온도는 30℃ 내지 80℃일 수 있으며, 바람직하게는 40℃내지 60℃일 수 있고, 더욱 바람직하게는 50℃일 수 있다. 본 발명의 상기 (b) 단계에서 열처리 온도가 30℃ 미만인 경우 너무 낮은 온도로 인해 헛개나무 열매로부터 추출효율이 떨어지며, 열처리 온도가 60℃를 초과하는 경우 열효율 대비 추출효율이 미미하거나 감소하기 때문이다.
본 발명의 (c) 단계는 상기 열처리 과정을 거쳐 제조되는 헛개나무 열매 추출물에서 불용성 물질을 제거하는 단계이다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 불용성 물질 제거는 필터프레스와 연속원심분리기를 사용하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 (d) 단계는 불용성 물질이 제거된 추출물을 분획하는 단계로서, 자세하게는 상기 (c) 단계를 통해 불용성 물질이 제거된 헛개나무 열매 추출물에서 암페롭신을 분리하기 위하여 분획화를 실시하는 단계이다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 분획은 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 분자량 300,000 Da 이하의 물질을 분획하고, 다시 15,000 Da 이하의 물질을 분획하는 과정을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명에서 ‘헛개나무’란 갈매나무과의 낙엽활엽교목으로 한국이 원산지이며, 일본 및 중국에서도 자생이 되고 있으며, 호깨나무, 허리깨나무, 지구(枳俱), 백석목(白石木), 목밀(木蜜), 현포리(玄圃梨)로 불리고 있다. 우리나라에서는 경기와 강원 이남지역 해발 50~800미터의 산지에서 자라며, 열매는 10~11월 사이에 수확한다. 헛개나무에는 당분이 많이 존재하며, 당 성분이 외에 사포닌 성분이나, 플라보노이드, 알칼로이드 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.
상기와 같은 특징을 갖는 헛개나무는, 그 열매에 많은 유효성분을 함유하고 있는데 헛개나무 열매에 함유된 주요 성분을 살펴보면, 호베니틴, 라리세트린, 암페롭신, 미리세틴 및 갈로카테친 등이 존재하며, 간보호, 숙취해소 및 피로회복 등의 간기능 개선에 효과적인 것으로 보고되고 있다.
그러나 이들의 분리를 위해서는 높은 온도에서의 추출 공정으로 인한 유효성분의 변성의 문제, 헛개나무 섬유소질의 단단한 구조로 인한 낮은 추출 효율 및 다수의 단계를 통한 분획화 과정에 따른 장시간이 소요된다는 단점이 존재한다.
본 발명자들은 특정 미생물에서 유래된 섬유소 분해효소를 이용하여 낮은 온도에서 열처리하는 공정을 통해 헛개나무 열매로부터 유효성분을 안정적이고 높은 효율로 추출할 수 있으며, 또한 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 추출 물질을 분획하는 공정을 통해 최종적으로 단시간에 암페롭신이 분리할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.
이러한 사실은 본 발명의 일실시예를 통해 확인할 수 있었는데, 기존의 열처리하여 추출한 방법과 섬유소 분해효소를 처리하고 열처리한 방법의 환원당 측정결과(표 3 참조), 본 발명의 섬유소 분해효소를 처리하였을 경우 높은 농도의 환원당이 측정되어, 기존의 열수추출 보다 생산성이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는, 섬유소 분해효소를 첨가하고 열처리하는 방법에 의하여 추출한 수용성 물질에서 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 분리한 최종 물질이 암페롭신인 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
이와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 섬유소 분해효소와 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 이용한 암페롭신(ampelopsin)의 분리방법은 기존의 추출공정보다 안정적이고 효과적임을 실험적으로 입증하였다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 분리된 암페롭신을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물이나 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 암페롭신은 조성물에 10 내지 1000μM의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 암페롭신은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 질환으로는, 간 질환, 산화스트레스 관련 질환 또는 염증질환일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 암페롭신을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 암페롭신 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 암페롭신을 유효성분으로 포함하는 간기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 간기능 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 암페롭신을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 암페롭신을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 암페롭신을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 암페롭신과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 암페롭신과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 암페롭신을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 체지방 감소효과를 가질 뿐만 아니라, 혈청 내의 중성지방(triglyceride)의 농도 감소, 콜레스테롤 수치 감소, HDL-콜레스테롤 농도 증가 및 동맥경화지수 감소를 통한 지질대사 개선 효과를 동시에 가지기 때문에, 비만 예방 또는 개선에 효과적이다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 비교예 1>
헛개나무 열매의 열수추출에 따른 환원당 생산 정도
더원물산 (사업자번호: 210-12-55819, 주소: 경기도 포천시 가산면 가산리 386-1)에서 구입한 헛개나무 열매 건조물을 40 g/L의 농도로 물에 첨가한 후에 각각 20℃, 40℃, 50℃, 60℃, 80℃ 및 100℃의 온도로 열처리하면서 시간별로 생산되는 환원당의 농도를 측정하였다.
