KR101935200B1

KR101935200B1 - 패에서 분리한 신규 화합물 헥사데카플로레톨 및 그 화합물을 이용한 항당뇨 조성물

Info

Publication number: KR101935200B1
Application number: KR1020180064000A
Authority: KR
Inventors: 전유진; 류보미
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2019-01-03

Abstract

본 발명은 본 발명은 패(Ishige okamurae)에서 분리한 신규 화합물인 헥사데카플로레톨(hexadecaphlorethol, HdP) 및 그 화합물을 이용한 항당뇨 조성물을 개시한다. 상기 신규 화합물인 HdP는 알파-글루코시다제(α-glucosidase)의 활성을 저해하고 근원세포인 C2Cl12의 당 흡수를 유도하며, 알록산(alloxan) 처리에 의하여 인슐힌 분비가 감소된 제브라피시의 혈중 글루코오스 농도를 감소시키는 활성을 갖는다.

Description

패에서 분리한 신규 화합물 헥사데카플로레톨 및 그 화합물을 이용한 항당뇨 조성물{Novel Compound Hexadecaphlorethol Isolated from Ishige okamurae and Composition for Anti-Diabetes Using the Same}

본 발명은 패(Ishige okamurae)에서 분리한 신규 화합물인 헥사데카플로레톨(hexadecaphlorethol, HdP) 및 그 화합물을 이용한 항당뇨 조성물에 관한 것이다.

당뇨병이란 췌장의 β세포에서 분비되는 글루코오스 조절 호르몬인 인슐린이 부족하거나 제대로 작용하지 못하여 혈액 속의 혈당이 에너지로 이용되지 않고 혈액 속에 쌓여 고혈당을 유발하고 요중에 당이 검출되는 증상을 말한다.

당뇨병은 보통 인슐린 의존형 당뇨병(I형 당뇨병)과 인슐린 비의존형 당뇨병(II형 당뇨병)으로 구분된다. 인슐린 의존형 당뇨병은 바이러스 감염 등이 원인이 되어 췌장의 베타세포가 파괴된 결과 인슐린이 분비되지 않아 발병하며, 주로 10 내지 20대의 젊은 연령층에서 발병되기 때문에 소아 당뇨병이라고도 하는데, 인슐린이 외부에서 공급되지 않으면 생명유지가 어렵기 때문에 붙여진 이름이다. 인슐린 비의존형 당뇨병은 비만 등의 원인으로 췌장의 베타 세포에서 인슐린이 분비되기는 하지만 그 양이 부족하고 그 작용력이 감소하여 발병하며, 주로 30대 이후에 발병하므로 성인형 당뇨병이라고도 한다. 생명유지를 위해서는 외부로부터 인슐린을 반드시 공급할 필요가 없다고 하여 인슐린 비의존형 당뇨병이라 불리고 있지만, 그렇다고 고혈당 치료를 위하여 인슐린 치료가 필요하지 않다는 의미는 아니다.

당뇨병은 인슐린 작용의 부족에 의한 만성 고혈당증이 지속됨에 따라 심근경색, 협심증, 시신경 손상, 족부 궤양 등 합병증을 수반하며, 인슐린은 주로 탄수화물 대사 이상에 관여하며 탄수화물 대사의 이상이 기본적인 문제이나, 이로 인해 체내의 단백질과 지질 대사 및 전해질의 대사에 이상을 초래하므로, 총체적인 대사성의 질병이라고 할 수 있다(J Korean Soc Food Sci Nutr. 2002 31:1071-1077). 따라서 혈당조절은 당뇨병으로 인한 만성 합병증 발생을 예방하거나 지연 시킬 수 있는 방법으로 사료된다.