상기 얻어진 헛개나무 열매 추출물 10ml을 9배의 증류수에 현탁하여 5분간 진탕시킨 후 1,200rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 분리하고, 분리한 상등액에 유리된 환원당을 측정하였다. 상기의 유리된 환원당의 정량방법은 상기의 상등액을 발색반응의 유효범위내로 희석한 액 1ml 및 3, 5-디니트로살리시릭산(dinitro salicylic acid, DNS) 시약 1ml을 첨가하여, 100℃에서 5분간 발색 반응시켰다. 다음으로, 반응물에 증류수 10ml을 첨가한 후, 540mm에서 흡광도를 측정하여 환원당을 정량하였다.
상기의 결과는 하기 표 1 및 도 1에 나타내었으며, 100℃에서 12시간 처리할 경우에 환원당의 생산 농도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
헛개나무 열매의 열처리 온도 및 시간에 따른 환원당의 생산
Temperature (℃) Reducing sugar (g/L)
0 hr 6 hr 12 hr 18 hr 24 hr
20 0.0±0.1 1.6±0.2 3.0±0.4 4.0±0.3 5.1±0.4
40 0.0±0.2 2.3±0.2 4.1±0.4 5.8±0.4 7.4±0.6
50 0.0±0.1 3.8±0.3 8.0±0.6 10.1±0.6 11.5±0.7
60 0.0±0.1 5.9±0.5 10.9±0.7 12.0±0.8 12.9±0.8
80 0.0±0.2 7.2±0.6 11.9±0.6 12.5±0.6 13.1±0.7
100 0.0±0.2 10.9±0.5 13.1±0.7 6.3±0.5 5.5±0.4
< 실시예 1>
본 발명의 섬유소 분해효소를 첨가한 후 열처리에 따른 헛개나무 열매 추출물의 환원당 생산 정도
<1-1> 미생물 유래 섬유소 분해효소 준비
섬유소 분해효소를 생산하기 위해서, 먼저 바실러스 아미로리퀘페이션스 DL-3 (Bacillus amyloliquefaciens DL-3: KACC 91344P) 균주를 20 g/L 왕겨, 2.5 g/L 효모엑기스, 5.0 g/L K2HPO4, 1.0 g/L NaCl, 0.2 g/L MgSO4ㆍ7H2O 및 0.6 g/L (NH4)2SO4로 이루어진 배지에서 30℃, 2일간 전배양한 후에 전배양액을 5.0% 농도로 본 배양배지에 접종하고 동일한 온도에서 3일간 배양하여 섬유소 분해효소를 생산하였다. 이후, 섬유소 분해효소를 분리 정제하기 위하여 원심분리기를 사용하여 배양된 균체를 제거하고, 균체가 제거된 상등액에 최종 농도가 90%되게 황산암모늄을 처리한 후에 4℃에서 24시간 방치하였다. 황산암모늄을 처리하여 생선된 단백질 침전물을 원심분리하여 수거하였다. 수거한 침전물을 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)로 녹인 후에 분자량이 12,000 ~ 15,000 Da 이하의 물질을 제거하는 투석장치를 이용해 투석함으로써 염 성분을 제거하였다. 염 성분을 제거한 시료를 HiTrapTM QXL 와 Mono Q HR 5/5 (Ion -exchange chromotography)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 섬유소 분해효소를 분리하였다.
참고로, 바실러스 아미로리퀘페이션스 DL-3은 본 발명자가 이전에 연구를 통해 규명한 섬유소 분해효소의 생산성이 매우 우수한 균주로서, 한국농업미생물보존센터에 2008.1.9일자로 기탁하고 기탁번호를 KACC 91344P로 부여받은 균주이다(한국공개특허 제2009-0085379호 참조).
<1-2> 섬유소 분해효소를 첨가한 후 열처리에 따른 헛개나무 열매 추출물의 환원당 생산
헛개나무 열매 건조물을 40 g/L의 농도로 물에 첨가한 후에 상기 실시예<1-1>을 통해 준비된 바실러스 아미로리퀘페이션스 DL-3이 생산하는 섬유소 분해효소를 80 U/mL의 농도로 첨가하였다. 섬유소 분해효소가 첨가된 헛개나무 열매 혼합물을 각각 20℃, 40℃, 50℃, 60℃, 80℃ 및 100℃의 온도로 열처리하면서 시간별로 생산되는 환원당의 농도를 측정하였다. 환원당 측정은 상기 비교예 1과 동일한 방법으로 측정되었다.