소화기관 내의 탄수화물은 소화 효소인 알파-아밀라아제(α-amylase)와 알파-글루코시다아제(α-glucosidase)에 의해 분해되며, 소장의 융모에서 최종적으로 글루코오스(glucose)와 프럭토스(fructose) 등으로 분해되어 흡수된다. 그러나 혈당의 효과적인 조절이 안 되는 당뇨병 환자의 경우 소화 흡수되는 글루코오스를 제대로 처리하지 못하여 고혈당 상태가 악화된다. 따라서 소화기관의 알파-아밀라아제와 알파-글루코시다아제를 저해함으로써 글루코오스의 흡수가 천천히 일어나게 하여 식후 혈당을 조절할 수 있다(Int J Obes. 1984. 8 Suppl 1:181-90; Asia Pac J Clin Nutr. 2004. 13(4):401-8; J Int Med Res. 1998 Oct-Nov 26(5):219-32; Diabetes Care. 1999 Jun 22(6):960-4).

특히 알파-글루코시다아제는 탄수화물의 소화 과정 중 마지막 단계를 촉매 하여 포도당으로 전환시키는 효소이므로 알파-글루코시다아제 저해제는 다당류에서 단당류로 분해되는 과정을 저해하여 당의 흡수를 지연시켜 혈당을 조절하는데 도움을 줄 수 있다(Journal of Life Science. 2008. 18(7):1005-1010; J. Ethnopharmacol. 2000. 72:129-133). 알파-글루코시다아제 저해제의 작용기전은 인슐린을 분비하지 않고 소장에서 당의 흡수를 저해해 기존 약물들이 가지고 있는 저 혈당, 간독성, 베타세포 기능 저하 등의 부작용을 최소화 할 수 있다(European Jounal of Pharmacology. 2009. 615:252-256; Journal of Life Science. 2008. 18(7):1005-1010; Food Chem. 2008. 108:965-972).

알파-글루코시다아제 저해제로는 아카보즈(acarbose), 보글리보스(voglibose) 등이 임상에 널리 사용되고 있다. 특히 아카보즈는 소장에서 포도당의 흡수를 억제함으로써 항당뇨에 효과적이라고 알려져 있으나(Eur J Clin Invest. 1994 Aug, 24 Suppl 3:3-10), 복부 팽만, 복통, 구토, 설사 등의 위장 장애를 나타낼 뿐만 아니라 미 분해된 이당류가 대장에서 박테리아에 의해 분해되어 가스, 설사, 변비 등과 같은 부작용을 야기시킬 수 있다(World J Gastroenterol. 2008 Oct 21. 14(39):6087-92). 또한 알파-글루코시다아제를 완전히 저해시킬 경우 당의 흡수율이 현저히 떨어져 저혈당 증상이 발생하므로 치료제로 사용하는데 문제점이 있다(Mol Cell Biochem. 1998 May, 182(1-2):101-8).

이러한 부작용을 줄이고 식후 혈당 상승 억제 효과를 낼 수 있는 새로운 알파-글루코시다아제 저해제 개발은 매우 필요하다. 특히, 식물체 기원 저해제의 경우 알파-아밀라아제에 대해서는 낮은 저해율을 보이는 반면, 알파-글루코시다아제에 대해서는 매우 높은 저해율을 보여, 당뇨병 치료에 있어 최소한의 부작용으로 효과적인 치료에 사용 가능할 것이라는 연구도 보고되고 있다(Asia Pac J Clin Nutr. 2006, 15(1):107-18). 최근에는 천연물로부터 약리작용이 있는 물질을 찾으려는 관심이 높아지면서 한약재를 비롯한 허브, 뽕잎(J Korean Soc Food Sci Nutr. 2008. 37(4):452-458), 곶감, 생감, 감잎 (J Korean Soc Food Sci Nutr, 2008, 37(8):957-964), 더덕(J. Medicinal Crop Sci. 2009. 17(4):280-285) 등과 같이 식품에서 알파-글루코시다아제를 저해할 수 있는 소재를 찾고 있다.

더불어 해조류의 생리활성에 관한 연구 뿐 아니라 유효 활성성분을 추출, 개발하여 이용하고자 하는 노력이 증대되고 있다(J Korean Soc Food Sci Nutr. 2005. 34(8):1143-1150; J Agric Food Chem. 2002 Feb 13. 50(4):840-5). 하지만 해양식물에 대한 연구는 육상식물에 비해 미흡한 실정이고, 해조류를 이용한 항 당뇨 관련 연구는 Lee 등(한국의학회지. 1996. 29(3):296-306)의 다시마, 미역, 한천, 김파래 등을 이용한 항 당뇨 유발 쥐에 관한 연구와 곰피(Plant Foods Hum Nutr. 2008 Dec. 63(4):163-9), 감태(Journal of Life Science. 2012. 22(6):751~759), 지충이(Kor J Fish Aquat Sci. 43(6):648-653), 파래(Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 2005. 23(3):354-356) 정도만 보고되어 있을 뿐 다양하고 풍부한 자원에 비해 해조류에 대한 연구는 미흡하다.

이에 본 발명의 발명자들은, 패(Ishige okamurae)로부터 분리·동정한 신규물질인 HdP의 혈당 조절 활성을 개시한다.

본 발명의 목적은 패에서 분리·동정한 신규물질인 HdP와 그 물질을 이용한 항당뇨 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 패에서 분리?동정한 아래의 <화학식 1>의 신규 물질인 HdP가 알파-글루코시다제(α-glucosidase)의 활성을 저해하고 근원세포인 C2Cl12의 당 흡수를 유도하며, 알록산(alloxan) 처리에 의하여 인슐힌 분비가 감소된 제브라피시의 혈중 글루코오스 농도를 감소시킴을 확인하였다.

<화학식 1>

전술한 바의 실험 결과를 고려할 때, 본 발명은 일 측면에 있어서, 상기 <화학식 1>의 화합물, 이의 프로드럭, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물에 관한 것이고, 다른 측면에 있어서, 상기 <화학식 1>의 화합물, 이의 프로드럭, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서, "프로드럭(prodrug)"은 어떤 약물을 화학적으로 변화시켜 물리적, 화학적 성질을 조절한 약물을 의미하며, 그 자체는 생리 활성을 나타내지 않지만 투여 후 체내에서 화학적 혹은 효소의 작용에 의해 원래의 약물로 바뀌어 약효를 발휘할 수 있는 약물을 의미한다.

또 본 명세서에서 "수화물(hydrate)"은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서 "용매화물"은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 화합물을 의미한다.

또한 본 명세서에서, "항당뇨"는 당뇨병의 증상의 경감, 예방, 또는 치료를 의미한다.

본 명세서에서 "당뇨병"이란 전술한 바의 인슐린 의존형 당뇨병(제1형 당뇨병)과 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)을 포함하는 의미이며, 나아가 다른 질병 등으로 인하여 췌장이 손상됨에 따라 발생하는 당뇨병 예컨대, 갑상선 기능 항진증, 부신피질 기능 항진증, 성장호르몬 과다증 또는 카테콜라민 과다증에 의한 당뇨병, 임신성 당뇨병을 포함하는 의미이다.