그 결과 하기 표 2 및 도 2에서 나타낸 바와 같이, 비교적 낮은 40℃, 50℃ 및 60℃에서 24시간 처리할 경우 비교적 높은 환원당의 농도를 얻을 수 있었으며, 특히 50℃의 열처리 온도에서는 처리 후 12시간이 경과한 시점부터 높은 환원당의 농도를 확인할 수 있었다. 반면에, 열처리 온도가 80℃인 실험군에서는 60℃와 비교하여 온도 증가에 따른 환원당 생산이 미미하였으며, 열처리 온도가 100℃인 실험군에서는 오히려 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
섬유소 분해효소를 첨가한 헛개나무 열매의 열처리 온도 및 시간에 따른 환원당의 생산
Temperature (℃) Reducing sugar (g/L)
0 hr 6 hr 12 hr 18 hr 24 hr
20 0.0±0.2 4.2±0.3 5.6±0.4 6.0±0.5 6.2±0.5
40 0.0±0.1 6.7±0.5 8.7±0.7 10.2±0.7 10.8±0.8
50 0.0±0.1 7.5±0.6 11.0±0.7 11.5±0.9 11.7±0.8
60 0.0±0.2 7.8±0.6 10.8±0.9 11.6±0.8 12.4±0.9
80 0.0±0.1 9.8±0.8 11.4±0.8 12.5±0.9 13.0±0.8
100 0.0±0.1 11.6±0.8 11.6±0.9 8.0±0.7 6.8±0.6
또한, 상기의 결과를 바탕으로, 헛개나무 열매 건조물에 열처리만을 하여 유효성분을 추출한 방법과 섬유소 분해효소를 첨가한 헛개나무 열매 건조물에 열처리한 방법에 의한 유효성분의 생산성을 비교하였으며, 그 결과를 표 3 및 도 3에 나타내었다.
그 결과, 20℃, 40℃ 및 50℃ 등의 비교적 낮은 온도에서는 섬유소 분해효소를 첨가한 방법이 월등히 우수한 것을 확인할 수 있었다.
헛개나무 열매 열수추출물과 섬유소 분해효소 첨가 후 열처리에 따라 생산된 헛개나무 열매 유효성분의 비교
Temperature (℃) Cellulase Reducing sugar (g/L)
0 hr 6 hr 12 hr 18 hr 24 hr
40 - 0.0±0.2 2.3±0.2 4.1±0.4 5.8±0.4 7.4±0.6
+ 0.0±0.1 6.7±0.5 8.7±0.7 10.2±0.7 10.8±0.8
50 - 0.0±0.1 3.8±0.3 8.0±0.6 10.1±0.6 11.5±0.7
+ 0.0±0.1 7.5±0.6 11.0±0.7 11.5±0.9 11.7±0.8
60 - 0.0±0.1 5.9±0.5 10.9±0.7 12.0±0.8 12.9±0.8
+ 0.0±0.2 7.8±0.6 10.8±0.9 11.6±0.8 12.4±0.9
< 실시예 2>
헛개나무 열매의 첨가 농도별 헛개나무 열매 추출물의 환원당 생산 정도
헛개나무 열매의 농도를 각각 40 g/L, 60 g/L, 80 g/L, 100 g/L 및 120 g/L로 물에 첨가한 후에 상기 실시예<1-1>을 통해 준비된 바실러스 아미로리퀘페이션스 DL-3이 생산하는 섬유소 분해효소를 80 U/mL의 농도로 첨가한 후에 50℃의 온도로 열처리하면서 시간별로 생산되는 환원당의 농도를 측정하였다. 환원당 측정은 상기 비교예 1과 동일한 방법으로 측정되었다.
그 결과 하기 표 4, 5 및 도 4에서 나타낸 바와 같이, 헛개나무 열매의 첨가 농도 및 시간경과에 의존적으로 헛개나무 열매 추출물의 환원당 생산이 증대되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 헛개나무 열매의 농도가 100 g/L까지도 비교적 높은 추출효율을 보여주었는데, 이는 섬유소 분해효소가 작용하여 헛개나무 열매 혼합물을 부분적으로 가수분해하기 때문에 단순한 열처리 방법으로 얻을 수 없는 고농도에서도 유효성분의 생산이 가능하기 때문일 것이다.