또한 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 조성물에서 그 유효성분은 항당뇨 효과 등 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 항당뇨 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 항당뇨 효과 등의 상승·보강을 위하여 또는 체지방 감소, 혈중 콜레스테롤 개선 활성, 혈중 중성지방 개선 활성 등 유사 활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성이 확인된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임), 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조?판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 "건강기능식품에관한법률"임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물 등이 포함된다. 예컨대 한국 건강기능식품공전 또는 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 개별 인정 원료로서, 혈당 조절 기능성 원료인 L-arabinose, nopal 추출물, 계피 추출분말, 구아바 잎 추출물, 난소화성 말토덱스트린, 동결건조 누에 분말, 마 주정 추출물, 바나바 잎 추출물, 상엽 추출물, 서목태(쥐눈이콩) 펩타이드 복합물, 솔잎 증류 농축액, 실크 단백질 효소 가수분해물, 알부민, 인삼 가수분해 농축액, 지각 상엽 추출 혼합물, 콩 발효 추출물, 타가토스, 탈지 달맞이꽃 종자 추출물, 피니톨, 홍경천 등 복합 추출물, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 등이나, 체지방 감소 기능성을 가진 가르시니아 캄보지아 껍질 추출물, 공액 리놀렌산(유리지방산), 공액리놀렌산(트리글리세라이드), 녹차 추출물, 키토산, 그린마떼 추출물, 그린커피빈 추출물, 깻잎 추출물, 대두 배아 추출물 등의 복합물, 돌외잎 주정 추출 분말, 락토페린(우유 정제 단백질), 레몬 밤 추출물 혼합 분말, 마테 열수 추출물 또는 미역 등의 복합 추출물(잔티젠) 등이나, 혈중 콜레스테롤 개선 기능성을 가진 녹차 추출물 또는 스피루리나, 대나무 잎 추출물, 보리 베타글루칸 추출물, 보이차 추출물, 식물 스타놀에스테르, 감태주정추출물, 아마인, 알로에 복합 추출물 또는 알로에 추출물 등이나, 혈중 중성지방 개선 기능성을 가진 DHA 농축 유지, 난소화성 말토덱스트린, 대나무 잎 추출물, 식물성 유지 디글리세라이드, 정제 오징어유, 글로빈 가수분해물 또는 정어리 정제어유, 혈행 개선 기능성을 가진 은행잎 추출물, 나토균 배양 분말, 나토 배양물, 메론 추출물 또는 카카오 분말 또는 홍삼 추출물 등이 그러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.

이러한 화합물 또는 추출물은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또 본 발명의 식품 조성물은 법률상?기능상의 구분에 있어서 제조?유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 "건강기능식품에관한법률"에 따른 건강기능식품이거나, 한국 "식품위생법"의 식품공전(식약처 고시 "식품의 기준 및 규격"임)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조?유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 "식품위생법"임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 "식품첨가물 기준 및 규격)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 식품 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위한 용도로 사용되는 것으로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충?보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 법률에 따른 식품공전이나 식품첨가물공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코오스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 점안제, 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제, 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 점안제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 식염수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있으며 필요에 따라 염화벤잘코늄, 메필파라벤, 에틸파라벤 등을 방부 목적으로 첨가할 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 패에서 분리한 신규 화합물인 HdP와 이 화합물을 이용한 항당뇨 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품 또는 약품으로 제품화될 수 있다.

도 1은 HdP 분리과정을 모식화한 것이다.
도 2는 HdP의 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 HdP의 ¹H, ¹³C NMR 스펙트럼 데이터이다.
도 4는 HdP의 이차원(2D) NMR 스펙트럼 HMQC(a)와 HMBC(b) 데이터이다.
도 5는 HdP의 LC-MS-MS 스펙트럼 데이터이다.
도 6은 분화된 근원세포인 C2C12 세포에서 HdP가 글루코오스의 흡수를 유도함을 보여주는 결과이다.
도 7은 제브라피시 배아에서의 HdP의 독성 데스트 결과이다.
도 8은 성체 제브라피시에서 HdP가 혈중 글루코오스 농도를 저하시킴을 보여주는 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 패 추출물로부터 HdP의 분리 및 동정

<실시예 1> HdP의 분리

패 추출물로부터의 HdP의 분리는 아래와 같이 수행하였으며, 그 분리 과정의 모식도를 도 1에 나타내었다.

패는 제주 성산 지역에서 채집되어 담수에서 2회를 씻어 염분을 제거하여 자연건조 하였다. 건조된 패를 믹서기에 갈아서 분말화하고 이 분말 100g을 2L의 50% 에탄올에 24시간 실온에서 추출한 뒤, 여과하고 감암농축하여 추출용매를 제거하고 분말상의 추출물을 얻었다.

이 추출물 분말 10g을 5L의 증류수에 현탁하고 여기에 동량의 5L 에틸아세테이트를 가하여 분획하고 감압농축하여 용매를 제거하고 에틸아세테이트 분획물을 얻었다.

원심향류분배 크로마토그래피(centrifugal partition chromatography, CPC)를 수행하기 위하여, 예비실험을 통해, 용매계(solvent system)로 n-헥산-에틸아세테이트-메탄올-물로 구성되어 있는 용매계를 우선 선정하고, 이 용매계의 용매 비율을 변화시켜 가면서 최적의 분배계수인 K 값을 측정·탐색하여, n-헥산-에틸아세테이트-메탄올-물의 용매계가 1:9:4.5:6.5의 부피비를 가지는 조건에서 0.5의 K 값이 적절함을 확인하였다.

상기 용매계를 분별깔때기에 넣고 강하게 흔들어 진탕한 후에 상온에서 완전히 균형을 이루도록 하여 상·하층으로 분리하고 상층의 유기상은 고정상으로, 하층의 액상은 이동상으로 사용하였다.

CPC를 수행하기 위하여 1000 rpm으로 회전하는 CPC 칼럼에 상기 상층 유기 고정상을 가득 채우고, 회전 속력을 1000 rpm으로 하여 펌프 압력이 일정하게 유지될 때까지 상층 유기 고정상을 2ml/min의 속력으로 주입시켰다. 압력이 일정해지면 시료(상기 에틸아세테이트 분획물 500mg을 6mL의 물과 메탄올 1:1 부피비 혼합물에 용해시킨 것) 60ml를 주입시킨 후 230nm의 파장에서 모니터링하면서 각 분획물을 분취했고, 상대적으로 비극성인 분획물을 70분부터 120분까지의 분획에서 분리하였다.

다음 상기 얻어진 CPC 분획물에 대해서 semipreparative HPLC 칼럼(YMC-Pack ODS-A, 10 x 250 mm, 5 ㎛ particle size, YMC Co Ltd, Tokyo, Japan)을 이용하여 HPLC를 수행하였다. 구체적으로 이동상은 0.1% 포름산을 함유한 31% 아세토니트릴(32% acetonitrile containing 0.1% formic acid)및 0.1%의 포름산을 함유한 69% 물(68% water containing 0.1% formic acid)로 하였으며, 유속 2mL/min로 흘려주었고 UV 흡광도 230nm 측정하여 강도가 두번째로 높은 17.302분대의 화합물을 분리하였다. 이 화합물이 표시된 HPLC 크로마토그램을 도 2에 나타내었다.

<실시예 2> 상기 화합물의 동정

분리된 상기 화합물을 구조를 동정하기 위하여 ¹H NMR, ¹³C NMR 스펙트럼을 측정하였고 수소원자간 및 수소와 탄소원자간의 상관관계를 알아보기 위한 이차원(2D) NMR스펙트럼으로 HMQC 및 HMBC 스펙트럼을 측정하였으며, 분자량을 분석하기 위하여 LC-MS-MS을 측정하였다. 각 결과를 도 3 내지 5에 나타내었으며, 관련 문헌과의 비교 검토를 통하여 기존에 보고되지 않은 신규 화합물인 <화학식 1>의 HdP로 확인하였다.

<실험예> HdP의 항당뇨 활성

1. 실험 방법

1.1 알파-글루코시다제(α-glucosidase) 저해 활성 측정

알파-글루코시다제 저해 활성의 평가는 Watanabe et al.(Watanabe, Kawabata, Kurihara, & Niki, 1997)에 기술되어 있는 방법에 따랐으며, 효모 효소를 사용하여 수행하였다. pH 7.0, 37℃ 반응 조건에서 기질인 5mM의 p-니트로페닐 α-D-글루코피라노시드(p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside, PNP-G)와, 100mM의 인산완충액(phosphate buffer)으로 희석된 32 mU/ml 효소액(yeast α-glucosidase, Sigma)을 반응시켜, 분광광도계(spectrophotometry)를 이용하여 저해 활성을 측정하였다. 시료를 PNP-G와 5분간 반응 시켜 PNP-G의 가수분해에 의해 방출되는 4-니트로페놀(4-nitrophenol)의 흡광도를 405nm에서 측정하였다. 이후 동량의 기질 용액을 첨가한 후 실온에서 5분간 추가로 반응시킨 후, 0.5 M Na₂CO₃를 가하여 반응을 중지시키고 흡광도를 측정하여 흡광도의 변화량을 확인하였다.