섬유소 분해효소를 첨가한 헛개나무 열매의 농도에 따른 환원당의 생산
Hovenia dulcis fruit
(g/L)		 Reducing sugar (g/L)
0 hr 3 hr 6 hr 9 hr 12 hr
40 0.0±0.1 10.5±0.7 13.7±0.8 13.9±0.7 14.2±1.0
60 0.0±0.1 16.6±1.0 19.3±0.9 20.1±1.1 21.4±1.2
80 0.0±0.2 20.4±1.4 24.0±0.3 24.9±1.3 25.8±1.4
100 0.0±0.1 24.3±1.3 28.9±0.2 29.5±1.4 30.6±1.5
120 0.0±0.1 26.3±1.2 29.9±1.4 30.9±1.6 31.6±1.5
섬유소 분해효소를 첨가한 헛개나무 열매의 농도에 따른 추출률
Hovenia dulcis fruit
(g/L)		 Reducing sugar (g/L)
0 hr 3 hr 6 hr 9 hr 12 hr
40 - 26.3 34.5 34.9 35.7
60 - 27.7 32.2 33.6 35.8
80 - 34.1 30.0 31.2 32.3
100 - 24.4 29.0 29.6 30.6
120 - 22.0 22.8 25.8 26.4
< 실시예 3>
섬유소 분해효소를 첨가한 후 열처리에 따른 헛개나무 열매 추출물에서 세라믹필터를 장착한 막여 과 정수처리 시스템( UF / MF System )을 사용하여 암페롭신의 분리하는 방법
헛개나무 열매 건조물을 100 g/L의 농도로 물에 첨가한 후에 상기 실시예<1-1>을 통해 준비된 바실러스 아미로리퀘페이션스 DL-3이 생산하는 섬유소 분해효소를 80 U/mL의 농도로 첨가한 후에 50℃의 온도로 열처리하였다. 그 후, 열처리한 혼합물을 필터프레스(한국필터(주) [모델명; Lab #6])와 연속원심분리기(Kokusan Seiko [모델명; Kokusan Type S-6])를 사용하여 불용성 물질을 제거하였다. 불용성 물질을 제거한 수용성 물질을 일차로 분자량 300,000 Da 이상의 물질을 제거하는 세라믹필터를 장착한 UF/MF system (한국(주)퓨어테크엔지 [모델명; Ceramic pilot system])을 사용하여 분자량 300,000 Da 이하의 물질 분획만 분리하였다. 분리한 분자량 300,000 Da 이하의 분획을 분자량 15,000 Da 이상의 물질을 제거하는 세라믹필터를 장착한 UF/MF System을 사용하여 분자량 15,000 Da 이하의 물질 분획만 분리하였다.
이렇게 분리된 분획은 암페롭신을 분석하는 표준 방법을 사용하여 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 분석하였으며, 암페롭신의 표준물질과 상기 HPLC 분석 결과를 비교하였다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 상기 공정에 의하여 분리된 물질이 암페롭신이라는 사실을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. (a) 물에 헛개나무 열매와 섬유소 분해효소를 첨가하여 혼합하는 단계;
    (b) 혼합물에 열처리하여 헛개나무 열매 추출물을 제조하는 단계;
    (c) 헛개나무 열매 추출물에서 불용성 물질을 제거하는 단계; 및
    (d) 불용성 물질이 제거된 추출물을 분획하는 단계를 포함하는, 헛개나무 열매로부터 암페롭신(ampelopsin)을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 헛개나무 열매는 40 내지 120 g/L의 농도로 첨가되며, 섬유소 분해효소는 50 내지 100 U/mL의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 섬유소 분해효소는 미생물 유래인 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 미생물은 바실러스(Bacillus) 속, 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 루미노코커스(Ruminococcus)속 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 바실러스(Bacillus) 속 미생물은 바실러스 아미로리퀘페이션스 DL-3 (Bacillus amyloliquefaciens DL-3: KACC 91344P)인 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 섬유소 분해효소는 셀룰레이즈(cellulase)인 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 열처리 온도는 40 내지 60℃인 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 불용성 물질 제거는 필터프레스와 연속원심분리기를 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 분획은 세라믹필터를 장착한 막여과 정수처리 시스템(UF/MF System)을 사용하여 분자량 300,000 Da 이하의 물질을 분획하고, 다시 15,000 Da 이하의 물질을 분획하는 과정을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법.
  10. 삭제
KR1020130023500A 2013-03-05 2013-03-05 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법 KR101421615B1 (ko)

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