알파-글루코시다제의 저해 활성(%)을「(1-시료 첨가구 흡광도/용매 첨가구 흡광도) × 100」 수식에 따라 산출하였다.

양성대조군으로 알파 글루코시다제 억제제 계열의 경구용 혈당 강하제인 아카보즈(Acarbose)를 사용하였다.

1.2 C2C12 세포 당 흡수 측정

1.2.1 C2C12 세포 배양과 분화

마우스 유래 근원세포인 C2C12 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 10% FBS와 항생제가 포함된 DMEM(Dulbeccos Modified Eagle's Media) 배지에 현탁하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양기에서 배양했다. 세포 밀도가 80%가 되면, C2C12세포는 2% 마혈청(horse serum)과 저농도 글루코오스가 포함된 DMEM 배지에서 5일 동안 분화시켰으며 배지는 3일마다 교체하였다. 분화된 세포는 저농도의 글루코오스가 포함된 무혈청 DMEM 배지에서 12시간 동안 혈청 기아 상태(starvation)를 유지시키고, PBS 용액으로 세척한 후, 저농도의 글루코오스가 포함된 새로운 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 동안 시료(HdP)와 반응시켰다.

1.2.2 유세포분석기(FACS)를 이용한 C2C12세포의 당 흡수 측정

마우스 유래 C2C12 근원세포의 당 흡수 측정은 2-NBDG((2-(N-(7-Nitrobenz-2 oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) 분석법(Cell Death Dis. 2017 Oct 5. 8(10):e3078)를 사용하여 유세포분석장치(FACS)로 측정하였다. 상기 배양된 세포를 10μM 농도의 2-NBDG와 함께 37℃에서 24시간 동안 반응 시킨 후, BD FACS CantoII(BD　Biosciences, NJ, USA)로 분석을 수행하였고, 2-NBDG의 형광은 FITC 채널에서 검출하였다.

1.3 동물실험

성체 제브라피시(Zebrafish)는 시중(제주 아쿠라이룸, 제주도, 한국)에서 구입하여 실험에 사용하였으며, 28.5±1℃ 온도 및 14/10시간 명암 주기 조건의 3.5L 아크릴 탱크에서 관리하며 1일 2회 식이(Tetra GmgH D-49304 Melle, made in Germany)를 급여하였다. 제브라피시 실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 승인하에 이루어 졌다.

1.3.1 제브라피시 배아에서의 HdP 독성 테스트

수정 후 4시간이 경과한 배아(n=15)를 배아 배지(60 ppm 의 염을 포함하는 증류수) 950㎕와 HdP(0.01, 0.1, 1, and 10㎍/㎖) 50㎕이 함유된 12 웰 플레이트의 각 웰에 옮기고, 수정 후 168시간 동안 HdP에 노출된 제브라피시 배아의 생존율을 측정하였다.

1.3.2 제브라피시의 혈중 글루코오스 농도 측정

야생형 성체 제브라피시를 2mg/ml의 알록산(alloxan)에 1시간 동안 반응시킨 후, 인슐린이 없는 상태에서 1% 글루코오스에 1시간 반응시켰다. 이후 반응용액을 물로 바꾸고 1시간 동안 반응시킨 후, HdP, 메트포르민(Metformin), BAPTA-AM을 90분 동안 처리하였다. 실험군은 무처리군, 알록산 처리군(control), 알록산과 HdP(0.3 ㎍/g body weight) 처리군, 알론산과 메트포르민(5 ㎍/g body weight) 처리군, 알록산과 BAPTA-AM(3 ㎍/g body weight) 처리군, 및 알록산과 BAPTA-AM(3 ㎍/g body weight) 그리고 HdP(0.3 ㎍/g body weight) 처리군으로 구성하였다.

2. 실험 결과

2.1 알파-글루코시다제(α-glucosidase) 저해 활성 측정 결과

결과를, 알파-글루코시다제 활성을 50% 억제하는데 필요한 시료의 농도(IC₅₀)를 아래의 표 1에 나타내었다.

시료	IC₅₀(μM)
Hexadecaphlorethol(HdP)	54.97
Acarbose	1050.23

상기 표에서 확인되듯이, 본 발명의 HdP는 아카보즈에 비해 높은 알파-글루코시다아제 억제 활성을 보였다.

2.2 C2C12세포의 당 흡수 측정 결과

분화된 C2C12 세포에서, HdP에 의한 글루코오스 흡수능을 측정하여 결과를 도 7에 나타내었다. FACS는 세포의 불균질 혼합물로부터 다수의 형광이 부착된 세포를 단리하는 장치이다. 형광이 표지된 글루코스 유사체(analogues)인 2-NBDG와 반응시킨 C2C12세포에서 FITC필터에 의해 2-NBDG의 검출이 많을 수록 형광 강도는 강해지며, 그래프는 오른쪽으로 움직이게 된다. 따라서, 도 6을 참조하여 보면, HdP를 24시간 처리한, 분화된 C2C12 세포 내의 글루코오스 흡수가 HdP의 처리 농도에 의존적으로 유의하게 증가함을 알 수 있다. 이는 HdP가 혈중 글루코오스 농도를 낮출 수 있음을 보여주는 결과라 할 수 있다. 분화된 C2C12 세포 내로의 글루코오스 흡수는 글루코오스의 혈중 농도 감소의 지표로 알려져 있다(Diabetes 30 (1981) 1000-1007; Biochemical and Biophysical Research Communications 420 (2012) 576-581; Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (2006) 85-96; Eur. J. Cell Biol. 87 (2008) 337-351)

2.3 제브라피시 배아에서의 HdP 독성 테스트 결과

독성이 없는 HdP의 농도를 확인하고자 제브라피시 배아를 통해 생존율을 평가한 결과 도 7에서 보여지는 바와 같이 1㎍/ml 이하에서 약 90% 이상의 생존율을 보였다.

2.4 제브라시피시의 HdP에 의한 혈중 글루코오스 레벨 측정 결과

HdP가 동물모델에서 혈당을 조절하는지 확인하기 위해, 알록산(alloxan) 처리에 의해 인슐린 분비가 감소된 성채 제브라피시에 글루코오스를 주입하여 HdP에 의한 혈액 내 글루코오스 변화를 관찰하였다.

결과를 도 8에 나타내었는데, 도 8을 참조하여 보면 알록산을 처리한 성체 제브라피시의 혈중 글루코오스는 HdP가 처리될 경우 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 효과는 혈당조절을 위해 시중에 사용되는 메트포르민(metformin)과 비교하였을 때 유사한 수준로 나타났다. 특히 이는 HdP의 처리 농도가 0.3㎍/g임을 고려할 때, 메트포르민의 처리 농도인 5㎍/g보다 16.7배 낮은 농도로 유사한 수준의 글루코오스 유입 유도 효과를 기대할 수 있음을 의미한다.

Claims

아래 <화학식 1>의 화합물, 그 수화물 또는 그 용매화물.
<화학식 1>
삭제
아래 <화학식 1>의 화합물, 그 수화물 또는 그 용매화물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 식품 조성물.
<화학식 1>
아래 <화학식 1>의 화합물, 그 수화물 또는 그 용매화물을 유효성분으로 포함하는 항당뇨용 약제학적 조성물.
<화학식 1>